KR101530817B1

KR101530817B1 - L-트립토판 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 l-트립토판을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101530817B1
Application number: KR1020140045650A
Authority: KR
Inventors: 김형준; 장준호; 김경림; 이근철; 황영빈; 홍형표
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2013-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2015-06-25
Also published as: JP2016515400A; PL2987854T3; WO2014171747A1; BR112015026210B1; ES2643442T3; MY171291A; EP2987854B1; EP2987854A1; CN105143440B; EP2987854A4; US20160153014A1; KR20140125314A; CN105143440A; BR112015026210A2; US9562246B2; JP6177995B2

Abstract

본 발명은 고농도로 L-트립토판을 생산할 수 있도록 하기 위해서, 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 발현하도록 변형된 L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아 속 미생물 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판 생산방법에 관한 것이다. 상기 유전자 재조합 대장균은 L-트립토판을 고수율로 생산할 수 있어 의약 및 약학산업, 사료산업에서, 특히 동물 사료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

L-트립토판 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법{MICROORGANISMS FOR PRODUCTION OF L-TRYPTOPHAN AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF L-TRYPTOPHAN USING THE SAME}

본 발명은 L-트립토판의 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되고 있다. L-트립토판은 주로 코리네형 세균(Corynebacterium), 바실러스형 세균(Bacillus), 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물을 이용한 발효법으로 생산되며, 이들 균주의 야생형 균주로부터 유도된 인공변이주가 L-트립토판의 생산을 위해 사용되고 있다.

L-트립토판은 방향족 아미노산의 공통 중간물질인 코리스믹산(chorismic acid)으로부터 생합성 된다. 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 D-에리트리오스-4-인산(D-erythrose-4-phosphate)으로부터 시작되는 공동의 시킴산 (shikimic acid) 경로를 거쳐 생성된 코리스믹산(chorismic acid)에 트립토판 오페론인 trpEDCBA가 합성하는 5가지의 효소들이 작용하여 L-트립토판이 생합성 된다. 먼저 안트라닐산 합성효소(anthranilate synthase, TrpE-TrpD 중합체)가 코리스믹산에 작용하여 안트라닐산(anthranilic acid)을 합성하고, 이어서 안트라닐산 포스포리보실 전이효소 (anthranilate phosphoribosyltransferase, TrpD)가 작용하여 포스포리보실 안트라닐(N산-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate)을 합성한다. 이어서 포스포리보실 안트라닐산 이성화효소(phosphoribosylanthranilate isomerase, TrpC)와 인돌-3-글리세롤 인산합성 효소(indole-3-glycerol phosphate synthase, TrpC)가 작용하여 인돌-3-글리세롤 인산 (indole-3-glycerol-phosphate)을 합성하고, 여기에 트립토판 합성효소(tryptophan synthase, TrpB-TrpA 중합체)가 작용하여 L-트립토판 합성을 완성한다(도 1; Bonggaerts et al., Metab Eng, 3, 289-300, 2001).

대장균의 경우 trpE와 trpD 유전자가 생성하는 단백질이 중합체를 이뤄 안트라닐산 합성효소를 형성하여 안트라닐산을 합성한다. 이렇게 합성된 안트라닐산은 trpD 유전자가 생성하는 안트라닐산 포스포리보실 전이효소에 의해 5-포스포리보실 1-피로인산(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate, PRPP)과 반응하여 포스포리보실 안트라닐산이 된다.

이때 trpD 유전자가 생성하는 단백질은 trpE 유전자가 생성하는 단백질과 중합체를 이루어 안트라닐산 합성효소로 작용하거나, 단독으로 안트라닐산 포스포리보실 전이효소로 작용하게 되는데 야생형 대장균에서는 이 두 가지의 작용이 균형을 이루고 있다.

야생형 대장균의 경우 세포 내 트립토판 생합성에서 보조 인자로 활용되는 PRPP의 농도는 180μM 정도이다(Bennett et al., Nat Chem Biol, 5, 595-599, 2009). 안트라닐산의 생합성이 강화된 L-트립토판 생산 균주에서 세포 외부로 배출되어 축적되는 안트라닐산의 농도가 최대 수 mM인 것에 비하면, 세포 내 PRPP 농도는 안트라닐산의 농도에 비해 크게 낮은 편이다. 낮은 PRPP 농도는 포스포리보실 안트라닐산 생성에 있어 제한인자(limiting factor)로 작용하여 전체적인 L-트립토판의 합성속도를 저해시키고 세포 내/외부에 안트라닐산의 축적을 가중시킨다. 그러므로, PRPP에 대한 친화도가 보다 높은 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 이용할수록 세포 내/외부의 안트라닐산 축적을 방지하고 L-트립토판 생합성 속도를 높일 수 있게 된다.

L-트립토판 생산균주를 개량하는 이전의 보고들 중에서, 이처럼 안트라닐산 합성효소와 안트라닐산 포스포리보실 전이효소 활성의 균형을 맞추어 가며 생합성 경로를 강화하는 기술은 현재까지 없다.

연구자료에 따르면, 대장균의 PRPP에 대한 K _m 값이 50인데 비해 효모의 PRPP에 대한 K _m 값은 22.4 ± 2.6 수준이다 (Hommel et al., Eur J Biochem, 180, 33-40, 1989). 따라서, 효모 유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소는 대장균의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소보다 PRPP에 대한 친화력이 높다. 따라서, 대장균의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소보다 효모의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 이용할 경우 L-트립토판 생합성 경로가 강화된 미생물에서 안트라닐산의 세포 내/외부 축적을 방지하고, L-트립토판의 생합성을 증가시키는 효과가 더욱 클 것으로 예상된다.

