MX2014008470A - Un microorganismo del género escherichia que tiene productividad aumentada de l-triptófano y un método para producir l-triptófano utilizando el mismo. - Google Patents
Un microorganismo del género escherichia que tiene productividad aumentada de l-triptófano y un método para producir l-triptófano utilizando el mismo.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona a microorganismos de Escherichia coli que tienen una productividad aumentada de L-triptófano y a un método para producir L-triptófano usando los mismos; más particularmente, la invención presente se relaciona a una variante de Escherichia coli en el que el control de la represión y atenuación del operón de triptófano se libera y se reduce la acumulación de antranilato y así se aumenta la productividad del L-triptófano; la invención presente también se refiere a un método para producir L-triptófano usando la variante de Escherichia coli.
Description
UN MICROORGANISMO DEL GÉNERO ESCHERICHIA QUE TIENE
PRODUCTIVIDAD AUMENTADA DE L-TRIPTÓFANO Y UN MÉTODO PARA
PRODUCIR L-TRIPTÓFANO UTILIZANDO EL MISMO
CAMPO TÉCNICO
La invención presente se refiere a un microorganismo del género Escherichia que tiene productividad aumentada de L-triptófano, y a un método de producción de L-triptófano usando el mismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El L-triptófano, un aminoácido esencial, ha sido utilizado extensamente como un aditivo de comida, una materia prima para fármacos médicos tales como soluciones de infusión, y como un material para alimentos saludables, y ha sido producido por síntesis química, reacción enzimática, fermentación, etc.
Recientemente, la producción de L-triptófano es llevada a cabo principalmente por fermentación microbiana. En la etapa inicial de industrialización, se han usado principalmente cepas análogas resistentes obtenidas por mutación química. Sin embargo, ya que las tecnologías de recombinación de genes se desarrollaron rápidamente en los años 1990 y se comprendieron los mecanismos reguladores a nivel molecular, se han usado
ampliamente las cepas recombinantes E. coli y Corynebacterium obtenidas por técnicas de diseño genético.
La producción de triptófano por los microorganismos comienza con DAHP(3-deoxi-D-arobino-heptulosonato-7-fosfato) producido por la polimerización de PEP (FosfoEnolPiruvato) que es un intermediario de la glucólisis, con E4P (eritrosa-4-fosfato) que es un intermediario de la trayectoria de pentosa fosfato. Entonces, el triptófano es biosintetizado de corismato a través de la trayectoria común biosintética aromática. Específicamente, el triptófano se sintetiza por antranilato sintasa (EC 4.1.3.27) codificada por el gen trpE, antranilato sintasa (EC 4.1.3.27) y antranilato PRPP transferasa (EC 2.4.1.28) codificada por el gen trpD, indol-3-glicerol fosfato sintasa (EC 4.1.1.48) y fosforibosilantranilato isomerasa (EC 5.3.1.24) codificado por el gen trpC, y triptófano sintasa (EC 4.2.1.20) codificado por el gen trpB y el gen trpA. El conjunto génico trpEDCBA que media la reacción anterior se coloca en el cromosoma y tiene una estructura de operón que contiene una sola región reguladora.
Un operón de triptófano es transcrito activamente para producir una cantidad suficiente de triptófano requerido por la célula. Sin embargo, si el nivel de triptófano en la célula es alto, un represor se une al triptófano y entonces el operón de triptófano es desactivado por la unión del represor a la región reguladora del operón, con lo cual se inhibe la transcripción.
Además, los operones para la biosintesis de aminoácidos tal como treonina, fenilalanina, leucina, triptófano e histidina tienen otro
mecanismo regulador conocido como una atenuación (Bacteriol J. (1991) 173, 2328-2340). Como es sabido en la técnica con respecto a la atenuación, bajo condiciones deficientes en aminoácidos, la estructura del ARNm que corresponde a la región específica de secuencia entre el promotor y el primer gen del operón en el cromosoma, los cambios a una estructura ventajosos para el proceso de traducción para promover la expresión de genes biosintéticos, pero bajo condiciones ricas en aminoácidos, el ARNm transcrito corto forma una estructura tridimensional, denominada "estructura de horquilla", para inhibir el proceso de traducción (J Biol Chem. (1988) 263:609-612).
En la etapa inicial del desarrollo de cepas productoras de L-triptófano, fue un objetivo principal aumentar la eficiencia de la producción a través de la mejora de la actividad de enzima ya sea liberando las enzimas de inhibición de retroalimentación de la trayectoria de biosíntesis de triptófano causadas por el producto final, triptófano o aumentando el número de copias de los genes de operón de triptófano en el cromosoma o en forma de vector para aumentar la expresión de las enzimas biosintéticas de triptófano (Appl. Environ. Microbiol., (1982) 43:289-297; Appl. Microbio!. Biotechnol., (1993) 40:301-305; Trends Biotechnol., (1996) 14:250-256).
Los métodos para impartir la capacidad de producir L-triptófano a microorganismos incluyen un método para impartir resistencia a los análogos del triptófano o antranilato como el producto intermediario por mutación química, o por un método de modificación de microorganismos por
ingeniería genética. Ejemplos del método de mutación química incluyen aquellos descritos en el Registro de Patente Coreana No. 1987-0001813, Registro de Patente Coreana No. 0949312 y similares, y ejemplos del método de modificación basado en la ingeniería genética incluyen varios enfoques que utilizan una cepa obtenida aumentando el gene tktA que codifica la transcetolasa o el gen galP que codifica la galactosa permeasa en la trayectoria de biosíntesis de aminoácidos aromáticos para aumentar el suministro de E4P (eritrosa4-fosfato) o PEP (fosfoenolpiruvato) y reducir la inhibición de retroalimentación de DAHP (3-deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato) para mejorar la trayectoria biosintética aromática (Trends Biotechnol., (1996) 14:250-256, Microbial Cell Faetones (2009) 8:19), o una cepa obtenida introduciendo adicionalmente genes de operón de triptófano en el vector o el cromosoma (Appl. Environ. Microbiol.,(1982) 43:289-297, Appl. icrobiol. Biotechnol., (1993) 40:301-305).
