JPS619287A - 複合プラスミド及びそれを保持する微生物 - Google Patents
複合プラスミド及びそれを保持する微生物Info
- Publication number
- JPS619287A JPS619287A JP59127471A JP12747184A JPS619287A JP S619287 A JPS619287 A JP S619287A JP 59127471 A JP59127471 A JP 59127471A JP 12747184 A JP12747184 A JP 12747184A JP S619287 A JPS619287 A JP S619287A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gal
- gene
- beta
- plasmid
- complex plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は違伝子操作技術に関連し、特に複合プラスミド
及びそれを保持するβ−ｇａｌ生産性宿主微生物に関す
るものである。更に詳しくは本発明はｔｒｐプロモータ
下流のｔｒｐＢ遺伝子の開始コドンを含むＤＮＡに連結
されたβ−ｇａｌ遺伝子を含む複合プラスミドを保持し
たβ−ｇａｌ生産性宿主微生物に関するものである。
及びそれを保持するβ−ｇａｌ生産性宿主微生物に関す
るものである。更に詳しくは本発明はｔｒｐプロモータ
下流のｔｒｐＢ遺伝子の開始コドンを含むＤＮＡに連結
されたβ−ｇａｌ遺伝子を含む複合プラスミドを保持し
たβ−ｇａｌ生産性宿主微生物に関するものである。
β−ｇａｌは牛乳中の乳糖（ラクトース）をグルコース
とガラクトースに加水分解する酵素であり、乳糖不耐症
の人のために牛乳を加工するのに用いられている。これ
は工業的には大腸菌やｆＱｅｔｉｄｕ８などから生産さ
れている。
とガラクトースに加水分解する酵素であり、乳糖不耐症
の人のために牛乳を加工するのに用いられている。これ
は工業的には大腸菌やｆＱｅｔｉｄｕ８などから生産さ
れている。
最近、宿主微生物のベクタープラスミドに有用物質の生
産情報を有するＤＮＡを組み込んだ複合プラスミドを保
持する宿主微生物を用いて、該微生物に上記有用物質を
大量生産させる遺伝子組み換え技術が発展してきた。こ
の技術により既にヒトインターフェロンやインスリンな
どが生産されつつあ）、大腸菌は宿主微生物として利用
されつつある。
産情報を有するＤＮＡを組み込んだ複合プラスミドを保
持する宿主微生物を用いて、該微生物に上記有用物質を
大量生産させる遺伝子組み換え技術が発展してきた。こ
の技術により既にヒトインターフェロンやインスリンな
どが生産されつつあ）、大腸菌は宿主微生物として利用
されつつある。
本発明の目的は、上記したβ７ ｇａｌを生産させるた
めの、また新たなプロモータの探索や外来遺伝子の発現
量をβ−Ｈａｔの発現で検定するのに有用な複合プラス
ミド及び該複合プラスミドを保持する専−主微生物を提
供するにある。
めの、また新たなプロモータの探索や外来遺伝子の発現
量をβ−Ｈａｔの発現で検定するのに有用な複合プラス
ミド及び該複合プラスミドを保持する専−主微生物を提
供するにある。
本発明者らは次に述べる手法を利用して、ｔｒｐプロモ
ータとβ−ｇａｌ遺伝子を連結した複合プラスミドの造
成に成功した。
ータとβ−ｇａｌ遺伝子を連結した複合プラスミドの造
成に成功した。
ｔｒｐプロモータを有するプラスミドｐＴＲＥ１は大腸
菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＬ（！ｊ−ダ
ベプタイド）及びｔｒｐＥ（アントラニル酸合成酵素）
の先端部分の一部を含む約５００ｂｐ（ｂａＳｅ ｐａ
ｉｒｓ ）のＤ−″ＮＡ断片をｐＢＲａ２ｚ プラスミ
ドのＥｃｏａＩ部位に挿入したものである。
菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＬ（！ｊ−ダ
ベプタイド）及びｔｒｐＥ（アントラニル酸合成酵素）
の先端部分の一部を含む約５００ｂｐ（ｂａＳｅ ｐａ
ｉｒｓ ）のＤ−″ＮＡ断片をｐＢＲａ２ｚ プラスミ
ドのＥｃｏａＩ部位に挿入したものである。
ｉｒｐプロモータの向きはｐＢＲ３２２のＴｃｒ（テト
ラサイクリン耐性遺伝子）の向きであり、またＩｒｐプ
ロモータの上流側のＥｃｏａＩ部位はＤＮＡポリメラー
ゼエで埋めて欠失させ、プロモータ下流側のＥｃｏＲＩ
部位のみに改良したものである。
ラサイクリン耐性遺伝子）の向きであり、またＩｒｐプ
ロモータの上流側のＥｃｏａＩ部位はＤＮＡポリメラー