본 발명자들은 산업적으로 유용한 L-트립토판을 대량생산하기 위해 대장균의 코리스믹산 생합성 경로 및 trp 오페론을 강화하던 중, 상기 두 경로를 강화할수록 안트라닐산이 세포 내/외부에 축적되고, 이로 인해 비정상 배양이 나타나는 것을 발견하였다. 따라서, L-트립토판 생합성 경로가 강화된 미생물에서 부족한 안트라닐산 포스포리보실 전이효소의 발현을 강화하는 것은 안트라닐산의 세포 내/외부 축적을 방지하고, L-트립토판의 생합성을 증가시킬 수 있을 것으로 예상하여 예의 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 효모 유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소 (trp4)를 발현하도록 변형된, L-트립토판 생산능이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 발현하도록 변형된, L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 L-트립토판을 분리하는 단계를 포함하는 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 미생물은 고수율로 L-트립토판을 생산할 수 있어 의약산업, 사료산업, 특히 동물 사료 분야에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 대장균에서의 L-트립토판 생합성 경로와 여기에 관여하는 단백질들을 도식화한 것이다.
도 2는 효모유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소들의 아미노산 서열의 상동성을 도식화한 것이다.
도 3은 pCL-P_CJ1-trpD와 pCL-P_CJ1-trp4 벡터를 도식화한 것이다.
도 4는 발효 40시간에서의 L-트립토판 생산 모균주와 벡터 pCL-P_CJ1-trpD 또는 pCL-P_CJ1-trp4가 도입된 균주의 L-트립토판의 생산성을 비교한 것이다.
도 5는 L-트립토판 생산 모균주와 벡터 pCL-P_CJ1-trpD 또는 pCL-P_CJ1-trp4가 도입된 균주의 발효 후 트립토판 전구체인 안트라닐산의 축적량을 비교한 것이다.
도 6은 발효 40시간에서의 L-트립토판 생산 모균주와 유전체에 trp4 유전자 발현카세트가 삽입된 균주의 L-트립토판의 생산성을 비교한 것이다.
도 7은 L-트립토판 생산 모균주와 유전체에 trp4 유전자 발현카세트가 삽입된 균주들의 발효 후 트립토판 전구체인 안트라닐산의 축적량을 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 효모 유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 발현하도록 변형된, L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물을 제공한다.

안트라닐산 포스포리보실 전이효소는 안트라닐산과 PRPP를 이용하여 포스포리보실 안트라닐산을 합성하는 효소이다. L-트립토판 생산능이 강화된 생산균주의 경우 강화된 시킴산 경로를 통해 코리스믹산의 합성이 증가되고, 이는 다시 안트라닐산의 증가로 이어진다. 증가된 안트라닐산은 세포 내/외부에 축적되어 세포의 정상 생리활성을 방해하여 L-트립토판의 생산을 저해한다.

따라서, 안트라닐산 포스포리보실 전이효소의 발현강화를 통해 세포 내/외부의 안트라닐산 축적을 방지하고, L-트립토판의 생합성을 강화하고자 한다.

이때, 대장균의 trpD 유전자가 암호화하는 안트라닐산 포스포리보실 전이효소보다 PRPP에 대한 친화력이 더 우수한 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 이용함으로써 포스포리보실 안트라닐산의 합성속도를 더욱 증가시키고자 한다.

본 발명의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소는 효모 유래이며, 다양한 종의 효모 유래의 당해 효소의 아미노산 서열은 87% 이상의 상동성을 나타냄을 알 수 있다(도 2). 바람직하게는, 본 발명의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 그러나, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 효소의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다.

즉, 본 발명의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 유사 아미노산으로의 변이를 유발하는 침묵돌연변이(silent mutation) 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체 또는 인위적인 변형체일 수 있다. 여기에서, "수개"란, 단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2에서 20개, 바람직하게는 2에서 10개, 보다 바람직하게는 2에서 5개이다. 또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 또는 인위적인 변이(variant)에 의해서 발생하는 것도 포함된다.

본 발명의 활성 강화는 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 형질도입되거나, 상기 폴리 뉴클레오티드가 염색체 내에 삽입되어 달성될 수 있다.

상기 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 9로 기재된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포에 형질도입 될 수 있는데, 상기 도입될 숙주세포에서 사용하기 쉬운 코돈으로 치환할 수 있으며, N 말단 또는 C 말단이 연장 또는 삭제될 수 있으며, 발현량 조절을 위해 개시코돈이 변경될 수 있다. 이에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 변이체의 상기 효모유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해서, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수 (score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열로부터 제조된 프로브(probe)와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있으며, 정상적으로 기능하는 효모유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 암호화하는 변이형일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 용어 "엄격한 조건(stringent conditions)"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미하는 것이다. 이는 분자 클로닝(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 또는 분자 생물학에서 현재의 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있으며, 예컨대, 65℃의 혼성화 완충액(3.5X SSC, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청알부민, 2.5mM NaH₂PO₄ (pH 7.0), 0.5% SDS, 2 mM EDTA)에서의 혼성화를 기재하고 있다. SSC는 pH 7.0의 0.15 M 염화나트륨 / 0.15 M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을 실온에서 2X SSC로 세척하고 나서, 68℃의 온도에서 0.1 내지 0.5X SSC / 0.1X SDS로 세척한다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정 되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.

또한, 세균 내 염색체 삽입용 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편을 통해 염색체내 특정 유전자 좌(locus)에 목적 단백질을 암호화하는 신규 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 신규 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 염색체 삽입용 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합을 일으켜서, 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 세포를 선별, 즉, 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현카세트는 통상 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 프로모터는 숙주세포 내에서 목적 단백질을 암호화하는 풀리뉴클레오티드의 전사를 높은 빈도로 개시하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 프로모터를 이용할 수 있다. 바람직하게는 T7 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, CJ1 프로모터(대한민국 등록특허번호 제0620092호) 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 trc 프로모터, CJ1 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 발현카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명의 미생물은 L-트립토판을 생산할 수 있는 한, 원핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함 될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리키아 속에 속하는 미생물이고, 더 바람직하게는 대장균 (Escherichia coli)이다.

본 발명의 미생물이 L-트립토판을 생산하기 위해서는 추가로 안트라닐레이트 신타제(trpE), 포스포글리세레이트 데하이드로게나제(serA), 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-인산 신타제(aroG), 3-데하이드로퀴네이트 신타제(aroB), 시킴산 데하이드로게나제(aroE), 시킴산 키나제(aroL), 5-에놀산피루빌시킴산-3-인산 신타제 (aroA), 코리슴산 신타제(aroC), 프레펜산 데하이드라타제, 코리슴산 뮤타제 및, 트립토판 신타제(trpAB)로부터 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강화되거나, 코리슴산 뮤타제/프레펜산 데하이드라타제, 코리슴산 뮤타제/프레펜산 데하이드로게나제의 활성이 약화될 수 있다. 또한, 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 중 하나 이상이 L-트립토판 및 L-세린에 의한 피드백 저해가 해제되도록 변이를 가진 효소를 도입가 도입되도록 변형될 수 있다.

