KR101706451B1

KR101706451B1 - 마이크로불비퍼 속 유래 말토트리오스 생성용 아밀라아제 및 이를 이용한 말토트리오스 생산방법

Info

Publication number: KR101706451B1
Application number: KR1020150056248A
Authority: KR
Inventors: 이용석; 최용락
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2015-04-22
Publication date: 2017-02-15
Also published as: KR20160125619A

Abstract

본 발명은 재조합 미생물을 이용하여 말토트리오스을 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 특정 박테리아 마이크로불비퍼(Microbulbifer) 속 균주, 바람직하게는 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans)가 생산하는 α-아밀라아제 효소를 이용하여 수용성 전분을 가수분해함으로써 말토트리오스를 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

마이크로불비퍼 속 유래 말토트리오스 생성용 아밀라아제 및 이를 이용한 말토트리오스 생산방법{Maltotrios-Producing Amylase derived from Microbulbifer sp. and the Process for Producing Maltotrios therewith}

본 발명은 말토트리오스 생성 아밀라아제 및 이를 이용한 말토트리오스(maltotriose) 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정 균주 마이크로불비퍼 속(Microbulbifer sp .) 생물 유래의α-아밀라아제로 전분을 가수분해함으로써, 말토트리오스를 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

말토 올리고당은 단백질 변성방지 효과 및 식품의 마스킹(masking) 효과와 부드러운 식감 부여등 식품분야에서 널리 이용되고 있는 기능성 당류이다. 말토올리고당은 말토오스(G2, maltose), 말토트리오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스 (G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose), 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7,maltoheptaose), 말토옥타오스(G8, maltooctaose), 말토노나오스(G9, maltononaose)등을 포함한다.

말토 올리고당을 전분으로부터 생산하는 방법으로는 산 가수분해 방법과 효소를 이용한 방법이 주로 이용되고 있다.

상기 효소를 이용한 방법으로는 미생물에서 유래한 알파-아밀레이즈를 전분에 작용시켜 말토 올리고당을 제조하는 방법이다.

α-아밀라아제(E.C. 3.2.1.1)는 전분, 글리코겐, 및 관련 다당류 및 올리고당류의 가수분해를 촉매 작용시키는 효소의 군을 이룬다. 알파-아밀라아제(Amylase)는 전분 가수분해 반응을 촉매하는 효소로서 그 분해산물은 올리고당의 혼합물이다. 이 효소는 동물, 식물 그리고 미생물에 이르기까지 다양하게 분포되어 있다. 서로 다른 분자량이나 최적 pH, 최적 온도를 달리한 수많은 종류의 아밀라아제가 알려져 있다

그러나 상기 방법으로 제조하는 경우 글루코오스(G1, glucose), 말토오스(G2, maltose), 말토트리오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose) 등이 다량으로 함께 생성되어, 원하는 올리고당 형태를 분리하기 위해 컬럼크로마토그래피, 유기용매를 이용한 분리 및 정제공정이 요구됨으로써 생산경비가 과다하게 소요될 뿐만 아니라 분리, 정제가 어려워 고순도의 특정 말토 올리고당 형태를 얻기가 매우 어렵다

그러므로, 특정 형태의 말토 올리고당을 경제적으로 수득할 수 있는 방법에 대한 요구가 존재하여왔다.

이에 본 발명자들은 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 균주가 생성하는 알파-아밀라아제 효소가 전분을 가수분해하여, 특히, 말토트리오스(G3, maltotriose)를 고효율로 생산함을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

1.한국 공개특허 10-2007-0006963 2.한국 공개특허 10-2008-0072496 3.한국 공개특허 10-1997-0070190 4.한국 공개특허 10-2009-0059366

본 발명의 목적은 신규한 말토트리오스 생성용 α-아밀라아제(α-amylase, AmyA)를 생산하는 미생물 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주로부터 생산된 신규한 말토트리오스 생성 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하여 말토트리오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해,

본 발명은 재조합 미생물을 이용하여 말토트리오스을 생산하는 방법, 구체적으로는 특정 박테리아 마이크로불비퍼(Microbulbifer) 속 균주, 바람직하게는 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans)를 이용하여 α-아밀라아제를 제조하는 방법 및 상기 제조된α-아밀라아제를 이용하는 말토올리고당 생산 방법을 제공한다.

일 구체예로서, 본 발명은 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 균주에서 유래된, 말토트리오스 생성용 α-아밀라아제 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

특히, 상기 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 균주는 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) DAU221(기탁번호: KCCM 11603P)인 것이 가장 바람직하다.

상기 α-아밀라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 2의 DNA 염기 서열을 가질 수 있고, 수용성 전분을 가수분해함으로써 특히, 말토트리오스를 효과적으로 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 상기 α-아밀라아제는 아세톤, 벤젠, 및 헥산으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 유기 용매에 대한 내성을 가지고, pH 6 ~ 7 및 40 ~ 50℃에서 최적의 활성을 나타낸다. 더욱 바람직하게는 1.08 mg/mL 및 1.736 mmol 말토트리오스/mg 단백질/min의 Km 및 Vmax 값을 각각 가진다.

다른 구체예로서, 본 발명은 상기 α-아밀라아제로 전분 기질을 가수분해시키는 것을 특징으로 하는, 말토트리오스 생산방법을 제공한다.

상기 전분 기질은 아밀로펙틴, 아밀로스, 가용성 녹말, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분 및 밀 전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 수용성 성분으로 구성될 수 있다.

또한, 상기 방법은 pH 6 ~ 7 및 40 ~ 50℃에서 수행되는 것이 바람직하고, α-아밀라아제 활성 촉진을 위해 Mg² ⁺ 존재 하 수행되는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 방법은 2~3시간 동안 수행될 수 있다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 균주 유래 α-아밀라아제를 이용하여 말토트리오스 생산하는 방법에 사용될 수 있는 재조합 벡터 및/또는 재조합 미생물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 균주 유래 α-아밀라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 사용하였다.

이처럼, 본 발명은 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 균주 유래 α-아밀라아제를 이용하여, 말토 올리고당 중 말토트리오스를 고효율로 생산하는 것에 관한 모든 태양을 포함한다.

본 발명의 방법은 특정 균주를 이용하여 아밀라아제 효소를 생성시킴으로써, 전분을 가수분해하여 직접적으로 말토트리오스를 높은 수율로 수득할 수 있게 하므로 말토트리오스 생산을 통한 상업화 기술에 매우 유용할 것이다.

도 1은 SDS-PAGE 방법에 의한 분리 정제된, 본 발명의 α-아밀라아제에 대한 분자량을 확인한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 α-아밀라아제에 대한 pH 영향을 관찰한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 α-아밀라아제에 대한 온도 영향을 관찰한 결과이다.
도 2c는 본 발명의 α-아밀라아제에 대한 시간에 따른 온도 안정성을 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 α-아밀라아제에 대한 NaCl 농도에 따른 활성을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 α-아밀라아제에 대해 반응표면분석법을 통한, 온도, pH 및 수율을 확인하여 효소 활성 최적화 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 α-아밀라아제 효소 반응 산물의 TLC(Thin Layer Chromatography) 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 α-아밀라아제 효소 반응 산물의 HPLC 분석 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"～에 의해 코딩되는" 또는 "～를 코딩하는"이란 핵산 서열이 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것을 말하며, 여기서 상기 폴리펩티드 서열은 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 적어도 3～5개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 8～10개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 15～20개 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 사용하여 면역학적으로 확인할 수 있는 폴리펩티드 서열도 포함된다. 따라서, 항원 "폴리펩티드", "단백질" 또는 "아미노산" 서열은 항원의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 유사성, 바람직하게는 약 80% 이상의 유사성, 더 바람직하게는 약 90～95%의 유사성, 가장 바람직하게는 약 99%의 유사성을 가질 수 있다.

