CN101517076B - 双歧杆菌中的遗传重建 - Google Patents
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Abstract
公开了包含经定制从而缺乏有效功能基因的基因组的双歧杆菌。还公开了制备此类细胞的方法。该方法用于制备双歧杆菌细胞，其缺少某些功能性抗生素抗性基因，如tetW，并且对抗生素如四环素敏感。
Description
发明领域
本发明涉及乳酸细菌中的抗生素敏感性。更特别地，其涉及双歧杆菌种中四环素抗性基因的去除，以及去除或无效双歧杆菌种中基因的方法。
发明背景
近几年对于针对可用抗生素增强的细菌抗性的关注已经不断增强。尽管多数关注涉及获得的抗性，该抗性至少部分归因于医师对广谱抗生素的广泛使用，也有一些关注是有关因食物和农业目的使用获得性抗生素抗性基因的细菌所产生的抗生素抗性。例如，在从环境、动物和人类包括儿童分离的微生物中四环素抗性基因的存在和分布是普遍的。在一些情况下，抗生素抗性对于特定种类而言可能是固有的——例如，由于特定的细胞膜特性。抗生素抗性也可通过细菌基因突变而获得，并且其可通过基因转移从环境中的抗性细菌中获得。
在食物加工或农业生产中使用任何拥有或获得性抗生素抗性的细菌造成在消费之前或之后的某点，抗性促进基因向其它细菌转移的潜在的理论上的危险，所述其它细菌存在于食物中、消费食物之后人或动物的胃肠道(GIT)中、或环境中。此类细菌的例子可发现于双歧杆菌种，例如，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)例如动物双歧杆菌乳酸亚种(也称为动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis subsp.nov.)，从前称为乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，且有时本文也这样提及)。一个此类菌种，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818，CNCMI-3446是商业上可获得的，已用作食品添加剂超过20年，并通常被认为是安全的。最近发现，与人和动物来源的某些其它革兰氏阴性和革 兰氏阳性细菌一样，该细菌也有四环素抗性基因tetW存在。尽管四环素抗性转移在理论上是可能的，但目前即使是在实验室条件下仍不可能证实这一点。然而，从克隆实验已知来自此菌株的tetW在革兰氏阳性细菌中是有活性的，尽管在革兰氏阴性细菌中是无活性的。
然而，为排除该基因的任何意外转移的风险，需要用于从此菌株中去除该基因的方法。也需要具有对四环素降低的抗性的菌株变体。
发明简述
本发明的一个方面描述了双歧杆菌细胞，所述细胞包含经定制的从而缺乏有效功能基因的基因组。在某些实施方案中，双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌细胞，且更特别地，是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。本文示例了动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034。
在某些实施方案中，功能基因提供了抗生素抗性；例如，功能基因是tetW并提供对四环素的抗性。在多种实施方案中，经定制的缺乏有效tetW基因的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的相当的细胞对四环素更敏感至少5-10倍。在其它实施方案中，如利用平板扩散试验所测定的，细胞对高于大约0.3微克每毫升的四环素浓度是敏感的。示例性实施方案的特征是动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034，保藏为CNCMI-3664。定制的双歧杆菌细胞可基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在一项实施方案中，定制的细胞在其基因组的剩余部分是基本上未改变的。
本发明的另一方面特征在于包含上述细胞的动物双歧杆菌。
本发明的另一方面特征在于产生缺乏有效的预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法。该方法包括下述步骤：(1)从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；(2)用在双歧杆菌中非复制的质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒包含该功能基因的上游和下游侧翼序列和编码选择性标记的基因；(3)在允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长、但那些不具有编码选择性标记的基因的细胞不能生长的条件下培养双歧杆菌细胞，从而选择含有整合质粒的转化体；(4)在非选择性条件下培养转 化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合的质粒丢失；(5)通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；和(6)确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生出缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。
在某些实施方案中，预定功能基因被缺失。功能基因可为提供对抗生素增强的抗性的基因；例如，提供对四环素抗性的tetW基因。
在本文所述的某些实施方案中，缺失的或致使其失效的唯一功能基因是预定的功能基因。
在多种实施方案中，选择压力是抗生素例如大观霉素的存在。
在某些实施方案中，质粒通过同源重组整合进基因组。整合质粒可通过第二次同源重组而失去。
在前述方法的多种实施方案中，在非选择性条件下培养转化体至少大约100代。
上述方法可在动物双歧杆菌种的双歧杆菌细胞上实施，更特别地在动物双歧杆菌乳酸亚种，且甚至更特别地动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818细胞上实施。从对菌株NCC2818实施该方法所获得的细胞通过动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034来例证。
上述方法还可在长双歧杆菌(B.longum)种的双歧杆菌细胞上实施。
本发明的另一方面特征在于动物双歧杆菌乳酸亚种细胞，如利用平板扩散试验所测定的，其对高于大约0.3微克每毫升的四环素浓度是敏感的。在示例性实施方案中，动物乳酸双歧杆菌细胞是菌株NCC9034。
本发明的其它特征和优势将通过参考下列的发明详述、附图和实施例而得到理解。
附图简述
图1.pMDY28的限制性内切酶切割位点图谱，其显示出大观霉素(spec)和氨苄青霉素(Amp)抗性标记的位置。tetW侧翼序列插入ApaI 位点(碱基659)和位于6840的HindIII之间。质粒不含有用于在双歧杆菌中复制的有效ori。
图2.上图显示了从两个单独的突变体(命名为A和B的泳道)获得的基因组DNA的ClaI、EcoRI、KpnI和NotI限制性片段的DNA印迹分析。泳道C含有获得自用于产生突变体的野生型菌株(NCC2818)的比较片段。下图显示了在DNA印迹上观察到的片段的大小，所述片段是获得自突变体(A&B)的与获得自野生型菌株的那些。
图3.如利用E-TEST检测最小抑制浓度(MIC)所测定的，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC362(野生型)(左图，大约16μg/ml四环素)和NCC9034(右图，大约0.3μg/ml四环素)对抗生素四环素的抗性。
图4.NCC362(上图)和NCC9034(下图)菌株的tet基因座图谱，显示出后一菌株中tetW基因的缺失。用于产生敲除突变体的tetW侧翼序列显示于两图中的阴影条形中。
图5.pMDY24的限制性内切酶切割位点图谱，显示出氯霉素(Cm)和氨苄青霉素(Amp)抗性标记的位置。Bl0108侧翼序列插入EcoRI位点(碱基1)和位于5766的SalI之间。质粒不含有用于在双歧杆菌中复制的有效ori。
图6.NCC2705(上图)和NCC9035(下图)菌株的Bl0108基因座图谱，显示出后一菌株中Bl0108基因缺失。用于产生敲除突变体的Bl0108侧翼序列显示于两图中的阴影条形中。
图7.图A显示在第二次重组事件和在BL0108缺失方法的最后步骤中质粒解离后获得的氯霉素敏感克隆的PCR分析。来自两个菌落(第1&2泳道)的PCR片段的大小表明Bl0108(3885bp)的缺失，然而来自10个其它菌落的PCR片段的大小表明Bl0108基因座的野生型构型。图B显示了取自两个单独的突变体(第1&2泳道)的基因组DNA的HindIII限制性片段的DNA印迹分析。泳道3含有获得自用于产生突变体的野生型菌株(NCC2705)的比较片段。下图显示了在DNA印迹上观察到的片段的大小，所述片段是获得自突变体(1&2)的与获得自野生型菌株(3)的那些。
图8.用于从双歧杆菌细胞缺失功能基因的通用策略的图解。该策略是用于本文所述的方法中以及实施例中策略的一个例子。简要地，将目的突变区域(在此实施例中为突变的tetW基因座)克隆进大肠杆菌(E.coli)质粒中(A)并转化至双歧杆菌细胞中(B)。通过同源重组获得质粒向双歧杆菌基因组的整合，并通过在含有合适抗生素(在本实施例中为大观霉素)的生长培养基上平板接种细胞进行选择(C)。在无抗生素选择下复制细胞以便允许导致质粒解离的第二次同源复制事件(D)且染色体区域以如图A中所述质粒相同的构型突变。等位基因交换之后含有野生型基因座区域的质粒不能在双歧杆菌中复制，并且在无抗生素选择的培养基上培养的细胞复制过程中被消除(E)。用合适的分子生物学技术例如PCR或DNA印迹分析来检查最终的突变细胞。
说明性实施方案详述
细胞和培养物
在本发明的几方面的第一方面提供了双歧杆菌细胞，例如来自动物双歧杆菌或长双歧杆菌的那些，其包含定制的从而缺乏或基本缺乏有效的预定功能基因的基因组。任何特定的预定基因的定向破坏或缺失都还未在双歧杆菌中完成。
在一项实施方案中，双歧杆菌是来自食品或饲料加工或者饮食或药物补充物中所用菌株的细胞。合适的双歧杆菌菌株包括但不限于动物双歧杆菌和长双歧杆菌的菌株。另外合适的为分类或未分类的其它双歧杆菌，其被有意地添加至食品或饲料产品，或大量发现于食品或饲料产品中。其它有用的双歧杆菌种包括由于制造或生产食品或饲料、或通过其它商业过程、或通过人或动物对此类产品的消费而释放进环境的任何细胞。双歧杆菌种还可以有意作为人类或动物，包括人类婴儿和动物幼崽的补充物的多种形式获得，例如用来治疗胃肠状况例如腹泻、或促进健康的肠道微生物区系。在一项实施方案中，细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。
尽管所要破坏或缺失的基因可为任何功能基因(例如，为细胞编码功 能的任何基因)，在一项目前优选的实施方案中，功能基因提供抗生素抗性。在具体的实施方案中，基因是获得性抗生素抗性基因，即，认为基因不是双歧杆菌细胞中当前发现的内在基因，而认为其为非外在的，例如来自环境或另一生物。在另一实施方案中，功能基因编码酶或酶抑制剂，例如能够负面影响食品加工或生物的其它目的特性(例如，促进健康肠道微生物区系)的抑制剂。本领域技术人员将理解，多种此类抑制剂可由一种或多种基因编码。在一项实施方案中，抑制剂是蛋白酶抑制剂。
在特别的实施方案中，基因产物提供了对四环素的抗性。在一项实施方案中，功能基因是tetW。已知tetW基因分布相对广泛。在一项实施方案中，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC2818目前优选作为含有待缺失tetW基因的细胞来源。tetW基因座序列显示于SEQ ID NO：1中。
在某些实施方案中，野生型细胞与本发明的细胞即具有缺失基因的细胞相比对更高浓度的抗生素有抗性。微生物细胞对特定抗生素的敏感性可以多种方式进行测定。测定抗生素敏感性的一种方便的方法是利用平板扩散试验，例如E-试验(由AB BIODISK在商业上生产)。E-试验系统使用在塑料条上的抗生素浓度的预制梯度并可用于测定抗生素对特定生物的精确的最小抑制浓度(MIC)。
在目前优选的实施方案中，本发明的双歧杆菌细胞具有被破坏的tetW基因，但无其它功能基因缺失，且该细胞比含有有效tetW基因的对照野生型细胞对四环素更敏感至少5倍。在另一实施方案中，具有失效的tetW基因的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的对照细胞更敏感至少10倍。
在一项实施方案中，如用平板扩散试验所测定的，具有失效的tetW基因的双歧杆菌细胞对高于大约0.3μg每毫升的四环素浓度是敏感的。
如本文所用的，与基因组有关的术语“定制的”表明该基因组已通过人手进行处理或修饰。在一些实施方案中，通过缺失特定基因的整个基因座来定制基因组。在其它定制的基因组中，调节序列中的缺失或突变可提供预定基因功能性的完全或至少基本丧失。除了那些经操作而丧失整个基因座、基因或甚至编码序列的基因组外，定制的基因组包括仅仅具有小的改 变(包括插入或缺失)的那些，所述改变例如导致功能基因的功能丧失或基本丧失的点突变或移码突变。
尽管定制导致有效性的完全丧失是优选的，但这也许不总是容易完成的，并且有时某种活性的基本丧失将是有用的。如本文所用的“基本上丧失”表明多于一半的功能活性丧失，即具有定制基因组的细胞具有由预定功能基因所提供的功能属性的一半以下。例如，当与其所来源的亲本细胞相比较时，具有关于酶的定制基因组的细胞将具有该酶的低于50％的活性。备选地，具有定制基因组的细胞可产生少于50％的与预定功能基因相关的基因产物。本领域技术人员将理解，在处理某些功能活性中，具有少于50％的特定功能基因的基因产物的细胞可能不总是丧失细胞中可测定活性的50％。
