JPH0669375B2

JPH0669375B2 - 特異的切断リンカ−

Info

Publication number: JPH0669375B2
Application number: JP56029294A
Authority: JP
Inventors: ウイリアム・ジエイ・ルツタ−
Original assignee: ザ・レジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シイテイ・オブ・カリフオルニア
Priority date: 1980-02-29
Filing date: 1981-02-28
Publication date: 1994-09-07
Anticipated expiration: 2009-09-07
Also published as: IL62237A0; DE3176248D1; EP0035384B1; KR860001305B1; CA1200773A; IE53311B1; DK166784B1; DK88881A; EP0035384A3; IE810433L; JPS56166200A; ZA811308B; IL62237A; AU6792281A; AU545394B2; KR830005350A; EP0035384A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、特異的切断部位を有する、アミノ酸配列をコ
ードするデオキシニユクレオチド配列を提供する。これ
らのデオキシニユクレオチド配列は本明細書中では特異
的切断リンカーと称せられ、組換えDNA工学に有用であ
る。

より詳細には、本発明は組換えDNAであつて、天然状態
では隣接していない三つの断片からなり、第一の断片は
真核タンパク質をコードし、かつ少なくとも二つのアミ
ノ酸の特異的に開裂しうるアミノ酸配列をコードする第
二の断片に隣接し、この第二の断片は第三の断片に隣接
しており、前記DNAと発現生成物は真核タンパク質と特
異的に開裂しうるアミノ酸配列とを連結するペプチド結
合を少なくとも一つの酵素試薬または化学試薬で特異的
に切断され、そして第三の断片は宿主ペプチドをコード
し、このペプチドはポリカチオンペプチド、ポリアニ
オンペプチドおよび疎水性ペプチドからなる群から選
択され、そしてこの第三の断片によりコードされるペプ
チドは天然には前記真核タンパク質とは関連のないもの
である組換えDNAおよびこのような組換えDNAの発現を適
当な宿主細胞中で行なうことができる組換えDNA断片に
関する。

生化学および組換えDNA工学における最近の進歩は、特
定の蛋白質を、正常にはそれらが分解された高等生物と
は無関係に、制御された条件下で合成することを可能と
した。このような生化学的合成方法は、インビトロー
か、無細胞系またはインビボーで、微生物の生きた細
胞に存在する蛋白質合成機構の酵素および細胞の構成成
分を用いている。いずれの場合でも、不可欠な要素は、
望むアミノ酸配列を規定するに必要な情報を含有する、
特異的配列のデオキシリボ核酸（DNA）を提供すること
である。このような特異的DNAは、本明細書中では、DNA
コード断片と称する。デオキシニユクレオチド配列が蛋
白質のアミノ酸配列を規定するのに用いられるコードの
関係は、下記に簡単に記載するが、これは、生きた生物
の既知の範囲の全体を通してひとつの基本的原則に従つ
て用いられている。

クローン化されたDNAを、インビトロー系で合成され
る蛋白質のアミノ酸配列を規定するのに用いうる。DNA
により導びかれる蛋白質合成系は、これの方面の技術で
よく知られている。たとへば、Zubay,G.,Ann Rev.Genet
ics７,267（1973）をみよ。さらに、一本鎖DNAは、イン
ビトローでメツセンジヤーRNAとして作用するように
誘導でき、その結果、高い信頼度でDNA配列が翻訳され
る（Salas,J.等、J.Biol.Chem.243,1012（1968）。この
分野でよく知られている他の技術もまた、上記の操作に
組合わせて、結果を改良するのに用いられうる。

組換えDNA工学の発展は、ヒトまたは他の哺乳動物のよ
うな高等動物より特異的遺伝子またはそれらの部分を分
離し、そして、それらの遺伝子または断片を、殺菌また
は酵母のような微生物に導入することを可能とした。導
入された遺伝子は、導入された微生物が複製するにとも
なつて、複数されそして増殖してゆく。その結果、転換
された微生物は、酵素であれ、ホルモンであれ、抗原で
あれ、抗体であれまたはそれらの１部分であれ、遺伝子
またはその断片がコードする蛋白質のすべてを合成する
能力を備えるようになりうる。微生物はこの能力を子孫
に伝えるので、結果として、この導入により、記載され
たような能力を有する新株が生じたことになる。たとへ
ばUllrich,A.等、Science196,1313（1977）およびSeebu
rg,P.H.等、Nature270,486（1977）をみよ。実際の目的
にこの技術を応用することの基礎となつている事実は、
微生物からヒトに至るまで、すべての生物のDNAが化学
的に類似しており、同じ４種のニユクレオチドより構成
されていることである。顕著な相違は、重合DNA分子中
のこれらのニユクレオチドの配列である。ニユクレオチ
ド配列は、生物が有している蛋白質のアミノ酸配列を規
定するのに用いられる。異なつた生物の蛋白質は相互に
異なつているけれども、ニユクレオチド配列のアミノ酸
配列に対する遺伝コードとしての関係は、すべての生物
について基本的に同じである。たとへば、ヒト脳下垂体
細胞中のヒト生長ホルモンのアミノ酸配列に対するコー
ド断片であるニユクレオチド配列と同じものが、微生物
に導入されても、同じアミノ酸配列のコードとして認識
されるであろう。

本明細書で用いる略称を表１に示しておく。

DNA配列の蛋白質のアミノ酸列へのコードとしての関係
は、全体として遺伝コードとして知られ、表２に示すよ
うである。

キー：各３文字デオキシニユクレオチドトリプレツト
は、左側に５′−末端を有し、右側に３′−末端を有す
る。mRNAのトリニユクレオチドに相当する。ここに示さ
れたDNA配列のすべては、配列がmRNAの配列に対応して
いる鎖の配列である。ウラシルに代わつてチミンが存在
する、これらの文字は、デオキシニユクレオチド配列を
形成するプリンまたはピリミジン塩基を表わしている。

Ａ＝アデニンＪ＝ＡまたはＧＧ＝グアニンＫ＝ＴまたはＣＣ＝シトシンＬ＝A,T,CまたはＧＴ＝チミンＭ＝A,CまたはＴＸ＝ＹがＡまたはＧならば、ＴまたはＣＸ＝ＹがＣまたはＴならば、ＣＹ＝ＸがＣならば、A,G,CまたはＴＹ＝ＸがＴならば、ＡまたはＧＷ＝ＺがＡまたはＧならばＣまたはＡＷ＝ＺがＣまたはＴならばＣＺ＝ＷがＣならばA,G,CまたはＴＺ＝ＷがＡならばＡまたはＧ QR＝ＳがA,G,CまたはＴならばTC QR＝ＳがＴまたはＣならばAG Ｓ＝QRがTCならば、A,G,CまたはＴＳ＝QRがAGならばＴまたはＣ差当たり目的として、このコードの重要な特徴は、各ア
ミノ酸が、ニユクレオチドトリプレツトしても知られる
トリユクレオチドにより規定されていることである。隣
り合うトリプレツトを結合するホスホジエステル結合
は、DNA中の他のすべてのニユクレオチド間結合と化学
的に区別されない。それで、読み枠を決定する追加の情
報がないと、特定のアミノ酸配列のコードとなるよう
に、ニユクレオチド配列が読まれ得ない。この読み枠と
は、遺伝情報を解読する際に、細胞により使用されるト
リプレツト群を表わすのに用いられている用語である。

原核細胞においては、内在するコード断片に先行して、
転写（mRNA合成）のイニシエーターおよび翻訳（蛋白質
合成）のイニシエーターの機能を有するニユクレオチド
配列を有するのがふつうで、それらは、それぞれプロモ
ーターおよびリボゾーム結合部位と称されている。コー
ド断片は、リボゾーム結合部位から約３から11個のニユ
クレオチド分だけ離れて始まつている。リボゾーム結合
部位とコード断片の開始コドンとの間に存在するニユク
レオチドの正確な数は、正しい読み枠内でのコード断片
の翻訳に不可欠でないようである。プロモーター、リボ
ゾーム結合部位およびリボゾーム結合部位に続く３−11
のニユクレオチドスペーサーを含めたニユクレオチド配
列を表わすのに、“発現調節断片”と、本明細書では称
することとする。真核細胞においては、転写および翻訳
の調節はやや複雑であろうが、しかし、このようなニユ
クレオチドを含みうる。

多くの組換えDNA技術では、２群の化合物、つまり導入
ベクターおよび制限酵素を用いているが、これらについ
て順次説明してゆくことにする。導入ベクターとは、DN
A分子が宿主微生物株に導入された時に、そのDNA分子の
複製を保証する遺伝情報を含有しているようなDNA分子
である。細菌遺伝学においてふつうに用いられている導
入ベクターの例としては、プラスミドおよびある種バク
テリオフアージのDNAがある。本明細書中に記載の実験
では、導入ベクターにプラスミドを用いているが、もち
ろん、他の型の導入ベクターを使用しうる。プラスミド
とは、宿主細胞自体のゲノム以外の、微生物細胞中に見
出だされうる、自律的に複製するDNA単位のすべてに適
用される。プラスミドは、宿主細胞の染色体に遺伝的に
結合していない。プラスミドは、一般的に数百万ダルト
ンの分子量の程度の二重鎖環構造として存在する。しか
し、あるものは10⁸ダルトンより大きい分子量を有す
る。それらは、細胞の全DNA中のわづかに小さいパーセ
ントを占めるのみである。導入ベクターDNAは、ふつ
う、宿主細胞DNAより、それらのあいだの大きさの差が
大きいことを利用して分けうる。導入ベクターは、大部
分の例で、宿主細胞の分裂とは無関係に、宿主細胞中で
の複製を可能とする遺伝情報を有している。ある種のプ
ラスミドは、それらの複製速度を、研究者が発育条件を
変えることにより変えうるような性質を有している。適
当な技術により、プラスミドDNA環を開き、異種DNAを挿
入し、環を閉じ、挿入されたDNA断片を含有する拡大分
子となしうる。バクテリオフアージDNAは、ある不可欠
フアージ遺伝子に代えて挿入された異質DNA断片を有し
うる。いずれにせよ、導入ベクターは、挿入異質DNA断
片の担体またはベクターとなりうる。