ゼエで埋めて欠失させ、プロモータ下流側のＥｃｏＲＩ
部位のみに改良したものである。
第１図にｔｒｐプロモータ下流域の塩基配列を示す。
ｔｒｐＢポリペブタイド遺伝子中のＥＣＯＲ＋Ｉ部位に
外来遺伝子を連結することでｔｒｐ Ｅポリペブタイド
のＮ末端側８個のアミノ酸と融合した形で外来遺伝、子
の発現が可能である。
外来遺伝子を連結することでｔｒｐ Ｅポリペブタイド
のＮ末端側８個のアミノ酸と融合した形で外来遺伝、子
の発現が可能である。
一方、β−ｇａｌ遺伝子はｐＭｃ１４ｏ３（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｏｌ、 、 １４３． ｐ９７１〜９８０
．１９８０ ）を用いた。これは、ｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩとＳａｌ工部位間に６．２ ｋ ｂ （ｋｉ １
ｏｔ）ａ’ｓｅ ｐａｉｒｓ ）のβ−ｇａｌ遺伝子（
１ａｃｚ＋ １ａｃＹ ）を挿入したものである。
．１９８０ ）を用いた。これは、ｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩとＳａｌ工部位間に６．２ ｋ ｂ （ｋｉ １
ｏｔ）ａ’ｓｅ ｐａｉｒｓ ）のβ−ｇａｌ遺伝子（
１ａｃｚ＋ １ａｃＹ ）を挿入したものである。
第２図にｔｒｐプロモータの下流にβ−ｇａｌ−遺伝子
が連結されたＩ）ＴＲＥＺＩの造成方法を示す。
が連結されたＩ）ＴＲＥＺＩの造成方法を示す。
ｐＴＲＥｌから切シ出したｔｒｐプロモータを含む４．
２１ ｋ、 ｂのＤＮＡ断片と９ＭＣ１４０３から切シ
出した６、 ２ ｋ ｂのβ−ｇａＬ遺伝子とをＤＮＡ
リガーゼで連結すると１０．２１ｋｂの複合プラスミド
ｐＴＲＥ１を造成できる。
２１ ｋ、 ｂのＤＮＡ断片と９ＭＣ１４０３から切シ
出した６、 ２ ｋ ｂのβ−ｇａＬ遺伝子とをＤＮＡ
リガーゼで連結すると１０．２１ｋｂの複合プラスミド
ｐＴＲＥ１を造成できる。
第３図にｔｒｐプロモータとβ−ｇａｌ遺伝子の連結部
分の塩基配列を示す。ｔｒｐポリペブタイドのＮ末端側
８個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片にβ−ｇａｌ遺
伝子が連結している。連結部付近には図に示すように、
ＥＣ，ＯＲＩ 、 ｆ３ｍａｌ及びＢ ａ ｍ）（Ｉの
制限酵素１部位があり、これらを利用して外来遺伝子を
この部分に挿入可能である。これにより、ｔｒｐプロモ
ータ以外のプロモータの検索や活性発現の測定が難しい
外来遺伝子の発現効率をβ−ｇ、ａｌ活性で測定するこ
となどに利用できる。
分の塩基配列を示す。ｔｒｐポリペブタイドのＮ末端側
８個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片にβ−ｇａｌ遺
伝子が連結している。連結部付近には図に示すように、
ＥＣ，ＯＲＩ 、 ｆ３ｍａｌ及びＢ ａ ｍ）（Ｉの
制限酵素１部位があり、これらを利用して外来遺伝子を
この部分に挿入可能である。これにより、ｔｒｐプロモ
ータ以外のプロモータの検索や活性発現の測定が難しい
外来遺伝子の発現効率をβ−ｇ、ａｌ活性で測定するこ
となどに利用できる。
ｔｒｐプロモータ以外のプロモータの探索には上記した
３つの制限酵素部位のいずれかを用いて、大腸菌の染色
体などを同じ制限酵素で切シ出したＤＮＡ断片を挿入し
、β−ｇａｌ活性の増大を検出することで達成できる。
３つの制限酵素部位のいずれかを用いて、大腸菌の染色
体などを同じ制限酵素で切シ出したＤＮＡ断片を挿入し
、β−ｇａｌ活性の増大を検出することで達成できる。
また、外来遺伝子の発現では酵素または生理活性そのも
ので直接検出するか １２５ エラベルした抗体を用い
た抗原抗体反応などが用いられるが、その検出には煩雑
な操作が必要である。−この場合、外来遺伝子を上記の
３つの制限酵素部位のいずれかに挿入し、β−ｇａｌ活
性を検出することでｔｒｐプロモータによる外来遺伝子
の発現効率を容易に測定できる。
ので直接検出するか １２５ エラベルした抗体を用い
た抗原抗体反応などが用いられるが、その検出には煩雑
な操作が必要である。−この場合、外来遺伝子を上記の
３つの制限酵素部位のいずれかに挿入し、β−ｇａｌ活
性を検出することでｔｒｐプロモータによる外来遺伝子
の発現効率を容易に測定できる。
以下、実施例によシ本発明複合プラスミドの造成、これ
を保持する宿主微生物の調製について述べる。
を保持する宿主微生物の調製について述べる。
実施例１
約３μｇのｐＴＲＥｌとＩ）ＭＣＩ４０３をＢＣＯＲＩ
と５ａｌＩそれぞれ２５ ｕｎｉｔｓ で切断後、ア
