BR102013007954A2 - Sistema de expressão de gene, bactéria,e, método para produzir um l-aminoácido de cadeia ramificada - Google Patents

Abstract

Sistema de expressão de gene, bactéria,e, método para produzir um l-aminoácido de cadeia ramificada. A presente invenção descreve um método para produzir um metabólito últil usando uma bactéria da família enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria que pertence ao gênero escherichia, que foi modificada para conter um sistema de expressão de gene (s) que inclui elementos do mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo lysrr modificado em um tal modo que a regulagem da retroalimentação positiva autoindutível do dito sistema é mediada por um coindutor. O método é adequado para produzir l- aminoácido de cadeia ramificada, particularmente l-valina, l-isoleucina e l-leucina; e ácido d-pantotênico.

Description

“SISTEMA DE EXPRESSÃO DE GENE. BACTÉRIA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁC1DO DE CADEIA RAMIFICADA” Campo Técnico A presente invenção diz respeito à indústria microbiológica e especificamente a um método para produzir metabólitos úteis pela fennentação de uma bactéria da família Enterobacteriaceae, em que o sistema de expressão regulado pela proteína do tipo Lys-R da bactéria foi modificado em um tal modo que a funcionalidade do dito sistema de expressão é mediada por um condutor e como um resultado, os níveis de expressão dos genes regulados pelo dito sistema de expressão são realçados. Mais especificamente, o sistema de expressão e o método podem ser úteis para a melhora da produção de metabólitos do trajeto sintético de L-aminoácido, tal como o L-aminoácido de cadeia ramificada. Técnica Fundamenta] Convencionalmente, os L-aminoácidos são industrialmente produzidos pelos métodos de fermentação que utilizam cepas de microrganismos obtidos de fontes naturais, ou seus mutantes. Tipicamente, os microrganismos são modificados para realçar os rendimentos de produção de L-aminoácidos.

Muitas técnicas para realçar os rendimentos de produção de L-aminoácido foram relatados, que incluem a transformação de microrganismos com DNA recombinante (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.278.765) e alteração de regiões reguladoras tais como promotor, sequência líder, e/ou atenuador ou outros conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, a US20060216796 Al e W09615246 Al). Outras técnicas para realçar rendimentos de produção incluem aumentar as atividades de enzimas envolvidas na biossíntese de aminoácido e/ou dessensibilizar as enzimas alvo para a inibição de retroalimentação pelo L-aminoácido resultante (ver, por exemplo, a W09516042 Al, EP0685555 Al ou Patentes U.S. Nos. 4.346.170, 5.661.012 c 6.040.160). Por exemplo, a acetoidróxi-ácido sintetase I mutante bacteriana (também aludida como acetolactato sintase 1, daqui em diante AHAS I) que é resistente à inibição da retroalimentação pela L-valina foi utilizada para melhorar a produção de L-aminoácido de cadeia ramificada em cepas que produzem L-aminoácido correspondentes (Patente Russa No. 2355763). Λ biossíntese de L-aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs) tais como L-valina, L-leucina e L-isoleucina ocorre através de um trajeto biossintético ramificado. A acetolactato sintase (a classificação da enzima (EC) número 2.2.1.6) catalisa a reação na primeira etapa no trajeto, que é comum a todos os três trajetos biossintéticos do aminoácido. A reação inclui a condensação de acetaldeído ativado (difosfato de 2-(a-hidroxietiljtiamina) derivado de piruvato com piruvato ou 2-oxobutanoato para produzir 2-acetolactato (AL) ou 2-aceto-2-hidroxibutanoato (AHB), respectivamente. AL é um precursor de L-valina e L-leucina e AHB é um precursor de L-isoleucina. Na Escherichia coli (E. coli), por exemplo, as reações entre moléculas de piruvato, assim como reações entre piruvato e 2-oxobutanoato, são catalisadas pelas três isozimas AHAS, AHAS I, AHAS II e AHAS III, que são codificadas pelos genes ilvBN, ilvGM e ilvIH, respectivamente. AHAS I e AHAS III são os alvos para a inibição do produto final (também aludida como inibição de retroalimentação) pela L-valina. A inibição de retroalimentação pelo produto final desempenha um papel principal no controle fisiológico destes trajetos em bactérias.

Os produtos da reação catalisada por AHAS, AL ou AHB, são os substratos para a 2-acetoidróxi ácido isômero redutase IlvC (EC 1.1.1.86) que é codificada pelo gene ilvC, um membro do operon ilvYC. O operon ilvYC da E. coli é um sistema regulado pela proteína LysR prototípica que é o tipo mais comum de sistema regulador positivo em bactérias e pode ser encontrado em famílias bacterianas procarióticas que variam de Enterobacteriaceae a Rhizobiaceae (Rhee K. Y. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1999, 96: 14294-14299). O gene ilvY codifica a proteína reguladora do tipo LysR IlvY, um regulador transcricional, que liga em uma maneira altamente cooperativa a duas regiões operadoras em tandem na região promotora de ilvYC de sobreposição divergente (Figura 1). Na ligação à primeira região operadora, a transcrição autorregula negativamente o regulador IlvY do promotor ilvY atenuando assim a sua própria síntese. A parte desta função, IlvY desempenha um papel central na ativação da transcrição do gene ilvC. A ativação da transcrição de ilvC requer a ligação do regulador IlvY para a segunda região operadora e ligação adicional de um condutor tal como 2-acetolactato (AL) ou 2-aceto-2-hidroxibutanoato (AHB) a um complexo TlvY/DNA pré-formado. Na ligação de um condutor, uma mudança conformacional no complexo de proteína/DNA ocorre que remodela a região -35 do promotor ilvC e drasticamente aumenta a capacidade de ligação da RNA polimerase (Rhee K.Y. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273: 11257-11266).

Na biossíntese de L-valina e L-leucina, 2-acetolactato (AL) é convertido pela proteína IlvC no 2,3-di-idróxi-3-metilbutanoato (também aludido como 2,3-di-idróxi-isovalerato, DHIV) (Figura 2). Na biossíntese de L-isoleucina, 2-aceto-2-hidroxibutanoato (AFIB) é convertido pelo IlvC em 2,3-di-idróxi-3-metilpentanoato (também aludido como 2,3-di-idróxi-3-metilvalerato, DHMV).

Recentemente, os sistemas de expressão de gene autoindutíveis tomaram-se muito atraentes para realçar a expressão de um gene desejado em relação aos métodos genéticos de rotina. Por exemplo, a literatura fornece um sistema de expressão de gene com base na retroalimentação positiva artificialmente planejada que pode funcionar como um amplificador de sinal genético que intensifica a sensibilidade para os sinais indutores de proteína assim como aumentam os níveis máximos de expressão sem a necessidade para o cofator externo da acil homosserina Iactona (AHL, também abreviada como HSL) (Nistala G. J. et al., J. Biol. Eng., 2010, 4: 4). O sistema planejado utiliza uma variante constitutivamente ativa do regulador do sensor de quórum (QS) LuxR (operon lux) de Vibrio fischeri, que é autoindutor independente de (AHL) devido à mutação pontual Ala221Val (Sayut D. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 363: 667-673; Poellinger K. A. et al., FEMS Microbiol Lett., 1995, 129: 97-101). Um sistema de expressão de gene similar com variações leves foi aplicado para manipular as cinéticas de expressão de uma proteína de membrana modelo, citocromo bd quinol oxidase em E. coli (Bansal K. et al., J. Biol. Eng., 2010, 4: 6). A retroalimentação positivamente autoindutível regulou o sistema de ativação com base no mecanismo de sensor de quórum de V. fischery (genes de bioluminescência lux) e contando com a fonte endógena de um autoindutor (HSL) foi utilizada para a expressão de proteínas recombinantes tais como antígenos para preparar composições farmacêuticas (WO2010136897 A2).

Entretanto, nenhum dado foi relatado até agora que descreva um sistema de expressão de gene(s) regulado pela proteína tipo LysR modificado em um tal modo que a funcionalidade do dito sistema de expressão seja mediado por um condutor e o seu uso para a produção de metabólitos úteis do trajeto biossintético de L-aminoácido tal como L-aminoácidos de cadeia ramificada e/ou um trajeto ramificado deste.

Sumário da invenção Um aspecto da presente invenção é fornecer um sistema de expressão de gene(s) que compreende o mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR modificado cm um tal modo que a regulagem da retroalimentação positiva autoindutível do sistema é mediada por um condutor.

Um outro aspecto da presente invenção é fornecer uma bactéria da família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, às espécies Escherichia coli, que foi modificada para conter o sistema de expressão.

Um outro aspecto da presente invenção é fornecer um método para produzir metabólitos úteis, por exemplo, L-aminoácido tal como L-aminoácidos de cadeia ramificada, ou sais destes, em particular, L-valina, L-isoleucina e L-leucina, ou sais destes. Este objetivo foi obtido pela descoberta de que a modificação de genes que codificam a acetolactato sintase mutante, que é resistente à inibição de retroalimentação pela L-valina, em um tal modo que a expressão dos genes é regulado pelo mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR da qual a expressão é mediada por um condutor que é produzido pela reação da acetolactato sintase resulta na produção aumentada de L-aminoácidos de cadeia ramificada. É um aspecto da presente invenção fornecer um sistema de expressão de gene que compreende elementos do mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR que compreende um promotor e um operador do qual a expressão é positivamente regulada pela proteína reguladora do tipo LysR e um condutor e um gene(s) de interesse ao qual o mecanismo transcricional é operavelmente ligado, em que o(s) gene(s) de interesse codifica(m) uma proteína(s) envolvida(s) na biossíntese do condutor, um substrato, ou um precursor do condutor, por meio do qual a regulagem da retroalimentação positiva autoindutível do sistema de expressão é mediada pelo condutor. E um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o sistema é de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae ou Pseudomonadaceae. E um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o sistema é de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o sistema é de uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que a bactéria pertence à espécie Escherichia coli. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o sistema é do trajeto biossintético de L-aminoácido selecionado do grupo que consiste de L-aminoácidos de cadeia ramificada, L-lisina, L-cisteína, L-metionina e L-triptofano. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o sistema é do trajeto biossintético dos L-aminoácidos de cadeia ramificada. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o promotor é o promotor P,ivcs a proteína reguladora do tipo LysR é a proteína IlvY e o condutor é ácido 2-acetolactato, ácido 2-aceto-2-hidroxibutírico ou sais destes. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o condutor é ácido 2-acetolactato ou um sal deste. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o(s) gene(s) de interesse codifica(m) a acetoidróxi-ácido sintetase. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que os genes de interesse codifica proteínas selecionadas do grupo que consiste de: (A) combinação do AI e A2 que seguem: (A 1) uma proteína que compreende as sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 2, ou uma proteína que compreende as sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 2, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de A2; e (A2) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de Al; (B) combinação do BI e B2 que seguem: (B1) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de B2; e (B2) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de B1; e (C) combinação do Cl e C2 que segue: (Cl) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 32; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 32, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de C2; e (C2) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 34; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 34, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de Cl. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que a acetoidróxi-ácido sintetase é uma acetolactato sintase 1 mutante resistente à inibição de retroalimentação pela L-valina. E um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o operador compreende uma região à qual a proteína reguladora do tipo LysR se liga. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que a proteína reguladora do tipo LysR é selecionada do grupo que consiste de: (D) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 0; e (E) uma proteína variante que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da proteína reguladora do tipo LysR. E um outro aspecto da presente invenção fornecer o sistema de expressão como descrito acima, em que o promotor compreende: (F) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30; ou (G) um DNA variante que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30, mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de nucleotídeo e tem atividade da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30. E um aspecto da presente invenção fornecer uma bactéria que produz L-aminoácido que pertence à família Enlerobacteriaceae, em que a bactéria foi modificada para conter o sistema de expressão como descrito acima. E um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a bactéria contém um gene que codifica a proteína reguladora do tipo LysR. E um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escheríchia. É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a bactéria pertence à espécie Escheríchia coli. É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que o L-aminoácido é L-aminoácido de cadeia ramificada. É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que o L-aminoácido de cadeia ramificada é selecionado do grupo que consiste de L-valina, L-leucina e L-isoleucina. É um aspecto da presente invenção fornecer um método para produzir um L-aminoácido de cadeia ramificada que compreende: (i) cultivar a bactéria como descrita acima em um meio de cultura de modo que o L-aminoácido de cadeia ramificada é acumulada no meio de cultura; e (ii) coletar o L-aminoácido de cadeia ramificada do meio de cultura. É um outro aspecto da presente invenção fornecer o método para produzir o L-aminoácido de cadeia ramificada como descrito acima, em que o L-aminoácido de cadeia ramificada é selecionado do grupo que consiste de L-valina, L-leucina e L-isoleucina.