"유전자"는 유전적 기능이 관련되어 있는 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등)의 뉴클레오티드 서열이다. 유전자는, 예를 들어, 유기체의 게놈 내의 특정 물리적 위치("유전자좌")를 차지하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 포유동물의 DNA 서열)을 포함하는, 유기체의 유전 단위이다. 유전자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 발현 생산물을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 폴리펩티드 코딩 서열과 같은 코딩 서열 및 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)과 같은 비코딩 서열을 포함한다. 다수의 진핵생물 유전자가 "인트론"(비코딩 서열)이 개재되어 있는 "엑손"(코딩 서열)을 갖는다.

"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

"벡터" 또는 "플라스미드"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내 및/또는 사이로 전달하는 핵산 분자, 바람직하게는 자가-복제성 핵산 분자이다. 이 용어는 1차적으로 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입을 위해 기능하는 벡터,1차적으로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 기능하는 벡터의 복제물, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한, 하나 초과의 상기 기능을 제공하는 벡터도 포함된다. "발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때 폴리펩티드(들)로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 대체로 요구되는 발현 생산물을 생산하도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 의미한다.

"숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터가 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입되기 쉬운 등등의 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 E. coli를 사용하였다.

"효소 반응 조건"이란 효소가 기능하도록 허용하는 환경에서 이용가능한 임의의 필수적인 조건(즉, 온도, pH, 물질 비저해)과 같은 요인을 의미한다. 효소 반응 조건은 시험관에서와 같은 시험관내, 또는 세포내와 같은 생체내일 수 있다.

"대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 폴리뉴클레오티드의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반한다. "대사 조작된"은 원하는 경로를 유도하는 중간생성물과 경쟁하는 경쟁 대사 경로(competing metabolic pathway)의 감소, 파괴 또는 적중을 비롯한, 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 호스트에 외래성이거나, 또는 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 및/또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주 미생물에 이종성일 수 있다. 일 견지에서, 폴리뉴클레오티드가 숙주 생물체에 이종 발생성인 경우에, 폴리뉴클레오티드는 코돈(codon) 최적화될 수 있다.

"기질"은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나 전환되게 되어있는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 단일 화합물뿐만 아니라 용제, 혼합물 및 최소한 하나의 기질을 포함하는 다른 재료와 같은 화합물의 조합 및 이들의 유도체를 포괄한다. 게다가, 용어 "기질"은 바이오매스(biomass) 유도된 설탕과 같은 출발 재료로서 사용하기 적합한 탄소 공급원을 제공하는 화합물뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 대사 조작 미생물과 연관된 경로에서 사용되는 중간생성물과 최종 대사산물을 포괄한다. 미생물에 의해 통상적으로 사용되는 적합한 탄소 기질을 포괄한다.

"기능" 및 "기능성" 등은 생물학적 또는 효소적 기능을 의미한다.

"증가된" 또는 "증가"라는 것은 비변형 미생물 또는 상이하게 변형된 미생물과 같은 대조 미생물에 비해 주어진 산물 또는 분자(예를 들면, 범용 화학물질, 바이오연료 또는 이들의 중간체 산물)를 더 많은 양으로 생산할 수 있는 하나 이상의 재조합 미생물의 능력을 의미한다.

"~로부터 얻은" 또는 "~유래의" 이란 예를 들어, 소정 유기체, 전형적으로 미생물과 같은 특정 공급원으로부터 단리되거나, 이로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 추출물 또는 폴리펩티드 추출물 등과 같은 샘플을 의미한다. 또한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 특정 유기체 또는 미생물로부터 단리되거나, 이로부터 유도된 상황도 의미할 수 있다.

"재조합" 미생물은 전형적으로, 예컨대 플라스미드 또는 벡터에 하나 이상의 외래 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

또한, 본 발명은 상기 M. thermotolerans DAU221로부터 α-아밀라아제 유전자를 클로닝하는 것을 포함한다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여, α-아밀라아제를 코딩하는 유전자를 기본 벡터에 삽입하여 형질전환시킨 재조합미생물을 배양함으로써 구현할 수 있다.

따라서, 본 발명은 말토트리오스와 같은 범용 화학물질로 전환시키는 방법, 효소, 재조합 미생물 및 미생물 시스템을 포함한다.

<α-아밀라아제 제조>

본 발명은 일 관점에서 M. thermotolerans DAU221를 이용하여 α-아밀라아제(AmyA) 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 M. thermotolerans DAU221 게놈 라이브러리로부터 α-아밀라아제 유전자를 클로닝하고, 이를 발현 및 정제하는 공정을 모두 포함한다.

AmyA 유전자 유래 균주

본 발명의 α-아밀라아제는 마이크로불비퍼 속 균주로부터 분리하거나 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다.

특히, 본 발명의 α-아밀라아제를 발현하는 유전자는 특정 박테리아 균주 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans), 바람직하게는 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) DAU221에서 유래한 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 상기 M. thermotolerans DAU221를 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다(KCCM 11603P, 16S rDNA sequence GenBank ID KC571186).

또한, 본 발명의 M. thermotolerans DAU221의 말토트리오스-생성 α-아밀라아제 유전자에 대한 뉴클레오타이드 서열은 어세션 넘버 KJ509613 하 GenBank 데이터베이스 내 기탁하고, 상기 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 1로 표시하였다.

상기 유전공학적인 방법은 통상의 공지된 방법일 수 있고, 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포를 이용하여 단백질을 생산하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 본원 발명의 α-아밀라아제를 제조하는 방법은 미생물 발현 생산시스템을 통하여 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 예로, α-아밀라아제의 생산방법은 (a) 마이크로불비퍼 속 균주에서 분리된 α-아밀라아제를 코딩하는 DNA서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 α-아밀라아제를 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

재조합벡터

상기 (a) 단계에서, 상기 재조합 벡터는 상기 α-아밀라아제를 코딩하는 유전자가 발현 가능하도록 공지의 벡터에 삽입된 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에서 벡터(vector)는 적합한 미생물 내에서 상기 유전자들의 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　

상기 공지의 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적절하게 선택하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 효모, 대장균 또는 곰팡이에서 이종 단백질을 발현하기 위해 제안된 모든 종류의 벡터일 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다.　바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.　"작동 가능하게 연결된"이란 언급된 구성요소들이 그 일반적 기능을 수행하도록 구성되어 있는 요소들의 배열을 말한다.

발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커는 그 산물이 살균 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양 요구 균주에 대한 독립 영양성 등을 제공하는 유전자이다. 박테리아의 선택가능한 마커의 예는 바실러스 리케니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예를 들어 앰피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커이다.

전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질 전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.　적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 통상적으로, 하나 이상의 제한 효소로 DNA 서열 및 벡터를 절단하고 단편들을 함께 결찰하여 최종적으로 발현될 DNA 서열을 벡터에 결합시킨다. 제한 효소 소화처리 및 결찰은 당업자들에게 익히 알려졌다.

본 발명의 일 실시예에서는 pUC118 및 pCold I (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 클로닝 및 단백질 발현 벡터로 사용하였다.

재조합 숙주 세포(재조합 미생물)

상기 (b) 단계는 형질전환체를 제조하는 단계로, 본 발명은 또한 본 발명의 α-아밀라아제을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 또는 재조합 숙주 세포를 포함한다.

숙주 세포는 변이체의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.

원핵 숙주 세포는 임의의 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아일 수 있다. 그램-양성 박테리아에는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 게오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 그램-음성 박테리아에는 캄필로박터, 에스케리키아 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라 및 유레아플라스마가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

박테리아 숙주 세포는 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 라우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 바실러스 세포일 수 있다.

본 발명의 대사 조작 미생물은 생물의 게놈 내에서 또는 생물 내에서 게놈 외부에 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 미생물은 야생형 생물체에서 발견되는 유전자의 감소(reduction), 파괴(disruption) 또는 적중(knockout) 및/또는 이종(heterologous) 폴리뉴클레오티드의 도입(introduction)을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서는 에스케리키아 콜라이, E. coli JM109 및 BL21 (DE3)를 클로닝 및 단백질 발현 숙주로 사용하였다.

