KR101628856B1

KR101628856B1 - 다기능성 베타-자일로시데이즈 b

Info

Publication number: KR101628856B1
Application number: KR1020140083312A
Authority: KR
Inventors: 최대건; 박양순; 윤기홍
Original assignee: 주식회사 씨티씨바이오
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2016-06-21
Also published as: KR20160004673A

Abstract

본 발명은 다기능성 효소인 신규한 베타-자일로시데이즈 B, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 포함하는 조성물, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 이용하면 D-자일로즈를 주성분으로 하는 당류를 분해할 수 있으며, 이러한 방법에 따라 D-자일로즈를 제조할 수 있고, 또한 바이오매스에 상기 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 등으로 산업적으로 활용할 수 있다.

Description

다기능성 베타-자일로시데이즈 B{Mutifunctional beta-Xylosidases}

본 발명은 2 이상의 기질에 대해 효소 활성을 나타내는 다기능성 베타-자일로시데이즈 B, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 포함하는 조성물, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 제조하는 방법, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 이용하여 D-자일로즈를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법, 상기 방법에 따라 D-자일로즈를 제조하는 방법, 또는 바이오매스에 상기 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

자일란(Xylan)은 헤미셀룰로오스의 주요 성분으로 아세틸기, 아라비노실기 및 글루쿠로닐기를 포함하는 치환체를 가지는 다분지β-1,4-linked D-자일로즈 폴리머이다. 자일란을 완전히 분해하기 위해서는 몇몇 효소, 즉 엔도-베타-1,4-자일라나제(endo-β-1,4-xylanase), 베타-자일로시데이즈(β-xylosidase), 알파-아라비노퓨라노시데이즈(α-arabinofuranosidase), 알파-글루쿠로니다아제(α-glucuronidase), 아세틸자일란 에스터레이즈(acetylxylan esterase) 및 페룰산 에스터레이즈(ferulic acid esterase)가 필요하다. 이들 효소 중, 엔도자일라네이즈 및 베타-자일로시데이즈는 자일란 분해에 특히 중요한 활성을 가진다. 엔도자일라네이즈는 자일란 골격의 내부 자일로사이드 결합을 공격하여 자일란을 자일로-올리고사카라이드로 분해하여, 연속해서 베타-자일로시데이즈는 자일로비오스(xylobiose)를 가수분해하며 짧은 자일로-올리고사카라이드를 엔드와이드 어택(endwise attack)으로 D-자일로즈로 가수분해한다. 자일로즈는 자일리톨, 자일루오스 및 에탄올을 포함하는 산물들의 생산을 위한 발효성 당(fermentative sugar)으로 간주된다. 베타-자일로시데이즈는 그러므로 자일란을 완전히 가수분해하기 위해 매우 중요하다.

베타-자일로시데이즈는 다양한 박테리아 및 균류에 의해 생산된다. 몇 가지 예외가 있으나, 박테리아 베타-자일로시데이즈 대다수는 내세포성인데 반해, 균류의 베타-자일로시데이즈는 세포-결합성이거나 외세포성이다. 베타-자일로시데이즈는 아미노산 서열 유사성에 기초해, 글리코실 가수분해효소(glycosyl hydrolases, GHs)의 3, 30, 39, 43, 52, 54, 116 패밀리로 분류된다. 이들 효소는 모노머(monomeric), 다이머(dimeric) 또는 테트라머(tertrameric) 성분이다. 몇몇 베타-자일로시데이즈는 베타-자일로시데이즈 뿐만 아니라 알파-아라비노퓨라노시데이즈 활성도 함께 보이는 이중기능성 단백질인바, 이들은 베타-자일로시데이즈/알파-아라비노퓨라노시데이즈라 명명한다.

아애로모나스(Aeromonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 지오바실러스(Geobacillus) 속, 레이프소니아(Leifsonia) 속, 프리보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토마이시스(Streptomyces) 속, 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter) 속, 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium) 속 및 써모토가(Thermotoga) 속에 속하는 박테리아 균주 유래의 몇몇 효소가 정제되고 이의 특징이 규명되어 왔으나, 최근에는 셀레모나스 루미나티움(Selenomonas ruminantium) 및 지오바실러스 스테아서보필러스(Geobacillus stearothermophilus ) 유래의 베타-자일로시데이즈 구조 및 촉매 잔기에 관한 연구가 집중적으로 이뤄지고 있다.

또한, 2005년부터 자일란을 분해할 수 있는, 패니바실러스(Paenibacillus) 15개 신규 종이 분리되고 규명되어 왔다. 패니바실러스 바르시노넨시스(P. barcinonensis), 및 패니바실러스 커르드라노리티쿠스(P. curdlanolyticus)를 포함한 패니바실러스에서 자일라네이즈가 분리되었다. 비록, 자일로시데이즈/아라비노퓨라노시데이즈 유전자가 패니바실러스 종 JDR-2 (GenBank accession no. ABKS01000022)에서 예견된 것이기는 하나, 베타-자일로시데이즈 및 알파-아라비노퓨라노시데이즈 어떤 것도 패니바실러스 균주에서 생화학적으로 탐지된 바 없다.

본 발명의 발명자들은 산림토에서 패니바실러스 우송엔시스(P. woosongensis)를 분리하고 해당 균주를 한국생명공학연구원 유전자 은행에 2007년 5월 2일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 3953를 부여받았다.