优选在定制的基因组中，在其本身编码序列中至少有一个点突变或移码突变，以便阻止完整功能基因向与具有定制基因组的细胞邻近的、或其环境中的其它细胞转移。因此，如本文所用的，“定制”需要有基因组的操作，其中该操作针对预定功能基因有效性的丧失或基本丧失。
因此，在一项实施方案中，功能基因是完全缺失的、或至少部分缺失的。该实施方案确保了没有功能性抗生素抗性基因可不经意地转移至环境、其它肠道微生物区系、或环境中的其它生物中，并且还确保了甚至没有一个破坏的基因可被转移以仅通过下游事件而被恢复。因此，在优选的实施方案中，根据本发明此方面的双歧杆菌细胞基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在一项实施方案中，编码序列至少基本上缺失。备选地，与预定功能基因相关的一个或更多编码序列也可被缺失。例如功能基因的在细胞中无其它功能的结合序列或调节序列可被缺失。在其它实施方案中，具有定制基因组的细胞具有更精细的改变，例如导致预定基因的功能性丧失或基本丧失的点突变或移码突变，例如，定制的基因组的功能基因的有效性降低。
另外在优选的实施方案中，双歧杆菌细胞在其基因组的剩余部分中是基本上未改变的。换句话说，除了丧失功能基因的有效性，并且优选该功 能基因完全或至少基本上从细胞缺失外，双歧杆菌细胞与其来源的细胞(例如亲本细胞)是相同的，或接近相同的。在已经经过长时间适应从而提供目的特性的菌株或培养物的情况下，这是特别有用的，所述目的特性对于例如食品加工，例如乳制品例如酸乳等的发酵是有用的。例如，在下面更加详细描述的一项实施方案中，其中动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818是起始(亲本)细胞，tetW是预定的功能基因的情况下，所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034，其定制的基因组与亲本区别仅在于缺乏预定的tetW基因。如预期的，除了NCC9034细胞所展示出来的对四环素增加的敏感性，细胞在表型上也是类似的。前述实施方案对用于帮助治疗临床状况的菌株也是有用的，特别是那些已经选择或开发而具有目的功能例如快速的传代时间或在肠道中延长的停留时间的菌株。
在其几个方面的另一方面，本发明提供了双歧杆菌的培养物，其包含具有缺失的、或至少失效的功能基因的细胞。此类培养物的用途无需详细讨论，因为本领域技术人员将理解它们。在一项实施方案中，培养物包含来源于已知培养物的细胞，该已知培养物经发现或测定在其基因组中具有不期望的功能基因。在一项实施方案中，基因是外源获得性基因，例如编码抗生素抗性的基因。在一项实施方案中，基因是四环素抗性基因。在一项特定的实施方案中，基因是tetW基因，且在特别的实施方案中相关的tetW基因序列是SEQ ID NO：1中提供的序列。
制备细胞和培养物的方法
在另一方面，本发明提供了生产缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法。该方法包含下述步骤：
从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；
用质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒在双歧杆菌中是非复制的且包含所述功能基因的上游和下游侧翼序列、以及编码选择性标记的基因；
在仅允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长的条件下培养双歧杆菌细胞，从而选择已将质粒整合进染色体的功能基因的基因座上 的转化体；
在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合质粒的丢失；
通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；
确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。
如上面对细胞和培养物的描述，优选双歧杆菌细胞来自食品或饲料加工中所用的细胞，例如动物双歧杆菌或长双歧杆菌。考虑将其它双歧杆菌用于本文，例如那些用于人类或动物临床治疗的、或其中预防所用的双歧杆菌。在一项实施方案中，用作起始细胞的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种。在本文例证的某些实施方案中，动物双歧杆菌乳酸亚种细胞是菌株NCC2818(商业上可以“BB12”获得自Chr.Hansen)。
缺失的基因可为任何功能基因(例如，为细胞编码功能的任何基因)，在一项目前优选的实施方案中，功能基因提供抗生素抗性。在具体的实施方案中，基因是获得的抗生素抗性基因，即，认为基因不是双歧杆菌细胞当前发现内在的，而认为其为外在的，例如来自环境或另一生物。
在一项实施方案中，致使失效或缺失的基因编码对四环素的抗性。在一项实施方案中，功能基因是tetW。在一项实施方案中，tetW基因具有如SEQ ID NO：1所提供的序列，其代表了动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818中整个tetW基因座。在一项实施方案中，起始细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞菌株NCC2818。这些细胞的样品按照布达佩斯条约的规定已保藏于巴斯德研究所的专利保藏机构中。当动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818是起始细胞时，tetW是预定的功能基因，所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034，其样品也按照布达佩斯条约的规定已保藏于巴斯德研究所的专利保藏机构中。
在某些实施方案中，野生型细胞与从所提供的方法获得的细胞相比对更高浓度的抗生素有抗性。平板扩散试验和相关敏感性测试例如E-test(AB BIODISK)是检测细胞对抗生素敏感性的优选途径。然而，所测定的抗生素对特定生物的最小抑制浓度(MIC)是比较相对敏感性的便利途径。
在目前优选的实施方案中，本发明的双歧杆菌细胞具有被破坏的或缺失的tetW基因，但没有其它功能基因在其功能方面受到损失或破坏。在一项实施方案中，由该方法产生的细胞比含有有效tetW基因的对照野生型细胞对四环素更敏感至少5倍。更特别地，所获得的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的对照细胞对四环素更敏感至少10倍。在其它实施方案中，细胞比保留tetW基因的对照细胞更敏感20、30、40或甚至50倍或更多倍。在特定的实施方案中，如利用平板扩散试验或E-TEST所测定的，所获得的双歧杆菌细胞对高于大约0.3μg每毫升的四环素浓度敏感。
如上所述，对于细胞和培养物，在一项实施方案中，功能基因被完全缺失，或至少基本上缺失，使得没有功能性抗生素抗性基因可不经意地转移至环境、其它肠道微生物、或环境中的其它生物中。类似地，甚至没有一个被破坏的基因可转移，因为基本上所有的序列已从生物丢失。因此，在此类实施方案中，根据该方法制备所获得的双歧杆菌细胞基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在多项实施方案中，编码序列至少基本上缺失，且甚至与预定功能基因相关的非编码序列也被缺失。
在目前优选的实施方案中，除了缺失或致使失效的基因外，所获得的双歧杆菌细胞基因组基本上未改变。优选地，除了致使失效或缺失的功能基因外，所获得的双歧杆菌细胞的基因组与其来源的细胞(例如，亲本细胞)的是相同的或近乎相同的。因此，由本方法所产生的细胞将与其来源的亲本、野生型或原始型菌株具有基本上或甚至完全相同的功能或属性(例如营养需求、酶谱、生长特性、风味产生、和酸产生)。因此，如此产生的细胞可用于产生有用的双歧杆菌培养物，其包含具有缺失的、或至少失效的功能基因的细胞。当细胞来自已知培养物时这是特别正确的，其中发现已知培养物在其基因组中具有不希望的功能基因，例如获得的抗生素抗性基因，例如四环素抗性基因，特别地tetW基因。
在本方法的一项实施方案中，质粒编码另外的选择性标记。在某些实 施方案中，选择性标记提供了抗生素抗性。在此类实施方案中，筛选整合质粒的转化体的选择性条件包括以对应于抗性标记的抗生素形式的选择压力。在一项实施方案中，抗生素是大观霉素，在另一实施方案中其为氯霉素。
在某些实施方案中，质粒通过同源重组整合进基因组，优选地位于上游和/或下游侧翼序列；发生交换事件，从而允许环形质粒变为整合进双歧杆菌基因组。在另一实施方案中，整合的质粒通过第二次同源重组事件而丢失，优选地伴随着丢失全部或基本上全部的预定功能基因——例如，tetW基因座或其它靶向基因。
如上所述，在优选的实施方案中，缺失或致使失效的唯一功能基因为预定的功能基因。
在一项实施方案中，在非选择条件下培养转化体足够的代数，从而允许不需要的序列丢失，包括预定的功能基因。在一项实施方案中，培养至少100代将促进此类丢失。
提供下列实施例进一步解释本发明的这些或其它方面，并不应理解为将本发明限制至所举例的内容。
实施例
非复制性质粒的构建
用下列引物对扩增tetW起始密码子上游和其终止密码子下游两侧的大约3kb的DNA片段：
mdy100：5’-CGCACCGGGCCCCCTCACGCAAACTCTACG-3’(SEQID NO.：2)；
mdy98：5’-TGTGGTGTATCACATGTGATTGTCCTCCCTTTA-3’(SEQ ID NO.：3)和
mdy99：5’-AGGACAATCACATGTGATACACCACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.：4)
mdy89：5’-CCGTCCAAGCTTTCTATCGCGAGATAATCAGC-3’)(SEQ ID NO.：5)。
将获得的扩增产物用作模板，利用引物mdy100和mdy89来进行融合PCR，其获得含有通过tetW的起始和终止密码子连接起来的tetW上游和下游区域的DNA片段。
通过HindIII和Apa1在其末端消化DNA片段并将其克隆进pJL74(Ledeaux和Grossman，J.Bacteriol.1995 Jan；177(1)：166-75.)中位于HindIII和Apa1之间。所获得的质粒命名为pMDY28(SEQ ID NO.：6)。图1提供了详细的限制性内切酶位点图谱。插入pJL74从而形成pMDY28的DNA片段的序列得到验证并显示与来自动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818染色体的序列相同。这表明在PCR介导的DNA扩增过程中和在随后的DNA操作中均未引入突变。
动物双歧杆菌的转化和等位基因交换
利用Argnani等人1996(Microbiology；142：109-14.)所述的方法将质粒pMDY28转化入动物双歧杆菌细胞中。将细胞置于每升含有100mg大观霉素的MRS平板上。厌氧选择所获得的specR转化体。由于质粒pMDY28不能在动物双歧杆菌中复制，specR菌落最可能来自经单次交换事件通过同源重组而整合进动物双歧杆菌基因组的质粒。从前还未报道过非复制性质粒向双歧杆菌细胞的成功转化。
在无抗生素选择的MRS培养液中培养specR转化体大约100代从而允许质粒丢失，并将单独的菌落平板接种于MRS琼脂培养基上。为了确保质粒已从动物双歧杆菌基因组中移除，通过在添加和不添加大观霉素的MRS琼脂上影印培养测试单独菌落的大观霉素抗性的丢失。
在所测试的750个菌落中，163个菌落是大观霉素敏感的(21％)，表明质粒已通过第二次交换事件的发生从动物双歧杆菌染色体中切除。
第二次此事件可导致两种基因组构型：
i)回复至带有与野生型细胞相同的tetW基因座的野生型构型，或者
ii)缺失tetW。
为了区别这两种可能性，利用下列引物对通过直接菌落PCR测试了上述163个大观霉素敏感菌落中135个菌落的tetW缺失：
mdy94：5’-GAGCATGTATTCGGTGTCG-3’(SEQ ID NO.：7)和
mdy95：5’-GATTTGCCCTATCGACTG-3’(SEQ ID NO.：8)。
在135个所测的菌落中，两个产生了1034bp的DNA条带，表明tetW缺失，而其它获得了与野生型细胞所获得的相似的更高分子量(2949)的PCR片段(见图2，小图B)。
tetW缺失突变体的DNA印迹分析
利用从经PCR分析所鉴定的两个候选突变体提取的基因组DNA，通过PCR和DNA印迹分析证实了tetW的缺失(见图2，小图A&B)。用限制性酶(ClaI、EcoRI或NotI)消化染色体DNA样品。DNA印迹与来自pMDY28的DNA杂交。DNA印迹杂交确认tetW已从两个候选突变体的基因组中缺失(泳道A&B)。仅保留了一个菌株，随后将其命名为NCC9034。
动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034相对于NCC2818的抗生素敏感性测试
将动物双歧杆菌乳酸亚种野生型菌株NCC2818的四环素敏感性与显示出缺失了基本上全部tetW基因的衍生菌株NCC9034相比较。使用商业化的E-TEST(AB BIODISK)测定每个菌株的四环素MIC。
结果显示于图3中。尽管菌株NCC2818具有16μg/ml的MIC，NCC9034对四环素更加敏感，具有仅大约0.3μg/ml的MIC。因此，NCC9034比其亲本野生型菌株NCC2818对四环素更敏感大约50倍。该敏感表型与tetW基因功能性的丧失完全一致。如上面DNA印迹分析中所看到的，这得到了基因分析的支持。