Descrição Resumida dos Desenhos A FIG. 1 mostra o esquema para a regulagem da transcrição dos genes ilvYe ilvC.

IlvY é o regulador transcricional tipo LysR. AL ou AHB é o condutor 2-acetolactato ou 2-aceto-2-hidroxibutanoato. OI e 02 são as regiões operadoras 1 e 2. TSjivc significa o início da transcrição do gene ilvC. TSíivy significa o início da transcrição do gene ilvY. O sinal de menos (-) significa influência negativa sobre a transcrição de gene. O sinal de mais (+) significa influência positiva sobre a transcrição de gene. A FIG. 2 mostra o esquema para a biossíntese de L-valina a partir do piruvato. AL é a 2-acetolactato. DHIV é a 2,3-di-idróxi-isovalerato. AHAS é a acetolactato sintase.

IlvC é a isômero redutase.

Descrição da invenção A presente invenção é descrita em detalhes abaixo. 1. Bactéria A frase “metabólito útil” não é particularmente limitada contanto que o metabólito possa ser produzido por uma reação enzimática ou trajeto biossintético e possa incluir L-aminoácidos, álcoois superiores e ácido D-pantotênico. a frase “uma bactéria que produz L-aminoácido” pode significar uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tem uma capacidade para produzir e causar o acúmulo de um L-aminoácido em um meio de cultura quando a bactéria é cultivada no meio. A capacidade de produzir L-aminoácido pode significar a capacidade da bactéria para produzir um L-aminoácido em um meio ou das células bacterianas e causam acúmulo do L-aminoácido a um tal grau que o L-aminoácido possa ser coletado do meio ou das células bacterianas, quando a bactéria é cultivada no meio. A frase “L-aminoácido” pode incluir L-alanina, L-arginina, L- asparagina, L-ácido aspártico, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosinae L-valina. A frase “L-aminoácido ramificado” pode incluir L-valina, L-leucina e L-isoleucina. A bactéria pode inerentemente ter a capacidade para produzir o metabólito útil tal como L-aminoácido ou pode ser modificada para ter uma tal capacidade pelo uso de um método de mutação ou técnicas de recombinação de DNA.

As bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae pode ser dos gêneros Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Yersinia e assim por diante e pode ter a capacidade para produzir um L-aminoácido. Especificamente, aqueles classificados dentro da família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy /Browser/wwwtax.cgi?id=543) pode ser usado. Os exemplos de cepas da família Enterobacteriaceae que podem ser modificadas incluem uma bactéria do gênero Escherichia, Enterobacter ou Pantoea.

As cepas da bactéria Escherichia que pode ser modificada para se obter bactérias Escherichia de acordo com a matéria individual presentemente divulgada não são particularmente limitadas e especificamente, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et aí. pode ser usado (Bachmann, B. J., Derivations and genotypes of some mutante derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. Em F. C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2a ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996). A espécie E. coli é um exemplo particular. Os exemplos específicos de E. coli incluem E. coli W31 10 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076) e assim por diante, que são derivadas da cepa protótipo do tipo selvagem, cepa K-12. Rstas cepas são disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, os números de registro são dados a cada uma das cepas e as cepas podem ser encomendadas usando-se estes números de registro (reportar-se ao www.atcc.org). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection.

Os exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e assim por diante. Os exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis e assim por diante. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii com base na análise da sequência de nucleotídeo de 16S rRNA, etc. Uma bactéria que pertence a qualquer um dos gêneros Enterobacter ou Pantoea pode ser usada contanto que a mesma seja uma bactéria classificada dentro da família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa de Pantoea ananatis é reproduzida pelas técnicas de engenheiramento genético, Pantoea ananatis cepa AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) e seus derivados pode ser usado. Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando elas foram isoladas e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, elas foram recentemente reclassificadas como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeo de 16S rRNA e assim por diante como descrito acima.

Os exemplos da bactéria que pertence à família Pseudomonadaceae podem ser do gênero Pseudomonas. Os exemplos das bactérias Pseudomonas incluem Pseudomonas putida, P. aeruginosa e P. syringae. A frase “uma bactéria que foi modificada para conter o sistema de expressão” pode significar uma bactéria, por exemplo, uma bactéria que produz L-aminoácido da família Enterobacteriaceae, em que um sistema de expressão regulado pela proteína do tipo LysR foi modificado em um tal modo que a funcionalidade da regulagem da retroalimentação positiva autoindutível do dito sistema é mediada por um condutor. Por exemplo, a frase “uma bactéria que foi modificada para conter o sistema de expressão” pode significar uma bactéria da família Enlerobacteriaceae que tem uma capacidade para produzir L-aminoácido tal como L-aminoácido de cadeia ramificada, que foi modificada para ter o sistema de expressão de gene(s). Bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada A frase “uma bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada” pode significar uma bactéria que tem uma capacidade para produzir e causar o acúmulo de L-aminoácidos de cadeia ramificada em um meio tal como L-valina, L-leucina e L-isoleucina, quando a bactéria é cultivada no meio. Os L-aminoácidos de cadeia ramificada, sem considerar L-valina, L-lcucina e L-isoleucina, também podem incluir L-aminoácidos de cadeia ramificada não naturais tais como L-homoleucina e L-homoisoleucina. A capacidade para produzir L-aminoácido de cadeia ramificada pode ser comunicada ou realçada pela reprodução. A frase “uma bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada” pode indicar também uma bactéria que é capaz de produzir e causar acúmulo de L-aminoácidos de cadeia ramificada em um meio de cultura em uma quantidade maior do que uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa precursora e também podem significar que a bactéria é capaz de produzir e causar acúmulo em um meio dos L-aminoácidos de cadeia ramificada em uma quantidade de não menos do que 0,5 g/L, ou ainda não menor do que 1,0 g/L. A bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada pode ser uma bactéria da família Enterobacteriaceae, que contém uma região regulatória que positivamente afeta a expressão dos genes da acetolactato sintase por um complexo que inclui uma proteína reguladora de transcrição e um condutor que é um produto de reação catalisada pela acetolactato sintase.

Além disso, a bactéria pode ser uma bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae que tem atividade da acetolactato sintase mutante aumentada. Especificamente, a bactéria pode ser uma bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae, em que a produção do L-aminoácido de cadeia ramificada pela bactéria é aumentada pelo realce da atividade da acetolactato sintase mutante pela introdução da região reguladora dentro da bactéria. A bactéria é uma bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada que pertence ao gênero Escherichia, em que a produção do L-aminoácido de cadeia ramificada pela bactéria pode ser aumentada pelo realce da atividade da acetolactato sintase mutante resistente à inibição de retroalimentação pela L-valina. A bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae não é limitada à bactéria como divulgada acima. Mais especificamente, a bactéria que produz L-aminoácido de cadeia ramificada também pode ser uma bactéria que produz L-valina, L-leucina, e/ou L-isoleucina.

Bactérias que produzem L-valina Os exemplos de cepas precursoras para derivar bactérias que produzem L-valina podem incluir, mas não são limitados a, cepas que foram modificadas para super expressar o operon ilvGMEDA (Patente U.S. No. 5.998.178). E desejável remover a região do operon ilvGMEDA que é requerido para a atenuação de modo que a expressão do operon não seja atenuada pela L-valina que é produzida. Além disso, o gene ilvA no operon é desejável mente rompido de modo que a atividade da treonina dcsaminase seja diminuída.

Os exemplos de cepas precursoras para derivar bactérias que produzem L-valina podem incluir também mutantes que tem uma mutação de amino-acil t-RNA sintetase (Patente U.S. No. 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica a isoleucina tRNA sintetase, pode ser usada. E. coli VL1970 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKJPM) (Russian Federation, 117545 Moscou, lsl Dorozhny Froezd, 1) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411. Além disso, mutantes que requerem o ácido lipoico para o crescimento e/ou que carecem de H+-ATPase também podem ser usados como cepas precursoras (WO 96/06926).

Como a cepa precursora, as bactérias que produzem L-valina que pertencem ao gênero Escherichia tal como H-81 (VKPM B-8066), NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (Patente US No. 4.391.907), VKPM B-4411 (Patente US No. 5.658.766), VKPM B-7707 (Pedido de Patente Europeu EP1016710A2), NS1610 (refere-se à Patente EP1942183, Exemplo 7 e os exemplos aqui mencionados) ou outros podem ser utilizados.

Bactérias que produzem L-leucina Os exemplos de cepas precursoras para derivar bactérias que produzem L-leucina podem incluir, mas não são limitados às cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tal como cepas E. coli resistentes à leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. No. 6.124.121)) ou análogos de leucina que inclui β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); cepas de E. coli obtidas pelo método de engenheiramento de gene descrito na WO96/06926; a E. coli H-9068 (JP 8-70879 A) e outras. A bactéria pode ser melhorada pelo realce da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Os exemplos incluem genes do operon leuABCD, que pode ser representado por um gene mutante leuA que codifica a isopropilmalato sintase não individualizada para a inibição de retroalimentação pela L-leucina (Patente US 6.403.342). Além disso, a bactéria pode ser melhorada pelo realce da expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácido a partir da célula bacteriana. Os exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).

Como a cepa precursora, as bactérias que produzem L-leucina que pertencem ao gênero Escherichia tais como H-9070 (FERM BP-4704) e H-9072 (FERM BP-4706) (US5744331), VKPM B-7386 e VKPM B-7388 (RU2140450), W1485atpA401/pMWdAR6, W14851ip2/ pMWdARó e AJ12631/pMWdAR6 (EP0872547), ou outras podem ser utilizadas.

Bactérias que produzem L-isoleucina Os exemplos de cepas precursoras para derivar as bactérias que produzem L-isoleucina podem incluir, mas não são limitados a, mutantes que tem resistência a 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), mutantes que tem resistência a um análogo de isoleucina tal como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina e mutantes que adicionalmente tem resistência à DL-etionina e/ou hidroxamato de arginina (JP 5-130882 A). Além disso, as cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, tais como a treonina desaminase e acetoidroxato sintase, também podem ser usadas como cepas precursoras (JP 2-458 A, FR 0356739 e Patente U.S. No. 5.998.178).

Como a cepa precursora, bactérias que produzem L-isoleucina que pertencem ao gênero Escherichia tal como a cepa (NZ10) TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi K. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4): 672-679) ou cepa A.T12919 descrita no Pedido de Patente Europeu EP685555 Al, ou outros podem ser utilizadas.

Bactérias que produzem álcoois superiores e ácido D-pantotênico A bactéria que produz L-aminoácidos da família Enterobacteriaceae e mais especificamente a bactéria que produz L-aminoácidos de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae pode ser usada para a produção de álcoois superiores e ácidos orgânicos, ou seus derivados. Por exemplo, álcoois superiores tais como isobutanol, 2-metil-l-butanol e 3-metil-l-butanol; e ácido orgânico tal como ácido D-pantotênico (vitamina B5) pode ser produzido usando uma tal bactéria. E conhecido na técnica que nas bactérias da família Enterobacteriaceae, o trajeto biossintético para L-valina, L-leucina e L-isoleucina prossegue através de intermediários de ceto-ácido. Mais especificamente, 2-oxoisovalerato (2-cetoisovalerato, 2-KIV) é um precursor para L-valina e L-leucina; e 2-oxobutanoato é um precursor para L-isoleucina. Também, é conhecido na técnica que os intermediários de ceto-ácido ou seus derivados podem ser os precursores para álcoois superiores com uma cadeia carbônica do comprimento de mais do que dois átomos devido ao trajeto da degradação de Ehrlich (Yan Y. e Liao J. C. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2009, 36: 471-479). Por exemplo, o 2-oxoisovalerato é um precursor para isobutanol e seu derivado 4-metil-2-oxopentanoato é um precursor para o 3-metil-1-butanol; 2-oxobutanoato é um precursor para o n-propanol e seu derivado 3-metil-2-oxopentanoato é um precursor para o 2-metil-l-butanol. A capacidade para produzir álcoois superiores pode ser prejudicada para as cepas de E. coli que não têm uma capacidade nativa para produzir álcoois superiores pela introdução dos genes que codificam a ceto-ácido descarboxilase (KDC) de faixa de substrato ampla e álcool desidrogenase (ADII) (kivd e adh2) a partir de microrganismos hospedeiros. Por exemplo, o gene kivd de Bacillus subtilis e o gene adh2 de Lactococcus lactis pode ser usado. Neste aspecto, as referências podem ser dadas para Connor M. R. e Liao J. C., Appl. Env. Mocrobiol., 2008, 74: 5769-5775; e Pedido de Patente W02009046370 A2.

