KR101261147B1

KR101261147B1 - Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101261147B1
Application number: KR1020110005136A
Authority: KR
Inventors: 이광호; 이근철; 이석명; 황영빈
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2013-05-06
Also published as: JP5740488B2; EP2665809A2; CN103443267A; KR20120083795A; PL2665809T3; US20140024087A1; US8835154B2; EP2665809A4; JP2014504876A; ES2664837T3; EP2665809B1; DK2665809T3; WO2012099396A2; WO2012099396A3; MY170507A; RU2549689C2; HUE036527T2; RU2013134401A; BR112013018385B1; CN103443267B

Abstract

본 발명은 NAD 키나아제의 활성은 강화되고, tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성은 불활성화되도록 형질전환된, L-아미노산의 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물을 및 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-아미노산을 생산하는 방법{A MICROORGANISM HAVING ENHANCED L-AMINO ACIDS PRODUCTIVITY AND PROCESS FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING THE SAME}

본 발명은 환원력의 증가로 인한 세포 활성의 개선과 균체 배양시간의 단축을 통하여 유용 아미노산의 생산효율이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산방법에 관한 것이다.

발효를 통하여 유용 산물을 생산해 내는 미생물들은 그것들의 생합성 경로를 강화시키는데 있어서 ATP(Adenosine 5'-triphosphate) 에너지 또는 NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phospate)와 같은 환원제의 요구성이 매우 큰 것으로 알려져 있다.

미생물의 대사과정에서, 이화반응(catabolic reaction)에서 사용되는 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)와 동화반응(anabolic reaction)에서 사용되는 NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)의 세포내 균형은 매우 중요한 것으로 알려져 있다. 그 균형은 하기에 나타낸 것과 같은 NAD의 인산화 또는 NADP의 탈인산화 반응을 통하여 조절된다.

NAD⁺ + ATP → NADP⁺ + ADP

NADP⁺ → NAD⁺ + phosphate

대장균에서 NAD의 인산화는 nadK(혹은 yfjB) 유전자로부터 코딩되는 NAD 키나아제(NAD kinase)(EC 2.7.1.23)라는 효소에 의해 이루어지는 것으로 알려져 있다. NAD 키나아제는 효소반응의 보조인자(cofactor)로서 Mg² ⁺를 사용하고, NADPH와 NADH로부터 알로스테릭 억제(allosteric inhibition)을 받는다. NAD⁺에 대한 K_m값은 2000μM 이고, ATP에 대한 K_m값은 2500μM로 알려져 있다(Eur. J. Biochem., (2001) 268: 4359-4365).

NADP 탈인산화반응의 경우에는 대사경로의 중요성에도 불구하고 거의 연구가 진행되어 있지 않다. 고세균인 메타노코커스 자나쉬(Methanococcus jannaschii)의 NAD 키나아제의 유사체(homolog)가 NADP 탈인산화효소 활성을 가진다는 보고가 있기는 했으나, 진핵생물(eukaryote)이나 진정세균(eubacteria)에서 그와 같은 활성을 가지는 효소를 암호화하는 유전자가 밝혀진 바는 아직까지 없다. 최근 대장균에서 cysQ 유전자의 산물이 높은 NADP 및 NADPH 탈인산화효소 활성을 보이기는 했으나, 정제된 효소로 진행된 반응속도연구에서 NADP 탈인산화효소가 아닌것으로 판명되었다(Biochem J., (2007) 402:205-218, Biosci. Biotechnol. Biochem., (2008) 72 :919-930).

NAD 키나아제의 활성은 여러 미생물에서 발견되는데, 그 활성을 나타내는 주요한 부위인 NAD 결합부위 및 NAD 키나아제 활성부위는 종간에도 매우 보존적인 아미노산 서열을 나타내는 것으로 알려져 있다. 일례로, 그람 양성균을 포함한 다양한 미생물에서도 첨부된 도 2의 아미노산 서열 정렬(sequence alignment)의 결과와 같이, 예측된 3차원 구조에서 나선형 띠(Helix) 2번, 4번, 5번이(각각 H2, H4, H5로 표시) 높은 수준의 상동성을 가지는 것을 알 수 있다.

NAD 키나아제를 통해 만들어진 NADP는 결국 환원력을 공급하는 재료가 되며, 특히 대장균 내에서 유용산물을 대량생산하는데 필요한 NADP+/NADPH는 동화반응에 반드시 필요한 요소이다(Biochem J., (2007) 402:205-218). 대장균에서 NADPH는 1) 산화적 오탄당 인산경로(oxidative pentose phosphate pathway), 2) TCA경로의 NADP 의존성 이소시트르산 탈수소효소(NADP-dependent isocitrate dehydrogenase; Icd 유전자), 3) 수소전달효소(Transhydrogenase; pntAB 유전자)에 의해 주로 생산되는 것으로 알려져 있다(J Biol Chem., (2004) 279: 6613-6619).