구체적인 실시예에서, 대장균에 서열번호 1로 기재되는 효모유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 암호화하는 유전자(trp4)를 포함하는 벡터로 형질전환하였으며, 제작된 균주를 CA04-2006으로 명명하고, 2013년 04월 08일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에 수탁번호 KCCM11408P로 기탁하였다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 효모유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 발현하도록 변형된 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 L-트립토판을 분리하는 단계를 포함하는 L-트립토판을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양조건은 통상의 에스케리키아 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있으나, 본 발명의 미생물의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

본 발명의 구체적인 양태로서, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

이때, 탄소원으로는 글루코오스, 프록토오스, 수크로스, 말토스, 만니톨, 소르비톨 같은 탄수화물, 당 알콜, 글리세롤, 피루브산, 락트산 및 시트르산과 같은 알콜 및 유기산, 글루탐산, 메티오닌 및 리신과 같은 아미노산 등이 포함되며, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수찌기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 L-트립토판은 추가로 정제 또는 회수하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 정제 또는 회수 방법은 본 발명의 미생물의 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-트립토판을 정제 또는 회수할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: CJ1 프로모터와 대장균유래 trpD 유전자 또는 효모유래 trp4 유전 자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

1-1. CJ1 프로모터 단편의 준비

CJ1 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해서, CJ1 프로모터를 포함하고 있는 pECCG117-CJ1 플라스미드(미국 등록특허번호 제8048648호)를 주형으로 이용하여 연쇄중합 반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 실시하였다. PCR HL 프리믹스 키트(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하였고, 이때 사용한 프라이머는 서열번호 2와 3이며, PCR 반응조건은 변성(denaturation)은 94℃에서 30초, 어닐링(annealing)은 55℃에서 30초, 신장 (elongation)은 72℃에서 30초이며, 이를 30회 반복 수행하였다.

상기 PCR 결과물(이하, "P_CJ1 단편"이라 명명함)은 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리(elution)하여 수득하였다.

1-2. trpD 및 trp4 유전자 단편의 준비

trpD 유전자의 ORF를 얻기 위하여 야생형 대장균 K-12유래의 W3110 균주를 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms)로부터 구입하였고, trp4 유전자의 ORF을 얻기 위하여 효모(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 미국생물자원 센터(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다.

상기 균주들로부터 유전체 DNA 추출 키트(QIAGEN사 제품)를 이용하여 유전체 DNA를 준비하였다. 상기 대장균 유전체 DNA를 주형으로, 서열번호 4와 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 서열번호 6의 trpD 유전자 ORF에 해당하는 DNA 단편 1,607 bp를 증폭하였다. 또한, 효모 유전체 DNA를 주형으로, 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 서열번호 9의 trp4 유전자 ORF에 해당하는 DNA단편 1,154 bp를 증폭하였다. 상기 PCR 결과물(이하, 각각 'trpD 단편', 'trp4 단편'이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.

1-3. 재조합 벡터 pCL - P _CJ1 - trpD 와 pCL - P _CJ1 - trp4 의 제조

상기 실시예 1-1에서 준비한 P_CJ1 단편과 pCL1920 벡터를 제한효소 EcoRⅠ으로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하였다. 각각의 DNA 단편을 Rapid DNA ligation kit (ROCHE사 제품, 이하 동일함)를 이용하여 30분간 접합(ligation)한 후, 대장균 DH5α 세포로 형질전환시키고, 이를 스펙티노마이신 (spectinomycin)을 함유한 LB 플레이트에 도말하여 형질전환된 균체를 선별하였다.

선별된 균체는 백금이를 이용하여 스펙티노마이신 함유 LB 액체 배지 20 mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 추출 키트(QIAGEN사 제품, 이하 동일함)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 EcoRI 을 처리하여 확인하였으며(데이터 미도시), 서열번호 2와 3의 프라이머로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합벡터를 "pCL-P_CJ1"로 명명하였다.

상기 실시예 1-2에서 준비한 trpD 단편 또는 trp4 단편과 상기 pCL-P_CJ1 벡터를 제한효소 EcoRV와 PstI으로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하였다. 각각의 DNA 단편을 Rapid DNA ligation kit (ROCHE사 제품, 이하 동일함)을 이용하여 30분간 접합(ligation)한 후, 대장균 DH5α 세포로 형질전환시켰다. 형질전환된 균체는 상기와 같은 방법으로 선별하였으며, 같은 방법으로 형질전환 균체로부터 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 EcoRI과 PstI 을 처리하여 확인하였으며(데이터 미도시), 서열번호 2와 5, 또는 서열번호 2와 8의 프라이머로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합벡터를 각각 "pCL-P_CJ1-trpD"와 "pCL-P_CJ1-trp4"로 명명 하였다(도 3).

실시예 2: 재조합 벡터 pCL - P _CJ1 - trpD 혹은 pCL - P _CJ1 - trp4 가 도입된 L-트립토판 생산균주 제작

실시예 1에서 준비한 pCL-P_CJ1-trpD와 pCL-P_CJ1-trp4 재조합 벡터는 EPICENTRE사가 공급하는 TSS 시약(Transformation and storage solution)을 이용하여 L-트립토판 생산 모균주에 도입하였다.

본 실시예에서는 L-트립토판 생산 모균주로서 대장균 KCCM11166P를 사용하였다. 대장균 KCCM11166P는 대장균 KCCM10812P(대한민국 등록특허번호 제10-0792095호)로부터 제작된 L-트립토판 생산균주로서 염색체상의 tehB 유전자가 불활성화되고, NAD 키나아제의 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균이다(대한민국 특허공개번호 제10-2012-0083795호).

L-트립토판 생산 모균주를 한 백금이 만큼 4 mL의 LB배지에 접종하여 3시간 동안 배양한 후 원심분리하였다. 분리한 세포에 50 ng의 pCL-P_CJ1-trpD 벡터 플라스미드 또는 pCL-P_CJ1-trp4 벡터 플라스미드와 TSS 시약을 100μL 첨가하여 잘 혼합하였다. 그 후, 단일단계 형질전환기법 (One-step transformation; Chung et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86, 2172-2175, 1989)을 사용하여 L-트립토판 생산 모균주에 도입하고, 이를 스펙티노마이신이 함유된 LB플레이트에 도말하여 형질전환된 균주를 선별해 내었다. 형질전환된 균주를 확인하기 위하여 형질전환된 균주로부터 플라스미드 DNA를 회수하였고, 실시예 1-3에서와 같은 방법으로 제한효소 처리 및 PCR을 수행하여 확인하였다. 상기 형질전환된 균주를 각각 'Con/pCL-P_CJ1-trpD'와 'Con/pCL-P_CJ1-trp4'으로 명명하였다.

실시예 3: 형질전환된 균주들의 L-트립토판 생산성 및 생리활성 비교

상기 실시예 2에서 준비한 형질전환된 균주들을 하기 표 1의 트립토판 역가배지를 이용하여 삼각플라스크에서 배양하여 L-트립토판 생산성을 비교하였다.

