KR20030016275A - 비피도박테륨에서 단리한 베타-갈락토시다제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비피도박테륨 비피둠에서 단리한, 트랜스갈락토실화 활성을 보유하는 β-갈락토시다제 및 β-갈락토시다제 단백질의 C-말단 종결부가 결실되어 트랜스갈락토실화 활성이 히드롤라제 활성 보다 더 높은 말단절단형 효소에 관한 것이다. 트랜스갈락토실라제 활성은 기질로서 락토스를 사용하는 경우, 갈락토-올리고당류를 생산한다. 갈락토-올리고당류는 낙농업에서 수많은 용도로 사용할 수 있는 건강 촉진 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다.
Description
비피도박테륨 속은 유제품 산업에서 다양한 유제품 발효에 가장 널리 이용되는 유형의 박테리아 배양물 중 하나이다. 또한, 비피도박테륨을 함유하는 제품의 섭취는 건강을 촉진하는 효과가 있다. 이러한 효과는 장내 내용물의 pH 감소에 의해서만이 아니라, 항생제 복용 등으로 인해 장내 플로라 (flora)가 파괴된 개인에서 장내 플로라를 복구할 수 있는 비피도박테륨의 능력에 의해서도 달성된다. 또한, 비피도박테륨은 잠재적으로 해로운 장내 미생물들을 배출시키는 (outcompeting) 능력도 보유한다.
갈락토-올리고당류는 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다고 공지되어 있다. 이러한 효과는 갈락토-올리고당류를 탄소 공급원으로 활용하는 비피도박테륨의 독특한 능력을 통해 달성되는 것으로 보인다. 또한, 식이보조제로서의 갈락토-올리고당류는 수많은 장기간의 질환을 보호하는 효과를 갖는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 갈락토-올리고당류의 복용은 래트에서의 직장결장암 진행에 대한 고도의 보호 효과를 나타내는 것으로 밝혀진 바 있다 [Wijnands, et al., 1999]. 그러므로, 식이보조제 및 유제품을 개선하는 산업에 사용하기 위해서, 갈락토-올리고당류를 생산하는 저렴하고 효율적인 방법의 개발에 많은 관심이 있다.
효소 β-갈락토시다제 (EC 3.2.1.23)는 통상적으로 락토스를 단당류인 D-글루코스 및 D-갈락토스로 가수분해한다. β-갈락토시다제의 정상적인 효소 반응에서, 상기 효소는 락토스를 가수분해하고 갈락토스 단당류를 갈락토스-효소 복합체 중에서 일시적으로 결합하였다가 상기 갈락토스를 물의 히드록실기에 전달함으로써, D-갈락토스 및 D-글루코스를 유리시킨다. 그러나, 락토스가 고농도인 경우, 일부의 β-갈락토시다제는 트랜스갈락토실화라고 지칭되는 과정을 통해 갈락토스를 D-갈락토스 또는 D-글루코스의 히드록실기에 전달하여 갈락토-올리고당류를 생산할 수 있다.
트랜스갈락토실화할 수 있는 효소는 박테리아 및 효모 등을 비롯한 광범위한 범위의 미생물로부터 단리되어 왔다. 갈락토-올리고당류가 건강 촉진 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다는 관찰이 비피도박테륨 및 이의 β-갈락토시다제 효소에 대한 연구를 자극시켰다. 비피도박테륨 브레브 (Bifidobacterium breve)의 β-갈락토시다제 유전자 및 비피도박테륨 롱검 (Bifidobacterium longum)의 β-갈락토시다제 유전자 2가지의 DNA 서열이 진뱅크 (수탁 번호: 각각 E5040 및 AJ242596)에 기탁되어 있다. 문헌 [Dumortier et al. (1994)]에는 비피도박테륨 비피둠 DSM 20215이 3종의 β-갈락토시다제를 함유하고, 이들 효소 중 하나가 트랜스-갈락토실화 성질을 보유한다고 보고되어 있다. 그러나, 이러한 활성을 보유하는 상기 효소를 확인하거나, 상기 효소의 임의의 서열 또는 비피도박테륨 비피둠 DSM 20215로부터의 상응하는 유전자가 공개된 적은 없었다.