이 반응들은 NADP를 기질로 하여 NADPH를 만들기 때문에, NADP의 세포 내 농도를 증가시켜 준다면 NADPH의 농도를 높일 수 있으므로 여러 대사산물의 산업적 생산을 위해 NADP의 세포 내 농도 증가가 시도되어 왔다. 예를 들면, 1) 대장균에서의 nadK 과발현에 의한 NADPH의 증가 및 티미딘(thymidine)의 생산성 향상(Biotechnol Lett., (2009) 31:19291936), 2) 대장균에서의 nadK 과발현에 의한 NADPH의 증가 및 PHB(polyhydroxybutyrate)의 생산성 향상(Appl Microbiol Biotechnol., (2009) 83:939947), 3) 코리네형 세균에서 대장균의 nadK와 같은 역할을 하는 ppnK 유전자의 발현 증가로 인한 라이신(lysine)의 생산성 향상(Appl Microbiol Biotechnol., (2010) 87: 583-593) 등이 있으며, 위의 모든 경우에서 nadK 유전자의 발현을 증가시키는 것을 기술의 핵심으로 하고 있다. 하지만, NAD 키나아제의 발현 증가가 NADP의 증가를 가져와서 궁극적으로는 NADPH의 증가를 통한 환원력의 증가로 이어지려면, ATP와 같은 인산공급원이 함께 증가되어야만 한다.

ATP는 미생물 내부에서 전자전달계(electron transport system) 또는 기질수준 인산화 반응(substrate level phosphorylation)을 통해 주로 만들어진다. 만들어진 ATP는 분해되면서 세포에서 필요로 하는 에너지를 공급하고, 해당경로 (glycolysis)나 산화적 인산화 반응(oxidative phosphorylation)을 통하여 다시 재생되는 과정을 거쳐 재사용된다. 이 사실에 기반하여 유용산물의 대량생산시 에너지 공급을 원활히 하기 위해 박테리아 내부 ATP 재생과정을 생산 공정에 적용하려는 연구도 진행되었다(Biosci Biotechnol Biochem., (1997) 61: 840-845).

하지만, 상기에 언급한 바와 같이, NAD 키나아제의 발현증가로 인한 환원력의 증가 및 뒤이은 생합성 산물의 증가로 이어지는 선순환에 필수적인 인산공급원의 증가방법에 대한 연구는 아직 미진한 수준이다. 또한, ATP의 증가를 통한 에너지 공급증가도 단지 세포 내 에너지의 공급이라는 측면에서 접근이 되었을 뿐, ATP를 인산공급원으로 활용하는 부분도 당업계에서 거의 이루어지지 않은 상황이다.

따라서, 본 발명자들은 L-아미노산을 고농도로 생산하는 미생물을 개발하기 위한 개선방법으로, 여러가지 에너지 및 환원력 대사에 관여하는 유전자를 대상으로 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 nadK에 의하여 코딩되는 NAD 키나아제의 발현 강화와 tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성이 불활성화된 미생물이 고농도의 L-아미노산 생산에 효과가 있음을 확인하게 되었으며, 이러한 사실에 근거하여 인산공급원인 ATP를 효과적으로 증가시킬 수 있는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아 속 미생물의 환원력을 증가시키기 위하여 NADP를 다량 합성하도록 하는 과정에서 감소되는 ATP를 추가 공급함으로써 미생물 내 환원력을 효율적으로 증가시켜 목적하는 아미노산의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 NAD 키나아제의 활성을 강화시키고, tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성을 불활성화시킴으로써 세포내 환원력이 강화되도록 형질전환되어 L-아미노산의 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NAD 키나아제의 활성은 강화되고, tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성은 불활성화되도록 형질전환된, L-아미노산의 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 L-아미노산 생산능을 가진 미생물의 세포내 에너지 대사에서 부족되기 쉬운 환원제인 NADPH를 NADP 강화를 통해 보충하고, 이에 따른 ATP의 부족은tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성을 불활성화시킴으로써 보충하도록 하는 방법으로, 에너지 대사 균형 회복과 그에 따른 세포 활성의 증가, 배양시간의 단축에 의한 L-아미노산의 생산능 증가 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 대장균의 nadK 유전자 카피수를 증가시키기 위한 벡터 nadK-pINT17E를 나타내는 도면이다.
도 2는 기능적으로 분석된 NAD 키나아제와 유사체(homolog)들의 단백질 서열 유사성 정렬을 나타내는 도면이다. 이는 참고문헌(Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:583-593)에서 발췌하였다.

본 발명은 L-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물은 원핵 미생물 및 진핵 미생물이라면 어느 것이라도 포함할 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리키아 속에 속하는 미생물, 더욱 바람직하게는 대장균이다.

본 발명에 있어서, 상기 L-아미노산은 바람직하게는 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명은 NAD 키나아제의 활성이 강화되고 tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성이 불활성화되도록 형질전환되어 세포 내 환원력이 강화되어 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.

본 발명에서 상기 NAD 키나아제(NAD Kinase)는 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)를 ATP 혹은 다른 화합물에서 유래한 인산기를 이용하여 NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)로 만드는 활성을 가지는 효소를 말한다.