한국특허 공개번호 제10-2012-0132237호

GenBank/EMBL/DDBJ accession number AY847463.1

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 패니바실러스 균주에서 유래한 다기능성 효소인 신규한 베타-자일로시데이즈 B, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 포함하는 조성물, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 제조하는 방법, 상기 베타-자일로시데이즈 B를 이용하여 D-자일로즈를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법, 상기 방법에 따라 D-자일로즈를 제조하는 방법, 또는 바이오매스에 상기 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일 양태로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-자일로시데이즈 B를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 패니바실러스 우송엔시스(기탁번호 KCTC 3953)로부터 신규한 베타-자일로시데이즈 B 효소를 수득하였고, 상기 신규한 베타-자일로시데이즈 B 효소는 베타-자일로시데이즈 활성을 포함하여 2개 이상의 반응을 촉매하는 활성을 가지고, 동물의 장내와 가까운 환경인 중성 pH와 중온에서 높은 반응성을 나타낼 뿐만 아니라, 우수한 열안정성을 보이고, 동시에 높은 반응율을 보여 효율적으로 가수분해물을 수득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "베타-자일로시데이즈(β-xylosidase)"는 비환원성 말단으로부터 연속적 D-자일로즈 잔기를 제거하기 위한 (1->4)-β-D-자일란 가수분해 화학반응을 촉매하거나, 자일로비오스, 자일로트리오즈, 자이로테트라오즈 또는 자일로펜타오즈를 D-자일로즈로 가수분해하는 화학반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B에는 자연적으로 유도될 수 있는 베타-자일로시데이즈 뿐만 아니라, 본 발명의 구체적 실시예에 기재된 바와 같이 합성 베타-자일로시데이즈도 포함될 수 있으며, 단 서열번호 1의 아미노산 서열과 상동성이 있어야 한다. 보다 구체적으로, 자연적으로 유도될 수 있는 베타-자일로시데이즈는 패니바실러스 우송엔시스(P. woosongensis ) 균주 (기탁번호 KCTC 3953)으로부터 수득할 수 있으며, 상기 균주로부터 당업계 공지된 통상의 방법에 따라 분리·정제하여 수득할 수 있으며, 예컨대 균주 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 세포외 분획을 수득하거나 상등액을 회수하고 남은 펠렛을 세척한 다음 재현탁하고 원심분리하여 펠렛결합-분획을 통해서 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어, "균주"에는 생균, 사균, 건조균 또는 균주 배양액이 포함된다. 또한, 상기 용어, "배양액"은 상기 균주를 적합한 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 여액을 농축한 농축액, 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 라이소자임을 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등이 포함된다.

본 발명에 있어서, "베타-자일로시데이즈 B"에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "상동성"이란 베타-자일로시데이즈 B의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 핵산분자의 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 바람직하게는 85% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

"실질적으로 동질의 활성"이란 베타-자일로시데이즈 B와 같은 기능적 특성이 있으며, 특히 효소의 기능적 특성을 가지는 것을 의미한다. 또한, 상기 기능적 동등물의 범위에는 베타-자일로시데이즈 B의 기본 골격 및 이의 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함된다. 또한, 단백질의 단편(fragment)으로서 베타-자일로시데이즈 B와 실질적으로 대등한 활성을 갖는 폴리펩타이드는 베타-자일로시데이즈 B의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 베타-자일로시데이즈 B에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "활성"은 주어진 기질을 정량적으로 전환하는 것을 의미하고, 용어 "다기능 효소"는 하나의 효소가 2개 이상의 반응을 촉매하는 효소를 의미하는바, 2개 이상의 기질을 정량적으로 전환할 수 있는 효소를 지칭한다. 구체적 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B는 pNP-β-D-자일로피라노사이드(pNPX), pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드(pNPA), pNP-α-D-글루코피라노사이드 및 pNP-α-L-아라비노피라노사이드로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 기질의 가수분해 반응을 촉매하는 활성을 가지는바, 다기능 효소로서의 특징을 가진다.

바람직하게, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B는 하기와 같은 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

(a) 44 - 51℃에서 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄, 더욱 바람직하게, 45 - 47℃에서 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;

(b) pH 6 - 7에서 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄, 더욱 바람직하게, pH 6.5에서 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;

(c) 35 - 45℃ 에서 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄, 더욱 바람직하게, 40℃ 에서 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;

(d) pH 6 - 7에서 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄, 더욱 바람직하게, pH 6.5에서 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;

(e) 50℃ 이하의 온도에서 3 시간 이상 열안정성을 나타냄;

(f) pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대해 Km은 0.71 mM 및 Vmax는 2.88 U/mg를 나타냄;

(g) pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대해 Km은 12.68 mM 및 Vmax는 59.84 U/mg를 나타냄;

(h) K⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ 또는 Co²⁺첨가시 효소 활성이 증가됨;

(i) Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺또는 SDS 첨가시 효소 활성이 감소됨;

(j) EDTA 첨가시 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 활성은 감소되고 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 활성은 증가됨;

(k) 글루코스 첨가시 효소 활성이 증가됨; 및

(l) 펜토스 첨가시 효소 활성이 감소됨.

상기 (a) - (e) 특징을 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B는 중성 pH와 중온에서 높은 반응성을 나타내고, 우수한 열안정성을 보이므로, 다양한 산업에 활용도가 높다.

또한, 상기 (a) - (l) 특징에 따라, 기질의 종류, 반응의 목적, 반응율/반응속도의 조절 등에 활용할 수 있으므로 산업상 이용 가치가 높다.

본 발명의 베타-자일로시데이즈 B는, 이의 N- 또는 C- 말단에 외래 아미노산을 포함할 수 있으며, 상기 "외래 아미노산"은 천연(자연적으로 발생한) 베타-자일로시데이즈 B에 존재하지 않는 아미노산, 바람직하게 약 1개 이상, 약 3개 이상, 약 5개 이상 약 6개 이상 또는 약 7개 이상의 인접 아미노산의 연장부(stretch)를 의미한다. 외래 아미노산의 바람직한 연장부는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 재조합적으로 생성된 베타-자일로시데이즈 B의 정제를 용이하게 하는 "태그(tag)"을 포함할 수 있다. 이러한 태그의 예로는 예컨대, His₆ 태그, FLAG 태그, myc 태그 등이 포함되나, 이제 제한되지 않는다.