Assim, pela introdução dentro de uma bactéria que produz L-aminoácido da família Enterobacteriaceae o sistema de expressão de gene(s) e genes heterólogos adequados, por exemplo, kivd e adh2, ou suas variantes, a partir de microrganismos hospedeiros, a capacidade para produzir álcoois superiores tais como isobutanol, 3-metil-l-butanol e 2-metil-l-butanol pode ser comunicada à bactéria.

Também é conhecido na técnica que em uma bactéria da família Enterobacteriaceae, o 2-oxoisovalerato é um precursor para o ácido D-pantotênico. Assim, pela modificação de uma bactéria da família Enterobacteriaceae com o sistema de expressão de gene(s) a capacidade para produzir ácido D-pantotênico pode ser comunicada à bactéria. 2. Sistema de expressão O sistema de expressão pode ser um sistema regulador da transcrição de gene(s) que inclui elementos do mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR. Os elementos do mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR podem incluir promotor, operador, do qual a expressão é positivamente regulada pela proteína reguladora do tipo LysR e um condutor. O sistema de expressão pode incluir ainda um gene(s) de interesse para o(s) qual(is) o mecanismo transcricional mencionado acima é operavelmente ligado. A frase “operavelmente ligado” pode significar que o gene de interesse está ligado à(s) sequência(s) reguladora(s) tal(is) como um promotor e operador em uma maneira que permita a expressão do gene. O(s) gene(s) de interesse pode(m) codificar uma proteína(s) envolvida(s) na biossíntese do condutor, um substrato, ou um precursor do dito condutor.

De acordo com o planejamento descrito acima do sistema de expressão, a expressão do sistema pode ser autoindutível e positivamente regulada pela retroalimentação pela mediação do condutor produzido com o envolvimento de produto(s) expressão do(s) gene(s) de interesse. Um tal sistema de expressão pode ser chamado “o sistema de expressão positivamente regulado pela retroalimentação autoindutível”, mas por razões de simplicidade, também pode ser aludida como o sistema de expressão. O sistema de expressão pode ser positivamente autorregulado pela retroalimentação por um condutor que pode ser um substrato ou um precursor para um metabólito útil em um trajeto biossintético, mais especificamente no trajeto biossintético de L-aminoácidos de cadeia ramificada e/ou um trajeto ramificado deste. A “proteína reguladora do tipo LysR” também pode ser aludida como o “regulador transcricional do tipo LysR (LTTR)”, regulador transcricional da família LysR, ou simplesmente “regulador”. A proteína reguladora do tipo LysR pode pertencer à família diversa de fatores transcricionais bacterianos oligoméricos que regulam uma ampla variedade de unidades de transcrição em resposta a uma ampla variedade de sinais ambientais. Os membros desta família podem atuar como ativadores transcricionais e/ou repressores transcricionais e têm vários traços estruturais comuns tais como: i) um domínio de ligação de DNA que utiliza um motivo de hélice-volta-hélice (os resíduos podem ser das posições de 1 a 65 do terminal N do LTTR), (ii) domínios envolvidos no reconhecimento e/ou resposta de condutor (os resíduos podem ser de 100 a 173 e de 196 a 206) e (iii) um domínio requerido para a ligação de DNA e resposta de condutor (os resíduos podem ser de 227 a 253) como descrito em Schell M. A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47: 597-626. na ausência de um condutor, LTTRs podem ligar-se aos promotores regulados via uma região diádica de 15 pares de base com uma estrutura e posição comuns (próximo a -65) como descrito em Schell Μ. A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47: 597-626. Na presença de um condutor, interações adicionais de LTTRs com regiões próximas ao sítio de ligação da RNA polimerase -35 e/ou a curvatura do DNA pode ocorrer que resulta na ativação da transcrição (Schell Μ. A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47: 597-626). Além disso, alguns membros da família da proteína reguladora do tipo LysRs podem ter quatro outras características funcionais tais como: (i) ser proteínas transcricionais reguladoras responsivas a condutor de tamanho variável, tal como variando de 276 a 324 resíduos de aminoácido, (ii) independentemente da presença de um condutor, se ligam em alvos regulados para as regiões de DNA operador que têm uma posição e motivo estrutural similar, (iii) ser divergentemente transcritos a partir de um promotor que esteja muito próximo ou sobreponha um promotor de um gene regulado de interesse e (iv) reprimem a sua própria transcrição por um grau variável, tal como em 3 a 10 vezes, isto é ser negativamente autorregulados como descrito em Schell Μ. A., Ann. Rev. Microbiol., 1993, 47: 597-626.

Por exemplo, mas não são limitados a, o sistema de expressão pode incluir o mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR que contém um promotor e operador regulados pela retroalimentaçâo positivamente autoindutível e gene(s) de interesse. A expressão do sistema é positivamente regulada pela proteína reguladora do tipo LysR e um condutor. Os exemplos de uma retroalimentaçâo positivamente autoindutível regulada podem incluir o promotor Pjwc· Os exemplos da proteína reguladora do tipo LysR pode incluir a proteína IlvY. Os exemplos de condutor podem incluir um membro dos ácidos 2-aceto-2-hidroxicarboxílicos tais como o ácido 2-acetoláctico (AL), ácido 2-aceto-2-hidroxibutírico (AIIB, também referido como ácido 2-aceto-2-hidroxibutanoato) e um sal destes. Os exemplos do(s) gene(s) de interesse podem incluir os genes que codificam a acetolactato sintase I, II e/ou III, ou variantes mutantes destes. Um sistema de expressão exemplar pode ser descrito esquematicamente sem limitar o tipo, quantidade e arranjo de elementos do sistema de expressão.

Os genes ilvY e ilvC estão localizados lado a lado na direção oposta como ilustrado na Fig. 1, Transcrição dos genes ilvY e ilvC são iniciados pelos promotores de sobreposição divergentes ilvY e ilvC, respectivamente. Entretanto, as palavras “promotor ilvC” ou o “promotor Píivc” podem inclusivamente significar os promotores ilvY e ilvC. Existem dois operadores em tandem na região promotora (Fig. 1). O(s) gene(s) de interesse está(ão) operavelmente ligado(s) ao mecanismo transcricional, especificamente, ao promotor. Por exemplo, em um caso que os genes de interesse são os genes ilvBN que codificam a acetolactato sintase I c que o promotor é o promotor HvC, a região promotora nativa localizada a montante dos genes ilvBN é substituído por um fragmento de DNA que inclui um promotor indutível do gene ilvC e a segunda região operadora em um tal modo que a expressão dos genes é controlada pelo promotor. Por exemplo, os genes no operon ilvBN4 que codifica AIIAS I que é resistente à inibição de retroalimentação pela L-valina foram colocados sob o promotor ilvC, que toma-se transcricionalmente ativado apenas quando o complexo entre AL ou AHB, o regulador transcricional IlvY e a segunda região operadora é formada. O cassete de expressão que inclui o promotor PiivC e genes do operon ilvBNA permite que os genes ilvBNA sejam transcritos para produzir AHAS I. A AHAS converte dois moles de pimvato em um mol de 2-acetolactato (AJL), ou um mol de piruvato e um mol de 2-oxobutanoato em um mol de 2-aceto-2-hidroxibutanoato (AHB), dependendo da presença de 2-oxobutanoato.

Como uma vantagem da presente invenção, uma porção do produto de reação catalisada por AHAS 1 (AL ou AHB) atua como um condutor e se liga ao complexo UvY/DNA, induzindo a transcrição dos genes do operon ilvBNA e fornecendo assim a síntese de AL ou AHB. Uma outra porção de AL ou AHB pode ser convertida em um produto final do L-aminoácido ramificado (L-valina, L-leucina ou L-isoleucina) pela cetol-ácido rédutoisomerase IlvC e outras enzimas do trajeto biossintético dos L-aminoácidos ramificados como descrito acima.

Fomecendo-se continuamente o sistema de expressão com 2-acetolactato ou 2-aceto-2-hidroxibutanoato pode-se explicar as suas propriedades autoindutíveis; e circuitos repetíveis através do sistema de expressão positivamente regulado pela retroalimentação autoindutível pode resultar em um fornecimento contínuo dos trajetos biossintéticos do L-aminoácido de cadeia ramificada com precursores tais como 3-hidróxi-3- metil-2-oxobutanoato para L-valina e L-leucina ou 3-hidróxi-3-metil-2-oxopentanoato para L-isoleucina. O método proposto para a expressão de gene pode ser aludido como um sistema de expressão de gene autoindutível que tem a regulagem de rctroalimentação positiva mediada pelo condutor AL ou AHB. O sistema de expressão positivamente regulado pela retroalimentação autoindutível não é limitada ao sistema de expressão anteriormente mencionado que inclui o regulador transcricional IlvY. Outros sistemas de expressão que usam a proteína reguladora do tipo LysRs também podem ser incluídos, os exemplos dos quais são descritos na Tabela 1. A frase “acetolactato sintase” pode significar enzima existente em bactéria tal como bactérias da família Enterobacteriaceae, bactérias c o ri ne formes e bactérias que pertencem ao gênero Bacillus, etc. A família Enterobacteriaceae pode ser exemplificada pelas bactérias que pertencem aos gêneros Escherichia, Pantoea, Erwinia, Providencia e Serrada tais como E. coli, Pantoea ananatis (P. ananatis) e outros. As bactérias corineformes podem ser exemplificadas pelas bactérias que pertencem ao gênero Corynebacterium tais como Corynebacterium glutamicum. As bactérias que pertencem ao gênero Bacillus podem ser exemplificadas pelo Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefaciens FZB42 e Bacillus amiloliquefaciens DSM7. A acetolactato sinlase também pode significar uma enzima que tem atividade de acetolactato sintase. A frase “atividade da acetolactato sintase” pode significar uma atividade de catalisar a reação de formação de i) 2-acetolactato e C02 de duas moléculas de piruvato, e/ou ii) 2-aceto-2-hidroxibutanoato e CCf de piruvato e 2-oxobutanoato sob condições apropriadas tais como temperatura, concentração iônica, acidez (pH), cofatores e concentração de substratos e assim por diante. A atividade da acetolactato sintase pode ser medida usando o método de Stormer F. C. e Umbarger Η. E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, 17(5): 587-592. A acetolactato sintase í, II, ou III (AHAS I, AHAS II, ou AHAS III) (EC 2.2.1.6) também podem ser aludidas como acetolactato sintase. A acetolactato sintase é uma proteína heterotetramérica de estrutura tipo α2β2 que consiste de dois domínios catalíticos e dois reguladores (Weinstock O. et al., J. Bacteriol., 1992, 174(17): 5560-5566). É no geral aceito que as subunidades grandes (cerca de 60 kDa) são catalíticas, enquanto que as pequenas (cerca de 11 kDa) são reguladoras. AHAS I é codificada pelos genes ilvB e ilvN encontrados no operon ilvBN. AHAS TI é codificada pelos genes ilvG e ilvM encontrados no operon ilvGMEDA. AHAS II não é nomialmente expressado nas células K-12 da E. coli (Guardiola J. et al., Mol. Gen. Genet., 1977, 156: 17-25). AHAS III é codificada pelos genes ilvl e ilvH encontrados no operon ilvIH. A AHAS I da E. coli, por exemplo, pode ter substituições de resíduos de aminoácido tais como N17K e/ou A30P, que as tomam resistentes à inibição de retroalimentação pela L-valina (Patente Russa No. 2355763, Pedido de Patente U.S. No. 2009197309 Al). Também, substituindo alanina na posição 33 com qualquer aminoácido(s), tal como a substituindo com 12 aminoácidos que contêm um sítio de término de tradução resulta em uma proteína truncada de 45 aminoácidos IlvN33 (Patente Russa No. 2355763, Pedido de Patente U.S. No. 2009197309 A1). Esta proteína mutante é também resistente à inibição de retroalimentaçâo pela L-valina. Λ subunidade pequena de AHAS I mutante que tem a substituição N17K (Asn na posição 17 é substituído com Lys, isto é correspondendo ao codon AAC é substituído com AAG) na AHAS I do tipo selvagem pode ser codificada pelo gene ilvN mutante, que pode ser aludido como gene ilvN4 ou ilvN ValR4 como descrito na EP1942183. AHAS I que tem a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 2 e 4 pode ser aludida como “uma acetolactato sintase I do tipo selvagem”.