導入は、転換として知られる方法により達成しうる。転
換に際して、プラスミドDNAと混合した宿主細胞は、全
プラスミド分子を細胞に取り込む。この方法の機構は明
らかでないが、ある種の実験的に定められた処理によ
り、プラスミドDNAを取り込みうる宿主細胞の割合、従
つて転換されうる割合を最大となしうる。細胞がプラス
ミドをひとたび取り込むと、プラスミドは細胞内で複製
され、プラスミドのレプリカが、娘細胞の分裂にともな
つて分配される。プラミドDNAのニユクレオチド配列中
に含有される遺伝情報のすべては、原則として、宿主細
胞中に発現されうる。典型的には、転換された宿主細胞
は、プラスミド上に担われている形質、たとへばある種
の抗生物質に対する抵抗性の獲得で認知しうる。異なる
プラスミドは、それらが、それらを含有する宿主細胞に
付与する能力または能力の組合わせの差で認識されう
る。ある所定のプラスミドはプラスミドを含有する細胞
の純培養物を大量発育させ、それよりプラスミドDNAを
分離することで製造しうる。

制限エンドニユクレアーゼは、DNA分子の部位特異的切
断を触媒しうる加水分解酵素である。制限エンドニユク
レアーゼ作用の示される位置は、特異的ニユクレオチド
配列の存在で決まる。このような配列は、制限エンドニ
ユクレアーゼの認識部位と称されている。種々の原料よ
り制限エンドニユクレアーゼが分離されており、それら
の認識部位のニユクレオチド配列により特徴づけられて
いる。ある種の制限エンドニユクレアーゼは、ニユクレ
オチド鎖の両方共に、同じ位置でホスホジエステル結合
を水解し、ブラント（blunt）末端を生ずる。他は、相
互に数ニユクレオチド分だけ離れている結合を水解し、
切断された分子の各末端に、一本鎖の部分を生ずる。こ
のような一本鎖末端は、自己相補性で、それゆえに、付
着があり、水解DNAの再結合に使用しうる。このような
酵素により切断されうるDNAはすべて同じ認識部位を有
せねばならないので、同じ付着末端を生じ、ある制限エ
ンドニユクレアーゼで処理された異質DNA配列を、同様
に処理された他の配列に結合することが可能となる。Ro
berts,R.J,Crit.Rev.Biochem.４,123（1976）をみよ。
しかし、制限部位は比較的に稀である。しかし制限エン
ドニユクレアーゼの一般的用途は、制限部位配列を有す
る二重鎖オリゴニユクレオチドの化学的合成で増大され
た。それで、見掛け上、すべてのDNA断片に、分子の末
端に適当な制限オリゴニユクレオチドを付着させ、そし
て、生成物を適当な制限エンドニユクレアーゼの水解作
用に処して、それにより必要な付着末端を生成さすだけ
で、任意の他の断片に結合させうる。

Heyneker,H.L.等,Nature263,748（1976）およびSchelle
r,R.H.等、Science196,177（1977）をみよ。、制限エン
ドニユクレアーゼ認識部位の分布の重要な特徴は、それ
らが、読み枠に関して、無作為に分布していることであ
る。それで、制限エンドニユクレアーゼによる切断は、
相隣るコドンのあいだかまたはひとつのコドンの内部に
おこりうる。

DNA切断または末端配列の修飾のためにはより一般的方
法も用いうる。種々の非特異的エンドニユクレアーゼ
を、あとから論議するように、DNAを無作為に切断する
のに使用しうる。末端の配列は、１万の端にdAのオリゴ
ニユクレオチド尾部を、他端にdT尾部を形成するか、ま
たは、dGおよびdCの尾部を形成することにより、特異的
なリンカーの配列を必要としないで結合のための部位を
創製しうる。

“発現”の用語は微生物は、ある時点で、遺伝的に付与
された能力のすべてを用いることは、たとへおこること
があつたとしても、稀であることの認識から用いられて
いる。細菌のような比較的単純な微生物でも、細胞の合
成しうる蛋白質の多くは合成されない。しかし、適当な
環境条件下では、それらは合成されるようになる。所定
の遺伝子によりコードを与えられる蛋白質生成物がその
微生物により合成された時に、その遺伝子は発現された
という。その蛋白質生成物が作られないならば、遺伝子
は発現されない。ふつう、E.coli中の遺伝子の発現は、
あとから一般的に記載するように調節されている。その
場合、ある所与の環境では有用でない機能を有する蛋白
質は、合成されず、代謝エネルギーは節約される。

遺伝子の発現が調節される手段は、E.coliおよび酵母に
おいて、過去20年間の広範な研究により、よく理解され
ている。一般的なものとして、Hayes,W.,The Genetics
of Bacteria and Their Viruses,第２版、John Wiley＆
Sons,Inc.,New York（1968）、Watson,J.D.,The Molecu
lar Biology of the Gene,第３版、Benjamin,Menlo Par
k,California（1976）をみよ。これらの研究で、いくつ
かの遺伝子、ふつうは、細胞中の関連した機能を行なう
蛋白質をモードするいくつかの遺伝子は、連続した順序
で集まつていることが分つた。この集合をオペロンとい
う。オペロン中のすべての遺伝子は、配列中の第１の蛋
白質のＮ−末端アミノ酸をコードするコドンより始ま
り、そしてオペロン中の最後の蛋白質Ｃ−末端まで連続
して、同じ方向にむけて転写される。オペロンの開始部
分には、Ｎ−末端アミノ酸コドンの先方に、調節域と称
されているDNAの領域が存在する。これは、オペレータ
ー、プロモーターおよびリゾボームの結合のための配列
を含めた種々の調節要素を含有する。これらの部位の機
能は、これらによりコントロールされている遺伝子が、
微生物の必要に応じて発現することを可能とするのであ
る。たとへば、乳糖の利用だけに必要とされる酵素をコ
ードする遺伝子は、乳糖またはその類縁体が培地中に実
際に存在しないと顕著に発現されることがない。発現が
おこるために存在しなければならない調節域の機能は、
転写の開始および翻訳の開始である。それでコード断片
の独立した発現のための最小限の必要条件は、プロモー
ター、リボゾーム結合部位および３−11のニユクレオチ
ドスペーサー断片である。これらの機能を果たすニユク
レオチド配列は比較的に短かく、発現調節のための断片
の主要部分は、長さで15から25ニユクレオチドでありう
る。配列中の第１の遺伝子の発現は、オペロンの第１の
蛋白質のＮ−末端アミノ酸をコードする位置における転
写および翻訳の開始で開始される。この点より下流にあ
るそれぞれの遺伝子の発現は、やはり、順次に発現され
てゆき、ついには、終止シグナルに到達するか、また
は、異なる環境要件に反応するためのキーとなつている
調節域と遭遇するに至る。この一般的なスキームの詳細
については多くの変型があるが、E,coliのような宿主ま
たは酵母のような真核細胞中で発現されるためには、遺
伝子は、転写のイニシエーターおよび翻訳のイニシエー
ターとしての機能を有する調節域に対して適当な位置に
存在せねばならない。

正常には所与のオペロンの部分になつていない遺伝子を
オペロン中に挿入し、オペロンによりコントロールさせ
うることが示されている。古典的な証明は、Jacob,F.,
等J.Mol.Biol.13,704（1965）に記載の論文でなされて
いる。この実験で、プリン生合成に関与する酵素をコー
ドする遺伝子が、乳糖オペロンによりコントロールされ
ている領域に導入された。ついで、プリン生合成酵素の
発現が、乳糖または乳糖類縁体が存在しないと抑制され
ることが分つた。そして、その発現をコントロールして
いた環境因子に反応しなくなることが分つた。

それより下流の遺伝子の転写の開始を調節するオペレー
ター領域に加えて、所与の蛋白質内のＣ−末端を示すス
トツプシグナルとして機能するコドンが存在することも
知られている。表２をみよ。このようなコドンは終止シ
グナルとして知られ、また、ナンセンスコドンともい
う。それは、それらがアミノ酸をコードしていないから
である。オペロンの構造遺伝子のあいだの終止シグナル
を除去すると、融合遺伝子となり、これは、隣接する遺
伝子によりコードされる２つのアミノ酸配列がペプチド
結合により結合されているキメラまたは融合蛋白質を生
ずる。遺伝子が融合した時にこのようなキメラ蛋白質が
合成されることは、Benzer,S.およびChampe,S.P.により
Proc.Nat.Acad.Sci USA48,114（1962）記載の論文に示
されている。