L-트립토판 생산 배지 조성 (리터당)

성분	첨가량 (g/L)
포도당	60
KH₂PO₄	0.3
K₂HPO₄	0.6
(NH₄)₂SO₄	15
MgSO₄·7H₂O	1
시트르산 나트륨	5
효모 추출물	2.5
L-타이로신	0.1
L-페닐알라닌	0.15
NaCl	2.5
탄산칼슘	40

37℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 L-트립토판 생산 모균주(Con), Con/pCL-P_CJ1-trpD 및 Con/pCL-P_CJ1-trp4 균주를 상기 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 40시간 동안 배양하였으며, 결과를 하기 표 2 및 3에 나타내었다.

L-트립토판 생산 모균주와 벡터로 trpD 혹은 trp4 유전자를 발현시킨 균주의 트립토판 생산성 비교

균주	L-트립토판 (g/L)	안트라닐산 ( mg /L)
Con/pCL Con/pCL-P_CJ1-trpD	6.9 ± 0.5 8.0 ± 0.4	722 ± 62 42 ± 13
Con/pCL-P_CJ1-trp4	10.3 ± 2.4	28 ± 1

L-트립토판 생산 모균주와 벡터로 trpD 혹은 trp4 유전자를 발현시킨 균주의 생리활성 비교

균주	균체량 ( OD ₆₀₀ )	당소모 속도 (g/L·h ^-1 )
Con/pCL Con/pCL-P_CJ1-trpD	18.2 ± 0.7 19.1 ± 1.4	1.78 ± 0.03 1.76 ± 0.05
Con/pCL-P_CJ1-trp4	20.7 ± 1.5	1.67 ± 0.06

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, L-트립토판 생산 모균주는 40시간 배양하였을 경우 6.9 g/L의 L-트립토판을 생산하였으나, Con/pCL-P_CJ1-trp4 균주와 Con/pCL-P_CJ1-trp4 균주는 각각 8.0 g/L와 10.3 g/L의 L-트립토판을 생산하여 모균주에 비해 각각 1.1 g/L와 3.4 g/L의 향상된 L-트립토판 생산성을 나타내었다(각각 16%, 49% 증가).

또한, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 균주들은 L-트립토판 생산모균주와 비교하였을 때, 당을 이용하는 속도나 세포성장에 있어서 비슷한 양상을 나타냈으며, 발효부산물인 아세테이트의 축적도 유사하거나 낮은 수준을 나타냈다(데이터 미도시). 따라서, 상기 형질전환된 균주는 L-트립토판 생산 모균주와 거의 유사한 생리활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

특히, L-트립토판 생산 모균주의 경우 발효 중의 안트라닐산의 축적을 동반하는 이상발효현상으로 인해 정상적인 발효를 유지하지 못하는 경우가 종종 나타난다. 따라서, L-트립토판 생산 모균주의 발효에서는 안트라닐산이 과도하게 축적되지 않도록 발효인자들을 조절하는 것이 중요하며, 지속적으로 모니터링 해야만 하는 어려움이 있다. 따라서, 안트라닐산이 적게 축적되는 L-트립토판 생산균주는 이상 발효의 빈도를 낮출 수 있다는 점에서 중요하게 여겨진다. 상기 표 2 및 도 3에서 보듯이 trpD 또는 trp4 유전자를 pCL벡터를 통해 발현하는 형질전환된 균주들은 L-트립토판 생산 모균주에 비해 안트라닐산이 적게 축적되는 현상을 나타냈다.

대장균 유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소와 효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 발현하는 형질전환된 균주를 비교할 경우, PRPP에 대한 친화력이 우수한 trp4 유전자를 발현하는 형질전환체가 L-트립토판의 생산성 증가와 안트라닐산의 축적 감소 측면에서 보다 더 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서, 이 형질전환된 균주를 이용하여 L-트립토판을 생산할 경우보다 높은 생산성으로 L-트립토판을 생산할 수 있음을 확인하였으며, 보다 높은 발효 안정성을 유지해 전체적인 L-트립토판의 생산성을 높게 유지할 수 있다고 결론지을 수 있다.

실시예 4: L-트립토판 생산균주에 재조합 벡터 pCL - P _CJ1 - trp4 의 도입 및 형질 전환체의 L-트립토판 생산성 비교

다른 L-트립토판 생산균주에서도 실시예 3에서와 같은 효과가 동일하게 나타나는지 확인하기 위하여, pCL-P_CJ1-trp4벡터를 도입하여 실시예 3과 같은 방법으로 L-트립토판 생산성을 비교하였다.

본 실시예에 사용된 L-트립토판 생산 대장균은 KCCM10805P(대한민국 등록특허번호 제0850853호)와 KCCM10814P(대한민국 등록특허번호 제0838036호)이다. KCCM10805P 대장균 변이주는 트립토판 유사체인 트립토판 하이드록사메이트(tryptophan hydroxamate) 내성을 갖는 L-트립토판 생산대장균 CJ285(대한민국 특허 공고 10-2005-0059685)로부터 유래된 균주로, 아질산염 환원작용에 관여하는 nrfE 유전자가 상동 재조합으로 불활성화된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산대장균이다. KCCM10814P 대장균 변이주는 CJ285 유래의 균주로 내부 생체막을 합성하는데 필요한 단백질을 코딩하는 yjeO 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산 대장균이다.

4-1. 재조합 벡터 pCL - P _CJ1 - trp4 가 도입된 여러 L-트립토판 생산균주의 제작

L-트립토판 생산균주균인 KCCM10805P와 KCCM10814P에 재조합 벡터 pCL-P_CJ1-trp4을 실시예 2에서와 같은 방법으로 도입하여 형질전환된 균주를 제작하였으며, 상기 형질전환된 균주를 각각 'KCCM10805P/pCL-P_CJ1-trp4'와 'KCCM10814P/pCL-P_CJ1-trp4'로 명명하였다.