β-갈락토시다제를 사용하여 갈락토-올리고당류를 생산하는 방법이 여러 문헌에 보고되어 있다. 예를 들어, 대장균의 β-갈락토시다제는 락토스가 고농도 (0.5 M 락토스 또는 대략 20％ 락토스)인 경우에 올리고당류를 생산하는 것으로 나타났다 [Huber et al. 1976]. 각종 호열성 미생물이 고온 및 고농도의 락토스 조건에서 올리고당류를 생산하는 것으로 나타난 바 있는데, 예를 들어 스테리그마토마이세스 엘비애 (Sterigmatomyces elviae)는 60℃에서 20％ 락토스로부터 39％ 올리고당류를 생산할 수 있으며 [Onishi ＆ Tanaka, 1995], 사카로폴리스포라 렉티비르굴라 (Saccharopolyspora rectivirgula)는 70℃에서 1.75 M 락토스 중에서 41％ 올리고당류를 합성할 수 있다 [Nako et al., 1994].
그러나, 상기에서 기재한 효소들은 모두 유의한 트랜스갈락토실라제 활성을 발휘하기 위해서는 고온 또는 고농도의 락토스가 필요하거나, 또는 이들 두가지가모두 필요하다는 결점이 있다. 그러므로, 산업에 사용하기 위한 갈락토-올리고당류를 생산하는 더욱 저렴하고 더욱 효율적인 방법의 개발이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 비피도박테륨 비피둠의 신규 β-갈락토시다제를 기재한다. 놀랍게도, 상기 효소의 말단절단형 버전은 높은 트랜스갈락토실화 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 상기 말단절단형 효소 또는 재조합 말단절단형 효소를 발현하는 숙주 세포를 락토스와 함께 적절한 조건하에서 인큐베이션시키는 경우, 갈락토-올리고당류가 고효율로 생산된다. 유제품 또는 기타의 식품 중 갈락토-올리고당류의 존재는 상기 제품 중 및(또는) 상기 제품을 복용한 소비자의 장내 플로라 중의 건강 촉진 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다는 장점이 있다.
본 발명은 발효시킨 유제품의 개선에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 트랜스갈락토실화 활성을 보유하는 β-갈락토시다제에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 비피도박테륨 비피둠 (Bifidobacterium bifidum)에서 단리한 β-갈락토시다제로서 상기 단백질의 C-말단 종결부가 결실되어 트랜스갈락토실화 활성이 히드롤라제 활성 보다 더 높은 말단절단형 (truncated) 효소로 생성된 β-갈락토시다제에 관한 것이다. 트랜스갈락토실라제 활성은 기질로서 락토스를 사용하는 경우, 갈락토-올리고당류를 생산한다. 갈락토-올리고당류는 낙농업에서 수많은 용도로 사용할 수 있는 건강 촉진 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다.
도 1: OLGA5 서열. 비피도박테륨 비피둠의 OLGA5 β-갈락토시다제의 DNA 및 단백질 서열. 신호 서열은 굵은체로 나타내었고, OLGA347에서 결실된 OLGA5 유전자의 일부는 이탤릭체로 나타내었다. 결실 생성에 사용된 BglII 부위는 밝게 표시했다.
도 2: β-갈락토시다제 활성 부위 영역들의 비교. 대장균의 촉매적 Glu461 잔기의 주변 영역들의 정렬 (밝게 표시한 부분). 상기 서열은 이들의 데이타베이스 수탁 번호를 통해 확인하였다. 6-포스포-β-갈락토시다제 서열은 (P)로 표시했다.
도 3: 도 1에서의 정렬을 계통별로 연결 (neighbour joining)한 분석으로서,술폴로부스 (Sulfolubus) 서열은 외(外)집단으로 사용했다. 부트스트랩 분석 (n = 100) 결과는 80 초과의 수치로 관련있음을 나타낸다.
도 4: OLGA5 트랜스갈락토실라제 활성. 플라스미드에 OLGA5 유전자를 보유하는 대장균 세포의 전체 세포 용균물을 0.4 M 락토스와 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 총 반응 부피 50 ㎕는 전체 세포 용균물을 지시된 양만큼 함유했다. 반응 샘플을 실리카겔 TLC 플레이트상에서 분석했다. 상기 플레이트에 오르시놀 (Orcinol) 시약을 분무하여 당을 가시화했다.
