JP2005073696A

JP2005073696A - 不活化したｎｉｒオペロンを有する腸内細菌科の細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法

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Publication number: JP2005073696A
Application number: JP2004240795A
Authority: JP
Inventors: Leonid Romanovich Ptitsyn; ロマノヴィッチプチツィンレオニド; Irina Borisovna Altman; ボリソヴナアリトマンイリナ; Sergey Vasil'evich Smirnov; ヴァシリエヴィッチスミルノフセルゲイ; Natalia Nikolaevna Samsonova; ニコラエヴナサムソノヴァナタリヤ; Vladimir Yurievich Ermishev; ユリエヴィッチエルミシェフヴラジミル
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2005-03-24
Also published as: RU2003126289A; US20050069994A1; EP1510582A1; RU2276686C2

Abstract

【課題】Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を向上させ、それらの株を用いてＬ−アミノ酸を製造する方法を提供する。
【解決手段】腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌であって、ｎｉｒオペロンが不活化するように改変されている細菌を培地で培養し、培地から蓄積されたＬ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物産業、詳しくは、ｎｉｒＢＤＣ−ｃｙｓＧ遺伝子を含むｎｉｒオペロンが不活化されている腸内細菌科の細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。

エシェリヒア・コリは（Escherichia coli）、ｎｒｆＡＢＣＤＥＦＧおよびｎｉｒＢＤＣオペロンによりコードされる２種の生化学的に異なる亜硝酸レダクターゼ酵素を有している（非特許文献１）。ｎｉｒオペロンの基礎発現レベルはｎｒｆオペロンのそれよりも約８倍高く、硝酸塩を加えることにより２１倍増加し得る（非特許文献２）。ｎｉｒＢＤＣオペロンの転写は、単一のプロモーターから駆動され、発現は２種の環境的シグナル、すなわち、生育培地中の酸素の非存在、および亜硝酸または硝酸塩イオンの存在により、活性化される（非特許文献３、非特許文献４）。また、ｃｙｓＧ遺伝子は、ｎｉｒＢＤＣオペロンとともに共転写（co-transcribe）されるが、第二の構成プロモーターが、ｃｙｓＧ遺伝子の上流１００ｂｐ未満に位置している（非特許文献５)。

ｃｙｓＧ遺伝子の産物、シロヘム合成酵素は、ヘム補因子であるシロヘム（これは硫酸および亜硝酸還元プロセスで亜硫酸レダクターゼおよび亜硝酸レダクターゼ酵素に使用される）の合成を触媒する。

ＮｉｒＢＤＣ亜硝酸レダクターゼもまた、ＮＡＤＨを電子供与体として使用して細胞質中の亜硝酸塩を還元する、シロヘム含有酵素である（非特許文献６、非特許文献７）。ｎｉｒＢ遺伝子を欠損したエシェリヒア・コリ変異株は、ＮＡＤＨ依存性亜硝酸レダクターゼの活性を欠き、嫌気的生育の間にゆっくりと亜硝酸塩を還元する。これらの変異株は生育にシステインを必要とする（非特許文献８）。

ｃｙｓＧ変異株の栄養要求性は、それらがＣｙｓＩＪ酵素の補因子であるシロヘムを生成できないためである。シロヘム依存性亜硫酸還元は、硫酸塩または亜硫酸塩が硫黄源としてシステイン、メチオニン、および他の硫黄含有代謝産物の合成に用いられるときはいつでも、それらの代謝産物の合成に必要とされる（非特許文献９、非特許文献１０）。シロヘムはまた、亜硝酸レダクターゼ（ＮｉｒＢ）にも必要であるため、ｃｙｓＧ変異株はまた、亜硝酸塩の還元が不完全である。

ｎｉｒプロモーター（Ｐ_nir）は、ＦＮＲ結合部位（位置−４１．５）、ＮａｒＬ／ＮａｒＰ結合部位（位置−６９．５）（非特許文献１１、非特許文献１２）、Ｆｉｓ結合部位（−１４２、＋２３）、ＩＨＦ結合部位（−８８）、およびヌクレオイド（核様体）関連タンパク質であるＨ−ＮＳ（ｎｉｒプロモーターの上流の配列に優先的に結合する）を含んでいる。