ガロースゲル電気泳動を行いＤＮＡ断片を回収した。回
収したＤＮＡ（７）二断片をＴＥＮ緩衝液（０，０２Ｍ
Ｔｒｊｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２ＭＮａＣ
１゜ｐＨ８，０）に溶解後、’Ｉ’４ＤＮＡリガーゼ２
．５ｕｎｉｔｓ（全量５０ｍ／）にて連結した。この複
合プラスミドを染色体上のβ−ｇａＬ遺伝子が欠損して
いる大腸菌Ｍ２Ｂ５株に導入しようとしたが形質転換株
を得ることができなかった。。この原因を調べるため、
Ｉ）ＢＲ３２２で大腸菌Ｃ６００株またはＭ２Ｂ５株を
形質転換したところ形質転換効率はそれぞれＩ Ｘ １
０’ 個／μｇＤＮＡと７ Ｘ １０’個／μｇＤＮＡ
であった。これからＭ２Ｂ５株は０６００株に比べて形
質転換効率は約１／１００であり、きわめて低いことが
分った。そこで、まず０６００株を形質転換し、得られ
た形質転換株の中からｐＴＲＥＺｌ を有する株を選択
し、培養して得られたＩ）ＴＲＥＺＩ を用いてＭ２Ｂ
５株を形質転換することにした。培養して採取した約０
．１μｇのｐＴＲＥＺＩ を用いてＭ２Ｂ５株を形質転
換したところ、１個の形質転換株が得られ複合プラスミ
ド実施例２ 複合プラスミドを保持する大腸菌をＡｐ（アンピシリン
）を５０μｇ／ｍｌ添加したＬＢ培地（トリフトン１０
ｇ、［Ｓｌ母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣｔ５
ｇ、水道水１ ｔ、 ｐＨ７，２） １０ｍｌで３７Ｕ
で１５時間種培養した。この培養液１ｎ／！をＡｌ）を
５０μｇ／ｍｌ添加したＭ９−カザミノ酸培地（ＮＨ４
Ｃｌ １ ｇ 、 ＮａｚＨＰＯ４６ｇ 、 ＫＨ２Ｐ
Ｏ４３ｇ、ＮａＣ１，５ｇ、Ｍｇ８０４７Ｈ２００，１
ｇ。
と５ａｌＩそれぞれ２５ ｕｎｉｔｓ で切断後、ア
ガロースゲル電気泳動を行いＤＮＡ断片を回収した。回
収したＤＮＡ（７）二断片をＴＥＮ緩衝液（０，０２Ｍ
Ｔｒｊｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２ＭＮａＣ
１゜ｐＨ８，０）に溶解後、’Ｉ’４ＤＮＡリガーゼ２
．５ｕｎｉｔｓ（全量５０ｍ／）にて連結した。この複
合プラスミドを染色体上のβ−ｇａＬ遺伝子が欠損して
いる大腸菌Ｍ２Ｂ５株に導入しようとしたが形質転換株
を得ることができなかった。。この原因を調べるため、
Ｉ）ＢＲ３２２で大腸菌Ｃ６００株またはＭ２Ｂ５株を
形質転換したところ形質転換効率はそれぞれＩ Ｘ １
０’ 個／μｇＤＮＡと７ Ｘ １０’個／μｇＤＮＡ
であった。これからＭ２Ｂ５株は０６００株に比べて形
質転換効率は約１／１００であり、きわめて低いことが
分った。そこで、まず０６００株を形質転換し、得られ
た形質転換株の中からｐＴＲＥＺｌ を有する株を選択
し、培養して得られたＩ）ＴＲＥＺＩ を用いてＭ２Ｂ
５株を形質転換することにした。培養して採取した約０
．１μｇのｐＴＲＥＺＩ を用いてＭ２Ｂ５株を形質転
換したところ、１個の形質転換株が得られ複合プラスミ
ド実施例２ 複合プラスミドを保持する大腸菌をＡｐ（アンピシリン
）を５０μｇ／ｍｌ添加したＬＢ培地（トリフトン１０
ｇ、［Ｓｌ母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣｔ５
ｇ、水道水１ ｔ、 ｐＨ７，２） １０ｍｌで３７Ｕ
で１５時間種培養した。この培養液１ｎ／！をＡｌ）を
５０μｇ／ｍｌ添加したＭ９−カザミノ酸培地（ＮＨ４
Ｃｌ １ ｇ 、 ＮａｚＨＰＯ４６ｇ 、 ＫＨ２Ｐ
Ｏ４３ｇ、ＮａＣ１，５ｇ、Ｍｇ８０４７Ｈ２００，１
ｇ。
ＣａＣｌ２・２ Ｈ＊Ｏ１５” ｇ Ｉグルコース２
ｇ 、 カリ ザミノ酸２０ｇ、蒸留水Ｉ
Ｌ、 ｐＨ７，０） １０ｍｌに接種し、３７Ｃで４
時間培養した。なお、培養開始１時間目にＩＡ（３−β
−インドリルアクリリンク酸）を１５μｇ／ｍｌ添加し
てｍＲＮＡの転写を開始させた。− 培養終了後、β−ｇａｌの活性を測定するため、培養液
１１ｎｌを採取し、トルエン１５ｍ１を添加して激しく
攪拌し、３７Ｃで３０分間振とうした。これに０．３５
Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７，２５）を２ｍｌ。
ｇ 、 カリ ザミノ酸２０ｇ、蒸留水Ｉ
Ｌ、 ｐＨ７，０） １０ｍｌに接種し、３７Ｃで４
時間培養した。なお、培養開始１時間目にＩＡ（３−β
−インドリルアクリリンク酸）を１５μｇ／ｍｌ添加し
てｍＲＮＡの転写を開始させた。− 培養終了後、β−ｇａｌの活性を測定するため、培養液
１１ｎｌを採取し、トルエン１５ｍ１を添加して激しく
