JP2015513892A - 自己誘導性発現系、及び腸内細菌科の細菌を使用する有用な代謝産物を製造するためのその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、系の自己誘導性で正のフィードバック調節がコインデューサによって媒介されるように改変された、LysR型タンパク質により調節される転写機構の要素を含む遺伝子発現系を含むよう改変された、腸内細菌科の細菌、特にEscherichia属に属する細菌を使用する有用な代謝産物を製造するための方法を記載するものである。この方法は、分岐鎖L-アミノ酸、特にL-バリン、L-イソロイシン、及びL-ロイシン並びにD-パントテン酸を製造するのに適切である。
Description
本発明は、微生物工業に関し、更に詳しくは、腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）の細菌の発酵によって有用な代謝産物を製造する方法に関するものであって、細菌のLysR型タンパク質により調節される発現系を、前記発現系の機能性がコインデューサによって媒介（影響）され、この結果、前記発現系によって調節される遺伝子の発現レベルが増強されるように改変したものである。更に詳しくは、この発現系及び方法は、L-アミノ酸、例えば、分岐鎖L-アミノ酸の合成経路に由来する代謝産物の製造の改良に有用なものとすることができる。
従来、L-アミノ酸は、天然起源から得られた微生物又はその変異体の株を利用する発酵法によって工業的に製造されている。典型的には、微生物は、L-アミノ酸の生産収量を増強するために改変される。
L-アミノ酸の生産収量を増強するための多くの技術が報告されており、これには、組換えDNAを用いた微生物の形質転換（例えば、特許文献１参照）、及び調節領域、例えば、プロモータ、リーダー配列、及び／又はアテニュエータ又は他の当業者に公知のものの変更（例えば、特許文献２及び特許文献３参照）が含まれる。生産収量を増強する他の技術には、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は結果的に得られるL-アミノ酸によるフィードバック阻害に対して標的酵素を脱感作することが含まれる（例えば、特許文献４〜８、参照）。例えば、L-バリンによるフィードバック阻害に対して耐性である変異体細菌アセトヒドロキシ酸合成酵素I（acetohydroxy-acid synthetase I）（アセト乳酸合成酵素I（アセトラクテート合成酵素I、acetolactate synthase I）としても言及され、以下ではAHAS Iとする）は、対応するL-アミノ酸生産株における分岐鎖L-アミノ酸の生産を改良するために利用されている（特許文献９）。
分岐鎖L-アミノ酸（branched-chain L-amino acids）(BCAAs)、例えば、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンの生合成は、分岐した生合成経路を介して生起する。アセト乳酸合成酵素（酵素分類(EC)番号2.2.1.6）は、この経路における第１のステップの反応を触媒し、これは３つのアミノ酸全ての生合成経路に共通である。この反応は、ピルビン酸から誘導された活性化されたアセトアルデヒド（2-(α-ヒドロキシエチル)チアミンジホスフェート）とピルビン酸又は2-オキソブタン酸（2-オキソブタノエート、2-oxobutanoate）との縮合を含み、それぞれ2-アセト乳酸（2-アセトラクテート、2-acetolactate）(AL)又は2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸（2-アセト-2-ヒドロキシブタノエート、2-aceto-2-hydroxybutanoate）(AHB)を生成するものである。ALは、L-バリン及びL-ロイシンの前駆体であり、AHBは、L-イソロイシンの前駆体である。Escherichia coli (E. coli)（大腸菌）においては、例えば、ピルビン酸分子同士の反応並びにピルビン酸と2-オキソブタン酸との間の反応は、３つのAHASアイソザイム、AHAS I、AHAS II、及びAHAS IIIによって触媒され、これらはそれぞれilvBN、ilvGM、及びilvIH遺伝子によってコードされている。AHAS I及びAHAS IIIは、L-バリンによる最終産物阻害（フィードバック阻害としても言及される）についての標的である。最終産物によるフィードバック阻害は、細菌におけるこれらの経路の生理学的な制御において主要な役割を果たしている。
AHASにより触媒された反応の生成物、AL又はAHBは、2-アセトヒドロキシ酸異性化還元酵素（2-acetohydroxy acid isomeroreductase）IlvC(EC 1.1.1.86)の基質であり、IlvCはilvYCオペロンの一員であるilvC遺伝子によってコードされている。E. coliのilvYCオ
ペロンは、原型的なLysRタンパク質により調節される系（LysR protein-regulated system）であって、これは細菌における最も共通な種類の正の調節系であり、腸内細菌科からリゾビウム科の範囲に渡る原核細菌ファミリーに見出すことができる(非特許文献１)。ilvY遺伝子は、転写レギュレータである、LysR型調節タンパク質IlvYをコードし、これは高度に協働的に、両方向に機能する重複するilvYCプロモータ領域における２つのタンデムなオペレータ領域に結合する（図１）。第１のオペレータ領域への結合に際しては、IlvYレギュレータは、ilvYプロモータからの転写を負に自己調節し、これによりそれ自身の合成を減衰させる。この機能は別として、IlvYは、ilvC遺伝子の転写の活性化に枢要な役割を果たしている。ilvC転写の活性化には、第２のオペレータ領域に対するIlvYレギュレータの結合が必要であり、更に予備形成されたIlvY/DNA複合体に対するコインデューサ、例えば、2-アセト乳酸（2-acetolactate）(AL)又は2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸（2-aceto-2-hydroxybutanoate）(AHB)の付加的な結合が必要である。コインデューサを結合させるに際しては、タンパク質/DNA複合体の立体構造変化が生起し、これによりilvCプロモータの-35領域がリモデル（remodel）され、RNAポリメラーゼ結合能力が劇的に増加する（非特許文献２）。
ペロンは、原型的なLysRタンパク質により調節される系（LysR protein-regulated system）であって、これは細菌における最も共通な種類の正の調節系であり、腸内細菌科からリゾビウム科の範囲に渡る原核細菌ファミリーに見出すことができる(非特許文献１)。ilvY遺伝子は、転写レギュレータである、LysR型調節タンパク質IlvYをコードし、これは高度に協働的に、両方向に機能する重複するilvYCプロモータ領域における２つのタンデムなオペレータ領域に結合する（図１）。第１のオペレータ領域への結合に際しては、IlvYレギュレータは、ilvYプロモータからの転写を負に自己調節し、これによりそれ自身の合成を減衰させる。この機能は別として、IlvYは、ilvC遺伝子の転写の活性化に枢要な役割を果たしている。ilvC転写の活性化には、第２のオペレータ領域に対するIlvYレギュレータの結合が必要であり、更に予備形成されたIlvY/DNA複合体に対するコインデューサ、例えば、2-アセト乳酸（2-acetolactate）(AL)又は2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸（2-aceto-2-hydroxybutanoate）(AHB)の付加的な結合が必要である。コインデューサを結合させるに際しては、タンパク質/DNA複合体の立体構造変化が生起し、これによりilvCプロモータの-35領域がリモデル（remodel）され、RNAポリメラーゼ結合能力が劇的に増加する（非特許文献２）。
L-バリン及びL-ロイシンの生合成においては、2-アセト乳酸(AL)が、IlvCタンパク質によって、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸（2,3-ジヒドロキシ-3-メチルブタノエート、2,3-dihydroxy-3-methylbutanoate）（2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸(2,3-ジヒドロキシイソバレレート、2,3-dihydroxy-isovalerate)、DHIVとしても言及される）に変換される（図２）。L-イソロイシンの生合成においては、2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸(AHB)が、IlvCによって、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルペンタン酸（2,3-ジヒドロキシ-3-メチルペンタノエート、2,3-dihydroxy-3-methylpentanoate)（2,3-ジヒドロキシ-3-メチル吉草酸（2,3-ジヒドロキシ-3-メチルバレレート、2,3-dihydroxy-3-methylvalerate）、DHMVとしても言及される）に変換される。
最近、自己誘導性の遺伝子発現系（auto-inducible gene expression system）は、日常的な遺伝子的アプローチを超えて、所望の遺伝子の発現を増強させるのに極めて魅力的になった。例えば、文献によれば、人工的に設計された正のフィードバックに基いた遺伝子発現系が提供されており、これはタンパク質インデューサ信号に対する感受性を向上させると共に、外部的なコファクターであるアシルホモセリンラクトン（acyl homoserine lactone）（AHL、HSLとしても略される）を必要とすることなく、最大の発現レベルを増加させる遺伝子信号の増幅体として機能することができる（非特許文献３）。設計された系は、Vibrio fischeri由来のクオラムセンシング(quorum-sensing、QS)レギュレータLuxR(luxオペロン)の構成的に活性な異型体を利用するものであり、これはAla221Val点突然変異のために、オートインデューサ(AHL)独立性である（非特許文献４及び５）。差異が僅かな、類似する遺伝子発現系が、E. coliにおけるモデルの膜タンパク質、チトクロムbdキノールオキシダーゼの発現の動態学を操作するのに適用されている（非特許文献６）。
V. fischery由来のクオラムセンシング機構（luxバイオルミネセンス遺伝子）に基き、オートインデューサ(HSL)の内因性の起源に依拠する自己誘導性で正にフィードバック調節される活性化系が、組換えタンパク質、例えば、薬学的組成物を調製するための抗原を発現するために利用されている（特許文献１０）。
しかしながら、発現系の機能性がコインデューサによって媒介されるように改変された、LysR型タンパク質により調節される遺伝子発現系、及びL-アミノ酸、例えば、分岐鎖L-アミノ酸の生合成経路、及び／又はその分岐から離れた経路からの有用な代謝産物の生産のためのその使用を記載したデータは、現在までのところ報告されていない。
Rhee K.Y.ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1999, 96:14294-14299
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本発明の一態様は、系の自己誘導性で正のフィードバック調節がコインデューサによって媒介されるように改変された、LysR型タンパク質により調節される転写機構の要素を含む遺伝子発現系を提供することにある。
本発明の他の態様は、腸内細菌科の細菌であって、Escherichia属に属するものとすることができ、更に詳しくは、Escherichia coliに属するものとすることができ、且つ、この発現系を含むよう改変された細菌を提供することにある。
本発明の他の態様は、有用な代謝産物、例えば、L-アミノ酸、例えば、分岐鎖L-アミノ酸又はその塩、特にL-バリン、L-イソロイシン、及びL-ロイシン又はその塩を製造する方法を提供することにある。この目的は、遺伝子の発現がLysR型タンパク質により調節される転写機構によって調節され、その発現が、アセト乳酸合成酵素反応によって生産されるコインデューサによって媒介されるように、L-バリンによるフィードバック阻害に対して耐性である変異体アセト乳酸合成酵素をコードする遺伝子を改変することにより、分岐鎖L-アミノ酸の生産が増加することを見出したことによって達成された。
本発明の１つの態様によれば、遺伝子発現系であって、LysR型調節タンパク質及びコインデューサにより発現が正に調節されるプロモータ及びオペレータを含む、LysR型タンパク質により調節される転写機構と、転写機構が作動可能に連接された目的遺伝子であって、コインデューサ、基質、又はコインデューサの前駆体の生合成に関与するタンパク質をコードする目的遺伝子とを含み、それにより発現系の自己誘導性で正のフィードバック調節が、コインデューサによって媒介されることを特徴とする遺伝子発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、系が、腸内細菌科又はシュードモナス科に属する細菌に由来する前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、系が、腸内細菌科に属する細菌に由来する前記発現系が
提供される。
提供される。
本発明の更なる態様によれば、系が、Escherichia属に属する細菌に由来する前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、細菌が、Escherichia coliに属する前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、系が、分岐鎖L-アミノ酸、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、及びL-トリプトファンからなる群から選択されるL-アミノ酸の生合成経路に由来する前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、系が、分岐鎖L-アミノ酸の生合成経路に由来する前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、プロモータがPilvCプロモータであり、LysR型調節タンパク質がIlvYタンパク質であり、コインデューサが2-アセト乳酸、2-アセト-2-ヒドロキシ酪酸、又はその塩である前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、コインデューサが2-アセト乳酸又はその塩である前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、目的遺伝子がアセトヒドロキシ酸合成酵素をコードする前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、目的遺伝子が、
(A)以下のA1及びA2の組合せ：
(A1)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、A2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(A2)配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、A1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、
(B)以下のB1及びB2の組合せ：
(B1)配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、B2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(B2)配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、B1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(C)以下のC1及びC2の組合せ：
(C1)配列番号32のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号32のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、C2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(C2)配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、C1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるタンパク質をコードする前記発現系が提供される。
(A)以下のA1及びA2の組合せ：
(A1)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、A2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(A2)配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、A1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、
(B)以下のB1及びB2の組合せ：
(B1)配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、B2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(B2)配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、B1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(C)以下のC1及びC2の組合せ：
(C1)配列番号32のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号32のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、C2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(C2)配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、C1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるタンパク質をコードする前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、アセトヒドロキシ酸合成酵素が、L-バリンによるフィードバック阻害に耐性である変異体アセト乳酸合成酵素Iである前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、オペレータが、LysR型調節タンパク質が結合する領域を含む前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、LysR型調節タンパク質が、
(D)配列番号10のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
(E)配列番号10のアミノ酸配列を含む異型体タンパク質であって、かつ、１又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含み、LysR型調節タンパク質の活性を有する異型体タンパク質
からなる群から選択される前記発現系が提供される。
(D)配列番号10のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
(E)配列番号10のアミノ酸配列を含む異型体タンパク質であって、かつ、１又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含み、LysR型調節タンパク質の活性を有する異型体タンパク質
からなる群から選択される前記発現系が提供される。
本発明の更なる態様によれば、前記プロモータが、
(F)配列番号30のヌクレオチド配列を含むDNA、又は
(G)配列番号30のヌクレオチド配列を含む異型体DNAであって、かつ、１又は幾つかのヌクレオチド残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含み、配列番号30のヌクレオチド配列の活性を有する異型体DNA
を含む前記発現系が提供される。