베타-자일로시데이즈 B를 비롯한, 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 단리된 형태로 제공될 수 있고, 바람직하게는 균질하게 제공된다. 본원에서, "단리된"이라는 용어는 물질이 그의 고유한 환경(예컨대, 자연적으로 발생할 경우 자연환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예컨대, 살아있는 미생물에 존재하는 자연적으로 발생된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이 아니지만, 천연 시스템 중 일부 또는 모든 공존하는 물질로부터 분리된, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부 및/또는 조성물의 부분일 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니도록 단리될 수 있다. 단리된 폴리펩타이드는 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 더욱더 바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 99% 이상 순수하다. 순도는 당 분야의 공지된 방법에 따라, 예컨대 SDS-PAGE 및 후속적인 단백질 염색에 의해 결정될 수 있고, 단백질 밴드는 밀도측정계에 의해 정량화 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태로, 본 발명은 베타-자일로시데이즈 B를 코딩하는 핵산 분자 또는 이들의 분리 내지 정제된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "핵산 분자"는 cDNA, genomic DNA, 합성 DNA 또는 RNA, PNAS 또는 LNA 기원의 임의의 단일 또는 이중 나선 핵산 분자, 또는 이들의 혼합물을 의미한다. 상기 "핵산 분자"에는 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B 및 이의 기능적 동등물을 암호화하는 a) 핵산 염기 서열, 또는 b) 이들 서열과 고긴축 조건(high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 또한, 상기 a) - b)의 핵산 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다. 또한, 상기 a) - b)의 임의의 핵산 분자의 단편 또는 보체(complement)가 포함될 수 있다.

본 발명의 베타-자일로시데이즈 B를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내는 베타-자일로시데이즈 B를 코딩하는 염기 서열 및 이와 상동성을 가지는 염기 서열을 가질 수 있고, 보다 바람직하게 서열번호 2의 염기 서열 또는 이와 상동성을 가지는 염기 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 베타-자일로시데이즈 B를 코딩하는 핵산 분자는 본 발명에서 개시한 서열 정보로부터 당 분야에 공지된 핵산 분자 구축 방법에 의해 수득될 수 있다. 예컨대, 출발물질로서의 핵산 분자는 패니바실러스 우송엔시스 균주로부터 단리될 수 있고 및/또는 본 발명에서 개시한 염기 서열을 기초로 하여 합성에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 베타-자일로시데이즈 B를 코딩하는 핵산 분자는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 즉 이에 제한되는 것은 아니지만 다른 염색체 DNA 및 RNA, 및 염색체 외 DNA 및 RNA와 같은 다른 염기 서열이 실질적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 당분야의 통상의 기술자에게 공지된 핵산 분자 정제 방법이 단리된 핵산 분자를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터, 박테리아 세포의 경우 필요에 따라 리보좀-결합 부위 및 종결자가 작동적으로 연결된 기능성 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

또 다른 양태로, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "플라스미드", "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되며, 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro) 발현을 위한 컨스트럭트를 의미한다. 이들 컨스트럭트는 숙주세포로 베타-자일로시데이즈 B 인코딩 핵산 분자를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 이들 컨스트럭트에서 베타-자일로시데이즈 B 인코딩 핵산 분자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결(operably linked)되며, 숙주세포로 삽입되면, 벡터는 숙주 게놈과는 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나 또는 일부 경우에 숙주 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 통상적으로 플라스미드 벡터는 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, 플라스미드 벡터로 삽입된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자, 및 외래 핵산 분자가 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 가진다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따라 합성 올리고뉴믈레오타이드어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 핵산 분자를 용이하게 라이게이션시킬 수 있다.

상기 "작동가능하게 연결된"은 적절한 핵산 분자가 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다.

상기 "재조합"은 세포가 이종의 핵산 분자를 복제하거나, 상기 핵산 분자를 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 상기 "벡터"는 세포 내로 핵산 분자를 전달한다. 상기 "벡터"에는 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

숙주세포에서 발현하기 위해 사용될 수 있는 벡터는 당 분야에 공지되어 있고, 특히 대장균(E. coli)에서 발현하기 위해 사용될 수 있는 적합한 벡터 또한 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 벡터로 pET23을 사용하였으며, 도 1에 재조합 벡터 개열 지도를 구체적으로 개시하였으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "숙주세포"는 상술한 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 임의의 세포를 포함하며, 베타-자일로시데이즈 B의 재조합 생산에 이용될 수 있다. 숙주세포는 통상적으로 핵산 분자의 도입 효율이 높고, 도입된 핵산 분자의 발현 효율이 높은 것이 사용된다. 숙주세포는 원핵 또는 진행 세포를 포함하며, 이러한 숙주세포를 포함하는 재조합 미생물로서, 예컨대 박테리아, 효소, 곰팡이 등이 이용될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 대장균(E. coli)이 이용되었으나, 이에 제한되지 않고, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B 변이체가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.

