JP2022547466A - 新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法に関する。

Description

本出願は、新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法に関する。
コリネ型微生物は、伝統的にアミノ酸や核酸関連物質の生産に最も広く用いられている産業用微生物である。主にアミノ酸及び各種核酸を含む飼料、医薬品、食品などの分野で様々な用途を有する化学物質の生産に用いられるグラム陽性菌であり、生育にビオチンが必要である。細胞分裂の際に直角に曲がる特徴（snapping）を有し、生成される代謝物質に対する分解活性が低いことがこの菌の利点の一つである。
コリネ型微生物が生産する産物の一つであるＬ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品の原料や、食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられている。よって、アミノ酸を産業的に生産することは、経済的に重要な産業工程となっている。
アミノ酸を効率的に生産するための様々な研究、例えばアミノ酸高効率生産微生物や発酵工程技術を開発するための努力がなされている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株においてアミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、アミノ酸生合成に不要な遺伝子を除去するような標的物質に特異的なアプローチが開発されており（特許文献１など）、これらの方法以外にも、アミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産において具体的に機能が知られていない遺伝子を除去する方法も活用されている。しかし、依然として効率的かつ高収率でアミノ酸を生産する方法に関する研究が強く求められている。
前述したようにコリネ型微生物から遺伝工学的又は代謝工学的技術により標的物質を高力価で生産する菌株を開発するためには、微生物中の様々な代謝過程に関与する遺伝子の発現を選択的に調節しなければならない。このような調節のためには、調節遺伝子の一つとしてＤＮＡ分子上にＲＮＡ合成酵素が結合して転写（transcription）を開始する部位であるプロモーターの活性を調節することが重要である。
米国特許第８０３００３６号明細書 米国特許出願公開第２０２０／００３２３０５号明細書 米国特許第８４６５９６２号明細書 国際公開第２００８／０３３００１号 韓国登録特許第１０－１３３５７８９号公報 韓国公開特許第１０－２０１９－０００３０１９号公報 韓国登録特許第１０－００５７６８４号公報 米国特許第１０３５１８５９号明細書
Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984) Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990) Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467 Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996) World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377 Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008 van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
本発明者らは、強力な発現誘導活性を示すプロモーターを開発すべく鋭意努力した結果、コリネバクテリウム染色体上のｉｌｖＣ遺伝子プロモーターを塩基置換により改良し、改良したプロモーターがそれと作動可能に連結された遺伝子の発現を増加させることを確認し、本出願を完成するに至った。
本出願は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むプロモーターを提供する。
本出願は、前記プロモーター及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本出願は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、標的物質を生産する方法を提供する。
本出願は、前記プロモーターを標的遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む、標的遺伝子の発現強化方法を提供する。
本出願は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドのプロモーターとしての使用を提供する。
本出願の新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを用いると、前記ポリヌクレオチドに連結された標的遺伝子の発現を増加させることができるので、標的物質の生産に有用である。
バリン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 バリン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 バリン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 バリン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 イソロイシン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 イソロイシン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 ロイシン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。 ロイシン生産菌株のｉｌｖＣプロモーター領域を示す図である。
以下、本出願をより詳細に説明する。なお、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は、共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な説明に本出願が限定されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
本出願の一態様は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ鎖を意味する。
本出願における「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」とは、後に連結する遺伝子、すなわち標的遺伝子の発現のために、ＲＮＡポリメラーゼやエンハンサーなどが結合する部位を含む標的遺伝子の転写部位付近に存在するＤＮＡ領域を意味する。本出願の目的上、前記ポリヌクレオチドは、汎用強化プロモーターとして用いられ、細胞内において、従来のプロモーターや細胞内在性プロモーターと比較して、それと作動可能に連結される標的遺伝子の発現、前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の生産及び／又は活性を調節することのできるものであるか、前記タンパク質が生産に関与する標的産物（生物学的活性物質であり、例えばアミノ酸、核酸、ビタミン、タンパク質、脂肪酸、有機酸などからなる群から選択される１種以上）の生産及び／又は活性を増加させるものであるが、これらに限定されるものではない。
一例として、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの発現を強化させるプロモーターとして用いられてもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、アミノ酸、具体的には分枝鎖アミノ酸、より具体的にはロイシン、バリン、イソロイシンが含まれるアミノ酸の生産又は生産量の増加に関与するポリヌクレオチドであるが、これらに限定されるものではなく、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
本出願における配列番号１は、プロモーター活性を有する配列であり、配列番号１のヌクレオチド配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋでその配列を確認することができ、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）由来のものであってもよいが、これに限定されるものではなく、前記ヌクレオチドと同じ活性を有する配列であればいかなるものでもよい。なお、配列番号１は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）のプロモーターであってもよい。しかし、これに限定されるものではない。