编码蛋白酶抑制因子蛋白质的长双歧杆菌基因(Bl0108)的缺失
非复制型质粒的构建
利用下列引物对扩增Bl0108两侧大约3kb的DNA片段：
mdy82：5’-CGACCCAAGCTTGGATCGGCTCGTGCATCATTGC-3’(SEQ ID NO.：9)；
mdy83：5’-GCAAACCGTACCTCAATACC-3’(SEQ ID NO.：10)和
mdy84：5’-CGACCCAAGCTTGCAGTCCGTCAATTAGGGTG-3’(SEQID NO.：11)
mdy85：5’-CGTTGCTGACGTTGCGGTTC-3’)(SEQ ID NO.：12)。
利用EcorI和HindIII消化用mdy82和mdy83所获得的PCR产物。通过HindIII和SalI消化用mdy84和mdy85所获得的PCR产物。
通过它们共同的HindIII限制性位点连接扩增的DNA片段，并通过三路连接将其克隆进入pJH101(Ferrari，F.R.等人，J.Bacteriol.(1983)154：1513-1515)在EcoRI和SalI之间。将所获得的质粒命名为pMDY24(SEQ ID NO.：13)。pMDY24详细的限制性内切酶位点图在图5中提供。
长双歧杆菌的转化和等位基因交换
根据Argnani等人1996(Microbiology；142：109-14)所述的方法将质粒pMDY24转化进长双歧杆菌NCC2705细胞中，只是在生长培养基中省去蔗糖。将细胞涂布在含有每升3.5mg氯霉素的MRS平板上。厌氧选择所获得的cmR转化体。因为质粒pMDY24在长双歧杆菌中不能复制，cmR菌落最可能来自于经单次交换事件通过同源重组整合进长双歧杆菌基因组的质粒。
在将单独的菌落平板接种于MRS琼脂培养基之前，在无抗生素选择下培养cmR转化体大约100代从而允许质粒丢失。为确保质粒已从长双歧杆菌基因组中移除，通过在添加和不添加氯霉素的MRS琼脂上影印培养来测试个体菌落的氯霉素抗性的丢失。
在所测试的200个菌落中，22个菌落是氯霉素敏感的(11％)，表明 质粒已通过第二次交换事件的发生从长双歧杆菌染色体中切除。
第二次交换事件可导致两种基因组构型：
i)回复至带有与野生型细胞相同的Bl0108基因座的野生型构型，或者
ii)缺失Bl0108。
为了区别这两种可能性，从22个氯霉素敏感菌落的12个中提取染色体DNA。利用下列引物对通过PCR测试了染色体DNA中Bl0108的缺失：
mdy27：5’-TCGGAAGATCTCATGGTCAACGAGTTCGC-3’(SEQ IDNO.：14)和
mdy39：5’-TAGTACTAAGCTTCTTGAGCTCTTCCTTCTGC-3’(SEQID NO.：15)。
在所测的12个菌落中，两个显示出3885bp的PCR片段，表明Bl0108的缺失(图7，小图A，泳道1-2)。测试的其它10个菌落导致与野生型细胞所获得的片段相似的5311bp的较大PCR片段(见图7，小图A，泳道3-12)。
Bl0108缺失突变体的DNA印迹分析
利用从如上所述的经PCR分析所鉴定的两个候选突变体提取的基因组DNA，通过PCR和DNA印迹分析证实了Bl0108的缺失，并显示于图7。用限制酶(EcoRI和HindIII)消化染色体DNA样品。用来自pMDY24的DNA与DNA印迹杂交。DNA印迹分析确认Bl0108基因已从两个候选突变体的基因组中缺失(图7，泳道A和B)。仅保留了一个菌株，随后将其命名为NCC9035。
序列表
<110>F·阿里戈尼
M·戴雷
<120>双歧杆菌中的遗传重建
<130>48520-1009-P1(NO 8025/US/PSP)
<160>15
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>26917
<212>DNA
<213>动物双歧杆菌
<400>1
agtgatggag acctatgccg accaccgtat ggccaccttc gccgcgatgc tcggattggc 60
gattgatggc attgaagtaa cgaatgtgga gaccacgcgc aagacgattc cggatttcgt 120
gggtatgtgg aatggcatgt tgcgcggcaa gtgacagtag gcgcccggaa aaatgtgagg 180
ggctgcaaga cgaacggtct tgcagcccct cacatttttt gtggagaatc agatcttgtt 240
gccgtaggtg tcttccccgg cggtgacgat ctcgttggcg cgctgtgcga tggcgagctc 300
ctcattggtg gggtagacga cgacggtgac agtggaatcc ggcgtggaga taatgcgcgg 360
ttccttcgaa cgggtgtcgt tcttgtcgtt gtcgagcttg acaccgaacg gtgccagctt 420
ctcacacacc atgcggcgaa cgatttcgtc gttctcgccg acaccggcgg tgaaggtgag 480
cacatcgagg ccgccgagct gtgcggtgta ggcgccgatg tagctgacga tgcggtgcac 540
gtagatgtcg agggcgagct tggcgttctc gtcgccttcc gcaacgaggc ggtgcacttc 600
gcgcatgtcg ccgaagccgg tcatgcccat catgccggac ttcttgttga acaggtcgtc 660
gagctcatcg acattcatat cggcattgcg catcaggtgg aacacggcgg ctggatcgat 720
gtcgcccgtt cgggagccca tgacgaggcc ttcgagcggg gtgaggccca tggaggtctc 780
gatggggcgg ccgccgagtt ccgcggaggc ggaggcgccg ttgccgatgt gcagcacgat 840
ctgcttgagg cccttggcgg cctcggcgtc aatgccgagg aactctggaa tctgggagga 900
gacgaaccag tgcgaggtgc cgtgtgcgcc gtaacgcttg atcttgtact tgtcggcgac 960
ttccttgttc aacgcatagg tgctcgatgc cttcggcagc tgctggaaga aggaggagtc 1020
gaagacataa acctgcggaa tctcagggag cagctcgcgc atgactcgcg cccccttggc 1080
ctccgggccg ttgtgcagcg gagcgagcac agccagctcc tcgaccttgg cagtggtgtc 1140
gggggtcacc aaggcagggt tcgggaaggt gtcgccgccc tggacaactc ggtgcccgac 1200
ggcgatgatg ccggtctctt caaggctcgg gccgtattcc tcgaagaacc cgagcacgcg 1260
cttgaggccc tgctcatggt tttcgacctt ctcgtcgagc tcgtgctttt cgccgttgta 1320
ttcgtacttg tagtggccgt caatcggttc gccgatcttc tcgacgatac ccgatgcgat 1380
tccttcgccg gactcgagat ctaccagctg gtacttgatc gagctagaac ccgaattgat 1440
aacaaggacg gttttcgcca ttgtggcatc ctccattggt gattgctctg ccgctatgcg 1500
gctttccaac acacaagatt actcaatgtt tgctacaaaa cggtgaatgg gtgccctctc 1560
gttctatatt tcgaaaaagc acccatccac gtcatgaatt cgcgagatgg tgtggactat 1620
tcgttacttt gcgcttcgat ggcggtcaag gcgatggtat tgatgatgtc ctgcaccaag 1680
gcgcctcggc tcaggtcgtt gacaggccgg ttgagcccct gaagcaccgg tccgatcgcc 1740
acggcgccgg aggtgcgctg cactgccttg tagcagatgt tccccgcatc gaggtccggg 1800
aacacgaaca cggtgacatt gccggcaatc gggttgccga aggccttgac cctggcaacc 1860
gtcttcgacc aagcggcatc gaactggatg ggaccgacga tgggtaggtc cggtcgtttg 1920
ttctgggcga tcgaagtggc ctcgactacc agatcgacat ccggtccctt accggaaccc 1980
aaggtggagt aggagagcaa accgattttg ggatcgatgg agaatgcctt ggcggtctcg 2040
gccgactgga tggcgatgtc ggccagctgc tgcggatcgg gatcgaggtt gatggcacaa 2100
tcggcaaata ccgacacatg gtccttgaga cacatgagga aggcacccga tacggaggag 2160
acaccgggtt tcgtcttgat gagctggagc gcggggcgca cggtgttggc ggtggagctg 2220
atggcacctg agaccagacc atcggccatg ccgagcacga tgagcatggt gccgaagtag 2280
ttcgtgtccc tgagtgtctt cagagccaca tcgggggtca tgcccttctt ggcgcgcaat 2340
tcgcacagtt tgggcaccat ggtgtcgagc agatgcttgt cgtcgatgga gacgaacttc 2400
gcctgatcaa gcgccttgag gccgagtttt tcaccccggg caagaatctc gttgcggtcg 2460
ccgatgatga ccagatcgac cacattcgac tgcagcaggt agttcgcggc ggtgatgatg 2520
cggtcgtcct ctccttccgg tagcacaatc gtcttcttgt ctttcttcgc acgtgcgagc 2580
agatcgtact ggaacgcgaa tggtgtggtc ggcggtacga aaggtgtgtc aagcacgttg 2640
aggagtgatt ccttgtcgac atgctcgtcg aaggcatcga gcgcggcctt gacattcgtg 2700
tcagcggaac cgagttccac gaggggaagc ggccacgtcg gcaggtcgta gctcacgaat 2760
tcgtcggtga gtgtgggcag cgccgaattc gtgcagtcgg tgatgaacac gccgatcact 2820
tgggtgcctg cgttggcgac cacctcgcgg catgcgtcta tcgtctcacg aatctcgtcc 2880
ggcgtgcgtc ccatcgagct cactgagagc agcaccggag actgcaggtc ggcggagacg 2940
tccgcattga aggtgaaccg ttcgggatcg cccacattgg tgcggtctga tccgacgatc 3000
actcggatct gcggattgat ctcggcattc gtgtcgatga atttggagac gatctgctgg 3060
cgggcattgt ctttgtcaag acgtgcgtca tgcagtgtga cgccgacggc ctgttcgcgc 3120
gtctgcagca cgctcaccac cgagaggagt gcatcggtga gattttcgtc tgcctgcacc 3180
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accacgttcc ggccgtctcc aggttcggga ctgatgatgc tcacgttttt gaggctcacg 3300
atgactcctt tgaaatcgat gatctgcctg acgtgcgact gcgttgtgca cgcagaccat 3360
tgtaactggg aagggggcgt ggcagaccgg ttattttgca attgccacga gaatgtgacg 3420
caggtcacat tctgtatggg tatgggatat tcggcgttgt gtgatggata gcaaatggat 3480
agcaaaaggc ccgggtgctg acacccgggc ctttcatcgg ctaagcgatg agactatgct 3540
cactcgttgt cgccggcggt cgcggcggtg gcggagagca tggaggtctc gtcgaccttg 3600
acatccgggt acacccaatc ggtgaactca ggaatgtcat agccattgtc gacggcgaac 3660