(F)配列番号30のヌクレオチド配列を含むDNA、又は
(G)配列番号30のヌクレオチド配列を含む異型体DNAであって、かつ、１又は幾つかのヌクレオチド残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含み、配列番号30のヌクレオチド配列の活性を有する異型体DNA
を含む前記発現系が提供される。
本発明の態様によれば、腸内細菌科に属するL-アミノ酸生産細菌であって、前記発現系を含むよう改変されたことを特徴とするL-アミノ酸生産細菌が提供される。
本発明の更なる態様によれば、細菌が、LysR型調節タンパク質をコードする遺伝子を含む前記細菌が提供される。
本発明の更なる態様によれば、細菌が、Escherichia属に属する前記細菌が提供される。
本発明の更なる態様によれば、細菌が、Escherichia coliに属する前記細菌が提供される。
本発明の更なる態様によれば、L-アミノ酸が、分岐鎖L-アミノ酸である前記細菌が提供される。
本発明の更なる態様によれば、分岐鎖L-アミノ酸が、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンからなる群から選択される前記細菌が提供される。
本発明の態様によれば、分岐鎖L-アミノ酸を製造する方法であって、
(i)分岐鎖L-アミノ酸が培養培地中に蓄積されるよう、培養培地中で前記細菌を培養し、
(ii)分岐鎖L-アミノ酸を培養培地から捕集する
ことを含むことを特徴とする分岐鎖L-アミノ酸の製造方法が提供される。
(i)分岐鎖L-アミノ酸が培養培地中に蓄積されるよう、培養培地中で前記細菌を培養し、
(ii)分岐鎖L-アミノ酸を培養培地から捕集する
ことを含むことを特徴とする分岐鎖L-アミノ酸の製造方法が提供される。
本発明の更なる側面によれば、分岐鎖L-アミノ酸が、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンからなる群から選択される前記分岐鎖L-アミノ酸の製造方法が提供される。
本発明を以下に詳細に説明する。
１．細菌
「有用な代謝産物」という記載は、酵素反応又は生合成経路によって代謝産物を製造することができる限り、特に限定されるものではなく、代謝産物が、L-アミノ酸、高級アルコール、及びD-パントテン酸を含み得る。
「有用な代謝産物」という記載は、酵素反応又は生合成経路によって代謝産物を製造することができる限り、特に限定されるものではなく、代謝産物が、L-アミノ酸、高級アルコール、及びD-パントテン酸を含み得る。
「L-アミノ酸生産細菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、L-アミノ酸を生産し、培養培地中でL-アミノ酸の蓄積を生起する能力を有する腸内細菌科の細菌を意味する。L-アミノ酸生産能とは、細菌を培地中で培養した場合に、L-アミノ酸を培地又は細菌細胞から捕集することのできる程度に、培地又は細菌細胞中でL-アミノ酸を生産すると共にL-アミノ酸の蓄積を生起する細菌の能力を意味するものとすることができる。
「L-アミノ酸」という記載は、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、及びL-バリンを含むものとすることができる。
「分岐したL-アミノ酸」という記載は、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンを含むものとすることができる。
細菌は、有用な代謝産物、例えば、L-アミノ酸を生産する能力を固有に有していてもよく、又は、変異方法若しくはDNA組換え技術を使用することによってこのような能力を有するよう改変されていてもよい。
腸内細菌科に属する細菌は、Enterobacter属, Erwinia属, Escherichia属, Klebsiella属, Morganella属, Pantoea属, Photorhabdus属, Providencia属, Salmonella属, Yersinia属等に由来するものとすることができ、L-アミノ酸を生産する能力を有するものとすることができる。特に、NCBI(National Center for Biotechnology Information) データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)で使用されている分類学に準じて腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。改変することのできる腸内細菌科に由来する株の例には、Escherichia属, Enterobacter属又はPantoea属の細菌が含まれる。
ここに開示した主題に従ってEscherichia属細菌を取得するために改変することのできるEscherichia属細菌の株は特に限定されず、 特にNeidhardtらの業績に記載されたものを使用することができる(Bachmann, B.J., E. coli K-12の幾つかの変異体誘導体の誘導及び遺伝子型(Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-1
2), p. 2460-2488、F.C. Neidhardt ら(編), E. coliとSalmonella:細胞及び分子生物学、第２版(E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed.) ASM Press, Washington, D.C., 1996に記載されている)。E.coliは特定の例である。E. coliの特定の例には、E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076)等が含まれ、これらはプロトタイプ野生型株、K-12株から誘導される。これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection ）(P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)から入手可能である。すなわち、それぞれの株に対して登録番号が与えられており、これらの登録番号を使用することにより株を注文することができる(www.atcc.org参照)。株の登録番号は、American Type Culture Collectionのカタログに列記されている。
2), p. 2460-2488、F.C. Neidhardt ら(編), E. coliとSalmonella:細胞及び分子生物学、第２版(E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed.) ASM Press, Washington, D.C., 1996に記載されている)。E.coliは特定の例である。E. coliの特定の例には、E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076)等が含まれ、これらはプロトタイプ野生型株、K-12株から誘導される。これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection ）(P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)から入手可能である。すなわち、それぞれの株に対して登録番号が与えられており、これらの登録番号を使用することにより株を注文することができる(www.atcc.org参照)。株の登録番号は、American Type Culture Collectionのカタログに列記されている。
Enterobacter属細菌の例には、Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes等が含まれる。Pantoea属細菌の例には、Pantoea ananatis等が含まれる。Enterobacter agglomeransの幾つかの株は、最近では、16S rRNAのヌクレオチド配列解析等に基いて、Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis,又はPantoea stewartiiに再分類されている。腸内細菌科に分類される細菌である限り、Enterobacter属又はPantoea属のいずれかに属する細菌を使用することができる。Pantoea ananatis株を遺伝子工学技術によって育種する場合、Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614), AJ13356株(FERM BP-6615), AJ13601株(FERM BP-7207)及びその誘導体を使用することができる。これらの株は、分離された当時は、Enterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomeransとして寄託されていた。しかしながら、前記したように、これらは最近では、16S rRNAのヌクレオチド配列決定等に基いてPantoea ananatisとして再分類されている。
シュードモナス科に属する細菌の例は、Pseudomonas属に由来するものとすることができる。Pseudomonas属細菌の例には、Pseudomonas putida, P. aeruginosa,及びP. syringaeが含まれる。
「発現系を含むよう改変された細菌」という記載は、この場合、LysR型タンパク質により調節される発現系は、前記系の自己誘導性で正のフィードバック調節の機能性がコインデューサによって媒介されるように改変された、細菌、例えば、腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌を意味することができる。例えば、「発現系」を含むよう改変された細菌」という記載は、L-アミノ酸、例えば、分岐鎖L-アミノ酸を生産する能力を有する腸内細菌科の細菌を意味するものとすることができ、これは遺伝子発現系を有するよう改変されたものである。
分岐鎖L-アミノ酸生産細菌
「分岐鎖L-アミノ酸生産細菌」という記載は、細菌が培地中で培養された場合に、培地中で分岐鎖L-アミノ酸、例えばL-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンを生産して蓄積を生起する能力を有する細菌を意味するものとすることができる。L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシン以外に、分岐鎖L-アミノ酸は、非天然の分岐鎖L-アミノ酸、例えば、L-ホモロイシン及びL-ホモイソロイシンも含むことができる。分岐鎖L-アミノ酸を生産する能力は、育種によって付与するか増強することができる。「分岐鎖L-アミノ酸生産細菌」という記載は、培養培地中で改変されていない株、例えば、野生型又は親株よりも多い量で分岐鎖L-アミノ酸を生産し蓄積を生起することのできる細菌を示すものとすることもでき、0.5 g/L以上、更に1.0 g/L以上の量で培地中で分岐鎖L-アミノ酸を生産して蓄積を生起することのできる細菌を意味するとすることもできる。
「分岐鎖L-アミノ酸生産細菌」という記載は、細菌が培地中で培養された場合に、培地中で分岐鎖L-アミノ酸、例えばL-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンを生産して蓄積を生起する能力を有する細菌を意味するものとすることができる。L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシン以外に、分岐鎖L-アミノ酸は、非天然の分岐鎖L-アミノ酸、例えば、L-ホモロイシン及びL-ホモイソロイシンも含むことができる。分岐鎖L-アミノ酸を生産する能力は、育種によって付与するか増強することができる。「分岐鎖L-アミノ酸生産細菌」という記載は、培養培地中で改変されていない株、例えば、野生型又は親株よりも多い量で分岐鎖L-アミノ酸を生産し蓄積を生起することのできる細菌を示すものとすることもでき、0.5 g/L以上、更に1.0 g/L以上の量で培地中で分岐鎖L-アミノ酸を生産して蓄積を生起することのできる細菌を意味するとすることもできる。
分岐鎖L-アミノ酸生産細菌は、腸内細菌科の細菌とすることができ、これは複合体によってアセト乳酸合成酵素遺伝子の発現に正に影響を与える調節領域を含む（これは転写調節タンパク質と、アセト乳酸合成酵素により触媒された反応の生成物であるコインデュー
サとを含む）。更に、細菌は、増加した変異体アセト乳酸合成酵素活性を有する腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌とすることができる。特に、細菌は、腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌とすることができ、この場合、細菌による分岐鎖L-アミノ酸の生産は、細菌中に調節領域を導入することにより変異体アセト乳酸合成酵素の活性を増強することによって増加されている。細菌は、Escherichia属に属する分岐鎖L-アミノ酸生産細菌であり、この場合、細菌による分岐鎖L-アミノ酸の生産は、L-バリンによるフィードバック阻害に対して耐性である変異体アセト乳酸合成酵素の活性を増強することによって増加させることができる。
サとを含む）。更に、細菌は、増加した変異体アセト乳酸合成酵素活性を有する腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌とすることができる。特に、細菌は、腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌とすることができ、この場合、細菌による分岐鎖L-アミノ酸の生産は、細菌中に調節領域を導入することにより変異体アセト乳酸合成酵素の活性を増強することによって増加されている。細菌は、Escherichia属に属する分岐鎖L-アミノ酸生産細菌であり、この場合、細菌による分岐鎖L-アミノ酸の生産は、L-バリンによるフィードバック阻害に対して耐性である変異体アセト乳酸合成酵素の活性を増強することによって増加させることができる。
腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌は、前記したような細菌に限定されるものではない。更に詳しくは、分岐鎖L-アミノ酸生産細菌は、L-バリン、L-ロイシン、及び／又はL-イソロイシン生産細菌とすることもできる。
L-バリン生産細菌
L-バリン生産細菌を誘導するための親株の例には、限定されるものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するよう改変された株を含むものとすることができる(米国特許第5,998,178号)。生産されるL-バリンによってオペロンの発現が減衰されないよう、転写減衰に必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去するのが望ましい。更に、オペロン内のilvA遺伝子は、スレオニンデアミナーゼ活性が減少するよう、望ましくは破壊するものとする。
L-バリン生産細菌を誘導するための親株の例には、限定されるものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するよう改変された株を含むものとすることができる(米国特許第5,998,178号)。生産されるL-バリンによってオペロンの発現が減衰されないよう、転写減衰に必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去するのが望ましい。更に、オペロン内のilvA遺伝子は、スレオニンデアミナーゼ活性が減少するよう、望ましくは破壊するものとする。
L-バリン生産細菌を誘導するための親株の例には、アミノアシルｔRNA合成酵素の変異を有する変異体を含むものとすることもできる(米国特許第5,658,766号)。例えば、イソロイシンｔRNA合成酵素をコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970を使用することができる。E. coli VL1970は、1988年６月24日に、受託番号VKPM B-4411の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1st Dorozhny Proezd, 1)に寄託された。更に、生育にリポ酸を要求し且つ／又はH+-ATPaseを欠如する変異体を親株として使用することもできる(WO96/06926)。
親株としては、Escherichia属に属するL-バリン生産細菌、例えば、H-81 (VKPM B-8066), NRRL B-12287及びNRRL B-12288(米国特許第4,391,907号), VKPM B-4411(米国特許第5,658,766号), VKPM B-7707(欧州特許出願EP1016710A2), NS1610(特許EP1942183、実施例 7及びここに記載する実施例参照)等を用いることができる。
L-ロイシン生産細菌
L-ロイシン生産細菌を誘導するための親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ロイシン(例えば、株57(VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))又はβ-2-チエニルアラニン, 3-ヒドロキシロイシン, 4-アザロイシン, 5,5,5-トリフルフロロイシン (JP 62-34397 B及びJP 8-70879 A)を含むロイシンアナログに耐性であるE. coli株、WO96/06926に記載された遺伝子工学による方法によって得られたE. coli株、E. coli H-9068 (JP 8-70879 A)等が含まれる。
L-ロイシン生産細菌を誘導するための親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ロイシン(例えば、株57(VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))又はβ-2-チエニルアラニン, 3-ヒドロキシロイシン, 4-アザロイシン, 5,5,5-トリフルフロロイシン (JP 62-34397 B及びJP 8-70879 A)を含むロイシンアナログに耐性であるE. coli株、WO96/06926に記載された遺伝子工学による方法によって得られたE. coli株、E. coli H-9068 (JP 8-70879 A)等が含まれる。
細菌は、L-ロイシン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。この例には、leuABCDオペロンの遺伝子が含まれ、これはL-ロイシンによるフィードバック阻害を受けないイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする変異体leuA遺伝子により代表されるものとすることができる(米国特許第6,403,342号)。加えて、細菌は、細菌細胞からL-アミノ酸を分泌するタンパク質をコードする１以上の遺伝子の発現を改良することによって改良することができる。このような遺伝子の例には、b2682及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子)が含まれる(EP1239041 A2)。
親株としては、Escherichia属に属するL-ロイシン生産細菌、例えば、H-9070 (FERM BP-4704)及びH-9072 (FERM BP-4706) (US5744331), VKPM B-7386及びVKPM B-7388 (RU2140450), W1485atpA401/pMWdAR6, W1485lip2/pMWdAR6及びAJ12631/pMWdAR6 (EP0872547)等を用いることができる。
L-イソロイシン生産細菌
L-イソロイシン生産細菌を誘導するための親株の例には、限定されるものではないが、6-ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異体(JP 5-304969 A)、イソロイシンアナログ、例えば、チオイソロイシン及びイソロイシンヒドロキサメートに対する耐性を有する変異体、及びDL-エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対する耐性を付加的に有する変異体(JP 5-130882 A)が含まれる。加えて、L-イソロイシン生合成に関与するタンパク質、例えば、スレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキシ酸（アセトヒドロキセート）合成酵素をコードする遺伝子により形質転換された組換え株を親株として使用することもできる(JP 2-458 A, FR 0356739,及び米国特許第5,998,178号)。