本出願における「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）」は、Ｌ－分枝鎖アミノ酸の生合成に関与する酵素である。Ｌ－分枝鎖アミノ酸の生合成経路においては、まずアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）がピルビン酸の脱炭酸（decarboxylation）と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒し、バリンの前駆体であるアセト乳酸を生産するか、ピルビン酸の脱炭酸と２－ケトブチレート（2-ketobutyrate）との縮合反応を触媒し、イソロイシンの前駆体であるアセトヒドロキシブチレートを生産することができる。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、このように生成されたアセト乳酸又はアセトヒドロキシブチレートを基質として反応を次のステップで行い、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン及びＬ－イソロイシンを生成する。具体的には、アセトヒドロキシ酸シンターゼの反応により生成されたアセト乳酸又はアセトヒドロキシブチレートとアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの反応により異性化が起こり、その後還元反応が進行し、各基質から（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－イソ吉草酸（(2R)-2,3-dihydroxy-3-isovalerate）又は（２Ｒ，３Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－メチル吉草酸（(2R，3R)-2,3-dihydroxy-3-methylvalerate）が生成される。（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－イソ吉草酸がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、トランスアミナーゼＢ（transaminase B）により触媒される反応を経るとＬ－バリンが生成され、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、２－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（2-isopropylmalate synthase）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（isopropylmalateisomerase）、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）、トランスアミナーゼＢ（transaminase B）により触媒される反応を順次経るとＬ－ロイシンが生成され、（２Ｒ，３Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－３－メチル吉草酸がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、トランスアミナーゼＢにより触媒される反応を経るとＬ－イソロイシンが生成される。よって、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、Ｌ－分枝鎖アミノ酸の生合成経路における重要な酵素である。
本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとは、配列番号１及び／又は配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性（homology）もしくは同一性（identity）を有するヌクレオチド配列において、少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものを意味する。相同性もしくは同一性を有するヌクレオチド配列は、前記範疇のうち１００％の同一性を有する配列を除くものであってもよく、１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。
具体的には、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むものであってもよく、具体的には、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるものであってもよい。
前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、一般式１で表され、前記一般式１において、ｉ）ＸはＣＮＧＮであり、ｉｉ）ＹはＣＴＡＡＴＴＮであり、ｉｉｉ）ＺはＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＡＮＡＡＮであり、ｉｖ）前記ＮはＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）又はＣ（シトシン）から選択されるいずれかであってもよい。また、前記一般式１のポリヌクレオチド配列において、Ｚは配列番号２で表されるものであってもよく、Ｙは配列番号３で表されるものであってもよく、Ｘは配列番号４で表されるものであってもよい。
［一般式１］
Ｘ－Ｙ－Ｚ
具体的には、前記一般式１において、ＸはＣＮ１ＧＮ２であり、ＹはＣＴＡＡＴＴＮ３であり、ＺはＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴで表されるものであってもよく、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３はそれぞれＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）又はＣ（シトシン）から選択されるいずれかであってもよい。
より具体的には、前記一般式１において、ｉ）Ｎ１はＣ（シトシン）もしくはＧ（グアニン）であるか、ｉｉ）Ｎ２はＡ（アデニン）もしくはＴ（チミン）であるか、ｉｉｉ）Ｎ３はＡ（アデニン）もしくはＧ（グアニン）であるか、又はｉｖ）前記ｉ）～ｉｉｉ）の置換の組み合わせであってもよいが、これらに限定されるものではない。
一例として、式１のポリヌクレオチド配列において、Ｚは配列番号２で表されるヌクレオチド配列の１４番目のＮ及び１７番目のＮがＴ（チミン）であってもよく、ここで、Ｘは配列番号４で表されるヌクレオチド配列の２番目のＮがＣ（シトシン）又はＧ（グアニン）であり、４番目のＮがＡ（アデニン）又はＴ（チミン）であってもよく、配列番号８～１１のいずれかであってもよく、Ｙは配列番号３で表されるヌクレオチド配列の７番目のＮがＡ（アデニン）又はＧ（グアニン）であってもよい。具体的には、Ｚは配列番号２で表されるヌクレオチド配列の１４番目のＮ及び１７番目のＮがＴ（チミン）であり、Ｘは配列番号８～１１のいずれかであり、Ｙは配列番号６又は７であってもよい。
他の例として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１３～２０から選択されるいずれかのポリヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
本出願において「特定配列番号で表されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」、「特定配列番号で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド」と記載されていても、当該配列番号のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記ポリヌクレオチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、当該配列番号のヌクレオチド配列の前後の無意味な配列付加、自然に発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、このような配列付加又は突然変異を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
相同性（homology）及び同一性（identity）とは、２つの与えられた塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。
相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
保存されている（conserved）ポリヌクレオチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コドンの代わりに縮退コドンを有するポリヌクレオチドであってもよい。
任意の２つのポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５，６，７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含んでもよい。よって、本出願における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
また、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、同じ活性を有するポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献１１）に具体的に記載されている。例えば、相同性（homology）又は同一性（identity）の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シアトンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献１１参照）。
本出願の他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むプロモーターを提供する。