4-2. 재조합 벡터 pCL - P _CJ1 - trp4 가 도입된 여러 L-트립토판 균주에서 L-트립토판 생산성 비교

상기 실시예 4-1에서 제작한 형질전환된 균주들을 실시예 3에서와 같은 방법으로 삼각플라스크에서 배양하여 L-트립토판 생산성을 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

균주	L-트립토판 (g/L)	Anthranilic acid ( mg /L)
Con/pCL Con/pCL-PCJ1-trp4	6.5 ± 0.5 10.2 ± 0.5	833 ± 100 45 ± 12
KCCM10805P KCCM10805P/pCL-P_CJ1-trp4	8.7 ± 0.3 9.6 ± 0.6	356 ± 82 67 ± 12
KCCM10814P KCCM10814P/pCL-P_CJ1-trp4	8.2 ± 0.9 9.8 ± 0.5	484 ± 114 63 ± 11

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 세 가지 L-트립토판 생산균주에서 모두 벡터로 효모유래 trp4 유전자를 발현시킨 경우 L-트립토판 생산성이 0.9 g/L에서 3.7 g/L 정도 향상되는 결과를 나타내었다. 또한, 세 균주에서 모두 벡터로 효모유래 trp4 유전자를 발현시켰을 경우 안트라닐산이 크게 감소함을 확인하였다. 따라서, 효모유래 trp4 유전자를 L-트립토판 생산균주에서 발현시킬 경우 L-트립토판의 생산성을 향상시키면서 안트라닐산의 축적을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5: L-트립토판 생산모균주의 염색체상에 CJ1 프로모터와 trp4 유전자 를 도입한 재조합 L-트립토판 생산균주 제작

실시예 3에서 제작한 Con/pCL-P_CJ1-trp4 균주의 경우 형질전환된 균주가 세포 분열하는 과정에서 플라스미드를 소실할 가능성이 있으며, 이를 통해 trp4 유전자의 발현 카세트를 소실할 수 있다. 이 경우 L-트립토판 생산모균주로 돌아가게 되어 안정적인 trp4 유전자의 발현카세트의 유지가 어려워진다. 또한, 플라스미드에 있는 항생제 내성 선별마커가 L-트립토판 생산 모균주의 유전체에 도입되어 해당 항생제에 대해 내성을 갖는 돌연변이 균주가 생성될 위험성이 있다.

이에 본 발명에서는 trp4 유전자의 발현카세트만을 L-트립토판 생산 모균주의 유전체에 있는 ybiX 유전자 좌에 삽입하여 이런 문제를 해결하고자 하였다.

5-1. P _CJ1 - trp4 단편과 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자를 포함하는 벡터의 준비

유전체 내부로의 trp4 유전자 발현카세트 삽입을 확인하기 위한 선별 마커로 클로람페니콜(chlroramphenicol)에 저항성을 부여하는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자를 이용하였으며, 이를 위해 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자를 포함하는 pUCprmfmloxC 벡터(대한민국 공개 특허: 제2009-0075549호)를 이용하였다.

실시예 1-3에서 제작한 pCL-P_CJ1-trp4를 주형으로 하여 서열번호 10과 11의 프라이머로 PCR을 수행하여 P_CJ1-trp4 단편을 준비하였다. 준비한 단편과 pUCprmfmloxC 벡터를 제한효소인 KpnI과 SpeI을 처리한 후, 0.8% 아가로스 겔에서 용리하였다. 각각의 DNA 단편을 Rapid DNA ligation kit(ROCHE社 제품, 이하 동일함)을 이용하여 30분간 접합(ligation)한 후, 대장균 DH5α 세포로 형질전환시켰다. 형질전환된 균체는 클로람페니콜을 포함하는 LB 고체배지에서 선별하였다. 선별한 콜로니를 LB 액체 배지에 배양하여 플라스미드 DNA를 회수하였고, 제한효소 처리 및 시퀀싱(sequencing)을 통하여 P_CJ1-trp4 유전자와 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자가 포함된 벡터가 제대로 제작된 것을 확인하였다. 확인된 벡터는 'pmlox-Cmt-P_CJ1-trp4'로 명명하였다.

5-2. ybiX 유전자 좌( locus )에 P _CJ1 - trp4 유전자와 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입하기 위한 단편의 준비

ybiX 유전자(Gene ID: 12930961)는 아직까지 기능이 명확히 규명되지 않은 유전자로 결손시 세포내 ATP 수위가 높아지는 것으로 알려져 있다 (Hara et al., FEMS Microbiol Lett, 297, 217-224, 2009). 대장균에서 ybiX 유전자를 결손하여도 대장균의 생리활성에 크게 영향을 끼치지 않음이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 trp4 유전자 발현 카세트를 L-트립토판 생산모균주의 유전체에 있는 ybiX 유전자 좌에 삽입하였다.

ybiX 유전자 좌에 삽입하기 위한 trp4 발현카세트 단편은 실시예 5-1에서 제작한 pmlox-Cmt-P_CJ1-trp4 플라스미드를 주형으로 하여 서열번호 12와 13의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 준비하였다. 준비한 DNA 단편은 0.8% 아가로스 겔에서 용리하였다. 이렇게 용리한 DNA 단편을 다시 주형으로 하여 서열번호 14과 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 준비한 DNA 단편은 0.8% 아가로스 겔에서 용리하였다.

준비된 DNA 단편은 5'와 3' 말단에 각각 ybiX 유전자와 같은 서열을 100 bp 포함하는 단편조각으로, L-트립토판 생산균주의 ybiX 유전자 좌에서 유전자재조합효소(recombinase)에 의해 유전체 내로 삽입될 수 있다. 준비한 DNA 단편은 나노드롭(NanoDrop, Thermo SCIENTIFIC社)을 이용하여 농도를 측정하였으며, 이를 'ybiX::Cm-P_CJ1-trp4'로 명명하였으며, 그 서열을 서열번호 16에 나타내었다.

5-3. L-트립토판 생산균주의 ybiX 유전자 좌( locus )에 P _CJ1 - trp4 의 효모유래 안트라닐산 포스포리보실 전이효소 발현 카세트의 삽입

ybiX 유전자 좌에 trp4 유전자 발현카세트를 유전자재조합효소 (recombinase)를 이용하여 삽입하였다. 이를 위해 Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lamda Red recombinase)를 이용한 1단계 유전자 불활성화 기법(one-step inactivation)을 응용하였다(Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97, 6640-6645, 2000).

람다 레드 재조합효소를 발현하는 벡터인 pKD46 플라스미드를 실시예 2와 같은 방법으로 L-트립토판 생산균주(KCCM 10812P)에 도입하였다. pKD46 벡터가 도입된 L-트립토판 생산균주를 암피실린(ampicilin)을 포함하는 LB고체 배지에서 선별하였다. 선별한 pKD46 벡터가 도입된 L-트립토판 생산균주는 람다 레드 재조합효소의 발현을 유도하기 위하여 5 mM의 아라비노즈(arabinose)를 포함한 20 mL 의 액체 LB배지에서 배양하였다. 균체의 양이 5 Ⅹ 10⁸ cells/mL 로 자랐을 때 원심분리하여 균체를 회수하고 이를 차가운 10% 글리세롤(glycerol) 용액으로 3회 세척하였다.