ｎｉｒプロモーターは、次の３つのＤＮＡ結合タンパク質、Ｆｉｓ、ＩＨＦ、およびＨ−ＮＳにより抑制される。ｎｉｒプロモーター発現の活性化は、ＦＮＲタンパク質（嫌気的に誘発される転写アクチベーター）と、ＮａｒＬまたはＮａｒＰタンパク質（亜硝酸塩および硝酸塩により誘発される転写アクチベーター）の両方に共依存（co-dependent）している。嫌気的条件下では、ＦＮＲは部位−４１．５に結合して、ｎｉｒオペロンの転写を活性化する。ｎｉｒプロモーターは、培地中の亜硝酸または硝酸イオンの存在によりさらに調節される。これは、２つのよく似た応答−制御ファミリー転写因子、ＮａｒＬおよびＮａｒＰにより達成される（非特許文献１３により総説される）。亜硝酸塩または硝酸
塩に応答して、ＮａｒＬおよびＮａｒＰは、膜結合センサーであるリン酸化酵素タンパク質、ＮａｒＸおよびＮａｒＱによりリン酸化される。次いで、リン酸化したＮａｒＬおよびＮａｒＰは、標的プロモーターの特異的七量体配列に結合し、そしてこれらのプロモーターで転写開始を上方または下方のいずれかに調節する（例えば、非特許文献１４、非特許文献１５を参照）。

Ｆｉｓ、ＩＨＦ、およびＨ−ＮＳの連携は、ｎｉｒプロモーターＤＮＡが、ＦＮＲ依存性転写活性化を抑制する高次核タンパク質構造に隔絶されることを示唆している。ＮａｒＬおよびＮａｒＰは、ＩＨＦ媒介性およびＦｉｓ媒介性抑制の両方を軽減し得るが、Ｈ−ＮＳ媒介性抑制を打ち消すことはできない（非特許文献１６）。

ｎｉｒＢ誘導に必要な高亜硝酸塩条件は、解毒におけるＮｉｒＢ酵素に提唱されている役割と一致する（非特許文献１７）。ＮｉｒＢ酵素について第二の妥当と思われる役割は、過剰な還元等量（reducing equivalent）が細胞内に存在する条件下で、ＮＡＤＨを酸化することによりそれを再生させることである。そのような条件は、ＮａｒＧ硝酸レダクターゼ複合体を介して硝酸塩依存性呼吸により十分なエネルギーが生成される場合に生じる。したがって、ＮｉｒＢ酵素の存在は、細胞が、ＮＡＤＨ−ＮＡＤ再生のための無駄なサイクルを使用することにより、亜硝酸呼吸経路から炭素異化作用を効果的に切り離すことを可能にする（非特許文献１８）。
Cole, J., FEMS Microbiol. Lett. 136:1-11 (1996) Wang, H. and Gunsalus, H.P., J. Bacteriol., 182, No. 20, p. 5813-5822 (2000) Jayaraman et al., J. Mol. Biol., 196, 4:781-8 (1987) Page et al., Arch Microbiol., 154:4:349-54, (1990) Peakman, T. et al, Eur. J. Biochem., 191(2):325-331 (1990) MacDonald, H. and Cole, J., Mol. Gen. Genet., 200:320-334 (1985) Peakman, T. et al, Eur. J. Biochem., 191:315-323 (1990) Cole, J.A. et al, J. Gen. Microbiol. 120:475-483 (1980) Becker, M.A. et al, J. Biol. Chem., 244:2418-2427 (1969) Becker, M.A. and Tomkins, G.M., J. Biol. Chem., 244:6023-6030 (1969) Jayaraman, P.S. et al, Nucleic Acids Res. 17:1 135-45 (1989) Tyson, K.L. et al, Mol. Microbiol., 7:1:151-7 (1993) Darwin, A.J. et al, Mol. Microbiol., 20:3:621-32 (1996) Tyson, K.L. et al., Mol. Microbiol., 13:6:1045-55 (1994) Darwin, A.J. et al., Mol. Microbiol., 25:3:583-95 (1997) Browning D.F. et al, Molecular Microbiology, 37(5), 1258-1269 (2000) Fazzio, T. G., and Roth, J. R., J. Bacteriol. 178:6952-6959 (1996) Wang, H. and Gunsalus, R.P., J. Bacteriol., 182, No. 20, p. 5813-5822 (2000)

