JPH0787977A - コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 - Google Patents
コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片Info
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- JPH0787977A JPH0787977A JP5200707A JP20070793A JPH0787977A JP H0787977 A JPH0787977 A JP H0787977A JP 5200707 A JP5200707 A JP 5200707A JP 20070793 A JP20070793 A JP 20070793A JP H0787977 A JPH0787977 A JP H0787977A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３か
ら単離されたアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ
をコードする遺伝子に由来する１７９塩基対よりなるコ
リネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片。 【効果】 このプロモーター機能を有するＤＮＡを、タ
ンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラスミドベ
クターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入したときに、
該構造遺伝子が高発現する。
ら単離されたアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ
をコードする遺伝子に由来する１７９塩基対よりなるコ
リネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片。 【効果】 このプロモーター機能を有するＤＮＡを、タ
ンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラスミドベ
クターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入したときに、
該構造遺伝子が高発現する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコリネ型細菌内のアセト
ヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子
に由来するコリネ型細菌内でプロモーター機能を有する
新規なＤＮＡを含むＤＮＡ断片に関する。
ヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子
に由来するコリネ型細菌内でプロモーター機能を有する
新規なＤＮＡを含むＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株育種改良は、エシリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ター構造に関する知見は極めて少なく、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
かなり問題となっている。
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株育種改良は、エシリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ター構造に関する知見は極めて少なく、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
かなり問題となっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主たる目的
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、コリネ型
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を鋭意検
索した結果、先に提案したコリネ型細菌内のアセトヒド
ロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．８
６）をコードする構造遺伝子（以下これを「ｉｌｖＣ」
ということがある；この遺伝子の詳細については特願平
５−６８１５３号明細書参照）上流の１７９ｂｐのＤＮ
Ａ断片がプロモーターとして機能することを見いだし、
本発明を完成するに至った。
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を鋭意検
索した結果、先に提案したコリネ型細菌内のアセトヒド
ロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．８
６）をコードする構造遺伝子（以下これを「ｉｌｖＣ」
ということがある；この遺伝子の詳細については特願平
５−６８１５３号明細書参照）上流の１７９ｂｐのＤＮ
Ａ断片がプロモーターとして機能することを見いだし、
本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち本発明は、コリネ型細菌内のアセ
トヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする構造
遺伝子（ｉｌｖＣ）に由来するコリネ型細菌内でプロモ
ーター機能を有する後記配列表の配列番号：１に示され
る１７９ｂｐの塩基配列を含むＤＮＡ断片である。以
下、本発明についてさらに詳細に説明する。
トヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする構造
遺伝子（ｉｌｖＣ）に由来するコリネ型細菌内でプロモ
ーター機能を有する後記配列表の配列番号：１に示され
る１７９ｂｐの塩基配列を含むＤＮＡ断片である。以
下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００６】本明細書において、「プロモーター機能を
有するＤＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲ
ＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域で
あって、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプ
ラスミドベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入
された時に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を有す
るＤＮＡを意味する。
有するＤＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲ
ＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域で
あって、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプ
ラスミドベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入
された時に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を有す
るＤＮＡを意味する。
【０００７】本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ
断片は、その塩基配列が決定された後においては合成す
ることができるが、通常はコリネ型細菌内のアセトヒド
ロ酸イソメロレダクターゼをコードする構造遺伝子を含
むＤＮＡ断片（以下これを「ｉｌｖＣ断片」ということ
がある）から確認取得することができる。上記ｉｌｖＣ
断片の供給源となる微生物は、コリネ型細菌であれば特
に限定されるものではないが、一般的には、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）およびその由来株が有利に使用される。
断片は、その塩基配列が決定された後においては合成す
ることができるが、通常はコリネ型細菌内のアセトヒド
ロ酸イソメロレダクターゼをコードする構造遺伝子を含
むＤＮＡ断片（以下これを「ｉｌｖＣ断片」ということ
がある）から確認取得することができる。上記ｉｌｖＣ
断片の供給源となる微生物は、コリネ型細菌であれば特
に限定されるものではないが、一般的には、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）およびその由来株が有利に使用される。
【０００８】これらの供給源微生物からｉｌｖＣ断片を
調製するための基本的操作の一例を述べれは次のとおり
である。すなわちｉｌｖＣ断片は、上記コリネ型細菌、