本出願における「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ（polymerase）に対する結合部位を含み、標的遺伝子のｍＲＮＡへの転写（transcription）開始活性を有する、コード領域の上流（upstream）の翻訳されないヌクレオチド配列、すなわちＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域を意味する。前記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置する。
本出願のプロモーターは、従来のプロモーターより増加したプロモーター活性を有してもよい。すなわち、宿主細胞において、標的遺伝子の発現だけでなく、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現及び活性を増加させることができる。
本出願の目的上、生産しようとする産物、すなわち「標的産物」に応じて発現強化のための標的遺伝子を適宜変更することができ、前記プロモーターは、標的遺伝子の強化のための汎用プロモーターとして用いられる。
前記「標的遺伝子」とは、本出願の目的上、本出願のプロモーター配列により発現を調節しようとする遺伝子を意味する。前記標的遺伝子によりコードされるタンパク質を「標的タンパク質」といい、前記「標的タンパク質」をコードする遺伝子を「標的遺伝子」という。例えば、前記プロモーターの標的遺伝子は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子、すなわちｉｌｖＣであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリヌクレオチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチド配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。ポリヌクレオチド配列については前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、本出願のプロモーターを含むベクターを提供する。
本出願のさらに他の態様は、本出願のプロモーター及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
具体的には、前記標的タンパク質は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼであるベクターであってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリヌクレオチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域又は発現調節配列に作動可能に連結された前記標的ポリヌクレオチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれ、具体的には本出願のプロモーターが含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより染色体内で標的ポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチド分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
本出願のさらに他の態様は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を提供する。
本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）微生物を提供する。
本出願における「微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は弱化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物が全て含まれる概念である。本出願における微生物は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが導入されるか、それを含む微生物であればいかなるものでもよい。
具体的には、前記微生物は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換することにより作製される微生物であってもよく、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子、又はそれらを含むベクターを含む微生物であってもよい。具体的には、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質が生産に関与する標的産物の生産能を有する微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記微生物は、自然に標的タンパク質もしくは標的産物生産能を有する微生物、又は標的タンパク質もしくは標的産物生産能のない親株に標的タンパク質又は標的産物生産能が付与された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願における「標的タンパク質又は標的産物を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするタンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物であってもよい。当該微生物は、標的タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つにより遺伝的に改変された微生物、前記標的タンパク質もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを発現するように改変された微生物、前記標的タンパク質もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え微生物、又は前記標的タンパク質活性を有する組換え微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願における「形質転換」とは、本出願のポリヌクレオチドと標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが含まれるポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で標的タンパク質を発現させることを意味する。標的タンパク質が宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞又は微生物内に導入されたポリヌクレオチド又はベクターが宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含み、前記プロモーターは、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本出願のポリヌクレオチドと作動可能に連結され、それ自体の形態で宿主細胞に導入されてもよいが、これに限定されるものではない。
さらに、本出願における「作動可能に連結」されたものとは、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。前記プロモーター配列は、本出願において提供するプロモーターであってもよい。
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願の目的上、前記微生物は、標的タンパク質又は標的産物を生産する微生物であって、本出願のポリヌクレオチドを含み、標的タンパク質又は標的産物生産能が向上したことを特徴とする微生物であってもよい。
一例において、本出願のポリヌクレオチドを含む微生物は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、標的タンパク質の活性を強化した微生物であってもよいが、これに限定されるものではない。
具体的には、前記微生物は、配列番号１のポリヌクレオチド配列における少なくとも１つのヌクレオチドが置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む微生物であって、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、一般式１で表され、前記式１において、ＸはＣＮＧＮであり、ＹはＣＴＡＡＴＴＮであり、ＺはＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＡＮＡＡＮであり、前記ＮはＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）又はＣ（シトシン）から選択されるいずれかであってもよい。前記ポリヌクレオチドについては前述した通りである。
［一般式１］
Ｘ－Ｙ－Ｚ
一例として、本出願の微生物は、本出願のポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換され、標的タンパク質の活性が強化されたものであってもよい。
本出願における、標的タンパク質もしくは標的産物を生産する微生物、又は標的タンパク質もしくは標的産物生産能を有する微生物は、標的タンパク質又は標的産物生合成経路の遺伝子の一部が強化又は弱化されるか、標的タンパク質又は標的産物分解経路の遺伝子の一部が強化又は弱化された微生物であってもよい。
例えば、標的タンパク質が分枝鎖アミノ酸の生産に関与するタンパク質である場合、自然に分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物、又は分枝鎖アミノ酸生産能のない親株に分枝鎖アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