攪拌し、３７Ｃで３０分間振とうした。これに０．３５
Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７，２５）を２ｍｌ。
０．２５Ｍラクト−２液を２ｍｌ添加し、３０Ｃで４０
分間振とり後、沸騰水中に１５分間浸漬して酵素反応を
停止させた。液中のグルコース量をグルコース分析計（
ＹＳ Ｉ＃りにて測定した。β−ｇａｌの酵素活性は１
分間に１μｍｏｔｅのラクトースを分解する量を１単位
（ｕｎｉｔ、Ｕ）とした。
分間振とり後、沸騰水中に１５分間浸漬して酵素反応を
停止させた。液中のグルコース量をグルコース分析計（
ＹＳ Ｉ＃りにて測定した。β−ｇａｌの酵素活性は１
分間に１μｍｏｔｅのラクトースを分解する量を１単位
（ｕｎｉｔ、Ｕ）とした。
添加すると培養液１ｍｌ当シのβ−ｇａｌ活性は１．２
２Ｕとなり、添加しない場合の約５倍量であった。
２Ｕとなり、添加しない場合の約５倍量であった。
ＯＮ Ｐ Ｇ（ｏｒｔｈｏｎｉ ｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ）法で測定した場合の純粋な
β−ｇａｚｔｍｇは３４０Ｕであり、かつ０ＮＰＧ法で
測定したβ−ｇａｌ活性はラクトース基質の場合よシ約
５倍高い値となる。そこで、これらの値を用いてβ−ｇ
ａＬ量を算出し、大腸菌１個当りのβ−ｇａｌ分子数と
して表わすとＩＡを添加した場合は８６，０００分子で
あった。これは通常の大腸菌の最大生産量の２０〜３０
、倍の生産量になる。これから、遺伝子組換えにより多
量の酵素生産が可能になった。抑制物質としてＴｒｐ（
トリプトファン）を添加した場合は、β−ｇａｌ生産量
はＩＡを添加しない場合の１／２であった。これはＴｒ
ｐによプリブレッサが活性化されオペレータ部分に結合
するだめ、ｔｒｐプロモータへのＲＮＡポリメラーゼの
結合が妨げられるからである。
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ）法で測定した場合の純粋な
β−ｇａｚｔｍｇは３４０Ｕであり、かつ０ＮＰＧ法で
測定したβ−ｇａｌ活性はラクトース基質の場合よシ約
５倍高い値となる。そこで、これらの値を用いてβ−ｇ
ａＬ量を算出し、大腸菌１個当りのβ−ｇａｌ分子数と
して表わすとＩＡを添加した場合は８６，０００分子で
あった。これは通常の大腸菌の最大生産量の２０〜３０
、倍の生産量になる。これから、遺伝子組換えにより多
量の酵素生産が可能になった。抑制物質としてＴｒｐ（
トリプトファン）を添加した場合は、β−ｇａｌ生産量
はＩＡを添加しない場合の１／２であった。これはＴｒ
ｐによプリブレッサが活性化されオペレータ部分に結合
するだめ、ｔｒｐプロモータへのＲＮＡポリメラーゼの
結合が妨げられるからである。
以上のことから、ｔｒｐプロモータ下流に連結したβ−
ｇａｌ遺伝子を有する複合プラスミドはβ−ｇａｌを細
胞１個当ｊ５８６，０００分子生産していることと、β
−ｇａｌ遺伝子の発現はｔｒｐプロモータによシ制御さ
れていることを実証した。
ｇａｌ遺伝子を有する複合プラスミドはβ−ｇａｌを細
胞１個当ｊ５８６，０００分子生産していることと、β
−ｇａｌ遺伝子の発現はｔｒｐプロモータによシ制御さ
れていることを実証した。
本発明によシ造成された複合プラスミドｐＴＲＥＺ１
を用いることにより、β−ｇａｌを大量生産でき、かつ
新たなプロモータの探索や外来遺伝子の発現量をβ−ｇ
ａｌの発現で検定することなどができる。
を用いることにより、β−ｇａｌを大量生産でき、かつ
新たなプロモータの探索や外来遺伝子の発現量をβ−ｇ
ａｌの発現で検定することなどができる。
第１図はｔｒｐプロモータ下流域の塩基配列を示す図、
第２図はｐＴＲＥＺｌの造成方法を示す図、第３図はｔ
ｒｐプロモータとβ−ｇａｌ遺伝子の連結部分の塩基配
列を示す図及び第１表は大腸菌によるβ−ｇａｌ生産量
を示す表である。 １ 代理人 弁理
士 高橋明夫ａｑｌ 舎 ＴＴＣＡＣＣＡＴ６Ｃ６ＴＡＡＡＧＣＡＡＴＣＡ６ＡＴ
ＡＣＣＣ／ｖＪ［ＣＣＧＣＣＴＡＡＴ６ＡＧＣＧＧＧＣ
Ｔ′第３ ■ ｒｔｒｐＥポリベフ対ド
第２図はｐＴＲＥＺｌの造成方法を示す図、第３図はｔ
ｒｐプロモータとβ−ｇａｌ遺伝子の連結部分の塩基配
列を示す図及び第１表は大腸菌によるβ−ｇａｌ生産量
を示す表である。 １ 代理人 弁理
士 高橋明夫ａｑｌ 舎 ＴＴＣＡＣＣＡＴ６Ｃ６ＴＡＡＡＧＣＡＡＴＣＡ６ＡＴ
ＡＣＣＣ／ｖＪ［ＣＣＧＣＣＴＡＡＴ６ＡＧＣＧＧＧＣ
Ｔ′第３ ■ ｒｔｒｐＥポリベフ対ド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ下流域のｔｒ