しかし、現在までに、Ｌ−アミノ酸の製造を目的としてｎｉｒオペロンを不活化することを記載した報告はない。

本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を向上させることである。本発明のさら
なる目的は、それらの株を用いてＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。

本発明は、腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌であって、ｎｉｒオペロンが不活化するように改変されている細菌を提供する。
また本発明は、前記ｎｉｒオペロンはｎｉｒＢＤＣ遺伝子およびｃｙｓＧ遺伝子を含む、前記Ｌ−アミノ酸生産菌を提供する。
また本発明は、エシェリヒア属に属する前記Ｌ−アミノ酸生産菌を提供する。
また本発明は、前記Ｌ−アミノ酸はＬ−アルギニンである、前記Ｌ−アミノ酸生産菌を提供する。
また本発明は、Ｌ−アルギニンオペロンの発現が増強されるように改変されている前記Ｌ−アミノ酸生産菌を提供する。
また本発明は、前記の細菌を培地で培養し、培地から蓄積されたＬ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供することである。
また本発明は、前記Ｌ−アミノ酸はＬ−アルギニンである、前記の方法を提供する。
また本発明は、前記細菌は、Ｌ−アルギニンオペロンの発現が増強されるように改変されている、前記の方法を提供する。

本発明により、発酵法によるＬ−アルギニン等のＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができる。

前記の目的は、ｎｉｒオペロンを不活化することにより、Ｌ−アルギニンのようなＬ−アミノ酸の生産を増強させ得ることを見い出したことにより達成された。本発明はこうして完成されたものである。
以下、本発明を詳細に説明する。

１．本発明の細菌
本発明の細菌は、ｎｉｒオペロンが不活化するように改変された腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌である。

本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産菌」は、本発明の細菌が培地で培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を生成、蓄積させる能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種に付与又は増強されてもよい。ここで使用される用語「Ｌ−アミノ酸生産菌」はまた、エシェリヒア・コリＫ−１２株のような、細菌の野生型または親株よりも多い量のＬ−アミノ酸を培地中に生成および蓄積し得る細菌を意味し得る。

本発明において使用され得る腸内細菌科（Enterobacteriaceae)の細菌は、特に制限されないが、例えば、Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1）に記載された細菌が含まれる。

腸内細菌科は、エシェリヒア属、エルウィニア（Erwinia）属、プロビデンシア（Providencia）属、およびセラチア（Serratia）属細菌を含む。エシェリヒア属が好ましい。

用語「エシェリヒア属細菌」は、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類される細菌を意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属微生物の例として、エシェリヒア・コリ（E.coli）が挙げられ得る。エシェリヒア・コリは本発明で最も好ましい。

用語「ｎｉｒオペロンが不活化された」あるいは「ｎｉｒオペロンを不活化する」は、改変された標的オペロンの遺伝子が活性が減少した又は活性を持たない変異型タンパク質をコードするように、標的オペロンが改変されることを意味する。オペロンの一部分の欠失、１又は複数のオペロン遺伝子のリーディングフレームのずれ、または１もしくは複数のプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター等のオペロン発現を制御する配列を含むオペロンの隣接領域の改変により、改変されたＤＮＡ領域がオペロンを普通に発現できないということでもよい。ｎｉｒオペロンの発現はｎｉｒＢ遺伝子の上流に位置する単一プロモーターから駆動され、ｃｙｓＧ遺伝子の構成的な基本発現レベルはそれ自身の弱いプロモーターのために、シロヘム合成には不十分である。したがって、ｎｉｒＢ遺伝子の下流に位置する遺伝子をさらに発現させることができないように、ｎｉｒＢ遺伝子のみを不活化させることができる。Ｌ−アルギニン生成における、ｎｉｒＢ遺伝子によりコードされる亜硝酸レダクターゼの役割は依然として不明である。可能性のある説明は、ｎｉｒＢ遺伝子の不活化がｃｙｓＧ遺伝子のｎｉｒＢプロモーターからの転写を妨げ、ｃｙｓＧ遺伝子自身の弱いプロモーターからのｃｙｓＧ遺伝子の発現がシロヘム合成に不十分であるということである。これは、Ｌ−アルギニン生合成経路を誘導するシステイン、メチオニン、および他の含硫黄代謝産物の合成の欠乏を導く。したがって、本発明の一実施形態は、ｃｙｓＧ遺伝子の不活化または破壊を含む。