Sin embargo, aunque el operón del triptófano fue introducido con liberación de la inhibición de retroalimentación de las enzimas biosintéticas, esos enfoques no alcanzaron un aumento en el rendimiento de la producción del triptófano, debido a los mecanismos reguladores tales como la inhibición o atenuación de los genes de operón al nivel de la transcripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Problema Técnico
Los inventores presentes han desarrollado un método para liberar la inhibición o la atenuación de los genes de operón de triptófano al nivel de transcripción en una cepa productora de L-triptófano, y un método capaz de mejorar las enzimas biosintéticas de triptófano utilizando el mismo. Además, para resolver el problema en que el rendimiento de la producción de las cepas productoras de triptófano no aumenten debido a la acumulación de antranilato a medida que se mejora el operón de triptófano, los inventores presentes han construido una cepa productora de triptófano que tiene un aumento en el rendimiento de producción y bajo nivel de acumulación de antranilato al expresar el conjunto del gen diferente del gen que codifica la antranilato sintasa (TrpE) entre los genes de operón de triptófano como una forma que está desensibilizada a un mecanismo regulador tal como el mecanismo de inhibición de retroalimentación o de inhibición
Es un objetivo de la invención presente proporcionar un microorganismo del género Escherichia que tiene una productividad aumentada de L-triptófano al modificar como para desensibilizar la inhibición o atenuación del operón de triptófano y reduce la acumulación de antranilato.
Otro objetivo de la invención presente es proporcionar un método para producir L-triptófano usando el microorganismo del género Escherichia.
Solución técnica
Para alcanzar los objetivos anteriores, una modalidad de la invención presente proporciona un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad aumentada de L-triptófano que ha sido modificado para deletar una parte o todo de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 en un operón de triptófano endógeno.
Otra modalidad de la invención presente también proporciona un método para producir L-triptófano, que comprende cultivar el microorganismo recombinante antes mencionado del género Escherichia.
Efectos ventajosos
El microorganismo recombinante producido de acuerdo con la invención presente elimina la acumulación excesiva de antranilato en el mismo y puede ser ventajosamente usado para producir L-triptófano en alto rendimiento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra una vista esquemática que representa los genes del operón de triptófano, una región reguladora para los genes en el cromosoma de E. coli, y la forma de deleción del gen descrito en la invención
presente.
A) Los genes del operón de Triptófano, y a región reguladora de los mismos en el cromosoma de E. coli (Ptrp);
B) Una forma Ptrp;
C) Una forma que en el péptido líder de codificación del gen trpL es deletada (DtrpL); y
D) Una forma que en el péptido líder que codifica el gen trpL y el atenuador son deletados (Dtrp att).
La figura 2 muestra un vector pCL-GFP usado para medir la intensidad de una región reguladora de expresión del operón de triptófano.
La figura 3 muestra el vector plNT17E-Patt-trpDCBA para introducir los genes biosintéticos de triptófano trpDCBA en el cromosoma para aumentar el número de copias de los genes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En lo siguiente, la presente invención se describirá en detalle.
Una modalidad de la invención presente proporciona un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene productividad aumentada de L-triptófano, que ha sido modificado para deletar parte o todo de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 en un operón de
triptófano endógeno.
Como se usa en la presente, el término "operón de triptófano" u "operón de Trp" significa el operón entero que incluye todos los genes trpEDCBA. El operón de triptófano tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 9.
Un microorganismo productor de L-triptófano que puede ser usado en la invención presente puede ser cualquier microorganismo procariótico o eucariótico en tanto que tengan una productividad de L-triptófano. Ejemplos de este microorganismo pueden incluir los microorganismos que pertenecen al género Escherichia, el género Erwinia, al género Serratia, al género Providencia, al género Corynebacterium y al género Brevibacterium. El microorganismo es específicamente un microorganismo que pertenece al género Escherichia, y más específicamente E. coli. Más específicamente, la cepa de E. coli de la invención presente puede ser una cepa obtenida al aumentar las actividades de las enzimas biosintéticas de triptófano tal como antranilato sintasa (TrpE), antranilato PRPP transferasa (TrpD), fosforibosil antranilato isomerasa (TrpC) o triptófano sintasa (TrpA, TrpB) mientras que mantiene la 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato sintasa (aroG) que se libera para la inhibición de retroalimentación, mejorando las actividades de las enzimas de la trayectoria de biosíntesis aromática tal como 3-dehidroquinato sintetasa(AroB), shikimato deshidrogenasa (AroE), shikimato cinasa (AroL), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (AroA) o corismato sintasa (AroC), mejorando la actividad de la
fosfoglicerato deshidrogenasa (SerA) o transcetolasa (TktA) para aumentar el suministro de los intermediarios, serina y PRPP, de la trayectoria de biosíntesis del triptófano. Además, la cepa de E. coli de la invención presente puede ser una cepa obtenida al inactivar las actividades de la prefenato deshidratase y corismato mutasa (PheA) en la trayectoria de biosíntesis aromática o inactivando las actividades de la prefenato deshidrogenasa, corismato mutasa (tyrA), triptófanoasa (tnaA) y transportador de triptófano (tnaB, mtr).
Más específicamente, el microorganismo recombinante de la invención presente es la cepa recombinante de E. coli CA04-2004 (número de acceso: KCCM1 1246P).
Como se usa en este documento, el término "región reguladora de expresión" del operón de triptófano endógeno significa una región que incluye un promotor, un péptido líder y un atenuador endógeno. Específicamente, la región reguladora de expresión tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 .
Como se utiliza en este documento, el término "péptido líder" significa un péptido de peso molecular bajo que es codificado por la secuencia líder corriente arriba del codón de comienzo del gen. Específicamente, el péptido líder tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 2, y un polipéptido que es expresado por el péptido líder puede ser una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 4. Este péptido líder funciona para formar la estructura de horquilla cuando la concentración de
triptófano es alta, con lo cual se promueve la formación de la estructura del atenuador endógeno para terminar la transcripción de los genes biosintéticos de triptófano.
Como se utiliza en este documento, el término "deletar" significa remover parte o todo de cualquiera de una secuencia de nucleótidos del codón de comienzo al codón de parada del gen objetivo, o de la secuencia de nucleótidos de una región reguladora del mismo, del cromosoma.
Un aspecto de la invención presente también proporciona un microorganismo recombinante del género Escherichia, que ha sido modificado además para deletar todo o parte del atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 3 para aumentar su capacidad de producir L-triptófano.
Como se utiliza en este documento, el término "atenuador endógeno" significa una región que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 3, que excluye el promotor y el péptido líder en la región reguladora de expresión que causa el mecanismo de atenuación.
Un aspecto de la invención presente también proporciona un microorganismo del género Escherichia, que ha sido modificado además para aumentar las actividades de las proteínas que son codificadas por el operón del triptófano.