도 5: OLGA5 β-갈락토시다제의 C-말단 결실. 1752개 아미노산의 오픈 리딩 프레임은 OLGA5 β-갈락토시다제를 코딩하며, 출발하는 32개 아미노산이 신호 펩티드 (백색 박스)를 나타내는 것으로 여겨진다. OLGA5의 결실 돌연변이체는 지시된 제한 부위를 사용하여 제작하였다. 밤새 성장시킨 박테리아 배양물로부터 제조한 용균물을 사용하여 β-갈락토시다제 활성을 측정하고, 상대적인 결과를 각 구조물의 오른쪽에 나타냈다. 사용한 제한 효소 부호: BglII (B), EcoRI (E), EcoRV (V), HindIII (H), KpnI (K), NruI (N), PstI (P).
도 6: 트랜스갈락토실라제 활성의 TLC 분석. 시험한 2가지 결실 돌연변이체인 OLGA347 및 OLGA345의 전체 세포 용균물을 지시된 양으로 사용하여 총 부피 50 ㎕로 0.4 M 락토스와 반응시켰다. 반응물을 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 샘플을 실리카겔 TLC 플레이트상에서 분석했다. 상기 플레이트에 오르시놀 시약을 분무하여 당을 가시화했다.
도 7: OLGA347에 의해 생산된 올리고당류. OLGA347 전체 세포 용균물을 지시된 양으로 사용하여 총 부피 50 ㎕로 15％ 락토스와 37℃에서 21시간 동안 인큐베이션했다. 글루코스 C-1 위치에14C로 표지한 방사성 락토스를 사용했다. 샘플들을 TLC 플레이트상에서 분리하고 포스포화상기 (phosphoimager)를 사용하여 정량하였다. A: 락토스, 글루코스 및 갈락토-올리고당류 (GOS) 스팟으로부터의14C 신호 측정에 사용한 화상; B: 백그라운드 (background) (빈 레인)를 감하여 측정한14C-신호.
도 8: OLGA347 효소 반응 생성물의 HPLC 측정. OLGA347 전체 세포 용균물을 지시된 양으로 사용하여 10％, 20％ 및 40％ 락토스와의 반응을 수행했다. 총 부피를 200 ㎕로 사용하였고, 반응물을 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 희석한 샘플을 HPLC 분석하였고, 표준 곡선을 사용하여 관찰된 피크 영역을 농도 (mg/mL)로 전환시켰다. A: OLGA347이 10％ 락토스와 반응한 후에 수득된 당 (mg/mL); B: OLGA347이 20％ 락토스와 반응한 후에 수득된 당 (mg/mL); C: OLGA347이 40％ 락토스와 반응한 후에 수득된 당 (mg/mL); D: 상기 10％ 반응 결과의 플롯. 갈락토-올리고당류의 생산량을 글루코스 또는 갈락토스로서 회수되지 않은 락토스의 양으로서 계산했다 ("GOS").
본 발명의 제1 측면은 비피도박테륨 비피둠으로부터 단리하여 특성화한 신규 β-갈락토시다제인 OLGA5 (서열 1 및 서열 2)에 관한 것이다. 비피도박테륨 비피둠으로부터의 염색체 DNA를 PstI로 소화시킨 삽입물을 함유하는 플라스미드로 대장균 세포를 형질전환시켰다. 발색성 β-갈락토시다제 기질을 함유하는 플레이트상에서 β-갈락토시다제 활성을 보유한 클론을 선별했다. 양성 콜로니 중 하나는 대략 20 kb의 인서트인 pOLGA5 (서열 1)가 있는 플라스미드를 함유했다. DNA 서열결정을 통해 OLGA5 β-갈락토시다제의 추정되는 아미노산 서열 (서열 2)이 현재 공지된 β-갈락토시다제 길이의 대략 2배이며, 공지된 β-갈락토시다제와의 서열 상동성 정도가 놀라울 만큼 낮다는 것을 밝혀냈다. 대장균 내 재조합 OLGA5의 발현을 통해 상기 효소가 락토스 가수분해 활성 뿐 아니라 트랜스갈락토실화 활성까지 보유한다는 것을 밝혀냈다. OLGA5 효소의 C-말단부는 공지된 β-갈락토시다제와 상동성이 없었다. 이어서, OLGA5의 다양한 C-말단 결실 돌연변이체를 제작하고, 생성된 효소의 가수분해 활성 및 트랜스갈락토실화 활성에 대해 조사했다.