エシェリヒア・コリのｎｉｒオペロンは、以下の連続的に位置する遺伝子：ｎｉｒＢ、ｎｉｒＤ、ｎｉｒＣ、およびｃｙｓＧを含む。ｎｉｒＢおよびｎｉｒＤ遺伝子は、亜硝酸リダクターゼをコードする。ｎｉｒＣ遺伝子は亜硝酸トランスポーターをコードする。ｃｙｓＧ遺伝子は、シロヘム合成酵素をコードする。ｎｉｒＢ遺伝子（ｇｉ：１６１３１２４４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００９１３．１中番号３４９１６４８〜３４９４１９１）、ｎｉｒＤ遺伝子（ｇｉ：１６１３１２４５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００９１３．１中番号３４９４１８８〜３４９４５１４）、ｎｉｒＣ遺伝子（ｇｉ：１６１３２２３３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００９１３．１中番号３４９４６４０〜３４９５４４６）、およびｃｙｓＧ遺伝子（ｇｉ：１６１３１２４６；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００００９１３．１中番号３４９５４６５〜３４９６８３８）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上ｙｈｆＣとｙｈｆＬのＯＲＦの間に位置する。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｎｉｒオペロンの塩基配列は、受入れ番号ＡＥ０００４１２Ｕ０００９６としても、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。ＭＧ１６５５株のｎｉｒＢ、ｎｉｒＤ、ｎｉｒＣ及びｃｙｓＧ遺伝子を含む塩基配列を配列番号６に示す。ｎｉｒＢ、ｎｉｒＤ、ｎｉｒＣ及びｃｙｓＧ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７、８、９及び１０に示す。ｎｉｒＢ、ｎｉｒＤ、ｎｉｒＣ及びｃｙｓＧ遺伝子の配列番号１０中のコード領域は、それぞれ１３５〜２６７８、２６７５〜３００１、３３７９〜３９３３、及び３９５２〜５３２５である。

遺伝子の不活化は、従来法、例えばＵＶ照射またはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理を使用する変異誘発処理、部位特異的変異法、相同組換えまたは／および「レッド−ドリブンインテグレーション（Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」とも称される挿入−削除（insertion-deletion）変異法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45）を用いた遺伝子破壊等により行われ得る。

エシェリヒア・コリ以外の腸内細菌科の細菌のｎｉｒオペロンも、エシェリヒア・コリのｎｉｒオペロン断片、又はエシェリヒア・コリのｎｉｒオペロンのホモログであり得る固有のｎｉｒオペロン断片を用いた相同組換えにより不活化することができる。そのようなｎｉｒオペロンホモログは、エシェリヒア・コリのｎｉｒオペロンとそれぞれのコード
領域について７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有し得る。

Ｌ−アルギニン生産菌
ｎｉｒオペロンを不活化する親株としては、Ｌ−アルギニン生産菌が含まれる。

Ｌ−アルギニンを生産するエシェリヒア属細菌には、エシェリヒア・コリ２３７株（ＶＫＰＭＢ−７９２５）および変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導株（ロシア特許出願第２００１１１２８６９号）、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子が導入されたアルギニン生産株（特開昭５７−５６９３）等が含まれるが、それらに限定されない。
２３７株は、ピリミジンアナログである６−アザウラシルに耐性な変異株であり、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いてエシェリヒア・コリＫ１２ｉｌｖＡ：：Ｔｎ５から誘導された株である。２３７株は、２０００年４月１０日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russia, 117545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）に寄託され、受託番号ＶＫＰＭ
Ｂ−７９２５が付与され、２００１年５月１８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。

本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本質的に有する細菌のｎｉｒオペロンを不活化することにより取得することができる。あるいは、本発明の細菌は、既に不活化したｎｉｒオペロンを有する細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得できる。

プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化およびライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知の通常の方法であってもよい。それらの方法は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 「分子クローニングの実験室手引き、第二版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) などに記載されている。