Un aspecto de la invención presente también proporciona un microorganismo del género Escherichia, que ha sido modificado además para aumentar las actividades de las proteínas que son codificadas por el conjunto
del gen biosintético de triptófano trpDCBA excluyendo el gen trpE que codifica la antranilato sintasa.
Como se utiliza en este documento, el término "conjunto de genes biosintéticos de triptófano" significa un conjunto de genes que consiste en una combinación de dos o más de trpD, trpC, trpB y trpA que son genes del operón de triptófano. Específicamente, el conjunto de genes biosintéticos de triptófano puede ser un conjunto de genes de trpDCBA que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 10. En este documento, el gen trpD codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37; el gen trpC codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38; el gen trpB codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39; y el gen trpA codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 40.
Mejorar la actividad del conjunto de genes biosintéticos de triptófano excepto por la antranilato sintasa que es codificada por el gene trpE del operón de triptófano se realiza para resolver el problema de que el rendimiento de la producción de triptófano no aumenta debido a la acumulación de antranilato a medida que mejora el operón de triptófano.
Los métodos para aumentar la expresión de los genes incluyen: 1) un método para incrementar el número de copias cromosomáticas o intracelulares de los genes; o 2) un método para reemplazar al promotor
cromosomático de los genes con un fuerte promotor o exógeno o modificando el promotor cromosomático a un promotor fuerte.
Ejemplos del método para incrementar el número de copias incluye un método para introducir el gen en un vector para aumentar la expresión del gen. Ejemplos de un vector que puede ser utilizado en la invención presente incluyen vectores de plásmidos tales como pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL y plásmidos del tipo pET. Los vectores que pueden ser usados en la invención presente no se limitan particularmente a, y pueden usarse cualesquiera vectores de expresión conocidos. Específicamente, pueden usarse los vectores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG1 17, pUC19, pBR322 o pMW118. Más específicamente, pueden usarse los vectores pACYC177, pCL y pCCI BAC.
Mientras tanto, ejemplos de un promotor exógeno que pueden ser utilizados en la invención presente incluyen, pero no se limitan a, promotores conocidos tales como los promotores trc, lac y tac. Además, la modificación del promotor cromosomático a un promotor fuerte puede ser realizada deletando parte o todo el péptido líder y/o deletando además parte o todo el atenuador endógeno como fue descrito antes, pero no se limita a lo mismo.
En una modalidad específica de la invención presente, un microorganismo recombinante productor de L-triptófano del género Escherichia fue producido deletando parte o todo el péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 2 en la región
reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 1 en el operón endógeno de triptófano, y deletando parte o todo del atenuador endógeno que tienen una secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 3 como para aumentar la capacidad de producir L-triptófano. Además, el microorganismo recombinante productor de L-triptófano fue producido aumentando además las actividades de las proteínas que tienen una secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 37, 38, 39 y 40, que son codificados por el conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA excluyendo al gene trpE que codifica la antranilato sintasa. El microorganismo recombinante producido fue depositado como el número de acceso KCCM1 1246P.
Otra modalidad de la invención presente también proporciona un método para producir L-triptófano, que comprende cultivar un microorganismo recombinante productor de triptófano del género Escheríchia que tiene una productividad aumentada de L-triptófano.
En un aspecto específico, la invención presente proporciona un método que comprende cultivar in microorganismo recombinante productor de L-triptófano del género Escheríchia que tiene productividad aumentada de L-triptófano, que ha sido modificado para deletar parte o todo del péptido líder que tiene una secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 2 en la región reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 1 en un operón de triptófano endógeno y para deletar parte o todo el atenuador endógeno que tiene una secuencia de
nucleótidos representada por SEQ ID NO: 3 para aumentar la capacidad de producir L-triptófano, y además para mejorar las actividades de las proteínas que son codificadas por el operón de triptófano aumentando la expresión del conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA que excluyen el gene trpE que codifica la antranilato sintasa.
Las condiciones del medio y el cultivo que se usan en el cultivo del microorganismo de la invención presente puede ser cualquiera de esos que se usan en el cultivo de microorganismos que pertenecen al género Escherichia, pero estos deben satisfacer adecuadamente los requerimientos del microorganismo de la invención presente. Específicamente, el microorganismo de la invención presente puede ser cultivado en un medio convencional que contiene fuentes de carbono adecuadas, fuentes de nitrógeno, aminoácidos, vitaminas y similares bajo condiciones aeróbicas mientras ajusta la temperatura, el pH y similares.
Las fuentes de carbono que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen carbohidratos tal como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol; alcoholes tal como el alcohol de azúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico y ácido cítrico; y aminoácidos tal como ácido orgánico, ácido glutámico, metionina y lisina. Además, fuentes de nutrientes orgánicas naturales tal como hidrolizados de almidón, melaza, melazas residuales, arroz salvado, yuca, bagazo y licor de maceración de maíz puede usarse. Específicamente, pueden utilizarse los carbohidratos tales como glucosa y melazas estériles pretratadas (es decir, las melazas convertidas a
azúcares reducidos). Además, pueden usarse cantidades convenientes de otras fuentes de carbono sin limitación.
Fuentes de nitrógeno que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen fuentes de nitrógeno inorgánico tal como amoníaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio; aminoácidos tal como ácido glutámico, metionina y glutamina; y fuentes de nitrógeno orgánico tal como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, y licor de maceración de maíz, hidrolizado de caseína, harina de pescado o su producto digerido, torta de soya desgrasada o su producto digerido, etc. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinación.
El medio puede contener, como fuentes de fósforo, fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico y correspondientes sales que contienen sodio. Los compuestos inorgánicos que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso y carbonato de calcio. Además, el medio puede contener los aminoácidos, vitaminas y precursores adecuados. Estas fuentes o precursores pueden añadirse al medio por lotes o en una manera continua.
Los compuestos tales como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico pueden añadirse al medio de manera adecuada durante el cultivo para ajusfar el pH del medio de cultivo. Además, durante el cultivo, un agente desespumante tal como poliglicol éster
del ácido graso puede utilizarse para suprimir la formación de burbujas. Además, con el fin de mantener el medio de cultivo en un estado aerobio, oxígeno o gas que contiene oxígeno se puede inyectar en el medio de cultivo. Además, con el fin de mantener el medio de cultivo en un estado no-aerobio o anaerobio, no se inyecta gas, o nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono se puede inyectar en el medio de cultivo.