본 발명의 제2 측면은 OLGA5의 결실 돌연변이체, 예를 들어 OLGA347에 관한 것이다. 여러 C-말단 결실 돌연변이체 중에서, 578개 아미노산의 C-말단이 결실된 OLGA347이 비교적 저농도의 락토스와 인큐베이션시키는 경우일지라도 생산되는 올리고당류의 수준은 가장 두드러지게 증가된 것으로 밝혀졌다. 명백하게, 상기 효소는 실제로 모든 갈락토스 분자를 갈락토스 또는 글루코스에 전달한다. 그러므로, OLGA5의 C-말단 종결부의 결실은 상기 효소를 가수분해성 OLGA5 β-갈락토시다제에서 트랜스갈락토실화 OLGA347-트랜스갈락토시다제로 전환시킨다. 천연 OLGA5 효소를 포함하는 다른 트랜스갈락토실화 β-갈락토시다제와는 달리, 상기 말단절단형 β-갈락토시다제 OLGA347은 시험된 모든 락토스 농도에서 갈락토스를 수용자 당 분자에 높은 빈도로 전달한다.
한 실시양태에서, OLGA5, OLGA342, OLGA345, OLGA347, OLGA344 또는 임의의 다른 OLGA5 변이체를 코딩하는 인서트를 보유하는 발현 벡터를 사용한다. 이러한 발현 벡터를 사용하여 비피도박테륨, 락토콕쿠스 (Lactococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 스트렙토콕쿠스 (Streptococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 에쉐리히아 (Escherichia), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 토룰라 (Torula), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 아스페르길루스 (Aspergillus)를 포함하는 군에서 선택된 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 비피도박테륨 속의 세포는 비피도박테륨 브레브, 비피도박테륨 롱검, 비피도박테륨 인판티스 (Bifidobacterium infantis), 비피도박테륨 비피둠 및 락토콕쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)로 구성된 군에서 선택한다. 이어서, 상기 세포를 적합한 배양 배지 중에서 OLGA5 또는 OLGA347 변이체 등의 발현을 허용하는 조건하에 배양한 후에, 생성된 효소를 배양물로부터 회수한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, OLGA5 변이체는 상기 언급한 숙주 세포 중 임의의 하나를 형질전환시킬 수 있는 발현 벡터의 일부이다. 이어서, 상기 세포를 적합한 배양 배지 중에서 OLGA5 변이체의 발현을 허용하는 조건하에 배양한 후에, 생성된 효소를 배양물로부터 회수한다. OLGA5 변이체는 임의의 무작위 돌연변이 또는 통상적인 분자 생물학 기술을 통해 제작한 임의의 돌연변이를 함유할 수 있다. 돌연변이되거나 야생형인 OLGA5 DNA 분자의 임의의 단편을 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 상기 단편은 PCR (중합효소 연쇄 반응) 및(또는) 상기 서열에 존재하는 임의의 제한 부위를 이용하여 제작할 수 있다. OLGA5 변이체의 제작 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러므로, 변이체 수득 방법은 본 발명에 중요하지 않다. 본원에 개시된 변이체는 상기 서열 중에 존재하는 제한 부위를 이용하여 서브클로닝함으로써 수득된다.
본 발명의 다른 측면은 요구르트, 치즈, 발효시킨 유제품, 식이보조제 및 건강보조 (probiotic) 식품으로 구성된 군에서 선택된 제품의 생산을 위한, 상기 언급한 세포 유형 중 1종 이상의 용도에 관한 것이다. 이러한 측면에서, 비피도박테륨의 성장 향상이라는 기술적 효과를 이용하여 산업적 제품의 품질을 개선시킨다. 갈락토-올리고당류의 첨가는 건강 촉진 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다. 그러므로, OLGA347에 의해 생산된 갈락토-올리고당류는 올리고당류 생산을 위해 천연 β-갈락토시다제를 사용하는 경우에 비해 훨씬 저렴하고 수득 방법이 쉽다.