一例として、標的タンパク質がアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼである場合、本出願のポリヌクレオチドとアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子が作動可能に連結され、前記アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの活性を強化できる細胞又は微生物であってもよく、ここで、宿主細胞又は微生物は、前記標的タンパク質を含み、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物であってもよい。
本出願における前記「分枝鎖アミノ酸を生産する微生物」は、「分枝鎖アミノ酸を生産できる微生物」、「分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物」と混用される。
本出願における「分枝鎖アミノ酸」とは、側鎖に分岐アルキル基を有するアミノ酸を意味し、バリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれるものである。具体的には、本出願における前記分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－分枝鎖アミノ酸であり、前記Ｌ－分枝鎖アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン又はＬ－ロイシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願における「分枝鎖アミノ酸を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とする分枝鎖アミノ酸の生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物であってもよい。本出願の目的上、前記分枝鎖アミノ酸を生産する微生物は、前記本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み、目的とする分枝鎖アミノ酸生産能が向上したことを特徴とし、具体的にはコリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本出願における、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物、又は分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物は、分枝鎖アミノ酸生合成経路の遺伝子の一部が強化又は弱化されるか、分枝鎖アミノ酸分解経路の遺伝子の一部が強化又は弱化された微生物であってもよい。例えば、前記分枝鎖アミノ酸を生産する微生物は、本出願において提供するプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするｉｌｖＣの発現が増加したものであるが、これに限定されるものではない。
本出願における「分枝鎖アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然のもの又は変異により分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本出願の分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするｉｌｖＣを含み、ｉｌｖＣのプロモーターの活性を強化することにより向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、本出願における、分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むか、又は前記ポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。
前記「向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物」とは、形質転換前の親株又は非改変微生物に比べて分枝鎖アミノ酸生産能が向上した微生物を意味する。前記「非改変微生物」とは、天然型の菌株自体、前記アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子を含まない微生物、又は本出願のポリヌクレオチド配列を含まないか、本出願のポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
また、前記「親株」は、分枝鎖アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、前記親株は、自然に又は人為的に遺伝的変異が起こった分枝鎖アミノ酸生産微生物であってもよい。例えば、前記親株は、コリネバクテリウム属微生物に変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；非特許文献１２］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株であってもよく、コリネバクテリウム属微生物にｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異体及びｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）変異体（非特許文献１３）を導入し、トレオニンデヒドラターゼ（L-threonine dehydratase）をコードする遺伝子にｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）変異（非特許文献１４）を導入してＬ－イソロイシン生産能が向上した菌株であってもよい。また、コリネバクテリウム属微生物に変異［ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）；特許文献２］を導入してＬ－ロイシン生産能が向上した菌株であってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」は、コリネバクテリウム属微生物であればいかなるものでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）、コリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、標的物質を生産する方法を提供する。
具体的には、前記標的物質はアミノ酸であり、より具体的には、分枝鎖アミノ酸であってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記方法における前記微生物を培養するステップは、特に限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行うことができる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節してもよく、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。前記培養により生産されたアミノ酸は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス(molasses)、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
本出願の標的物質の生産方法は、前記培地から標的物質を回収するステップをさらに含んでもよい。
本出願の前記培養ステップで生産された標的物質を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とする物質を回収（collect）することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とする物質を回収することができる。
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。例えば、標的物質がアミノ酸である場合、前記回収されるアミノ酸は、精製された形態であってもよく、アミノ酸を含有する微生物発酵液であってもよい（非特許文献１５）。
本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むプロモーターを標的遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む、標的遺伝子の発現強化方法を提供する。
前記ポリヌクレオチド、標的遺伝子、プロモーターなどについては前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドのプロモーターとしての使用を提供する。
前記ポリヌクレオチドについては前述した通りである。
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
ランダム変異法によるバリン生産能向上変異株の選択
実施例１－１：ＵＶ照射によるランダム突然変異誘発
バリン生産能が向上した変異株を選択するために、寒天を含む栄養培地にバリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献３）を塗抹し、３０℃で３６時間培養した。このようにして得られた数百個のコロニーに室温でＵＶを照射し、菌株のゲノムにランダム突然変異を誘発した。
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
実施例１－２：突然変異誘発菌株の発酵力価試験及び菌株の選択