El medio de cultivo normalmente se mantiene a una temperatura que varía de 27 °C a 37 °C, y específicamente de 30 °C a 35 °C. El cultivo del microorganismo puede ser continuado hasta que el nivel deseado de la sustancia útil se obtenga. Específicamente, el periodo de cultivo puede ser 10 a 100 horas.
El método de la presente invención puede además comprender la purificación o recuperación el L-aminoácido producido en el paso de cultivo.
El procedimiento de purificación o recuperación puede ser realizado por purificación o recuperación del L-aminoácido deseado del medio de cultivo usando un método adecuado, por ejemplo, un método de cultivo por lotes, continuo o alimentado por lotes.
Posteriormente, la presente invención se describirá con mayor detalle con referencia a los ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Construcción de un vector de fusión que comprende GFP y una región reguladora de la cual se eliminó un péptido de líder, para liberar una regulación de expresión para la biosíntesis de triptófano
Como se muestra en la figura 1 , para amplificar una región reguladora de expresión que comprende una deleción del gen trpL que codifica un péptido líder (L) (la región reguladora de expresión es referida más adelante como "DtrpL", correspondiente a la figura 1 línea C) en una región reguladora de expresión del operón de triptófano que está compuesto de un promotor (P), el péptido líder (L) y un atenuador (A), se realizó la reacción en cadena de polimerasa (en lo siguiente referida como "PCR") usando el ADN cromosomico de una cepa de E. coli W31 10 (comprada de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC); Número de Acceso de GenBank AC000091 ) como una plantilla.
Específicamente, un fragmento de 155bp que tiene un sitio de restricción de enzima Kpnl en la región 5' fue amplificada por PCR con Pfu polimerasa usando cebadores 1 y 2 bajo las condiciones siguientes: 30 ciclos, cada consistiendo en la desnaturalización a 94 °C por 1 min, anillado a 58 °C por 30 seg, y extensión a 72 °C por 30 seg. Mientras tanto, un fragmento de 105bp que tiene un sitio de enzima de restricción de EcoRV en la región 3' fue
amplificada por PCR usando cebadores 3 y 4 bajo las condiciones antes descritas. Los fragmentos de ADN obtenidos fueron recuperados usando el kit GeneAIIR Expin™ GEL SV (Seoul, Korea), y luego se usaron como una plantilla para PCR cruzado.
Para hacer el DtrpL, el PCR cruzado fue realizado utilizando los dos fragmentos de ADN como una plantilla y los cebadores 1 y 4. Específicamente, un fragmento de 245bp (SEQ ID NO: 5) fue amplificado por PCR bajo las condiciones antes descritas. El fragmento amplificado fue tratado con las enzimas de restricción Kpn\ y EcoR , y entonces ligado con pCL1920GFP (SEQ ID NO: 8) que fue tratado con las mismas enzimas de restricción, construyendo así el pCL DtrpL GFP.
Para amplificar una región reguladora de expresión que comprende una deleción de los genes que codifican el péptido líder (L) y el atenuador (A) (la región reguladora de expresión es referida más adelante como "Dtrp att") en la región reguladora de expresión del operón de triptófano, un fragmento 148bp (SEQ ID NO: 6) que tiene un sitio de enzima de restricción de Kpn\ en la región 5' y un sitio de enzima de restricción de Eco ?V en la región 3' fue amplificada por PCR usando el ADN cromosomático de la cepa de E. coli W3110 como una plantilla y los cebadores 1 y 5. El fragmento amplificado fue tratado con las enzimas de restricción Kpnl y EcoRV, y entonces ligado con pCL1920GFP que fue tratado con las mismas enzimas de restricción, con lo cual se construye el pCL-Dtrp_att-GFP.
Además, para hacer un vector que tiene una región reguladora
de expresión de tipo silvestre para el uso como un control en los experimentos subsiguientes, un fragmento 290bp que tiene un sitio de enzima de restricción de Kpnl en la región 5' y un sitio de enzima de restricción de EcoFN en la región 3' fue amplificado por PCR utilizando el ADN cromosomático de la cepa E. coli W3110 como una plantilla y los cebadores 1 y 4. El fragmento amplificado fue tratado con las enzimas de restricción Kpnl y EcoRV, y entonces ligado con pCL 920GFP que fue tratado con las mismas enzimas de restricción, con lo cual se construye el pCL-Ptrp-GFP.
Cebador 1 :
5' TTAGGTACCGGCGCACTCCCGTTCTGGATA 3' (SEQ ID
NO: 1 1);
Cebador 2:
5" ACTGCCCGTTGTCGATACCCTTTTTACGT 3' (SEQ ID NO:
12);
Cebador 3:
5' TCGACAACGGGCAGTGTATTCACCATG 3' (SEQ ID NO: 13);
Cebador 4:
5" AATGATATCTGTTATTCTCTAATTTTGTT 3' (SEQ ID NO:
14);
Cebador 5:
5' AATGATATCACCCTTTTTACGTGAACTTG 3' (SEQ ID NO:
15).
EJEMPLO 2
Medición del nivel de expresión de GFP
Cada uno de los vectores pCL-DtrpL_GFP, pCL-Dtrp_att-GFP y pCL-Ptrp_GFP preparado en el Ejemplo 1 fue transformado en el E. coli W3110 de tipo silvestre y la cepa E. coli KCCM10812P productora de triptófano, y luego se midieron las intensidades del GFP en las cepas.
La cepa parental E. coli KCCM10812P (Registro de Patente Coreana No. 10-0792095) usada en este Ejemplo es una cepa derivada de una variante de E. coli que tiene productividad de L-fenilalanina (KFCC 10066, Publicación de Patente Coreana No. 1985-0001232). Específicamente, KCCM10812P es una cepa recombinante de E. coli que tiene productividad de L-triptófano, en donde la cepa ha sido modificada para recuperar la auxotrofía del triptófano, para inactivar los genes pheA, trpR, mtr y tnaAB, y para mutar los genes aroG y trpE.
Específicamente, cada una de las cepas fue inoculada en 25 mi de medio M9 (que contenía glucosa al 0.5% + 2 g/L de extracto de levadura y además contenía 0.1 g/L de tirosina y 0.1 g/L de fenilalanina en el caso de KCCM10812) en un matraz de 250 mi a una proporción en volumen de 1/100 (v/v) y cultivado a 37 °C hasta que se alcanzó un OD predeterminado. Las cepas cultivadas fueron recuperadas por centrifugación y lavadas una vez con 1xTE, y el GFP en ellas fue medido utilizando Lector de Multimodo de ALTURA de Sinergia Microplate (Biotek, EEUU).