L-イソロイシン生産細菌を誘導するための親株の例には、限定されるものではないが、6-ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異体(JP 5-304969 A)、イソロイシンアナログ、例えば、チオイソロイシン及びイソロイシンヒドロキサメートに対する耐性を有する変異体、及びDL-エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対する耐性を付加的に有する変異体(JP 5-130882 A)が含まれる。加えて、L-イソロイシン生合成に関与するタンパク質、例えば、スレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキシ酸（アセトヒドロキセート）合成酵素をコードする遺伝子により形質転換された組換え株を親株として使用することもできる(JP 2-458 A, FR 0356739,及び米国特許第5,998,178号)。
親株としては、Escherichia属に属するL-イソロイシン生産細菌、例えば株(NZ10) TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi K. ら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4):672-679)又は欧州特許出願EP685555 A1に記載された株AJ12919等を用いることができる。
高級アルコール及びD-パントテン酸生産細菌
腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌、更に詳しくは、腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌は、高級アルコール及び有機酸又はその誘導体を生産するために使用することができる。例えば、高級アルコール、例えば、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール、並びに有機酸、例えば、D-パントテン酸(ビタミン B5)は、この種の細菌を使用して製造することができる。
腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌、更に詳しくは、腸内細菌科の分岐鎖L-アミノ酸生産細菌は、高級アルコール及び有機酸又はその誘導体を生産するために使用することができる。例えば、高級アルコール、例えば、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール、並びに有機酸、例えば、D-パントテン酸(ビタミン B5)は、この種の細菌を使用して製造することができる。
腸内細菌科の細菌では、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンの生合成経路は、ケト酸中間体を介して進行することは本技術分野で公知である。更に詳しくは、2-オキソイソ吉草酸(2-ケトイソ吉草酸（ケトイソバレレート）、2-KIV)は、L-バリン及びL-ロイシンの前駆体であり、2-オキソブタン酸は、L-イソロイシンの前駆体である。また、ケト酸中間体又はその誘導体は、エーリッヒ分解経路(Ehrlich degradation pathway)により、２原子を超える長さの炭素鎖を有する高級アルコールの前駆体となり得ることも、本技術分野で公知である(Yan Y.とLiao J.C. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2009, 36:471-479)。例えば、2-オキソイソ吉草酸（オキソイソバレレート）は、イソブタノールの前駆体であり、その誘導体である4-メチル-2-オキソペンタン酸（オキソペンタノエート）は、3-メチル-1-ブタノールの前駆体であり、2-オキソブタン酸（オキソブタノエート）は、n-プロパノールの前駆体であり、その誘導体である3-メチル-2-オキソペンタン酸（オキソペンタノエート）は、2-メチル-1-ブタノールの前駆体である。
高級アルコールを生産する能力は、宿主微生物由来の広範囲基質ケト酸脱炭酸酵素(broad-substrate-range keto-acid decarboxylase)(KDC)及びアルコール脱水素酵素(alcohol
dehydrogenase)(ADH)をコードする遺伝子(kivd及びadh2)を導入することにより、高級アルコールを生産する生来の能力を有さないE. coli株に減損させることができる。例えば、Bacillus subtilis由来のkivd遺伝子及びLactococcus lactis由来のadh2遺伝子を使用することができる。この側面では、Connor M.R.とLiao J.C., Appl. Env. Mocrobiol., 2008, 74:5769-5775及び特許出願WO2009046370 A2を参照することができる。
dehydrogenase)(ADH)をコードする遺伝子(kivd及びadh2)を導入することにより、高級アルコールを生産する生来の能力を有さないE. coli株に減損させることができる。例えば、Bacillus subtilis由来のkivd遺伝子及びLactococcus lactis由来のadh2遺伝子を使用することができる。この側面では、Connor M.R.とLiao J.C., Appl. Env. Mocrobiol., 2008, 74:5769-5775及び特許出願WO2009046370 A2を参照することができる。
よって、宿主微生物から、腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌に、遺伝子発現系及び適切な異種遺伝子、例えば、kivd及びadh2又はその異型体を導入することにより、高級アルコール、例えば、イソブタノール、3-メチル-1-ブタノール、及び2-メチル-1-ブタノールを
生産する能力を細菌に与えることができる。
生産する能力を細菌に与えることができる。
腸内細菌科の細菌においては、2-オキソイソ吉草酸はD-パントテン酸の前駆体であることも本技術分野で公知である。よって、遺伝子発現系を用いて腸内細菌科ファミリーの細菌を改変することにより、D-パントテン酸を生産する能力を細菌に与えることができる。
２．発現系
発現系は、LysR型タンパク質により調節される転写機構の要素を含む遺伝子転写調節系とすることができる。LysR型タンパク質により調節される転写機構の要素は、プロモータ及びオペレータ（その発現がLysR型調節タンパク質及びコインデューサによって正に制御される）を含むものとすることができる。
発現系は、LysR型タンパク質により調節される転写機構の要素を含む遺伝子転写調節系とすることができる。LysR型タンパク質により調節される転写機構の要素は、プロモータ及びオペレータ（その発現がLysR型調節タンパク質及びコインデューサによって正に制御される）を含むものとすることができる。
発現系は、前記した転写機構が作動可能に連接（連結）された目的遺伝子を更に含むものとすることができる。「作動可能に連接された」という記載は、遺伝子の発現を許容するように、目的遺伝子が調節配列、例えば、プロモータ及びオペレータに連接（連結）されていることを意味するものとすることができる。
目的遺伝子は、コインデューサ、基質、又は前記コインデューサの前駆体の生合成に関与するタンパク質をコードすることができる。
発現系の前記した設計によれば、系の発現は、目的遺伝子の発現産物の関与により生産されたコインデューサの媒介によって、自己誘導性で正にフィードバック調節される。このような発現系は、「自己誘導性で正にフィードバック調節される発現系」と呼ぶことができるが、簡便性の理由により、発現系として言及する場合がある。この発現系は、生合成経路、更に詳しくは、分岐鎖L-アミノ酸の生合成経路及び／又はその分岐から離れた経路（branched off pathway）における有用な代謝産物のための基質又は前駆体とすることのできるコインデューサによって正にフィードバックされ自己調節されるものとすることができる。
「LysR型調節タンパク質」は、「LysR型転写レギュレータ(LTTR)」、LysRファミリー転写レギュレータ、又は単に「レギュレータ」として言及することもできる。LysR型調節タンパク質（LysR-type regulatory protein）は、広範な種類の環境信号に応答して広範な種類の転写ユニットを調節するオリゴマー性の細菌転写因子の多様なファミリーに属し得る。このファミリーの構成員は、転写活性化因子及び／又は転写抑制因子として作用することができ、Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626に記載されているように、幾つかの共通の構造的特徴、例えば、(i)へリックス-ターン-へリックスモチーフ（helix-turn-helix motif）を用いるDNA-結合ドメイン(残基は、LTTRのN-末端から、位置1から65までとすることができる)、(ii)コインデューサの認識及び／又は応答に関与するドメイン(残基は、100から173まで、及び196から206までとすることができる)、及び(iii)DNA結合及びコインデューサ応答に必要なドメイン(残基は、227から253までとすることができる)を有する。コインデューサの非存在下では、Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626に記載されているように、LTTRsは、共通の構造及び位置(-65近傍)を有する15-bpダイアディック領域（15-bp dyadic region）を介して、制御されたプロモータに結合することができる。コインデューサの存在下では、-35 RNAポリメラーゼ結合部位近傍の領域に対するLTTRsの付加的な相互作用及び／又はDNAの湾曲が生起し得て、これにより転写の活性化に帰着する(Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626)。加えて、LysR型調節タンパク質ファミリーの幾つかの構成員は、Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47:597-626に記載されているように、他の４つの機能的特徴、例えば、(i) 276〜324の範囲に渡るアミノ酸残基のように、さまざまな大きさのコインデューサ応答性転写レギュレータタンパク質であり、(ii)コインデューサの存在とは
独立して、類似する位置及び構造的モチーフを有するオペレータDNA領域に対する制御された標的に結合し、(iii)制御された目的遺伝子のプロモータに対して極めて近いか、又はこれと重なるプロモータから反対向きに転写され、(iv)さまざまな程度に、例えば、3〜10倍、それ自身の転写を抑制する、すなわち、負に自己制御するという特徴を有し得る。
独立して、類似する位置及び構造的モチーフを有するオペレータDNA領域に対する制御された標的に結合し、(iii)制御された目的遺伝子のプロモータに対して極めて近いか、又はこれと重なるプロモータから反対向きに転写され、(iv)さまざまな程度に、例えば、3〜10倍、それ自身の転写を抑制する、すなわち、負に自己制御するという特徴を有し得る。
例えば、限定されるものではないが、発現系は、自己誘導性で正にフィードバック調節されるプロモータ及びオペレータを含むLysR型タンパク質により調節される転写機構、及び目的遺伝子を含むものとすることができる。系の発現は、LysR型調節タンパク質及びコインデューサによって正に調節される。自己誘導性で正にフィードバック調節されるものの例には、PilvCプロモータが含まれ得る。LysR型調節タンパク質の例には、IlvYタンパク質が含まれ得る。コインデューサの例には、2-アセト-2-ヒドロキシカルボン酸の一員、例えば、2-アセト乳酸(AL)、2-アセト-2-ヒドロキシ酪酸(AHB, 2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸としても言及される)、及びその塩が含まれ得る。目的遺伝子の例には、アセト乳酸合成酵素I, II及び／又はIII、又はその変異体の異型体をコードする遺伝子が含まれ得る。例示的な発現系は、種類、量、及び発現系の要素の配置を限定することなく、概略的に記述することができる。
ilvY及びilvC遺伝子は、図１に示すように、反対方向に並んで局在し、ilvY及びilvC遺伝子の転写は、それぞれ上流下流反対向きに機能する重なるプロモータであるilvY及びilvCによって開始される。ただし、「ilvCプロモータ」又は「PilvCプロモータ」という語は、ilvY及びilvCプロモータを包括的に意味することができるものとする。プロモータ領域には、２つのタンデムなオペレータがある(図１)。
目的遺伝子は、転写機構、特にプロモータに作動可能に連接されている。例えば、目的遺伝子がアセト乳酸合成酵素IをコードするilvBN遺伝子であり、プロモータがilvCプロモータである場合は、ilvBN遺伝子の上流に位置した生来のプロモータ領域は、遺伝子の発現がプロモータによって調節されるように、ilvC遺伝子の誘導性のプロモータ及び第２のオペレータ領域を含むDNA断片によって置き換えられる。例えば、L-バリンによるフィードバック阻害に対して耐性であるAHAS IをコードするilvBN4オペロン上の遺伝子をilvCプロモータの下に配置し、これをAL又はAHB、転写レギュレータIlvY、及び第２のオペレータ領域の間の複合体が形成される場合のみ転写的に活性化されるものとする。PilvCプロモータ及びilvBN4オペロン遺伝子を含む発現カセットにより、ilvBN4遺伝子が転写され、AHAS Iが生産される。AHASは、2-オキソブタン酸の存在に依存して、２モルのピルビン酸を１モルの2-アセト乳酸(AL)へと、又は１モルのピルビン酸と１モルの2-オキソブタン酸とを１モルの2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸(AHB)へと変換する。
本発明の利点としては、AHAS Iにより触媒された反応の生成物(AL又はAHB)の一部がコインデューサとして作用し、IlvY/DNA複合体に結合するものであり、ilvBN4オペロン遺伝子の転写を含むものであって、これによりAL又はAHBの合成がもたらされる。AL又はAHBの他の部分は、前記したように、ケトール−酸還元異性化酵素IlvC及び分岐L-アミノ酸生合成経路の他の酵素によって、最終産物である分岐L-アミノ酸(L-バリン、L-ロイシン、又はL-イソロイシン)へと変換され得る。
発現系に対して2-アセト乳酸又は2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸を連続的に供給することにより、自己誘導性の性質の源泉とすることができ、自己誘導性で正にフィードバック調節される発現系を介する繰り返し可能な回路は、分岐鎖L-アミノ酸生合成経路に対して、前駆体、例えば、L-バリン及びL-ロイシンについての3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソブタン酸及びL-イソロイシンについての3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソペンタン酸の連続的な供給に帰着し得る。
遺伝子発現のための提案された手法は、コインデューサであるAL又はAHBによって媒介される正のフィードバック調節を有する自己誘導性遺伝子発現系として言及することができる。
自己誘導性で正にフィードバック調節される発現系は、IlvY転写レギュレータを含む前記した発現系に限定されるものではない。LysR型調節タンパク質を使用する他の発現系も包含することができ、この例を表１に示す。
「アセト乳酸合成酵素」という記載は、細菌、例えば、腸内細菌科の細菌、コリネ型細菌、及びBacillus属に属する細菌等に存在する酵素を意味するものとすることができる。腸内細菌科は、Escherichia属, Pantoea属, Erwinia属, Providencia属,及びSerratia属に属する細菌、例えばE. coli, Pantoea ananatis (P. ananatis)等によって例示することができる。コリネ型細菌は、Corynebacterium属に属する細菌、例えば、Corynebacterium glutamicumによって例示することができる。Bacillus属に属する細菌は、Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens FZB42,及びBacillus amyloliquefaciens DSM7によって例示することができる。アセト乳酸合成酵素は、アセト乳酸合成酵素の活性を有する酵素も意味するものとすることができる。
「アセト乳酸合成酵素の活性」という記載は、例えば、温度、イオン強度、酸度(pH)、コファクター及び基質濃度等の適切な条件下で、i)２分子のピルビン酸から2-アセト乳酸とCO2とを、及び／又はii)ピルビン酸と2-オキソブタン酸とから2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸とCO2とを形成する反応を触媒する活性を意味するものとすることができる。ア
セト乳酸合成酵素活性は、Stormer F.C.とUmbarger H.E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, 17(5):587-592の方法を使用して測定することができる。
セト乳酸合成酵素活性は、Stormer F.C.とUmbarger H.E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, 17(5):587-592の方法を使用して測定することができる。
アセト乳酸合成酵素I, II,又はIII(AHAS I, AHAS II,又はAHAS III)(EC 2.2.1.6)は、アセト乳酸合成酵素として言及することもできる。アセト乳酸合成酵素は、２つの触媒ドメイン及び２つの制御ドメインからなるα2β2型構造のヘテロテトラマータンパク質である(Weinstock O.ら、J. Bacteriol., 1992, 174(17):5560-5566)。大(約60-kDa)サブユニットは触媒性であり、一方、小サブユニット(約11-kDa)は制御性（調節性）であることが一般に認められている。
AHAS Iは、ilvBNオペロン上に認められるilvB及びilvN遺伝子によってコードされている。AHAS IIは、ilvGMEDAオペロン上にに認められるilvG及びilvM遺伝子によってコードされている。AHAS IIは、E. coli K-12細胞においては通常は発現されていない(Guardiola J.ら、Mol. Gen. Genet., 1977, 156:17-25)。AHAS IIIは、ilvIHオペロン上に認められるilvI及びilvH遺伝子によってコードされている。
例えば、E. coli AHAS Iは、アミノ酸残基の置換、例えば、N17K及び／又はA30Pを有することができ、これによりL-バリンによるフィードバック阻害に対して耐性となっている(ロシア連邦特許第2355763号, 米国特許出願第2009197309 A1号)。また、何らかのアミノ酸により33位のアラニンを置き換えることにより、例えば、翻訳終了部位を含む12のアミノ酸で置き換えることにより、45アミノ酸で切断されたタンパク質（truncated protein）IlvN33が結果的に得られる(ロシア連邦特許第2355763号, 米国特許出願第2009197309 A1号)。この変異体タンパク質は、L-バリンによるフィードバック阻害に対しても耐性である。
野生型 AHAS Iにおいて置換N17Kを有する変異体AHAS Iの小サブユニット(位置17のAsnがLysにより置き換えられている、すなわち、対応するコドンAACがAAGにより置き換えられている)は、変異体ilvN遺伝子によってコードされ得て、これはEP1942183に記載されているように、ilvN4又はilvN ValR4遺伝子として言及することができる。配列番号2及び4のアミノ酸配列を有するAHAS Iは、「野生型アセト乳酸合成酵素I」として言及することができる。
E. coli由来のAHAS III制御小サブユニットのバリン結合領域のモデルに基いて、小サブユニットのカルボキシル末端からの切断を行った。切断により、切断されたAHAS III 酵素におけるバリン感受性の欠如が誘導された(Mendel S.ら、J. Mol. Biol., 2003, 325(2):275-284)。