２．本発明の方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養して培地中にＬ−アミノ酸を生成および蓄積させ、同培地から蓄積したＬ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法である。より具体的には、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養して培地中のＬ−アルギニンを生成および蓄積させ、同培地から蓄積したＬ−アルギニンを回収することを含む、Ｌ−アルギニンの製造法である。

本発明において、培養、培地からのＬ−アミノ酸の回収および精製等は、微生物を用いたアミノ酸の製造法に通常用いられる方法によって行ってもよい。

培養に使用される培地は、培地が、炭素源および窒素源およびミネラル類、そして必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。

炭素源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化の様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。

窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物
のような天然の窒素源が使用され得る。

ミネラル類としては、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用され得る。ビタミンとしては、チアミン、酵母菌抽出物等が使用され得る。

培養は、好ましくは、振盪培養および通気を伴う攪拌培養のような好気的条件下、２０℃〜４２℃、好ましくは３０℃〜３８℃の温度で行われる。培養のｐＨは、通常５〜９の間であり、好ましくは６．５〜７．２の間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１日〜５日間の培養で、培地に目的のＬ−アミノ酸が蓄積する。

培養後、細胞のような固体は、遠心分離または膜濾過により培養液から除去することができ、次いで目的のＬ−アミノ酸がイオン交換、濃縮、および結晶法により回収および精製され得る。

以下、本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してより具体的に説明する。本実施例において、アミノ酸はＬ−体である。

〔実施例１〕不活化したｎｉｒオペロンを有する菌株の構築
ｎｉｒＢ遺伝子の欠失
ｎｉｒＢ遺伝子の欠失は、Datsenko and Wanner（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,
97(12), 6640-6645）により初めて開発され、「Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」と称される方法により構築された。この手順に従って、鋳型プラスミド中の、ｎｉｒＢ遺伝子に隣接する両領域および抗生物質耐性を与える遺伝子と相同な、ＰＣＲプライマーｎｉｒＢＬ（配列番号１）およびｎｉｒＢＲ（配列番号２）を構築した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（NBL Gene Sciences Ltd., UK）（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受入番号Ｘ０６４０３）を、ＰＣＲ反応における鋳型として使用した。以下のようにしてＰＣＲを行った。９５℃で３分間の変性工程、最初の２サイクルのプロファイル:９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒、その後２５サイクルのプロファイル:９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で４０秒、最終工程:７２℃で５分。

得られた９４５ｂｐのＰＣＲ産物（図１、配列番号３）を、アガロースゲル電気泳動で精製し、複製が温度感受性のプラスミドｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のエレクトロポレーションに使用した。プラスミドｐＫＤ４６（Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45）は、アラビノース−誘導性のＰ_araBプロモーターの制御下にあるλＲｅｄ相同組換え系遺伝子（γ、β、エキソ遺伝子）を含む、ファージλ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０２４５９）の２，１５４ヌクレオチド（３１０８８〜３３２４１）のＤＮＡフラグメントを含む。プラスミドｐＫＤ４６は、ＰＣＲ産物をＭＧ１６５５株の染色体中に組込むのに必要である。

エレクトロコンピテント細胞を以下のようにして調製した。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ培地中３０℃で増殖させたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の一晩培養物（night culture）を、アンピシリンおよびＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含む５ｍｌのＳＯＢ培地（Sambrook et al,「分子クローニングの実験室手引き、第二版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で１００倍に希釈した。得られた培養物を３０℃で通気しながらＯＤ₆₀₀が約０．６まで増殖させ、次いで１００倍に濃縮して氷冷した脱イオンＨ₂Ｏで３回洗浄することによりエレクトロコンピテントにした。７０μｌの細胞懸濁液および約１０
０ｎｇのＰＣＲ産物を使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の細胞を、１ｍｌのＳＯＣ培地（Sambrook et al, 「分子クローニングの実験室手引き、第二版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で、３７℃で２．５時間インキュベートし、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含むＬ−寒天培地に蒔いて、３７℃で増殖させてＣｍ^R組換え体を選択した。次いで、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ−寒天培地を用いて４２℃で２継代を行い、そして得られたコロニーのアンピシリンに対する感受性について検査した。