tggaacgcgg tcttgcggaa ctcgttgagc tcgttgatct tgtcggcata cttgtcggcg 3720
tcgatgagct cgagggcctt ggcctgaagg gcgtagcgat ccatgtcgtt gacacgcacc 3780
atgtcgaacg gcgtcgtcgt ggagccctgc tccttgtatc cgacaacggt gaagttgtcg 3840
tggttcgggc ggtcgtagat gaggccacga acgtcctggg cataggagtg gtaggcgaag 3900
aggaccggct tgtccgcggt gaacaggtcg gcgaagtcct cgtcagacat ggcctcgtcg 3960
ttctccttcg aggactgcag cttgatgagg tccacgacgt tgacgacctt gaacttgatg 4020
cccatcttgt tgagggcatc ggaagcggcc atgatctcct gggtcgggac gtcgccggcg 4080
gcggcgagga caacctggac ctcgtcgttg ctcttggcgt tggaagccca cttccactcg 4140
gcggcaccag cctcgagctc ggcgcgtgcc tcgtcgaggg tgatccacgt cgcggccggc 4200
tgcttgccgg cgaagattgc gttgatcttg ttggtggact tgaagcactt ctcggcgatg 4260
gccagcagca tgttggcatc ggtcgcgaag tagatgttcg tcacgtggtc gttgttgaac 4320
gtcttgttca gcaggacgga ggtcacaccc ggatcctggt gcgagaagcc gttgtgatcc 4380
tgacgccaca cgtgcgagga gaccaggagg ttcaccgagg agatcggctt acgccacggg 4440
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tgcacgaagg actcgtagga gctccagatg ccgtgacggc cggtgagcag gtaggcctcg 4560
aggaagcctt cgcactgatg ctcggagagc tgctcgacaa cctggccggt gacggccatg 4620
ttctcgtcga cgagagccga gaggtatccg ttgtcccact gcttcttggt gacctcgtag 4680
gtcgcgttca gacggttgga cgcggtctcg tcaggtccga agacgcggaa cgaatccggg 4740
ttgttcttga tgatgtcgcg gcagtacgcg ccgagggaac gcggagcctc gacctggccc 4800
caaccgtggc cgtattcctt gacgccggtg atctcgtact gatcgagctc agggagcttc 4860
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ttaggcatga atgcggtgac gtcctccttg atggagccgt cggcgttgaa gagctcctcc 4980
ggcttgtagg attccatcca gcccttgagg acttcgaagt gggcctcggt gtcgcgggcg 5040
gaagccagcg ggacctggtg tgcacgccag gagccttcgg tcttcttgcc gtcgatgaac 5100
ttcgggcagg tccagccctt cggggtgcgg aagatgagca tcgggtagaa cggacgggtc 5160
atgtcgtcgg tctgagccgc agccttgata tcgcagatct cgtcgaagat ggtctcgaag 5220
agctcggcga agcgacggtg gatcgacagg tgatcctcgt tgtcgaagcc ggcgacgaac 5280
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tcggcttcgc cgtcaccgat gatgcacggg acgaagaggc tcgggttgtc catgatcgcg 5520
ccgtaggcgt gcgacagggc gtagcccagc tcgccgcctt cgtggatgga gcccggcgtc 5580
tccggagcga agtgggaagg aatgccaccc gggtaggaga actggcggaa gaacttctgc 5640
aggccagctt cgtccttggt gatgttcggg tagtactcgg tgtaggtgcc gtcgatgtag 5700
gactgagcgg tacctgcagg gccgccgtgg ccaggaccca tgatgaacac ggtgttctgc 5760
tggtgatcgg cgatcaggcg gttgatgtgg gcgagaagga agttcaggcc cggggtggtg 5820
ccccagtggc cgaccagacg gtgcttcacg tcatcgcggg tgaagggctc cttcatcagc 5880
gggttgctac gcaggtagat ctggccgata gacatgtagt tggcgacgcg ccagtacttg 5940
tccatgcctt cgatggcctc ttcggaaacc ggacgatcca gcttctgcca tggggtacca 6000
ataacaggat tagtcatgtg tgctcctgta ctcctgcaca taaatgtgcg atttgtttat 6060
tccgttgggc acgggcttcg gcgctgtcct gcaggccggt ctccgtgccc gatcgctgat 6120
tatgttacgc gaatacgctg acctttttgc agtttttgaa acagtgtgag cgaatctgtg 6180
cgcataattt gcgaatttgg gagattgctc gggcgatttg tgaaaatgga aaatcagtga 6240
ataaaggcga gaaacgttga aataccaacg aatgcaagcg ttttcgccgt cgttgtcgcg 6300
tgcggtttgt gaggatattg cgcggcgtgt tgaaaacaag cgaacaatct ggaaaatcct 6360
tgtgattgca gtgcttgagc gcttaagacg acaccgatgc gacccgtggc atgtgcgaat 6420
ttcaatgtct acttgcctgc gcacaataga tgtgttgtaa tgcccgagta atgaacctat 6480
atataagggg agcgtaatgg cagcaggtcc tgtccttgtc gttgatttcg gagcgcagta 6540
cgcgcagctc atcgcgcgcc gcgtgcgcga ggcgaacgtg tattccgaat tggtgcctca 6600
ttcgatgccg gtcgaggaga tgctggccaa gaagccgtcc gcgatcatac tgtcaggcgg 6660
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agtgccggtg cttggcatct gctatggctt ccaggtgatg gcccatgagc tcggcggcga 6780
cgtcgacaag gcggcgctcg gcgagtacgg caagacggag gcggtggtgg acgatgccac 6840
gggcattctc gacagttcgc catccctgca gaccacttgg atgagccatg gtgtcgccgt 6900
gaacaaggca cccgccggat tcgaagtcac cgcgcatacc gaaggggcgc cggtggctgc 6960
gatggaggat ccctcacgca aactctacgg cgtgcagtgg catcctgagg tcaagcacac 7020
gccgttggga caggatctga tcgagaattt cctgcatgat tgcgccggca tcgaagccga 7080
ttggaacgca aggaacatca tcgacgagca ggtcgctgcg attcgtgaga aggtcggtga 7140
cgcacgggtc atctgtggtc tgtctggtgg agtcgattcg gccgtggctg cagcgctcgt 7200
gcaccgcgcg atcggtgacc agctcacctg cgtgttcgtg gatcacggtc tgctacgcaa 7260
gggcgaggcc gagcaggtca aacatgattt cgtcgcggcg accggcatca agctcatcgc 7320
cgtcgatgcc tccaaggatt tcctcgatgc actcaagggc gtctccgatc ctgagacgaa 7380
gcgcaagatc atcggcgaaa aattcatccg cactttcgag aaggcgcagc gccaggtgat 7440
agaggaggcc ggtgcccagg gcaaggaggt caagttcctc gtgcagggca cgctttaccc 7500
ggacgtcgtc gaatccggtg gcggcgacgg cgcctcgaac atcaagtcgc atcataacgt 7560
cggtggtttg cctgacgaca tcaagttcga actgattgag ccgctccgtt cgctgttcaa 7620
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accgttcccc gggccgggtc tgggcatccg catcatcggt gagatcacga aggaacgtct 7740
cgacttgctg cgtgatgccg atgcgattgc ccgcgaggag ctctcgaagg ccggtctcga 7800
ccgcgacatc tggcagtgcc cggtcgtgct gctcgccgac gtgcactccg tcggcgtgca 7860
gggcgacgaa cgcacctacg gttcgccgat cgtgctgcgg ccggtcagct ctgaggacgc 7920
gatgactgcc gactggtcgc gtgtgccgta cgacgtgctc gccaccatct cgactcgcat 7980
cacgaacgaa tgccgtcaga tcaaccgcgt tgtgctcgac tgcacgtcga agccaccggc 8040
gacaatcgag tgggaataac tgacaaaacc cgcaaagcct tgaaaacact ggggtcttaa 8100
agcggaaacg gggcatttga tagcaaattg atagcagata ccaaaaccgg atttactttg 8160
ttcactcccg tataacgggt ggcttgcggg taaatcctcc atatcctaag aaaaaggtct 8220
tgctgacttt caccagtcgg caagaccttt tttgttattt gtcttttctc tgtttcttca 8280
atccttttat cagagcatcg cttaattcct tcgaggggac tttggcccac cgctgggtgg 8340
tgtcgtactt cgggtagttg tagcgccagc ggtcatagtc ctccttggtg atctccccgg 8400
cctccaactt cgccgcctgt tcccgccacg caatcaagat tttgttcagc tcactggctt 8460
gacggcctcc ctgaaaaata tctgcttgca ggcaggcacg tccatccgcc tctaccactt 8520
tcagactgta aacatcctcc aaggcgaaca gcgtatgggc caaacctatg tagttgtcta 8580
tgtccgggac gctcaacgcc tggggcgata catctaaggc aataccgcac agaaaaaaag 8640
tgccatatat cgccaagtgt gatataacaa acttatggat aaacagatga cgatttccgc 8700
attcagcgac gaactggcac aggtgcggac gaagaaaaaa gcatttctcg accagattga 8760
acggatcgtc ccgtggaagg aatggcttgc catgattcag ccgtgctatt acaaaggaga 8820
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ctatgacctg agtgacgagg ccacggtggc agaagccatc gacagccgcg cattttcgga 8940