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－バリンの生産能が向上した変異株を選択するために、ランダム突然変異を誘発した菌株を対象に発酵力価試験を行った。各コロニーを栄養培地で継代培養し、その後生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表１に示す。
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，硫酸アンモニウム４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2022547466000002
表１に示すように、対照群であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株に対するバリン生産量がそれぞれ１７８％、１７４％である、最も多く増加したＭ４及びＭ１５菌株を選択した。
遺伝子シーケンシングによる変異の確認
バリン生産能が向上した前記Ｍ４及びＭ１５菌株のバリン生合成経路における主要遺伝子をシーケンシングし、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型菌株ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＴＣＣ１３０３２及びＡＴＣＣ１３８６９と比較した。その結果、前記Ｍ４及びＭ１５菌株がアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（Acetohydroxy acid isomeroreductase; AHAIR）をコードする遺伝子であるｉｌｖＣのプロモーター領域（promoter region）の特定位置に同じ変異を含むことが確認された（図１）。具体的には、Ｍ４及びＭ１５は、配列番号５で表される配列を含むプロモーター領域の配列における１４番目のヌクレオチドであるＧ、及び１７番目のヌクレオチドであるＣがＴに置換されていることが確認された。配列番号５で表される配列は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＴＣＣ１３０３２及びＡＴＣＣ１３８６９）のｉｌｖＣのプロモーター領域に共通して含まれる配列である。以下の実施例においては、前記変異がコリネバクテリウム属微生物のアミノ酸の生産量に影響を及ぼすか否かを確認する。
変異を導入した菌株の作製及びバリン生産能の確認
実施例３－１：コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに変異を導入した菌株の作製及びバリン生産能の評価
実施例３－１－１：菌株の作製
配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列の１４番目、１７番目のヌクレオチドをＴに置換し、その変異をバリン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに導入するために、ターゲット変異を含むベクターを作製した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎＴｏｔａｌＤＮＡ抽出ミニキット（Intron社, Cat. No 17045）を用いて、キットのプロトコルに従って抽出した。前記各ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター領域に変異を導入するベクターを作製するために、プライマー１（配列番号２１）とプライマー２（配列番号２２）のプライマー対、及びプライマー３（配列番号２３）とプライマー４（配列番号２４）のプライマー対を用いて、ＤＮＡ断片Ａ、Ｂをそれぞれ得た。
前述した２つの断片を鋳型とし、プライマー１（配列番号２１）とプライマー４（配列番号２４）を用いてＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲを行うことにより、約１．４ｋｂのＰＣＲ産物（以下、「変異導入断片」という）が得られた。用いたプライマー配列を表２に示す。
Figure 2022547466000003
前述したように得られた変異導入断片を制限酵素ＸｂａＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理し、その後同じ制限酵素で処理したｐＤＺベクター（特許文献４）とＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有ＬＢ培地から選択し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（iNtRON社）によりＤＮＡを得て、組換えプラスミドｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７を作製した。前記ＡＴＣＣ１４０６７のゲノムＤＮＡをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３０３２のそれぞれに置換して同じ過程を行い、それぞれｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１３８６９及びｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１３０３２と命名した組換えプラスミドをさらに作製した。
前述したように作製した３種の組換えプラスミドのうちｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７を染色体上での相同組換えにより、Ｌ－バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換した（非特許文献１６）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー１及び４を用いたＰＣＲにより、染色体上でｉｌｖＣプロモーターに変異を導入した菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）を作製した（図２）。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ０８－１０６３と命名し、２０１９年８月２１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ１２５７４Ｐとして寄託した。
実施例３－１－２：バリン生産能の評価
バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１ＰとＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）のバリン生産能を比較するために、発酵力価評価を行った。各菌株を栄養培地で継代培養し、その後生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表３に示す。
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，硫酸アンモニウム４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2022547466000004
これらの結果から、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）菌株のＬ－バリン生産能は、対照群に対して１１％増加することが確認された。その結果、ｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター変異によりＬ－バリンの生産能が向上することが確認された。
実施例３－２：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖに変異を導入した菌株の作製及びＬ－バリン生産能の評価
実施例３－２－１：バリン生産菌株ＣＪ７Ｖの作製
Ｌ－バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム属菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；非特許文献１２］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を作製した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎＴｏｔａｌＤＮＡ抽出ミニキット（Intron社, Cat. No 17045）を用いて、キットのプロトコルに従って抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ｉｌｖＮ遺伝子にＡ４２Ｖ変異を導入するベクターを作製するために、プライマー５（配列番号２５）とプライマー６（配列番号２６）のプライマー対、及びプライマー７（配列番号２７）とプライマー８（配列番号２８）のプライマー対を用いて、遺伝子断片Ａ、Ｂをそれぞれ得た。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を２５サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。用いたプライマー配列を表４に示す。
Figure 2022547466000005
その結果、断片Ａ、Ｂのどちらも５３７ｂｐのポリヌクレオチドが得られた。前述した２つの断片を鋳型とし、プライマー５（配列番号２５）とプライマー８（配列番号２８）を用いてＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲを行うことにより、１０４４ｂｐのＰＣＲ産物（以下、「変異導入断片」という）が得られた。