ｐＥポリペフタイドのＮ末端側８個のアミノ酸をコード
するＤＮＡに連結されたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇ
ａｌ）遺伝子を有することを特徴とする複合プラスミド
。 ２、特許請求の範囲第１項の複合プラスミドを保持する
微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
であることを特徴とする宿主微生物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59127471A JPS619287A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | 複合プラスミド及びそれを保持する微生物 |
| EP85107679A EP0165614A3 (en) | 1984-06-22 | 1985-06-21 | Hybrid plasmid and microorganism containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59127471A JPS619287A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | 複合プラスミド及びそれを保持する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS619287A true JPS619287A (ja) | 1986-01-16 |
| JPH046353B2 JPH046353B2 (ja) | 1992-02-05 |
Family
ID=14960743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59127471A Granted JPS619287A (ja) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | 複合プラスミド及びそれを保持する微生物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0165614A3 (ja) |
| JP (1) | JPS619287A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2693475B1 (fr) * | 1992-07-08 | 1994-09-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procédé d'identification et/ou de clonage de promoteurs transcriptionnels, et utilisation de ces promoteurs pour l'expression de gènes. |
| HUE057864T2 (hu) | 2012-01-10 | 2022-06-28 | Cj Cheiljedang Corp | Fokozott L-triptofán termeléssel rendelkezõ Escherichia coli mikroorganizmusok és eljárás L-triptofán elõállítására azok alkalmazásával |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH078231B2 (ja) * | 1985-03-25 | 1995-02-01 | 株式会社日立製作所 | 培養制御方法及び培養制御装置 |
-
1984
- 1984-06-22 JP JP59127471A patent/JPS619287A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-21 EP EP85107679A patent/EP0165614A3/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BACTERIOL=1980 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0165614A3 (en) | 1988-01-07 |
| JPH046353B2 (ja) | 1992-02-05 |