小サブユニットのカルボキシル末端で35, 48, 80又は95アミノ酸残基で切断されたアセト乳酸合成酵素IIIは、「変異体アセト乳酸合成酵素III」として言及することができる。変異体AHAS III小サブユニットをコードするDNAは、「変異体ilvH遺伝子」として言及することができる。変異体ilvH遺伝子を含むilvIHオペロンは、「変異体ilvIHオペロン」として言及することができる。配列番号6及び8のアミノ酸配列を有するAHAS IIIは、「野生型アセト乳酸合成酵素III」として言及することができる。
変異体AHAS Iは、アセト乳酸合成酵素の活性が依然として維持される限り、初発アミノ酸配列中の17, 30及び／又は33以外の１以上の位置における１又は幾つかのアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、又は付加を含むことができる。同様に、変異体AHAS IIIは、アセト乳酸合成酵素の活性が依然として維持される限り、初発アミノ酸配列中の１以上の位置における１又は幾つかのアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、又は付加を含むことができる。更に、アセト乳酸合成酵素の活性が減少しない限り、35, 48, 80又は95のアミノ酸残基に
必ずしも制限されることなく、変異体AHAS IIIのカルボキシル末端を１以上のアミノ酸残基で切断することができる。
必ずしも制限されることなく、変異体AHAS IIIのカルボキシル末端を１以上のアミノ酸残基で切断することができる。
「幾つかの」アミノ酸残基の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類によって異なる。これは、幾つかのアミノ酸は、タンパク質内部におけるその構造及び機能において互いに類似し、このようなアミノ酸の相互変更は、タンパク質の三次元構造又は機能に大きな影響を及ぼさないからである。切断構成体が、変異体AHAS IIIが活性を維持するよう触媒性の（大）サブユニットに結合して活性化させる限り、AHAS IIIは、さまざまな長さのアミノ酸残基配列で切断することができる。したがって、変異体AHAS I, II及びIIIは、アセト乳酸合成酵素の活性が維持される限り、アセト乳酸合成酵素の全アミノ酸配列に対して65％以上, 80％以上, 90％以上, 95％以上, 97％以上, 98％以上,又は99％以上の相同性を有するものとすることができる。この明細書において、「相同性」という用語は、「同一性」を意味するものとすることができる。
変異体AHAS Iは、公知の方法を使用して、野生型ilvN遺伝子に変異を導入することによって取得することができる。例えば、ilvB及び変異体ilvN4遺伝子を含む変異体ilvBN4オペロンは、ilvN遺伝子(配列番号3)のヌクレオチド配列に基いたプライマーを利用するPCR(ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）; White T.J. ら, Trends Genet., 1989, 5:185-189参照)によって取得することができる。他の微生物由来のアセト乳酸合成酵素をコードする遺伝子は、同様の方法で取得することができる。
小サブユニットの切断したカルボキシル末端を有する変異体AHAS IIIは、ilvH遺伝子の所望の位置に導入すべき停止コドンを配置することにより、重複伸長（overlap extension）PCRを使用する部位特異的変異誘発によって取得することができる(Ho S.N. et. al., Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction, Gene, 1989, 77:51-59)。ilvIHオペロン遺伝子の合成に適切なPCRのためのプライマーは、ilvH遺伝子(配列番号7)のヌクレオチド配列を参照することにより選択することができる。
ilvB遺伝子は、アセト乳酸合成酵素Iの大サブユニットをコードする(KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, エントリー No. b3671)。ilvB遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3849119〜3850807, 相補体;遺伝子ID: 948182)は、E. coli K-12の染色体上でilvN遺伝子とivbL遺伝子との間に位置する。ilvB遺伝子のヌクレオチド配列及びilvB遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素Iの大サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1及び配列番号2に示されている。
ilvN遺伝子は、アセト乳酸合成酵素Iの小サブユニットをコードする(KEGGエントリー No.b3670)。ilvN遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3848825〜3849115, 相補体;遺伝子ID: 948183)は、E. coli K-12の染色体上でuhpA遺伝子とilvB遺伝子との間に位置する。ilvN遺伝子のヌクレオチド配列及びilvN遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素Iの小サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3及び配列番号4に示されている。
ilvI遺伝子は、アセト乳酸合成酵素IIIの大サブユニットをコードする(KEGGエントリー
No.b0077)。ilvI遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 85630〜87354; 遺伝子ID: 948793)は、E. coli K-12の染色体上でleoO遺伝子とilvH遺伝子との間に位置している。ilvI遺伝子のヌクレオチド配列及びilvI遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIIの大サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5及び配列番号6に示されている。
No.b0077)。ilvI遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 85630〜87354; 遺伝子ID: 948793)は、E. coli K-12の染色体上でleoO遺伝子とilvH遺伝子との間に位置している。ilvI遺伝子のヌクレオチド配列及びilvI遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIIの大サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5及び配列番号6に示されている。
ilvH遺伝子は、アセト乳酸合成酵素IIIの小サブユニットをコードする(KEGGエントリー
No.b0078)。ilvH遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 87357〜87848;遺伝子ID: 947267)は、E. coli K-12の染色体上でilvI遺伝子とfruR遺伝子との間に位置している。ilvH遺伝子のヌクレオチド配列及びilvH遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIIの小サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号7及び配列番号8に示されている。
No.b0078)。ilvH遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 87357〜87848;遺伝子ID: 947267)は、E. coli K-12の染色体上でilvI遺伝子とfruR遺伝子との間に位置している。ilvH遺伝子のヌクレオチド配列及びilvH遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIIの小サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号7及び配列番号8に示されている。
ilvY遺伝子は、DNA-結合転写デュアルレギュレータ（DNA-binding transcriptional dual regulator）であるIlvY(LysRファミリー転写レギュレータ, ilvCのための正のレギュレータ)をコードする(KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,エントリー No.B3773)。ilvY遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3954950〜3955843, 相補体;遺伝子ID: 948284)は、E. coli K-12の染色体上でilvA遺伝子とilvC遺伝子との間に位置しており、両者は対向するストランド（鎖）上にある。ilvY遺伝子のヌクレオチド配列及びilvY遺伝子によってコードされるIlvYタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9及び配列番号10に示されている。
ilvG遺伝子は、偽遺伝子（シュードジーン）である(KEGGエントリー No.b4488)。ilvG遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3948583〜3950227;遺伝子ID:
2847699)は、E. coli K-12の染色体上でilvX遺伝子とilvM遺伝子との間に位置している。ilvG遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号31に示されている。ilvG遺伝子は、アセト乳酸合成酵素IIの大サブユニットをコードし得るが、ただしこれは遺伝子の開始点から位置982〜984におけるAAT-コドンに対するTGA-コドンの置換、又はLawther R.P.ら、J. Bacteriol., 1982, 159:294-298に記載されているような変異を含むものである。位置982〜984においてTGA-コドンがAAT-コドンによって置き換えられているilvG遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIの大サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号32に示されている。
2847699)は、E. coli K-12の染色体上でilvX遺伝子とilvM遺伝子との間に位置している。ilvG遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号31に示されている。ilvG遺伝子は、アセト乳酸合成酵素IIの大サブユニットをコードし得るが、ただしこれは遺伝子の開始点から位置982〜984におけるAAT-コドンに対するTGA-コドンの置換、又はLawther R.P.ら、J. Bacteriol., 1982, 159:294-298に記載されているような変異を含むものである。位置982〜984においてTGA-コドンがAAT-コドンによって置き換えられているilvG遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIの大サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号32に示されている。
ilvM遺伝子は、アセト乳酸合成酵素IIの小サブユニットをコードする(KEGGエントリー
No.b3769)。ilvM遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3950224〜3950487;遺伝子ID: 948279)は、E. coli K-12の染色体上でilvG遺伝子とilvE遺伝子との間に位置している。ilvM遺伝子のヌクレオチド配列及びilvM遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIの小サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号33及び配列番号34に示されている。
No.b3769)。ilvM遺伝子(GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3950224〜3950487;遺伝子ID: 948279)は、E. coli K-12の染色体上でilvG遺伝子とilvE遺伝子との間に位置している。ilvM遺伝子のヌクレオチド配列及びilvM遺伝子によってコードされるアセト乳酸合成酵素IIの小サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号33及び配列番号34に示されている。
腸内細菌科の属又は株の間でDNA配列に幾分かの相異があり得ることから、アセト乳酸合成酵素をコードする遺伝子ilvB, ilvN, ilvI, ilvH, ilvG,及びilvM並びに転写レギュレータをコードする遺伝子ilvYは、配列番号1, 3, 5, 7, 31, 33及び9に示す遺伝子に限定されるものではなく、配列番号1, 3, 5, 7, 31, 33及び9の異型体ヌクレオチド配列またはこれに相同なものであって、IlvB, IlvN, IlvI, IlvH, IlvG, IlvM及びIlvYタンパク質の異型体をコードする遺伝子を含み得る。
「異型体タンパク質」という記載は、配列番号2, 4, 6, 8, 32, 34及び10と比較して、アミノ酸残基の置換,欠失, 挿入,及び／又は付加であるかに拘らず、配列中に１又は幾つかの変更を有するが、IlvB, IlvN, IlvI, IlvH, IlvG, IlvM及びIlvYタンパク質のものと類似する活性をそれぞれ依然として維持するタンパク質を意味するものとすることができる。異型体タンパク質における多数の変更は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置又は種類に依存する。これは、厳密に限定されるものではないが、配列番号2,
4, 6, 8, 32, 34及び10において、1〜30, 他の例では1〜15, 他の例では1〜10, 更に他の例では1〜5とすることができる。
4, 6, 8, 32, 34及び10において、1〜30, 他の例では1〜15, 他の例では1〜10, 更に他の例では1〜5とすることができる。
異型体タンパク質の活性及び特徴が維持され、IlvB, IlvN, IlvI, IlvH, IlvG, IlvM及びIlvYタンパク質のものと類似するものとなるよう、１又は幾つかのアミノ酸残基の置換,欠失, 挿入,及び／又は付加は、保存的な（conservative）変異とすることができる。代表的な保存的な変異は、保存的な置換である。保存的な置換の例には、Alaに対するSer又はThrの置換、Argに対するGln, His又はLysの置換、Asnに対するGlu, Gln, Lys, His又はAspの置換、Aspに対するAsn, Glu又はGlnの置換、Cysに対するSer又はAlaの置換、Glnに対するAsn, Glu, Lys, His, Asp又はArgの置換、Gluに対するAsn, Gln, Lys又はAspの置換、Glyに対するProの置換、Hisに対するAsn, Lys, Gln, Arg又はTyrの置換、Ileに対するLeu, Met, Val又はPheの置換、Leuに対するIle, Met, Val又はPheの置換、Lysに対するAsn, Glu, Gln, His又はArgの置換、Metに対するIle, Leu, Val又はPheの置換、Pheに対するTrp, Tyr, Met, Ile又はLeuの置換、Serに対するThr又はAlaの置換、Thrに対するSer又はAlaの置換、Trpに対するPhe又はTyrの置換、Tyrに対するHis, Phe又はTrpの置換、及びValに対するMet, Ile又はLeuの置換が含まれる。
タンパク質又はDNAの相同性の程度を評価するために、幾つかの計算方法を使用することができ、これには、例えば、BLASTサーチ, FASTAサーチ及びClustalW法がある。BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)サーチは、プログラムblastp, blastn, blastx, megablast, tblastn,及びtblastxによって用いられるヒューリスティックサーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel K.とAltschul S.F.の統計学的な方法を使用する調査結果に有意性を帰するものである(「Methods for
assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)。コンピュータプログラムBLASTは、３つのパラメータ、すなわちスコア、同一性、及び類似性を計算する。FASTA検索方法は、Pearson W.R.によって記述されている(「FRapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA」, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98)。ClustalW法は、Thompson J.D.らによって記述されている(「 CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice」, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680)。
assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)。コンピュータプログラムBLASTは、３つのパラメータ、すなわちスコア、同一性、及び類似性を計算する。FASTA検索方法は、Pearson W.R.によって記述されている(「FRapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA」, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98)。ClustalW法は、Thompson J.D.らによって記述されている(「 CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice」, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680)。
更に、ilvB, ilvN, ilvI, ilvH, ilvG, ilvM及びilvY遺伝子は、異型体ヌクレオチド配列とすることができる。「異型体ヌクレオチド配列」という記載は、「異型体タンパク質」をコードするヌクレオチド配列を意味するものとすることができる。また、「異型体ヌクレオチド配列」という記載は、配列番号1, 3, 5, 7, 31, 33及び9に示す配列に相補的なヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列から調製することのできるプローブ（ただし、これは不活性化に先立って機能的なアセト乳酸合成酵素又は調節タンパク質をコードするものとする）も意味するものとすることもできる。「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッド、例えば、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記したものより低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものを含む。例えば、ストリンジェントな条件は、60℃、又は他の例では65℃で、1×SSC, 0.1％ SDS、又は他の例では0.1× SSC, 0.1％ SDSの塩濃度で、１回以上、又は他の例では２回又は３回の洗浄を行うことにより例示することができる。洗浄の期間はブロッティングに使用する膜の種類に依存し、原則として、製造業者によって推奨されているものとすべきである。例えば、ストリンジェントな条件下で、Amersham HybondTM-N+の正に帯電したナイロン膜(GE Healthcare)についての推奨される洗浄の期間は、15分である。洗浄工程は、２〜３回行うことができる。プローブとしては、配列番号1,