ある遺伝子が分離され、精製されそして導入ベクター中
に挿入されると、これらの操作全体は遺伝子のクロン化
と称されているが、実質的量でそれらを入手することが
可能となる。クロン化された遺伝子は適当な微生物に導
入され、微生物の増殖にともなつて遺伝子は複製され、
従来法により再分離されうる。このようにして、さらに
処理し、変型しそして他のベクターまたは同じベクター
中の他の遺伝子座に導入するための、連続的に更新しう
る遺伝子の原料を提供する。

従来法によると、発現さすのに、クロン化された遺伝子
を適当な配向性および読み枠になるように調節域に導入
し、宿主遺伝子より読んでくると、クロン化された遺伝
子によりコードされたアミノ酸配列を含有するキメラ蛋
白質が合成されるようになつていた。調節域に対して適
切な配列としたクローン化遺伝子を有する、発現導入ベ
クターの構成については、つぎに示す参考文献を記載さ
れている。Polisky,B.,等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA73,3
900（1976）;Itakura,K.等、Science198 ,1056（197
7）;Villa-Komaroff,L.,等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA75,
3727（1978）;Mercereau-Puijalon,O.,等、、Nature27
5,505（1978）;Chang,A.C.Y.等、Nature275,617（197
8）、および1978年８月11日願Rutter等によるアメリカ
合衆国特許願シリースNo.933,035。なお、この特許願
は、その全体を、本明細書の参考として引用する。

シリースNo.933,035に記載のように、クロン化遺伝子
は、遺伝子を発現さすために宿主の調節断片に接続させ
ている。この調節断片は、転写の開始および翻訳の開始
をさすための調節域だけから構成されているか、また
は、構造遺伝子の１部を追加して含むこともありうる。
これは、挿入部位に応じて変わつてくる。そして、発現
生成物は、以降非融合蛋白質と称するような、クロン化
遺伝子によりコードされた蛋白質であるか、または、１
部が原核細胞の構造遺伝子により、１部がクロン化され
た遺伝子により、そして１部が、２つの遺伝子を結合す
るニユクレオチド配列が介在すればそれによりコードさ
れている蛋白質となる。融合蛋白質中の、Ｃ−末端を含
有する望む蛋白質またはペプチドと、残余の部分とのあ
いだに存在するペプチド結合を、“接続結合junction b
ond"と称することとする。

蛋白質が生成されたら、それは精製されねばならない。
非融合蛋白質または融合蛋白質の精製には、いくつかの
利点や欠点がある。非融合蛋白質は細胞内に生産され
る。その結果、非融合蛋白質を放出さすには、細胞は融
解さすかまたは別様に処理せねばならない。融解物は、
非融合蛋白質に加えて細胞蛋白質のすべてを含有する。
それで精製を困難にする。また、非融合蛋白質は、よそ
もの蛋白質としてみなされ、細胞内ですみやかに分解さ
れる。それで非融合蛋白質をかなりの収量でうることは
できない。非融合蛋白質の主な利点は、その蛋白質自体
が望む最終生成物であることである。

発現生成物の安定性は、しばしば、融合蛋白質の発現に
より強化される。融合蛋白質の宿主部分は、しばしば、
細胞内分解に対して発現生成物を安定化する。さらに、
隔離することによりまたは細胞から培地中に分泌するこ
とにより分解より保護されるような宿主蛋白質を選択す
ることもできる。それで、クロン化遺伝子は、そのよう
な蛋白質に対する宿主遺伝子に付着させうる。分泌され
るかまたは隔離されうる宿主蛋白質（Ｎ−末端）および
真核蛋白質（Ｃ−末端）より成立つ融合蛋白質は、同様
に、細胞から分泌されたりまたは隔離されるであろう。
つまり、分泌性を付与するシグナルとなるアミノ酸配列
は、融合蛋白質のＮ−末端部分に存在するからである。
細胞培地中に分泌される融合蛋白質の場合、精製は非常
に簡単になる。ある場合、宿主部分が、単純な精製操作
を可能とするような特徴的物理性を有している。この融
合蛋白質の主な欠点は、宿主蛋白質を融合蛋白質より取
り除いて真核細胞蛋白質を得ねばならぬことである。

宿主細胞中で蛋白質が安定ならば、非融合蛋白質として
直接に発現さす方が一般的に有利であろう。多くの例
で、細胞融解物より発現生成物を精製せねばならぬとい
う欠点は、Ｎ−末端部分を除去するのに特殊な切断手段
を用いなくてよいという利点で克服されよう。もつとも
有利には、本発明により、本明細書に示されるように、
精製に有用な顕著な物理的性質を有するＮ−末端配列を
含有し、そして望むＣ−末端との接続点において、望む
Ｃ−末端蛋白質またはペプチドにほとんど影影を与えな
い手段で切断しうる、上記定義のような接合結合を有す
る融合蛋白質として、Ｎ−末端配列含有融合蛋白質が発
現されることである。

ペプチドの化学的切断に多くの方法が提案され試験され
た。たとへば、Spande,T.F.等、Adv.Protein Chem.24,9
7（1970）をみよ。しかし、これらの方法の多くは非特
異的、つまり、蛋白質の多くの部位で切断する。また、
The Proteins,3版、Neurath,H.およびHill,R.L.,編、Ac
ademic Press,Vol.3,50−57頁（1977）をみよ。ペプチ
ド結合の水解は、種種の既知の蛋白質分解酵素で触媒さ
れる。酵素、第３版、Boyer,P.D.,編、Academic Press,
Vol.III（1971）;Methods in Enzymology,Vol.XIX,Perl
man,G.E.およびLorand,L.編、Academic Press（197
0）；および、Methods in Enzymology,Vol.XLV,Lorand,
L.,編、Academic Press（1976）をみよ。しかし、多く
の蛋白質分解酵素は、やはり、切断部位に関して非特異
的である。

切断についての化学的または酵素的手段の特異性は、水
解されるペプチド結合の部位またはその近くのアミノ酸
残基により表現される。蛋白質またはポリペプチド中の
ペプチド結合の水解は、本明細書中では、加水分解され
る結合部位における、蛋白質またはポリペプチドの切断
と称することにする。化学的または酵素的手段により水
解されるペプチド結合は一般的に既知である。（上記参
考文献をみよ。）たとへば、トリプシン（3.4.4.4）
は、アルギニンまたはリジン残基のカルボキシル側を切
断する。（酵素のあとのかつこ内の数は、Internationa
l Union of Biochemistsにより設定された命名法に従つ
ている。）つまり、トリプシンは、アルギニンまたはリ
ジンに対して特異的であると言われる。トリプシンは、
アルギニンまたはリジンのカルボキシル側のみを水解切
断するので、せまい特異性を有すると言われる。他方、
ペプシン（3.4.4.1）は広い特異性を有し、大部分のア
ミノ酸のカルボキシル側を切断するが、より好んで、フ
エニルアラニン、チロシン、トリプトフアン、システイ
ン、シスチンまたはロイシン残基のカルボキシル側を切
断する。いくつかの特異的化学的切断反応が知られてい
る。たとへば、CNBrは、適当な条件では、メチオニン残
基の部位においてのみ切断する。しかし、化学的であれ
酵素的であれ、すべての特異的切断手段にともなう困難
は、その手段が、切断部位またはその近くに存在する単
一のアミノ酸残基の存在に依存しており、望む蛋白質の
アミノ酸配列の内部にはそのような残基がまつたく存在
しないことの知れている特異的な場合にのみ有用なこと
である。望む蛋白質が大きければそれだけ水解される部
位が望む蛋白質内に生ずる可能性も増大する。それで、
望む部位で融合蛋白質を切断する一般的に有用な技術
は、望む蛋白質の内部に存在する可能性の低いアミノ酸
配列が接続結合の部分に存在する場合に有利に適用され
ることになる。

水解されるペプチド結合部位についての特異性は、一般
的に、酵素の第１次特異性と称されている。それで、ト
リプシンは、アルギニンおよびリジン残基に対して第１
次特異性を有することになる。酵素の第１次特異性につ
いては、著しく研究されて来た。ある特定の酵素は、酵
素の第１次特異性に対応する蛋白質分子中のアミノ酸残
基を認識しそして結合してその部位で蛋白質を切断する
であろう。基質を認識しそして結合しそして反応を触媒
する酵素の部分は、活性部位として知られている。たと
へば、トリプシンは、蛋白質内のアルギニン残基を認識
しそしてそれに結合し、アルギニンのカルボキシル側に
おいてその酵素を切断する。多年の間、第１次特異性に
相当するアミノ酸残基のみが、酵素によるペプチド結合
の水解の特異性に影響すると考えられた。しかし、水解
部位のすぐ近くにあるアミノ酸も、酵素の水解部位への
親和性に影響することが認められている。この影響につ
いてのいくつかの例をトリプシンについて示しうる。配
列−Ｘ−Arg−Ｙ（ただし、ＸおよびＹはアミノ酸とす
る）を考える場合、Arg−ｙ結合へのトリプシンの結合
親和性は、ＸがGluまたはAspの場合に著しく減少するこ
とが分つた。同様にアルギニンまたはリジン残基への親
和性は、リジン、アルギニンまたはそれらの組合わせが
反復する配列に対して、アルギニンまたはリジンの残基
が単独に存在する場合より大きいことが分つた。つま
り、酵素は、ｙ−Arg−ｘに比して、−Arg−Arg−ｘに
より選択的に結合するのである。さらに、トリプシン
は、−Arg−Pro−または−Lys−Proペプチド結合は水解
しないようにみえる。Kasper,C.B.,Protein Sequence D
etermination,Needleman,S.B.,編、Springer−Verlag,N
ew York（1970）137頁をみよ。