이렇게 준비한 L-트립토판 생산균주에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 실시예 5-2에서 준비한 500ng의 ybiX::Cm-P_CJ1-trp4 DNA 단편을 도입하였다. 상기 DNA 단편 조각이 도입된 L-트립토판 생산균주는 람다 레드 재조합효소에 의해 ybiX 유전자 좌에서 유전자 재조합이 일어나서 클로람페니콜 저항성 유전자와 trp4 유전자 발현카세트가 ybiX 유전자 좌에 삽입된다. 이 균주는 클로람페니콜에 대한 저항성을 나타내기 때문에 클로람페니콜을 포함하는 LB고체 배지에서 선별해 내었다. 이렇게 선별한 균주는 서열번호 17과 18의 프라이머로 콜로니 PCR을 통해서 ybiX 유전자 좌에 Cm-P_CJ1-trp4 단편이 삽입된 것을 확인하였다.

다음으로, pKD46 벡터는 온도에 민감한 복제기점(replication origin)을 가지고 있기 때문에, 선별한 균주를 40℃ 이상에서 배양하여 균체 내에서 pKD46 벡터를 제거하였고, 이는 암피실린을 포함한 고체 LB배지에서 선별한 균주가 자라지 않는 것을 통해서 확인하였다.

그 후에 L-트립토판 생산균주의 유전체에서 클로람페니콜에 대한 저항성을 나타내는 유전자를 제거하기 위하여 pJW168 플라스미드(Palmeros et al., Gene, 247, 255-264, 2000)를 균주에 실시예 2와 동일한 방법으로 도입하였다. 도입한 pJW168 플라스미드로부터 Cre 재조합효소(Cre-recombinase)를 발현시키기 위하여 암피실린을 포함한 LB배지에 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토시드(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)를 도말하여 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 Cre 재조합효소에 의해 mutant loxP 위치에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜에 대한 저항성 유전자가 제거되었고, 이를 서열번호 17과 18의 프라이머로 확인하였다. 이렇게 확인된 균주는 trp4 유전자 발현카세트가 삽입된 L-트립토판 생산균주로 'Con/ybiX::P_CJ1-trp4'로 명명하였다.

실시예 6: 염색체상에 P _CJ1 - trp4 의 발현카세트가 삽입된 형질전환체의 L-트립 토판 생산성 및 생리활성 비교

상기 실시예 5에서 준비한 형질전환체를 상기 표 1의 트립토판 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크에서 배양하여 L-트립토판 생산성을 비교하였다.

37℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 중에서 밤새 배양한 L-트립토판 생산모균주(Con), Con/ybiX::P_CJ1-trp4 균주를 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 40시간 동안 배양하였으며, 그 결과를 하기 표 5와 6에 나타내었다.

L-트립토판 모균주와 trp4 유전자 발현카세트를 염색체상에 삽입시킨 균주의 트립토판 생산성 비교

균주	L-트립토판 (g/L)	안트라닐산 ( mg /L)
Con	6.3 ± 1.5	579 ± 32
Con/ybiX::P_CJ1-trp4	9.2 ± 1.2	31 ± 18

L-트립토판 모균주와 trp4 유전자 발현카세트를 염색체상에 삽입시킨 균주의 생리활성 비교

균주	균체량 ( OD ₆₀₀ )	당소모속도 (g/L·h ^-1 )
Con	17.7 ± 1.3	1.50 ± 0.08
Con/ybiX::P_CJ1-trp4	19.3 ± 1.6	1.54 ± 0.07

상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 모균주는 40시간 배양하였을 경우 6.3 g/L의 L-트립토판을 생산하였으나, Con/ybiX::P_CJ1-vhb 균주는 9.2 g/L로 L-트립토판을 생산하여 모균주에 비해 2.9 g/L(46% 증가)의 향상된 L-트립토판 생산성을 나타내고 있음을 확인하였다.

또한, 표 6에 나타낸 바와 같이 Con/ybiX::P_CJ1-trp4는 벡터로 trp4 유전자 발현카세트를 도입하였을 때와 마찬가지로 당을 이용하는 속도나 세포성장에 있어서 모균주와 비슷한 양상을 나타냈고, 발효부산물인 아세테이트의 축적도 유사하거나 낮은 수준을 나타냈다(데이터 미도시).

따라서, 상기 Con/ybiX::P_CJ1-trp4 역시 벡터로 trp4 유전자 발현카세트를 도입한 형질전환체와 마찬가지로 L-트립토판 생산모균주와 거의 유사한 생리활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 발효 중의 안트라닐산의 축적량도 벡터로 trp4 유전자 발현카세트를 도입한 형질전환체와 마찬가지로 L-트립토판 생산모균주에 비해 크게 감소함을 확인하였다. 따라서, 이 형질전환체를 이용하여 L-트립토판을 생산할 경우 보다 높은 생산성으로 L-트립토판을 생산할 수 있음을 확인하였으며, 보다 높은 발효 안정성을 유지해 전체적인 L-트립토판의 생산성을 높게 유지할 수 있다고 결론지을 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11408P