例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在し、この染色
体を適当な制限酵素で切断することにより生ずる切断断
片の中から以下に述べる方法で分離、取得することがで
きる。
調製するための基本的操作の一例を述べれは次のとおり
である。すなわちｉｌｖＣ断片は、上記コリネ型細菌、
例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在し、この染色
体を適当な制限酵素で切断することにより生ずる切断断
片の中から以下に述べる方法で分離、取得することがで
きる。
【０００９】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＢｇｌII及びＥ
ｃｏＲＩを用いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。得ら
れるＤＮＡ断片を平滑末端処理後、大腸菌における発現
ベクター、例えばｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社
製）に挿入し、このベクターを用いてアセトヒドロキシ
酸イソメロレダクターゼ構造遺伝子が欠損したイソロイ
シン及びバリン要求性大腸菌変異株エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＥ８３１５
〔国立遺伝学研究所、遺伝実験生物保存研究センター；
〒４１１、静岡県三島市谷田１１１１番地〕を形質転換
し、選択培地に塗抹することにより、形質転換株を取得
する。得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来のｉｌ
ｖＣ断片を確認・取得することができる。
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＢｇｌII及びＥ
ｃｏＲＩを用いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。得ら
れるＤＮＡ断片を平滑末端処理後、大腸菌における発現
ベクター、例えばｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社
製）に挿入し、このベクターを用いてアセトヒドロキシ
酸イソメロレダクターゼ構造遺伝子が欠損したイソロイ
シン及びバリン要求性大腸菌変異株エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＥ８３１５
〔国立遺伝学研究所、遺伝実験生物保存研究センター；
〒４１１、静岡県三島市谷田１１１１番地〕を形質転換
し、選択培地に塗抹することにより、形質転換株を取得
する。得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来のｉｌ
ｖＣ断片を確認・取得することができる。
【００１０】かくして得られるｉｌｖＣ断片をさらに適
当な制限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を大
腸菌で複製可能なベクタープラスミドに挿入し、このベ
クタープラスミドを通常用いられる形質転換法、例え
ば、塩化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換
により前記イソロイシン及びバリン要求性大腸菌変異株
に導入し、選択培地に塗抹する。
当な制限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を大
腸菌で複製可能なベクタープラスミドに挿入し、このベ
クタープラスミドを通常用いられる形質転換法、例え
ば、塩化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換
により前記イソロイシン及びバリン要求性大腸菌変異株
に導入し、選択培地に塗抹する。
【００１１】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し制限酵素で解析することにより、挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｉｌｖＣ断片を確認・取得することができる。このよ
うにして得られるｉｌｖＣ断片の一つは、上記ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切り出し、さらに
それを制限酵素ＢｇｌIIで切断することによって得られ
る大きさが約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることがで
きる。
を抽出し制限酵素で解析することにより、挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｉｌｖＣ断片を確認・取得することができる。このよ
うにして得られるｉｌｖＣ断片の一つは、上記ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切り出し、さらに
それを制限酵素ＢｇｌIIで切断することによって得られ
る大きさが約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることがで
きる。
【００１２】この約２．１ｋｂのアセトヒドロキシ酸イ
ソメロレダクターゼをコードする構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数
及び切断断片の大きさを下記表１に示す。
ソメロレダクターゼをコードする構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数
及び切断断片の大きさを下記表１に示す。
【００１３】
【表１】 表 １ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＰｖｕＩＩ １ １．５５ ０．５５ ＳａｌＩ ２ ０．９５ ０．６５ ０．５ ＥｃｏＲＶ １ １．１ １．０ ＳｔｕＩ １ １．８ ０．３ ＤｒａＩ １ １．４ ０．７
【００１４】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを制限酵
素の存在下で完全分解し、それらの分解物はそれ自体既
知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断
片の数から決定した値を採用した。
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを制限酵
素の存在下で完全分解し、それらの分解物はそれ自体既
知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断
片の数から決定した値を採用した。
【００１５】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ IIIで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大
きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それ
ぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の
大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさにつ
いては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる
結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大
きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ IIIで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大
きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それ
ぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の
大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさにつ
いては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる
結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大
きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって得られる結果を採用した。
【００１６】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、ＢｇｌIIによって切断することにより得られる大き
さが約２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ｉｌｖＣ断片）につい