最近、水解部位に近く存在するアミノ酸もまた酵素によ
り認識されそして結合されるであろうことが確実になつ
た。たとへば、Schechter,I.等は、Biochem.Biophys.Re
s.Comm.,27,157（1967）に、パパイン（3.3.4.10）は、
種々の長さのペプチドの水解より、活性部位において、
数個のアミノ酸残基に結合することを示している。いく
つかのアミノ酸残基に対して結合する活性部位は、拡大
された活性部位と称されている。水解されるその部位で
ない。追加のアミノ酸に対する酵素の特異性は、時とし
て、酵素の第２次特異性と称されている。今や、多くの
酵素が拡大された活性部位を有することが示されてい
る。拡大された活性部位を有する酵素の例を追加すると
つぎのようである。エラスターゼ（3.4.4.7）−Thompso
n,R.C.,等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA67,1734（1970）；
アルフアー−キモトリシプシン（3.4.4.5）−Bauer,C.
A.等、Biochem.15.1291および1296（1976）；キモシン
（3.4.23.4）−Visser,S.,等、Biochem.Biophys.Acta43
8 265（1976）；エンテロキナーゼ（3.4.4.8）−Marou
x,S.,等、J.Biol.chem.246,5031（1971）。（また、Fro
lif,J.S.,Cold Spring Harbor Conf.Cell Prolif.２,33
（1975）．）拡大された活性部位は少なくとも、酵素の
触媒効果を増加さすように見える。さらに、それは、ペ
プチドへの酵素の結合親和性を増加させうる。

上記引用のFruton,J.S.の文献をみよ。たとへば、Bioch
em.Biophys.Res.Comm.,32,898（1969）にSchechter,I.
等が記載しているように、−Ｘ−Phe−Ｙ−Ｚ（ただし
式中、X,YおよびＺはアミノ酸とする）の配列で、フエ
ニルアラニンが、ペプチドのパパインによる水解されや
すさを強化しそしてＹ−Ｚペプチド結合への酵素の攻撃
を導びく。上記の配列中でPheに代わつて、バリンおよ
びロイシンも類似の結果を与えうる。これにより、パパ
インの特異性の広さが説明されえよう。上記引用のGlaz
er,A.N.等、The Enzymesの501頁をみよ。つまり、酵素
は、それの第１次特異性のみかまたはそれの第２次特異
性との組合わせ（つまり、酵素が拡大された活性部位を
有する場合）により、せまい特異性を有することにな
る。

本発明は、望む蛋白質が、融合蛋白質であれまたは非融
合蛋白質であれ、望む場合に応じて生産され、そして、
融合蛋白質の接続結合における特異的切断を可能としそ
してさらには迅速な精製を可能とするような、追加の特
異的アミノ酸配列を与えられるような、クロン化された
コード断片の原核細胞または真核細胞における発現方法
を提供する。ここに記載する、発明の一般的方法は、望
む蛋白質の大きさおよび機能、および融合または非融合
にするかについての発現の相対的な有利さ（上記論議し
たような、この分野でよく知られている原則により判断
する）に応じて、研究者は、適宜選択して応用しうる。

接続結合の特異的切断のための一般的に有用な手段を提
供するためには、せまい特異性を有する化学的または酵
素的切断手段は、特殊なケースを除いては不適当であろ
う。融合蛋白質の真核蛋白質部分に存在するような切断
部位での切断手段は不適当であろう。たとへば、真核蛋
白質は、いくつかのアルギニンおよび（または）リジン
残基を含有しうる。トリプシンは、これらの残基のカル
ボキシル側を切断するであろう。切断は真核蛋白質内で
もおこるであろうから、トリプシンは、本発明に用いる
のに不適当であろう。このことは、また、多くの化学的
切断手段にも言える。それで、より特異的な切断を実現
するには、２個またはより多くのアミノ酸残基を含む特
異的アミノ酸配列中に切断部位を有するであろう切断手
段を用いる必要があることを理解しえよう。たとへば、
アミノ酸配列−Ｘ−Ｙ−Ｚ−に特異的な切断手段で、Ｚ
残基のカルボキシル側で切断することが望ましい。真核
蛋白質内に類似の配列が存在する確率は非常に小さいで
あろう。それゆえに、真核蛋白質内に切断のおこる確率
も非常に小さくなる。そうすると、真核蛋白質を取り出
しそして精製しうる。

本発明は、少なくとも二つのアミノ酸の特異的に開裂し
うるアミノ酸配列が、宿主部分と真核部分とのあいだに
挿入されるように融合蛋白質が発現されるようにデザイ
ンされている。真核部分の配列が既知ならば、真核蛋白
質に現われないようなただ１個のアミノ酸残基の特異的
に開裂しうるアミノ酸配列を選択することが可能であ
る。しかし、本明細書中で、しばしば拡大された特異的
に開裂しうるアミノ酸配列と称するような、２個または
２個より多くのアミノ酸を含有する特異的に開裂しうる
アミノ酸配列を用いるのが有利である。この型の配列
は、種々の酵素の拡大された活性部位を利用している。
拡大された特異的に開裂しうるアミノ酸配列を用いるこ
とにより、切断が望む部位つまり接続結合にのみ生起
し、そして望む蛋白質内に生起しないという可能性が大
となる。本発明は、組換えDNA工学に重要である。特異
的に認識されうるアミノ酸配列を融合蛋白質の宿主蛋白
質部分と望む蛋白質部分のあいだに挿入することによ
り、望む蛋白質を影響しないで、融合蛋白質より望む部
分のみを特異的に切り取ることが今や可能になつたので
ある。

本発明で考慮する実際的目的では、接続部位での切断の
特異性が、望む蛋白質にありうる切断部位との関連にお
いて、絶対的に片方に存在し片方に存在してはいけない
という必要はない。接続結合の切断部位が、結合親和性
の増加かまたは回転の増加により速度論的に十分に有利
となり、望む蛋白質が妥当な収量で得られるように、接
続結合が優先して切断されるようであれば十分である。
温度、緩衝液、酵素と基質との比率、反応時間および類
似の条件を、この分野でふつうの技術によつて、望む蛋
白質が最大収量で得られるように選択しうる。

特異的切断部位で切断しうる酵素のひとつにシグナルペ
プチダーゼと呼ばれているものがある。いくつかの真核
蛋白質および原核蛋白質で、最初の翻訳生成物はその蛋
白質自体ではなくて、蛋白質のアミノ末端に約20個の追
加アミノ酸の存在する蛋白質である。この追加のアミノ
酸配列はシグナルペプチドと呼ばれる。このシグナルペ
プチドは、合成蛋白質を小胞体内に一定方向に輸送する
ための特異的シグナルで、この輸送段階で、切り取られ
る。Blobel,G.等、J.Cell Biol,67,835（1975）をみ
よ。特異的切断酵素つまりシグナルペプチダーゼは、膜
通過にともなつて、シグナルペプチドと活性淡白質との
あいだのペプチド結合を水解する無細胞系に観察されて
いる。Blobel,G.等、Proc.Nat.Acad.Sci.SA75,361（1
978）をみよ。

本発明は、分離DNA断片の末端に、その断片を導入ベク
ター中に挿入する前に付着させうる、蛋白質のＮ−末端
部分をコードする特異的切断リンカーを合成する方法を
提供する。この特異的切断リンカーは、望む蛋白質中に
存在しない特異的切断部位を含有するアミノ酸配列をコ
ードする。つまり、リンカーアミノ酸配列中での特異的
切断は、融合蛋白質により望む蛋白質の分離を可能とす
る。本発明の利点は、望む蛋白質のＮ−末端の第１のア
ミノ酸のアミノ末端側において切断することである。別
の利点は、望む蛋白質は、切断操作中にほとんど分解さ
れぬことである。

非融合蛋白質としての発現を提供する目的では、本発明
はプロモーター、リボゾーム結合部位および３−11ニユ
クレオチドスペーサーを含有する合成オリゴニユクレオ
チドリンカーを提供する。このリンカーは、コード断片
と組合わせて、導入ベクターに挿入され適当な宿主を変
換するのに用いられた場合に、コード断片の直接的発現
を可能にする。そのようなリンカーを用いると、ベクタ
ーの“サイレントsilent"領域に挿入されても、コード
断片を発現しうる。その結果、適当な挿入部位の選択の
範囲は増加する。なるべくは、コード断片の直接的発現
を、合成プロモーター断片によらないで達成する。リボ
ゾーム結合部位リンカーを、３から11個のニユクレオチ
ドスペーサーとあわせると、天然に存在するプロモータ
ー部位で開始されたmRNAの翻訳の再開始を指示する。そ
れで、コード断片および発現リンカーを、天然に存在す
るプロモーターの調節下にある導入ベクター遺伝子に挿
入する限り、挿入されたリボゾーム結合部位における再
開始は、付着させたコード断片の直接的発現をもたら
す。もつとも有利には、存在するプロモーターに隣接し
て、それと、それが正常の状態で調節している構造遺伝
子のあいだに挿入する。