Com base em um modelo da região de ligação de valina da subunidade pequena reguladora de AHAS III da E. coli, truncagens da extremidade carboxila da subunidade pequena foram feitas. Estas truncagens induziram uma falta de sensibilidade de valina nas enzimas AHAS III truncadas (Mendel S. et al., J. Mol. Biol., 2003, 325(2): 275-284). A acetolactato sintase III que é truncada na extremidade carboxila da subunidade pequena em 35, 48, 80 ou 95 resíduos de aminoácido pode ser aludida como a “acetolactato sintase III mutante”. Um DNA que codifica a subunidade pequena AHAS III mutante pode ser aludida como o “gene ilvH mutante”. O operon ilvIH que compreende o gene ilvH mutante pode ser aludido como o “operon ilvIH mutante”. AHAS III que tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 6 e 8 pode ser aludida como “uma acetolactato sintase III do tipo selvagem”. A AHAS I mutante pode incluir deleção, substituição, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou mais posições outras que não 17, 30 e/ou 33 na sequência de aminoácido inicial, contanto que a atividade da acetolactato sintase seja ainda mantida. Similarmente, a AHAS III mutante também pode incluir deleção, substituição, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou mais posições na sequência de aminoácido inicial, contanto que a atividade da acetolactato sintase seja ainda mantida. Além disso, a extremidade carboxila da AHAS III mutante pode ser truncada por um ou mais resíduos de aminoácido, não necessário ser restrito a 35, 48, 80 ou 95 resíduos de aminoácido, contanto que a atividade de acetolactato sintase não seja reduzida. O número de “vários” resíduos de aminoácido difere dependendo da posição na estrutura tridimensional da proteína ou o tipo de resíduo de aminoácido. Isto é porque alguns aminoácidos são similares entre si na sua estrutura e função dentro de uma proteína e a permuta de tais aminoácidos não afeta muito a estrutura tridimensional ou a função da proteína. A AHAS III pode ser truncada por uma sequência de resíduos de aminoácido de comprimento variável contanto que a construção truncada ligue e ative a subunidade catalítica (grande) de modo que a AHAS III mutante mantenha a atividade. Portanto, a AHAS I, II e III mutante pode ser uma que tem homoiogia de não menos do que 65 %, não menos do que 80 %, não menos do que 90 %, não menos do que 95 %, não menos do que 97 %, não menos do que 98 %, ou não menos do que 99 % com respeito à sequência de aminoácido inteira para a acetolactato sintase e contanto que a atividade da acetolactato sintase seja mantida. Neste relatório descritivo, o termo “homoiogia” pode significar “identidade”. A AHAS I mutante pode ser obtida pela introdução de mutações dentro de um gene ilvN do tipo selvagem usando métodos conhecidos. Por exemplo, o operon ilvBNA mutante que contém o gene ilvB e ilvN A mutante pode ser obtido pela PCR (reação da cadeia da polimerase; consultar White T. J. et al., Trends Genet., 1989, 5: 185-189) que utiliza iniciadores com base na sequência de nucleotídeo do gene ilvN (SEQ ID NO: 3). Os genes que codificam a acetolactato sintase de outros microrganismos podem ser obtidos em uma maneira similar. A AHAS 111 mutante com uma extremidade carboxila truncada da subunidade pequena pode ser obtida pela mutagênese loco-dirigida usando a PCR de extensão de sobreposição pela colocação de códons de parada a serem introduzidos na posição desejada do gene ilvH (Ho S. N. et al., Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction, Gene, 1989, 77: 51-59). Os iniciadores para a PCR adequados para a síntese de genes de operon ilvIH podem ser escolhidos por referência à sequência de nucleotídeo do gene ilvH (SEQ ID NO: 7). O gene ilvB codifica a subunidade grande da acetolactato sintase I (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, entrada No. b3671). O gene ilvB (acesso do Banco de Genes No. NC 000913.2; posições de nucleotídeo: 3849119 a 3850807, complemento; Gene ID: 948182) está localizado entre os genes ilvN e ivbL no cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvB e a sequência de aminoácido da subunidade grande da acetolactato sintase I codificada pelo gene ilvB são mostradas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. O gene ilvN codifica a subunidade pequena da acetolactato sintase I (KEGG entrada No. b3670). O gene ilvN (acesso do Banco de Genes No. NC_000913,2; posições de nucleotídeo: 3848825 a 3849115, complemento; Gene ID: 948183) está localizado entre os genes uhpA e ilvB no cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvN e a sequência de aminoácido da subunidade pequena da acetolactato sintase I codificada pelo gene ilvN são mostrados na SEQ ID NO: 3 e SEQ TD NO: 4, respectivamente. O gene ilvl codifica a subunidade grande da acetolactato sintase 111 (KEGG entrada No. b0077). O gene ilvl (acesso do Banco de Genes No. NC 000913.2; posições de nucleotídeo: 85630 a 87354; Gene ID: 948793) está localizado entre os genes leoO c ilvH no cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvl e a sequência de aminoácido da subunidade grande da acetolactato sintase III codificada pelo gene ilvl são mostrados na SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente. O gene ilvH codifica a subunidade pequena da acetolactato sintase III (KEGG entrada No. b0078). O gene ilvH (acesso do Banco de Genes No. NC 000913,2; posições de nucleotídeo: 87357 a 87848; Gene ID: 947267) está localizado entre os genes ilvl e fruR no cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvH e a sequência de aminoácido da subunidade pequena da acetolactato sintase III codificada pelo gene ilvH são mostradas na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente. O gene ilvY codifica o regulador duplo da transcrição da ligação de DNA IlvY (regulador transerieional da família LysR, regulador positivo para ilvC) (KEGG, Kyoto Enciclopédia of Genes and Genomes, entrada No. B3773). O gene ilvY (acesso do Banco de Genes No. NC 000913,2; posições de nucleotídeo: 3954950 a 3955843, complemento; Gene ID: 948284) está localizado entre os genes ilvA e ilvC, ambos no filamento oposto, no cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvY e a sequência de aminoácido da proteína IlvY codificada pelo gene ilvY são mostrados na SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. O gene ilvG é um pseudogene (KEGG entrada No. b4488). O gene ilvG (acesso do Banco de Genes No. NC_000913,2; posições de nucleotídeo: 3948583 a 3950227; Gene ID: 2847699) está localizado entre os genes ilvX e ilvMno cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvG é mostrada na SEQ ID NO: 31.0 gene ilvG pode codificar a subunidade grande da acetolactato sintase II dado que o mesmo contém a substituição do códon TGA no lugar do códon AAT na posição 982 a 984 do início do gene, ou mutações como descritas em Lawther R. P. et al., J. Bacteriol., 1982, 159: 294-298. A sequência de aminoácido da subunidade grande da acetolactato sintase II codificada pelo gene ilvG no qual o códon EGA é substituído pelo códon AAT na posição 982 a 984 é mostrada na SEQ ID NO: 32. O gene ilvM codifica a subunidade pequena da acetolactato sintase II (KEGG entrada No. b3769). O gene ilvM (acesso do Banco de Genes No. NC_000913,2; posições de nucleotídeo: 3950224 a 3950487; Gene ID: 948279) está localizada entre os genes ilvG e i.lvE no cromossoma da E. coli K-12. A sequência de nucleotídeo do gene ilvM e a sequência de aminoácido da subunidade pequena da acetolactato sintase II codificada pelo gene ilvM são mostradas na SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, respectivamente.

Visto que pode haver alguma diferença nas sequências de DNA entre os gêneros ou cepas da família Enterobacteriaceae, os genes ilvB, ilvN, ilvl, ilvH, ilvG e ilvM que codificam a acetolactato sintase e o regulador transcricional que codifica o gene ilvY não são limitados aos genes mostrados nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 31, 33 e 9, mas podem incluir genes que são sequências de nucleotídeo variantes de ou homólogos às SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 31, 33 e 9 e que codificam variantes das proteínas IlvB, IlvN, Ilvl, IlvH, IlvG, IlvM e IlvY. A frase “uma proteína variante” pode significar uma proteína que tem uma ou várias mudanças na sequência comparada com as SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 32, 34 e 10, sejam elas substituições, deleções, inserções, e/ou adições de resíduos de aminoácido, mas ainda mantêm uma atividade similar àquela das proteínas IlvB, IlvN, Ilvl, IlvH, IlvG, IlvM e IlvY, respectivamente. O número de mudanças na proteína variante depende da posição ou do tipo de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína. Pode ser, mas não é estritamente limitada a, 1 a 30, em um outro exemplo 1 a 15, em um outro exemplo 1 a 10 e em um outro exemplo 1 a 5, nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 32, 34 e 10. A substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido podem ser uma mutação(ões) conservativa(s) de modo que a atividade e traços da proteína variante sejam mantidos e são similares a aqueles das proteínas IlvB, IlvN, Ilvl, IlvH, IlvG, IlvM e IlvY. A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. Os exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de Ser ou Thr no lugar de Ala, substituição de Gin, His ou Lys no lugar de Arg, substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp no lugar de Asn, substituição de Asn, Glu ou Gin no lugar de Asp, substituição de Ser ou Ala no lugar de Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg no lugar de Gin, substituição de Asn, Gin, Lys ou Asp no lugar de Glu, substituição de Pro no lugar de Gly, substituição Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr no lugar de His, substituição de Leu, Met, Vai ou Phe no lugar de Ile, substituição de Ile, Met, Vai ou Phe no lugar de Leu, substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg no lugar de Lys, substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe no lugar de Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu no lugar de Phe, substituição de Thr ou Ala no lugar de Ser, substituição de Ser ou Ala no lugar de Thr, substituição de Phe ou Tyr no lugar de Trp, substituição de His, Phe ou Trp no lugar de Tyr e substituição de Met, Ile ou Leu no lugar de Vai.

Para avaliar o grau de proteína ou homologia de DNA, vários métodos de cálculo podem ser usados, tais como pesquisa BLAST, pesquisa FASTA e método ClustalW. A pesquisa BLAST (Ferramento de Procura de Alinhamento Local Básico, wwov.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) é o algoritmo de procura heurístico utilizado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn e tblastx; estes programas atribuem significância para as suas descobertas usando os métodos estatísticos de Samuel K. e Altschul S. F. (“Methods for assessing thc statistical signiflcance of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc. Nall. Acad. Sei. USA, 1990, 87: 2264-2268; “Applications and statisties for múltiplo high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90: 5873-5877). O programa de computador BLAST calcula três parâmetros: contagem, identidade e similaridade. O método de pesquisa FASTA é descrito por Pearson W. R. (“Rapid and sensitive comparation of sequence with FASTP e FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183: 63-98). O método ClustalW é descrito por Thompson J. D. et al. (“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic AcidRes., 1994, 22: 4673-4680).

Além disso, os genes ilvB, ilvN, ilvl, HvH, ilvG, ilvM e ilvY podem ser sequências de nucleotídeo variantes, a frase “uma sequência de nucleotídeo variante” pode significar uma sequência de nucleotídeo que codifica “uma proteína variante”, a frase “uma sequência de nucleotídeo variante” também pode significar uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições severas com a sequência de nucleotídeo complementar à sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7, 3 1, 33 e 9, ou uma sonda que possa ser preparada a partir da sequência de nucleotídeo sob condições severas contanto que a mesma codifique a acetolactato sintase funcional ou proteína reguladora antes da inativação. “Condições severas” incluem aquelas sob as quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido que tem homologia de não menos do que 70 %, não menos do que 80 %, não menos do que 90 %, não menos do que 95 %, não menos do que 96 %, não menos do que 97 %, não menos do que 98 %, ou não menos do que 99 % seja formado e um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido que tenha homologia mais baixa do que a acima não é formada. Por exemplo, condições severas podem ser exemplificadas pela lavagem uma vez ou mais, ou em um outro exemplo, duas ou três vezes, cm uma concentração salina de 1 x SSC, 0,1 % de SDS, ou em um outro exemplo, 0,1 x SSC, 0,1 % dc SDS a 60° C, ou em um outro exemplo a 65° C. A duração de lavagem depende do tipo de membrana usada para o manchamento e, como uma regra, deve ser a que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana de náilon positivamente carregada Amersham Hybond^-N+ (GE Healthcare) sob condições severas é de 15 minutos. A etapa de lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes. Como a sonda, uma parte da sequência complementar para as sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 31, 33 e 9 também pode ser usada. Uma tal sonda pode ser produzida pela PCR usando oligonucleotídeos como iniciadores preparados com base nas sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 1,3,5, 7, 31, 33 e 9 e um fragmento de DNA que contém a sequência de nucleotídeo como um padrão. O comprimento da sonda é recomendado ser >50 pares de base; o mesmo pode ser adequadamente selecionado dependendo das condições de hibridização e é usualmente de 100 pares de base a 1 kbp. Por exemplo, quando um fragmento de DNA que tem um comprimento de cerca de 300 pares de base é usado como a sonda, as condições de lavagem depois da hibridização podem ser exemplificadas por 2x SSC, 0,1 % de SDS a 50° C, ou a 60° C, ou em um outro exemplo a 65° C.