숙주 세포로 DNA를 도입하기 위한 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다.

박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 분자 생물학 분야에서 일반적이며 잘 알려져 있다. 예를 들어, 당해 유전자의 서열이 공지되어 있는 경우, 적합한 게놈 라이브러리가 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성될 수 있으며, 원하는 유전자 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 일단 당해 서열이 단리되면, 그 DNA는 표준 프라이머-유도 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용하여 증폭되어 적절한 벡터를 이용한 형질전환에 적합한 양의 DNA가 얻어질 수 있다. 이종 숙주에서의 발현을 위한 코돈 최적화 도구는 쉽게 이용가능하다. 코돈 최적화를 위한 일부 도구는 숙주 유기체의 GC 함량을 기반으로 하여 이용가능하다. 일단 관련 경로 유전자가 동정되어 단리되면, 이 유전자는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 적합한 발현 숙주를 형질전환시킬 수 있다.

형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection)은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자 폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 비롯한 다수의 수단 중에서 하나에 의해 달성될 수 있다

"재조합 숙주세포" 및 "재조합 미생물"라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 본 발명의 특정 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하거나 과다 발현하기 위하여 유전적으로 변형된 미생물을 지칭한다.

효소 생산

(c) 단계는 형질전환체를 배양하여 α-아밀라아제를 생산하는 단계로, 본 발명은 또 다른 관점에서 본 발명의 재조합 숙주 세포를 α-아밀라아제의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 α-아밀라아제를 회수하는 단계를 포함한다.

구체적으로, 상기 재조합 미생물을 탄소원을 함유하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양된 미생물로부터 α-아밀라아제 효소를 발현 정제하는 것을 특징으로 하는, α-아밀라아제 생산 방법을 제공한다. 이때 재조합 미생물의 배양 및 α-아밀라아제 수득과정은 통상적으로 알려진 배양방법 및 단백질 분리정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 배지는 적합한 탄소 기질을 포함하여야 한다. 적합한 기질은 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 C1 기질 또는 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소 공급원을 사용할 수 있다.

단당류, 예를 들어 글루코스 및 프룩토스, 올리고당류, 예를 들어 락토스 또는 수크로스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로오스 또는 그 혼합물과, 재생 가능한 공급재료로부터의 비정제된 혼합물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 탄소 기질은 글루코스, 수크로스, 셀룰로스, 글리세롤 등이다. 가장 바람직하게는 글루코스를 사용할 수 있다.

적절한 탄소 공급원 외에, 배지는 적합한 미네랄, 염, 보조 인자, 완충액 및 아밀라아제 생성에 필요한 효소 경로의 촉진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 공지된 기타 성분을 포함할 수 있다.

배양 조건 역시 숙주세포에 따라 적합한 조건을 선택할 수 있으며, 전형적으로, 세포는 적절한 배지에서 약 25℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 성장시킨다. 본 발명에서 적합한 성장 배지는 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 액체 배지, 사부로 덱스트로스(Sabouraud Dextrose, SD) 액체 배지 또는 효모 배지(Yeast Medium, YM) 액체 배지와 같이 일반적으로 상업적으로 제조된 배지이다. 일 실시예에서는 LB 브로스(액체 배지)를 사용하였다.

배양에 적합한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0이며, 여기서 pH 6.0 내지 pH 8.0이 초기 조건에 바람직하다. 배양은 호기 조건 또는 혐기 조건 하에 실시될 수 있다.

본 발명의 방법은, 적합한 배지 중에서 수행된 실험실 또는 산업적 발효조에서 그리고 아밀라아제가 발현 및/또는 단리되게 하는 조건 하에서 진탕 플라스크 배양, 또는 소-규모 또는 대-규모 발효(연속, 회분식, 유가식, 또는 고체상 발효)에 의해 배양될 수 있다.

α-아밀라아제가 영양 배지 내로 분비된다면, α-아밀라아제는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. α-아밀라아제가 분비되지 않는다면, 이는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이들에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.

제한되는 것은 아니지만, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기영동 절차(예를 들어, 예비 등전점 전기영동), 분별 용해성(예를 들어, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어, 문헌[Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조)을 포함하는 본 발명이 속하는 분야에 공지된 다양한 절차에 의해 정제되어 실질적으로 순수한 α-아밀라아제를 획득할 수 있다.

<α-아밀라아제>

본 발명은 다른 관점에서 상기 방법에 의해, 즉, M. thermotolerans DAU221를 이용하여 수득한 α-아밀라아제 효소 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 α-아밀라아제는 말토제닉 아밀라아제(maltogenic amylase, MAase)로서, 구조적으로는 글리코사이드 하이드로라아제(GH) 패밀리 13에 속하고 (β/α)8 원통형 구조를 기본 골격으로 하여 4군데의 공통적인 상동 부위 서열을 공유하면서 서로 차별되는 다양한 기질 특이성을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, α-D-(1,6)-글리코사이드 결합보다 α-D-(1,4)-글리코사이드 결합을 더 잘 분해하며, 최종적으로 수용성 전분(slouble starch) 기질을 주로 말토오스 단위로 분해한다.

본 발명의 α-아밀라아제는 상기 마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) 유래 α-아밀라아제 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드는 전형적으로, 원하는 활성의 손실이나 중대한 손실 없이, 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 허용할 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 단백질의 효소적 동화 또는 이화 활성을 갖는다면, 상기 기준 폴리펩티드(reference polypeptide)와 상이한 아미노산 서열을 갖는 변형되거나 변이된 폴리펩티드 역시 포함한다.

본 발명의 유전자와 폴리펩티드/효소에 대한 서열은 인터넷에서 이용 가능한 자료베이스를 사용하여 용이하게 확인할 수 있다( http:(//)eecoli.kaist.ac.kr/main.html). 이에 더하여, 이들 아미노산 서열과 핵산 서열은 당분야에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(BLAST 등)을 이용하여 동일성에 대하여 용이하게 비교할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 수득한 α-아밀라아제 유전자(AmyA)는 33 아미노산 분비 신호 펩타이드로 구성되는 761-잔기 단백질을 코딩하고 있고, 정제된α-아밀라아제는 분자량 약 70 내지 90 kDa, 바람직하게는 80 kDa을 가지고, 142 nt 에서 ATG으로 시작하고 761 아미노산으로 단백질을 인코딩하는 2,425 nt에서 TAA로 끝난다.

본 발명의 AmyA 아미노산 서열(서열번호 1)은, Geobacillus sp . WCH70 (YP_002948858, 74%, 84%) 아밀라아제와 74% 동일성(identitiy) 및 84% 상동성(homology)을 가지고, Thermoanaerobacter pseudothanolicus ATCC 33223 (YP_00166467)와도 각각 71% 및 80%, T. mathranii A3 (YP_003677650)와 71% 및 80%, Halomicrobium mukohataei DSM 12286 (YP_003176054)와 60% 및 74%, 그리고 Streptococcus parauberis (WP_003104300)와 56% 및 73%의 동일성 및 상동성을 가진다.

뿐만 아니라, 본 발명의 AmyA은 글리코사이드 하이드로라아제 패밀리 13 (GH13)의 4개의 일치 영역 특성으로, 영역 I, DXXXNH; 영역 II, GXRXDXXZZ; 영역 III, (G/A)EZZZ; 및 영역 IV, XXBBHD의 보존 서열 모티프를 공유한다.(X는 소수성 아미노산, B는 친수성 아미노산, Z는 특이성에 대해 중요한 아미노산)(표 1 참조)

한편, 본 발명의 M. thermotolerans 유래 AmyA 유전자에 의해 발현되는α-아밀라아제 효소는 약 pH 6 ~ 7 및 40 ~ 50℃에서 최적으로 활성화된다. 더욱 바람직하게는, 약 pH 6~6.5 및 43~48℃에서, 가장 바람직하게는 pH 6.35 및 44.95℃에서 최적으로 활성화된다.