融合または非融合蛋白質の精製を改良する目的では、本
発明は、精製の容易さを増強するように機能するアミノ
酸配列をコードするリンカーを提供する。たとへば、ポ
リ陰イオン性アミノ酸断片、ポリ陽イオン性アミノ酸断
片または疎水性断片は、種々の既知固体相吸着剤または
カラム材料により強く結合されるであろう。特異的結合
材料により認識される特異的アミノ酸配列を、望む蛋白
質のいずれかの端に添加して、アフイニテイクロマトグ
ラフイーに精製しうるようになしうる。このような精製
用の断片を特異的切断用の断片と組合わせて用いると、
融合または非融合蛋白質を簡単に精製しついて精製断片
を特異的に切断しそしてそれを定量的に除去することを
可能とする。

本発明によれば、上記の諸目的をそれぞれのシステムに
性質に従つて達成し、望む蛋白質の調製に際しての個々
の問題の解決が可能となる。本明細書に議論するような
本発明の諸原則は、望む発現生成物の１部ではない、蛋
白質またはペプチドのいずれからも特異的に切断されう
る精製用断片を用いるかまたは用いないで、融合蛋白質
かまたは非融合蛋白質としてコード断片を発現するため
の、一般的に応用されうる手段を提供する。

本発明は、クロン化されたDNAコード断片に付着さすべ
き、特異的オリゴニユクレオチド断片（本明細書では
“リンカー”と称する）を提供するという一般的原則に
基づいている。本発明のリンカーは、コード配列により
コードされる蛋白質の発現に際して望ましい機能的性質
を付与する。本発明のリンカーを用いて、望む蛋白質を
融合または非融合蛋白質として発現させうる。単純化さ
れた精製方法を適用しうる性質を付与するように選択し
た追加のアミノ酸配列をコードするリンカーを付着させ
うる。淡白分解酵素の示す拡大された特異的切断部位に
存在するアミノ酸配列をコードするリンカーならびによ
り単純な特異的切断部位に対応する特異的切断リンカー
を提供する。

用いるオリゴニユクレオチドリンカーは、本明細書では
“断片”と称する。それで、特異的切断部位をコードす
るオリゴニユクレオチドは、特異的切断断片と称する。
転写および翻訳の開始のためのコードは、発現調節断片
と称する。再開始翻訳のためのコードは発現断片と呼ば
れる。特異的精製のためのコードは、精製断片と呼ばれ
る。望む蛋白質をコードするクロン化ニユクレオチド配
列はコード断片と呼ばれる。発現生成物は、上記したよ
うな部分を有する蛋白質またはポリペプチドである。望
む蛋白質またはペプチドを融合蛋白質として表現する場
合、宿主または導入ベクターゲノムに由来するＮ−末端
アミノ酸配列は宿主部分と呼ばれる。特異的切断リンカ
ーを用いた場合、それの発現に由来するアミノ酸配列
は、特異的切断部分と呼ばれ、そして精製断片を付着さ
せた場合、それの発現生成物は、精製部分と呼ばれる。
クロン化されたコード断片によりコードされる部分は、
望む蛋白質と呼ばれ、この呼称は、コード断片により規
定される、すべての大きさのポリペプチド、ポリアミノ
酸、蛋白質または蛋白質断片を表わすのに用いる。

本発明のリンカーは、コード断片のいずれかの端に付着
させると、望む蛋白質のアミノ末端かまたはカルボキシ
ル末端かに望む部分を付与しうるとみなしうる。もちろ
ん、望む蛋白質のカルボキシル末端に付着させた部分の
発現のためには、コード断片は終止コドンを含有しては
ならない。さらに理解されるように、望む蛋白質のカル
ボキシル末端に付着させた部分を発現させようとするリ
ンカーは、発現させようとするリンカー断片の末端にお
およそ位置する終止コドンを含まねばならない。

本発明は、望む蛋白質およびそれを発現させる宿主の性
質に応じて、クロン化させたコード断片の発現のさせ方
に、多様な選択の道を開く。宿主は原核性でも真核性も
よく、望む蛋白質が宿主中で小型であるかまたは不安定
であるならば、融合蛋白質を発現さすのが有利である。
本発明の特異的切断リンカーの使用は、融合蛋白質の宿
主部分の特異的除去を引き続き行なうことを可能とす
る。さらに、精製断片を含ませて、特異的切断前に簡単
化させた精製に利用しうるような機能的性質を付与する
融合蛋白質の領域を与えるのが望ましいであろう。特異
的切断のあとに、精製部分は宿主部分に付着したままに
残り、望む蛋白質よりの宿主部分の分離を簡単にする。
ある場合には、望む蛋白質を非融合蛋白質として発現さ
すのが有利である。その場合、発現断片または発現調節
断片のリンカーの使用は、コード断片の直接的表面を可
能とする。もちろん、このような直接の発現は、開始コ
ドンの存在に依存する。開始コドンがコード断片に含ま
れないならば、それは、発現断片の１部分として提供し
うる。Ｎ−末端メチオニンを望まないならば、開始メチ
オニンコドンとコード断片とのあいだに特異的切断断片
を挿入しうる。精製断片リンカーを含ませて、発現生成
物のすみやかな精製を可能としうる。別様には、発現断
片リンカーの使用に続いてシグナルペプチドをコードす
るリンカーを付着させ、発現生成物を宿主細胞より分泌
させる。

所与の望む蛋白質の発現を助けるように選択したリンカ
ーの特定の組合わせは、望む淡白質の性質および発現シ
ステムにおける機能に応じて選択する。記載したリンカ
ーのあるものは、原核性および真核性宿主に適当であ
り、他のものは、宿主細胞の特定のタイプに特異的であ
る。一般的な技術的問題として、このような選択をなし
うるであろう。本明細書に具体的に記載されていない、
記載されたリンカーの見合わせも、本発明の範囲内にあ
るものとする。

つぎに、本発明を詳細に記載してゆく。特異的切断リン
カーは、特異的切断部位を含有するアミノ酸配列をコー
ドするデオキシニユクレオチド配列とする。特異的切断
リンカーは、微生物に導入する前にコード断片に付着さ
せる。特異的切断リンカーの利点は、融合蛋白質の接続
結合に特異的切断部位を含有する特異的切断配列を提供
することである。この結合は切断されると望む蛋白質を
生成する。

現行の組換えDNA工学を用いて、分離されたコード断片
を導入ベクターに挿入し、この導入ベクターで微生物を
転換し、適当な条件下で、コード断片を微生物により発
現さすことが可能である。しばしば、正常には細胞より
分泌される蛋白質をコードする宿主遺伝子の部分にコー
ド断片を結合さすのが望ましい。このようにするのは、
発現生成物である、宿主蛋白質部分および望む蛋白質を
含有する融合蛋白質が、隔離されるかまたは細胞より培
地中に分泌されるようにするためである。望む蛋白質の
細胞内での分解を減少さすかまたは防止するので、この
方法が望ましい。培地中に分泌される融合蛋白質の場合
には、融合蛋白質を精製するのがより容易である。培地
中の全蛋白量は、融解物中の全蛋白量より少ないので、
融合蛋白質の精製は容易である。

融合蛋白質発現の別の利点は、宿主部分を精製するため
の、よく知られている手段がしばしば存在するからであ
る。このような手段はしばしば融合蛋白質にも適用され
うる。アフイニテイクロマトグラフイーは、用いうる場
合には、特に有用である。

この方法の主な難点は、融合蛋白質中の宿主部分より望
む蛋白質を除去する必要のあることである。望む蛋白質
を精製するためにはこの段階が必要である。このことが
ふつう困難であるのは、望む蛋白質のアミノ末端の宿主
蛋白質のカルボキシ末端とのあいだに、特異的な化学的
または酵素的手段で単独に攻撃されうる特異的切断部位
が存在しないからである。そこで本発明は、融合蛋白質
の望む蛋白質と宿主部分とのあいだに特異的に開裂しう
るアミノ酸配列を加えることを提供するのである。

上記論議のように、蛋白質を切断するための方法が多く
存在する。化学的手段の例として、臭化シアノゲン（CN
Br）およびヒドロキシルアミンがある。たとへば、上記
引用のSpande,T.F.等の文献をみよ。蛋白分解酵素の例
には、トリプシン、パパイン、ペプシン、トロンビン
（3.4.4.13）およびエンテロキナーゼがある。上記引用
のThe Proteins,Meth.Enzymol.,Vol.XIX,およびMeth.En
zymol.,Vol.XLVをみよ。しかし、これらの手段の多く
は、本発明で使用するに十分な特異性を示していない。
つまり、これらの手段の多くは、特異的アミノ酸残基を
認識しそしてその部分で切断しているだけである。それ
で、非常にわづかな場合を除いて、これらの同じ手段は
望む蛋白質の切断もおこすであろう。