3, 5, 7, 31, 33及び9に示す配列に対して相補的な配列の一部も使用することができる。このようなプローブは、配列番号1, 3, 5, 7, 31, 33及び9に示す配列に基いて調製したプライマーとしてのオリゴヌクレオチド及びテンプレートとしてヌクレオチド配列を含むDNA断片を使用するPCRによって作製することができる。プローブの長さは、>50 bpであることが推奨され、これは適切にはハイブリダイゼーション条件に応じて選択されるものとし、通常は100 bp〜1 kbpとする。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、50℃又は60℃、又は他の例では65℃における2× SSC, 0.1％ SDSによって例示することができる。
3, 5, 7, 31, 33及び9に示す配列に対して相補的な配列の一部も使用することができる。このようなプローブは、配列番号1, 3, 5, 7, 31, 33及び9に示す配列に基いて調製したプライマーとしてのオリゴヌクレオチド及びテンプレートとしてヌクレオチド配列を含むDNA断片を使用するPCRによって作製することができる。プローブの長さは、>50 bpであることが推奨され、これは適切にはハイブリダイゼーション条件に応じて選択されるものとし、通常は100 bp〜1 kbpとする。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、50℃又は60℃、又は他の例では65℃における2× SSC, 0.1％ SDSによって例示することができる。
E. coliのIlvB, IlvN, IlvI, IlvH, IlvG, IlvM及びIlvYタンパク質をコードする遺伝子は既に解明されており（前記参照）、IlvB, IlvN, IlvI, IlvH, IlvG, IlvM及びIlvYタンパク質の異型体タンパク質をコードする異型体ヌクレオチド配列は、ilvB, ilvN, ilvI, ilvH, ilvG, ilvM及びilvY遺伝子のヌクレオチド配列に基いて調製されたプライマーを利用するPCR(ポリメラーゼ連鎖反応; White T.J.ら、Trends Genet., 1989, 5:185-189参照)によって取得することができる。IlvB, IlvN, IlvI, IlvH, IlvG, IlvM及びIlvYタンパク質をコードする遺伝子、又は他の微生物の異型体タンパク質は、同様の方法で取得することができる。
「自己誘導性で正に調節されるプロモータ」という記載は、当業者に公知のプロモータとすることができる。従来、自己誘導性で正に調節されるプロモータは、a)転写因子又はアクティベータのレベルが増加する、すなわち、正の制御が生起するにつれて増加する活性を有し、b)転写因子又はアクティベータの非存在下では活性を有さないか、又は活性が低く（ただし、これは転写因子又はアクティベータに結合した場合にのみ活性化され、すなわち、誘導性が生起し）、更にc) このプロモータによって制御されるコード遺伝子の発現産物（生成物）によって誘導することのできる（何らかの翻訳後に修飾（改変）された（post-translationally modified）発現産物、並びにこの種の発現産物のアナログ及び誘導体、更にこれとの複合体を含み、加えて生成物、例えば、コード遺伝子の発現産物の活性に起因する個々の物質又はその複合体を含む）、すなわち、自己誘導性が生起するプロモータを意味するものとすることができる。
自己誘導性で正に制御されたプロモータは、ilvC構造遺伝子の上流に位置したPilvCプロモータ(配列番号30)(Wek R.C.とHatfield G.W., J. Biol. Chem., 1986, 261(5): 2441-2450; Opel M.L.とHatfield G.W., Mol. Microbiol, 2001, 39(1): 191-198)、cysPUWAM転写ユニットの上流に位置したPcysPプロモータ、cysK構造遺伝子の上流に位置したPcysKプロモータ、及びmetE構造遺伝子の上流に位置したPmetRプロモータを例示することができる。PilvCプロモータは、IlvY/AL又はIlvY/AHBインデューサ複合体によって調節されるものとすることができる。PcysP及びPcysKプロモータは、O-アセチル-L-セリン/CysBオートインデューサ複合体によって調節されるものとすることができる。PmetRプロモータは、L-ホモシステイン/MetRオートインデューサ複合体によって調節されるものとすることができる。自己誘導性で正に調節されるプロモータは限定されるものではなく、プロモータの機能性が維持される限り、１又は幾つかのヌクレオチド残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含み得る。
「自己誘導性で負に調節されるプロモータ」という記載は、当業者に公知のプロモータとすることができる。従来、自己誘導性で負に調節されるプロモータは、a)転写因子又はアクティベータのレベルが増加する、すなわち、負の制御が生起するにつれて減少する活性を有し、b)転写因子又はアクティベータの存在下では活性を有さないか、又は活性が低く（ただし、これは転写因子又はアクティベータの閾値濃度が達成された場合にのみ活性化され、すなわち、誘導性が生起し）、更にc) このプロモータによって制御されるコード遺伝子の発現産物（生成物）によって脱調節（deregulate）することのできる（何らか
の翻訳後に修飾（改変）された発現産物、並びにこの種の発現産物のアナログ及び誘導体、更にこれとの複合体を含み、加えて、コード遺伝子の発現産物の活性に起因する生成物を含む）、すなわち、自己誘導性が生起するプロモータを意味するものとすることができる。自己誘導性で負に調節されるプロモータは、PilvY及びPcysBプロモータによって例示することができる。
の翻訳後に修飾（改変）された発現産物、並びにこの種の発現産物のアナログ及び誘導体、更にこれとの複合体を含み、加えて、コード遺伝子の発現産物の活性に起因する生成物を含む）、すなわち、自己誘導性が生起するプロモータを意味するものとすることができる。自己誘導性で負に調節されるプロモータは、PilvY及びPcysBプロモータによって例示することができる。
「自己誘導性プロモータ（auto-inducible promoter）」という記載は、正又は負のいずれに調節されているかに拘らず、「自己調節されるプロモータ（auto-regulated promoter）」、「自家調節されるプロモータ（self-regulated promoter）」、「自家誘導性プロモータ（self-inducible promoter）」等を意味するものとすることもできる。
「自己誘導性で正のフィードバック調節がコインデューサによって媒介される」という記載は、コインデューサの合成に対応する酵素をコードする遺伝子の発現を調節することによって、発現系がコインデューサの合成の要因となっていることを意味するものとすることができる。前記コインデューサは、コインデューサの合成に対応する酵素をコードする遺伝子の翻訳を活性化するレギュレータタンパク質/DNA複合体に結合することができる。よって、発現系の機能性は、コインデューサによって媒介されることができることは明らかである。
「誘導性の発現系」という記載は、転写レベルを、少なくとも約1.5倍、又は少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも15倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも100倍、又はそれ以上変調することのできる発現系を意味するものとすることができる。「誘導性の発現系」は、例えば、コインデューサ、例えば、2-アセト乳酸、2-アセトヒドロキシ-2-ブタン酸（ブタノエート）、アラビノース、ラクトース、IPTG等、インデューサ、例えば、LysR型タンパク質ファミリーに属する調節タンパク質、刺激、例えば、熱、冷却等、又は生育条件、例えば細胞密度、酸度 (pH)等によって上方に調節する（up-regulated）（誘導される）ことのできるあらゆる発現系を包含するものとすることができる。また、「誘導性の発現系」は、下方に調節する（down-regulated）（抑制される）ことのできる発現系、例えば、化学物質の添加、タンパク質、環境の刺激等により下方に調節することのできるあらゆる発現系を含むものとすることもできる。
「目的遺伝子」という記載は、その発現レベルが発現系を使用して脱調節される遺伝子を意味するものとすることができる。例示的な目的遺伝子は、コインデューサ、又は基質、又はコインデューサの前駆体の生合成に関与するタンパク質、又はコインデューサ合成酵素をコードする遺伝子とすることができる。更に詳しくは、例示的な目的遺伝子は、AHAS I, II及び／又はIII、又はその変異体異型体の大及び／又は小サブユニットとすることができる。目的遺伝子は、L-バリンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変異体AHAS IをコードするilvBN4オペロン遺伝子によって例示することができる。目的遺伝子の「発現レベルの脱調節」は、前記遺伝子の転写減衰、不活性化、又は発現の増強を意味するものとすることができる（発現の増強は一例である）。
「オペレータ領域」という記載は、プロモータと構造遺伝子との間に位置し、プロモータの下で遺伝子の転写に影響を与えるDNA断片を意味するものとすることができる。また、「プロモータ」及び「プロモータ領域」という語は、プロモータ及びオペレータを意味するものとすることもできる。
オペレータ領域は、IlvY転写レギュレータが結合することのできる、PilvC又はPilvYプロモータの下流に位置するDNA断片によって例示することができる。
「遺伝子発現系のレギュレータ」という記載は、「自己誘導性で正にフィードバック調節される発現系のレギュレータ」又は「レギュレータ」としても言及することができ、遺伝子の転写を直接的又は間接的に調節することのできるLysR型調節タンパク質ファミリーに属するタンパク質を意味するものとすることができる。例示的な調節タンパク質を表１に示す。
「遺伝子の不活性化」という記載は、改変された遺伝子が、完全に不活性であるか、又は非機能的であるタンパク質をコードすることを意味するものとすることができる。改変されたDNA領域が、一部又は全部の遺伝子の欠失、遺伝子のリーディングフレームのシフト、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、又は遺伝子の隣接する領域の改変（修飾）のために、遺伝子発現を制御する配列、例えばプロモータ、エンハンサ、アテニュエータ、リボソーム結合部位等を含む遺伝子を自然に発現することができない、とすることもできる。遺伝子の不活性化は、従来の方法、例えば、紫外線照射又はニトロソグアニジン(N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン)を使用する変異誘発処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子破壊、及び／又は挿入−欠失変異誘発(Yu D.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):5978-83; Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12):6640-45)（「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」又は「λRed媒介インテグレーション（λRed-mediated integration）」とも呼ばれている）によって行うこともできる。
「遺伝子発現の増強」又は「遺伝子発現が増強される」という記載は、遺伝子の発現レベルが、遺伝的改変（修飾）のために、改変（修飾）されていない株、例えば、野生型又は親株、例えば E. coli MG1655, E. coli K12 (VKPM B-7)又はE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株のレベルと比較して高いことを意味するものとすることができる。このような改変の例には、発現された遺伝子の細胞当りのコピー数を増加させること、及び／又は遺伝子の隣接する領域の改変（修飾）によって遺伝子の発現レベルを増加させること（遺伝子発現を制御する配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、アテニュエータ、リボソーム結合部位等、及び他の例を含む）が含まれる。また、遺伝子の発現を増強するのに使用することのできる方法には、腸内細菌科の細菌内で遺伝子のコピー数を増加させることのできるベクターに遺伝子を導入することも含まれる。ベクターの例には、限定されるものではないが、広宿主範囲ベクター、例えば、pCM110, pRK310, pVK101, pBBR122, pBHR1等が含まれる。また、遺伝子発現の増強は、例えば、相同組換え、Mu組込み等によって細菌の染色体DNA中に多コピーの遺伝子を導入することによっても達成することができる。
また、遺伝子発現の増強は、強力なプロモータの制御の下にDNAを配置することによっても達成することができる。例えば、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダファージのPR又はPLプロモータは全て強力なプロモータとして知られている。腸内細菌科に属する細菌内で高いレベルの遺伝子発現を与える強力なプロモータを使用することができる。代替的に、プロモータの効果は、例えば、細菌染色体上の遺伝子のプロモータ領域に変異を導入してより強いプロモータ機能を取得し、これにより結果的にプロモータの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加させることによって増強することができる。更に、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンとの間のスペーサにおける幾つかのヌクレオチド、特に開始コドンの直ぐ上流の配列の置換は、mRNAの翻訳能力に甚大な影響を与えることが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性状に依存して、20倍範囲の発現レベルが認められている(Gold L. ら、Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A.ら、EMBO J., 1984, 3:62,3-629)。強力なプロモータの使用は、遺伝子コピーの増倍と組合せることができる。
コピー数、遺伝子の存在又は非存在、及び／又はオペロン遺伝子は、例えば、染色体DN
Aを制限酵素処理した後、遺伝子配列に基いたプローブを使用するサザンブロッティング、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)等を行うことによって測定することができる。遺伝子及び／又はオペロン遺伝子の発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR等を含む種々の公知の方法によって測定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することによって決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEの後にイムノブロッティングアッセイ(ウエスタンブロッティング解析)等を行うことを含む公知の方法によって測定することができる。
Aを制限酵素処理した後、遺伝子配列に基いたプローブを使用するサザンブロッティング、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)等を行うことによって測定することができる。遺伝子及び／又はオペロン遺伝子の発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR等を含む種々の公知の方法によって測定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することによって決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEの後にイムノブロッティングアッセイ(ウエスタンブロッティング解析)等を行うことを含む公知の方法によって測定することができる。
プラスミドDNAの調製、DNAの消化、連結、及び形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等のための方法は、当業者に周知の通常の方法とすることができる。これらの方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F.及びManiatis T., 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。分子クローン化及び異種遺伝子発現のための方法は、BeRNArd R. Glick, Jack J. PasteRNAk及びCheryl L. Patten, 「Molecular Biotechnology: principles
and applications of recombinant DNA」, 4th ed., Washington, D.C: ASM Press (2009); Evans Jr., T.C.とXu M.-Q., 「Heterologous gene expression in E. coli」, 1st ed., Humana Press (2011)に記載されている。
and applications of recombinant DNA」, 4th ed., Washington, D.C: ASM Press (2009); Evans Jr., T.C.とXu M.-Q., 「Heterologous gene expression in E. coli」, 1st ed., Humana Press (2011)に記載されている。
遺伝子によってコードされた酵素の「活性が増強されるという記載」は、細胞当りの酵素の活性が、改変されていない株、例えば、野生型又は親株より高いことを意味するものとすることができる。例えば、増強された活性は、細胞当りの遺伝子によってコードされた酵素の分子の数、又は酵素分子当りの比活性が増加したこと等を意味するものとすることができる。野生型アセト乳酸合成酵素を含む例示的な野生型E. coli K-12株を、比較のための使用することができる。
「代謝経路」又は「生化学的経路」としても言及される「生合成経路」という記載は、１つの生体分子の化学種を所望の最終産物又は有用な代謝産物へと向けてより成熟した生体分子の化学種へと変換する同化又は異化の（生）化学反応の集合体を意味するものとすることができる。「生合成経路」という記載は、通常は当業者に対して明らかである。所望の最終産物は、L-アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、コファクター、低級又は高級アルコール、有機酸、その誘導体、タンパク質等とすることができる。
「基質」という記載は、酵素の作用によって、他の物資、化合物、又は生化学的化学種へと変換することができるか、又は変換されると意図されるいずれかの化学物質、化合物、又は生化学的化学種を意味するものとすることができる。「基質」という記載は、単独の化合物のみならず、少なくとも１つの基質、又はその誘導体を含む化合物の組合せ、例えば、溶液、混合物、及び他の材料を含むことができる。また、「基質」という記載は、代謝的に操作された微生物に随伴する経路において使用される、出発材料として使用するのに適切な炭素源、例えば、いずれかのバイオマス誘導糖類、中間体、又は最終産物の代謝産物を与える化合物を意味するものとすることもできる。化学物質、化合物又は生化学的化学種は、酵素によって触媒される単一の反応の結果として、所望の最終産物へと変換することができる。基質の例には、ピルビン酸及び2-オキソブタン酸が含まれる。
「前駆体」という記載は、生合成経路における所望の最終産物に向けて、他のより成熟した化学物質、化合物又は生化学的化学種を形成することのできるいずれかの化学物質、化合物又は生化学的化学種を意味することができるものとする。L-バリンの生合成においては、例示的な前駆体は、ピルビン酸、2-アセト乳酸、3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソブタン酸、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸（メチルブタノエート）、及び2-オキソ
イソ吉草酸（オキソイソバレレート）とすることができる。L-ロイシンの生合成においては、例示的な前駆体は、ピルビン酸、2-アセト乳酸、3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソブタン酸、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸、2-オキソイソ吉草酸、2-イソプロピルリンゴ酸（イソプロピルマレート）等とすることができる。L-イソロイシンの生合成においては、例示的な前駆体は、L-スレオニン、ピルビン酸、2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソペンタン酸（オキソペンタノエート）、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルペンタン酸（メチルペンタノエート）等とすることができる。