또한, 본 발명의 M. thermotolerans 유래 AmyA 유전자에 의해 발현되는α-아밀라아제 효소는 Mg² ⁺ 의 존재 하 활성이 가장 최적화된다. 그러나, Cu² ⁺, Fe³ ⁺, Hg² ⁺, Zn² ⁺, 및 EDTA는 상기 효소의 활성을 억제한다.

또한, 본 발명의 M. thermotolerans 유래 AmyA 유전자에 의해 발현되는α-아밀라아제 효소는 유기-용매 내성(Organic-solvent-tolerant)을 가진다. 예를 들어, 헥산, 아세톤, 벤젠 등에 대해 강한 내성을 가지고, 특히, 헥산에 대해 매우 높은 내성을 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 유기-용매에 대한 내성은 본 발명의 α-아밀라아제가 산업적 적용, 생물 환경 정화, 및 산업적 폐수 처리를 위해 유용할 수 있음을 의미한다.

<말토트리오스 생산>

특히, 본 발명의 M. thermotolerans 유래 AmyA 유전자에 의해 발현되는α-아밀라아제 효소는 수용성 전분을 가수분해함으로써, 말토트리오스를 주요한 생성물로 생산한다.

말토트리오스(maltotrios)는 글루코오스 세 분자가 두 개의 알파-1,4 글루코사이드 결합한 삼당류로서, 무정형 고체로 환원성이 있으며, 식품 분야에 널리 사용되고 있는 기능성 올리고당이다.

그러나, 종래 일반적인 α-아밀라아제 효소는 말토트리오스(G3) 뿐만 아니라, 말토오스(G2), 말토테트라오스(G4), 말토펜타오스 (G5), 말토헥타오스(G6), 및 말토헵타오스(G7) 등과 같은 다양한 올리고당을 함께 생산하는 바, 말토트리오스(G3)만을 분리, 정제하기 위한 여러 공정이 필요하여 과다한 비용이 발생하는 문제점이 있었다. 일부에서는 풀루라네이즈(pullulanase)를 이용하여 플루란을 가수분해하는 방법을 이용하기도 하였으나, 플루란은 고비용이어서 비경제적인 문제점이 있기도 하였다. 본 발명은 저비용의 전분을 이용하면서도, 말토트리오스(G3)를 주요한 생성물로 수득할 수 있기 때문에 이러한 종래 문제점을 해결하고 있다.

주요한 생성물이라 함은 말토 올리고당이 두 종류의 말토 올리고당으로 이루어진 경우에는 전체 말토 올리고당을 기준으로 51 중량% 이상, 세 종류의 말토올리고당으로 이루어진 경우에는 전체 말토 올리고당을 기준으로 40 중량 % 이상, 네 종류의 말토 올리고당으로 이루어진 경우에는 전체 말토 올리고당을 기준으로 30 중량% 이상인 성분을 의미하며, 바람직하게는 30 중량% 내지 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 40 중량% 내지 90 중량%인 것을 의미한다.

상기 전분은 포도당(D-글루코오스)이 축합반응을 일으키면서 길게 연결되어 만들어지는 다당류를 의미하며, 녹말이라고 명칭될 수 있다. 상기 전분은 바람직하게는 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 녹말, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분 및 밀 전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 전분을 포함하는 기질은 바람직하게는 전분 수용액일 수 있으나, 생산되는 물질의 종류 및 용도에 따라서 적절하게 선택될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 α-아밀라아제 효소반응은 40℃ 내지 60℃, 바람직하게는 40℃ 내지 50℃ 및 pH 6.0 내지 pH 8.0, 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 7.0일 수 있다.

상기 α-아밀라아제 효소반응에서 α-아밀라아제 효소의 첨가량 및 반응시간은, 한 유닛의 α-아밀라아제를, 분당 1 μmol의 환원당(reducing sugar)을 유리시키는 효소의 양으로 정의한 후, 말토트리오스를 기준으로 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 방법은 상기 전분을 포함하는 기질에 디브랜칭 효소(debranching enzyme)를 첨가하여 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전처리 단계는 상기 α-아밀라아제를 상기 기질에 반응시키기 전에, 상기 전분의 알파-1,6 글루코시드 결합을 가수분해하여, 알파-1,6 글루코시드 결합을 제거함으로써, 상기 전분을 선형 말토올리고당으로 제조하는 단계일 수 있다. 상기 디브랜칭 효소는 알파-1,6 글루코시드 결합을 선택적으로 가수분해하는 효소를 의미하며, 바람직하게는 아이소아밀레이즈(isoamylase)일 수 있다.

또한, 상기 말토트리오스를 제조하는 제조방법은 말토 올리고당 농축 단계를 추가로 포함할 수 있다

전분에 α-아밀라아제를 첨가하고 반응을 시켜 제조된 반응액 즉, 상기 말토트리오스를 포함하는 말토 올리고당에 유기용매를 가하여 불순물을 제거하고, 상기 불순물을 제거한 말토트리오스를 포함하는 말토올리고당에서 말토트리오스의 함량을 높이는 농축 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유기용매는 알콜일 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알콜일 수 있고, 더욱 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 n-부탄올:메탄올:물을 부피비 4:2:1 [vol:vol:vol]로 함유하는 용매 시스템으로 수행하였다

또한, 상기 말토트리오스 제조방법은 추가로 정제과정을 수행할 수 있다.

상기 정제 과정은 크로마토그래피, 바람직하게는 액체 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 과정일 수 있다. 일예로, 상기 액체크로마토그래피는 젤 투과컬럼을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피를 이용한 정제과정은 상기 농축과정 후에 수행할 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 상기 설명한 재조합 미생물(균주)을 이용하여 말토트리오스를 생산하는 임의의 방법을 모두 포함한다.

본 발명에 따라, 전분로부터 말토트리오스를 주요 산물로 하는 말토트리오스 농축액을 제조할 수 있게 됨으로써, 의약분야, 화학시약분야 또는 식품분야 등 다양한 분야에 사용되는 고순도의 말토트리오스를 쉽고 간단하게 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 기술이 이용하던 값비싼 원료인 플루란을 경제적인 원료인 전분으로 대체함으로써 저가의 비용으로 말토트리오스를 제조할 수 있어 산업적으로 그 이용가치가 매우 높다

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 M. thermotolerans을 이용한 α-아밀라아제의 제조 및 이를 이용한 말토트리오스의 생산에 관한 다양한 용도를 모두 포함한다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 특정 발현벡터와 대장균(Escherichia coli) 숙주세포만을 예시하였으나, 다른 종류의 적절한 발현벡터와 숙주세포를 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

1. 화합물, 벡터 및 세포주(strain)

수용성 전분, 글루코오스(G1), 말토오스(G2), 말토트리오스(G3), 말토테트라오스(G4), 말토펜타오스 (G5), 말토헥타오스(G6), 및 말토헵타오스(G7)를 Tokyo Chemical Industry (TCI, Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. pUC118 및 pCold I (TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 클로닝 및 단백질 발현 벡터로 사용하였다. E. coli JM109 및 BL21 (DE3)를 클로닝 및 단백질 발현 숙주로 사용하였다. M. thermotolerans DAU221를 한국 미생물 보존센터에 기탁하고 (KCCM 11603P, 16S rDNA sequence GenBank ID KC571186) 본 실험에 사용하였다.

2.α-아밀라아제 유전자의 클로닝

포스미드 라이브러리 구축 키트, CopyControl Fosmid Library Production Kit (Epicentre, USA)를 이용하여 M. thermotolerans DAU221의 게놈 라이브러리가 구축되어 있음이 공지되어 있다(Lee et al. 2014).

상기 게놈 라이브러리를 1% 수용성 전분 및 암피실린과 함께 LB(Luria-Bertani) 아가 플레이트 상에서 배양하였다. 37 ℃ 하 2일 동안 배양 후, KI/I2 용액을 α-아밀라아제 활성 검출 시약으로 사용하였다.