NAD 키나아제의 활성을 가지는 단백질의 서열은 구체적으로 서열번호 4의 아미노산 서열로 개시되며, 상기 NAD 키나아제를 코딩하는 nadK 유전자는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에서, L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물의 NAD 키나아제 활성을 강화하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 NAD 키나아제를 코딩하는 염기서열과 자체 혹은 외부로부터 도입된 발현조절부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 유전자의 발현을 조절하는 발현조절부위를 다른 조절서열로 치환, 발현조절부위의 염기서열 전체 혹은 일부 돌연변이가 유발된 변형, 유전자 자체의 변이도입에 의한 효소활성 강화 등에 의한 방법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물의 NAD 키나아제의 활성을 강화시키기 위하여 NAD 키나아제를 코딩하는 염기서열을 균체의 염색체 DNA에 도입함으로써 카피수를 증가시키는 방법을 사용할 수 있다.

당업자라면 염색체 DNA 내부의 NAD 키나아제 카피수 증가에 의한 효과를 통해 NAD 키나아제가 염색체 외부에서 벡터를 통해 카피수가 증가되거나, 염색체 내외부에서 NAD 키나아제를 코딩하는 nadK 유전자의 발현조절부위 변형 혹은 유전자 자체의 변이를 통한 발현량 증가시에도 동일한 효과를 가져올 것이라고 예측할 수 있다. 벡터를 사용할 경우, 염기서열을 도입한 재조합 벡터로 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질전환함으로써 NAD 키나아제의 활성이 강화된 에스케리키아속 미생물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 벡터 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현에 따르면, 형질전환에 의해 NAD 키나아제의 활성이 강화됨으로써 균주의 세포내 NADP 및 NADPH의 농도는 증가하게 된다.

본 발명자들은 또한 ATP를 증가시키기 위한 방법으로서 tehB 유전자에 의하여 코딩되는 효소의 활성을 불활성화시키는 방법을 적용하였다.

본 발명에서 상기 tehB 유전자(NCBI Gene ID: 945979)는 텔룰라이트에 내성을 갖도록 하는 단백질(tellurite resistance protein), 혹은 S-아데노실 메치오닌 의존성 메틸전달단백질로 추정되는 효소(predicted S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase)를 코딩하는 유전자로 알려져 있으며, 현재까지 정확한 기능은 아직 밝혀져 있지 않다.

그러나, 최근의 문헌에 따르면 대장균의 tehB 유전자를 결실시킨 경우 ATP의 생성량이 모균주 대비 150%까지 향상되었음을 나타내는 연구결과가 있으며, 그 효과는 메치오닌으로부터 S-아데노실 메치오닌(S-adenosyl methionine)을 생합성할 때 필요로 하는 ATP의 수요감소에 따른 것이라 추정된 바 있다(FEMS Microbiol Lett., (2009) 297:217-224).

상기 S-아데노실 메치오닌 의존성 메틸전달단백질로 추정되는 효소의 서열은 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 개시될 수 있다. 또한, 상기 효소를 코딩하는 tehB 유전자는 대장균에서 유래하였으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 tehB 유전자에 의하여 코딩되는 효소의 활성을 불활성화시키는 방법은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 유전자에 의해 코딩되는 효소가 생성되지 못하도록 해당 유전자를 변형시키는 방법들을 모두 포괄한다. 상기 방법들은 상동성 재조합에 의한 유전자 일부 혹은 전체 결실, 해당 유전자 내부에 트랜스포존 (transposon)의 삽입에 의한 효소발현 억제, 항생제 내성 유전자 삽입에 의한 효소발현 억제 등이 있을 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본원에서 "형질전환"이란 용어는 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현에서, 상기 방법에 의해 형질전환된 미생물은 대장균일 수 있고, 바람직하게는 대장균 CA03-448(KCCM11167P), CA03-449(KCCM11168P) 또는 대장균 CA04-2001(KCCM11166P)이다.

본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명은 향상된 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 수크로오스 또는 글루코오스가 주 탄소원으로 포함되어 있는 배지에 배양하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 탄소원의 일부 또는 전부로서 수크로오스 또는 글루코오스가 포함된 배양 배지에 상기 재조합 에스케리키아 속 미생물을 접종하여 배양하고, 상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

본 발명에서 사용되는 배지는 수크로오스 또는 글루코오스를 주 탄소원으로 사용하며, 수크로오스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 오수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입한다.

배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 회수될 수 있다

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 대장균 유래의 tehB 유전자에 의하여 암호화되는 효소의 활성이 불활성화된 L- 쓰레오닌 생산균주의 제작

L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541(대한민국 등록특허 제10-0576342호)의 tehB 유전자를 상동 재조합에 의하여 결실시켰다.

상기 대장균 KCCM10541은 L-쓰레오닌 생산용 균주인 대장균 KFCC10718(한국특허공개 제10-1992-0008365호)로부터 유래된 균주로, 그 친주인 대장균 KFCC 10718은 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티르산 내성을 가지는 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균이다.

결실대상 유전자 tehB 유전자(NCBI Gene ID: 945979)는, S-아데노실 메치오닌 의존성 메틸전달단백질로 추정되는 효소(predicted S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase)를 코딩하는 것으로도 알려져 있어, 결실시 S-아데노실 메치오닌을 만드는데 필요한 ATP가 사용되지 않아, 에너지의 낭비를 줄이기 위한 대상 유전자로 선정하였으며, 서열번호 1의 염기서열을 가진다.