본 발명에 있어서, 핵산 분자를 숙주세포에 삽입하기 위해 통상적으로 알려진 조작방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 액상 내지 고상일 수 있다. 조성물에는 베타-자일로시데이즈 B를 단독으로 포함할 수도 있고, 다른 단백질 또는 효소를 함께 포함할 수도 있으며, 조성물 내 베타-자일로시데이즈 B, 다른 단백질, 또는 효소의 안정성 및/또는 활성을 보충할 추가 첨가제를 포함할 수도 있다. 예컨대, 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 염, 슈가, pH-버퍼, 보존제 및 카르보하이드레이트가 있으나, 이에 한정되지 않는다. 통상적으로 액상 조성물은 물 또는 오일 기반의 슬러리, 현탁액 또는 용매이다. 고상 조성물은 스프레이-건조, 동결건조(lyophilisation), 다운-드라우트 증기법(down-draught evaporation), 씬-레이어 증기법(thin-layer evaporation), 원심분리 증기법(entrifugal evaporation), 컨베이어 건조, 또는 이들의 조합에 의해 액상 조성물로부터 제조될 수 있다. 고상 조성물은 식품 또는 사료에 적용하기 적합한 크기로 과립화할 수 있다.

상기 조성물은 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B의 특성을 기초로 다양한 산업 분야에서 이용될 수 있는바, 예컨대, 하기와 같은 분야에서 이용가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다:

자일란 분해,

바이오매스 당화,

식품내 자일란 가공,

사료첨가제 또는 사료제조방법,

제지공정,

과일음료 및 맥주의 혼탁물 제거,

커피와 식물성 기름 및 전분의 추출, 또는

자일로올리고사카라이드 또는 D-자일로즈 생산 등.

본 발명에 따른 조성물에는 조성물의 용도에 따라 다양한 성분이 추가될 수 있고, 예컨대 효소가 추가될 수 있으며, 상기 효소에는 엔도자일라나제, 엑소자일라나제, 셀로비오히드롤라제, 피타제, 그루코아밀라제, 알파 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 만난아제 및 이들의 혼합물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B를 산업상 활용하는 방법을 제공하는바, 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 자일로즈를 주성분으로 하는 당류를 분해하는 방법을 제공한다. 상기 자일로즈를 주성분으로 하는 당류는 바람직하게, 자일란(xylan) 또는 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide) 일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하고 자일로즈를 주성분으로 하는 당류를 분해하여, 자일로즈를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 바이오매스에 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 명세서에 있어서, 용어 "바이오매스(biomass)"는 헤미셀룰로오스를 포함하는 대상 물체를 의미하며, 예컨대 식물의 씨, 낟알, 튜버, 옥수수(속대, 여물, 섬유 등 포함), 풀(인디안 그래스, 스위치그래스 등), 수수류, 사탕수수 바가스 등이 포함될 수 있으며, 식물 폐기물, 식품 가공 또는 산업적 가공의 부산물도 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상술한 방법들은 상술한 본 발명에 따른 조성물이 사용되는 산업 분야에서 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배양하여 베타-자일로시데이즈 B를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-자일로시데이즈 B를 회수하는 단계를 포함하는 베타-자일로시데이즈 B 제조방법을 제공한다.

보다 바람직하게, 하기 방법에 따를 수 있다:

상기 베타-자일로시데이즈 B는 C 말단에 6개의 히스티딘을 태깅한 융합 단백질로 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL을 배양하여 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-자일로시데이즈 B를 균체파쇄상등액으로부터 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

재조합 미생물의 (대량) 배양을 위해, 다양한 배양 방법이 적용될 수 있는데, 예컨대 재조합 미생물로부터 발현 또는 과발현된 유전자 산물의 대규모 제조는 회분(batch) 또는 연속 배양 방법에 의해 달성될 수 있다. 회분 및 유가(fed-batch) 배양 방법은 통상적인 것으로서 당분야에 공지되어 있다. 연속 배양 공정을 위한 영양분 및 성장 인자의 조절 방법, 뿐만 아니라 생성물 형성율을 최대로 하기 위한 기법은 미생물 산업 분야에 공지되어 있다. 또한, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미테랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게 탄소원으로 자일란을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 당분야에 공지된 바에 따라 조성 구성할 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 베타-자일로시데이즈 B 효소는 베타-자일로시데이즈 활성을 포함하여 2개 이상의 반응을 촉매하는 활성을 가지고, 동물의 장내와 가까운 환경인 중성 pH와 중온에서 높은 반응성을 나타낼 뿐만 아니라, 우수한 열안정성을 보이고, 동시에 높은 반응율을 보여 효율적으로 가수분해물을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-자일로시데이즈 B를 이용하면 D-자일로즈를 주성분으로 하는 당류를 분해할 수 있으며, 이러한 방법에 따라 D-자일로즈를 제조할 수 있고, 또한 바이오매스에 상기 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 등으로 효과적으로 다양한 산업 분야에서 활용할 수 있다.

도 1은 xylB 유전자의 재조합 벡터 pYEAX291을 도시한 것이다.
도 2a는 재조합 E. coli 로부터 발현된 His-tagged XylB의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다. 1: IPTG 무첨가/ 2: IPTG 첨가 후 25℃에서 5시간 동안 배양 후 균체파쇄액/ 3: IPTG 첨가 후 25℃에서 5시간 동안 배양 후 균체파쇄상등액
도 2b는 재조합 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL로부터 정제된 His-tagged XylB의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다. 1: E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL 균체파쇄액/ 2: E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL 균체파쇄상등액/ 3: 니켈 친화 크로마토그래피에 의해 정제된 His-tagged XylB
도 3은 pNPA(도 3a) 및 pNPX (도 3b)를 가수분해하기 위한 정제된 His-tagged XylB의 최적 온도 및 최적 pH를 도시한 것이다.
도 4는 정제된 His-tagged XylB의 열안정성을 도시한 것이다.
도 5a는 정제된 His-tagged XylB의 pNPA에 대한 역학 파라미터를 도시한 것이고, 도 5b는 정제된 His-tagged XylB의 pNPX에 대한 역학 파라미터를 도시한 것이다.
도 6은 pNPA 및 pNPX에 대한 XylB의 분해 활성에 금속 이온 또는 기타 제제가 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 7은 자일로올리고사카라이드의 가수분해 산물을 도시한 것이다. X1: 자일로즈, X2: 자이로비오즈, X3: 자일로트리오즈, X4: 자이로테트라오즈, X5: 자일로펜타오즈, E: His-tagged xylB
도 8은 XylB의 기질 특이성을 도시한 것이다.
도 9는 pNPA 및 pNPX에 대한 XylB의 분해 활성에 당 첨가가 미치는 영향을 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실험 방법]