본 발명의 다른 측면은 올리고당류의 생산을 위한, OLGA5, OLGA342, OLGA345, OLGA347, OLGA344 또는 임의의 다른 OLGA5 변이체의 용도 또는 상기 언급한 세포 유형 중 1종 이상의 용도에 관한 것이다. 올리고당류로는 프룩토올리고당류, 갈락토-올리고당류, 이소말토-올리고당류, 말토-올리고당류, 락토-수크로스 및 크실로-올리고당류 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이당류 기질, 예를 들어 락툴로스, 트레할로스, 람노스, 말토스, 수크로스, 락토스 또는 셀로비오스를 포함하는 배지 중에서 OLGA5 변이체를 발현하는 세포를 인큐베이션시켜 올리고당류를 생산한다. 인큐베이션은 올리고당류가 생산되는 조건하에 수행한다. 상기 세포는 요구르트, 치즈, 발효시킨 우유 제품, 식이보조제 및 건강보조 식품으로 구성된 군에서 선택된 제품의 일부일 수 있다. 별법으로, 올리고당류를 회수한 후에 이를 제조 전 또는 제조 후의 관심 제품에 첨가할 수 있다. 올리고당류의 첨가는 비피도박테륨 단독의 성장을 향상시키거나, 또는 혼합 배양물 중의 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다.
다른 실시양태에서, 이당류 기질, 예를 들어 락툴로스, 트레할로스, 람노스, 말토스, 수크로스, 락토스 또는 셀로비오스를 포함하는 배지 중에서 OLGA5 변이체를 인큐베이션시켜 올리고당류를 생산한다. 인큐베이션은 올리고당류가 생산되는 조건하에 수행한다. OLGA5 변이체 및 락토스를 포함하는 배지는 요구르트, 치즈, 발효시킨 우유 제품, 식이보조제 및 건강보조 식품으로 구성된 군에서 선택된 제품의 일부일 수 있다. 별법으로, 올리고당류를 회수한 후에 이를 제조 전 또는 제조 후의 관심 제품에 첨가할 수 있다. 올리고당류의 첨가는 비피도박테륨 단독의 성장을 향상시키거나, 또는 혼합 배양물 중의 비피도박테륨의 성장을 향상시킨다.
정의
"β-갈락토시다제 또는 이의 단편": β-갈락토시다제는 락토스를 단당류인 D-글루코스 및 D-갈락토스로 가수분해할 수 있는 효소로서 정의된다. β-갈락토시다제의 단편은 상기 단백질의 5 내지 98％, 바람직하게는 40 내지 95％ 및 가장 바람직하게는 55 내지 75％를 포함하며, 상기 결실은 C-말단 종결부가 결실된 것이 바람직하다.
"숙주 세포"는 잔균, 효모 및 원핵생물로 구성된 군에서 선택된다. 상기 미생물은 더욱 바람직하게는 원핵생물이고, 가장 바람직하게는 비피도박테륨 속 또는대장균 종의 박테리아이다.
"올리고당류"란, 3개 이상의 당 분자로 구성된 올리고당류를 의미한다. 올리고당류의 예로는 갈락토-올리고당류 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 올리고당류의 당 잔기 사이의 연결 방식은 1-4 및 1-6 결합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
β-갈락토시다제와 락토스의 인큐베이션은 0.5 내지 60％ 락토스, 바람직하게는 2 내지 30％ 락토스 및 가장 바람직하게는 2 내지 15％ 락토스의 존재하에서 수행한다.
β-갈락토시다제와 락토스를 인큐베이션시키는 조건은 5 내지 75℃, 바람직하게는 15 내지 45℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 인큐베이션을 수행하는 것으로 정의된다. 인큐베이션에 필요한 시간은 1 내지 50시간, 바람직하게는 5 내지 40시간, 가장 바람직하게는 15 내지 25시간이다.