Como os genes que codificam as proteínas IlvB, IlvN, Ilvl, TlvH, IlvG, IlvM e IlvY da espécie E. coli já foram elucidados (ver acima), as sequências de nucleotídeo variantes que codificam as proteínas variantes das proteínas IlvB, IlvN, Ilvl, IlvH, IlvG, IlvM e IlvY podem ser obtidas pela PCR (reação da cadeia da polimerase; consultar White T. J. et al., Trends Genet., 1989, 5: 185-189) que utiliza iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeo dos genes ilvB, ilvN, ilvl, ilvH, ilvG, ilvM e i/vY. Os genes que codificam as proteínas IlvB, IlvN, Ilvl, IlvH, IlvG, IlvM e IlvY ou suas proteínas variantes de outros microrganismos podem ser obtidos em uma maneira similar. A frase “promotor positivamente regulado autoindutívcl” pode ser um promotor conhecido por aqueles habilitados na técnica. Convencionalmente, um promotor positivamente regulado autoindutível pode significar um promotor que tem: a) uma atividade aumentada conforme o nível de um fator de transcrição ou um ativador aumenta, isto é a regulagem positiva ocorre; e b) nenhuma ou baixa atividade na ausência de um fator de transcrição ou um ativador, entretanto o mesmo é ativado apenas quando a ligação a um fator de transcrição ou um ativador, isto é indutibilidade ocorre; e c) pode ser induzido pelo produto de expressão do gene codificador que é controlado por este promotor, incluído qualquer um dos produtos de expressão pós-translacionalmente modificados, assim como análogos e derivados e complexos com tal produto de expressão, além disso, incluído produtos tais como substâncias individuais ou seus complexos resultantes da atividade do produto de expressão do gene codificador, isto é, a autoindutibilidade ocorre.

Os promotores positivamente regulados autoindutíveis podem ser exemplificados pelo promotor PiivC (SEQ ID NO: 30) (Wek R. C. e Hatfield G. W., J. Biol. Chem., 1986, 261(5): 2441-2450; Opel M. L. e Hatfield G. W., Mol. Microbiol, 2001, 39(1): 191-198) localizado a montante do gene estrutural ilvC, o promotor PcysP localizado a montante da unidade de transcrição cysPUWAM, o promotor PcysK localizado a montante do gene estrutural cysK e o promotor PmetK localizado a montante do gene estrutural metE. O promotor PjivC pode ser regulado pelos complexos indutores IlvY/AL ou IlvY/AHB. Os promotores PcysP e PcysK podem ser regulados pelo complexo autoindutor O-acetil-L-serina/CysB. O promotor PmetR pode ser regulado pelo complexo autoindutor L-homocisteína/MetR. Os promotores positivamente regulados autoindutíveis não são limitados e podem incluir substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de nucleotídeo contanto que a funcionalidade do promotor seja mantida. A frase “promotor autoindutível negativamente regulado” pode significar um promotor conhecido na técnica. Convencionalmente, um promotor autoindutível negativamente regulado pode significar um promotor que tem: a) uma atividade decrescente conforme o nível de um fator de transcrição ou um ativador aumenta, isto é a regulagem negativa ocorre; e b) nenhuma ou atividade baixa na presença de um fator de transcrição ou um ativador, entretanto está se tomando ativado apenas quando uma concentração limiar de um fator de transcrição ou um ativador é obtido, isto é a indutibilidade ocorre; e c) pode ser desregulado pelo produto de expressão do gene codificador que é controlado por este promotor, incluindo qualquer um dos produtos de expressão pós-translacionalmente modificado, assim como análogos e derivados e complexes com tal produto de expressão, além disso, incluindo os produtos resultantes da atividade do produto de expressão do gene codificador, isto é a autoindutibilidade ocorre. Os promotores autoindutíveis negativamente regulados podem ser exemplificados pelos promotores Pi)vy e PcySB· A frase “promotor autoindutível” também pode significar “um promotor autorregulado”, “um promotor autorregulado”, “um promotor autoindutível”, ou outros; independente se o mesmo é positiva ou negativamente regulado. A frase “a regulagem da retroalimentação positiva autoindutível é mediada por um condutor” pode significar que o sistema de expressão é responsável pela síntese de um condutor pela regulagem da expressão de um gene que codifica a enzima que é responsável pela síntese do condutor. O dito condutor pode ligar-se a um complexo de proteína reguIadora/DNA para ativar a tradução do gene que codifica a enzima que é responsável pela síntese do condutor. Assim, está evidente que a funcionalidade do sistema de expressão pode ser mediado por um condutor. A frase “sistema de expressão indutível” pode significar um sistema de expressão em que o nível de transcrição pode ser modulado em pelo menos cerca de 1,5 vezes, ou pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 1 5 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou mais. Um “sistema de expressão indulível” pode abranger qualquer sistema de expressão que possa ser supra-regulado (induzido), por exemplo, por um condutor (tal como 2-acetolactato, 2-acetoidróxi-2-butanoato, arabinose, lactose, IPTG, etc.), um indutor tal como uma proteína reguladora que pertence à família de proteínas do tipo LysR, um estímulo tal como calor, frio, etc., ou condições dc crescimento tais como densidade de célula, acidez (pH), etc. Um “sistema de expressão indutível” também pode abranger qualquer sistema de expressão que possa ser infra-regulado (reprimido), por exemplo, sistemas de expressão que possam ser infra-regulados na adição de um produto químico, uma proteína, estímulos ambientais e outros. A frase “um gene(s) de interesse” pode significar o(s) gene(s), o nível de expressão dos quais deve ser desregulado usando o sistema de expressão. O(s) gene(s) de interesse exemplar(es) pode(m) ser o(s) gene(s) que codifica(m) a(s) proteína(s) envolvida(s) na biossíntese de condutor, ou substrato ou precursor de condutor, ou uma sintase de condutor. Mais especificamente, o(s) gene(s) de interesse exemplar(es) pode(m) ser subunidade(s) grande(s) e/ou pequena(s) de AIIAS I, II e/ou III, ou suas variantes mutantes. O(s) gene(s) de interesse pode(m) ser exemplificado(s) pelos genes do operon ilvBN4 que codificam a AHAS I mutante dessensibilizado para a inhibição da retroalimentação pela L-valina. A “desregulagem do nível de expressão” de um gene(s) de interesse pode significar atenuação, inativação ou realce da expressão do(s) dito(s) gene(s); o realce da expressão é um exemplo. A frase “região operadora” pode significar um fragmento de DNA que está localizado entre um promotor e um gene estrutural e influencia a transcrição de um gene sob o promotor. As palavras “promotor” e “região promotora” também pode significar um promotor e um operador. A região operadora pode ser exemplificada pelo fragmento de DNA localizado a jusante dos promotores P;ivc ou Pj|vY e à qual o regulador transcricional IlvY pode ligar-se. A frase “um regulador do sistema de expressão de gene(s)”, que também pode ser aludida como “um regulador do sistema de expressão positivamente regulado pela retroalimentação autoindutível” ou “um regulador”, pode significar uma proteína que pertence à família de proteína reguladora do tipo LysR capaz de regular direta ou indiretamente a transcrição dc um gene. As proteínas reguladoras exemplares são mostradas na Tabela 1. A frase “inativação de um gene” pode significar que o gene modificado codifica uma proteína completamente inativa ou não funcional. Também é possível que a região de DNA modificada seja incapaz de expressar naturalmente o gene devido à deleção de uma parte do ou o gene inteiro, mudança da matriz de leitura do gene, introdução de mutação(ões) de sentido errado/não sentido, ou modificação de uma região adjacente do gene, que inclui as sequências que controlam a expressão do gene, tal(is) como promotor(es), realçador(es), atenuador(es), sítio(s) de ligação de ribossoma, etc. A inativação do gene também pode ser realizada por métodos convencionais tais como um tratamento de mutagenênese usando irradiação ultravioleta ou nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina), mutagênese loco-dirigida, rompimento de gene usando recombinação homóloga, ou/e mutagênese de inserção-deleção (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12): 5978-83; Datsenko K. A. e Wanner B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2000, 97(12): 6640-45), também chamado “integração levada ao Red” ou “integração mediada por XRed”. A frase “realce de uma expressão de gene” ou “a expressão de gene é realçada” pode significar que o nível de expressão do gene é mais alto do que aquele nível em uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou precursora tal como E. coli MG1655, E. coli Kl2 (VKPM B-7) ou E. coli B7 AilvGM ΔilvIH cepa P] -ilvBN4, devido a uma modificação genética. Os exemplos de tal modificação incluem aumentar o número de cópia do gene expressado por célula e/ou aumentar o nível de expressão do gene pela modificação de uma região adjacente do gene, que inclui sequências que controlam a expressão de gene, tal como promotores, realçadores, atenuadores, sítios de ligação de ribossoma, etc. e outros exemplos. Os métodos que podem ser usados para realçar a expressão do gene também podem incluir introduzir o gene em um vetor que seja capaz de aumentar o número de cópia do gene em uma bactéria da família Enterobacteriaceae. Os exemplos dos vetores incluem, mas não são limitados a, vetores de faixa de hospedeiro ampla tais como pCMllO, pRK310, pVK.101, pBBR122, pBHRl e outros. O realce da expressão de gene também pode ser obtido pela introdução de cópias múltiplas do gene dentro do DNA cromossômico de uma bactéria, por exemplo, pela recombinação homóloga, integração Mu, ou outros. O realce da expressão de gene também pode ser obtida pela colocação do DNA sob o controle de um promotor potente. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor tac, os promotores PR ou o Pl de fago lambda são todos conhecidos como promotores potentes. Os promotores potentes que fornecem um alto nível de expressão de gene em uma bactéria que pertence à família de Enterobacteriaceae podem ser usados. Altemativamente, o efeito de um promotor pode ser realçado, por exemplo, pela introdução de uma mutação na região promotora do gene no cromossoma bacteriano para se obter uma função promotora mais forte, resultando assim no nível de transcrição aumentado do gene localizado a jusante do promotor. Além disso, é conhecido que a substituição de vários nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e o códon de partida, especialmente as sequências imediatamente a montante do códon de partida, afeta profundamente a traduzibilidade do mRNA. Por exemplo, uma faixa de 20 vezes nos níveis de expressão foi encontrada, dependendo da natureza dos trcs nucleotídeos que precedem o códon de partida (Gold L. et al., Annu. Rev.

Microbiol., 1981, 35: 365-403; Ilui A. et al., EMBO J., 1984, 3: 623-629). O uso dc um promotor potente pode ser combinado com a multiplicação de cópias de gene. O número de cópias, a presença ou ausência do gene e/ou genes de operon podem ser medidos, por exemplo, pela restrição do DNA cromossômico seguido pelo Southern blotting usando uma sonda com base na sequência de gene, hibridização in situ na fluorescência (FTSH) e outros. O nível do gene e/ou a expressão do gene de operon podem ser medidos por vários métodos conhecidos que incluem Northern blotting, RT-PCR quantitativa e outros. Além disso, o nível de expressão de gene pode ser determinado pela medição da quantidade de mRNA transcrito a partir do gene usando vários métodos bem conhecidos, que incluem Northern blotting, RT-PCR quantitativa c outros. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida pelos métodos conhecidos que incluem SDS-PAGE seguida pelo ensaio de imunomanchamento (análise de Western blotting) e outros.