박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 배지

페니바실러스 우송엔시스 KCTC 3953 (DSM 16971)는 베타-자일로시데이즈(XylB)의 코팅 유전자 원천으로 사용하였고, E.coli DH5α는 재조합 플라스미드 주입용 숙주로 사용하였고, E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL는 E.coli 유전자 발현을 위한 숙주로 사용하였다. 상기 페니바실러스 우송엔시스 KCTC 3953은 본 발명자에 의해 기탁기관 한국생명공학연구원에 2007. 05. 02자로 일반기탁되어 있으며, 기탁번호 KCTC 3953를 부여받았다. 또한, 동일한 균주는 독일의 기탁기관인 DSMZ DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH에도 기탁되어 있으며, 기탁번호 DSM 16971을 부여받았다.

이들 E. coli는 LB 브로스(10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl per liter, pH 7.0) 내 37 ℃에서 배양하였다. 암피실린(100 ㎍/ml)을 E. coli DH5α 형질전환체 선택과 배양을 위해 사용하였으며, 암피실린(100 ㎍/ml) 및 클로람페니콜 (30 ㎍/ml)을 E. coli BL21(DE3) Codon Plus 형질전환체 선택 및 배양을 위해 사용하였다. 패니바실러스 우송엔시스는 크립틱 소이 브로스 (TSB; 17 g tryptone, 3 g soytone, 2.5 g dextrose, 5 g NaCl, 2.5 g K₂HPO₄ per liter, pH 7.2) 내 37 ℃에서 배양하였다. 플라스미드 pUC19는 클로닝 및 시퀀싱 실험을 위해 사용하였고, pET23a+는 xylB 유전자의 발현 벡터로 사용되었다.

DNA 조작 및 시퀀싱

페니바실러스 우송엔시스 세포에서 분리한 게놈 DNA를 분리하였다. 분리한 게놈 DNA를 Sau3AI를 이용해 부분적으로 분해하고, 1.5 - 10 kb 길이의 DNA 단편을 아가로스 젤에서 분리하였다. Sau3AI-처리 크로모좀 DNA 단편을 pUC19의 인산화된 BamHI site에 도입하였고, 라이게이션 혼합물을 E. coli DH5 내에 형질전환하였다. 클로닝된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 DNA 시퀀서(ABI Prism 377, Perkin Elmer Co., Foster, CA, U.S.A.)를 이용해 결정하였다. E. coli 내에서 xylB를 고발현할 재조합 플라스미드를 구성하기 위해, 상기 유전자를 pET23a(+) 내로 서브클로닝하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열에 따라 다음과 같이 설계하였다:

포워드 프라이머 (5'-GGAATTCATATGAGCAAACCAGTAAAGCAAAAC-3': 서열번호 3) 및

리버스 프라이머 (5'-GGTGCTCGAGTTTATATGGATCGATCGTCTGG-3': 서열번호 4)

적절한 제한효소 인지 영역을 각각 포워드 프라이머(NdeI site) 및 리버스 프라이머(XhoI site)에 추가하였다. 아울러, 리버스 프라이머는 pET23a(+)이 6-His tag과 융합된 유전자 산물을 포함하기 위해 C-말단에 스탑 코톤(stop codon)을 포함하지 않도록 설계하였다. PCR 증폭은 클론 유전자 (10 ng), 각 프라이머 40 pmol, 1.5 mM MgCl₂, 0.3 mM dNTPs, PCR buffer 및 2.5 U Pfu DNA 포함 반응 혼합물을 포함하는 총 50㎕의 반응물을 95℃에서 25초, 58℃에서 40초, 72℃에서 3분의 공정으로 30회 반복 수행하였다. NdeI 및 XhoI-처리된 DNA 단편의 PCR 산물을 pET23a(+)의 동일 구역에 도입하고, 결과 플라스미드를 pYEAX291로 명명하였다(도 1).

E. coli 내 His-tagged 효소의 고발현 및 정제

플라스미드 pYEAX291를 함유한 재조합 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL 세포를 37℃, 항생제를 포함하는 LB 배양액 내에서 배양하였다. 배양물이 600 nm에서 0.6 광학 밀도에 다다르면, 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG를 첨가하였다. 25℃에서 5시간 동안 유도한 후, 세포를 걷어내고 세포 라이시스 버퍼(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0)에 현탁시켰고, 초음파 처리하여 분쇄하여 원심분리하여 균체파쇄상등액을 수득하였다. 균체파쇄상등액은 같은 버퍼를 이용해 평형화한 Ni-NTA에 첨가하였다. 세척용 버퍼(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH 8.0)를 이용해 비결합 내지 약하게 결합된 단백질을 제거한 후에, His-태깅 효소를 250 mM 이미다졸 포함 희석 버퍼를 이용해 추출하였다. 활성 분획은 통합하고 10mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에서 투석하였다.