"식품"은 음식물, 음료수, 정제 및 분말 등의 섭취에 의도되는 제품을 포함한다.
실시예 1: 비피도박테륨 비피둠으로부터 트랜스갈락토실화 β-갈락토시다제의 단리 및 특성화
비피도박테륨 비피둠 DSM 20215로부터의 염색체 DNA를 PstI로 소화시키고, 이를 표준 방법을 사용하여 pKS 플라스미드 (스트라타젠 (Stratagene) 제품)에 라이게이션시켰다. 상기 라이게이션 혼합물로 LacZ 및 β-갈락토시다제가 결핍된 대장균 균주 MT102를 형질전환시켰다. 발색성 β-갈락토시다제 기질인 X-gal을 함유하는 플레이트상에서 β-갈락토시다제를 생산하는 클론을 청색 콜로니로서 확인하였다.
청색 콜로니 중 하나는 대략 20 kb의 인서트인 pOLGA5가 있는 플라스미드를 함유했다. 상기 인서트를 추가로 서브클로닝하고 부분적으로 서열결정하였으며, 추정되는 β-갈락토시다제 (OLGA5 β-갈락토시다제)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 확인하였다 (도 1). BLAST 검색을 통해, OLGA5 β-갈락토시다는 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor) β-갈락토시다제 (AL133171) 및 써모언에어로박터 에탄올리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) (YO8557)와 가장 높은 상동성을 나타내어, 각각 38％ 및 30％ 동일성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 도 3은 OLGA5 및 관련된 아미노산 서열의 "동일성 트리 (tree)"를 나타낸다.
OLGA5 β-갈락토시다제 아미노산 서열에 관한 상세한 분석을 통해, 상기 효소가 이의 N-말단에 추정되는 신호 서열을 함유하고 오픈 리딩 프레임이 현재 공지된 임의의 β-갈락토시다제 크기의 대략 2배인 185 kDa의 폴리펩티드를 코딩한다는 것이 밝혀졌다. 대장균에서 생성된 재조합 OLGA5 효소를 정제하여 N-말단 아미노산을 서열결정한 결과, 대장균에서 발현되는 동안 신호 서열이 절단된다는 것을 확인하였다. SDS-PAGE를 통해, OLGA5 폴리펩티드의 분자량을 확인하였다.
pOLGA5를 함유하는 재조합 대장균 MT102의 세포 추출물을 제조하여 트랜스갈락토실화 활성에 대해 분석하였다. 도 4는 OLGA5가 락토스 가수분해 활성 뿐 아니라 트랜스갈락토실화 활성까지 보유한다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 높은 트랜스갈락토실라제 활성을 보유한 말단절단형 OLGA5 β-갈락토시다제의 제조
OLGA5 중 다른 β-갈락토시다제와 상동성이 있는 영역은 상기 단백질의 N-말단 종결부에 위치한다. C-말단 절반은 임의의 공지된 β-갈락토시다제와 상동성이 없는 것으로 나타났다. 그러나, C-말단부에서 시알리다제-유사 갈락토스-결합 도메인이 관찰되었다. 말단절단형 결실 돌연변이체를 제조하여 OLGA5 β-갈락토시다제의 이러한 C-말단부의 역할을 조사하였다. 생성된 재조합 β-갈락토시다제의 가수분해 활성 및 트랜스갈락토실화 활성을 분석했다. 도 5는 OLGA5 효소의 거의 1/3을 절단하여도 여전히 가수분해 활성을 보유할 수 있음을 나타낸다.
트랜스갈락토실화 활성의 분석시에, 플라스미드 pOLGA5, pOLGA342 및 pOLGA345를 함유하는 대장균으로부터의 추출물을 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 그러나, pOLGA347을 보유하는 세포 추출물에서는, 생산된 올리고당류의 수준은 증가되었으나 갈락토스는 전혀 생산되지 않은 것으로 나타났다. 도 5에 나타난 바와 같이, 말단절단형 OLGA347 β-갈락토시다제를 함유하는 추출물은 락토스를 가수분해하지는 않았으나, 상기 효소는 갈락토스를 물의 히드록실기에 전달하는 대신 실제로 모든 갈락토스 분자를 갈락토스 또는 글루코스 (또는 글리세롤; TLC상에서 글루코스보다 다소 느리게 이동하는 스팟은 NMR에 의해 갈락토-글리세롤임이 밝혀졌음 - 데이타는 나타내지 않음)에 전달했다. 결론적으로, OLGA347은 진정한 "트랜스갈락토실라제"이다.