前述したように得られた変異導入断片を制限酵素ＸｂａＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理し、その後同じ制限酵素で処理したｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有ＬＢ培地から選択し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（iNtRON社）によりＤＮＡを得た。前記ｉｌｖＮ遺伝子へのＡ４２Ｖ変異導入を目的とするベクターをｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。
その後、前述したように作製した組換えプラスミドｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を染色体上での相同組換えにより、野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に形質転換した（非特許文献１６）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー５及び８を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、次いで遺伝子配列分析により変異導入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖと命名した。
実施例３－２－２：バリン生産能の評価
実施例３－２－１で作製したＬ－バリン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖを対象に、実施例３－１と同様にｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７を形質転換させてｉｌｖＣ遺伝子のプロモーターに変異を導入した菌株を作製し、ＣＪ７Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）と命名した（図３）。作製した菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、実施例３－１と同様に培養してＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表５に示す。
Figure 2022547466000006
これらの結果から、ＣＪ７Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）菌株のＬ－バリン生産能は、対照群に対して１４％増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター変異によりＬ－バリンの生産能が向上することが再度確認された。
実施例３－３：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖに変異を導入した菌株の作製及びＬ－バリン生産能の評価
実施例３－３－１：バリン生産菌株ＣＪ８Ｖの作製
Ｌ－バリンを生産するさらに他のコリネバクテリウム・グルタミカム属菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、実施例３－２と同様に野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）］を導入してＬ－バリン生産能を有する変異株を作製し、前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖと命名した。
実施例３－３－２：バリン生産能の評価
実施例３－３－１で作製したＬ－バリン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖを対象に、ｉｌｖＣプロモーター変異を導入した菌株の作製を試みた。よって、実施例３－１－１で作製した組換えベクターｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７、ｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１３８６９をそれぞれＣＪ８Ｖに形質転換した（非特許文献１６）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー１及び４を用いたＰＣＲにより、染色体上でｉｌｖＣプロモーターに変異を導入した菌株ＣＪ８Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）とＣＪ８Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－２を作製した（図４）。前記組換え菌株のうちＣＪ８Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－２をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ０８－２０３４と命名し、２０１９年８月２１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ１２５７５Ｐとして寄託した。
作製した前記菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、実施例３－１と同様に培養してＬ－バリンの濃度を分析した。分析したＬ－バリンの濃度を表６に示す。
Figure 2022547466000007
これらの結果から、ＣＪ８Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＣＪ８Ｖ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－２菌株のＬ－バリン生産能は、どちらも対照群に対して８．６％増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター変異によりＬ－バリンの生産能が向上することが再度確認された。
イソロイシン生産菌株の作製及び生産能の評価
実施例４－１：Ｌ－イソロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ菌株にｉｌｖＣプロモーター変異を導入した菌株の作製及び評価
実施例３と同様に、Ｌ－イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献５）に実施例３－１で作製した組換えプラスミドｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７及びｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１３８６９を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、それぞれＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－２と命名した（図５）。作製した菌株を次の方法で培養し、イソロイシン生産能を比較した。
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母エキス５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １２．５ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸留水１リットル中）
培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－イソロイシンの生産能を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のＬ－イソロイシン濃度を表７に示す。
Figure 2022547466000008
表７に示すように、Ｌ－イソロイシン生産菌株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐに比べて、ｉｌｖＣプロモーター強化変異を導入したＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＫＣＣＭ１１２４８：：ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－２においては、Ｌ－イソロイシンの濃度がそれぞれ約３２．３％、約２７．８％増加することが確認された。よって、ｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター変異によりＬ－イソロイシンの生産能が向上することが確認された。これらの結果は、コリネバクテリウム属Ｌ－イソロイシン生産菌株においてｉｌｖＣプロモーター変異の導入がＬ－イソロイシン生産に効果的であることを示すものである。
実施例４－２：コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３０３２にｉｌｖＣプロモーター変異を導入したＬ－イソロイシン菌株の作製及びＬ－イソロイシン生産能の評価
ｉｌｖＣプロモーター導入によるＬ－イソロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＷＴ）菌株をベースにｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異体（特許文献６）とｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）変異体（非特許文献１３）を導入して菌株を作製し、公知のトレオニンデヒドラターゼ（L-threonine dehydratase）をコードする遺伝子にｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）変異（非特許文献１４）を導入してＬ－イソロイシン生産能を比較した。用いたプライマー配列を表８に示す。