α-아밀라아제 생성 재조합으로 분명한 할로존(halo zone)을 가지는 E. coli, ST1, 포스미드 클론(fosmid clone)을 선별하였다. 상기 ST1를 HindIII에 의해 다이제스팅시키고 pUC118 벡터 내로 라이게이션하여 1st 서브클론, ST1H1을 만들었고, 이는 α-아밀라아제 활성을 가졌다. 그리고나서 ST1H1를 BamHI으로 분해하고 pUC118 벡터로 라이게이션하여 2nd 서브클론을 만들어 서열을 확인하였다.

3. 재조합 α-아밀라아제의 발현 및 정제

추정상 신호 펩타이드(putative signal peptide)-인코딩 서열을 제외하고 상기 α-아밀라아제 유전자를 증폭시켰다.

정방향 프라이머, ST1-AmyA-SP를 EcoRI 위치에서 증폭에 이용하였다 (서열 중 이탤릭체 및 밑줄): 5´-CAAGCGGAATTCGCAACGTCCTCCGGTATG-3´ (서열번호 2)및

역방향 프라이머, ST1-AmyA-R를 PstI 위치에서 다음의 서열로 이용하였다 (서열 중 이탤릭체 및 밑줄): 5´-TCAGACTGCAGTTTACTGCCAGGTTAAAACGC-3´(서열번호 3)를 상업적으로 합성함(Bioneer, Korea).

PCR 산물을 콜드 발현 벡터 pCold I에 클로닝하고 E. coli BL21 (DE3) 내로 형질전환시켰다. 0.2 mM 이소프로필-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)로 단백질 과발현 공정 및 His-tag 친화성 크로마토그래피 공정을 이용한 정제를 수행하였다(Lee et al. 2014). 효소 준비의 단백질 농도는 기준으로서(0.2-1 mg/mL) BSA(bovine serum albumin)로 Bradford (1976) 법에 따라 결정하였다. 정제된 효소는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 확인하였다.

4. 효소 활성 분석

전분으로부터 환원 그룹(reducing groups)의 효소적 방출을 측정하기 위한 3, 5-디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid)(DNS)-기반의 방법을 표준 테스트 방법으로 이용하였다 (Miller 1959). 50 μL 1% [wt/vol] 수용성 전분 (Sigma-Aldrich); 75 μL의 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 6.0); 효소 용액 (≒ 1 μg)을 포함하는 최종 부피가 250 μL인 반응 혼합물을 50 ℃에서 20분 동안 배양하였다. 배양 후, 750 μL DNS 용액을 첨가하고, 상기 혼합물을 10분 동안 끓였다(boiling). 한 유닛의 α-아밀라아제를, 분 당 1 μmol의 환원당(reducing sugar)을 유리시키는 효소의 양으로 정의하였다. 말토트리오스를 기준으로 사용하였다.

AmyA 상 적정 pH를 50 mM 시트레이트 버퍼 (pH 3.0-6.0), 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 6.0-8.0), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0-9.0), 및 50 mM 글리신-NaOH 버퍼(pH 9.0-10.6)로 측정하였다. AmyA 상 pH 안정성은 각 버퍼로 1시간 동안 4 ℃에서 전-처리하고, 그리고나서 전-처리된 AmyA은 수용성 전분과 반응하였다. AmyA 상 최적 온도는 다양한 온도 범위(20-80℃)에서 측정하였다. 온도 안정성은 각 온도로 1시간동안 전-배양되고, 그리고나서 전-배양된 AmyA은 수용성 전분과 반응하였다. 금속 이온의 영향은 반응 혼합물 중 10 mM 최종 농도에서 분석되었고, 이는 1 시간동안 4 ℃에서 전-배양되었다.

테스트 이온들은 Ca² ⁺, Cs² ⁺, Cu² ⁺, Fe³ ⁺, Hg² ⁺, Li⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Mg² ⁺, Mn² ⁺, Zn² ⁺, 및 EDTA이었다. AmyA 상 유기 용매의 영향은 20% [vol/vol] 아세톤, 벤젠, n-부탄올, 클로로포름, 에탄올, 헥산, 및 메탄올로 측정하였다. 기질을 제외하고 전-반응 혼합물을, 20 ℃에서 200 rpm으로 2 시간 동안 전-배양하였다. 전-배양 후, 수용성 레이어 샘플들을 수집하고 효소 활성을 측정하는데 사용하였다.

Km 및 Vmax 값의 결정을 위해, 분석은 0.1-1 mg/mL 농도에서 기질을 함유한다. 동력학 파라미터(Kinetic parameter)들을 다양한 기질 농도에 대하여 SWIFT II Applications software (Amersham Bioscience, USA)를 이용하여 Lineweaver-Burk plots으로부터 수득하였다. 각 반응 샘플들을 어떠한 첨가물 없이 20 mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 6.0에서 50 ℃ 하 반응된 대조군과 비교하였다.

5. 말토트리오스의 산물에 대한 최적화를 위한 실험 디자인

시간(X1), 온도(X2), 및 배지의 최초 pH (X3)를 최적화를 위한 첫 실험의 독립 변수로서 선별하고, 말토트리오스 수율 (Y)을 종속 결과(출력) 변수로서 이용하였다. CCD(central composite design) 기반의 RSM(Response surface methodology)를, AmyA를 이용하는 말토트리오스 생산 조건을 최적화하고 다음의 다항식 모델에 맞도록 노출시켰다:

Y = β₀+ ∑β_iX_i + ∑β_ijX_iX_j + ∑β_iiX_i ²

이 때, Y는 예측된 반응(predicted response)이고, X_i 및 X_j 는 변수이며, β₀ 는 상수, β_i 는 선형 계수, β_ij 는 상호작용 계수, 및 β_ii 는 2차 계수이다. 회귀 분석 및 계수의 평가는 통계학적 소프트웨어 디자인-엑스퍼트(Version 8.0.7.1; Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA)를 이용하여 수행하였다. 각 다른 조건은 상기 표준 효소 분석 방법에 의해 반응되었다.

6. TLC(thin-layer chromatography) 분석

50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 6.0) 중 0.1 mg 기질을 함유하는 상기 반응 혼합물 (20 μL)을 정제된 효소(0.5 μg)로 50 °C에서 배양하였다. 반응 산물의 TLC를, 실리카 겔- 코팅된 알루미늄 시트(Kieselgel 60 F254; Merck, Darmstadt, Germany) 상에서 n-부탄올:메탄올:물을 부피비 4:2:1 [vol:vol:vol]로 함유하는 용매 시스템으로 수행하였다 (Kobayashi et al. 1992). 상기 크로마토그램을 아닐린-디페닐아민 시약(4 ml 알라닌, 4 g 디페틸아민, 200 ml 아세톤, 및 30 ml의 85% 인산)으로 분무하고 180 ℃에서 10분 동안 베이킹하여 탄수화물 스팟을 가시화하였다.

7.HPLC(High performance liquid chromatography) 분석

반응 산물을 이원 펌프(1525), 칼럼 오븐, 오토-샘플러(2707), ELS(evaporative light scattering) 검출기(2424), 및 디올 칼럼(Inertsil Diol 5 μm × 4.6 mm × 250 mm, GL Sciences, Japan) 를 구비한 Waters HPLC 시스템 상에서 분석하였다. 상기 샘플들을 70:30 아세토니트릴 및 물 이동상을 이용하여 수행하였다. 샘플 주입 부피는 5 μL이고, 이동상은 1 mL/min 유속에서 프로그래밍되었다.

8.뉴클레오타이드 서열 어세션 번호

M. thermotolerans DAU221의 말토트리오스-생성 α-아밀라아제 유전자에 대한 뉴클레오타이드 서열은 어세션 넘버 KJ509613 하 GenBank 데이터베이스 내 기탁되어 있다. 이를 서열번호 1로 표시하였다.