Os métodos para a preparação de DNA plasmídico, digestão, ligação e transformação de DNA, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e outros podem ser métodos comuns bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.”, Cold Spring FTarbor Laboratory Press (1989). Os métodos para a clonagem molecular e expressão de gene heterólogo são descritos em Bernard R. Glick, Jack J. Pastemak e Cheril L. Patten, “Molecular Biotechnology: principies and applications of recombinant DNA”, 4a ed., Washington, D.C: ASM Press (2009); Evans Jr., T. C. e Xu M. Q., “Heterologous gene expression in E. coli \ Ia ed., Humana Press (201 1). A frase “a atividade de uma enzima codificada pelo gene é realçada” pode significar que a atividade da enzima por célula é mais alta do que aquela em uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou uma precursora. Por exemplo, a atividade realçada pode significar que o número de moléculas das enzimas codificadas pelo gene por célula ou a atividade específica por molécula de enzima é aumentada e assim por diante. A cepa K-12 da E. coli do tipo selvagem exemplar que contém a acetolactato sintase do tipo selvagem pode ser usada para comparação. A frase “um trajeto biossintético”, que também pode ser aludida como “um trajeto metabólico” ou “um trajeto bioquímico”, pode significar um conjunto de reações (bio)químicas anabólicas ou catabólicas para converter uma espécie de biomolécula em uma outra, espécie de biomolécula mais madura para um produto final ou metabólito úteis desejados. A frase “um trajeto biossintético” está usualmente evidente para uma pessoa habilitada na técnica. O produto final desejado pode ser L-aminoácido, nucleosídeo, nucleotídeo, co-fator, álcool inferior ou superior, ácido orgânico, seus derivados, proteína e assim por diante. A frase “substrato” pode significar qualquer substância química, composto ou espécie bioquímica que pode ser convertida ou é intencionada a ser convertida em uma outra substância, composto ou espécie bioquímica pela ação de uma enzima. A frase “substrato” pode incluir não apenas um único composto, mas também combinações de compostos tais como soluções, misturas e outros materiais que contenham pelo menos um substrato, ou seu(s) derivado(s). A frase “substrato” também pode significar compostos que fornecem uma fonte de carbono adequada para o uso como um material de partida, por exemplo, qualquer biomassa derivada de açúcar, metabólitos intermediários ou de produto final usados em um trajeto associado com um microrganismo metabolicamente engendrado. A substância química, composto ou espécie bioquímica podem ser convertidos no produto final desejado como uma consequência de uma única reação catalisada por uma enzima. Os exemplos dos substratos inclui piruvato e 2-oxobutanoato. A frase “precursor” pode significar qualquer substância química, composto ou espécie bioquímica a partir do qual uma outra, substância química, composto ou espécie bioquímica mais madura pode ser formada na direção do produto final desejado no trajeto biossintético. Na biossíntese de L-valina os precursores exemplares podem ser piruvato, 2-acetolactato, 3-hidróxi-3-metil-2-oxobutanoato, 2,3-di-idróxi-3- metilbutanoato e 2-oxoisovalerato. Na biossíntese da L-leucina os precursores exemplares podem ser piruvato, 2-acetolactato, 3-hidróxi-3-metil-2-oxobutanoato, 2,3-di-idróxi-3-metilbutanoato, 2-oxoisovalerato, 2-isopropilmalato e assim por diante. Na biossíntese da L-isoleucina os precursores exemplares podem ser L-treonina, piruvato, 2-aceto-2-hidroxibutanoato, 3-hidróxi-3-metil-2-oxopentanoato, 2,3-di-idróxi-3-metilpentanoato e assim por diante.

As frases “substrato” e “precursor” podem ser intercambiáveis. A frase “biomolécula” pode significar qualquer substância química, composto ou espécie bioquímica, ou produto produzido por um microrganismo. As biomoléculas exemplares são proteínas, polissacarídeos, lipídeos, ácidos nucléicos e moléculas pequenas tais como metabólitos primários, metabólitos secundários e produtos naturais. A frase “metabólito útil” pode significar uma substância química, composto ou espécie bioquímica produzidos por um microrganismo com propósitos industriais, ração, alimentícios, farmacêuticos ou outros. O metabólito útil pode ser exemplificado pelos L-aminoácidos de cadeia ramificada tais como L-valina, L-isoleucina e L-leucina; álcoois superiores tais como isobutanol, 2-metil-l-butanol e 3-metil-l-butanol; e ácido orgânico tal como ácido D-pantotênico. O sistema de expressão pode ser introduzido em uma bactéria pelo métodos como descritos acima para realce da expressão de gene, por exemplo, pelo uso de um vetor que contém o sistema de expressão. O sistema de expressão também pode ser introduzido em uma bactéria pela substituição de um promotor nativo de gene(s) de interesse com um promotor autoindutível. A bactéria pode conter um gene que codifica a proteína reguladora do tipo LysR que positivamente regula o promotor. A expressão do gene que codifica a proteína reguladora do tipo LysR pode ser realçada, entretanto, o realce não é essencial. Em um caso que um promotor é o promotor ilvC e uma proteína reguladora do tipo LysR é a proteína IlvY, a expressão endógena do gene ilvYpode ser usualmente suficiente. 3. Método para produzir metabólitos úteis tais como L-aminoácidos, álcoois superiores e ácidos orgânicos O método para produzir metabólitos úteis, mais especificamente L-aminoácidos, especialmente L-aminoácidos de cadeia ramificada tais como L-valina, L-leucina e L-isolcucina; álcoois superiores tais como isobutanol, 2-metil-l-butanol e 3-metil-l-butanol; e ácidos orgânicos tais como ácido D-pantotênico, podem incluir as etapas de cultivar a bactéria em um meio de cultura para permitir que o metabólito útil seja produzido, excretado e acumulado no meio de cultura e coletar o L-aminoácido, álcool superior e/ou ácido orgânico do meio de cultura. O cultivo, coleta e a purificação de metabólitos úteis a partir do meio e outros podem ser realizados em um maneira similar aos métodos de fermentação convencionais em que um aminoácido, álcool superior ou ácido orgânico são produzidos usando um microrganismo. O meio de cultura para a produção de metabólito útil pode ser um meio típico que contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e outros componentes orgânicos como requerido. Como a fonte de carbono, sacarídeos tais como glicose, lactose, galactose, frutose, arabinose, maltose, xilose, trealose, ribose e hidrolisados de amidos; álcoois tais como glicerol, manitol e sorbitol; ácidos orgânicos tais como ácido glicônico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido málico e ácido succínico; e outros podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, os sais de amônio inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio; nitrogênio orgânico tal como de hidrolisados de soja; gás amônia; amônia aquosa; c outros podem ser usados. Vitaminas tais como vitamina Bl, substâncias requeridas, por exemplo, nutrientes orgânicos tais como ácidos nucléicos tais como adenina e RNA, ou extrato de levedura e outros podem estar presentes em quantidades apropriadas, ainda que traços. Outros que não estes, quantidades pequenas de fosfato de cálcio, sulfato de magnésio, íons ferro, íons manganês e outros podem ser adicionados, se necessário. O cultivo pode scr realizado sob condições aeróbicas por 16 a 72 horas, a temperatura da cultura durante o cultivo é controlado dentro de 30 a 45° C, ou dentro de 30 a 37° Ceo pH é ajustado entre 5 e 8, ou entre 6,5 e 7,2. O pll pode ser ajustado pelo uso de um ácido inorgânico ou orgânico ou substância alcalina, assim como gás amônia. Usualmente, um cultivo de 1 a 5 dias leva ao acúmulo do L-aminoácido alvo no meio líquido.

Depois do cultivo, os sólidos tais como células e fragmentos de célula podem ser removidos do meio líquido pela centrifugação ou flltração em membrana e depois o L-aminoácido ou ácido orgânico alvos podem ser recuperados do líquido de fermentação por qualquer combinação de técnicas convencionais tais como concentração, cromatografia de troca iônica e cristalização. Os álcoois superiores podem ser recuperados do meio de cultura bruto, por exemplo, pelo método de destilação seguido pela purificação usando destilação ou técnicas cromatográficas.

Exemplos A presente invenção será mais precisamente explicada abaixo com referência aos Exemplos não limitantes que seguem.

Exemplo 1: Construção da unidade de expressão regulada pelos ácidos acetoidróxi e análise da sua expressão usando o aene repórter lacZ sob vários fundos aenéticos A transcrição dos genes ilvYC foi bem caracterizada (Rhee K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999, 96(25): 14294-14299; Opel M. L. e Hatfíeld G. W. Mol. Microbiol., 2001, 39(1): 191-198). A possibilidade para usar o promotor do gene ilvC para sistema de expressão metabolicamente regulado foi estudada. Com este objetivo, primeiramente, o gene cat foi introduzido a jusante do gene ilvYno cromossoma da cepa MG 1655 da E. coli (ATCC 47076) usando a integração mediada por ZRed. O fragmento de DNA que carrega o cassete EattL-cat-YattR foi amplificado pela PCR (reação da cadeia da polimerase) usando os iniciadores de oligonucleotídeo PI (SEQ ID NO: 11) para a região ilvY-attL e P2 (SEQ ID NO: 12) para a região attR-ilvY e o plasmídeo pMWl \S-}^attL-cat-XattR (Katashkina Zh.T. et al., Mol. Biol. (Mosk.), 2005, 39(5): 823-831) como o padrão. O fragmento de DNA obtido foi introduzido na cepa MG1655/pKD46 da E. coli pela eletrotransformação usando o eletroporador “Bio-Rad” (USA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Como um resultado, o transformante resistente ao cloranfenicol MG1655cat-ilvY da E. coli que abriga o marcador de resistência de cloramfenicol (Xa.ttL-cat-YattR, CmR) no cromossoma a montante o gene ilvY foi obtido. O plasmídeo recombinante pKD46 (Datsenko K. A. e Wanner B. L., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 2000, 97: 6640-6645) com o réplicon sensível à temperatura foi usado como o doador dos genes derivados do fago λ responsável pelo sistema de recombinação mediado por λRed. A cepa MG 1655 de E. coli que contém o plasmídeo recombinante pKD46 pode ser obtida da E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA, o número de acesso é CGSC7669. Depois da integração do plasmídeo pKD46 na cepa MG 1655 da E. coli, a cepa MG1655/pKD46 da E. coli foi obtida.

Em segundo lugar, o fragmento cat-ilvY-PilvC que inclui XattL-cat-YattR, o gene ilvYe a região intergênica ilvY-ilvC com o promotor Pj|Vc foi amplificada pela PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeo P3 (SEQ ID NO: 13) para a região attL-lacZ e P4 (SEQ ID NO: 14) para a região ilvCp- lacZ e o cromossoma da cepa MG1655cat-i.lvY E. coli como o padrão. O fragmento de PCR obtido foi inserido na região de cromossoma MG1655/pKD46 da E. coli a montante do gene lacZ por meio da integração mediada por kRed. Como um resultado, a cepa MG 1 655cat-ilvY-P,]vC-/acZ da E. coli foi obtida. As colônias resistentes a CmR foram selecionadas nas placas que contém o caldo lisogênico (Sambrook, J. e Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press), ágar 1,5 % e cloramfenicol 40 mg/1. A inserção foi verificada pela PCR. Para este propósito, as colônias que cresceram dentro de 24 h foram testadas quanto a presença do fragmento cat-ilvY-P-úvC~lacZ ao invés do gene lacZ nativo pela PCR usando iniciadores P13 (SEQ ID NO: 23) e P14 (SEQ ID NO: 24). Para este propósito, uma colônia recém isolada foi colocada em suspensão em 20 μΐ de água e depois 1 μΐ de suspensão obtida foi usada para a PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 94° C seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 94° C por 30 s, recozendo a 53° C por 30 s e alongamento a 72° C por 3 min; e o alongamento final por 7 min a 72° C. Umas poucas colônias CmR testadas devem conter o fragmento de DNA de 3053 pares de base desejado, confirmando a presença do fragmento de DNA cat-ilvY-PúvC-lacZ ao invés do gene lacZ nativo de 288 pares de base. Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo pKD46 termossensível pelo cultivo a 37° Cea cepa resultante foi chamada como E. coli MG 1655 cat-ilvY-P\\vC-lacZ.

De modo a fornecer dados para o nível de expressão de genes que codificam AHAS 1 {ilvBN e ilvBNA), o nível de expressão do gene lacZ repórter sob o controle do promotor PüvC foi estimado sob vários fundos genéticos (Tabela 2). As cepas, contendo adicionalmente a deleção dos genes i/vAYC, foram também analisadas. A modificação de AilvATC-KmR foi introduzida por meio de transduções PI (Miller J. H. (1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor).