20130408

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Microorganisms for production of L-tryptophan and method for the production of L-tryptophan using the same <130> PA12-0470 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 380 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Glu Ala Thr Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Lys Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Pro Pro Gln Leu Ser Ser Thr Asp Leu His Asp Ala Leu Leu Val Ile 20 25 30 Leu Ser Leu Leu Gln Lys Cys Asp Thr Asn Ser Asp Glu Ser Leu Ser 35 40 45 Ile Tyr Thr Lys Val Ser Ser Phe Leu Thr Ala Leu Arg Val Thr Lys 50 55 60 Leu Asp His Lys Ala Glu Tyr Ile Ala Glu Ala Ala Lys Ala Val Leu 65 70 75 80 Arg His Ser Asp Leu Val Asp Leu Pro Leu Pro Lys Lys Asp Glu Leu 85 90 95 His Pro Glu Asp Gly Pro Val Ile Leu Asp Ile Val Gly Thr Gly Gly 100 105 110 Asp Gly Gln Asn Thr Phe Asn Val Ser Thr Ser Ala Ala Ile Val Ala 115 120 125 Ser Gly Ile Gln Gly Leu Lys Ile Cys Lys His Gly Gly Lys Ala Ser 130 135 140 Thr Ser Asn Ser Gly Ala Gly Asp Leu Ile Gly Thr Leu Gly Cys Asp 145 150 155 160 Met Phe Lys Val Asn Ser Ser Thr Val Pro Lys Leu Trp Pro Asp Asn 165 170 175 Thr Phe Met Phe Leu Leu Ala Pro Phe Phe His His Gly Met Gly His 180 185 190 Val Ser Lys Ile Arg Lys Phe Leu Gly Ile Pro Thr Val Phe Asn Val 195 200 205 Leu Gly Pro Leu Leu His Pro Val Ser His Val Asn Lys Arg Ile Leu 210 215 220 Gly Val Tyr Ser Lys Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Ala 225 230 235 240 Leu Val Tyr Pro Gly Ser Glu Thr Phe Ile Val Trp Gly His Val Gly 245 250 255 Leu Asp Glu Val Ser Pro Ile Gly Lys Thr Thr Val Trp His Ile Asp 260 265 270 Pro Thr Ser Ser Glu Leu Lys Leu Lys Thr Phe Gln Leu Glu Pro Ser 275 280 285 Met Phe Gly Leu Glu Glu His Glu Leu Ser Lys Cys Ala Ser Tyr Gly 290 295 300 Pro Lys Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Glu Glu Val Leu Ser Gly Lys 305 310 315 320 Tyr His Leu Gly Asp Asn Asn Pro Ile Tyr Asp Tyr Ile Leu Met Asn 325 330 335 Thr Ala Val Leu Tyr Cys Leu Ser Gln Gly His Gln Asn Trp Lys Glu 340 345 350 Gly Ile Ile Lys Ala Glu Glu Ser Ile His Ser Gly Asn Ala Leu Arg 355 360 365 Ser Leu Glu His Phe Ile Asp Ser Val Ser Ser Leu 370 375 380 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Pcj1-F-EcoRI <400> 2 cagaattcca ccgcgggctt attc 24 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Pcj1-R-EcoRI <400> 3 gagaattcgt agatatctta atctcctaga ttgggtttc 39 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for trpD-F-EcoRV <400> 4 atcatggctg acattctgct gctc 24 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for trpD-R-PstI <400> 5 cactgcagtt accctcgtgc cgccagtg 28 <210> 6 <211> 1596 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atggctgaca ttctgctgct cgataatatc gactctttta cgtacaacct ggcagatcag 60 ttgcgcagca atgggcataa cgtggtgatt taccgcaacc atattccggc gcaaacctta 120 attgaacgcc tggcgaccat gagcaatccg gtgctgatgc tttctcctgg ccccggtgtg 180 ccgagcgaag ccggttgtat gccggaactc ctcacccgct tgcgtggcaa gctgcccatt 240 attggcattt gcctcggaca tcaggcgatt gtcgaagctt acgggggcta tgtcggtcag 300 gcgggcgaaa ttctccacgg taaagcctcc agcattgaac atgacggtca ggcgatgttt 360 gccggattaa caaacccgct gccggtggcg cgttatcact cgctggttgg cagtaacatt 420 ccggccggtt taaccatcaa cgcccatttt aatggcatgg tgatggcagt acgtcacgat 480 gcggatcgcg tttgtggatt ccagttccat ccggaatcca ttctcaccac ccagggcgct 540 cgcctgctgg aacaaacgct ggcctgggcg cagcagaaac tagagccagc caacacgctg 600 caaccgattc tggaaaaact gtatcaggcg cagacgctta gccaacaaga aagccaccag 660 ctgttttcag cggtggtgcg tggcgagctg aagccggaac aactggcggc ggcgctggtg 720 agcatgaaaa ttcgcggtga gcacccgaac gagatcgccg gggcagcaac cgcgctactg 780 gaaaacgcag cgccgttccc gcgcccggat tatctgtttg ctgatatcgt cggtactggc 840 ggtgacggca gcaacagtat caatatttct accgccagtg cgtttgtcgc cgcggcctgt 900 gggctgaaag tggcgaaaca cggcaaccgt agcgtctcca gtaaatctgg ttcgtccgat 960 ctgctggcgg cgttcggtat taatcttgat atgaacgccg ataaatcgcg ccaggcgctg 1020 gatgagttag gtgtatgttt cctctttgcg ccgaagtatc acaccggatt ccgccacgcg 1080 atgccggttc gccagcaact gaaaacccgc accctgttca atgtgctggg gccattgatt 1140 aacccggcgc atccgccgct ggcgttaatt ggtgtttata gtccggaact ggtgctgccg 1200 attgccgaaa ccttgcgcgt gctggggtat caacgcgcgg cggtggtgca cagcggcggg 1260 atggatgaag tttcattaca cgcgccgaca atcgttgccg aactgcatga cggcgaaatt 1320 aaaagctatc agctcaccgc agaagacttt ggcctgacac cctaccacca ggagcaactg 1380 gcaggcggaa caccggaaga aaaccgtgac attttaacac gtttgttaca aggtaaaggc 1440 gacgccgccc atgaagcagc cgtcgctgcg aacgtcgcca tgttaatgcg cctgcatggc 1500 catgaagatc tgcaagccaa tgcgcaaacc gttcttgagg tactgcgcag tggttccgct 1560 tacgacagag tcaccgcact ggcggcacga gggtaa 1596 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for trp4-F-EcoRV <400> 7 atcatgtccg aggcgacttt gctatc 26 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for trp4-R-PstI <400> 8 gtctgcagct acaaggagct cacactatct ataaag 36 <210> 9 <211> 1143 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 9 atgtccgagg cgactttgct atcttacacc aagaaattat tggcttctcc gccgcaattg 60 agtagcacag acctacacga tgcgttgctg gttatattaa gtcttttgca aaaatgtgat 120 acaaatagcg atgagagtct ttccatctat accaaagttt cgagttttct cacggccttg 180 agagttacta aacttgatca caaggctgaa tacattgcgg aagctgcaaa ggctgtgctc 240 agacattccg accttgttga tctaccttta cccaagaagg acgaattaca cccggaagat 300 ggaccagtaa tcttagatat tgtaggtact ggtggtgacg gacagaatac ttttaatgtt 360 tccacgtctg ctgctatcgt tgcctccgga attcagggcc taaaaatttg taagcacggt 420 ggtaaagctt ctacatccaa tagtggagct ggtgacctaa ttggaacttt aggctgtgac 480 atgttcaagg ttaattcatc gacagtgccc aaactttggc ctgataatac gttcatgttt 540 ctacttgctc ctttttttca tcatggaatg ggccacgttt ctaagatacg caaatttctt 600 ggaattccga ctgttttcaa cgtactggga ccacttctac atccagttag ccacgtaaac 660 aagagaatat tgggcgttta ctcaaaggaa cttgcgcctg aatatgccaa ggcagccgct 720 ttggtatatc caggaagcga aacttttata gtttggggac atgttgggtt agacgaagta 780 