실시예 1 : M. thermotolerans DAU221 으로부터 amyA 의 유전자 클로닝 및 서열 분석

M. thermotolerans DAU221 유래의 포스미드 라이브러리에서 다수의 형질전환체는 전분 감소 활성(degrading activity)을 보여주었다. 가장 강한 전분 감소 활성을 가지는 형질전환체, ST1를 선별하여, HindIII 효소 절단, 이어서 BamHI 효소 절단으로 서브클로닝하였다. 완전 전분 감소 유전자를 포함하는 형질전환체, ST1H1B2는 2,803 뉴클레오타이드로 구성되어 있다. amyA 유전자는 142 nt 에서 ATG으로 시작하고 761 아미노산으로 단백질을 인코딩하는 2,425 nt에서 TAA로 끝난다.

상기 시그널 펩타이드 서열을 SignalP 서버 (http://www.cbs.dtu.dk./services/SignalP) (Peterson et al. 2011)를 이용하여 분석하였다.

특히, MKKKKNVLRCLGSSIALTATVGLSTLSAQQAEAATSS~서열 중 잠재적 절단 위치를 Ala33 및 Ala34 사이에서 예측하였다. AmyA의 추측되는 아미노산 서열을 BLAST를 이용하여 다른 박테리아 α-아밀라아제 서열과 비교하였다. 가장 높은 동일성(identitiy) 74% 및 상동성(homology) 84%가 Geobacillus sp. WCH70 (YP_002948858, 74%, 84%) 아밀라아제로 발견되었고, 이어서 Thermoanaerobacter pseudothanolicus ATCC 33223 (YP_00166467, 71%, 80%), T. mathranii A3 (YP_003677650, 71%, 80%), Halomicrobium mukohataei DSM 12286 (YP_003176054, 60%, 74%), 및 Streptococcus parauberis (WP_003104300, 56%, 73%). 또한, AmyA가 글리코사이드 하이드로라아제 패밀리 13 (GH13)의 4개의 일치 영역 특성으로 보존 서열 모티프를 공유하는 것을 발견하였다: 영역 I, DXXXNH; 영역 II, GXRXDXXZZ; 영역 III, (G/A)EZZZ; 및 영역 IV, XXBBHD.

X는 일반적으로 소수성 아미노산이고, B는 일반적으로 친수성 아미노산이며, 그리고 Z는 특이성에 대한 중요한 아미노산이다. 영역 III에서 Glu는 양성자 공여자(donor)로서 알려져 있고, 영역 II에서 Asp는 촉매 뉴클레오타이드로 알려져 있으며, 영역 IV에서 Asp 및 영역 I과 IV에서 His는 결합 기질에 기여한다(MacGregor et al. 2001). 상기 4개의 높은 보존 영역 및 5개 아미노산 잔기, 영역 I에서 His, 영역 II에서 Glu, 영역 III에서 Asp,및 영역 IV에서 His와 Glu를 M. thermotolerans DAU221로부터 AmyA 에서 확인하였다 (표 1).

그러나, 마지막 2개의 아미노산 잔기 중, 영역 II 에서 Lys 및 His는 기질 특이성에 결정적으로 중요한 것으로 알려져있고, Lys는 Leu로 대체되었다. 2개의 아미노산, Lys 및 His는 α-1, 4-글리코사이드 결합을 위한 특이성을 가지는 효소에서 나타난다 (Ballschmiter et al. 2005; MacGregor et al. 2001). 또한, NCBI 데이터 뱅크에서 AmyA는 21-32% 동일성의 상동성으로 발견되고, 박테리아 말토올리고사카라이드-생성 아밀라아제와 35-46% 유사하였다.

실시예 2 : AmyA 효소의 정제

pCold I-amyA 로 형질전환된 E. coli BL21 (DE3)를 0.2 mM IPTG로 유도하여 밤새 15 ℃에서 배양하였다. E. coli 세포들의 붕괴(disruption) 후, 재조합 AmyA를 His-tag 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 변성된 효소의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 80 kDa로 판명되었다 (도 1).

정제된 AmyA 에서 온도, pH , 금속 이온 및 유기 용매의 영향

정제된 AmyA는 소듐 포스페이트 버퍼 중 pH 6.0에서 50 °C 하 최적으로 활성화되었다(도 2a, 2b). 또한, AmyA를 30 ℃, 40 ℃, 및 50℃에서 각 배양 시간 1, 2, 4, 6, 8, 10, 및 12 시간 동안 전-배양하여 높은 온도 안정성을 분석하였다(도 2c).

30 ℃의 경우, 상기 전-배양된 AmyA는 약 90% 이상의 활성을 6시간까지, 그리고 80% 활성을 12시간까지 각각 유지하였다. 40℃인 경우, 상기 전-배양된 AmyA는 약 90% 이상의 활성을 2시간까지, 80% 활성을 4시간까지, 70% 활성을 8시간까지, 그리고 60% 활성을 12시간까지 각각 유지하였다. 50℃인 경우, 전-배양된 AmyA는 약 50% 활성을 1시간까지, 30% 활성을 6시간까지, 그리고 20% 활성을 12시간까지 각각 유지하였다.

반응 혼합물에 첨가된 다양한 금속 이온의 영향을, 반응 혼합물 중 최종 농도 10 mM에서 테스트하였다. 특히, 상기 효소 활성은 Mg² ⁺ 의 존재 하 가장 높음이 판명되었다(103±3.0% 잔기 활성).

상기 효소 활성이 Co² ⁺ (53%) 및 Ni² ⁺ (77%)존재 하 반으로 감소되는 반면, Ca² ⁺, Cs²⁺, Li⁺, 및 Mn² ⁺ 의 존재 하에서는 단지 경미하게 감소하였다(93~98% 잔기 활성). 그러나, Cu² ⁺, Fe³ ⁺, Hg² ⁺, Zn² ⁺, 및 EDTA는 강하게 이들의 활성을 억제함이 판명되었다 (표 2).

흥미롭게도, 높은 농도의 NaCl (0.5, 1, 1.5, 2, 3, 및 4 M)는 AmyA의 활성을 약간 감소시켰다. 효소는 2 M까지의 존재 하에서 중요한 활성을(50%) 보유하는 것이 확인되었다 (도 3).

유기-용매 내성의(Organic-solvent-tolerant) 아밀라아제가 산업적 적용, 생물 환경 정화, 및 산업적 폐수 처리를 위해 상당히 매력적임을 보여주었다. 유기 용매에 대한 뛰어난 내성은 20% [vol/vol] 헥산으로 20 ℃ 및 200 rpm에서 2 시간 동안 효소를 전-배양한 후 관찰되었다 헥산은 AmyA 활성에 거의 영향을 끼치지 않았다(약 99±1.4% residual activity).

그리고 AmyA는 아세톤 및 벤젠에서 약 90% 활성 (각각 88±0.4%, 93±1.96%)을 유지하였다. 효소 활성이 각각 에탄올(61±4.7%), 메탄올(56±0.3%), n-부탄올 (51±5.7%), 및 클로로포름(29±1.1%) 존재하에서 50%까지 감소됨이 확인되었다 (표 3).

Nesterenkonia sp . 유래 아밀라아제는 20%, 50%, 80% 벤젠, 클로로포름, 톨루엔 및 사이클로헥산에서 100일 이상의 반감기를 보였다(Shafiei et al. 2011).

또한, 동력학 파라미터, 즉, AmyA의 Km 및 Vmax는 수용성 녹말(기질로서)의 상이한 농도의 존재에서 결정되었다. 수용성 녹말의 가수분해에 대한 Km 및 Vmax 값은 각각 1.08 mg/mL 및 1.736 mmol 말토트리오스/mg 단백질/min이다(데이터 도시 않음).