本発明はDNAに対する制限エンドニユクレアーゼと類似
の状態を蛋白質に対しても創出しようとするのである。
上記論議のように、制限酵素は、DNAの特異的配列を認
識し、その場所でDNAを切断するのであろう。本発明
は、特定の化学的または酵素的切断手段により認識され
る、１種または１種より多くのアミノ酸残基を含有する
特異的アミノ酸配列を提供する。宿主部分と望む蛋白質
とのあいだの部分に特異的アミノ酸配列を加える。これ
を達成するには、特異的アミノ酸配列をコードするデオ
キシニユクレオチド配列を化学的に合成する。このDNA
配列を、導入ベクターに加える前の分離された遺伝子に
付着させる。このDNA配列を、本明細書では、特異的切
断リンカーと称する。この特異的アミノ酸配列を、本明
細書中では、特異的切断部分と称する。この特異的切断
部分は、特異的切断部位を含有する。この特異的切断部
分は、望む蛋白質中に存在しないか存在しそうにないも
のを選択する。このようにして、望む蛋白質を、それ自
体を分解することなしに、融合蛋白質の宿主部分により
分ける。

特異的に開裂しうるアミノ酸配列を選択する際には、い
くつかの要因を考慮せねばならない。望む蛋白質のアミ
ノ酸配列が既知であるならば、特異的に開裂しうるアミ
ノ酸配列を選択するのはかなり簡単なことである。この
場合、望む蛋白質内に見出だされない特異的切断部位を
用いるのが有利である。たとへば、ヒトプロインシユリ
ンはメチオニンをまつたく含有しない。それで、メチオ
ニンを特異的に開裂しうるアミノ酸配列に選択しうる。
メチオニンをコードするDNA配列を、導入ベクターに挿
入するより前の分離ヒトプロインシユリン遺伝子に付着
さすならば、発現に際して生産される融合蛋白質は、適
当な条件下にCNBrで処理して、宿主蛋白質よりヒトプロ
インシユリンを切断しうる。上記引用のKonigsberg,W.
H.等、The Proteinsの２頁をみよ。同様に、ヒトプロイ
ンシユリンは、配列Ｘ−Phe−Arg−Ｙを含有しない。酵
素カリクレインＢ（3.4.21.8）は、この配列を認識し、
アルギニンのカルボキシル側で切断する。上記引用のFi
edler,F.のMeth.Enzymol.,Vol.XLVの289頁をみよ。それ
で、Phe−ArgをコードするDNA配列（TTK−WGZ）を挿入
前の、分離されたヒトのプロインシユリン遺伝子に付着
さすことにより、発現に際して、生産される融合蛋白質
をカリクレインＢで切断して、ヒトプロインシユリンが
得られる。それで、望む蛋白質の配列が知られている時
には、化学的または酵素的切断手段により特異的に切断
され、そして望む蛋白質の配列には現われないアミノ酸
配列を選択することが可能である。

望む蛋白質のアミノ酸配列が知れていない時には、特異
的切断配列の選択はより困難となる。この場合には、少
なくとも２個のアミノ酸残基を有する配列を用いるのが
有利である。特異的切断配列中のアミノ酸残基の数が大
であるほど、望む蛋白質中に類似の配列が生ずる確率が
減少する。この結果、宿主部分より望む蛋白質を特異的
に切断する確率は増加する。特異的認識部位には少なく
とも２個のアミノ酸が必要な場合には、有利な切断手段
は酵素法である。使用されうるひとつの可能な化学的手
段は、ヒドロキシルアミンである。ヒドロキシルアミン
は、ＺがGly,LeuまたはAlaでありうる場合の−Asn−Ｚ
−結合を切断する。ＺがGlyの水解速度はＺがLeuまたは
Alaよりずつと速い。上記引用のKomigsberg,W.H.等の文
献をみよ。

特異的切断の選択に影響しうる別の要因は、同じアミノ
酸配列の場合の特定の切断手段の水解速度である。たと
へば、酵素Ａは、アミノ酸配列‐A-B-C-または‐A-B-D-
のＣまたはＤのカルボキシル側を認識しそして切断する
とする。しかし、前者の水解速度は、後者よりずつと大
きい。‐A-B-C-を特異的認識配列して選択し、そして、
‐A-B-D-が蛋白質に存在するとする。酵素Ａを用いる完
全水解で、“C"のカルボキシル側および“D"のカルボキ
シル側を切断しうる。しかし、A-B-C-の水解速度は‐A-
B-D-のそれよりずつと大であるので、最初の切断の大部
分は、A-B-C-におこるであろう。つまり、Ｃのカルボキ
シル側におこるであろう。それで望む部位での選択的切
断は、部分的水解により達成しうる。収率は減少すると
しても、この場合の酵素Ａの使用を可能とするに十分の
意味を有する。しかし、この事情は有利なわけではな
い。

適当な酵素の選択に際して、拡大された活性部位は、考
慮すべきもつとも重要な要因である。酵素は、少なくと
も２個のアミノ酸残基、そしてなるべくは２個より多く
のアミノ酸残基を認識せねばならぬ。このことは、上記
議論のように、望む蛋白質内での切断の確率を減少させ
る。たとへばアミノ酸配列‐X-Y-Z-を認識しそしてＺの
カルボキシル側を切断する酵素は、本発明に有用であろ
う。いくつかのアミノ酸の配列を認識するが、配列中に
置換された時の２つの異なるアミノ酸のカルボキシル側
を切断しうる酵素も、２つの側に対する水解速度が上記
論議のように異なれば、かなり有用であろう。特異的に
開裂しうるアミノ酸配列の内部において切断する酵素
は、また特異的アミノペプチダーゼと組合わせて用いる
時にも有用である。たとへば、アミノ酸配列‐A-B-C-D-
を認識し、Ｂのカルボキシル側で切断する酵素は、残り
の部分の望む蛋白質よりC-Dを特異的に切断するアミノ
ペプチダーゼとあわせて使用すれば有用であろう。この
酵素はまた、C-Dが望む蛋白質のN-末端である時に有用
であろう。

ある特異的配列を認識し特異的切断をおこす酵素ならい
ずれも本発明に使用しうるものである。この特異的認識
および切断は、正常の酵素的条件下でも特殊な限定され
た条件下でおこるものでもよい。たとへばアスペルギロ
ペプチダーゼＢは、37℃でかなり広い特異性を有する
が、０℃では非常にせまい特異性を示す。Spadari,S.
等、Biochim.Biophys.Acta359,267（1974）をみよ。本
発明に有用であることの期待される酵素の例をつぎに示
す。それらはエンテロキナーゼ、カリクレインＢまたは
キモシンである。エンテロキナーゼはｎ＝2-4として配
列X-（Asp）n-Lys-Yを認識し、Lysのカルボキシル側を
切断する。合成ペプチドを用いる研究で示されたよう
に、ｎが２から４に増加すると結合の割合は10から20倍
増加する。上記引用のMaroux,S.等の文献をみよ。Aspに
代えてGluまたはAspおよびGluの組合わせをそしてLysに
代えてArgをおき代えうることが分つた。Liepnieks,J.P
h.D.論文、Purdue University（1978）をみよ。カリク
レインＢは配列X-Phe-Arg-Yを認識し、Argのカルボキシ
ル側で切断する。上記引用のFiedler,F.の文献をみよ。
キモシンは、配列X-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-
Yを切断し、Phe-Met結合を切断する。Vesser,S.等の上
記引用の文献およびVesser,S.等、Biochim.Biophys.Act
a481,171（1977）をみよ。拡大された活性部位が十分に
研究された場合有用であるはづの２つの酵素として、ウ
ロキナーゼ（３、４、99、26）およびトロンビンがあ
る。ウロキナーゼは、プラスミノゲンの配列X-Arg-Val-
Y中のArg-Valのみを認識し切断することが知られてい
る。Robbins,K.C.等、J.Biol.Chem.242、2333（1967）
をみよ。トロンビンはArgのカルボキシル側を切断する
が、特定のアルギニル結合を切断するのみである。Ｚが
アミノ酸の任意の組合わせであるとして、配列X-Phe
（Ｚ）₆-Arg-Yは、トロンビンに対する基質のいくつか
のものに存在することが示された。Magnusson,S.のThe
Enzymes,Vol.IIIの277頁をみよ。

有用でありうる別の酵素は“シグナルペプチダーゼ”で
ある。Blobel,G.,の上記引用の文献およびJackson,R.C.
等Proc.Nat.Acad.Sci.USA74,5598（1977）をみよ。この
酵素は蛋白質からのシグナルペプチドを認識し切断す
る。融合蛋白質の望む蛋白質と宿主蛋白質とのあいだに
シグナルペプチドを加えると、宿主より融合蛋白質が分
泌されるあいだに特異的切断がおこり、望む蛋白質を与
える。