Los resultados de la medición se muestran en el Cuadro 1 a continuación. OD1 y OD3 en el Cuadro 1 indican los valores de OD medidos a 600 nm utilizando un espectrofotómetro de UV mini-1240 (Shimadzu) después de diluir cada uno de los productos de cultivo a una concentración conveniente.
Como se muestra en la figura 1 , en el caso de la cepa W31 10 de tipo silvestre, con respecto a esa de Ptrp como 1 , la intensidad relativa de Dtrp att (que comprende una deleción del péptido líder y el atenuador) fue aproximadamente 7 veces a un valor de OD de 1 (OD1) y 10 veces a un valor de OD de 3 (OD3), y la intensidad relativa de DtrpL que comprende una deleción de sólo el péptido líder fue aproximadamente 1.5-2 veces mayor que la región reguladora de tipo silvestre (Ptrp). En comparación con esto, en el caso de la cepa productora de L-triptófano KCCM 0812P, con respecto a esa de Ptrp tomada como 1 , la intensidad relativa de Dtrp_att (que comprende una deleción del péptido líder y el atenuador) fue aproximadamente 19 veces a un valor de OD de 1 (OD1 ) y 27 veces a un valor de OD de 3 (OD3), y la intensidad relativa de DtrpL que comprende una deleción de sólo el péptido líder fue aproximadamente 4 veces mayor que esa de la región reguladora de tipo silvestre (Ptrp). Tales resultados indican que la deleción del péptido líder o el atenuador lleva a un aumento en la expresión, aunque este aumento en la expresión en la cepa de tipo silvestre sea más débil que en la cepa productora de L-triptófano.
CUADRO 1
EJEMPLO 3
Construcción de vectores que tienen operón de triptófano (trpEDCBA) cuya región reguladora de expresión fue reemplazada
Con base en los resultados del Ejemplo 2, para construir una cepa de E. coli cuyos genes del operón de triptófano fueron mejorados usando un vector, un fragmento 6564bp (SEQ ID NO: 9) fue amplificado usando el ADN cromosomático de la cepa parental de E. coli KCCM10812P como una plantilla y los cebadores 6 y 7 bajo las condiciones de PCR antes descritas.
El fragmento de ADN amplificado fue recuperado usando el kit GeneAIIR Expin™ GEL SV (Seoul, Korea), y luego tratado con las enzimas de restricción EcoRV y Hind\\\. Para la clonación con el fragmento preparado de ADN, cada uno de los vectores pCL- Dtrp_att-GFP, pCL-DtrpL GFP y pCL-Ptrp_GFP fue tratado con EcoRV y Hind\\\ para remover la región de GFP, obteniendo así fragmentos de 4291 bp. Cada uno de los vectores preparados fue enlazado con el inserto, y luego introducido en E. coli DH5a para transformación, construyendo así los vectores pCL-Dtrp att-trpEDCBA, pCL-
DtrpL trpEDCBA y pCL-Ptrp_trpEDCBA.
Cebador 6:
5' CCCGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC 3' (SEQ ID NO:
16);
Cebador 7:
5' G G G AAG CTTAAAG G ATC CGTG G G ATTAACTG CGCGTCGC CGCTTT 3' (SEQ ID NO: 17).
EJEMPLO 4
Construcción de vectores cuya región reguladora de expresión fue reemplazada y gue tuvo el conjunto de genes biosintéticos de triptófano
(trpDCBA) excluyendo trpE
Para construir los vectores reemplazando la región de GFP de los vectores pCL-Dtrp_att-GFP, pCL-DtrpL GFP y pCL-Ptrp_GFP preparados en el Ejemplo 1 con trpDCBA, cada uno de los vectores pCL-Dtrp_att-GFP, pCL-DtrpL GFP y pCL-Ptrp_GFP fueron tratados con EcoRV y Hind\\\ para remover la región de GFP, obteniendo así fragmentos de 4291 bp.
Entonces, para construir las cepas de E. coli cuyos genes de trpDCBA del operón de triptófano fueron mejorados usando un vector, un fragmento 5002-bp (SEQ ID NO: 10) fue amplificado por PCR utilizando el ADN cromosomático de la cepa parental E. coli KCCM10812P como una plantilla y los cebadores 7 y 8.
El fragmento de ADN amplificado fue recuperado usando el kit GeneAIIR Expin™ GEL SV (Seoul, Korea), y luego tratado con las enzimas de restricción EcoRV y Hind\\\. El vector preparado y el inserto fueron enlazados entre sí, y luego introducidos en E, coli DH5a para transformación, construyendo así los vectores pCL-Dtrp_att-trpDCBA, pCL-DtrpL_trpDCBA y pCL-Ptrp_trpDCBA.
Cebador 8:
5' AAAGATATCATGGCTGACATTCTGCTGCT 3' (SEQ ID NO:
18).
EJEMPLO 5
Construcción de vectores que tienen bajo número de copias de genes del operón de triptófano que tienen varias regiones reguladoras de expresión
Un vector típico que se expresa con bajo número de copias en E coli es pCCI BAC (Epicentre, EEUU). Para expresar los genes del operón de triptófano con bajo número de copias usando este vector, los pCL-Dtrp att-trpEDCBA, pCL-DtrpL_trpEDCBA, pCL-Ptrp_trpEDCBA, pCL-Dtrp_att-trpDCBA, pCL-DtrpL_trpDCBA y pCL-Ptrp_trpDCBA preparados en los Ejemplos 3 y 4 fueron digeridos con la enzima de restricción Hind\\\.
Los fragmentos resultantes de ADN fueron electroforizados en agarosa, y luego cortados de acuerdo con su tamaño y recuperados usando el
kit GeneAIIR Expin™ GEL SV (Seoul, Korea). En seguida, cada uno de los fragmentos fue enlazado con el vector pCCI BAC vector (digerido en el sitio Hind\\\), y luego introducido en E. coli DH5a para transformación.
Cada una de las cepas transformadas fue colocada en medio sólido de LB Cm (placa de agar con LB + cloramfenicol), y las cepas conteniendo la resistencia de Cm fueron seleccionadas, construyendo así los vectores pBAC-Dtrp_att-trpEDCBA, pBAC-DtrpL trpEDCBA, pBAC-Ptrp trpEDCBA, pBAC-Dtrp_att-trpDCBA, p BAC- Dtrp L trp D C B A y pBAC-PtrpJrpDCBA.