실시예 3 : RSM 에 의한 말토트리오스 산물에서 시간, 온도 및 pH 의 최적화

반응표면분석법(Response Surface Metholodogy, RSM)를 이용하여 M. thermotolerans DAU221 유래 AmyA에 의한 말토트리오스 산물에서 다양한 조건의 영향을 검토해보았다. 시간 (X1), 온도 (X2), 및 시작 pH (X3) 를 포함하는 3개의 독립적 변수에 대하여 20개의 다른 조건을 조정하고 말토트리오스 산물의 강화에 최적화하였다.

상기 수행된 20개의 실험의 디자인 및 결과들을 표 4에 도시하였다.

이어서, 변량 분석의 관점에 적합한 (ANOVA) 이차 다항식 모델의 결과를 표 5에 나타내었다.

이차 다항식 기능은 실험값에 적합하였고, 결과적으로 다음의 회귀 방정식으로 나타내었다(방정식 2):

Y = 0.11 + 0.009806X₁ - 0.022X₂ + 0.014X₃

- 0.002951X₁X₂ + 0.002916X₁X₃ - 0.004159X₂X₃

- 0.012X₁ ² - 0.024X₂ ² - 0.025X₃ ² (2)

이 때 Y는 말토트리오스 수율(mg)이다. 말토트리오스 산물의 ANOVA로부터 모델 F-값 7.19는, 이러한 모델이 유의미함을 내포하고 있다. P-값은 각 계수의 중요도를 체크하는 수단으로 사용되었고, 다음으로 테스트 변수 사이에서의 상호작용의 패턴을 이해하는데 필요하였다(Gao et al. 2012).

상기 모델 P-값 < 0.05은 이러한 모델이 >95% 신뢰수준에서 통계학적으로 유의미한 것으로 간주된다(Ghevariya et al. 2011). 결정 계수 값(R2 = 0.8662)은 전체 변수의 단지 13.38% 만 모델에 의해 설명되지 않음을 가리킨다. 조정된 결정 계수 값 (Adj R2 = 0.7457) 은 모델의 높은 중요성에 대해 매우 높이 뒷받침한다(Khuri and Cornell 1987).

회귀 변수 평가의 결과는 온도 (X2) 및 pH (X3) 값의 선형(liner) 및 제곱(square) 관점이 말로트리오스 산물에서 유의미한 영향을 보여줌을 나타냈지만(P < 0.05), 시간 (X1) 및 상호작용의 선형 및 제곱 관점은 유의미하지 않음을 나타내었다(P > 0.05).

그 후, 3-차원 (3D) 반응 표면은 상수로서 시간으로 말토트리오스 산물에서 pH 및 온도의 영향을 설명하였다(도. 4).

상기 모델은 정지 포인트(stationary point)에서 1% 수용성 녹말에서 0.12mg의 최대 말토트리오스 산물을 예측한다. M. thermotolerans DAU221 유래 AmyA의 1% 수용성 녹말(표준 반응 혼합물 중 약 0.5mg)로부터 말토트리오스 컨버싱 속도(conversing rate)는 대략 24%이다. 정지 포인트에서, X1, X2, 및 X3의 3가지 변수에 대한 최적 수준은 각각 코딩 단위 관점에서 각각 0.009806, -0.022, 및 0.014, 즉, 시간 1.76 h, 온도 44.95 ℃ 및 pH 6.35이다.

실시예 4 : 수용성 녹말에서 작용 모드

AmyA의 반응산물을, 기질로서 수용성 녹말을 이용하여 50 °C에서 검토하고 TLC 및 HPLC에 의해 분석하여 작용 모드를 결정하였다 시간 경과에 의존하는 TLC 결과는 도 5에 도시하였다

AmyA는 수용성 녹말을, 주요 산물로 말토트리오스 및 최초 반응 단계에서 작은 산물로 말토헥소스로 가수분해하였다. 말토트리오스는 HPLC에 의해 3시간 동안 배양된 샘플에서 분석되었다 (도 6).

이러한 결과들은 본 발명의 AmyA가 말토트리오스-생성 박테리아 α-아밀라아제의 유력한 후보군임을 보여준다. 또한, 본 발명의 AmyA가 말토트리오스 특이적 생산에 매우 효과적임을 보여준다. 그러므로, 본 발명은 크게 향상된 생성능을 가지는 말토트리오스 생산방법으로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11603P