효소 분석 및 역학 분석

XylB 활성은 pNP-β-D-xylopyranoside (pNPX) 또는 pNP-α-L-arabinofuranoside (pNPA) 에서의 para-nitrophenol (pNP) 방출양을 측정하여 결정하였다. 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pNPX는 pH 6.5, pNPA는 pH 7.0) 내 1 mM 기질을 함유하는, 0.5 ml 반응 혼합물을 각각 pNPX는 50℃, pNPA는 45℃에서 10분간 인큐베이팅하였다. 반응은 1M 소듐 카르보네이트 1ml를 첨가하여 종결시켰다. 흡광도는 405 nm에서 측정하였다. 정상상태(Steady-state) 역학 측정은 기질의 농도(0.125 - 4 mM)를 바꿔가며 pNPX 및 pNPA의 최적 온도 및 pHs에서 실시하였다. Km 및 Vmax 값은 최초 pNP 유리 비율로부터 계산하였다. 자일란을 가수분해하는 효소 활성은 환원당(reducing sugars)의 양을 측정함으로써 결정하였다. 1 유닛 효소 활성은 분당 1 μmol의 pNP 또는 환원당을 생산한 효소의 양으로 정의하였다.

pH, 온도 및 다양한 제제가 효소 활성에 미치는 영향

pH가 반응율에 미치는 영향은 고정된 온도 (45℃) 및 다양한 pHs 버퍼(50 mM의 소듐 시트레이트(sodium citrate) (pH 4.0 - 6.0), 소듐 포스페이트(sodium phosphate) (pH 6.0 - 8.0) 및 트리스 (pH 8.0 - 9.0) 버퍼)에서 pNPX 및 pNPA에 대한 효소 활성을 측정함으로써 결정하였다. 정제된 효소의 활성은 30 - 65℃ 범위 내의 다양한 온도에서 50 mM 소듐 버퍼 (pH 6.5 또는 7.0) 에서 분석하였다. 화합물이 미치는 영향을 조사하기 위해, 베타-자일로시데이즈 및 알파-아라비노퓨라노시데이즈 모두는 표준 반응 혼합물 내 몇몇 시약 (5 mM)을 첨가함으로써 측정되었다. 효소 활성에 비치는 당의 효과를 시험하기 위해, 최종 농도가 25 mM - 400 mM가 되도록 표준 반응 혼합물에 단당류를 첨가한 후에 pNPX 및 pNPA에 대한 가수분해반응을 실시하였다.

[실험 결과]

패니바실러스 우송엔시스 xylB 유전자의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열

패니바실러스 우송엔시스 게놈 DNA를 함유하는 E. coli 형질전환체를 하룻밤 배양을 위해 LB 아가 플레이트로 옮겼다. 베타-자일로시데이즈 활성을 나타내는 E. coli를 스크리닝하기 위해, 0.2 mM 4-methylumbelliferyl β-D-xylopyranoside (MUX)를 소프트 아가를 플레이트 위에 도포하였다. 40 ℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한 후에, 360 nm에서 강한 형광물질 관찰을 통해 MUX를 가수분해하여, 4-methylumbelliferone 유리할 수 있는 콜로니 하나를 선택하였다. 재조합 플라스미드에서 패니바실러스 우송엔시스 게놈 DNA 전체 1,768 bp 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 뉴클레오티드 서열에서 오픈 리딩 프레임(ORF)은 36,811 Da 분자량을 가지는 326개 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 코딩하는 981 염기쌍으로 이루어져 있었다.

E- coli 내에서 His - tagged XylB 의 생산 및 정제

효소를 간단히 정제하기 위해, 재조합 E. coli를 통해 많은 융합 단백질을 만들어냈다. C 말단에 6개-히스티딘 꼬리를 가지는, His-tagged XylB (HtXylB)를 제조했다. 융합 단백질은 레어(rare) tRNA 유전자, 즉 아르기닌 코돈 AGA 및 AGG를 인식하는 tRNA 유전자 argU, 아이조루신 코돈 AUA를 인식하는 tRNA 유전자 ileY 및 루신 코돈 CUA를 인식하는 tRNA 유전자 leuW가 도입된 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL에서 IPTG에 의해서 효과적으로 고발현되었다. 상기 효소는 25℃ 에서 배양된 재조합 E. coli 세포에서 수용성 형태로 생산되었다(도 2a).

HtXylB는 Ni-NTA 레진을 사용해 한 단계의 크로마토그래피 과정만으로 균체파쇄상등액으로부터 95% 이상의 정제도로 정제되었다. 정제된 효소는 SDS-PAGE를 통해, 분자량이 36,811 Da에 대응하는 단일 단백질 밴드를 나타냈으며 이는 xylB 유전자 뉴클레오티드 서열에 의해 예견된 HtXylB의 분자량과 일치하였다 (도 2b).

정제된 His-tagged XylB의 반응 특성

온도 및 pH가 효소 활성에 미치는 효소를 조사하기 위해 두가지 기질, pNPX 및 pNPA를 사용하였다. 정제된 HtXylB는 45℃, 6.5 pH에서 pNPA에 대해 최대 활성을 보였고, 45℃ - 54℃ 에서 80% 이상의 활성을 나타냈다. 이에 반해, pNPX에 대해서는 40℃, 6.5 pH에서 최대 활성을 보였다. pH 8.0에서 pNPX에 대한 효소 활성은 약 40% 였고, pNPA에 대한 효소 활성은 약 30% 였다(도 3).

정제된 HtXylB의 열적안정성 및 pH 안정성을 확인하기 위해, 기질이 없는 상태에서 다양한 온도 (45 - 60℃) 또는 다양한 pHs (5.0 - 9.0)에서의 사전 인큐베이팅 후에 pNPX 가수분해에 대한 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, 인큐베이팅 3시간 동안 45℃에서 열안정성을 나타냈고, 45℃에서의 3시간 인큐베이팅 후에 최대 활성의 88%를 유지하였다. 다만, 효소의 안정성은 55℃ 이상의 온도에서는 감소 추세를 나타냈다(도 4).