イソ吉草酸（オキソイソバレレート）とすることができる。L-ロイシンの生合成においては、例示的な前駆体は、ピルビン酸、2-アセト乳酸、3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソブタン酸、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸、2-オキソイソ吉草酸、2-イソプロピルリンゴ酸（イソプロピルマレート）等とすることができる。L-イソロイシンの生合成においては、例示的な前駆体は、L-スレオニン、ピルビン酸、2-アセト-2-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシ-3-メチル-2-オキソペンタン酸（オキソペンタノエート）、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルペンタン酸（メチルペンタノエート）等とすることができる。
「基質」及び「前駆体」という記載は、交換可能（互換性）である。
「生体分子」という記載は、化学物質、化合物、又は生化学的化学種、又は微生物によって生産される生成物（産物）を意味するものとすることができる。例示的な生体分子は、タンパク質、多糖類、脂質、核酸、及び小さい分子、例えば、一次代謝産物、二次代謝産物、及び天然生成物（産物）である。
「有用な代謝産物」という記載は、工業的、飼料、食料、薬学的又は他の目的のために微生物によって生産される化学物質、化合物、又は生化学的化学種を意味するものとすることができる。有用な代謝産物は、分岐鎖L-アミノ酸、例えば、L-バリン、L-イソロイシン、及びL-ロイシン；高級アルコール、例えば、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール；有機酸、例えば、D-パントテン酸により例示することができる。
発現系は、例えば、発現系を含むベクターを使用することにより、遺伝子発現の増強のために、前記したような方法によって細菌中に導入することができる。また、発現系は、自己誘導性プロモータを用いて、目的遺伝子の生来のプロモータを置き換えることによって細菌中に導入することもできる。細菌は、プロモータを正に調節するLysR型調節タンパク質をコードする遺伝子を含むものとすることができる。LysR型調節タンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することができるが、ただし増強は必須ではない。プロモータがilvCプロモータであり、LysR型調節タンパク質がIlvYタンパク質である場合、ilvY遺伝子の内在性の発現で通常は十分とすることができる。
３．有用な代謝産物、例えば、L-アミノ酸、高級アルコール、及び有機酸を製造する方法
有用な代謝産物、更に詳しくは、L-アミノ酸、特に分岐鎖L-アミノ酸、例えば、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシン；高級アルコール、例えば、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール；有機酸、例えば、D-パントテン酸を製造するための方法は、培養培地中で細菌を培養し、有用な代謝産物を生産させ、分泌させ、培養培地中に蓄積させ、培養培地からL-アミノ酸、高級アルコール及び／又は有機酸を捕集する工程を含むものとすることができる。
有用な代謝産物、更に詳しくは、L-アミノ酸、特に分岐鎖L-アミノ酸、例えば、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシン；高級アルコール、例えば、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール；有機酸、例えば、D-パントテン酸を製造するための方法は、培養培地中で細菌を培養し、有用な代謝産物を生産させ、分泌させ、培養培地中に蓄積させ、培養培地からL-アミノ酸、高級アルコール及び／又は有機酸を捕集する工程を含むものとすることができる。
培養、捕集、及び培地等からの有用な代謝産物の精製は、従来の発酵法に類似する方法で行うことができ、この場合、微生物を使用してアミノ酸、高級アルコール、又は有機酸を製造する。有用な代謝産物の生産のための培養培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機成分を含有する典型的な培地とすることができる。炭素源としては、糖類、例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物；アルコール、例えば、グリセリン、マンニトール、及びソルビトール；有機酸、例えば、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等を使用することができる。窒素源としては、無機アンモニウム塩、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウム；有機窒素、例えば、大豆加水分解物；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。ビタミン、例えば、ビタミンB1、要求物質、例えば、有機栄養
物、例えば、核酸、例えば、アデニン及びRNA、又は酵母エキス等は、たとえ微量の量であっても存在するものとすることができる。これら以外に、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を、必要に応じて添加することができる。
物、例えば、核酸、例えば、アデニン及びRNA、又は酵母エキス等は、たとえ微量の量であっても存在するものとすることができる。これら以外に、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を、必要に応じて添加することができる。
培養は、好気的条件下で16〜72時間行うことができ、培養の際の培養温度は、30〜45℃以内、又は30〜37℃以内に制御し、pHは5と8との間、又は6.5と7.2との間に調整する。pHは、無機又は有機のアルカリ性物質、並びにアンモニアガスを使用することにより調整することができる。通常、1〜5日の培養により、液体培地中での標的L-アミノ酸の蓄積に至る。
培養の後、固体、例えば、細胞及び細胞残渣は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、従来の技術、例えば、濃縮、イオン交換クロマトグラフィ、及び結晶化のいずれかの組合せによって発酵液から標的L-アミノ酸又は有機酸を回収することができる。高級アルコールは、例えば、蒸留手法の後に蒸留又はクロマトグラフィ技術を使用する精製を行うことにより、粗製培養培地から回収することができる。
以下の限定的ではない実施例を参照し、本発明を以下により正確に説明する。
実施例１：アセトヒドロキシ酸により調節される発現ユニットの構築及び種々の遺伝子的背景の下でlacZレポータ遺伝子を使用するその発現の解析
ilvYC遺伝子の転写は、既に明らかにされている(Rhee K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96(25):14294-14299; Opel M.L.とHatfield G.W. Mol. Microbiol., 2001, 39(1):191-198).代謝的に調節される発現系について、ilvC遺伝子のプロモータを使用する可能性を検討した。この目的のために、第一に、λRed媒介インテグレーション（λRed-mediated integration）を使用し、E. coli MG1655 (ATCC 47076)株の染色体上でilvY遺伝子の下流にcat遺伝子を導入した。オリゴヌクレオチドプライマー、ilvY-attL領域についてのP1(配列番号11)及びattR-ilvY領域についてのP2(配列番号12)、並びにテンプレートとしてのプラスミドpMW118-λattL-cat-λattR (Katashkina Zh.I.ら、Mol. Biol. (Mosk.), 2005, 39(5):82,3-831)を使用し、λattL-cat-λattRカセットを担持するDNA断片をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅した。製造業者の指示に従って「Bio-Rad」エレクトロポーレータ（electroporator） (米国) (No.165-2098, バージョン2-89)を使用し、得られたDNA断片を、エレクトロトランスフォーメーション（electrotransformation）によってE. coli MG1655/pKD46株に導入した。この結果、ilvY遺伝子の上流の染色体上にクロラムフェニコール耐性マーカー(λattL-cat-λattR, CmR)を保有するクロラムフェニコール耐性の形質転換体E. coli MG1655cat-ilvYを得た。温度感受性のレプリコンを有する組換えプラスミドpKD46 (Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, 97:6640-6645)を、λRed媒介組換え系に対応するファージλ誘導遺伝子の供与体として使用した。組換えプラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株は、E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから入手することができ、受託番号はCGSC7669である。プラスミドpKD46のE. coli MG1655株への組込みの後に、E. coli MG1655/pKD46株が得られた。
ilvYC遺伝子の転写は、既に明らかにされている(Rhee K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96(25):14294-14299; Opel M.L.とHatfield G.W. Mol. Microbiol., 2001, 39(1):191-198).代謝的に調節される発現系について、ilvC遺伝子のプロモータを使用する可能性を検討した。この目的のために、第一に、λRed媒介インテグレーション（λRed-mediated integration）を使用し、E. coli MG1655 (ATCC 47076)株の染色体上でilvY遺伝子の下流にcat遺伝子を導入した。オリゴヌクレオチドプライマー、ilvY-attL領域についてのP1(配列番号11)及びattR-ilvY領域についてのP2(配列番号12)、並びにテンプレートとしてのプラスミドpMW118-λattL-cat-λattR (Katashkina Zh.I.ら、Mol. Biol. (Mosk.), 2005, 39(5):82,3-831)を使用し、λattL-cat-λattRカセットを担持するDNA断片をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅した。製造業者の指示に従って「Bio-Rad」エレクトロポーレータ（electroporator） (米国) (No.165-2098, バージョン2-89)を使用し、得られたDNA断片を、エレクトロトランスフォーメーション（electrotransformation）によってE. coli MG1655/pKD46株に導入した。この結果、ilvY遺伝子の上流の染色体上にクロラムフェニコール耐性マーカー(λattL-cat-λattR, CmR)を保有するクロラムフェニコール耐性の形質転換体E. coli MG1655cat-ilvYを得た。温度感受性のレプリコンを有する組換えプラスミドpKD46 (Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, 97:6640-6645)を、λRed媒介組換え系に対応するファージλ誘導遺伝子の供与体として使用した。組換えプラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株は、E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから入手することができ、受託番号はCGSC7669である。プラスミドpKD46のE. coli MG1655株への組込みの後に、E. coli MG1655/pKD46株が得られた。
第二に、attL-lacZ領域についてのオリゴヌクレオチドプライマーP3(配列番号13)及びilvCp-lacZ領域についてのP4(配列番号14)、並びにテンプレートとしてのE. coli MG1655cat-ilvY株の染色体を使用し、λattL-cat-λattR、ilvY遺伝子、及び遺伝子間領域ilvY-ilvCを含みPilvCプロモータを有する断片cat-ilvY-PilvCをPCR-増幅した。得られたPCR断片は、λRed媒介インテグレーションによって、lacZ遺伝子の上流のE. coli MG1655/pKD46の染色体領域に挿入した。この結果、株E. coli MG1655cat-ilvY-PilvC-lacZを得た。溶
原培地 (Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press)、寒天1.5％、及びクロラムフェニコール40 mg/lを含有するプレート上で、CmR-耐性コロニーを選択した。挿入はPCRによって検証した。この目的のために、プライマーP13(配列番号23)及びP14(配列番号24)を使用するPCRにより、生来のlacZ遺伝子に代わるcat-ilvY-PilvC-lacZ断片の存在について、24時間以内に生育するコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRに使用した。温度プロフィールは次の通りとした：94℃で5分間最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、53℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で3分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験した幾つかのCmRコロニーが所望の3053
bpのDNA断片を含む筈であり、288 bpの生来のlacZ遺伝子に代わるcat-ilvY-PilvC-lacZ DNA断片の存在が確認される。37℃で培養することにより、得られた株の１つについて温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株をE. coli MG1655 cat-ilvY-PilvC-lacZと命名した。
原培地 (Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press)、寒天1.5％、及びクロラムフェニコール40 mg/lを含有するプレート上で、CmR-耐性コロニーを選択した。挿入はPCRによって検証した。この目的のために、プライマーP13(配列番号23)及びP14(配列番号24)を使用するPCRにより、生来のlacZ遺伝子に代わるcat-ilvY-PilvC-lacZ断片の存在について、24時間以内に生育するコロニーを試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRに使用した。温度プロフィールは次の通りとした：94℃で5分間最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、53℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で3分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験した幾つかのCmRコロニーが所望の3053
bpのDNA断片を含む筈であり、288 bpの生来のlacZ遺伝子に代わるcat-ilvY-PilvC-lacZ DNA断片の存在が確認される。37℃で培養することにより、得られた株の１つについて温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株をE. coli MG1655 cat-ilvY-PilvC-lacZと命名した。
AHAS I-コード遺伝子(ilvBN及びilvBN4)の発現レベルについてのデータを提供するために、PilvCプロモータの制御下におけるレポータlacZ遺伝子の発現レベルについて、種々の遺伝子的背景の下で見積もりを行った(表２)。また、ilvAYC遺伝子の欠失を付加的に含む株も分析した。ΔilvAYC-KmRの改変は、P1-形質導入によって導入した(Miller J.H. (1972) Experiments in molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)。
P1-形質導入によって全ての改変を組み合わせ、EP1942183に記載されているように、「切出し可能な」マーカーについて、得られた株をキュアリングした。
ilvAYC欠失は、λRed媒介インテグレーションを使用する２つの工程で構成した。第一に、オリゴヌクレオチドプライマーP5(配列番号15)及びP6(配列番号16)、並びにカナマイシン耐性マーカー(λattL-kan-λattR, KmR)を保有するテンプレートとしてのプラスミドpMW118-λattL-kan-λattR(Katashkina Zh.I. (2002)、Development of the methods for
targeted modification of E. coli genetic loci for the construction of amino-acids-producing strains、博士論文（PhD Thesis.） Moscow)を使用し、PCR断片を取得した。第二に、前記したようなエレクトロトランスフォーメーションによって、得られた断片をE. coli MG1655/pKD46株に導入した。ilvAYC遺伝子が欠失したカナマイシン耐性クローンは、前記したようにカナマイシン含有プレート上で選択した。この結果、E. coli MG1655ΔilvAYC::KmR株を得た。挿入はPCRによって検証した。この目的のため、24時間以内に生育したコロニーについて、プライマーP15(配列番号25)及びP16(配列番号26)を使用するPCRによって、生来のilvAYC遺伝子に代わるΔilvAYC::KmR断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRに使用した。温度プロフィールは次の通りとした：94℃で5分間最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、57℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で2分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験した幾つかのKmRコロニーが、所望の1761 bpのDNA断片を含む筈であり、2926 bpの生来のilvAYC遺伝子に代わるΔilvAYC::KmR DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、得られた株をE. coli MG1655 ΔilvAYC::KmRと命名した。
targeted modification of E. coli genetic loci for the construction of amino-acids-producing strains、博士論文（PhD Thesis.） Moscow)を使用し、PCR断片を取得した。第二に、前記したようなエレクトロトランスフォーメーションによって、得られた断片をE. coli MG1655/pKD46株に導入した。ilvAYC遺伝子が欠失したカナマイシン耐性クローンは、前記したようにカナマイシン含有プレート上で選択した。この結果、E. coli MG1655ΔilvAYC::KmR株を得た。挿入はPCRによって検証した。この目的のため、24時間以内に生育したコロニーについて、プライマーP15(配列番号25)及びP16(配列番号26)を使用するPCRによって、生来のilvAYC遺伝子に代わるΔilvAYC::KmR断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRに使用した。温度プロフィールは次の通りとした：94℃で5分間最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、57℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で2分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験した幾つかのKmRコロニーが、所望の1761 bpのDNA断片を含む筈であり、2926 bpの生来のilvAYC遺伝子に代わるΔilvAYC::KmR DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、得られた株をE. coli MG1655 ΔilvAYC::KmRと命名した。