Figure 2022547466000009
実施例４－２－１：Ｌ３７７Ｋ変異の導入
ＷＴの染色体を鋳型とし、プライマー９とプライマー１０のプライマー対、又はプライマー１１とプライマー１２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５０９ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５２０ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー９とプライマー１２のプライマー対によりＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異を含む１０１１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＺベクターと１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次いでＤＮＡ接合酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）と命名した。
このようにして得たｐＤＺ－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ベクターをＷＴ菌株に電気パルス法（非特許文献１６）で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）を経て、染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異を導入した菌株ＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を得た。
実施例４－２－２：Ｇ３７８Ｅ変異の導入
ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）変異を導入するベクターを作製するために、ＷＴ ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１３とプライマー１４のプライマー対、プライマー１５とプライマー１６のプライマー対を用いて、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の２２０ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の２２０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。この２つのＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔを鋳型とし、プライマー１３とプライマー１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を含む４４０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。用いたプライマー配列を表９に示す。
Figure 2022547466000010
前述したｐＤＺベクターと４４０ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理し、次いでＤＮＡ接合酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）と命名した。
このようにして得たｐＤＺ－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）ベクターを実施例４－２－１で作製したＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）菌株に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（cross-over）を経て、染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｈｏｍ遺伝子にヌクレオチド変異を導入した菌株ＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）を得た。
実施例４－２－３：ｉｌｖＣプロモーター変異の導入
前記実施例と同様に、実施例４－２－２で作製したＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）菌株に実施例３－１で作製した組換えプラスミドｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７及びｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１３０３２を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、それぞれＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＷＴ：：ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３と命名した。
実施例４－２－４：ｉｌｖＡ変異の導入
ｉｌｖＡ遺伝子を対象に、公知のｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）変異（非特許文献１４）を導入したベクターを作製するために、変異位置を中心に、５’末端上流を増幅するためのプライマー１対（プライマー１７及び１８）と、３’末端下流を増幅するためのプライマー１対（プライマー１９及び２０）を考案した。プライマー１７及び２０の各末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線表示）を挿入し、プライマー１８及び１９は交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異（下線表示）が位置するようにした。用いたプライマー配列を表１０に示す。
Figure 2022547466000011
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー１７及びＷＴの染色体を鋳型とし、プライマー１７とプライマー１８のプライマー対、プライマー１９とプライマー２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｉｌｖＡ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の６２７ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の６０８ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。プライマー２０のプライマー対によりＰＣＲを行った。９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、３８３番目のバリンがアラニンに置換されたＩｌｖＡ変異体をコードするｉｌｖＡ遺伝子の変異を含む１２１７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献７）ベクターと１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）と命名した。
ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）ベクターを前記実施例のＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３に導入した菌株をそれぞれ作製し、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）とそれぞれ命名した（図６）。また、その対照群として、ＡＴＣＣ１３０３２：：－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）にｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）変異のみ導入した菌株も作製した。
実施例４－２－５：イソロイシン生産能の評価
実施例４－１のフラスコ培養法と同様に培養し、培養液中のＬ－イソロイシン濃度を分析した。
Figure 2022547466000012
表１１に示すように、野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２：：－ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）に比べて、ｉｌｖＣ変異を含むＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）とＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｏｍ（Ｇ３７８Ｅ）－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３／ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＡ（Ｖ３８３Ａ）においては、Ｌ－イソロイシンの濃度が約２５％、約２４％増加することが確認された。これらの結果は、コリネバクテリウム属Ｌ－イソロイシン生産菌株においてｉｌｖＣプロモーター変異の導入がＬ－イソロイシン生産に効果的であることを示すものである。