Todas as modificações foram combinadas por meio de transduções PI e as cepas obtidas foram curadas a partir de marcadores “excisáveis” como descrito na EP1942183. A deleção de ilvAYC foi construída em duas etapas usando a integração mediada por kRed. Primeiramente, o fragmento de PCR foi obtido usando os iniciadores de oligonucleotídeo P5 (SEQ TD NO: 15) e P6 (SEQ 1D NO: 16) e o plasmídeo pyP^Jll^-XattL-kan-T^attR (Katashkina Zh.I. (2002) Development of the methods for targeted modification of E. coli genetic loci for the construction of amino-acids-producing strains. PhD Thesis. Moscou) como o padrão que abriga o marcador de resistência à canamicina ("EattL-kan-YattR, KmR). Em segundo lugar, o fragmento obtido foi introduzido na cepa MG1655/pKD46 da E. coli pela eletrotransformação como descrito acima. Os clones resistentes à canamicina com genes ilvAYC deletados foram selecionados nas placas contendo canamicina como descrito acima. Como um resultado, a cepa MG1655A//v4TC::KmR da E. coli foi obtida. A inserção foi verificada pela PCR. Com este objetivo, colônias que cresceram dentro de 24 h foram testadas quanto a presença de fragmento de ÁilvA TC::KmR ao invés dos genes ilvAYC nativos pela PCR usando iniciadores P15 (SEQ 1D NO: 25) e PI 6 (SEQ ID NO: 26). Para este propósito, uma colônia recém isolada foi colocada em suspensão em 20 μΐ de água e depois 1 μΐ da suspensão obtida foi usada para PCR. O perfil de temperatura foi o que segue: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 94° C seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 94° C por 30 s, recozimento a 57° C por 30 s e alongamento a 72° C por 2 min; e o alongamento final por 7 min a 72° C. Umas poucas colônias KmR testadas devem conter o fragmento de DNA de 1761 pares de base desejado, confirmando a presença do fragmento de DNA EilvA TC::KmR ao invés dos genes ilvAYC nativos dc 2926 pares de base. Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo termossensívcl pKD46 pelo cultivo a 37° Cea cepa resultante foi chamada de E. coli MG 1655 AilvA FC: :KmR.

As modificações cat-ilvY-P;|vQ-lac'Z, AilvATC: :KmK, AilvGM, AilvJH, AilvBN, P\-ilvBN e P\ -ilvBN4 foram introduzidas na ccpa Kl2 da E. coli (VKPM B-7) usando transdução Pl. Λ construção de AilvBN, AilvGM, AilvJH e Pi-ilvBN é descrita na EP1942183. A cepa VKPM B-7 (aludida como B7) pode ser substituída por outras subcepas de Kl2 tais como Kl2 MG 1655 que está disponível da American Type Culture Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América) (ATCC47076).

Como um resultado, as cepas listadas na Tabela 2 foram obtidas.

Tabela 2.

Efeito dos vários fundos genéticos sobre a transcrição dependente de P;ivc- Para a medição da atividade de β-galactosidase, as cepas foram cultivadas até a fase logarítmica intermediária em meio M9:TB (9:1, v/v) suplementado com glicose (0,4 %, p/v). O meio para as cepas que têm a deleção ilvAYC e as cepas deficientes em AIIAS foi adicionalmente suplementado com Ile (25 mg/1) e Vai (25 mg/1). A atividade de β-galactosidase foi medida de acordo com o método de Miller (Miller J. II. (1972) Experiments in molecular geneties. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Os dados apresentados na Tabela 2 indicam que o nível de expressão do gene repórter lacZ sob promotor P;ivC varia dentro da faixa de mais do que duas ordens de magnitude dependendo do fundo genético. O nível máximo de expressão foi fornecido pelas cepas de E. coli modificadas para super expressar AHAS I resistente a L-valina (o produto dos genes ilvBN4) ou/e que contém inativado o gene que codifica a isôinero redutase TIvC (ilvC).

Exemplo 2: Construção da cepa mutante B7 AilvGM AilvIH cat-ilvY-Pnvc^ ilvBN4 da E. coli A cepa B7 AilvGM AilvIH PL-ilvBN4 da E. coli foi modificada para conter a unidade de expressão cat-ilvY-Px\vC obtida como descrito no Exemplo 1. O promotor de fago PL a montante dos genes ilvBN4 foi substituído no lugar da região reguladora cat-ilvY-Pi]vC usando a integração mediada de ERed na cepa B7 AilvIH AilvGM PL-ilvBN4 da E. coli (a construção desta cepa é descrita na EP1942183). Para este propósito, o fragmento de DNA que contém o cassete de expressão de DNA cat-ilvY-PilvC flanqueado com as regiões curtas adjacentes ao gene ilvB foi amplificado pela PCR usando os iniciadores de oligonucleotídeo P7 (SEQ ID NO: 17) e P8 (SEQ ID NO: 18) e o cromossoma da cepa MG1655 cai-ilvY-PlM-lacZ da E. coli como o padrão. O fragmento de PCR obtido foi introduzido pela eletrotransformação na cepa B7 AilvIH AilvGM P| -//v7?A4/pKD4ó da E. coli como descrito acima. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvGM cat-ilvY-P[)Vc-ilvBN4 da E. coli foi obtida, em que o promotor de fago λ PL a montante dos genes de operon ilvBNA que codificam AHAS I resistente à retroalimentação foi substituído com o promotor autoindutível PilvC. A substituição foi verificada pela PCR. Com este objetivo, as colônias que cresceram dentro de 24 h foram testadas quanto a presença do fragmento cat-HvY-Pnvc-ilvBN4, introduzido ao invés do cassete P\-ilvBN4, pela PCR usando iniciadores P17 (SEQ ID NO: 27) e PI 8 (SEQ ID NO: 28). Para este propósito, uma colônia recém isolada foi colocada em suspensão em 20 μΐ de água c depois 1 μΐ da suspensão obtida foi usada para a PCR. O perfil de temperatura foi o que segue: desnaturação inicial de DNA por 5 min a 94° C seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 94° C por 30 s, recozendo a 59° C por 30 s e alongamento a 72° C por 2 min; e o alongamento final por 7 min a 72° C. Umas poucas colônias CmR testadas deve conter o fragmento de DNA de 2865 pares de base desejados, confirmando a presença do fragmento de DNA cat-ilvY-Pilvc-ilvBN4 ao invés da construção \yL-tIvtíN4 inicial de 382 pares de base. Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo termossensível pKD46 pelo cultivo a 37° C e a cepa resultante foi denominada como E. coli B7 AilvGM AilvIH cat-ilvY-F^c-ilvBN4.

Exemplo 3: Propriedades da cepa B7 AilvGM AilvIH cat-ilvY-P:ivr-ilvBN4 mutante da E. coli As células foram cultivadas até a fase logarítmica intermediária em meio M9:LB (9:1, v/v) suplementado com glicose (0,4 %, p/v). A atividade dc AHAS I em extratos de célula bruta foi medida com ou sem a adição de 10 mM de L-Val de acordo com o ensaio descrito em Stormer F. e Umbarger H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, 17(5): 587-592. As médias de experimentos em triplicata são apresentados na Tabela 3. Os dados mostram que a região reguladora cat-ilvY-PnvC fornece o nível aumentado da expressão de AHAS I.

Tabela 3.

Atividade de AI AS I medida em cepas com unidade de expressão cat-ilvY-P\[vc-HvBN4.

Exemplo 4: Produção de L-valina pela cepa B7 AilvGM AilvIH cat-ilvY-Piivr-ilvBN4 da E. coli As cepas B7 AilvGM AilvJH cal-ilvΚ-Ρπν(-ilvBNA modificada e B7 AilvGM AilvJH P]rilvBN4 de controle da E. coli foram cada uma cultivada a 32° C por 18 horas em caldo de Luria-Bertani (também aludido como caldo íisogênico como descrito em Sambrook, J. e Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press). Depois, 0,2 ml da cultura obtida foi inoculado em 2 ml dc um meio de fermentação em tubos de teste de 20 * 200 mm e cultivado a 30° C por 60 horas em um agitador rotativo a 250 rpm.

Composição do meio de fermentação (g/L): Glicose 60,0 com a adição de meio LB: 10 % (v/v) O meio de fermentação foi esterilizado a 116° C por 30 min, exceto que a glicose e o CaC03 foram esterilizados separadamente e como segue: glicose a 110° C por 30 min, CaCOs a 116° C por 30 min. O pH foi ajustado a 7,0 pela solução de KOH.

Depois do cultivo, a L-valina acumulada foi medida usando a cromatografia de camada fina (TLC). As placas de TLC (10 x 20 cm) foram revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil contendo indicador não fluorescente (Sorbpolymer, KrAsnodar, Russian Federation). As amostras foram aplicadas às placas com o aplicador de amostra Linorna 5 da Camag. As placas de Sorbfil foram desenvolvidas com uma fase móvel que consiste de fw-propanolracetato de etila: 25 % de amônia aquisa: água (16:16:5:10, v/v). Uma solução de ninhidrina (2 %, p/v) cm acetona foi usada como o reagente de visualização. Depois do desenvolvimento, as placas foram secadas e escaneadas com o Escaner de TLC 3 da Camag no modo de absorbância com a detecção a 520 nm usando o software winCATS (versão 1.4.2).

Os resultados de 4 fermentações dc tubo de teste independentes são mostrados na Tabela 4. Como pode ser observado a partir da Tabela 4, a cepa B7 AilvGM AilvIH cal· /7vT P,|vC -/7vBN4 modificada da E. coli causou uma quantidade mais alta de acúmulo de L-valina quando comparada com a cepa 137 AilvGM AilvIH P[ -ilvBNA da E. coli precursora. Tabela 4.

Produção de T-valina pela cepa da E. coli modificada. Os valores são médias ± SD, onde SD representa desvio padrão.

Exemplo 5: Construção da cepa B7 AilvGM AilvIH ilvYmacm'e-PilvC-ilVBN4 da E. coli O cassete de expressão /7vT-PilvC-//v5iV4 contém o gene i/vY que codifica o regulador tipo LysR positivo de expressão mediada por PilvC. Portanto, uma cepa que abriga este cassete possui duas cópias do gene ilvY: uma cópia está localizada no seu local nativo no cromossoma e uma outra cópia está localizada a montante do operon ilvBN4. Para elucidar, se o efeito positive do cassete ilvY-PúvC-ilvBN4 é responsável pela duplicação do gene ilvY, o gene ilvY foi inativado no cassete de expressão iIvT-P,:vC-i/vBN4. A sequência de nucleotídeo do gene ilvY foi modificada em um tal modo que, sem considerar a inativação do gene ilvY, a região reguladora dos genes de operon ilvBN4 permaneceu inalterada. Mais especificamente, um fragmento de DNA do comprimento de 31 nucleotídeos foi inserido no gene ilvY do cassete de expressão ilvY~YúvC-ilvBN4 para substituir o quinto códon (GAT) da parte estrutural do gene ilvY pelo códon de “parada” TGA. A inativação do gene IlvY foi realizada como segue.

Primeiramente, o fragmento de PCR que abriga o cassete 'kaítL-cat-J^attR com as regiões adjacentes à parte interna de ilvY foi obtido usando os iniciadores de oligonucleotídeo P9 (SEQ ID NO: 19) e PIO (SEQ ID NO: 20) e o plasmídeo pMiV5-JS como o padrão. O plasmídeo pMlV5-JS foi construído como descrito na EP1942183. As células MG1655/pKD46 da E. coli foram eletrotransformadas com o fragmento de PCR obtido e os transformantes resistentes ao cloranfenicol foram selecionados como descrito acima. Como um resultado, a cepa MG1655 ilvYv.cat da E. coli que contém a inserção do marcador resistente ao cloranfenicol (CmR) na região que codifica ilvY foi obtida. A inserção foi verificada pela PCR como segue. As colônias qe cresceram dentro de 24 h foram testadas quanto a presença de fragmento de DNA ilvYv.cat ao invés do gene ilvY nativo pela PCR usando iniciadores PI 1 (SEQ ID NO: 21) e PI2 (SEQ ID NO: 22). para este propósito, uma colônia recém isolada foi colocada em suspensão em 20 μΐ de água e depois 1 μΐ da suspensão obtida foram usados para a PCR. O perfil de temperatura foi o que segue: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 94° C seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 94° C por 30 s, recozendo a 55° C por 30 s e alongamento a 72° C por 1 min e 30 s; e o alongamento final por 7 min a 72° C. Umas poucas colônias CmR testadas devem conter o fragmento de DNA de 1603 pares de base desejado, confirmando a presença do fragmento de DNA ilvYv.cat ao invés da região ilvY nativa de 297 pares de base. Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo termossensível pKD46 pelo cultivo a 37° C e a cepa resultante foi denominada como E. coli MG 165 5 ilvYv.cat.