ては、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８及び／ま
たはｐＵＣ１１９ (宝酒造製）を用いるジデオキシヌク
レオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ，ｃｈａｉｎ，ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎ法，Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，ｐ５４６３，１９７７）により決定すること
ができる。このようにして決定した約２．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列中に３３８個のアミノ酸をコードする
１０１４塩基対より成るオープンリーディングフレーム
が存在し（特願平５−６８１５３号明細書参照）、該オ
ープンリーディングフレームの上流部分がプロモーター
機能を有すると考えられた。
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、ＢｇｌIIによって切断することにより得られる大き
さが約２．１ｋｂのＤＮＡ断片（ｉｌｖＣ断片）につい
ては、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８及び／ま
たはｐＵＣ１１９ (宝酒造製）を用いるジデオキシヌク
レオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ，ｃｈａｉｎ，ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎ法，Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，ｐ５４６３，１９７７）により決定すること
ができる。このようにして決定した約２．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列中に３３８個のアミノ酸をコードする
１０１４塩基対より成るオープンリーディングフレーム
が存在し（特願平５−６８１５３号明細書参照）、該オ
ープンリーディングフレームの上流部分がプロモーター
機能を有すると考えられた。
【００１７】次に、該オープンリーディングフレームの
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域の上流および下流の配列に相当する適当な塩基配
列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番号：
３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライマー
ＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると考え
られるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライマー
ＤＮＡの合成は、例えばアプライド・バイオシステムズ
社製ＤＮＡ合成機３９４型を用いて合成でき、ＤＮＡ領
域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０８型
（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ１６
３（１９８６年）に記載の方法により行うことができ
る。
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域の上流および下流の配列に相当する適当な塩基配
列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番号：
３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライマー
ＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると考え
られるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライマー
ＤＮＡの合成は、例えばアプライド・バイオシステムズ
社製ＤＮＡ合成機３９４型を用いて合成でき、ＤＮＡ領
域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０８型
（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ１６
３（１９８６年）に記載の方法により行うことができ
る。
【００１８】かくして得られる増幅ＤＮＡをコリネ型細
菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクターに組
み込むことによって該増幅ＤＮＡのプロモーター機能を
確認することができる。「コリネ型細菌内で自律増殖可
能なプロモーター検出用ベクター」としては、例えば、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）と、
プロモーターが欠失している発現されるべきタンパク質
をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）（以下
これを「発現されるべき遺伝子」と略称することがあ
る）とを保有するプラスミドであれば特に制限はない。
このプラスミド検出用ベクターの具体例としては、コリ
ネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）としてブ
レビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）由来のプラスミドｐＢＹ
５０３を制限酵素ＫｐｎＩで切り出すことによって得ら
れる約６ｋｂのＤＮＡ断片およびプロモーターが欠失し
ている発現されるべきタンパク質をコードする構造遺伝
子を含むＤＮＡ断片（ｂ）としてエシェリヒア・コリの
トランポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺
伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）をコードする構造遺伝子を保有するプ
ラスミドｐＰＲ３（特開平３−１４７７９２号明細書参
照）を挙げることができる。
菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクターに組
み込むことによって該増幅ＤＮＡのプロモーター機能を
確認することができる。「コリネ型細菌内で自律増殖可
能なプロモーター検出用ベクター」としては、例えば、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）と、
プロモーターが欠失している発現されるべきタンパク質
をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）（以下
これを「発現されるべき遺伝子」と略称することがあ
る）とを保有するプラスミドであれば特に制限はない。
このプラスミド検出用ベクターの具体例としては、コリ
ネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）としてブ
レビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）由来のプラスミドｐＢＹ
５０３を制限酵素ＫｐｎＩで切り出すことによって得ら
れる約６ｋｂのＤＮＡ断片およびプロモーターが欠失し
ている発現されるべきタンパク質をコードする構造遺伝
子を含むＤＮＡ断片（ｂ）としてエシェリヒア・コリの
トランポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺
伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）をコードする構造遺伝子を保有するプ
ラスミドｐＰＲ３（特開平３−１４７７９２号明細書参
照）を挙げることができる。
【００１９】次に、上記プラスミド検出用ベクターを用
いてプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述
べる。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自
体既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス
法〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９
９０）参照〕等でコリネ型細菌、例えばブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。
いてプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述
べる。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自