改変体、cat-ilvY-PilvC-lacZ, ΔilvAYC::KmR, ΔilvGM, ΔilvIH, ΔilvBN, PL-ilvBN及びPL-ilvBN4を、P1-形質導入を使用してE. coli K12 (VKPM B-7)株に導入した。ΔilvBN, ΔilvGM, ΔilvIH,及びPL-ilvBNの構成は、EP1942183に記載されている。株VKPM B-7(B7として言及する)は、K12の他の亜系（substrain）、例えば、American Type Culture
Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) (ATCC47076)から入手可能なK12 MG1655によって置き換えることができる。この結果、表２に列記する株が得られた。
Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) (ATCC47076)から入手可能なK12 MG1655によって置き換えることができる。この結果、表２に列記する株が得られた。
β-ガラクトシダーゼ活性の測定のために、グルコース(0.4％, w/v)を補填したM9:LB (9:1, v/v)培地中で対数増殖期半ばまで株を生育させた。ilvAYC欠失を有する株及びAHAS-欠損株のための培地は、Ile(25 mg/l)及びVal(25 mg/l)を付加的に補填した。β-ガラクトシダーゼの活性は、ミラーの方法に従って測定した(Miller J.H. (1972) Experiments in molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)。表２に示すデータは、PilvCプロモータの下でのレポータlacZ遺伝子の発現レベルが、遺伝子的背景に依存して２桁より大きい範囲内で変動することを示す。最大の発現レベルは、L-バリン耐性のAHAS I(ilvBN4遺伝子の産物)を過剰発現するよう改変され、且つ／又は不活性化された異性化還元酵素IlvCコード遺伝子(ilvC)を含むE. coli株によって与えられた。
実施例２：変異体E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-P ilvC -ilvBN4株の構築
実施例１で前記したようにして得られたcat-ilvY-PilvC発現ユニットを含むよう、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株を改変した。E. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM PL-ilvBN4株(この株の構築はEP1942183に記載されている)においてλRed媒介インテグレーションを使用し、cat-ilvY-PilvC調節領域に対して、ilvBN4遺伝子の上流のファージプロモータPLを置換した。この目的のために、オリゴヌクレオチドプライマーP7(配列番号17)及びP8(配列番号18)、並びにテンプレートとしてのE. coli MG1655 cat-ilvY-PilvC-lacZ株の染色体を使用し、ilvB遺伝子の隣の短い領域に隣接するcat-ilvY-PilvC発現カセットを含むDNA断片をPCR-増幅した。得られたPCR断片は、前記したように、エレクトロトランスフォーメーションによってE. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM PL-ilvBN4/pKD46株に導入した。この結果、株E. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-ilvY-PilvC-ilvBN4が得られ、この株では、フィードバック-耐性のAHAS Iをコードするオペロン遺伝子ilvBN4の上流のλ-ファージプロモータPLが、自己誘導性プロモータPilvCにより置き換えられていた。この置き換えをPCRによって検証した。この目的のために、プライマーP17(配列番号27)及びP18(配列番号28)を使用するPCRにより、24時間以内に生育するコロニーについて、PL-ilvBN4カセットに代えて導入されたcat-ilvY-PilvC-ilvBN4断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRに使用し
た。温度プロフィールは次の通りとした：94℃で5分間の最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、59℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で2分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験した幾つかのCmRコロニーが所望の2865 bpのDNA断片を含む筈であり、382 bpの最初のPL-ilvBN4構成体に代わるcat-ilvY-PilvC-ilvBN4 DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株は、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4と命名した。
実施例１で前記したようにして得られたcat-ilvY-PilvC発現ユニットを含むよう、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株を改変した。E. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM PL-ilvBN4株(この株の構築はEP1942183に記載されている)においてλRed媒介インテグレーションを使用し、cat-ilvY-PilvC調節領域に対して、ilvBN4遺伝子の上流のファージプロモータPLを置換した。この目的のために、オリゴヌクレオチドプライマーP7(配列番号17)及びP8(配列番号18)、並びにテンプレートとしてのE. coli MG1655 cat-ilvY-PilvC-lacZ株の染色体を使用し、ilvB遺伝子の隣の短い領域に隣接するcat-ilvY-PilvC発現カセットを含むDNA断片をPCR-増幅した。得られたPCR断片は、前記したように、エレクトロトランスフォーメーションによってE. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM PL-ilvBN4/pKD46株に導入した。この結果、株E. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-ilvY-PilvC-ilvBN4が得られ、この株では、フィードバック-耐性のAHAS Iをコードするオペロン遺伝子ilvBN4の上流のλ-ファージプロモータPLが、自己誘導性プロモータPilvCにより置き換えられていた。この置き換えをPCRによって検証した。この目的のために、プライマーP17(配列番号27)及びP18(配列番号28)を使用するPCRにより、24時間以内に生育するコロニーについて、PL-ilvBN4カセットに代えて導入されたcat-ilvY-PilvC-ilvBN4断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRに使用し
た。温度プロフィールは次の通りとした：94℃で5分間の最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、59℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で2分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験した幾つかのCmRコロニーが所望の2865 bpのDNA断片を含む筈であり、382 bpの最初のPL-ilvBN4構成体に代わるcat-ilvY-PilvC-ilvBN4 DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株は、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4と命名した。
実施例３：変異体E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-P ilvC -ilvBN4株の性質
グルコース(0.4％, w/v)を補填したM9:LB (9:1, v/v)培地中で、細胞を対数増殖期半ばまで生育させた。Stormer F.とUmbarger H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, 17(5):587-592に記載されたアッセイに従い、10mM L-Valを添加して、又は添加することなく粗製細胞抽出物中のAHAS Iの活性を測定した。三連の実験の平均を表３に示す。データは、cat-ilvY-PilvC調節領域により、増加したレベルのAHAS I発現が与えられることを示す。
グルコース(0.4％, w/v)を補填したM9:LB (9:1, v/v)培地中で、細胞を対数増殖期半ばまで生育させた。Stormer F.とUmbarger H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, 17(5):587-592に記載されたアッセイに従い、10mM L-Valを添加して、又は添加することなく粗製細胞抽出物中のAHAS Iの活性を測定した。三連の実験の平均を表３に示す。データは、cat-ilvY-PilvC調節領域により、増加したレベルのAHAS I発現が与えられることを示す。
実施例４：E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-P ilvC -ilvBN4株によるL-バリンの生産
改変したE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4及び対照B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株のそれぞれを、Luria-Bertaniブロス(Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているように溶原培地としても言及されている)中で、32℃で18時間培養した。その後、0.2 mLの得られた培養物を20×200 mmの試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカー上で250 rpmで30℃で60時間培養した。
改変したE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4及び対照B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株のそれぞれを、Luria-Bertaniブロス(Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているように溶原培地としても言及されている)中で、32℃で18時間培養した。その後、0.2 mLの得られた培養物を20×200 mmの試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカー上で250 rpmで30℃で60時間培養した。
発酵培地の組成(g/L)：
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 15.0
KH2PO4 1.5
MgSO4・7H2O 1.0
チアミン-HCl 0.1
CaCO3 25
LB培地を添加する: 10％ (v/v)
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 15.0
KH2PO4 1.5
MgSO4・7H2O 1.0
チアミン-HCl 0.1
CaCO3 25
LB培地を添加する: 10％ (v/v)
発酵培地は116℃で30分間滅菌した。ただし、グルコース及びCaCO3は、次のようにして別々に滅菌した。グルコースについては、110℃で30分、CaCO3については116℃で30分とした。pHは、KOH溶液によって7.0に調整した。
培養の後、薄層クロマトグラフィ(TLC)を使用して、蓄積されたL-バリンを測定した。TLCプレート(10 x 20 cm)は、非蛍光指標（non-fluorescent indicator）(Sorbpolymer, Krasnodar, ロシア連邦)を含むSorbfilシリカゲルの0.11 mmの層により被覆した。Camag Linomat 5サンプルアプリケータを用いて、サンプルをプレートに適用した。Sorbfilプレートは、イソ-プロパノール：酢酸エチル：25％ アンモニア水：水(16:16:5:10, v/v)からなる移動相を用いて展開した。アセトン中のニンヒドリン(2％, w/v)の溶液を可視化試薬として使用した。展開の後、プレートを乾燥させ、吸光モードでCamag TLC Scanner 3を用いてスキャンし、winCATSソフトウェア(バージョン 1.4.2)を使用して520 nmで検出した。
４つの独立した試験管発酵の結果を表４に示す。表４から分るように、改変したE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4株は、親E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株と比較して、より高い量のL-バリンの蓄積を生起した。
実施例５：E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY inactive -P ilvC -ilvBN4株の構成
発現カセットilvY-PilvC-ilvBN4は、PilvCにより媒介された発現の正のLysR型レギュレータをコードするilvY遺伝子を含む。したがって、このカセットを保有する株は、２つのコピーのilvY遺伝子を有し、一方のコピーは染色体上のその生来の遺伝子座に位置し、他方のコピーはilvBN4オペロンの上流に位置する。ilvY-PilvC-ilvBN4カセットに由来する正の効果が、ilvY遺伝子の複製（重複）に関係しているか否かを解明するために、ilvY-PilvC-ilvBN4発現カセット内でilvY遺伝子を不活性化させた。ilvY遺伝子の不活性化は別として、ilvBN4オペロン遺伝子の調節領域が変更されないまま残るように、ilvY遺伝子のヌクレオチド配列を改変した。更に詳しくは、31ヌクレオチドの長さのDNA断片を、ilvY-PilvC-ilvBN4発現カセットのilvY遺伝子に挿入し、ilvY遺伝子の構造部分の５番目のコドン(GAT)を「ストップ」コドンTGAにより置き換えた。
発現カセットilvY-PilvC-ilvBN4は、PilvCにより媒介された発現の正のLysR型レギュレータをコードするilvY遺伝子を含む。したがって、このカセットを保有する株は、２つのコピーのilvY遺伝子を有し、一方のコピーは染色体上のその生来の遺伝子座に位置し、他方のコピーはilvBN4オペロンの上流に位置する。ilvY-PilvC-ilvBN4カセットに由来する正の効果が、ilvY遺伝子の複製（重複）に関係しているか否かを解明するために、ilvY-PilvC-ilvBN4発現カセット内でilvY遺伝子を不活性化させた。ilvY遺伝子の不活性化は別として、ilvBN4オペロン遺伝子の調節領域が変更されないまま残るように、ilvY遺伝子のヌクレオチド配列を改変した。更に詳しくは、31ヌクレオチドの長さのDNA断片を、ilvY-PilvC-ilvBN4発現カセットのilvY遺伝子に挿入し、ilvY遺伝子の構造部分の５番目のコドン(GAT)を「ストップ」コドンTGAにより置き換えた。
ilvY遺伝子の不活性化は、次のようにして行った。第一に、オリゴヌクレオチドプライマーP9(配列番号19)及びP10(配列番号20)、並びにテンプレートとしてのプラスミドpMIV5-JSを使用し、ilvY内部部分に隣接する領域を有するλattL-cat-λattRカセットを保有するPCR断片を取得した。EP1942183に記載されたように、プラスミドpMIV5-JSを構成した。得られたPCR断片を用いてE. coli MG1655/pKD46細胞をエレクトロトランスフォームし、クロラムフェニコール耐性の形質転換体を前記したようにして選択した。この結果、ilvYコード領域にクロラムフェニコール耐性マーカー(CmR)の挿入を含むE. coli MG1655 ilvY::cat株を取得した。この挿入は、PCRによって次のように検証した。プライマーP11(配列番号21)及びP12(配列番号22)を使用するPCRにより、24時間以内に生育したコロニーについて、生来のilvY遺伝子に代わるilvY::cat DNA断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRのために使用した。温度プロフィールは次の通りとした。94℃で5分間最初のDNA変性を行
った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で1分30秒間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行う。試験した幾つかのCmRコロニーは、所望の1603 bp DNA断片を含む筈であり、297 bpの生来のilvY領域に代わるilvY::cat DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株は、E. coli MG1655 ilvY::catと命名した。
った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で1分30秒間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行う。試験した幾つかのCmRコロニーは、所望の1603 bp DNA断片を含む筈であり、297 bpの生来のilvY領域に代わるilvY::cat DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株は、E. coli MG1655 ilvY::catと命名した。
E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4株(実施例２参照)について、pMWts-λInt/Xisプラスミド(Katashkina Zh.I.ら、Mol. Biol. (Mosk.), 2005, 39(5):82,3-831)のトランジェントな導入により、CmR-マーカー(cat)をキュアリングし、この結果、マーカーのないE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株を得た。E. coli MG1655