| EP0165614A2 (en) | 1985-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baecker et al. | Biosynthesis of bacterial glycogen. Primary structure of Escherichia coli 1, 4-alpha-D-glucan: 1, 4-alpha-D-glucan 6-alpha-D-(1, 4-alpha-D-glucano)-transferase as deduced from the nucleotide sequence of the glg B gene. | |
| JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| JPS6240999B2 (ja) | ||
| JPH0669375B2 (ja) | 特異的切断リンカ− | |
| Kanai et al. | A novel heterologous gene expression system in Saccharomyces cerevisiae using the isocitrate lyase gene promoter from Candida tropicalis | |
| CN116102663A (zh) | 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用 | |
| CN111944841A (zh) | 利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法 | |
| CN114672447B (zh) | 一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用 | |
| US6407208B1 (en) | Chimeric proteins with a cellulose binding domain | |
| JPS619287A (ja) | 複合プラスミド及びそれを保持する微生物 | |
| EP0259891A2 (en) | [Leu 13] motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| JPH06311884A (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ | |
| CN111575314A (zh) | 尿激酶受体稳定突变体suPARcc在真核胞外蛋白表达中的应用 | |
| EP0590721A1 (en) | Method for expressing receptors of the human nervous system in the yeast Schizosaccharomyces pombe | |
| Miksch et al. | Controlled secretion into the culture medium of a hybrid-glucanase by Acetobacter methanolicus mediated by the kil gene of Escherichia coli located on a Tn 5-derived transposon | |
| JPH03501322A (ja) | 発現ベクター及びそれらの構成方法 | |
| CN117586991B (zh) | β-N-乙酰氨基己糖苷酶FlaNag2353及其应用 | |
| CN117343950B (zh) | 一种提高里氏木霉表达外源蛋白表达水平的方法 | |
| CN116375806A (zh) | 一种B/Austria/1359417/2021(B/Victoria lineage)HA抗原制备方法 | |
| JPH0928380A (ja) | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 | |
| CA1200774A (en) | Expression linkers | |
| CN114957397A (zh) | 一种δ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 | |
| CN116178570A (zh) | 一种猴痘病毒a35r抗原及其制备方法 | |
| JP3060019B2 (ja) | マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法 | |
| CN114957398A (zh) | 一种α株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法 |