비록 XylB의 아미노산 서열이 베타-자일로시데이즈/알파-아라비노퓨라노시데이즈 및 알파-아라비노퓨라노시데이즈의 아미노산 서열과 높은 상동성을 나타내지만, HtXylB는 pNPA 보다는 pNPX에 보다 활성을 보였는바, 효소는 pNPX에 대한 활성의 58.9%로 pNPA를 가수분해하였다. pNP-α-D-글루코피라노사이드(pNP-α-D-Glucopyranoside) 및 pNP-α-L-아라비노피라노사이드(pNP-α-L-Arabinopyranoside)에 대해서도 적지만 활성을 나타냈다. 또한, pNPX는 베타-자일로시데이즈에 대한 기질이고 pNPA는 알파-아라비노퓨라노시데이즈에 대한 기질이므로, XylB는 베타-자일로시데이즈 및 알파-아라비노퓨라노시데이즈 활성을 보여주는 다기능성 효소인 것으로 추정된다. 또한, 오트 스펠트밀 유래 자일란(oat spelt xylan)에 대해서도 미미하지만 효소 활성을 보였다(도 8).

pNPX 및 pNPA에 대한 HtXylB의 역학(kinetic) 파라미터인, Km 및 Vmax는 정상 상태 역학 분석에 의해 확인하였다. Km은 pNPX에 대해 12.68 mM을 그리고, pNPA에 대해 0.71 mM인 것으로 나타났고, Vmax는 pNPX에 대해 59.84 μmol/min/mg을 그리고 pNPA에 대해 2.88 μmol/min/mg인 것으로 나타났다. 따라서 pNPX에 대한 kcat은 37.55 sec^-1, kcat/Km 값은 2.96X10³ M^-1·sec^- ¹ 이며, pNPA에 대한 kcat은 1.81 sec^-1, kcat/Km 값은 2.55X10³ M^-1·sec^- ¹ 으로 확인되어 pNPX에 대한 반응성이 높았다(도 5).

금속 이온 및 다른 제제가 효소 활성에 미치는 효과

금속 염, EDTA 및 SDS를 포함한 다양한 제제가 HtXylB 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 다양한 제제 존재 하에서, pNPX 및 pNPA의 가수분해 정도를 측정하여 XylB의 효소 활성을 측정하였고, 이러한 활성은 기질별로 다른 영향을 받는 것으로 나타났다. K⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺와 같은 금속 이온에 의해 모든 기질에 대해 효소의 가수분해 활성은 상당히 향상되었다. 이에 반해, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺와 같은 금속 이온 및 SDS는 모든 기질에 대한 효소의 가수분해 활성을 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, EDTA는 pNPA에 대한 효소의 가수분해 활성은 억제하는 반면, pNPX에 대한 효소의 가수분해 활성은 향상시키는 효과를 나타냈다(도 6).

현재까지 연구된 많은 수의 글리코시데이즈 효소는 그들에 의해 촉매된 효소 반응의 결과 생성물인, 당에 의해 효소활성이 억제되거나 이와 유사한 다른 단당류에 의해서도 억제되는 것으로 알려졌다. 효소 활성에 미치는 가수분해 반응의 결과 생성물의 효과를 조사하기 위하여, D-글루코스, D-자일로즈, L-아라비노스의 다양한 농도의 존재하에서의 HtXylB의 pNPX 및 pNPA, 각각의 가수분해 활성을 조사하였다. 그 결과 글루코스 보다 펜토스에 의해 pNPX 및 pNPA 모두에 대한 가수분해 활성이 상당히 억제됨을 알 수 있었다. 효소 활성은 당의 농도를 증가시킬수록 급격히 감소하였다. 펜토스에 의해 pNPX 가수분해 활성은 pNPA의 가수분해 활성보다 훨씬 더 억제되었으며, 글루코스에 의해 HtXylB의 활성은 유사한 정도로 약간 향상되었다(도 9).