gttctgcggc gtcgattcca gcaaccaggt tccgaacggg gatactcttg gccggttccg 9000
gaacttgctg atcaagaacg gactgcagga gaagctgttc gctcaggtgg tagcagcgct 9060
catggaacgt ggcctcattc tgaaaaaggg caccattgta gattccacca tcatttccgc 9120
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cgaagatgcc gtagtccgaa acaaagctgg ccggaaaatc aagtacaaga tcaatcgtcg 9420
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gcgcttccga aaaacgcgat accgagggct tgaaaagcaa caagccaaat tcaatatcat 9600
gtttgcgttg gcaaatctga ttctggctga cagaccctgt ctggcagctt gagtcagtgc 9660
gcctttgcgg acaaaaaatt cggaggttat ccacagtttt tattcggcac ctgctgtata 9720
atgcggattg tggcatttgt gcggtgttgc cttaaataaa actataatca aatagtggga 9780
acaaaggatt atgatagtcc cttttgtagg ggcttagttt tttgtaccca atttaagaat 9840
acttttgcct tatcaatttt gacatatccc caaaaacagc actcacaaac aggtgtatgc 9900
tgtatatgtg tatgtccgca aattatcatc cccagtggta aaagtatttt actgctgggg 9960
atttttatgc ccttcggggc agtaaaggga ggacaatcac atgaaaataa tcaatattgg 10020
aattcttgcc catgtagacg ctggaaagac gaccttgacg gagagcctgc tatatgccag 10080
cggagccatt tcagaaccgg ggagcgtcga aaaagggaca acgaggacgg acaccatgct 10140
tttggagcgg cagcgtggga ttaccattca agcggcagtc acttccttcc agtggcacag 10200
atgtaaagtc aacattgtgg atacgcccgg ccacatggat tttttggcgg aggtgtaccg 10260
ctctttggct gttttagatg gggccatctt ggtgatctcc gctaaagatg gcgtgcaggc 10320
ccagacccgt attctgttcc atgccctgcg gaaaatgaac attcccaccg ttatctttat 10380
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acttgcggat actgacccgc ttttgcgctg cgaggtggat tccatcaccc atgagatcat 11160
tctttctttt ttgggccggg tgcagttgga ggttgtttcc gctttgctgt cggaaaaata 11220
caagcttgaa acagtggtaa aggaacccac cgtcatttat atggagcggc cgctcaaagc 11280
agccagccac accatccata tcgaggtgcc gcccaacccg ttttgggcat ccatcggact 11340
gtctgttaca ccactcccgc ttggctccgg tgtacaatac aagagccggg tttcgctggg 11400
atacttgaac cagagttttc aaaacgctgt cagggatggt atccgttacg ggctggagca 11460
gggcttgttc ggctggaacg taacggactg taagatttgc tttgaatacg ggctttatta 11520
cagtccggtc agcacgccgg cggacttccg ctcattggcc ccgattgtat tggaacaggc 11580
attgaaggaa tcagggacgc aactgctgga accttatctc tccttcaccc tctatgcgcc 11640
ccgggaatat ctttccaggg cttatcatga tgcaccgaaa tactgtgcca ccatcgaaac 11700
ggtccaggta aaaaaggatg aagttgtctt tactggcgag attcccgccc gctgtataca 11760
ggcataccgt actgatctgg ccttttacac caacgggcag agcgtatgcc ttacagaact 11820
gaaagggtat caggccgctg tcggcaagcc agtcatccag ccccgccgtc caaacagccg 11880
cctggacaag gtgcgccata tgttcagtaa gatcacttga tacaccacag cgaggaaggt 11940
tattgcattt ccctgtcttt cgtggtaaaa tgtagttgta aaccaccaga gaaaccaatc 12000
taattttacc gttgatagcc atttccttga tagccaaatg atagcaaaag ttcggcaagc 12060
ccataggata aggataatag gtatcaggaa aaatcaaatg atatcaaatc tcccaaacaa 12120
aagcgtttag aattaagttt cattttgcga atgggagtga ccccgccgat catgcgacca 12180
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ccacctgtcg tcgttctgct atccagtatc cagtttcttc tcatggaagg tgccccggac 12300
gacgattacg acgtggacat cgatttggat gcgggcttca aggtgggacg ccatgacgtc 12360
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ctaccgccac gccggctaca gcagcaccga caagaccgcg ttcatccagt ggctgtaggg 14040
cgcgtccgtg tcacggtatc gcatccacca ccgtcgatat ccgtttggca tcgctcgacg 14100
gcgggatgat gtggctgtca accggaagtg aacgtaggat gcgcagctcc cgctctctgc 14160
gctcttcaag gcacgcgata tacccctcat atccgcgcaa cccatgcgct tcaccgtacc 14220
cttgtgctgt gtggtagtcg atgacggcat tgagccaacc atcaccgcgt tcgtcgagga 14280
caccgtcaat cgccgatttc gcgcccggtt cgtcaatgta gatgacgacg ggatgcagtg 14340
gcgcgatgat cgccgcaata tcgctgatgt accgtcgtga ctcgtcctcg ctcatgccga 14400
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actcgctcgg gagcatgttg tcgtctttta tgaattcatg atagatctgg aggaatcgtt 14880
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tgaggccggt gaatgatatg ccgtatgccg cttcttacgc ctcagcgggt gtcggtgatg 15000
gatggtcatg gaactcccgc atctccatat tgatgaatct gctgattatc tcgcgataga 15060
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cgatgtgcga acgcacttcg tccagactgt tgcactgcac ggcggtctcc tcttataagt 15300
ggggattacg gaagatacaa caaaacatgc cgatatggat tgctattcga taccataacc 15360
ttatgcaacg agcacaagca gagacgcttc gatgctctgg ggaacagttc attcggctca 15420
cacgcgatga atgtgcgcgc ggtatggcat gctccttgcg gcggttactg cgcgcatcct 15480
tggaaaccgg caacccatac tatggtgctg aatcatgact agtccaagca ttcttcctga 15540
tgatccgtcg ttgtgcattc ctcccatgga atccgacgat gaaaacgagc tgaacagcca 15600
gaccgcgcat aaccgagcca tggtcgagta ttccgcgcgc tgcggttgtt tccactgcgg 15660
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ggttgaatat gatgacgtgg acgtctacat gggcggcgtg gtgaccgtgc atgcgggatt 16080
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acattcgacg aacaatggtg cagggcacag ctgcagaggt tcacgcttcc gctgaaccag 19500
cagattcagg aattctccgc gggcatgctt gccgaatgca aaacgatcat ggcaatggca 19560
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ggccgaatcc gcatgcacga gaccatcgat gcattgcacg atgaatatgc ggtgctcacg 19800
ctcaccgacg atcagatgtc agctgcagac ccacggtaca tactcgtcaa acagcgcacg 19860
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accacaacga tgcaggaaag gacaatgcaa tgaaaggtct gttcgtcaga gacgcaatct 20040
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gcaggacagt gcagaacgac gtgtcacggg catgtcggcg catgttcttc acgatgccat 20220
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ctgttcatgg caaagtagtc gccggcggcg ctcacttcgc gcaatgtgac cttcctgcat 26520
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660
gccccctcac gcaaactcta cggcgtgcag tggcatcctg aggtcaagca cacgccgttg 720
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gccgagcagg tcaaacatga tttcgtcgcg gcgaccggca tcaagctcat cgccgtcgat 1020
gcctccaagg atttcctcga tgcactcaag ggcgtctccg atcctgagac gaagcgcaag 1080
atcatcggcg aaaaattcat ccgcactttc gagaaggcgc agcgccaggt gatagaggag 1140
gccggtgccc agggcaagga ggtcaagttc ctcgtgcagg gcacgcttta cccggacgtc 1200
gtcgaatccg gtggcggcga cggcgcctcg aacatcaagt cgcatcataa cgtcggtggt 1260
ttgcctgacg acatcaagtt cgaactgatt gagccgctcc gttcgctgtt caaagacgag 1320
gtgcgcgcca tcggcaccga actcggcttg ccggacgaga ttgtctggcg tcaaccgttc 1380
cccgggccgg gtctgggcat ccgcatcatc ggtgagatca cgaaggaacg tctcgacttg 1440