EJEMPLO 6
Construcción de la cepa de E. coli en la que se inactivo el gen pheA
Para construir una cepa cercana a una cepa productora de triptófano de E. co//' W3110 de tipo silvestre, el gen pheA (gene de NCBI ID: 12934467) que codifica la corismato mutasa/prefenato deshidratasa (CM-PDT) fue inactivada por deleción por recombinación homologa. La CM-PDT que es una enzima en el primer paso de producción de fenilalanina del corismato, y de la deleción del gene pheA fue utilizada para inhibir la trayectoria de biosíntesis de fenilalanina. Para esta deleción, se usó el método de inactivación de un paso (desarrollado por Datsenko KA et al.), técnica de mutagénesis usando lambda roja recombinasa, (inactivación de un paso de los genes cromosómicos en Escherichia coli K-12 usando productos de PCR,
Datsenko KA, Wanner BL, Proc Nati Acad Sci EEUU. 2000 Jun 6;97(12):6640-5). Como un marcador para confirmar la inserción en los genes, se utilizó el gen resistente acloranfenicol de pUCprmfmloxC (Publicación de patente coreana abierta a consulta para el público No. 2009-0075549).
Un fragmento de gen de aproximadamente 1200bp fue amplificado por PCR usando el vector pUCprmfmloxP como una plantilla y los cebadores 9 y 10, que tienen una parte del gen pheA y una parte de la secuencia de nucleótidos del gen resistente a cloramfenicol del vector pUCprmfmloxP.
Cebador 9:
5'- G G CCTC CC AAATC G G G G G G C CTTTTTTATTG ATAAC AAAAAG GC AAC ACT AGGTGACACTATAGAACGCG - 3' (SEQ ID NO: 19);
Cebador 10:
5'- AACAGCCCAATACCTTCATTGAACGGGTGATTTCCCCTAACTCTTTCAATT AGTGGATCTGATGGGTACC -3' (SEQ ID NO: 20).
El fragmento de ADN obtenido por amplificación de PCR fue electroforizado en gel de agarosa al 0.8%, y luego eluido y usado como una plantilla en un PCR secundario. Se realizó el PCR secundario de manera que las regiones 5' y 3' del fragmento de AFN primario tuvieron 20 pares de bases de nucleótidos complementarias. Además, un fragmento de gen de aproximadamente 1300bp fue amplificado por PCR usando el producto de
PCR primario eluido como una plantilla y los cebadores 1 1 y 12, que incluyen las regiones 5' y 3' del gen pheA. El fragmento resultante de ADN fue electroforizado en gel de agarosa al 0.8%, y entonces eluido y utilizado en la recombinación.
Cebador 1 1 :
5'-GAATGGGAGGCGTTTCGTCGTGTGAAACAGAATGCGAAG ACGAACAATAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGC -3' (SEQ ID NO: 21);
Cebador 12:
5-GGCACCTTTTCATCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTC TC ACTTG G GTAAC AG CCC AATAC CTTC ATT -3' (SEQ ID NO: 22).
Según el método desarrollado por Datsenko KA et al., la cepa de W3110 E. coli transformada con el vector pKD46 fue hecha como estado competente, y luego transformada con el fragmento del gen 1300bp obtenido por PCR. La cepa que tiene resistencia a cloramfenicol fue seleccionada en medio LB. El PCR fue realizado usando los cebadores 13 y 14, y el producto de amplificación de PCR tuvo un tamaño de aproximadamente 2500 bp, indicando que el gen pheA fue deletado en la cepa.
Cebador 13:
5 - TTGAGTGTATCGCCAACGCG -3' (SEQ ID NO: 23 );
Cebador 14:
5'- AAAGCCGCGTGTTATTGCGT -3' (SEQ ID NO: 24).
El vector pKD46 fue removido de la cepa recombinante primaria que tiene resistencia a cloramfenicol, y luego un vector pJW168 fue
introducido en la cepa, y el gen marcador de cloramfenicol fue removido de la cepa (Gene, (2000) 247,255-264). La cepa resultante fue un producto de amplificación de aproximadamente 500bp obtenido por PCR usando los cebadores 13 y 14, indicando que se logró la deleción del gen objetivo. La cepa construida fue denominada "E. coli W3110 trpA1 ".
EJEMPLO 7
Construcción de la cepa de E. coli de la cual se inactivo el gen tnaAB
De la cepa de E. co/ W3110 trpA1 construida en el Ejemplo 6, el operón de tnaAB (gen NCBI ID: 12933600, 12933602) que consiste del gen tnaA que codifica la triptófanoase y el gen tnaB que codifica al importador de triptófano fue deletado por recombinación homologa. Debido a esta deleción, puede ser bloqueada la trayectoria de degradación del triptófano después de su producción, y puede prevenirse la entrada de triptófano que es secretada al medio dentro de las células, impartiendo así las propiedades de las cepas productoras de triptófano. Para esta deleción, un fragmento de gen de aproximadamente 1200bp fue amplificado por PCR en la misma manera como se describió en el Ejemplo 6 usando el vector pUCprmfmloxP como una plantilla junto con los cebadores 15 y 16, que tienen una parte del gen tnaAB y una parte de la secuencia de nucleótidos del gen resistente al cloramfenicol del vector pUCprmfmloxP. Además, el fragmento de ADN obtenido por amplificación de PCR fue amplificado además por PCR en la misma manera
como se describió en el Ejemplo 6 usando los cebadores 17 y 18, obteniendo así un fragmento del gen 1300bp.
Cebador 15:
5'- TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAAC CAGCACAAAAAGGTGACACTATAGAACGCG - 3' (SEQ ID NO: 25);
Cebador 16:
5'- ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTG AACCGTTCCGTAGTGGATCTGATGGGTACC -3' (SEQ ID NO: 26);
Cebador 17:
5'- TG ATTTCCTG AGAG G C AAG AAG C C AG C G AATG G CTG G CT TCTTGAAGGATTTAGCCAAATTTAGGTAACA -3' (SEQ ID NO: 27);
Cebador 18:
5'- AATCGGTATAGCAGATGTAATATTCACAGGGATCACTGTA ATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAATGGA -3' (SEQ ID NO: 28).
Para deletar los genes de tnaAB, la cepa de E. coli W31 10 trpA1 a la que se introdujo el vector pKD46 fue hecho competente fue construida en la misma manera descrita en el Ejemplo 6, y luego el fragmento del gen de 1300bp obtenido por PCR fue transformado en la cepa de E. coli. La cepa que tiene resistencia a cloramfenicol fue seleccionada en medio LB. El PCR fue realizado usando los cebadores 19 y 20, y el producto de amplificación de PCR tuvo el tamaño de aproximadamente 5400 bp, indicando que los genes tnaAB fueron deletados en la cepa.