수탁일자 : 20141110

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Dong-A University <120> Maltotrios-Producing Amylase derived from Microbulbifer sp. and the Process for Producing Maltotrios therewith <130> pn1411-342 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 761 <212> PRT <213> alpha amylase aminoacid sequence <400> 1 Met Lys Lys Lys Lys Asn Val Leu Arg Cys Leu Gly Ser Ser Ile Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ala Thr Val Gly Leu Ser Thr Leu Ser Ala Gln Gln Ala Glu 20 25 30 Ala Ala Thr Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Thr Pro Lys Asp Val 35 40 45 Val Tyr Gln Ile Ile Thr Asp Arg Phe Val Asp Gly Asp Thr Ser Asn 50 55 60 Asn Ile Pro Thr Gly Ser Ser Ala Ser Leu Phe Asp Asp Pro Asp Gln 65 70 75 80 Asp Gly Leu Gly Asn Gly Asp Asp Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Gly Asp 85 90 95 Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Ser Tyr Leu Lys Asn Met Gly Val 100 105 110 Thr Ala Val Trp Ile Ser Ala Pro Tyr Glu Asn Arg Asp Thr Pro Ile 115 120 125 Tyr Asp Tyr Gln Gln Ser Gly Gly Tyr Asp Leu Trp Thr Ser Phe His 130 135 140 Gly Tyr His Val Arg Asn Tyr Phe Ala Thr Asn Lys His Phe Gly Leu 145 150 155 160 Met Gln Asp Phe Glu Ala Leu Arg Asp Ala Leu His Ala Asn Gly Ile 165 170 175 Lys Leu Ile Ile Asp Phe Val Ser Asn His Thr Ser Arg Gly Thr Asn 180 185 190 Pro Thr Ser Gly Asn Ser Pro Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Glu Pro Asp 195 200 205 Lys Asp Ser Asn Gly Asp Tyr Val Phe Asp Ser Asn Gly Asn Pro Val 210 215 220 Asp Tyr Asn Ser Asp Gly Asn Val Glu Asn Leu Leu Ala Asp Pro Asn 225 230 235 240 Tyr Asp Ile Asn Gly Trp Phe His Asn Leu Gly Asp Arg Gly Ser Asp 245 250 255 Asp Thr Gln Phe Gly Tyr Arg Phe Lys Asp Leu Gly Ser Leu Ser Asp 260 265 270 Phe Ser Thr Glu Asn Ala Ala Val Val Glu His Leu Glu Lys Ala Ala 275 280 285 Thr Phe Trp Lys Ser Lys Gly Val Asp Gly Phe Arg His Asp Ala Thr 290 295 300 Leu His Met Ser Pro Ser Phe Ala Lys Gly Phe Lys Asp Ala Ile Asp 305 310 315 320 Ser Ala Ser Gly Gly Pro Leu Thr His Phe Gly Glu Phe Phe Ile Gly 325 330 335 Arg Pro Asp Pro Lys Tyr Asp Glu Tyr Gln Ser Phe Pro Asp Arg Thr 340 345 350 Gly Ile Asn Asn Leu Asp Phe Glu Tyr Phe Arg Ala Ser Thr Asn Ala 355 360 365 Phe Gly Tyr Phe Ser Glu Thr Met Ser Ala Phe Gly Gln Met Leu Ile 370 375 380 Ala Thr Ser Ala Asp Tyr Glu Tyr Glu Asn Gln Ala Val Thr Phe Leu 385 390 395 400 Asp Asn His Asp Val Thr Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Pro Asn Asp Lys 405 410 415 Pro Tyr His Ala Ala Leu Ala Thr Leu Leu Thr Ala Arg Gly Thr Pro 420 425 430 Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ser 435 440 445 Asp Ile Ser Gly Arg Val Phe Met Glu Arg Glu Thr Ser Phe Asp Gln 450 455 460 Thr Thr Thr Ala Tyr Lys Ile Ile Gln Ala Leu Ser Ala Leu Arg Arg 465 470 475 480 Gln Asn Glu Ala Val Ala Tyr Gly Glu Thr Ala Ile Leu Tyr Ser Ser 485 490 495 Asp Asp Val Leu Val Phe Lys Arg Gln Phe Tyr Asp Lys Gln Val Ile 500 505 510 Val Ala Val Asn Arg Gln Pro Asp Leu Ser Phe Thr Val Pro Ala Ile 515 520 525 Asn Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Tyr Asp Asp Val Leu Asn Gly Leu 530 535 540 Leu Tyr Gly Asp Ser Met Thr Val Asn Asn Gly Lys Ile Gly Ser Phe 545 550 555 560 Thr Leu Ala Gly Gly Glu Val Ser Val Trp Ser Tyr Asn Pro Asp Leu 565 570 575 Gly Thr Ala Ile Pro Arg Ile Gly Asp Val Val Ser Thr Met Gly Arg 580 585 590 Ala Gly Asn Thr Val Tyr Ile Tyr Gly Thr Gly Leu Gly Gly Thr Val 595 600 605 Thr Val Lys Phe Asp Ser Thr Ala Ala Thr Val Val Ser Asn Ser Asp 610 615 620 Thr Met Ile Glu Ala Ile Val Pro Asn Val Ser Ala Gly Ala Arg Gln 625 630 635 640 Ile Thr Val Thr Lys Gly Thr Asn Val Ser Asn Gln Phe Arg Tyr Glu 645 650 655 Val Leu Ser Asp Asp Lys Asn Gln Val Ile Phe Lys Val Asn Ala Thr 660 665 670 Thr Ser Trp Gly Glu Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asp Ile Pro Glu Leu 675 680 685 Gly Ser Trp Asp Thr Ser Lys Ala Val Gly Pro Phe His Thr Pro Asn 690 695 700 Tyr Pro Glu Trp Phe Leu Pro Val Ser Val Pro Lys Asn Thr Thr Ile 705 710 715 720 Gln Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Val Thr Trp Glu 725 730 735 Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ile Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Gly Thr 740 745 750 Leu Asp Thr Ser Val Leu Thr Trp Gln 755 760 <210> 2 <211> 2286 <212> DNA <213> alpha amylase DNA sequence <400> 2 atgaaaaaga aaaaaaatgt attgcgatgt ttgggatctt ccattgcgct gaccgccaca 60 gtcggcttga gcacgctatc agcacagcaa gcggaagcgg caacgtcctc cggtatgctc 120 tccccggtca ctcctaagga cgtcgtttac cagattatta ccgaccgctt tgtcgacggc 180 gatacttcca acaacatccc gacaggatcg agcgccagtc tgtttgacga tccagaccag 240 gacggcctcg gtaacggaga cgacctgaaa ctgtatcagg gcggcgattg gcaggggatc 300 atcgataaaa tttcctacct gaaaaacatg ggcgttaccg cggtgtggat ttccgccccc 360 tacgaaaacc gcgatacgcc aatttacgac taccagcaga gcggtggcta cgacctctgg 420 accagcttcc acggttatca tgtgcgcaac tatttcgcca ccaacaagca cttcggcctg 480 atgcaggatt tcgaagcgct gagggacgcg ctgcacgcca acggcataaa gctcattatc 540 gattttgtat ccaaccatac gagccgcggc accaacccga ccagcggcaa ctcaccggag 600 gacggcaagc tgtacgagcc tgacaaggac agcaacggcg actatgtctt tgactcaaac 660 ggcaaccctg tagactacaa ctccgatgga aacgtcgaaa acctgctcgc cgatcccaac 720 tatgacatca acggctggtt ccacaacctc ggtgaccgag gcagtgatga cacacagttc 780 gggtaccgct ttaaggactt gggctctctg tctgatttct ccactgagaa cgcagcggtt 840 gtagaacatc tggaaaaagc ggccaccttc tggaaatcca aaggcgtgga tggtttccgc 900 cacgacgcaa ccctgcatat gagcccctca ttcgccaagg ggttcaagga tgcgattgac 960 tccgcaagcg gtggtccgct tacccacttc ggagagttct ttatcggacg tccagacccg 1020 aaatacgatg aataccagtc tttcccggat cgcacgggta taaacaatct cgattttgag 1080 tacttccgcg catcaaccaa cgctttcggc tacttctctg agacgatgag tgcattcggc 1140 cagatgctga ttgcgaccag cgcagattac gagtacgaga atcaggcagt cactttcctc 1200 gacaaccatg acgtcacccg attccgctac attcaaccaa acgacaaacc ttaccatgcg 1260 gctctggcca cactgctcac cgcacgcggc acgcccaaca tctactacgg tacagaacaa 1320 tacctgacct ctgccgacag tagcgacatt tccgggcggg tgtttatgga aagggagacc 1380 tcgttcgatc agacaaccac ggcctacaag atcattcagg ccctgtccgc actgcgcagg 1440 cagaatgaag cggtcgccta tggcgaaacc gccatacttt acagcagcga cgatgtgctt 1500 gttttcaaac ggcagttcta tgacaagcag gtgattgtcg cggtaaaccg ccaaccagac 1560 ctgtccttta ctgtcccggc aatcaatacg accctgcctg cgggaagcta cgatgacgtg 1620 ctgaacggcc tgctgtacgg ggactccatg accgtcaaca acggaaagat aggctccttt 1680 acactcgcag gtggcgaagt cagtgtctgg tcttacaatc ccgatctggg caccgccatt 1740 ccccgcattg gcgatgtcgt gtccacaatg ggacgcgctg gaaataccgt ctacatatac 1800 ggcacaggtc tcggcggcac cgttaccgtc aaatttgaca gcacagcggc aacggtagtg 1860 tccaacagcg atacgatgat cgaagcaatc gtacccaatg tcagtgcggg agccagacag 1920 attacggtca cgaaaggtac caacgtcagc aatcagttcc gctacgaggt attgtccgac 1980 gataagaatc aggtcatctt taaagttaac gccactacca gctggggaga gaatatctat 2040 atcgtcggtg atattccgga actgggaagc tgggacacct ccaaagctgt aggccccttc 2100 catacgccga actatccgga gtggtttctg ccggtctcag tgccgaagaa caccaccatt 2160 caatacaagt tcatcaaaaa ggacagcagt ggcaatgtaa cctgggaagg ggggaacaac 2220 cgctccatta catctccctc ttcatccacc gggactctgg atacaagcgt tttaacctgg 2280 cagtaa 2286

Claims

마이크로불비퍼 써모토레란스(Microbulbifer thermotolerans) DAU221(KCCM11603P) 균주에서 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 말토트리오스 생성용 α-아밀라아제.
제1항에 있어서,
상기 α-아밀라아제는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 유전자에서 코딩되는 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생성용 α-아밀라아제.
삭제
제1항에 있어서,
상기 α-아밀라아제는 아세톤, 벤젠, 및 헥산으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 유기 용매에 대한 내성을 가지는 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생성용 α-아밀라아제.
삭제
제1항, 제2항 또는 제4항의 α-아밀라아제로 전분 기질을 가수분해시키는 것을 특징으로 하는, 말토트리오스 생산방법.
제6항에 있어서,
상기 전분 기질은 아밀로펙틴, 아밀로스, 가용성 녹말, 쌀 전분, 옥수수 전분, 감자 전분 및 밀 전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 수용성 성분으로 구성된 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생산방법.
제6항에 있어서,
상기 방법은 pH 6 ~ 7 및 40 ~ 50℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생산방법.
제8항에 있어서,
상기 방법은 Mg²⁺존재 하 수행되는 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생산방법.
제8항에 있어서,
상기 방법은 2~3시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생산방법.
말토트리오스 생산을 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 α-아밀라아제를 코딩하는 유전자를 포함하는, 말토트리오스 생산용 재조합 미생물.
제11항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 말토트리오스 생산용 재조합 미생물.