tcacctatag gcaaaactac tgtctggcat attgatccga catcgtccga acttaaattg 840 aagaccttcc aattagaacc ttctatgttt ggtttagaag aacacgagtt gtcgaagtgt 900 gcttcatacg gccctaaaga gaatgcgaga attctaaaag aagaagtctt gtccggcaag 960 taccaccttg gcgacaataa tcctatttat gactacatct tgatgaacac cgccgtgtta 1020 tattgtttaa gccaaggtca ccagaactgg aaggaaggga tcattaaggc agaagaaagc 1080 atacattctg gtaatgcatt acgttcttta gaacacttta tagatagtgt gagctccttg 1140 tag 1143 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Pcj1-F-KpnI <400> 10 caggtaccca ccgcgggctt attc 24 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for trp4-R-SpeI <400> 11 gtactagtct acaaggagct cacactatct ataaag 36 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for GI-ybiX-Cm-F <400> 12 tcgcgaacaa ctggaacaag ccgaatgggt ggatggacgc gtcaccaccg ataggcctag 60 gatgcatatg 70 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for GI-ybiX-trp4-R <400> 13 acaggatctc ttcactttcg ccgtagcggc ttttcagcga ctgaatattg ccaaaacagc 60 caagctttac 70 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for GI-ybiX-F <400> 14 atgatgtacc acattcccgg cgtgttatcg ccacaggacg tcgctcgttt tcgcgaacaa 60 ctggaacaag 70 <210> 15 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for GI-ybiX-R <400> 15 tcagatctcc gaccattccc gcagcagatt atgataaaga ttaagcagcg acaggatctc 60 ttcactttcg 70 <210> 16 <211> 2824 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ybiX::Cm-PCJ1-trp4 <400> 16 tcagatctcc gaccattccc gcagcagatt atgataaaga ttaagcagcg acaggatctc 60 ttcactttcg ccgtagcggc ttttcagcga ctgaatattg ccaaaacagc caagctttac 120 cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta tctgccctga accgacgacc gggtcgaatt 180 tgctttcgaa tttctgccat tcatccgctt attatcactt attcaggcgt agcaaccagg 240 cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc ccgccctgcc actcatcgca 300 gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa cggcatgatg 360 aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatggt 420 gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac tggtgaaact 480 cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc 540 caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc 600 gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta 660 acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacggaattc 720 cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt 780 atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct ggttataggt 840 acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc 900 aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc ctgaaaatct 960 cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa agttggaacc 1020 tcttacgtgc cgatcaacgt ctcattttcg ccaaaagttg gcccagggct tcccggtatc 1080 aacagggaca ccaggattta tttattctgc gaagtgatct tccgtcacag gtatttattc 1140 ggcgcaaagt gcgtcgggtg atgcataact tcgtatagca tacattatac gaacggtacc 1200 catcagatcc ctcgagctac aaggagctca cactatctat aaagtgttct aaagaacgta 1260 atgcattacc agaatgtatg ctttcttctg ccttaatgat cccttccttc cagttctggt 1320 gaccttggct taaacaatat aacacggcgg tgttcatcaa gatgtagtca taaataggat 1380 tattgtcgcc aaggtggtac ttgccggaca agacttcttc ttttagaatt ctcgcattct 1440 ctttagggcc gtatgaagca cacttcgaca actcgtgttc ttctaaacca aacatagaag 1500 gttctaattg gaaggtcttc aatttaagtt cggacgatgt cggatcaata tgccagacag 1560 tagttttgcc tataggtgat acttcgtcta acccaacatg tccccaaact ataaaagttt 1620 cgcttcctgg atataccaaa gcggctgcct tggcatattc aggcgcaagt tcctttgagt 1680 aaacgcccaa tattctcttg tttacgtggc taactggatg tagaagtggt cccagtacgt 1740 tgaaaacagt cggaattcca agaaatttgc gtatcttaga aacgtggccc attccatgat 1800 gaaaaaaagg agcaagtaga aacatgaacg tattatcagg ccaaagtttg ggcactgtcg 1860 atgaattaac cttgaacatg tcacagccta aagttccaat taggtcacca gctccactat 1920 tggatgtaga agctttacca ccgtgcttac aaatttttag gccctgaatt ccggaggcaa 1980 cgatagcagc agacgtggaa acattaaaag tattctgtcc gtcaccacca gtacctacaa 2040 tatctaagat tactggtcca tcttccgggt gtaattcgtc cttcttgggt aaaggtagat 2100 caacaaggtc ggaatgtctg agcacagcct ttgcagcttc cgcaatgtat tcagccttgt 2160 gatcaagttt agtaactctc aaggccgtga gaaaactcga aactttggta tagatggaaa 2220 gactctcatc gctatttgta tcacattttt gcaaaagact taatataacc agcaacgcat 2280 cgtgtaggtc tgtgctactc aattgcggcg gagaagccaa taatttcttg gtgtaagata 2340 gcaaagtcgc ctcggacatg atatcttaat ctcctagatt gggtttcact caaggtttat 2400 gttccacgca ggcgcccgcg acggcaggat tggtgagtgt gtaccaacct caacctggtg 2460 tcagcaacca ttctggcact cagccccctc gagtgcaaga aaaaaggtac ttgagatcat 2520 aaatctccag ctcaccagcg tgcctgcaca tgtcattatt ttctctcctg gttggcagca 2580 tcggatcaga agctcccgac acagtcaatt tcgtcgcatt ccctgccatt cctggtcatt 2640 ccatgtaatg gaataagccc gcggtggtcg acgtcccatg tgcaggtgct ctgcaggcgg 2700 ccgccatatg catcctaggc ctatcggtgg tgacgcgtcc atccacccat tcggcttgtt 2760 ccagttgttc gcgaaaacga gcgacgtcct gtggcgataa cacgccggga atgtggtaca 2820 tcat 2824 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for UP-ybiX-F <400> 17 cctcaatcaa caagagcggc taccg 25 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DOWN-ybiX-R <400> 18 gcaccgcact cttcacattc atccag 26

Claims

효모유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 발현하도록 변형된, L-트립토판 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아속 미생물.
제1항에 있어서,
효모 유래의 안트라닐산 포스포리보실 전이효소는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, L-트립토판 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 변형은 안트라닐산 포스포리보실 전이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 형질도입되거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 삽입되어 이루어지는 것을 특징으로 하는, L-트립토판 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아속 미생물.
제3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, L-트립토판 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는, L-트립토판 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아속 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 L-트립토판 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 L-트립토판을 분리하는 단계를 포함하는 L-트립토판 생산방법.