体既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス
法〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９
９０）参照〕等でコリネ型細菌、例えばブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。
【００２０】なお、プラスミド検出用ベクターの宿主コ
リネ型細菌への導入に際して、ブレビバクテリウムＭＪ
−２３３由来菌株を宿主として用いる場合には、本菌株
が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６
７８７号明細書参照）の存在により形質転換が困難にな
る場合があるので、そのような場合には、本菌株より上
記プラスミドｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。
そのようなプラスミドを除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に失わすことも
可能であるし、人為的に除去することも可能である「Ｂ
ａｃｔ．Ｒｅｖ．，３６、３６１〜４０５ (１９７２）
参照」。
リネ型細菌への導入に際して、ブレビバクテリウムＭＪ
−２３３由来菌株を宿主として用いる場合には、本菌株
が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６
７８７号明細書参照）の存在により形質転換が困難にな
る場合があるので、そのような場合には、本菌株より上
記プラスミドｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。
そのようなプラスミドを除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に失わすことも
可能であるし、人為的に除去することも可能である「Ｂ
ａｃｔ．Ｒｅｖ．，３６、３６１〜４０５ (１９７２）
参照」。
【００２１】次に、発現されるべき遺伝子（ｂ）がコリ
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記ｉｌｖＣ断片由来の増幅Ｄ
ＮＡをＤＮＡリガーゼ処理により連絡し、コリネ型細菌
へ電気パルス法等により導入する。得られる形質転換株
を培養し、前記した発現されるべき遺伝子（ｂ）の確認
法により、形質転換株の該遺伝子の発現の有無及び強度
を調べることにより、挿入されたＤＮＡ断片のプロモー
ター機能を確認することができる。
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記ｉｌｖＣ断片由来の増幅Ｄ
ＮＡをＤＮＡリガーゼ処理により連絡し、コリネ型細菌
へ電気パルス法等により導入する。得られる形質転換株
を培養し、前記した発現されるべき遺伝子（ｂ）の確認
法により、形質転換株の該遺伝子の発現の有無及び強度
を調べることにより、挿入されたＤＮＡ断片のプロモー
ター機能を確認することができる。
【００２２】かくして得られる本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される１７９塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたｉｌｖＣ断片に由来するもののみな
らず、通常用いられるＤＮＡ合成機、例えばアプライド
・バイオシステムズ社製３９４型を用いて合成されたも
のであってもよい。
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される１７９塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたｉｌｖＣ断片に由来するもののみな
らず、通常用いられるＤＮＡ合成機、例えばアプライド
・バイオシステムズ社製３９４型を用いて合成されたも
のであってもよい。
【００２３】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００２４】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明するが、下記の実施例は本発明について具体的認識を
得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本
発明の範囲は何ら限定されるものではない。
明するが、下記の実施例は本発明について具体的認識を
得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本
発明の範囲は何ら限定されるものではない。
【００２５】実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のコリ
ネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ及びアセ
トヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする構造
遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｉｌｖＣ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ，（ＨＮ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4 ４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リット
ル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３ (ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後
期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ
／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−
２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼ
Ｋを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０
℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフ
ェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間
ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×
ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、
酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２
倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以
下の実験に用いた。
ネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ及びアセ
トヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする構造
遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｉｌｖＣ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ，（ＨＮ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4 ４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リット
ル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３ (ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後
期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ
／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−
２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼ
Ｋを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０
℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフ
ェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間
ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×
ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、
酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２
倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以
下の実験に用いた。
【００２６】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢｇｌII ５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時
間反応させ完全分解した。このＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII
分解ＤＮＡに平滑末端処理後、クローニングベクターｐ
ＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し平滑末端処理したものを混合し、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ2 及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃
度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合
させた。
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢｇｌII ５０ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１時
間反応させ完全分解した。このＥｃｏＲＩ及びＢｇｌII
分解ＤＮＡに平滑末端処理後、クローニングベクターｐ
ＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し平滑末端処理したものを混合し、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ2 及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃
度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合
させた。
【００２７】 （Ｃ）ｉｌｖＣ断片を含むプラスミドの選択 上記遺伝子（ｉｌｖＣ）の選択は、前記大腸菌変異株エ
シェリヒア・コリＭＥ８３１５を用いて行った。上記
（Ｂ）項で得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシ
ウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により前記
エシェリヒア・コリＭＥ８３１５を形質転換し、アンピ
シリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ 4 １ｇ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、グルコース２０ｇ、ロイシン２
０ｍｇ、チアミン１ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リッ
トルに溶解〕に塗抹した。
シェリヒア・コリＭＥ８３１５を用いて行った。上記
（Ｂ）項で得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシ
ウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により前記
エシェリヒア・コリＭＥ８３１５を形質転換し、アンピ
シリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、Ｋ
Ｈ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ 4 １ｇ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、グルコース２０ｇ、ロイシン２
０ｍｇ、チアミン１ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リッ
トルに溶解〕に塗抹した。
【００２８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の長
さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２．１ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。長さ約２．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種の制限で切断したときの認識部位数および
切断断片の大きさは前記表１に示したとおりであった。
このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示す。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３の長
さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２．１ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。長さ約２．１ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種の制限で切断したときの認識部位数および
切断断片の大きさは前記表１に示したとおりであった。
このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示す。
【００２９】また、上記で得たプラスミドを各種制限酵
素で切断して認識部位数および切断断片の大きさを測定
した。その結果を下記の表２に示す。
素で切断して認識部位数および切断断片の大きさを測定
した。その結果を下記の表２に示す。
【００３０】
【表２】 表２ プラスミドｐＫＫ２２３−ＩＲ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＳａｌＩ ４ ４．０５、１．２、０．９５、０．５ ＰｖｕＩＩ ２ ４．２、 ２．５ ＥｃｏＲＶ １ ６．７ 上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＫ
Ｋ２２３−ＩＲと命名した。
Ｋ２２３−ＩＲと命名した。
【００３１】以上によりアセトヒドロキシ酸イソメロレ
ダクターゼをコードする遺伝子を含む大きさが約２．１
ｋｂのＤＮＡ断片（ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ断片）を得る
ことができた。
ダクターゼをコードする遺伝子を含む大きさが約２．１
ｋｂのＤＮＡ断片（ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ断片）を得る
ことができた。
【００３２】実施例２コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ及び
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする
構造遺伝子の塩基配列の決定 実施例１の（Ｃ）項で得られたアセトヒドロキシ酸イソ
メロレダクターゼをコードする構造遺伝子を含む長さ約
２．１ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列をプラ
スミドｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９を用いるジデオキ
シヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｈｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７４，５４６３，１９７７）により図２に示した戦
略図に従って決定した。
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする
構造遺伝子の塩基配列の決定 実施例１の（Ｃ）項で得られたアセトヒドロキシ酸イソ
メロレダクターゼをコードする構造遺伝子を含む長さ約
２．１ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列をプラ
スミドｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９を用いるジデオキ
シヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｈｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７４，５４６３，１９７７）により図２に示した戦
略図に従って決定した。
【００３３】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、アセトヒドロキシ酸イソメロレダク