ctgcgtgatg ccgatgcgat tgcccgcgag gagctctcga aggccggtct cgaccgcgac 1500
atctggcagt gcccggtcgt gctgctcgcc gacgtgcact ccgtcggcgt gcagggcgac 1560
gaacgcacct acggttcgcc gatcgtgctg cggccggtca gctctgagga cgcgatgact 1620
gccgactggt cgcgtgtgcc gtacgacgtg ctcgccacca tctcgactcg catcacgaac 1680
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gagtgggaat aactgacaaa acccgcaaag ccttgaaaac actggggtct taaagcggaa 1800
acggggcatt tgatagcaaa ttgatagcag ataccaaaac cggatttact ttgttcactc 1860
ccgtataacg ggtggcttgc gggtaaatcc tccatatcct aagaaaaagg tcttgctgac 1920
tttcaccagt cggcaagacc ttttttgtta tttgtctttt ctctgtttct tcaatccttt 1980
tatcagagca tcgcttaatt ccttcgaggg gactttggcc caccgctggg tggtgtcgta 2040
cttcgggtag ttgtagcgcc agcggtcata gtcctccttg gtgatctccc cggcctccaa 2100
cttcgccgcc tgttcccgcc acgcaatcaa gattttgttc agctcactgg cttgacggcc 2160
tccctgaaaa atatctgctt gcaggcaggc acgtccatcc gcctctacca ctttcagact 2220
gtaaacatcc tccaaggcga acagcgtatg ggccaaacct atgtagttgt ctatgtccgg 2280
gacgctcaac gcctggggcg atacatctaa ggcaataccg cacagaaaaa aagtgccata 2340
tatcgccaag tgtgatataa caaacttatg gataaacaga tgacgatttc cgcattcagc 2400
gacgaactgg cacaggtgcg gacgaagaaa aaagcatttc tcgaccagat tgaacggatc 2460
gtcccgtgga aggaatggct tgccatgatt cagccgtgct attacaaagg agagcgcggc 2520
aacaaaccct atccgctgga gatcatgctc cgactgtatc tgctgcaaaa cctctatgac 2580
ctgagtgacg aggccacggt ggcagaagcc atcgacagcc gcgcattttc ggagttctgc 2640
ggcgtcgatt ccagcaacca ggttccgaac ggggatactc ttggccggtt ccggaacttg 2700
ctgatcaaga acggactgca ggagaagctg ttcgctcagg tggtagcagc gctcatggaa 2760
cgtggcctca ttctgaaaaa gggcaccatt gtagattcca ccatcatttc cgccccctct 2820
tctaccaaga ataaggaaaa gaaacgggat ccggatgccc accaagtcaa gaagggcaac 2880
acctggcact ttgggtacaa agcgcatatc ggcgtggaca aggacagcgg actggttcac 2940
acagtggaag ctacaccggc aaatgtccac gacgttgcgg aagtgccgaa attattgacg 3000
ggagaggaag aaacagtcta tggagacagc ggttatctcg gcgcaggtaa gcgcgaagat 3060
gccgtagtcc gaaacaaagc tggccggaaa atcaagtaca agatcaatcg tcgtccatcg 3120
cagatgaaga aactgagcaa aagcgggcag tacgcagcaa agaaagcgga acgggcgaaa 3180
tcctcagtgc gagcaaaagt agagcatgta ttcggtgtcg ttaagaagca gctgcgcttc 3240
cgaaaaacgc gataccgagg gcttgaaaag caacaagcca aattcaatat catgtttgcg 3300
ttggcaaatc tgattctggc tgacagaccc tgtctggcag cttgagtcag tgcgcctttg 3360
cggacaaaaa attcggaggt tatccacagt ttttattcgg cacctgctgt ataatgcgga 3420
ttgtggcatt tgtgcggtgt tgccttaaat aaaactataa tcaaatagtg ggaacaaagg 3480
attatgatag tcccttttgt aggggcttag ttttttgtac ccaatttaag aatacttttg 3540
ccttatcaat tttgacatat ccccaaaaac agcactcaca aacaggtgta tgctgtatat 3600
gtgtatgtcc gcaaattatc atccccagtg gtaaaagtat tttactgctg gggattttta 3660
tgcccttcgg ggcagtaaag ggaggacaat cacatgtgat acaccacagc gaggaaggtt 3720
attgcatttc cctgtctttc gtggtaaaat gtagttgtaa accaccagag aaaccaatct 3780
aattttaccg ttgatagcca tttccttgat agccaaatga tagcaaaagt tcggcaagcc 3840
cataggataa ggataatagg tatcaggaaa aatcaaatga tatcaaatct cccaaacaaa 3900
agcgtttaga attaagtttc attttgcgaa tgggagtgac cccgccgatc atgcgaccat 3960
cgctcccata gcgtctttct ttgcaggtgg cgcccgccga agcctatctt cggcgggcgc 4020
cacctgtcgt cgttctgcta tccagtatcc agtttcttct catggaaggt gccccggacg 4080
acgattacga cgtggacatc gatttggatg cgggcttcaa ggtgggacgc catgacgtcg 4140
aatccatccg aagacccgaa ccgggacgcc tcccaagggg aggggggaat gcgatccgta 4200
tccgctagaa gcgcgcccgc agtcgatagg gcaaatcatg aacatgtgac cggcaccgga 4260
aagtgacata atccgattgt cggcaatggg ctcgatatgg tatcagccga gcagccagtc 4320
gacgatattg cgtatctcaa tgccgtcaga ggtcgtgccg agacggaatc tgtcgagtgt 4380
gagcacgatt ttcgggaatg catccgataa cgattgcaaa ggcgcgagtt ccctcgcgcg 4440
ggtggattct tcgagcatcg tcccggtgac ctgaatgtag attctcctgt cgaatcgttg 4500
agcgacgaaa tcgatttcac ctccacgcag actgccgaca tgcacgttgt acccgcgtct 4560
gcgcagctcg ttcgcgacga cgttctccaa ttggaatccg tagttttgtg aggagaaacc 4620
atttgcgatg ttgcatagtc cggggtcttc ggcgtggaac ttgcgatgtg tcacaaaccg 4680
ctgaaggtgt caggtataac tgacatttct cggatttcaa gatggtttgt cgggtataac 4740
tgacggatct gtttgagggt gcatcccgta agaaagtgca gccggtaagt ggatatagag 4800
gatatggggt atacggttgc aggaagcgag tgaatggggt gtgatgatcg acaaccatgg 4860
atgcggttac gggatacagt ggtatgcgcc gtgtgcttgt catcggatgt ccgggtgcag 4920
gcaaaagcac gttcgcgcgc aggttgcggg atgcggccgg actgccgctg cattatctgg 4980
acatgctgtg gcacaatccg gaccggacga ctgtcacacg ggccgaattc gatgagcggt 5040
tgcaaaggat cctcgaggag gatgcctgga tcctcgacgg caatttcgcg cggacgctgc 5100
cgaaacgact ggaatattgc gacaccgtgt tcttcctcga cttcccgacc gacgtatgtc 5160
ttgagggcgt cgagggatgt agcggtatga agcgcgaaga catgccgtgg gtcgaacacg 5220
aattcgatga ggagttccgt cagtacatca tcgactttcc cgctgagcgg cgtccgcaga 5280
tggttgacgc gcttgaagac gccgccgcgc gccgcggtgt gcgtgtccat accacatcca 5340
aggcagagct ggtgcaagcg ctcgctgatg ttttgagtgg tcttgaagtg gggcgggcca 5400
gagcatgtct gacgttcatc atgtaccgtt atgcgacata ctgggcatca cggtgaacga 5460
actgcttggt gggggaggaa cttacaaaag tggattcccg tcagctccat cctccgtcgt 5520
ctcatcgtat gcgagcgcga gggcaccatc gtctcctcat gtgtatgcgt catcatcccg 5580
aatctgacgc ggggtgtgcg gccatacgcg ttcgtcgaga acgtcgtgac gcgcgccgat 5640
gcgcgtgggc atggttatgc taccgcatgt ctgaaccatg cgaaggcgct cgcgcagcag 5700
gccggctgct acaagatgat gctgctcacc ggctcccatg atccgaagac actcgatttc 5760
taccgccacg ccggctacag cagcaccgac aagaccgcgt tcatccagtg gctgtagggc 5820
gcgtccgtgt cacggtatcg catccaccac cgtcgatatc cgtttggcat cgctcgacgg 5880
cgggatgatg tggctgtcaa ccggaagtga acgtaggatg cgcagctccc gctctctgcg 5940
ctcttcaagg cacgcgatat acccctcata tccgcgcaac ccatgcgctt caccgtaccc 6000
ttgtgctgtg tggtagtcga tgacggcatt gagccaacca tcaccgcgtt cgtcgaggac 6060
accgtcaatc gccgatttcg cgcccggttc gtcaatgtag atgacgacgg gatgcagtgg 6120
cgcgatgatc gccgcaatat cgctgatgta ccgtcgtgac tcgtcctcgc tcatgccgaa 6180
ccgcatcatc gtctcgcaca tcggattctg cagcaggacg caattgaata cataggtcgt 6240
atcaggttcg gcgtgggctg cgaacgcgcg ccaagtatcg agtatcgtgg cgcgttcact 6300
tgcgaaatca gggaagtcgt ggtcgccgac atcggcggga tggtctgcgg ctccttcttc 6360
gacgcagacg acgttccttc cgcgcgcttc caattcggcg gcaaccatcg cagccgtcgt 6420
gcttttcccg ctatctggca gcccttcgac gatgatcaga cgggttcgca tctcatatgt 6480
gctcatgatg tcatggtacg gcgaaggata tgtgggatgt gcagatgtcc atgtatatag 6540