불활성화를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한 돌연변이 제작 기법인 1단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였다(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640 6645).

유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로는 클로람페니콜 내성 유전자를 사용하였고, 상기 클로람페니콜 내성 유전자의 제거를 위해서는 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 시스템(site-specific recombination system)을 이용하였다(BMC Biotechnology(2001) 1:7).

상기 tehB 유전자의 일부분과 클로람페니콜(Chloramphenicol) 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 하기 프라이머 1과 프라이머 2를 이용하여 pMloxCm 벡터를 주형으로 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 중합효소 연쇄반응법 (이하 'PCR'법)에 의해 약 1200쌍의 유전자 단편을 증폭하였다.

프라이머 1	5'-GCACACACTCTGAAGTACTGGAAGCGGTGAAAGTGGTTAAACCGGGTAAAACG CTGGATTAGGTGACACTATAGAACGCG - 3' (서열번호6)
프라이머2	5'-CACCCTCTCCCAGCCTTCGTAATATCGACGTAATTCTCCCTCTTTGAAGGCAAAC GGGAATAGTGGATCTGATGGGTACC -3' (서열번호7)

또한, PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편은 0.8% 아가로스겔 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 DNA 단편의 5’및 3’영역의 20쌍의 상보적 염기서열을 가지도록 하였고, 추가적으로 tehB 유전자의 5’및 3’영역을 더한 하기의 프라이머 3과 프라이머 4를 이용하여 용리된 1차 PCR산물을 주형으로 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 약 1300쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 상기 과정을 거쳐 얻어진 DNA 단편은 0.8% 아가로스겔 전기영동 후 용리하여 재조합에 사용하였다.

프라이머 3	5'- GTGACGAAAACTATTTTACTGATAAATATGAATTAACCCGCACACACTCTGAAGT ACTG -3' (서열번호 8)
프라이머4	5'- GTCGGTGCGGTGCAGCTCGCCGACGTCTTCATTGTATTTCACCCTCTCCCAGC CTTCGTA -3' (서열번호 9)

Datsenko KA 등이 개발한 방법(Proc. Natl. Acad. Sci.(2000) 97:6640-6645, GenBank No. AY048746)에 따라 pKD46 플라스미드로 형질 전환된 쓰레오닌 생산능을 가진 대장균 KCCM 10541을 컴피턴트한 상태로 제조한 후, PCR 법으로 얻어진 1300 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 형질전환 시켰다. 얻어진 균주를 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에서 선별하였으며, 다시 하기의 프라이머 5와 프라이머 6을 이용한 PCR로 얻어진 크기가 약 2000 염기쌍으로 tehB 유전자가 결실되었다는 것을 확인하였다.

프라이머 5	5'- TTTAGGCGCAGGCGTTTTCT -3' (서열번호 10)
프라이머 6	5'- TTTTACGTGCCAGCATCGTG -3' (서열번호 11 )

클로람페니콜에 내성을 가진 1차 재조합 대장균 균주는 pKD46플라스미드를 제거한 후, pJW168 플라스미드를 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene, (2000) 247,255-264). 최종적으로 얻어진 균체는 프라이머 5와 6을 이용한 PCR을 통해 얻어진 832쌍의 증폭산물로 의도한대로 결실이 이루어졌음을 확인하였다.

실시예 2: 대장균의 nadK 유전자의 염색체내 카피수 증가를 위한 벡터의 제작

유전자 nadK는 미국생물자원센터 (American Type Culture Collection: ATCC)로부터 구매한 대장균 W3110 균주의 염색체(GenBank accession number: AC000091)를 주형으로 PCR법을 통하여 증폭하였다.

구체적으로, 하기의 프라이머 7과 8을 이용하여 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 중합효소 연쇄반응법 PCR 법을 통하여 1407 염기쌍의 단편을 증폭하였다(서열번호 5).

증폭되는 서열은 nadK의 코딩서열 뿐만 아니라 자가 프로모터로 추정되는 부위의 501 bp를 함께 포함하고 있다. 또한, 프라이머 7은 제한 효소 EcoR I 부위를 가지고 있고, 프라이머 8은 Xba I 부위를 가지고 있다.

프라이머 7	5'CCCGAATTCGCGTCAGCTCAATGCCTTCA 3' (서열번호 12)
프라이머 8	5'GGGTCTAGAGCTGGCGTAAAATTAGAATA 3' (서열번호 13 )

얻어진 폴리뉴클레오티드를 Xba I 및 EcoR I으로 제한효소 처리하고, pINT17E 벡터의 Xba I, EcoR I 자리에 클로닝하여 대장균 BW25113에 형질전환한 후, LB Cm 고체배지(LB + chloramphenicol agar plate)에 도말하였다. 클로닝 된 벡터들을 얻어진 콜로니로부터 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득하였고, 이를 nadK_pINT17E로 명명하였다. 벡터에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.