ΔilvAYC::KmR (実施例１参照)を供与体として使用し、前記したようにP1-形質導入によって、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株からilvAYC遺伝子を欠失させた。プラスミドpKD46上のλRed-遺伝子をクローン化し、ilvY内部部分に隣接する領域を有するλattL-cat-λattRカセットを保有するPCR断片によって、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4 ΔilvAYC::KmR株をエレクトロトランスフォームした。オリゴヌクレオチドプライマーP11(配列番号21)及びP12(配列番号22)、並びにテンプレートとしてのE. coli MG1655 ilvY::cat株の染色体を用いて、このPCR断片を増幅した。この結果、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ΔilvAYC::KmR ilvY::cat-PilvC-ilvBN4株を取得し、更にこれをE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株にilvY::cat-PilvC-ilvBN4カセットを形質導入するための供与体株として使用した。P1-形質導入は、前記したようにして行った。PCRによって、カセットilvY::cat-PilvC-ilvBN4の検証を行った。この目的のために、プライマーP11(配列番号21)及びP19(配列番号29)を使用するPCRにより、24時間以内に生育したコロニーについて、カセットilvY-PilvC-ilvBN4に代わるilvY::cat-PilvC-ilvBN4 DNA断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRのために使用した。温度プロフィールは次の通りとした。94℃で5分間の最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で2分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験したCmRコロニーの幾つかは所望の1654
bpのDNA断片を含む筈であり、339 bpの最初のilvY-PilvC-ilvBN4構成体に代わるilvY::cat-PilvC-ilvBN4 DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株は、E. coli
B7 ΔilvGM ΔilvIH ΔilvAYC::KmR ilvY::cat-PilvC-ilvBN4と命名した。この株は更に、前記したように、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株にilvY::cat-PilvC-ilvBN4カセットを形質導入する供与体株として使用した。この結果、前記したようにilvY::cat-PilvC-ilvBN4カセットにおけるilvY遺伝子コピーの不活性化のために、その生来の遺伝子座に位置するilvY遺伝子の唯一の活性なコピーを有する株E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY::cat-PilvC-ilvBN4が得られた。pMWts-λInt/Xisプラスミドのトランジェント導入を使用し、cat遺伝子を除去した。この結果、マーカーのない株E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvYinactive-PilvC-ilvBN4が得られた。
ΔilvAYC::KmR (実施例１参照)を供与体として使用し、前記したようにP1-形質導入によって、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株からilvAYC遺伝子を欠失させた。プラスミドpKD46上のλRed-遺伝子をクローン化し、ilvY内部部分に隣接する領域を有するλattL-cat-λattRカセットを保有するPCR断片によって、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4 ΔilvAYC::KmR株をエレクトロトランスフォームした。オリゴヌクレオチドプライマーP11(配列番号21)及びP12(配列番号22)、並びにテンプレートとしてのE. coli MG1655 ilvY::cat株の染色体を用いて、このPCR断片を増幅した。この結果、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ΔilvAYC::KmR ilvY::cat-PilvC-ilvBN4株を取得し、更にこれをE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株にilvY::cat-PilvC-ilvBN4カセットを形質導入するための供与体株として使用した。P1-形質導入は、前記したようにして行った。PCRによって、カセットilvY::cat-PilvC-ilvBN4の検証を行った。この目的のために、プライマーP11(配列番号21)及びP19(配列番号29)を使用するPCRにより、24時間以内に生育したコロニーについて、カセットilvY-PilvC-ilvBN4に代わるilvY::cat-PilvC-ilvBN4 DNA断片の存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20 μｌの水に懸濁した後、得られた懸濁液の1 μｌをPCRのために使用した。温度プロフィールは次の通りとした。94℃で5分間の最初のDNA変性を行った後、30サイクルの94℃で30秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で2分間のエロンゲーションを行い、72℃で7分間の最後のエロンゲーションを行った。試験したCmRコロニーの幾つかは所望の1654
bpのDNA断片を含む筈であり、339 bpの最初のilvY-PilvC-ilvBN4構成体に代わるilvY::cat-PilvC-ilvBN4 DNA断片の存在が確認される。得られた株の１つを37℃で培養することにより、温度感受性プラスミドpKD46をキュアリングし、この結果得られた株は、E. coli
B7 ΔilvGM ΔilvIH ΔilvAYC::KmR ilvY::cat-PilvC-ilvBN4と命名した。この株は更に、前記したように、E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY-PilvC-ilvBN4株にilvY::cat-PilvC-ilvBN4カセットを形質導入する供与体株として使用した。この結果、前記したようにilvY::cat-PilvC-ilvBN4カセットにおけるilvY遺伝子コピーの不活性化のために、その生来の遺伝子座に位置するilvY遺伝子の唯一の活性なコピーを有する株E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY::cat-PilvC-ilvBN4が得られた。pMWts-λInt/Xisプラスミドのトランジェント導入を使用し、cat遺伝子を除去した。この結果、マーカーのない株E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvYinactive-PilvC-ilvBN4が得られた。
実施例６：E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvY inactive -P ilvC -ilvBN4株によるL-バリンの生産
改変されたE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvYinactive-PilvC-ilvBN4並びに対照B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4及びB7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4株を、Luria-Bertaniブロス(Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているように溶原培地としても言及される)中で、32℃で18時間培養した。その後、得られた培養物の0.2 mLを、20×200 mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカー上で250 rpmで30℃で60時間培養した。
改変されたE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvYinactive-PilvC-ilvBN4並びに対照B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4及びB7 ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4株を、Luria-Bertaniブロス(Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているように溶原培地としても言及される)中で、32℃で18時間培養した。その後、得られた培養物の0.2 mLを、20×200 mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカー上で250 rpmで30℃で60時間培養した。
発酵培地の組成(g/L)：
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 15.0
KH2PO4 1.5
MgSO4・7H2O 1.0
チアミン-HCl 0.1
CaCO3 25
LB培地を添加する：10％ (v/v)
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 15.0
KH2PO4 1.5
MgSO4・7H2O 1.0
チアミン-HCl 0.1
CaCO3 25
LB培地を添加する：10％ (v/v)
発酵培地は116℃で30分間滅菌した。ただし、グルコース及びCaCO3は、次のようにして別々に滅菌した。グルコースについては110℃で30分とし、CaCO3は116℃で30分とした。pHは、KOH溶液によって7.0に調整した。
培養の後、薄層クロマトグラフィ(TLC)を使用して、蓄積されたL-バリンを測定した。TLCプレート(10 x 20 cm)は、非蛍光指標(Sorbpolymer, Krasnodar, ロシア連邦)を含むSorbfilシリカゲルの0.11 mmの層により被覆した。Camag Linomat 5サンプルアプリケータを用いて、サンプルをプレートに適用した。Sorbfilプレートは、イソ-プロパノール：酢酸エチル：25％ アンモニア水：水(16:16:5:10, v/v)からなる移動相を用いて展開した。アセトン中のニンヒドリン(2％, w/v)の溶液を可視化試薬として使用した。展開の後、プレートを乾燥させ、吸光モードでCamag TLC Scanner 3を用いてスキャンし、winCATSソフトウェア(バージョン 1.4.2)を使用して520 nmで検出した。
４つの独立した試験管発酵の結果を表５に示す。表５から分るように、改変されたE. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH ilvYinactive-PilvC-ilvBN4株は、親E. coli B7 ΔilvGM ΔilvIH PL-ilvBN4株と比較して、より高い量のL-バリンの蓄積を生起した。更に、E. coli B7
ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4株におけるilvY遺伝子の不活性化は、この株によるL-バリンの生産に負の影響を有していない。
ΔilvGM ΔilvIH cat-ilvY-PilvC-ilvBN4株におけるilvY遺伝子の不活性化は、この株によるL-バリンの生産に負の影響を有していない。
その好適な態様を参照してこの発明を詳細に説明したが、発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。ここに引用した参考資料は全て、参考によりこの出願の一部として組み入れるものとする。
（配列表の説明）
配列番号1：ilvBのヌクレオチド配列
配列番号2：野生型アセト乳酸合成酵素I大サブユニットのアミノ酸配列
配列番号3：ilvNのヌクレオチド配列
配列番号4：野生型アセト乳酸合成酵素I小サブユニットのアミノ酸配列
配列番号5：ilvIのヌクレオチド配列
配列番号6：野生型アセト乳酸合成酵素III大サブユニットのアミノ酸配列
配列番号7：ilvHのヌクレオチド配列
配列番号8：野生型アセト乳酸合成酵素III小サブユニットのアミノ酸配列
配列番号9：ilvYのヌクレオチド配列
配列番号10：IlvYのアミノ酸配列
配列番号11-29：プライマーのヌクレオチド配列
配列番号30：PilvCプロモータのヌクレオチド配列
配列番号31：ilvGのヌクレオチド配列
配列番号32：アセト乳酸合成酵素II大サブユニットのアミノ酸配列
配列番号33：ilvMのヌクレオチド配列
配列番号34：アセト乳酸合成酵素II小サブユニットのアミノ酸配列
配列番号1：ilvBのヌクレオチド配列
配列番号2：野生型アセト乳酸合成酵素I大サブユニットのアミノ酸配列
配列番号3：ilvNのヌクレオチド配列
配列番号4：野生型アセト乳酸合成酵素I小サブユニットのアミノ酸配列
配列番号5：ilvIのヌクレオチド配列
配列番号6：野生型アセト乳酸合成酵素III大サブユニットのアミノ酸配列
配列番号7：ilvHのヌクレオチド配列
配列番号8：野生型アセト乳酸合成酵素III小サブユニットのアミノ酸配列
配列番号9：ilvYのヌクレオチド配列
配列番号10：IlvYのアミノ酸配列
配列番号11-29：プライマーのヌクレオチド配列
配列番号30：PilvCプロモータのヌクレオチド配列
配列番号31：ilvGのヌクレオチド配列
配列番号32：アセト乳酸合成酵素II大サブユニットのアミノ酸配列
配列番号33：ilvMのヌクレオチド配列
配列番号34：アセト乳酸合成酵素II小サブユニットのアミノ酸配列
Claims (23)
- 遺伝子発現系であって、
コインデューサ及びLysR型調節タンパク質により発現が正に調節されるプロモータ及びオペレータを含む、LysR型タンパク質により調節される転写機構と、
前記転写機構が作動可能に連接された目的遺伝子であって、前記コインデューサ、基質、又は前記コインデューサの前駆体の生合成に関与するタンパク質をコードする目的遺伝子とを含み、
それにより、前記発現系の自己誘導性で正のフィードバック調節が、前記コインデューサによって媒介されることを特徴とする、遺伝子発現系。 - 前記系が、腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）又はシュードモナス科（family Pseudomonadaceae）に属する細菌に由来する、請求項１に記載の発現系。
- 前記系が、腸内細菌科に属する細菌に由来する、請求項１又は２に記載の発現系。
- 前記系が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌に由来する、請求項３に記載の発現系。
- 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）に属する、請求項４に記載の発現系。
- 前記系が、分岐鎖L-アミノ酸、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、及びL-トリプトファンからなる群から選択されるL-アミノ酸の生合成経路に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現系。
- 前記系が、分岐鎖L-アミノ酸の生合成経路に由来する、請求項６に記載の発現系。
- 前記プロモータがPilvCプロモータであり、前記LysR型調節タンパク質がIlvYタンパク質であり、前記コインデューサが2-アセト乳酸、2-アセト2-ヒドロキシ酪酸、又はその塩である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現系。
- コインデューサが2-アセト乳酸又はその塩である、請求項８に記載の発現系。
- 前記目的遺伝子がアセトヒドロキシ酸合成酵素をコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現系。
- 前記目的遺伝子が、
(A)以下のA1及びA2の組合せ：
(A1)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、A2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(A2)配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、A1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、
(B)以下のB1及びB2の組合せ：
(B1)配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、B2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質）、
及び
(B2)配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、B1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(C)以下のC1及びC2の組合せ：
(C1)配列番号32のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号32のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、C2のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質、及び
(C2)配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつ、１若しくは幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、C1のタンパク質と共にアセト乳酸合成酵素活性を有するタンパク質
からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１０に記載の発現系。 - 前記アセトヒドロキシ酸合成酵素が、L-バリンによるフィードバック阻害に耐性な変異体アセト乳酸合成酵素Iである、請求項１１に記載の発現系。
- 前記オペレータが、前記LysR型調節タンパク質が結合する領域を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の発現系。
- 前記LysR型調節タンパク質が、
(D)配列番号10のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
(E)配列番号10のアミノ酸配列を含む異型体タンパク質であって、かつ、１又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含み、LysR型調節タンパク質の活性を有するタンパク質
からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の発現系。 - 前記プロモータが、
(F)配列番号30のヌクレオチド配列を含むDNA、又は
(G)配列番号30のヌクレオチド配列を含む異型体DNAであって、かつ、１若しくは幾つかのヌクレオチド残基の置換、欠失、挿入、若しくは付加を含み、配列番号30のヌクレオチド配列の活性を有するDNA
を含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現系。 - 腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）に属するL-アミノ酸生産細菌であって、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の発現系を含むよう改変されたことを特徴とする、細菌。 - 前記細菌が、LysR型調節タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１６に記載の細菌。
- 前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する、請求項１６に記載の細菌。
- 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）に属する、請求項１８に記載の細菌。
- 前記L-アミノ酸が、分岐鎖L-アミノ酸である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の細菌。
- 前記分岐鎖L-アミノ酸が、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンからなる群から選択される、請求項２０に記載の細菌。
- 分岐鎖L-アミノ酸を製造する方法であって、
(i)前記分岐鎖L-アミノ酸が培養培地中に蓄積されるよう、培養培地中で請求項２０に記載の細菌を培養し、
(ii)前記分岐鎖L-アミノ酸を培養培地から捕集する
ことを含む、方法。 - 前記分岐鎖L-アミノ酸が、L-バリン、L-ロイシン、及びL-イソロイシンからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
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