２．ＰＣＲによるｎｉｒＢ遺伝子欠失の検証
Ｃｍ耐性遺伝子（ｃａｔ）でマーキングされた、ｎｉｒＢ遺伝子の欠失を含む変異株を、ＰＣＲで検証した。遺伝子座特異的プライマーｎｉｒＢ１（配列番号４）およびｎｉｒＢ２（配列番号５）をＰＣＲによる検証に使用した。ＰＣＲ検証の条件は以下のとおりであった。９４℃で３分間の変性工程、３０サイクルのプロファイル:９４℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で１分、最終工程:７２℃で７分。鋳型として親株であるｎｉｒＢ⁺のＭＧ１６５５株の細胞を用いた反応で得られたＰＣＲ産物は、長さが９４９ｂｐであった。鋳型として変異株であるＭＧ１６５５ΔｎｉｒＢ：：ｃａｔ株の細胞を用いた反応で得られたＰＣＲ産物は、長さが１４００ヌクレオチドであった（図２）。

３．不活化したｎｉｒＢ遺伝子を持つアルギニン生産株の構築
Ｐ１形質導入の標準手順（Sambrook et al, 「分子クローニングの実験室手引き、第二版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）により、アルギニン生産株のエシェリヒア・コリ２３７（ＶＫＰＭＢ−７９２５）をＣｍ耐性となるように形質導入した。ＭＧ１６５５ΔｎｉｒＢ：：ｃａｔ株をｃａｔ遺伝子のドナーとして使用した。プライマーｎｉｒＢ１（配列番号４）およびｎｉｒＢ２（配列番号５）を用いて、得られた２３７ΔｎｉｒＢ：：ｃａｔ株について、ΔｎｉｒＢ：：ｃａｔ欠失を有することをＰＣＲで検証した。

〔実施例２〕不活化したｎｉｒＢ遺伝子を持つエシェリヒア・コリ菌株によるＬ−アルギニンの製造
エシェリヒア・コリ２３７株および２３７ΔｎｉｒＢ：：ｃａｔ株の両方を、Ｌ−寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。２３７ΔｎｉｒＢ：：ｃａｔ株のプレートにはクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含有させた。次いで、１白金耳の細胞を、２０×２００ｍｍの試験管中の発酵用最小培地２ｍｌに移した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で７２時間増殖させた。

培養後、培地中に蓄積したアルギニン量を、アルギニン（１ｇ／Ｌおよび２ｇ／Ｌ）およびグルタミン酸（１ｇ／Ｌおよび２ｇ／Ｌ）をコントロールとして使用して、ペーパークロマトグラフィーにより決定した。ペーパーは、移動相、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）で展開した。可視化試薬として、ニンヒドリン−アセトン溶液（０．５％）を使用した。

結果を表１に示す。

〔発酵培地の組成（ｇ／ｌ）〕
グルコース６７．０
イーストエキストラクト５．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３５．０
ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳ０₄・７Ｈ₂Ｏ２．０
チアミン（ビタミンＢ₁）１．０
ＣａＣＯ₃ ２５．０
Ｌ−イソロイシン０．０５
グルコースおよび硫酸マグネシウムは別個に滅菌する。ｐＨは７．２に調整する。

表１からわかるように、ｎｉｒオペロンの不活化は、Ｌ−アルギニン生産株２３７によるＬ−アルギニン蓄積を改善した。

ｃａｔ遺伝子の増幅に使用するプラスミドｐＡＣＹＣ１８４上のプライマーｎｉｒＢＬおよびｎｉｒＢＲの相対位置を示す。不活化したｎｉｒオペロンを含む染色体ＤＮＡフラグメントの構築を示す。

Claims

腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌であって、ｎｉｒオペロンが不活化するように改変されている細菌。
前記ｎｉｒオペロンはｎｉｒＢＤＣ遺伝子およびｃｙｓＧ遺伝子を含む、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産菌。
エシェリヒア属に属する請求項２に記載のＬ−アミノ酸生産菌。
前記Ｌ−アミノ酸はＬ−アルギニンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＬ−アミノ酸生産菌。
Ｌ−アルギニンオペロンの発現が増強されるように改変されている請求項４に記載のＬ−アミノ酸生産菌。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し、培地から蓄積されたＬ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法。
前記Ｌ−アミノ酸はＬ−アルギニンである、請求項６に記載の方法。
前記細菌は、Ｌ−アルギニンオペロンの発現が増強されるように改変されている、請求項７に記載の方法。