실시예 3 : 대장균 유래의 tehB 유전자에 의하여 암호화되는 효소의 활성이 불활성화되고, 염색체내 카피수 증가를 통한 NAD 키나아제의 활성이 강화된 L- 쓰레오닌 생산균주의 제작

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제작된tehB 유전자 결실균주와 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제작된 벡터 nadK_pINT17E를 이용하여 NAD 키나아제의 카피수를 증가시켰다.

먼저 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제작된 tehB 유전자 결실균주에 pKD46 플라스미드를 도입하고 컴피턴트한 상태로 만들어 벡터 nadK_pINT17E로 형질전환시킨 후, 37℃에서 1~2일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니들을 대상으로 염색체 내부에 제대로 삽입되었는지 여부를 프라이머 8과 프라이머 9를 이용한 PCR로 확인하였다. PCR 조건은 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 45초간 어닐링, 72℃에서 2분간 중합하는 조건을 30회 반복하였고, 약 2000 염기쌍의 단편을 증폭하여 확인하였다.

프라이머 9

5'TGGTATTCACTCCAGAGCGA 3' (서열번호 14 )

클로람 페니콜 내성을 가진 1차 재조합 균주에서 pKD46 플라스미드를 제거한 후, pJW168플라스미드를 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene ,(2000) 247, 255-264). 프라이머 10과 11을 이용하여 PCR을 통해 얻어진 약 1500쌍의 증폭산물로 nadK 유전자의 두 카피가 의도한대로 염색체 내에 연속적으로 존재하고 있음을 확인하였다.

상기 형질전환된 대장균을 KCCM10541ΔtehB nadK 2copy(CA03-448)로 명명하였다.

프라이머 10	5'GCATCAGCACCGCGATAAA 3' (서열번호 15)
프라이머 11	5'CATGTGTTGTCAGTGCAGT 3' (서열번호 16)

실시예 4 : 대장균 유래의 tehB 유전자에 의하여 암호화되는 효소의 활성이 불활성화되고, 염색체내 카피수 증가를 통한 NAD 키나아제의 활성이 강화된 L- 트립 토판 생산균주의 제작

L-트립토판 생산균주인 대장균 KCCM 10812를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1 내지 3에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 형질전환된 대장균을 제작하였다.

본 실시예에서 사용된 모균주인 상기 대장균 KCCM 10812P는 L-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)로부터 유래된 균주로, 염색체상의 트립토판 요구성이 해제되고, 불활성화된 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 및 변이된 aroG, trpE 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균이다 (대한민국 등록특허 10-0792095).

상기 형질전환된 대장균을 KCCM10812ΔtehB nadK 2copy(CA04-2001)라 명명하였다.

비교예 1 : tehB 유전자에 의하여 코딩되는 효소의 활성이 불활성화된 L- 쓰레오닌 또는 L-트립토판 생산균주의 제작

tehB 유전자를 결손시키기 위하여, 실시예 1에서 명시한 것과 같이 쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541과 트립토판 생산균주인 대장균 KCCM10812를 이용하였다. Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한 돌연변이 제작 기법인 1단계 불활성화(one step inactivation) 방법(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645)과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 시스템(site-specific recombination system)(BMC Biotechnology.(2001) 1:7)을 이용하였다.

최종적으로 얻어진 균체는 프라이머 5와 6을 이용한 PCR을 통해 얻어진 832쌍의 증폭산물로 의도한대로 결실이 이루어졌음을 확인하고, 이들을 각각 KCCM10541ΔtehB 와 KCCM10812PΔtehB 로 명명하였다.

비교예 2 : NAD 키나아제의 활성이 강화된 L- 쓰레오닌 또는 L-트립토판 생산균주의 제작

실시예 3에 기재된 방법에 따라 쓰레오닌 및 트립토판 생산균주의 염색체 상에 nadK 유전자를 두 카피로 증가시킨 NAD 키나아제 활성이 강화된 균주를 제작하였다.

쓰레오닌 생산균주인 KCCM10541과 트립토판 생산균주인 KCCM10812에 pKD46 플라스미드를 도입한 상태로 컴피턴트 셀을 만든 후, 벡터 nadK_pINT17E로 형질전환시켰다. 이후, 37℃에서 1~2일간 배양하여 콜로니를 얻었고, 얻어진 콜로니들을 대상으로 염색체 내부에 제대로 삽입되었는지 여부를 프라이머 8과 프라이머 9를 이용한 PCR로 확인하였다.

클로람 페니콜 내성을 가진 1차 재조합 균주에서 pKD46플라스미드를 제거한 후, pJW168 플라스미드를 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene,(2000) 247,255-264). 최종적으로 프라이머 10과 11을 이용하여 PCR을 통해 얻어진 약 1500쌍의 증폭산물로 nadK 유전자의 두 카피가 의도한대로 염색체 내에 연속적으로 존재하고 있음을 확인하였으며, 제작된 균주는 KCCM10541 nadK 2카피와 KCCM10812 nadK 2copy로 명명하였다.