A cepa B7 ΔilvGM AilvIH cat-ilvY-Y\u.c-HvBN4 da E. coli (ver o Exemplo 2) foi curada a partir do marcador CmR (caí) pela introdução transitória do plasmídeo pMWts-EInt/Xis (Katashkina Zh. 1. et ai., Mol. Biol. (Mosc.), 2005, 39(5): 823-831) resultando na cepa B7 ΔilvGM AilvIH ilvY-Pi,vc-//v£A4 da E. coli sem marcador. Os genes ilvAYC foram deletados da cepa B7 ΔilvGM AilvIH /7 v E- P, | vC - /7vBN4 da E. coli pela transdução de PI como descrito acima usando E. coli MG 1655 A//v^yC::KmR (ver Exemplo 1) como um doador. Que clonou os genes /.Red no plasmídeo pKD46, a cepa B7 AilvGM AilvIH il v F- P, | vV-ilvBN4 AilvAYC:: KmR da E. coli foi eletrotransfoi-mada pelo fragmento de PCR que abriga o cassete 7xxttL-cat-XattR com as regiões adjacentes à parte interna ilvY. Este fragmento de PCR foi amplificado com os iniciadores de oligonucleotídeo PI 1 (SEQ TD NO: 21) e P12 (SEQ ID NO: 22) e o cromossoma da cepa MG1655 ilvY::cat da E. coli como o padrão. Como um resultado, a cepa B7 AilvGM AilvIH AilvA FC: :KmR ilvY::cat-P\\vc~ilvBNA da E. coli foi obtida, que foi usada ainda como uma cepa doadora para transduzir o cassete ilvYv.cat-Y^c-ilvBNA na cepa B7 AilvGM AilvIH ilvY-PúvC-ilvBN4 da E. coli. A transdução de PI foi realizada como descrita acima. A verificação do cassete ilvYwcat-Pw^c-ilvBNA foi realizada pela PCR. Com este objetivo, as colônias que cresceram dentro de 24 h foram testadas quanto a presença do fragmento de DNA ilvY::cat-Pnvc-ilvBN4 ao invés do cassete ilvY-P\\vc-ilvBN4 pela PCR usando iniciadores PI 1 (SEQ 1D NO: 21) e P19 (SEQ 1D NO: 29). Para este propósito, uma colônia recém isolada foi colocada em suspensão em 20 μΐ de água e depois 1 μΐ da suspensão obtida foi usado para a PCR. O perfil de temperatura foi o que segue: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 94° C seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 94° C por 30 s, recozendo a 58° C por 30 s e alongamento a 72° C por 2 min; e o alongamento final por 7 min a 72° C. Umas poucas colônias CmR testadas devem conter o fragmento de DNA de 1654 pares de base desejados, confirmando a presença do fragmento de DNA ilvYv.cat-P\\wc-ilvBN4 ao invés da construção inicial ilvY-Pl]vC-UvBN4 de 339 pares de base. Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo termossensível pKD46 pelo cultivo a 37° Cea cepa resultante foi denominada como E. coli B7 AilvGM AilvIH AilvA KC::KmR ilvY::cat-P\\yi -ilvBN4. Esta cepa foi usada ainda como uma cepa doadora para transduzir o cassete ilvY:\cat-Pnvc-ilvBN4 na cepa B7 AilvGM AilvIH ilvY-PúvC-ilvBN4 da E. coli como descrito acima. Como um resultado, a cepa B7 AilvGM AilvIH ilvY::cat-P-l\vc-ilvBNA da E. coli foi obtida que possui apenas uma cópia ativa do gene ilvY localizada no seu local nativo devido à inativação da cópia de gene ilvY no cassete UvY::cat-P\\wc-ihBNA como descrito acima. O gene cat foi eliminado usando a introdução transitória do plasmídeo pMWts-klnt/Xis. Como um resultado, a cepa B7 AilvGM AilvIH zYvXnactlvc-PilvC-ilvBNA da E. coli sem marcador foi obtida.

Exemplo 6: Produção da L-valina pela cepa B7 AilvGM AilvIH z7vXnatlva-Piivc-ilvBNA da E. coli A B7 AilvGM AilvIH UvY^-P^ilvBNA E. coli modificada e as cepas B7 AilvGM AilvIH Py_-ilvBNA e B7 AilvGM AilvIH cat-ilvY-P^-ilvBNA de controle foram cada uma cultivadas a 32° C por 18 horas em caldo Luria-Bertani (também aludida como caldo lisogênico como descrito em Sambrook, J. e Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press). Depois, 0,2 ml da cultura obtida foi inoculada em 2 ml de um meio de fermentação em tubos de teste 20 x 200 mm e cultivados a 30° C por 60 horas em um agitador rotativo a 250 rpm. A composição do meio de fermentação (g/L): Glicose 60,0 (NH4)2S04 15,0 KH2P04 1,5 MgS04 * 7H20 1,0 Tiamina-HCl 0,1 CaC03 25, com a adição de meio LB: 10 % (v/v) O meio de fermentação foi esterilizado a 1 16° C por 30 min, exceto que a glicose e CaC03 foram esterilizados separadamente e como segue: glicose a 1 10° C por 30 min, CaC03 a 116° C por 30 min. O pH foi ajustado a 7,0 pela solução de KOH.

Depois do cultivo, a L-valina acumulada foi medida usando a cromatografía de camada fina (TLC). Placas TLC (10 x 20 cm) foram revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfd que contém indicador não fluorescente (Sorbpolymer, KrAsnodar, Russian Federation). As amostras foram aplicadas às placas com o aplicador de amostra 5 Linoma da Camag. As placas Sorbfil foram desenvolvidas com uma fase móvel que consiste deof fvo-propanol:acetato de etila:25 % de amônia aquosa: água (16:16:5:10, v/v). Uma solução de ninhidrina (2 %, p/v) em acetona foi usada como o reagente de visualização. Depois do desenvolvimento, as placas foram secadas e escaneadas com o Escaner de TLC 3 da Camag no modo de absorbância com detecção a 520 nm usando o software winCATS (versão 1.4.2).

Os resultados de 4 fermentações em tubo de teste independente são mostrados na Tabela 5. Como pode ser observado a partir da Tabela 5, a cepa B7 ΔilvGM AilvIH //vTnal,va-PjlvC-//vff/V4 da E. coli modificada causou uma quantidade mais alta de acúmulo de L-valina quando comparada com a cepa precursora B7 AilvGM AilvIH V\-ilvBNA da E. coli. Além disso, a inativação do gene ilvY na cepa B7 AilvGM AilvIH cat-i IvY-P^c-i IvBNA da E. coli não tem influência negativa sobre a produção de L-valina pela cepa. Tabela 5.

Produção de L-valina pela cepa da E. coli modificada. Os valores são média ± SD, onde SD representa desvio padrão.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com referência às suas formas de realização preferidas, estará evidente a uma pessoa habilitada na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes utilizados, sem divergir do escopo da invenção. I odas as referências aqui citadas são incorporadas como uma parte deste pedido por referência. (Explicação da Listagem de Sequência) SEQ ID NO: 1: sequência de nucleotídeos de ilvB SEQ ID NO: 2: sequência de aminoácido de uma subunidade grande da acetolactato sintase I do tipo selvagem SEQ ID NO: 3: sequência de nucleotídeos de ilvN SEQ ID NO: 4: sequência de aminoácido de uma subunidade pequena da acetolactato sintase I do tipo selvagem SEQ ID NO: 5: sequência de nucleotídeos de ilvl SEQ ID NO: 6: sequência de aminoácido de uma subunidade grande da acetolactato sintase III do tipo selvagem SEQ ID NO: 7: sequência de nucleotídeos de ilvH SEQ ID NO: 8: sequência de aminoácido de uma subunidade pequena da acetolactato sintase III do tipo selvagem SEQ ID NO: 9: sequência de nucleotídeos de ilvY

SEQ ID NO: 10: sequência de aminoácido de IlvY SEQ ID NOS: 1 1-29: sequência de nucleotídeos de iniciadores SEQ ID NO: 30: sequência de nucleotídeos do promotor Pjivc SEQ ID NO: 31: sequência de nucleotídeos de ilvG

SEQ ID NO: 32: sequência de aminoácido da subunidade grande da acetolactato sintase II

SEQ ID NO: 33: sequência de nucleotídeos de HvM

SEQ ID NO: 34: sequência de aminoácido da subunidade pequena da acetolactato sintase II

Claims (23)

1. Sistema de expressão de gene, caracterizado pelo fato de que compreende: o mecanismo transcricional regulado pela proteína do tipo LysR que compreende um promotor e um operador do qual a expressão é positivamente regulada pela proteína reguladora do tipo LysR e um condutor, e um(ns) gene(s) de interesse ao(s) qual(is) o dito mecanismo transcricional é operavelmente ligado, em que o(s) gene(s) de interesse codifica(m) uma proteína(s) envolvida(s) na biossíntese do dito condutor, um substrato, ou um precursor do dito condutor, por meio do qual a regulagem da retroalimentação positiva autoindutível do dito sistema de expressão é mediada pelo dito condutor.

2. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito sistema é de uma bactéria que pertence à família Eníerobacteriaceae ou Pseudomonadaceae.

3. Sistema de expressão de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito sistema é de uma bactéria que pertence à família Eníerobacteriaceae.

4. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito sistema é de uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia.

5. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria pertence às espécies Escherichia coli.

6. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito sistema é do trajeto biossintético de L-aminoácido selecionado do grupo que consiste de L-aminoácidos de cadeia ramificada, L-lisina, L-cisteína, L-metionina e L- triptofano.

7. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito sistema é do trajeto biossintético dos L-aminoácidos de cadeia ramificada.

8. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o promotor c o promotor P;ivc> a dita proteína reguladora do tipo LysR é a proteína IlvY e o condutor é ácido 2-acetolactato, ácido 2-aceto-2-hidroxibutírico ou sais destes.

9. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o condutor é ácido 2-acetolático ou um sal deste.

10. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o(s) dito(s) gene(s) de interesse codifica(m) a acetoidróxi-ácido sintetase.

11. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os ditos genes de interesse codificam proteínas selecionadas do grupo que consiste de: (A) combinação do Al e A2 que seguem: (Al) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ 1D NO: 2, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de A2; e (A2) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de Al; (B) combinação do BI e B2 que seguem: (B 1) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de B2; e (B2) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de B1; e (C) combinação do Cl e C2 que segue: (Cl) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 32; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 32, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de C2; e (C2) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 34; ou uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 34, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da acetolactato sintase com uma proteína de Cl.

12. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dita acetoidróxi-ácido sintetase é uma acetolactato sintase mutante I resistente à inibição de retroalimentação pela L-valina.

13. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito operador compreende uma região à qual a dita proteína reguladora do tipo LysR liga.

14. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a dita proteína reguladora do tipo LysR é selecionada do grupo que consiste de: (D) uma proteína que compreende a sequência de aminoácido da SEQIDNO: 10; e (E) uma proteína variante que compreende a sequência de aminoácido da SEQ 1D NO: 10, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e tem atividade da proteína reguladora do tipo LysR.

15. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito promotor compreende: (F) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30; ou (G) um DNA variante que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30, mas que inclui a substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de nucleotídeo e tem atividade da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30.

16. Bactéria que produz L-aminoácido pertencente à família Enterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria foi modificada para conter o sistema de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.

17. Bactéria de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria contém um gene que codifica a proteína reguladora do tipo LysR.

18. Bactéria de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria pertence ao gênero Escherichia.

19. Bactéria de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria pertence à espécie Escherichia coli.

20. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 19, caracterizada pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-aminoácido de cadeia ramificada.

21. Bactéria de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o dito L-aminoácido dc cadeia ramificada é selecionado do grupo que consiste de L-valina, L-leucina e L-isoleucina.

22. Método para produzir um L-aminoácido de cadeia ramificada, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar a bactéria como definida na reivindicação 20 em um meio de cultura de modo que o dito L-aminoácido de cadeia ramificada seja acumulado no meio de cultura; e (ii) coletar o dito L-aminoácido de cadeia ramificada do meio de cultura.

23. Método para produzir o L-aminoácido de cadeia ramificada de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido de cadeia ramificada é selecionado do grupo que consiste de L-valina, L-leucina e L-isoleucina.