ターゼをコードする構造遺伝子は、３３８個のアミノ酸
をコードする１０１４の塩基対より構成され、該オープ
ンリーディングフレームの上流にプロモーター機能を有
すると考えられる配列番号：１に示される１７９塩基対
よりなる配列が存在した。
レームの存在から、アセトヒドロキシ酸イソメロレダク
ターゼをコードする構造遺伝子は、３３８個のアミノ酸
をコードする１０１４の塩基対より構成され、該オープ
ンリーディングフレームの上流にプロモーター機能を有
すると考えられる配列番号：１に示される１７９塩基対
よりなる配列が存在した。
【００３４】実施例３コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
の単離 （Ａ）ＤＮＡ領域の増幅に使用するプライマーの合成 実施例２において決定したアセトヒドロキシ酸イソメロ
レダクターゼをコードする構造遺伝子の上流の１７９ｂ
ｐの配列に基づいて、該ＤＮＡ領域のみをＰＣＲ法によ
り特異的に増幅するために下記のプライマーを合成した
（アンダーライン部分は制限酵素ＢａｍＨＩ部位）。 ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＡＴＣＴ
ＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号：２） ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＧ
ＣＣＴＴＴＣ−３’（相補鎖；配列番号：３） プライマーの合成は、アプライド・バイオシステムズ社
製３９４型ＤＮＡ合成機を用いて行った。
の単離 （Ａ）ＤＮＡ領域の増幅に使用するプライマーの合成 実施例２において決定したアセトヒドロキシ酸イソメロ
レダクターゼをコードする構造遺伝子の上流の１７９ｂ
ｐの配列に基づいて、該ＤＮＡ領域のみをＰＣＲ法によ
り特異的に増幅するために下記のプライマーを合成した
（アンダーライン部分は制限酵素ＢａｍＨＩ部位）。 ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＡＴＣＴ
ＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号：２） ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＧ
ＣＣＴＴＴＣ−３’（相補鎖；配列番号：３） プライマーの合成は、アプライド・バイオシステムズ社
製３９４型ＤＮＡ合成機を用いて行った。
【００３５】 （Ｂ）プロモーター機能を有するＤＮＡ領域の増幅 反応液〔５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００μ
ｇ／ｍｌ ｇｅｌａｔｉｎ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、
２５０ｐｍｏｌ ｐｒｉｍｅｒｓ〕に２．５ｕｎｉｔｓ
のＴａｑポリメラーゼ１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネ
ーチャー９４℃１分間、アニーリング３７℃２分間、ポ
リメイゼーション７２℃３分間の反応を２５回繰り返す
ことにより、ＤＮＡを増幅させた。増幅ＤＮＡの確認は
４％アガロースゲルにより１７９ｂｐのＤＮＡを視認す
ることにより行った。
ｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００μ
ｇ／ｍｌ ｇｅｌａｔｉｎ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、
２５０ｐｍｏｌ ｐｒｉｍｅｒｓ〕に２．５ｕｎｉｔｓ
のＴａｑポリメラーゼ１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネ
ーチャー９４℃１分間、アニーリング３７℃２分間、ポ
リメイゼーション７２℃３分間の反応を２５回繰り返す
ことにより、ＤＮＡを増幅させた。増幅ＤＮＡの確認は
４％アガロースゲルにより１７９ｂｐのＤＮＡを視認す
ることにより行った。
【００３６】実施例４プロモーター機能を有するＤＮＡのプラスミドｐＰＲ３
への導入 特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基づいて調製
したプラスミドｐＰＲ３ ０．５μｇに制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラ
スミドＤＮＡを完全分解した。実施例３で調製したプロ
モーター機能を有するＤＮＡとプラスミドＤＮＡ Ｂａ
ｍＨＩ分解物を混合し、制限酵素を不活性化するために
６５℃で１０分間加熱処理をした後、該失活溶液中の成
分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．
６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１．０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔｓになるように各成分を強化し、１６℃で１５時間保
温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＨＢ１０
１コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
への導入 特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基づいて調製
したプラスミドｐＰＲ３ ０．５μｇに制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラ
スミドＤＮＡを完全分解した。実施例３で調製したプロ
モーター機能を有するＤＮＡとプラスミドＤＮＡ Ｂａ
ｍＨＩ分解物を混合し、制限酵素を不活性化するために
６５℃で１０分間加熱処理をした後、該失活溶液中の成
分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．
６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１．０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔｓになるように各成分を強化し、１６℃で１５時間保
温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＨＢ１０
１コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
【００３７】形質転換株５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）の
カナマイシンを含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、純水１１、ｐＨ７．２）で
３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。こ
れらの生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法「Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”（１９８２）９０−９１参照」により抽出した。
カナマイシンを含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、純水１１、ｐＨ７．２）で
３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。こ
れらの生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法「Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”（１９８２）９０−９１参照」により抽出した。
【００３８】得られたプラスミドは電気パルス法によ
り、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換
し、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドを抽出し
た。このプラスミドの制限酵素ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、
ＥｃｏＲＶ等の制限酵素パターンによってｐＰＲ３に前
記増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認し、このプ
ラスミドを“ｐＰＲ３−ＩＲ”と命名した。
り、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換
し、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドを抽出し
た。このプラスミドの制限酵素ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、