실험예 1 : NAD 키나아제의 활성이 강화되고, tehB 유전자에 의하여 코딩되는 효소의 활성이 불활성화된 L- 쓰레오닌 생산균주의 역가확인

먼저, L-쓰레오닌 생산균주에서 수크로오스의 이용성을 부여하기 위하여 pAcscBAR'-mak 벡터(대한민국 특허공개번호 10-2010-0092765)(서열번호 21)를 다음과 같이 제작하였다.

우선 pAcscBAR을 제작한 후 pAcscBAR에 mak 유전자를 클로닝하는 방법을 이용하였다. pAcscBAR의 제작은, 프라이머 12 및 13을 이용하여 cscK 부위가 제거된 cscB 부위의 폴리뉴클레오티드로 증폭하였다.

프라이머 12	5' CGCGATATCTAGCATATGCCGGGTACCGCACTAGTTGAGAGTAAACGGC GAAGT 3' (서열번호 17)
프라이머 13	5' ATTCGGCCGGAGCCCTGCAGGTGCACGAGTACATTTGAGCGACTGT 3' (서열번호 18)

PCR법의 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1521 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드와 pAcscBAR을 각각 EcoRV와 EagI으로 제한효소 처리를 한 후 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. LB 배지에서 성장한 콜로니를 이용한 PCR법을 통하여 pAcscBAR이 포함된 콜로니를 선별하였으며, 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 pAcscBAR 플라스미드의 XbaI과 EagI 자리에 연결된 cscBAR의 염기서열 분석을 통하여 변이가 없는 것을 확인하였다.

pAcscBAR'-mak 벡터는 프라이머 14 및 15와 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 mak 유전자가 포함된 폴리뉴클레오티드로 증폭한 후, pAcscBAR의 PstI과 EagI 의 제한 효소 자리에 클로닝하여 제작하였다.

프라이머 14	5' CACTGCAGTGGGGTAAATGCCATCG 3' (서열번호 19)
프라이머 15	5' AACGGCCGTCTCGGTGCTCATTACT 3' (서열번호 20)

PCR법의 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1388 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드와 pAcscBAR를 각각 PstI과 EagI으로 제한 효소 처리를 한 후 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. LB 배지에서 성장한 콜로니를 이용한 PCR법을 통하여 pAcscBAR'-mak가 포함된 콜로니를 선별하였으며, 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 pAcscBAR'-mak 플라스미드의 XbaI과 EagI 자리에 연결된 cscBAR-mak의 염기서열 분석을 통하여 변이가 없는 것을 확인하였다.

실시예 3의 재조합 대장균 KCCM10541ΔtehB nadK 2copy 균주, 모균주인 대장균 KCCM10541 균주, 비교예 1 내지 2에 따라 제조된 tehB유전자가 결실된 KCCM10541균주(KCCM10541ΔtehB라 칭함) 및 nadK 유전자의 카피수가 증가된 KCCM10541균주(KCCM10541 nadK 2copy라 칭함)에 각각 상기 제작된 pAcscBAR'-mak 벡터를 도입한 후, 역가평가를 진행하였다.

각기 다른 유전적 형질을 가진 상기 균주들을 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양하였다. 그 후, 하기 표 9의 조성과 같이 수크로오스가 함유된 25 mL의 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였다. 그 결과를 표 10에 나타내었다.　모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

조성물	농도 (리터당)
수크로오스	70 g
KH₂PO₄	2 g
(NH₄)₂SO₄	25 g
MgSO₄7H₂O	1 g
FeSO₄7H₂O	5 mg
MnSO₄4H₂O	5 mg
L-메티오닌	0.15 g
효모액기스	2 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

균주	OD	소모당 (g/L)*	L-쓰레오닌 (g/L)**
KCCM10541/ pAcscBAR’-mak	16.2	34.7	31.8
KCCM10541 ΔtehB / pAcscBAR’-mak	15.2	35.7	32.2
KCCM10541 nadK 2 copy/ pAcscBAR’-mak	16.4	36.6	32.9
KCCM10541 ΔtehB nadK 2copy/ pAcscBAR’-mak	14.9	37.4	34.7

* 24시간 측정치

** 48시간 측정치

표 10에서 보는 바와 같이, tehB 유전자만을 결실시킨 경우에는 수크로오스의 이용도가 모균주와 거의 유사하나, NAD 키나아제의 활성이 강화된 경우에는 수크로오스의 이용도가 모균주와 비교하여 약 2g 높아짐을 확인할 수 있었다.

또한, tehB 유전자를 결실시킨 경우는 모균주 대비 균체량을 약 6% 낮추는 효과를 보이지만 쓰레오닌의 생산량은 모균주와 유사하였다. 그러나, 두 가지 변이를 동시에 도입하였을 경우, 모균주 대비 균체량은 약 8%가 감소하였고, 수크로오스의 이용도는 약 8% 증가하였으며, 쓰레오닌의 생산량 또한 9% 증가하는 유용한 형질을 나타내었다.