Cebador 19:
5'- CGGGATAAAGTAAAACCAGG -3' (SEQ ID NO: 29);
Cebador 20:
5'- CGGCGAAGGTAAGTTGATGA -3' (SEQ ID NO: 30).
El vector pKD46 fue removido de la cepa recombinante primaria con la resistencia al cloramfenicol en la misma manera descrita en el Ejemplo 6, y luego el gen marcador de cloramfenicol fue removido de la cepa. La cepa resultante fue un producto de amplificación de aproximadamente 550bp obtenido por PCR usando los cebadores 19 y 20, indicando que se logró la deleción del gen deseado. La cepa construida fue denominada "E co// W3110 trpA2".
EJEMPLO 8
Identificación de la productividad de L-triptófano de las cepas que tienen el operón de triptófano con varios patrones de expresión
Las cepas de E. coli transformadas con los vectores preparados según los métodos descritos en los Ejemplos 3, 4 y 5. Los efectos de la variante de E. Coli fueron evaluados usando W31 10 trpA2 preparado en los Ejemplos 6 y 7 como una cepa progenitora, y su fuente de carbono fue glucosa.
Para evaluar la titulación, cada cepa fue inoculada por un bucle de platino y cultivada por la noche en medio sólido de LB. Entonces, un bucle de platino de cada cepa fue inoculado en 25 mL de medio conteniendo
glucosa, la composición del medio es mostrada en el Cuadro 2 siguiente. Después de la inoculación, cada cepa fue incubada a 37 °C y 200 Rpm durante 48 horas. Los resultados se muestran en el Cuadro 3 siguiente. Todos los resultados se registraron como el promedio de los tres resultados del matraz.
CUADRO 2
CUADRO 3
Como puede verse de los resultados en el Cuadro 3 anterior, en el caso en el cual la cepa parental E. co// W3110 trpA2 fue transformada con una combinación de varios vectores, si sólo se aumentó continuamente el operón de triptófano, no apareció ningún efecto positivo en el rendimiento de producción del triptófano mientras se acumuló el antranilato. Al contrario, la cepa modificada para aumentar el operón de Trp y trpDCBA mostró un efecto positivo en el rendimiento de la producción de triptófano junto con una disminución en la acumulación de antranilato, en comparación a la cepa en la
que sólo se aumentó el operón de triptófano. Así, fue confirmado que una disminución en la acumulación de antranilato es una manera efectiva de aumentar el rendimiento de la producción de L-triptófano en cepas productoras de triptófano.
EJEMPLO 9
Identificación de la productividad de L-triptófano de las cepas que tienen el operón de triptófano con varios patrones de expresión
Los vectores construidos de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 3, 4 y 5 fueron introducidos en la cepa parental productora de L-triptófano de E. coli KCC 10812P de acuerdo con la combinación mostrada en el Cuadro 5 siguiente. Las titulaciones de las cepas fueron evaluadas usando glucosa como una fuente de carbono. Como resultado, pareció que no sólo el aumento de trpDCBA, sino también el aumento del operón de triptófano, son importantes, semejante a los resultados del Ejemplo 8. Así, se evaluaron los efectos en las cepas productoras de triptófano.
Para evaluar la titulación, cada cepa fue inoculada por un bucle de platino y cultivada por la noche en medio sólido de LB. Entonces, un bucle de platino de cada cepa fue inoculado en 25 mL de medio conteniendo glucosa, la composición del medio es mostrada en el Cuadro 4 siguiente. Después de la inoculación, cada cepa fue incubada a 37 °C y 200 Rpm durante 48 horas. Los resultados se muestran en el Cuadro 5 siguiente. Todos
los resultados se registraron como el promedio de los tres resultados del matraz.
CUADRO 4
CUADRO 5
* medido a 33 horas
* medido a 48 horas
Como puede verse de los resultados en el Cuadro 5 anterior, en el caso en el cual la cepa parental E. coli KCCM10812P fue transformada con una combinación de varios vectores, si sólo se aumentó continuamente el
operón de triptófano, no apareció ningún efecto positivo en el rendimiento de producción del triptófano mientras se acumuló el antranilato. Al contrario, parece que la cepa modificada aumentando el operón usando el vector de pCL y aumentando el trpDCBA usando el vector de pBAC mostró un efecto positivo en el rendimiento de la producción de triptófano junto con una disminución en la acumulación de antranilato, en comparación con la cepa en la que sólo se aumentó el operón de triptófano. Así, fue confirmado que una disminución en la acumulación de antranilato es una manera efectiva de aumentar el rendimiento de la producción de L-triptófano en cepas productoras de triptófano.
EJEMPLO 10
Construcción de la cepa en donde el número de copia del conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA en el cromosoma fue
aumentado y la acumulación de antranilato disminuida
Con base en los resultados del Ejemplo 9, para aumentar el número de copias del conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA en el cromosoma, se construyó un vector.
Específicamente, el pCL-Dtrp_att-trpDCBA descrito en el
Ejemplo 5 fue disociado con las enzimas de restricción EcoR\ y BamH\ para obtener Dtrp_att-trpDCBA, y luego se enlazó con plNT17E tratado con las mismas enzimas de restricción, obteniendo así el plNT17E-Patt-trpDCBA.
Para introducir el plNT17E-Patt-trpDCBA en la cepa parental productora de triptófano de E. coli KCCM10812P para incrementar el número de copias del conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA, pKD46 que se usa en el método de inactivación de un paso (desarrollado por Datsenko KA et al.), una técnica de mutagénesis usando lambda roja recombinasa, de acuerdo con el Ejemplo 6. Como un marcador para confirmar la inserción en los genes, el gen resistente al cloramfenicol de pUCprmfmloxC fue usado. Específicamente, la cepa parental, en la cual se introdujo el pKD46, transformada con el plNT17E-Patt-trpDCBA, y luego cultivada a 37 °C durante 1 a 2 días para obtener colonias. Para confirmar si el plNT17E-Patt-trpDCBA fue insertado correctamente en el cromosoma de las colonias obtenidas, un fragmento de aproximadamente 2000 bp fue amplificado por PCR usando los cebadores 21 y 22.
Cebador 21 :
5' TATTTGCTGTCACGAGCAGG 3' (SEQ ID NO: 31 );
Cebador 22:
5' AGTTCCGGCATACAACCGGCTT 3' (SEQ ID NO: 32).