<110> CTC bio. <120> Mutifunctional beta-Xylosidases <130> P14-057 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 326 <212> PRT <213> Paenibacillus woosongensis <400> 1 Met Ser Lys Pro Val Lys Gln Asn Glu Pro Leu Val Thr His Ile Tyr 1 5 10 15 Thr Ala Asp Pro Ser Ala His Val Phe Glu Gly Lys Leu Tyr Ile Tyr 20 25 30 Pro Ser His Asp Leu Asp His Glu Met Glu Ser Asn Asp Asn Gly Asp 35 40 45 Gln Tyr Asp Met Glu Asp Tyr His Val Leu Ser Met Glu Asp Thr Asp 50 55 60 Ser Pro Cys Val Asp His Gly Glu Val Leu His Leu Arg Asp Ile Pro 65 70 75 80 Trp Ala Lys Gln Gln Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Lys Asn Asn 85 90 95 Thr Tyr Tyr Leu Phe Phe Pro Ala Arg Asp His Asp Gly Ile Phe Arg 100 105 110 Leu Gly Val Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ala Gly Pro Phe Thr Pro Gln 115 120 125 Pro Asp Tyr Ile Pro Gly Ser Phe Ser Ile Asp Pro Ala Val Leu Val 130 135 140 Asp Glu Asp Asp Lys Ala Tyr Ile Tyr Phe Gly Gly Leu Trp Gly Gly 145 150 155 160 Gln Leu Glu Lys Trp Gln Thr Gly Thr Phe Lys Pro Asp Ala Glu Gly 165 170 175 Pro Ala Ala Asp Ala Pro Ala Leu Gly Pro Arg Val Ala Glu Leu Ser 180 185 190 Glu Asp Met Leu Thr Phe Lys Asp Thr Pro Val Glu Ile Ser Ile Val 195 200 205 Asp Glu Asp Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gly Asp Glu Asp Arg Arg Phe 210 215 220 Phe Glu Gly Pro Trp Val His Lys His Asn Gly Tyr Tyr Tyr Leu Ser 225 230 235 240 Tyr Ser Thr Gly Ser Thr His Lys Ile Val Tyr Ala Met Ser Lys Asn 245 250 255 Pro Met Gly Pro Tyr Val Tyr Lys Gly Thr Ile Leu Thr Pro Val Leu 260 265 270 Gly Trp Thr Thr His His Ser Ile Val Gln Phe Lys Asp Lys Trp Tyr 275 280 285 Leu Phe Tyr His Asp Ser Ser Leu Ser Gly Gly Ala Asp Asn Lys Arg 290 295 300 Ser Val Lys Phe Thr Glu Leu Lys Tyr Asn Asp Asp Gly Thr Ile Gln 305 310 315 320 Thr Ile Asp Pro Tyr Lys 325 <210> 2 <211> 981 <212> DNA <213> Paenibacillus woosongensis <400> 2 atgagcaaac cagtaaagca aaacgagcct ttagttactc atatttatac cgcagaccct 60 tctgcccacg tatttgaggg caagctgtac atctacccat cgcatgacct tgatcatgaa 120 atggaatcca atgacaacgg cgaccaatac gacatggagg attaccacgt cctatccatg 180 gaagatactg attccccttg cgtcgaccat ggcgaggttc tgcatcttcg cgacattcca 240 tgggccaagc agcagctgtg ggctcccgat gccgcctaca agaacaatac atattacttg 300 ttcttcccag cccgggatca tgacggcatt ttcagactcg gcgtagcaac cagttcttct 360 ccagccgggc cgtttacgcc gcagccggac tatatcccgg gaagcttcag catcgatcct 420 gccgttctgg tcgatgagga cgacaaagca tatatttatt tcggcggcct gtggggcgga 480 cagctggaga aatggcaaac cggcaccttc aagcctgacg cagaggggcc tgctgcagac 540 gcgcctgcac ttggaccaag ggtggccgag ctcagcgagg atatgctgac cttcaaagac 600 acgcctgtag aaatatccat cgtggacgag gacggaaatc cgctgcttgc cggggatgag 660 gatcgcagat ttttcgaagg accatgggtt cataaacata acgggtacta ctatctgtcc 720 tattcaaccg gttctacaca caaaatcgtc tatgcgatga gcaaaaatcc aatgggtcct 780 tacgtttaca aagggacgat tctaacgcct gttctcggct ggaccaccca ccattctatc 840 gtgcaattca aggacaaatg gtatttgttc taccacgaca gctccttgtc cggaggagcc 900 gacaacaagc gcagcgtgaa gttcacggaa ctgaaataca acgatgacgg gacgatccag 960 acgatcgatc catataaata a 981 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 ggaattcata tgagcaaacc agtaaagcaa aac 33 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 ggtgctcgag tttatatgga tcgatcgtct gg 32

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 베타-자일로시데이즈 B.
제1항에 있어서, 상기 베타-자일로시데이즈 B는 pNP-β-D-자일로피라노사이드(pNPX), pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드(pNPA), pNP-α-D-글루코피라노사이드 및 pNP-α-L-아라비노피라노사이드로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 기질의 가수분해반응을 촉매하는 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 베타-자일로시데이즈 B.
제1항에 있어서, 상기 베타-자일로시데이즈 B는 패니바실러스 우송엔시스 균주(기탁번호 KCTC 3953)에서 생산된 것을 특징으로 하는 베타-자일로시데이즈 B.
제1항에 있어서, 상기 베타-자일로시데이즈 B는 하기 (a) - (l)의 특징 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 베타-자일로시데이즈 B:
(a) 44 - 51 ℃에서 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;
(b) pH 6 - 7에서 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;
(c) 35 - 45℃ 에서 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;
(d) pH 6 - 7에서 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 최대 활성을 나타냄;
(e) 45 - 50℃ 에서 3 시간 동안 열안정성을 나타냄;
(f) pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대해 Km은 0.71 mM 및 Vmax는 2.88 U/mg를 나타냄.
(g) pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대해 Km은 12.68 mM 및 Vmax는 59.84 U/mg를 나타냄.
(h) K⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ 또는 Co²⁺첨가시 효소 활성이 증가됨;
(i) Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺또는 SDS 첨가시 효소 활성이 감소됨;
(j) EDTA 첨가시 pNP-α-L-아라비노퓨라노사이드에 대한 활성은 감소되고 pNP-β-D-자일로피라노사이드에 대한 활성은 증가됨;
(k) 글루코스 첨가시 효소 활성이 증가됨; 및
(l) 펜토스 첨가시 효소 활성이 감소됨.
제1항의 베타-자일로시데이즈 B를 코딩하는 핵산 분자.
제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제5항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 핵산 분자 또는 제7항의 재조합 벡터가 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
제8항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-자일로시데이즈 B를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-자일로시데이즈 B를 회수하는 단계를 포함하는 베타-자일로시데이즈 B 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 베타-자일로시데이즈 B는 C 말단에 6개의 히스티딘을 태깅한 융합 단백질로서 E. coli BL21(DE3) Codon Plus-RIL을 숙주세포로 이용하여 발현되는 단계; 및 상기 발현된 베타-자일로시데이즈 B를 균체파쇄상등액으로부터 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-자일로시데이즈 B 제조방법.
제1항의 베타-자일로시데이즈 B를 포함하는 조성물.
제1항의 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 자일로즈를 함유하는 당류를 분해하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 자일로즈를 함유하는 당류는 자일란(xylan) 또는 자일로올리고사카라이드(Xylooligosaccharide)인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항의 방법에 따라 자일로즈를 제조하는 방법.
바이오매스에 제1항의 베타-자일로시데이즈 B를 첨가하여 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법.