또한, 실시예 3의 재조합 대장균 KCCM10541ΔtehB nadK 2copy 균주, 모균주인 대장균 KCCM10541 균주, 비교예 1 내지 2에 따라 제조된 tehB 유전자가 결실된 KCCM10541균주(KCCM10541ΔtehB라 칭함) 및 nadK 유전자의 카피수가 증가된 KCCM10541균주(KCCM10541 nadK 2copy라 칭함)을 대상으로 포도당을 탄소원으로 하는 역가평가를 진행하였다. 각기 다른 유전적 형질을 가진 해당 균주들을 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양하였다. 그 후, 하기 표 11의 조성과 같이 포도당이 함유된 25 mL의 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였다. 그 결과를 표 12에 나타내었다.　 모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

조성물	농도 (리터당)
포도당	70 g
KH₂PO₄	1 g
(NH₄)₂SO₄	28 g
MgSO₄7H₂O	0.5 g
FeSO₄7H₂O	5 mg
MnSO₄4H₂O	5 mg
효모액기스	2 g
L-메티오닌	0.15 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

균주	OD	소모당 (g/L)*	L-쓰레오닌 (g/L)**
KCCM10541	14.0	26.7	27.6
KCCM10541 ΔtehB	13.2	26.9	28.7
KCCM10541 nadK 2 copy	13.8	28.9	28.4
KCCM10541 ΔtehB nadK 2copy	12.5	30.3	30.1

* 24시간 측정치

** 48시간 측정치

상기 theB 유전자가 결실되고, NAD 키나아제의 활성이 강화된 포도당 이용균주인 L-쓰레오닌 생산 대장균 KCCM10541ΔtehB nadK 2copy를 CA03-448, 해당 균주에 수크로오스 이용성이 부여된 균주인 KCCM10541ΔtehB nadK 2copy/pAcscBAR'-mak를 CA03-449로 명명하고, 이를 2011년 01월 10일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 각각 기탁하였다(수탁번호 KCCM11167P, KCCM11168P).

실험예 2 : NAD 키나아제의 활성이 강화되고, tehB 유전자에 의하여 코딩되는 효소의 활성이 불활성화된 L-트립토판 생산균주의 역가확인

글루코오스를 탄소원으로 하여, 실시예 4의 재조합 대장균 KCCM10812ΔtehB nadK 2copy 균주, 모균주인 대장균 KCCM10812 균주, 비교예 1 내지 2에 따라 제조된 tehB 유전자가 결실된 KCCM10812균주(KCCM10812ΔtehB라 칭함) 및 nadK 유전자의 카피수가 증가된 KCCM10812균주(KCCM10812 nadK 2copy라 칭함)의 역가평가를 진행하였다.

상기 역가평가를 위하여 균체를 백금이로 접종한 후, LB 고체 배지에서 밤새 배양하였다. 하기 표 13에서와 같은 조성을 갖는 25 ml의 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 결과를 표 14에 나타내었다. 모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

조성물	농도 (리터당)
글루코오스	60 g
K2HPO₄	1 g
(NH₄)₂SO₄	10 g
NaCl	1 g
MgSO₄7H₂O	1 g
구연산나트륨	5 g
효모액기스	2 g
탄산칼슘	40 g
구연산나트륨	5 g
페닐알라닌	0.15 g
타이로신	0.1 g
pH	6.8

균주	OD	소모당 (g/L)*	L-트립토판 (g/L)**
KCCM10812P	13.0	54.8	6.8
KCCM10812P ΔtehB	14.5	55.0	7.0
KCCM10812P nadK 2 copy	13.3	57.6	6.9
KCCM10812P ΔtehB nadK 2copy	14.2	57.3	7.7

* 33시간 측정

** 48시간 측정치

표 14에서 나타내는 바와 같이 tehB 유전자를 결실시킨 경우에는 동일 시간에서 균체의 양이 모균주에 비해 약 10% 증가하는 것으로 나타났다. NAD 키나아제의 활성을 강화시킨 경우도 글루코오스의 이용도는 개선되지만, 트립토판의 생산량은 모균주와 큰 변화가 없었다.

그러나, 두 가지 변이를 함께 도입한 경우에는 균체의 양이 증가함은 물론 글루코오스의 이용도 또한 개선되면서 트립토판의 생산량이 약 14% 증가하였다.

상기 tehB 유전자가 결실되고, NAD 키나아제의 활성이 강화된 균주인 L-트립토판 생산 대장균 KCCM10812PΔtehB nadK 2copy을 CA04-2001으로 명명하고, 이를 2011년 1월 10일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 KCCM11166P).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11166P