El pKD46 fue removido de la cepa recombinante primaria que tiene resistencia al cloramfenicol, y luego el plásmido pJW168 fue introducido para remover el gen marcador de cloramfenicol de la cepa (Gene, (2000) 247, 255-264). Un producto de amplificación de aproximadamente 5000-bp obtenido por PCR usando los cebadores 23 y 24, y un producto de amplificación de aproximadamente 6500-bp obtenido por PCR usando los
cebadores 25 y 26, demostró que el trpDCBA se coloca continuamente siguiendo al operón de triptófano que se coloca endógenamente en el cromosoma. Esta cepa fue denominada "KCCM10812P/ trpDCBA".
Cebador 23:
5' TAATACGACTCACTATAGGG 3' (SEQ ID NO: 33);
Cebador 24:
5' CTGTTGGGCGGAAAAATGAC 3' (SEQ ID NO: 34);
Cebador 25:
5' TGATCGCCAGGGTGCCGACG 3' (SEQ ID NO: 35);
Cebador 26:
5' CCCTATAGTGAGTCGTATTA 3' (SEQ ID NO: 36). Para insertar adicionalmente una copia dentro de la cepa antes preparada en la que se incrementó el número de copias de trpDCBA, el pKD46 fue introducido en la cepa antes preparada de KCCM10812P/trpDCBA. Luego el vector de plNT 7E-Patt-trpDCBA fue introducido en el KCCM10812P/trpDCBA/pKD46, construyendo así una cepa con dos copias de trpDCBA insertadas en el cromosoma. Esta cepa construida fue denominada "KCCM10812P/2trpDCBA". Esta cepa fue depositada en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (361-221 , Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea), una autoridad internacional depositaría, el 29 de diciembre de 201 1 bajo el número de acceso KCCM1 1246P.
EJEMPLO 11
Examen del efecto de la cepa productora de L-triptófano que tiene actividades incrementadas de proteínas que son codificadas por el conjunto de genes biosintéticos de triptófano de trpDCBA
Según el método descrito en el Ejemplo 10, la titulación de KCC 10812P/trpDCBA fue evaluada utilizando glucosa como una fuente de carbono. La KCCM10812P/trpDCBA fue obtenida introduciendo además el trpDCBA en la cepa productora de triptófano de E. coli KCCM10812P para aumentar las actividades de algunas enzimas de la trayectoria de biosíntesis del triptófano.
Para evaluar la titulación, la cepa fue inoculada por un bucle de platino y cultivada por la noche en medio sólido de LB. Entonces, un bucle de platino de la cepa de cultivo fue inoculado en 25 mL de medio de titulación de matraz, la composición del medio es mostrada en el Cuadro 4 anterior. Después de la inoculación, la cepa fue cultivada a 37 °C y 200 rpm durante 48 horas. Los resultados se muestran en el Cuadro 6 siguiente. Todos los resultados se registraron como el promedio de los tres resultados del matraz.
CUADRO 6
* medido a 33 horas
* medido a 48 horas
Como puede verse en el Cuadro 6 anterior, cuando una copia
del conjunto de genes biosintético de triptófano trpDCBA fue insertada en el
cromosoma, la concentración de antranilato disminuyó por 39% en
comparación con esa en la cepa parental. Sin embargo cuando dos copias
fueron insertadas en el cromosoma, la concentración de antranilato disminuyó
por 69% en comparación con la cepa parental.
Además, las concentraciones de L-triptófano en las dos cepas
aumentaron por 10% y 13%, respectivamente. Como se muestra en el Cuadro
6 anterior, cuando se incrementó el número de copias de trpDCBA, la
velocidad de consumo de glucosa disminuyó ligeramente a veces, pero el
aumento del conjunto de genes biosintéticos de triptófano tuvo efectos
positivos en un aumento en la concentración de L-triptófano y una disminución
en la concentración de antranilato.
Mientras que la presente invención se ha descrito con referencia
a las modalidades ilustrativas particulares, los expertos en la técnica a los que
se relaciona la presente invención pueden entender que la presente invención
puede ser incorporada en otras formas específicas sin apartarse de la esencia
técnica o las características esenciales de la presente invención. Por lo tanto, las modalidades descritas anteriormente se considera que son ilustrativas en todos los aspectos y no restrictivas. Además, el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones anexadas en vez de por la descripción detallada, y debe ser entendido que todas las modificaciones o variaciones derivadas del significado y el alcance de la presente invención y sus equivalentes están incluidas en el alcance de las reivindicaciones anexadas.
Número de acceso
Autoridad Depositaría: Centro Coreano de cultivo de microorganismos (internacional)
Número de acceso: KCC 11246P
Fecha de depósito: jueves, 29 de diciembre de 2011
Claims (10)
1. Un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad aumentada de L-triptófano, en donde el microorganismo recombinante ha sido modificado para deletar parte o todo de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 en un operón de triptófano endógeno.
2. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo recombinante ha sido adicionalmente modificado para deletar parte o todo de un atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 3 en el que la región reguladora de expresión tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1.
3. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo recombinante ha sido modificado adicionalmente para aumentar las actividades de las proteínas que son codificadas por el operón de triptófano.
4. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo recombinante ha sido modificado adicionalmente para aumentar las actividades de una o más proteínas que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOs: 37, 38, 39 y 40, respectivamente, que son codificadas por el conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA.
5. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizado además porque las actividades de las proteínas son aumentadas ya sea por un método para incrementar el número de copias cromosomáticas o intracelulares de genes que codifican las proteínas, un método para reemplazar la región reguladora de expresión del gen en el cromosoma con un promotor fuerte, o un método para modificar la región reguladora de expresión en una región reguladora de expresión que tiene una actividad aumentada.
6. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microorganismo recombinante es una cepa de E. coli .
7. Un método para producir L-triptófano, que comprende cultivar un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad aumentada de L-triptófano, en donde el microorganismo recombinante ha sido modificado para deletar parte o todo de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 en un operón de triptófano endógeno de un microorganismo del género Escherichia.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el microorganismo recombinante ha sido modificado adicionalmente para deletar parte o todo de un atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 3 en la región reguladora de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el microorganismo recombinante es una cepa de E. coli.
10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el microorganismo recombinante ha sido modificado adicionalmente para aumentar las actividades de las proteínas que son codificadas por uno o más genes del conjunto de genes biosintéticos de triptófano trpDCBA.
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