ggtgatataa ccgaatataa ggtgatatat agtgatatat cgaaatgaaa cgatatacaa 6600
ctcgctcggg agcatgttgt cgtcttttat gaattcatga tagatctgga ggaatcgttg 6660
ttttgagtcc atggatggtc gatgcgctca agcgcatgtg ctggtgcgcg tcgaacatat 6720
gaggccggtg aatgatatgc cgtatgccgc ttcttacgcc tcagcgggtg tcggtgatgg 6780
atggtcatgg aactcccgca tctccatatt gatgaatctg ctgattatct cgcgatagaa 6840
agcttgatat cgaattcctg cagccccgat tttcgttcgt gaatacatgt tataataact 6900
ataactaata acgtaacgtg actggcaaga gatattttta aaacaatgaa taggtttaca 6960
cttactttag ttttatggaa atgaaagatc atatcatata taatctagaa taaaattaac 7020
taaaataatt attatctaga taaaaaattt agaagccaat gaaatctata aataaactaa 7080
attaagttta tttaattaac aactatggat ataaaatagg tactaatcaa aatagtgagg 7140
aggatatatt tgaatacata cgaacaaatt aataaagtga aaaaaatact tcggaaacat 7200
ttaaaaaata accttattgg tacttacatg tttggatcag gagttgagag tggactaaaa 7260
ccaaatagtg atcttgactt tttagtcgtc gtatctgaac cattgacaga tcaaagtaaa 7320
gaaatactta tacaaaaaat tagacctatt tcaaaaaaaa taggagataa aagcaactta 7380
cgatatattg aattaacaat tattattcag caagaaatgg taccgtggaa tcatcctccc 7440
aaacaagaat ttatttatgg agaatggtta caagagcttt atgaacaagg atacattcct 7500
cagaaggaat taaattcaga tttaaccata atgctttacc aagcaaaacg aaaaaataaa 7560
agaatatacg gaaattatga cttagaggaa ttactacctg atattccatt ttctgatgtg 7620
agaagagcca ttatggattc gtcagaggaa ttaatagata attatcagga tgatgaaacc 7680
aactctatat taactttatg ccgtatgatt ttaactatgg acacgggtaa aatcatacca 7740
aaagatattg cgggaaatgc agtggctgaa tcttctccat tagaacatag ggagagaatt 7800
ttgttagcag ttcgtagtta tcttggagag aatattgaat ggactaatga aaatgtaaat 7860
ttaactataa actatttaaa taacagatta aaaaaattat aaaaaaattg aaaaaatggt 7920
ggaaacactt ttttcaattt ttttgtttta ttatttaata tttgggaaat attcattcta 7980
attggtaatc agattttaga aaacaataaa cccttgctat ggggggatcc actagttcta 8040
gagcggccgc caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg 8100
cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 8160
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 8220
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 8280
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 8340
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 8400
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 8460
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 8520
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 8580
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 8640
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 8700
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 8760
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 8820
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 8880
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 8940
aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 9000
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 9060
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 9120
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 9180
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 9240
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 9300
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 9360
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 9420
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 9480
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 9540
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 9600
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 9660
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 9720
atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 9780
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 9840
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 9900
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 9960
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 10020
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 10080
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 10140
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 10200
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 10260
gtgccac 10267
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy94
<400>7
gagcatgtat tcggtgtcg 19
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy95
<400>8
gatttgccct atcgactg 18
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy82
<400>9
cgacccaagc ttggatcggc tcgtgcatca ttgc 34
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy83
<400>10
gcaaaccgta cctcaatacc 20
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy84
<400>11
cgacccaagc ttgcagtccg tcaattaggg tg 32
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy85
<400>12
cgttgctgac gttgcggttc 20
<210>13
<211>10504
<212>DNA
<213>质粒pMDY24
<400>13
gaattcaaga cttggaccgc aaacgtcgtt catcccacac aatgggaggg cgaacggaac 60
acacagtcca atcaagagtt cgctcgccgc aacaccattg agcagttgca cgcgggcagg 120
tttgcaagaa gagggctcaa atatgactgc tgctgaacag cagatttccg gcaatcccgc 180
ggctatggaa aacgcacaag cacgtaccac cgtgacggat caagccaagg ttcaggatat 240
tatctcgcgc atggatcgcg cacatgaaac cccgatgttc catcgcatcg tgacgctggt 300
cgccgctggc atgctgatgg acagcatcga cgtatatatt ggcagcgccg tcgcctccag 360
cgcgttggct acccactggt ccaccgttgc gcaaaattcc acctttatgt ccgcaggctt 420
cctgggtctg ctggtcggtt cgctgctggc cggcttcgtc ggtgacctga agggccgccg 480
cgtggcttac caaatcaacc tgttgctgtt tggcggcttc accttcctcg gcgcattcgc 540
cccgaacatg gccgtgctgt ccctgtgccg tctgggtgcc ggcctgggcc tcggcgctga 600
aatcgtcacc ggcttcgcca tggtcaacga gttcgcaccg atgaaccgcc gtggccactg 660
gtgcgcgatt gtctcgctcg tggccaactg cggtgtgcca atcgctatgc tgctgtgcgc 720
atggatcatc ccccgctggt cctggcgtcc gctgttcgtg gccatcggtc tgggggccgc 780
catcatctgg tggctgcgcc gcgacatccc cgaatccccg cgttggctcg ccgtgcacgg 840
ccgttacgat gaggccgacg ccatcgtcaa gcagcttgag gccaacggct ccgaaccgat 900
cgacgcagcc gccaaggccg acaccagcga cacccgcaac gccggcggcc gttcgctcgg 960
catctgcctg cttgtggctg tggttgctgt ggccgccacg aacgtgtgct cctacgcctt 1020
cacttcttgg gttccgacga ttctggtcaa gcgtggtatt aacctgtcca gctcgctgct 1080
cacctccacg gcgatgatgc tcggcgcccc ggtcggctgc ctgattggct ctctgcttat 1140
cgaccgcatc ggccgcaagc gcacgattgt gccggccttc ctgttcactg gcgtgttcgg 1200