실시예 3: OLGA347의 트랜스갈락토실화 활성의 특성화
다음의 두가지 방법을 사용하여 OLGA347 β-갈락토시다제의 트랜스갈락토실화 활성을 정량하였다: 방사성 표지된 락토스를 함유하는 반응 혼합물의 TLC 분석 및 표지되지 않은 락토스를 효소적 전환시킨 후의 HPLC 분석.
글루코스의 C-1 위치에14C 표지를 함유하는 락토스를 사용하여 방사성 실험을 수행했다. 표지는 상기 이당류의 글루코스 부분에 존재했기 때문에, 글루코스를 함유하는 반응 생성물만이 검출되었다. 도 7은 15％ 락토스 및 다양한 양의 OLGA347 효소를 사용한 트랜스갈락토실화 실험의 결과를 나타낸다. TLC을 통해 반응 혼합물을 분리한 후, 상기 플레이트를 스캐닝하여 방사성 스팟을 포스포화상기에서 정량했다. 낮은 효소 농도 (추출물 0 내지 0.2 ㎕ 사이)에서 글루코스 및 올리고당류 수준은 거의 동일했으며, 이는 트랜스갈락토실화 반응에서 모든 글루코스 분자가 기질로서 활용되었음을 지시했다. 가수분해되어 "유리"된 글루코스는 효소가 고농도인 경우에만 나타났다.
표지되지 않은 락토스를 사용한 실험에서, 상이한 기질 및 효소 농도를 시험하였다. 도 8은 OLGA347 효소의 농도를 변화시키면서 수행한 효소 반응에서 기질로서 10％, 20％ 및 40％ 락토스를 사용한 실험을 나타낸다. 반응 혼합물을 HPLC로 붙석하고, 락토스, 글루코스, 갈락토스 및 갈락토-올리고당류의 농도를 계산했다. 도 8은 효소 농도가 증가함에 따라 락토스 농도가 감소하고 글루코스 농도가 증가하지만, 실제로는 "유리" 갈락토스는 생산되지 않았음을 보여주며, 이는 락토스 중의 거의 모든 갈락토스 분자가 다른 당으로 전달되었음을 지시한다. 저농도의 효소를 사용한 반응에서 측정한 탄수화물의 농도 계산은 글루코스와 갈락토스의 비율이 대략 0.1임을 지시하는데, 이는 모든 락토스 분자가 유리 갈락토스 및 글루코스로 가수분해되며, 트랜스갈락토실화에는 9개의 락토스 분자가 사용된다는 것을 암시한다. 도 8에 나타난 바와 같이, 트랜스갈락토실화 반응은 10％ 내지 40％ 락토스 범위의 락토스 농도와는 무관하다. 10％, 20％ 또는 40％ 락토스를 기질로서 사용한 트랜스갈락토실화 반응에서 생산된 갈락토-올리고당류의 최대 수율은 각각 39％, 44％ 및 37％였다 (첨가된 락토스 1 mg 당 생산된 올리고당류 (mg)).
참고문헌
Claims (33)
- a) 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열,b) 엄격한 조건하에 (a)의 서열과 혼성화하는 DNA 서열, 또는c) (a) 또는 (b)의 서열과 동의성이 있는 (degenerative) DNA 서열.
- 제1항에 있어서, 서열 1의 서열인 DNA 서열 또는 이의 단편.
- 제2항에 있어서, 서열 1의 위치 212 내지 214의 ATG로 출발하여 위치 5468 내지 5470의 TGA에서 종결하는 서열을 포함하는 DNA 서열 또는 이의 임의의 단편.
- 제3항에 있어서, 서열 1의 위치 212 내지 214의 ATG로 출발하여 위치 3731 내지 3734의 ATCT에서 종결하는 서열을 포함하는 DNA 서열 또는 이의 임의의 단편.