特異的配列を認識しそして特異的切断をおこす化学的ま
たは酵素的手段ならばいずれも本発明に使用しうる。ま
ず、特定の望む蛋白質に対する適当な切断手段を選択す
る。ついで、その適当な切断手段の指示する特異的アミ
ノ酸配列をコードするDNA配列を化学的に合成する。DNA
配列は、Itakura,K.等がJ.Biol.Chem.250,4592（1975）
およびJ.Am.Chem.Soc.97,7326（1975）に記載したホス
ホトリエステル方法または他の適当な合成法で合成す
る。たとへば、エンテロキナーゼを切断手段とする時に
は、たとへば、Asp-Asp-Asp-Asp-LysをコードするDNA配
列を合成する。そうすると、このDNA配列は、GAK₁GAK₂G
AK₃GAK₄AAJ₅となる。有利なDNA配列は、宿主細胞が優先
して使用するコドンを考慮して定める。たとへばE.coil
では、優先されるDNA配列は、GATGATGATGATAAAであろ
う。望む蛋白質に対するDNAコードは、従来法たとへばc
DNA技術を用いて分離する。たとへば、上記引用のUllri
ch.A.等およびSeeburg,P.H.の文献をみよ。化学的に合
成されたDNA配列は、ついで、DNAリカーゼ触媒ブラント
末端連結により、分離されたDNAに付着させる。Sgarame
lla,V.等、Proc.Nat.Acad.Sci.USA67,1468（1970）をみ
よ。この特異的切断リンカー‐遺伝子DNAはついで、制
限部位を含有する第２のデオキシニユクレオチド配列を
添加処理し、DNAリガーゼ‐触媒ブラント末端連結によ
り、この第２の配列を特異的切断リンカー‐遺伝子DNA
に付着させる。制限部位リンカーおよびそれらの使用に
ついては、上記引用の、Heyneker,H.L.およびScheller,
R.L.の文献に記載されている。このような制限部位リン
カーには、本発明により変型して、０、１または２の追
加のデオキシニユクレオチドを加える。これらのデオキ
シニユクレオチドは、３種類の読み枠を与える。別様に
は、制限リンカー、０、１または２個の追加のデオキシ
ニユクレオチドおよび特異的切断リンカーを含有するリ
ンカーを合成しうる。この複合リンカーを、分離された
コード配列に、１度だけブラント末端連結段階で付着さ
せる。または、制限リンカーおよび０、１または２デオ
キシニユクレオチドを含有するものと、特異的切断リン
カーとの２つのDNA配列を合成しうる。これら２つの配
列は、ブラント末端連結で結合し、ついでブラント末端
連結により、分離されたコード配列を付着させる。最終
生成物である、制限リンカー‐０、１または２デオキシ
ニユクレオチド‐特異的切断リンカー‐DNAコード配列
はついで、従来法により導入ベクターに挿入する。もち
ろんこの技術において、ブラント末端連結の段階では、
コード断片の両端にリンカー配列が付着する。しかし、
コード断片は、終止コドンを含有するかまたはそれを与
えられるので、終止コドンより翻訳する方向の下流に付
着されたコード配列は、翻訳されぬままとなる。ついで
この導入ベクターで微生物を転換し、適当な条件で遺伝
子を発現させる。これを実施する技術は、1979年９月12
日願Bell等の特許願シリースNo.75,192および1978年８
月11日願Rutter等の特許願シリースNo.933,035に詳しく
記載されているので、共に、本明細書では、引用文献と
して使用する。発現の結果の融合生成物は、なるべく
は、下記するようにして精製し選択された手段により切
断する。

精製を容易とすることに役立つアミノ酸配列をコードす
る精製断片コードをリンカーとして含め、追加された精
製部分が接続結合のN-末端側に存在し、特異的切断によ
り除かれるようになしうる。このようなリンカーは、別
々に連結させても他のリンカー断片とあわせて、ひとつ
の複合リンカーに含めて連結させてもよい。

精製を容易にするアミノ酸配列の種類としては、ポリ陰
イオン性断片（Asp／Glu）_5-20およびポリ陽イオン性断
片（Lys／Arg）_5-20があり、これらは容易にイオン交換
体に結合する。ポリ陰イオン性断片は、C-末端リジンま
たはアルギニン残基が存在するならばエンテロキナーゼ
に対する拡大された部位配列ともなりうる。疎水性断片
としては（leu／ileu／val／Phe）_10-20がありうる。よ
り特異的には、アフイニテイクロマトグラフイーを用い
て、１回だけの段階の精製を行ないうる。原則として
は、アフイニテイー吸着剤は、発現された蛋白質のいず
れの部分とも結合しうる。なるべくは、望む蛋白質より
除かれることになつている部分へ特異的に結合するよう
にする。ある融合蛋白質では、特異的親和性を付与する
ものが、原核部分の免疫化学結合でありうる。別様に
は、精製断片により特異性を与えうる。たとへばブラデ
イキニンをコードするリンカー断片を加えて、融合蛋白
質の１部としてブラデイキニン配列を与える。ブラデイ
キニンに対する特異的免疫吸着剤（ブラデイキニン抗体
含有）は、この融合蛋白質に特異的に結合する。ついで
望む蛋白質を特異的に切断により吸着された複合物より
除去する。望まぬ部分は吸着されたままで、容易に分離
される。他の例もこの方面の技術の専門家には明らかで
あろう。高度に疎水性の精製断片を用いると、疎水性固
体相（逆相）担体への吸着、選択的沈殿および非水性媒
体への溶解度の差により、迅速で特異的分離を可能とす
る。

特殊な精製リンカーの場合として、発現生成物にシグナ
ルペプチド配列を加えることがある。既知シグナルペプ
チドのアミノ酸配列は、それに対するリンカーコードの
合成を可能とするほどに十分に短かい。シグナルペプチ
ドは、N-末端ペプチドとして機能するので、あとから記
載するように、非融合蛋白質として望む蛋白質を直接発
現さす時に組合わせて用いうるであろう。さらにシグナ
ルペプチドは、宿主細胞中に本来存在するシグナルペプ
チダーゼにより望む蛋白質より除かれるのがふつうなの
で、特異的切断リンカーの使用はいらない。それでシグ
ナルペプチドリンカーを使用すると、宿主に内在する機
能により、望む蛋白質が分泌されそしてシグナルペプチ
ドが除去されることになる。

本発明に従うリンカーの使用は、非融合蛋白質としてコ
ード断片を発現する手段を提供する。このような直接発
現に必要なリンカーは、プロモーター配列、リボゾーム
結合部位配列および約３から11個のニユクレオチドスペ
ーサーを含有する、発現調節断片である。リボゾーム結
合部位配列より3-11個ニユクレオチドの距離内に開始コ
ドン（ATG）を提供するコード断片ならばいずれも、正
しい読み枠において発現されるであろう。リンカーのリ
ボゾーム結合部位より3-11ニユクレオチドの距離内にAT
G配列が位置しているならば、ATGを有するコード断片を
５′末端として設ける必要はない。原核性リボゾーム結
合部位の例は、それのプラス鎖中につぎのような配列を
有するものである。Ｌ（ｎ）TAGGAGGAGCC（ただしＬ
は、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧとし、ｎは０、１または２であ
りうるとする）。なほDNA配列はプラス鎖で表わすとす
るが、すべてのそのようなリンカー断片は、さらに、相
補的塩基配列で反対の極声を有するマイナス鎖を有する
ことはもちろんである。上記の配列はつぎのような要素
を含有する。つまりShineおよびDalgarnoがProc.Nat.Ac
ad.Sci.USA,71 1342（1974）およびSteitzおよびJake
s,Proc.Nat.Acad.Sci.USA72 4734（1975）に記載され
ているように、16SリボゾームRNAの３′‐末端と実質的
に相同なリボゾーム結合部位配列である。これまでに研
究されたリボゾーム結合部位は、16SリボゾームRNA配列
との相同性の程度については、ばらつきがある。これま
でに見出だされた相補性塩基の最大数は７である。上記
の配列は６個を含有する。上記の配列はまたストツプコ
ドン（TAG）を含有する。これは、別の場所で開始され
た情報が読み続けられ翻訳されるのを防止するためであ
る。ストツプコドンが終止される情報と同じ相にあるた
めには、配列に０、１または２個の追加のニユクレオチ
ドを与えねばならぬ。終止コドンの含有が必要でない場
合もありうる。３種類のすべての相において終止を与え
る普遍的終止コドンは、配列TAGLTAGLTAGにより提供さ
れる。上記のリボゾーム結合部位断片はさらにBam HIリ
ンカー配列GGATCCを含有する。このリンカーはリボゾー
ム結合部位断片に追加の配列材料を付着さすため、リン
カーの導入されたDNA配列を同定するため、そして場合
によりリボゾーム結合部位リンカーを挿入するために有
用である。

リボゾーム結合部位断片をコード断片に連結するのに、
３か11個の塩基対のスペーサー配列が望ましい。これは
もつとも便宜的には、市販品として入手しうる制限部位
リンカーのひとつのブラント末端連結によりなしうる。
上記のSceller等の文献をみよ。これらのリンカーは、
希望に応じて適当な制限エンドニユクレアーゼで処理
し、生じた不対末端を充填するかまたは切り取るかして
望むスペーサー配列となしうる。たとへばEco RIリンカ
ーGGAATTCCをエンドニユクレアーゼEco RIで処理し、つ
いでDNAポリメラーゼで処理してAATTCCの配列を与えう
る。Bam HIリンカー配列を有するリボゾーム結合部位を
Bam HIエンドニユクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで
同様に処理してＬ（ｎ）TAGGAGGATCとなしうる。ブラン
ト末端連結で配列Ｌ（ｎ）TAGGAGGATCAATTCCが得られ
る。末端ATG開始コドンを有するコード断片を付着さす
ならば、開始コドンは、リボゾーム結合部位より８塩基
対となる。

リボゾーム結合部位リンカーの機能は、導入ベクター中
に選択された挿入部位により変動する。挿入により正常
には翻訳される情報が中断されるならば、リボゾーム結
合部位リンカーは、転写のための再開始点となりうるで
あろう。しかし、正常の転写の方向にあり、すでに存在
しており、既知であるプロモーターに隣接する部位に挿
入することにより翻訳の効率が改善されうる。たとへば
トリプトフアンオペロンのプロモーターに隣接する部位
に挿入すると、トリプトフアンプロモーターの調節下
に、トリプトフアンオペロンにより正常には発現される
蛋白質に代えて、挿入された断片直接に翻訳される。導
入ベクターのサイレント領域コード断片を挿入したいな
らば、転写の適切な開始を確実にするために、プロモー
ター配列を与える必要があろう。