20110110

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11167P

20110110

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11168P

20110110

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A MICROORGANISM HAVING ENHANCED L-AMINO ACIDS PRODUCTIVITY AND PROCESS FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING THE SAME <130> PA100864/KR <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 594 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgatcattc gtgacgaaaa ctattttact gataaatatg aattaacccg cacacactct 60 gaagtactgg aagcggtgaa agtggttaaa ccgggtaaaa cgctggatct gggctgtggc 120 aatggtcgta acagtcttta cctggcagcc aatggttatg atgttgacgc atgggataaa 180 aatgccatga gtatcgccaa cgtcgagcgc attaaatcca ttgaaaatct ggataattta 240 cacacccgag tcgttgatct gaataacctc acatttgata gacagtacga ttttattctt 300 tcgactgtgg tgctgatgtt ccttgaggct aaaaccatcc ccgggttgat tgccaatatg 360 caacgttgca ctaaacctgg tggttacaac ctgattgtgg cggcgatgga taccgctgat 420 tatccatgta ccgtcggctt cccgtttgcc ttcaaagagg gagaattacg tcgatattac 480 gaaggctggg agagggtgaa atacaatgaa gacgtcggcg agctgcaccg caccgacgcc 540 aacggtaatc gtattaaact gcgtttcgcc acgatgctgg cacgtaaaaa atga 594 <210> 2 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> predicted S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltrasnferase <400> 2 Met Ile Ile Arg Asp Glu Asn Tyr Phe Thr Asp Lys Tyr Glu Leu Thr 1 5 10 15 Arg Thr His Ser Glu Val Leu Glu Ala Val Lys Val Val Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Thr Leu Asp Leu Gly Cys Gly Asn Gly Arg Asn Ser Leu Tyr Leu 35 40 45 Ala Ala Asn Gly Tyr Asp Val Asp Ala Trp Asp Lys Asn Ala Met Ser 50 55 60 Ile Ala Asn Val Glu Arg Ile Lys Ser Ile Glu Asn Leu Asp Asn Leu 65 70 75 80 His Thr Arg Val Val Asp Leu Asn Asn Leu Thr Phe Asp Arg Gln Tyr 85 90 95 Asp Phe Ile Leu Ser Thr Val Val Leu Met Phe Leu Glu Ala Lys Thr 100 105 110 Ile Pro Gly Leu Ile Ala Asn Met Gln Arg Cys Thr Lys Pro Gly Gly 115 120 125 Tyr Asn Leu Ile Val Ala Ala Met Asp Thr Ala Asp Tyr Pro Cys Thr 130 135 140 Val Gly Phe Pro Phe Ala Phe Lys Glu Gly Glu Leu Arg Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Glu Gly Trp Glu Arg Val Lys Tyr Asn Glu Asp Val Gly Glu Leu His 165 170 175 Arg Thr Asp Ala Asn Gly Asn Arg Ile Lys Leu Arg Phe Ala Thr Met 180 185 190 Leu Ala Arg Lys Lys 195 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nadK gene <400> 3 atgaataatc atttcaagtg tattggcatt gtgggacacc cacggcaccc cactgcactg 60 acaacacatg aaatgctcta ccgctggctg tgcacaaaag gttacgaggt catcgttgag 120 caacaaatcg ctcacgaact gcaactgaag aatgtgaaaa ctggcacgct cgcggagatt 180 gggcaactag ctgatctcgc ggtagtcgtt ggtggcgacg gtaatatgct gggcgcggca 240 cgcacactcg cccgttacga tattaaagtt attggaatca accgtggcaa cctgggtttc 300 ctgactgacc ttgaccccga taacgcccag caacagttag ccgatgtgct ggaaggccac 360 tacatcagcg agaaacgttt tttgctggaa gcgcaagtct gtcagcaaga ttgccagaaa 420 cgcatcagca ccgcgataaa tgaagtggtg cttcatccag gcaaagtggc gcatatgatt 480 gagttcgaag tgtatatcga cgagatcttt gcgttttctc agcgatctga tggactaatt 540 atttcgacgc caacaggctc caccgcctat tccctctctg caggcggtcc tattctgacc 600 ccctctctgg atgcgattac cctggtgccc atgttcccgc atacgttgtc agcacgacca 660 ctggtcataa acagcagcag cacgatccgt ctgcgttttt cgcatcgccg taacgacctg 720 gaaatcagtt gcgacagcca gatagcactg ccgattcagg aaggtgaaga 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Claims

NAD 키나아제의 활성이 강화되고, tehB 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소의 활성이 불활성화된, L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 NAD 키나아제의 활성은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가진 단백질로부터 유래한 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 NAD 키나아제의 활성은 염색체 삽입과 벡터 도입에 의한 카피수 증가, 발현조절 부위의 치환, 변형 및 유전자 변이에 의한 방법 중 하나 이상의 방법에 의해 강화된 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 불활성화는 상동성 재조합에 의한 유전자 일부 혹은 전체 결실, 해당 유전자 내부에 트랜스포존 (transposon) 삽입에 의한 효소발현 억제, 항생제 내성 유전자 삽입에 의한 효소발현 억제에 의한 방법 중 하나 이상의 방법에 의해 불활성화되는 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 에스케리키아속 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 6항에 있어서,
상기 에스케리키아속 미생물은 수크로오스 이용성이 부가된 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물
제 1항에 있어서,
상기 에스케리키아속 미생물은 L-쓰레오닌 생산 대장균 CA03-448(수탁번호 KCCM11167P) 또는 CA03-449(수탁번호 KCCM11168P)인 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 에스케리키아속 미생물은 L-트립토판 생산 대장균 CA04-2001(수탁번호 KCCM11166P)인 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물.
탄소원의 일부 또는 전부로서 수크로오스 또는 글루코오스가 포함된 배양 배지에 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 에스케리키아속 미생물을 접종하여 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 L-아미노산이 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것을 특징으로 하는 L-아미노산을 생산하는 방법.