ロイシン生産菌株の作製及び生産能の確認
実施例５－１：Ｌ－ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ菌株にｉｌｖＣプロモーター変異を導入した菌株の作製及びロイシン生産能の評価
実施例３－１で作製した組換えプラスミドｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７を染色体上での相同組換えにより、Ｌ－ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ（特許文献８）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ（特許文献８）に形質転換した（非特許文献１６）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有する培地から選択した。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー１及び４を用いたＰＣＲにより、染色体上でｉｌｖＣプロモーターに変異を導入した菌株を作製した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）と命名した（図７）。ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）のロイシン生成能を比較するために、発酵力価評価を行った。各菌株を栄養培地で継代培養し、その後生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－ロイシンの濃度を分析した。分析したＬ－ロイシンの濃度を表１２に示す。
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース１０ｇ，肉汁５ｇ，ポリペプトン１０ｇ，塩化ナトリウム２．５ｇ，酵母エキス５ｇ，寒天２０ｇ，尿素２ｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース５０ｇ，硫酸アンモニウム２０ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）２０ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，炭酸カルシウム１５ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2022547466000013
これらの結果から、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）菌株のＬ－ロイシン生産能は、対照群に対して約１１％及び約１０％増加することが確認された。よって、ｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター変異によりＬ－ロイシンの生産能が向上することが確認された。
実施例５－２：ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８００１に変異を導入した菌株の作製及びＬ－ロイシン生産能の評価
Ｌ－ロイシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム属菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に１種の変異［ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）；特許文献２］を導入してＬ－ロイシン生産能が向上した菌株を作製した。
具体的には、前記特許で作製された組換えプラスミドｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ，Ｇ５６１Ｄ）を染色体上での相同組換えにより、野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換した（非特許文献１６）。その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、遺伝子配列分析により変異導入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８００１と命名した。
最後に、Ｌ－ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＬ８００１を対象に、実施例５－１と同様にｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１４０６７及びｐＤＺ－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－１３０３２ベクターを形質転換し、ｉｌｖＣ遺伝子のプロモーターに変異を導入した菌株ＣＪＬ８００１－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＣＪＬ８００１－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３を作製し（図８）、ＣＪＬ８００１－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１３－８１０１と命名し、２０１９年８月２１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ１２５７６Ｐとして寄託した。
作製した菌株のＬ－ロイシン生産能を比較するために、実施例５－１と同様に培養してＬ－ロイシンの濃度を分析した。分析したＬ－ロイシンの濃度を表１３に示す。
Figure 2022547466000014
これらの結果から、ＣＪＬ８００１－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）及びＣＪＬ８００１－ｉｌｖＣ（Ｐｍ３）－３菌株のＬ－ロイシン生産能は、どちらも対照群に対して約１５％増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてｉｌｖＣ遺伝子のプロモーター変異によりＬ－ロイシン生産能が向上することが再度確認された。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Figure 2022547466000015
Figure 2022547466000016
Figure 2022547466000017

Claims (15)

  1. 下記一般式１で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、
    下記一般式１において、
    ＸはＣＮ１ＧＮ２であり、
    ＹはＣＴＡＡＴＴＮ３であり、
    ＺはＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴであり、
    前記Ｎ１、前記Ｎ２及び前記Ｎ３は、それぞれＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）又はＣ（シトシン）から選択されるいずれかであるポリヌクレオチド。
    ［一般式１］
    Ｘ－Ｙ－Ｚ
  2. 前記ＸのＮ１は、Ｃ（シトシン）又はＧ（グアニン）である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記ＸのＮ２は、Ａ（アデニン）又はＴ（チミン）である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ＹのＮ３は、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記Ｘは配列番号８～１１のいずれかであり、Ｙは配列番号６又は７である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ポリヌクレオチドは、配列番号１３～２０から選択されるいずれかのポリヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプロモーター。
  8. 請求項７に記載のプロモーター、及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター。
  9. 前記標的タンパク質はアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）である、請求項８に記載のベクター。
  10. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物。
  11. 前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１０に記載の微生物。
  12. 請求項１０に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップと、
    前記培地から標的物質を回収するステップとを含む、
    標的物質を生産する方法。
  13. 前記標的物質はアミノ酸である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記アミノ酸はＬ－分枝鎖アミノ酸である、請求項１３に記載の方法。
  15. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプロモーターを標的遺伝子と作動可能に連結させるステップを含む標的遺伝子発現強化方法。
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