- 제3항에 있어서, 서열 1의 위치 308 내지 310의 GTC로 출발하여 위치 5468 내지 5470의 TGA에서 종결하는 서열을 포함하는 DNA 서열 또는 이의 임의의 단편.
- 제3항에 있어서, 서열 1의 위치 308 내지 310의 GTC로 출발하여 위치 3731 내지 3734의 ATCT에서 종결하는 서열을 포함하는 DNA 서열 또는 이의 임의의 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 2에 따른 아미노산 서열의 60％ 미만, 바람직하게는 45％ 미만, 더욱 바람직하게는 25％ 미만이 변화되는 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 DNA 서열 또는 이의 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 보존적 아미노산 치환되는 뉴클레오티드 치환을 포함하는 DNA 서열.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 DNA 서열에 의해 코딩되는 효소.
- 서열 2에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 효소.
- 서열 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 β-갈락토시다제.
- 제10항에 있어서, 서열 2에 정의된 바와 같은 Met(1) 내지 Gly(1752)의 서열 또는 이의 단편을 갖는 효소.
- 제12항에 따른 성숙한 β-갈락토시다제.
- 제10항에 있어서, 서열 2에 정의된 바와 같은 Met(1) 내지 Ile(1174)의 서열 또는 이의 단편을 갖는 효소.
- 제14항에 따른 트랜스갈락토실화 효소.
- 제14항에 있어서, 서열 2에 정의된 바와 같은 Ala(33) 내지 Ile(1174)의 서열 또는 이의 단편을 갖는 효소.
- 제16항에 따른 성숙한 트랜스갈락토실화 효소.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,a) 37℃에서 100 g/L 락토스 용액 중에서 β-갈락토시다제 활성에 대한 트랜스갈락토실화 활성의 비가 1 : 1 이상임,b) 37℃에서 100 g/L 락토스 용액을 사용한 배치 (batch) 반응에서 25％ 이상의 갈락토-올리고당류 생산을 촉매함,c) 37℃에서 100 g/L 락토스 용액을 사용한 배치 반응에서 갈락토-올리고당류 생산을 촉매하며 갈락토-올리고당류의 농도가 최고인 반응 시간에 유리 형태로 존재하는 락토스로부터 15％ 미만의 갈락토스 생산을 촉매함의 특징 중 하나 이상을 보유하는 트랜스갈락토실화 효소.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제19항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포.
- 제19항 또는 제20항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 진균 세포인 세포.
- 제23항에 있어서, 비피도박테륨 (Bifidobacterium), 락토콕쿠스 (Lactococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 스트렙토콕쿠스 (Streptococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 에쉐리히아 (Escherichia), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 토룰라 (Torula), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 아스페르길루스 (Aspergillus)로 구성된 군에서 선택된 세포.
- 제24항에 있어서, 비피도박테륨 브레브 (Bifidobacterium breve), 비피도박테륨 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테륨 인판티스 (Bifidobacterium infantis), 비피도박테륨 비피둠 (Bifidobacterium bifidum) 및 락토콕쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)로 구성된 군에서 선택된 세포.
- 요구르트, 치즈, 발효시킨 우유 제품, 식이보조제 및 건강보조 (probiotic) 식품으로 구성된 군에서 선택된 제품의 생산을 위한, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 유제품.
- 갈락토-올리고당류 생산을 위한, 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 트랜스갈락토실화 효소 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
- 요구르트, 치즈, 발효시킨 유제품, 식이보조제 및 건강보조 식품으로 구성된 군에서 선택된 제품의 일부인 갈락토-올리고당류 생산을 위한, 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 트랜스갈락토실화 효소 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
- 비피도박테륨의 성장을 향상시키는 갈락토-올리고당류 생산을 위한, 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 트랜스갈락토실화 효소 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
- 혼합 배양 발효물 중 비피도박테륨의 성장을 향상시키는 갈락토-올리고당류생산을 위한, 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 트랜스갈락토실화 효소 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포를 적합한 배양 배지 중에서 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 트랜스갈락토실화 효소의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계 및 생성된 효소를 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 트랜스갈락토실화 효소의 생산 방법.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 효소 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 세포를 락토스 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 갈락토-올리고당류의 생산 방법.
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