tttaatgtat gccttccaga cctctaccgt gagcgcaatt atcgttggct tcctgctcat 1260
gatgtgcctg tacgtgctta tggcttccgt ggtggctgtg tacgctccgg aactgttcgc 1320
caccaaggtt cgcttccgtt gcgtcggctt cgcgaacgcc gtggccaagc tgctcaatgt 1380
gttgatgccg atggtggtgg gctggatgct tacctcgctt ggtgtcacgt ccatctttgt 1440
ggccatcagc gcgattgcta ttgcatcgat gctgattgtc ggcttctttg gcgcggagac 1500
tgcgcagaag tcggttgggt gatcggtttc ctcacagtgg aataactgct gatgatgtcc 1560
attcggcgtc ttgcgtggtg atatgcaggg cgccgttttg ttgttctagt aattgtcggt 1620
aacggttgag gccggtgccg gtggataggt ctgcgtctcc agcggacaat cagcgtctgt 1680
gatgtcacat gcaatgccag gagcggcatc aacggtcgaa tcatgcggag tcactgcact 1740
gtgcgccgct tctcccctgc cttcaatcac atcaatgact tgatgcgtgc gatccaatgc 1800
gcccatagac atatccgtaa ccagcacgtc aggccgcttg gtggggctca ggcatcggct 1860
gatggccacg gcacccaaat cgcaggtcta tatcacggca aaatcgctgg acatacgttc 1920
gattagcgcg ccgaacactt tcagcgcata tgggtcattg tccacaatgc cgatgagtat 1980
gttgcggttg cgcgcttctc ccattacatt caccccttca gtgtgcccga cgccgaactg 2040
ctccgtcctg acatgtcatg gtcactatga caactatcat tccacatttc ctgcgtgatt 2100
tacgatggaa tcatcatcaa tccttgacaa ggcggtaaag gaggacggca atgaaccgtg 2160
cacaagcact cagcaagctc aacaggagcg atatgcgcaa tgccgccgcc gagcgcggga 2220
tgcaacgact gttcacatgg aaccgcgcgc attggattgg catggttgta ctgatagcgg 2280
tgttgctgct actgcagtgg agctcatcaa tgtatctcat gcccgacgag gttcttgaca 2340
gggctgccaa aaacctgttc gtatggttcc ccggtatggt tctgcactgg ccattggtgt 2400
tggaaatcac caacttgata ctcggttcga cacgatccgg cagtctgtct ttcccgttgg 2460
cgagcgcaat catcggacca ctggcattcg gctggaccaa tcttcgctta cggccggggt 2520
tcccataccg ttcctgggct caagggaaag ccgcaatata atgaaaacag cgatttcgtg 2580
caatgatgca cgagccgatc caagcttgca gtccgtcaat tagggtgtat cgtttgacgc 2640
atggttacga tgaaggaaat cgcgaacaag gcgggggttt ccgtctctac ggtatcgctg 2700
gtgctcaacg gacgcgacga ggggcgcgta aagtccaaaa ttgcggacaa tgtgcgcgcc 2760
atcgccacca agctcggcta ccagtcgaat ccgctggcca gttcgctgcg tacaggcagg 2820
acgcacatcc tcggtttcat cagtgaggag gtggccacca ccccgtacgc cggcggtatg 2880
attctgggcg cgcagaccgc tgcaagccag ttcggctata tgctcatcac cgtgagcacc 2940
gacggcgaga acagcgagag cgaggaaatc gccgcactca agcgatacgg caccgacggc 3000
tttctgtacg ccaagatgtc gaaccgcatc acccatgtgc cttcctcgct ggccaagacg 3060
ccactggtgt tggtggatgc caccgactcg cttggcaaaa tcccgagcgt ggaaccggac 3120
gagttccaaa tcggctacga cgccaccacc agattggtta aggccggatg cgcacgtatc 3180
gcctatgtgg gttgcttgga gccgctgatt gcgcaggacg atcgtttgga aggctatcag 3240
gcggcgctca gggacgccgg cctcgactat gacgatcatc tggtcgtcaa tgtgctcaac 3300
aacgggccgg cactgaccgc agtcagcgat ttgttcgatg ccgagcatcc ggacggattc 3360
ttctgcttca acgatgcccg cgcctggtat gtgtacgaat gcgccgcacg ccgaggactc 3420
acggtcggca aggacatctc cgtggtcggc gtggacaacc atcgcgtgtt cgccgaaacg 3480
ctggaaccga tgctcaccac tgtggaactg ccacatttcg agatgggcta ctgggccgtg 3540
gccaagctgg tgtcgattat cgaaggacgc tcgatggacg acgtctcatg gccagcgacc 3600
accgctcccc tgccgccgat tgacgcgccg attccggcga agatccactg cacgctgatc 3660
gaaaagacct cggtgaagta gccgagtccc acacgatttc tcaaggcctc cgtccagcac 3720
ggaggccttt ttgcgtgtcg aacaggtacg acacgccgat ttacgtcaat cgattgacgt 3780
aaatcgattg acgtcgcata ataattacta cataacaact tctacaaagg cacggccgcc 3840
cgagcagaag cgttacataa ccaataacca accaagtagt aatcaaagga tgattatggc 3900
aagtgcaacc aagtctgcat ggaagaatcc ttcctatctg cagagctctt tcggcatctt 3960
catgttcttc tgctcctggg gcatctggtg gtccttcttc cagcgctggc tcatctcagg 4020
cgttggattg accaatgctg aagtcggcac catctactcc atcaactcgc tggccaccct 4080
ggtcatcatg tttgtgtacg gcgtgattca ggatcagctc ggcatcaagc gcaagctcgt 4140
catcgtagtc tcggtaatcg ccgcctgcgt tggcccattc gtccaattcg tttacgcccc 4200
gatgatcctc gccggtggca ccacccgctg gatcggcgca ctcatcggct ccatcgttct 4260
gtctgccggc ttcatgtccg gctgctccct gttcgaggcc gtcaccgaac gctactcccg 4320
taaattcggt ttcgaatatg gccagtcccg tgcttggggc tccttcggtt acgccatcgt 4380
ggcgctgtgc gccggcttcc tgttcaacat caacccgctg atcaacttct gggtcggctc 4440
cgcattcggc cctggcatgc tcctcgtgta cgccttctgg gtcccggccg agcagaagga 4500
agagctcaag aaggaaaccg acccgaacgc agcccccacc aacccgtccc tcaaggaaat 4560
ggtcgccgtt ctcaagatgc cgaccctgtg ggtgctcatc gtcttcatgc tgctgaccaa 4620
caccttctac accgtgttcg atcagcagat gttcccgacc tactacgcca acctcttccc 4680
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<213>人工序列
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<223>引物mdy27
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tcggaagatc tcatggtcaa cgagttcgc 29
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物mdy39
<400>15
tagtactaag cttcttgagc tcttccttct gc
Claims (20)
1.双歧杆菌细胞，其包含经定制的从而缺乏有效功能基因的基因组，其中该功能基因是tetW并且其中所述双歧杆菌细胞缺乏tetW基因的核酸序列。
2.权利要求1的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌细胞。
3.权利要求2的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。
4.权利要求1的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034。
5.权利要求1的双歧杆菌细胞，其与含有有效tetW基因的对照细胞相比对四环素更敏感至少5倍。
6.权利要求5的双歧杆菌细胞，其与含有有效tetW基因的对照细胞相比对四环素更敏感至少10倍。
7.权利要求6的双歧杆菌细胞，如利用平板扩散试验所测定，其对高于0.3微克每毫升的四环素浓度敏感。
8.动物双歧杆菌的培养物，其包含权利要求1的细胞。
9.生产缺乏有效的预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法，其中所述功能基因是tetW并且提供对抗生素增加的抗性，所述方法包括步骤：
从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；
用在双歧杆菌中不复制的质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒包含功能基因的上游和下游侧翼序列和编码选择性标记的基因；
在允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长、但那些不具有编码所述选择性标记的基因的细胞不能生长的条件下培养所述双歧杆菌细胞，从而选择含有整合质粒的转化体；
在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合质粒的丢失；
通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；
确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。
10.权利要求9的方法，其中所述预定的功能基因被缺失。
11.权利要求9的方法，其中所述抗生素是四环素。
12.权利要求9的方法，其中所述选择压力是抗生素的存在。
13.权利要求12的方法，其中所述抗生素是大观霉素。
14.权利要求9的方法，其中所述质粒通过同源重组整合进基因组。
15.权利要求14的方法，其中所述整合的质粒通过第二次同源重组而丢失。
16.权利要求10或14的方法，其中缺失或致使失效的唯一的功能基因是所述预定的功能基因。
17.权利要求16的方法，其中在非选择条件下培养转化体至少100代。
18.权利要求9的方法，其中双歧杆菌细胞是长双歧杆菌细胞或动物双歧杆菌细胞。
19.权利要求9的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。
20.权利要求9的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818，且所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034。
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