ＥｃｏＲＶ等の制限酵素パターンによってｐＰＲ３に前
記増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認し、このプ
ラスミドを“ｐＰＲ３−ＩＲ”と命名した。
【００３９】実施例５プロモーター強度の測定 実施例４でプラスミドｐＰＲ３に挿入したプロモーター
の強度を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定することによって調べ
た。
の強度を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定することによって調べ
た。
【００４０】プラスミドｐＰＲ３を保有するブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３株とプラスミドｐＰＲ
３−ＩＲを保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株をそれぞれ、実施例１の（Ａ）項に記載の半
合成培地Ａ培地にカナマイシンを５０μｇ／ｍｌを加え
た培地１０ｍｌの入った試験管で一晩前培養し、その培
養液を上記の培地１００ｍｌの入った三角フラスコで約
６時間培養後集菌し、ＣＡＴ活性測定に用いた。ＣＡＴ
活性測定は、Ｗ．Ｖ．Ｓｈａｗらの方法「Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｇｙ Ｊａｎ．（１９６８）２８−３６参
照」により行った。その結果、ｐＰＲ３−ＩＲを有する
ＭＪ−２３３株は、プロモーターの挿入されていないｐ
ＰＲ３を有するＭＪ−２３３株の約１０倍のＣＡＴ活性
を持っていた。
テリウム・フラバムＭＪ−２３３株とプラスミドｐＰＲ
３−ＩＲを保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株をそれぞれ、実施例１の（Ａ）項に記載の半
合成培地Ａ培地にカナマイシンを５０μｇ／ｍｌを加え
た培地１０ｍｌの入った試験管で一晩前培養し、その培
養液を上記の培地１００ｍｌの入った三角フラスコで約
６時間培養後集菌し、ＣＡＴ活性測定に用いた。ＣＡＴ
活性測定は、Ｗ．Ｖ．Ｓｈａｗらの方法「Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｇｙ Ｊａｎ．（１９６８）２８−３６参
照」により行った。その結果、ｐＰＲ３−ＩＲを有する
ＭＪ−２３３株は、プロモーターの挿入されていないｐ
ＰＲ３を有するＭＪ−２３３株の約１０倍のＣＡＴ活性
を持っていた。
【００４１】
配列番号：１ 配列の長さ：１７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム 菌株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：１−１７９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACAGCAATTA ATCTGATTGC ACCTGCTGCA TAAATGTGAC TAGTCAAACA CCGTCTAATT 60 ACATGTGTGT GGTAGAACAA TAATGTAGTT GTCTGCCCAA CCGAGTGACA CTCCCACGAT 120 TTACAGTGGG GGCAGACATC TTTTCACCAA AATTTTTACG AAAGGCGAGA TTTTCTCCC 179
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCAC AGCAATTAAT CTGATTGC
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCGG GAGAAAATCTC GCCTTTC
【図１】コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤ
ＮＡおよびアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを
コードする構造遺伝子を含む大きさが約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素切断点地図。
ＮＡおよびアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを
コードする構造遺伝子を含む大きさが約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素切断点地図。
【図２】コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤ
ＮＡおよびアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを
コードする構造遺伝子を含む大きさが約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列決定のための戦略図。
ＮＡおよびアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを
コードする構造遺伝子を含む大きさが約２．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列決定のための戦略図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 コリネ型細菌内のアセトヒドロキシ酸イ
ソメロレダクターゼをコードする遺伝子に由来するコリ
ネ型細菌内でプロモーター機能を有する下記の塩基配
列： ACAGCAATTA ATCTGATTGC ACCTGCTGCA TAAATGTGAC TAGTCAAACA CCGTCTAATT 60 ACATGTGTGT GGTAGAACAA TAATGTAGTT GTCTGCCCAA CCGAGTGACA CTCCCACGAT 120 TTACAGTGGG GGCAGACATC TTTTCACCAA AATTTTTACG AAAGGCGAGA TTTTCTCCC 179 を含むＤＮＡ断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5200707A JPH0787977A (ja) | 1993-08-12 | 1993-08-12 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5200707A JPH0787977A (ja) | 1993-08-12 | 1993-08-12 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787977A true JPH0787977A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=16428893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5200707A Pending JPH0787977A (ja) | 1993-08-12 | 1993-08-12 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0787977A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010500884A (ja) * | 2006-08-18 | 2010-01-14 | ネステク ソシエテ アノニム | ビフィドバクテリウム属菌における遺伝子再構築（ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｍｏｄｅｌｉｎｇ） |
| JP2022547466A (ja) * | 2019-09-02 | 2022-11-14 | シージェイ チェイルジェダング コーポレイション | 新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法 |
-
1993
- 1993-08-12 JP JP5200707A patent/JPH0787977A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010500884A (ja) * | 2006-08-18 | 2010-01-14 | ネステク ソシエテ アノニム | ビフィドバクテリウム属菌における遺伝子再構築（ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｍｏｄｅｌｉｎｇ） |
| JP2022547466A (ja) * | 2019-09-02 | 2022-11-14 | シージェイ チェイルジェダング コーポレイション | 新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法 |
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