原核転写のイニシエーターとして機能しうる配列は知ら
れている。たとへば、Pribnow,D.,Proc.Nat.Acad.Sci.U
SA72 784（1975）をみよ。たとへば、配列TATJATJ（た
だし、ＪはＡまたはＧとする）は、プロモーターとして
機能するようである。真核細胞で、配列TATAAA、または
類似の配列TATAAT、TATAAGは、転写開始の前方の領域に
見出だされプロモーター領域の１部であるようである。
Gaunon,F.等、Nature,278,428-34（1979）をみよ。しか
し、上記配列以外の他のニユクレオチド配列も、さしあ
たり予知しえぬ方式でプロモーター機能の効率を変型す
ることがありうる。それで合成プロモーターおよび合成
リボゾーム結合部位断片の両方を含有する発現調節断片
リンカーをうることが現在可能であるが、別にクロン化
するかまたは隣りに挿入するような方法で、天然に存在
するプロモーターを利用するのが有利である。

真核細胞における発現に適当なリボゾーム結合部位リン
カーは、真核細胞に見出だされる18SリボゾームRNAの末
端配列と相同の断片により提供される。Hagenbuchle
等、Cell13,551（1978）をみよ。配列GGATCCTTCCは、市
販品として入手しうるBam HIリンカーの３′‐末端に配
列TTCCを連結することで簡単に合成しうる。生ずる配列
GGATCCTTCCは、18SリボゾームRNA配列に相補的な８個の
塩基を有し、それゆえに、翻訳のためのすぐれた開始部
位となる。前記したのと類似の技術を、必要なスペーサ
ーニユクレオチドをうるのに用いる。さらに上記した真
核リボゾーム結合部位配列を、ブラント末端連結により
相互に連結し、２個のリボゾーム結合部位を提供しう
る。つまりひとつは、開始コドンに隣接し、他は10塩基
対離れて存在することになる。同様に、前記の原核リボ
ゾーム結合部位リンカースペーサーとして用いうる。翻
訳が読み通されてしまうのを防止したいならば、後者は
さらに終止コドンも追加して提供する。

つぎに具体的な実施例により、本発明をより完全に理解
しうるであろう。これらの例では、単に説明のために、
エンテロキナーゼおよびヒトのプロインシユリンを用い
る。これらの例は本発明を限定するものでなく、本発明
は特許請求の範囲によつてのみ限定されるものとする。
E.coliのような原核宿主を便宜上例として用いている。
本発明のリンカーは、本発明の原則に従いそして専門家
の知つているふつうの技術を応用して、真核宿主による
発現にも応用しうる。

例１この例では、クロン化されたヒトプロインシユリン遺伝
子の調製、特異的切断リンカーの合成およびこれらの連
結について説明する。

ヒトプロインシユリンをコードする、分離されそして精
製された（以降クロン化されたと称する）DNA配列は、
特許願シリースNo.75,192により調製する。

エンテロキナーゼを特異的切断手段として選択する。エ
ンテロキナーゼの特異的に開裂しうるアミノ酸配列は、
NH₂-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-COOHである。このアミノ酸配
列をコードするプラス鎖のDNA配列は５′‐GATGATGATGA
TAAA-3′である。（プラス鎖はmRNA配列に対応するニユ
クレオチド鎖を有する鎖として定義する。マイナス鎖の
配列は、mRNA配列に相補的である）。このDNA配列は特
異的リンカー配列で、上記引用のItakura,K.,等の方法
によりホスホトリエステル法で合成しうる。

ついで、この配列を市販品として入手しうるHind IIIリ
ンカーにブラント末端連結する。これをHind IIIエンド
ニユクレアーゼで切断すると、Hind III部位に挿入する
に適当な特異的切断リンカーを与える。生成リンカーの
両方の鎖のニユクレオチド配列は AGCTTGGATGATGATGATAAA ACCTACTACTACTATTT となる。慣習により、上方の鎖がプラス鎖で、左方へ
５′‐末端が右方へ３′‐末端が来るように示してあ
る。下側の鎖は反対の極性を有する。他の２つの読み枠
のうちいずれかにおける発現は、３′末端のＧのうちの
ひとつを除くか、余分の３′末端Ｇを加えることで提供
される。生ずる複合リンカーの配列は、ニユクレオチド
が１個少ないかまたは１個多いかで、特異的切断部位配
列および正しい読み枠でそれを付着させたコード断片の
発現に用いられる。

特異的切断リンカーは、クロン化されたヒトプロインシ
ユリン遺伝子にブラント末端連結し、５′‐HindIIIリ
ンカー特異的切断リンカー‐ヒトプロインシユリン遺伝
子‐３′を含有するプラス鎖のデオキシニユクレオチド
配列を与える。

例２この例では、適当な発現プラスミドへの例１よりのデオ
キシニユクレオチド配列のクロン化そしてそのコード配
列の発現を記載する。

特異的切断リンカー‐ヒトプロインシユリン遺伝子を発
現導入ベクターに挿入する。挿入部位において、翻訳の
開始に関して挿入が正しい配向でおこるならば、そして
挿入物が、プロモーターおよびリボゾーム結合部位に対
して読み枠の相にあるならば、導入ベクターで転換され
た宿主細胞の活発な代謝により、クロン化されたコード
断片の蛋白質生成物が合成される。

クロン化されたDNAコード断片が、ペプチドまたは小型
蛋白質をコードする時には、発現導入ベクターが、プロ
モーターと挿入部分とのあいだに原核遺伝子の１部を含
有するのが有利である。この場合の蛋白質生成物は、融
合蛋白質である。融合蛋白質は、挿入された遺伝子によ
りコードされたよそもの蛋白質の宿主の細胞内媒体中で
の安定化に役立つ。宿主細胞より融合蛋白質の分泌もま
た、ある種の宿主蛋白質たとへばβ‐ラクタマーゼとの
融合で達成しうる。

発現プラスミドは、lacプロモーターで発現が調節され
るもの（Itakura,K.等、Science198,1056（1977）、Ull
rich,A.等、Excerpta Medica,（1979））およびβ‐ラ
クタマーゼプロモーター（本明細書で参考文献として用
いている、1979年６月１日願、Baxter等、シリースNo.4
4,647特許願）で調節されるものが開発されている。

発現プラスミドを構成する有利な方法は、β‐ラクタマ
ーゼ遺伝子中に見出だされる制限部位および適当な読み
枠を提供するためのｎ＝０、１または２のｎデオキシニ
ユクレオチドを含有するDNA配列を化学的に合成するこ
とである。この配列はついで、例１で調製した変型ヒト
プロインシユリン遺伝子にブラント末端連結する。この
新しいDNA配列および導入ベクターは同じ制限酵素で処
理する。上記引用のHeyneker,H.L.等およびSheller,R.
H.等の上記引用の文献をみよ。この新しいDNA配列を、
導入ベクターに挿入し、宿主微生物を転換する。本発明
に準ずるプラス鎖の一般的挿入DNA配列は、つぎのよう
である。５′‐制御リンカーbncm特異的切断リンカー‐
クロン化遺伝子‐３′（ただしｂおよびｃは任意のデオ
キシニユクレオチド塩基でありうるとし、ｎおよびｍ
は、ｎ＋ｍ＝０、１または２となるような整数とする）発現は、抗インシユリン抗体または抗プロインシユリン
抗体と免疫学的に結合しうる生成物の測定することによ
り検出する。発現を示す融合蛋白質は、挿入した場合お
よびしない場合の、発現プラスミドで転換された宿主細
胞中の融合蛋白質のN-末端部に寄与している宿主蛋白質
の分子量を比較することで検出しうる。

式X-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Y（ただし式中、Ｘはβ‐ラ
クタマーゼ蛋白質の１部で、Ｙはヒトプロインシュリン
蛋白質の１部である）を有する、この具体例での融合蛋
白質は、従来法により精製しうる。この融合蛋白質は、
上記引用のLiepnieks記載の方法でエンテロキナーゼを
用いて切断する。正しい切断がなされたかどうかは、ゲ
ル電気泳動で決定する。ヒトプロインシユリンが標準と
なる。切断生成物より２つのバンドが得られ、ひとつは
ヒトプロインシユリン標準と同様に移動する、ヒトプロ
インシユリンは従来法で精製する。

例３特異的精製リンカーは、配列５′‐GATGATGATGATAAA-3′を有する例１記載のリンカ
ーを変型して提供する。この配列は３′‐末端に、Ｇの
代わりに、ＣまたはなるべくＴ残基を与えることにより
改変する。この変型は、ATPおよびCTPの存在でT₄DNAポ
リメラーゼを用いて３′‐末端Ｇを除き、ついでS₁ニユ
クレアーゼを用いて、相補鎖上の５′‐末端Ｃを除くこ
とにより達成しうる。ＣまたはなるべくはＴは、酵素的
または化学的手段により３′‐末端に添加しうる。生ず
る配列は、アミノ酸AspAspAspAspAsnをコードする。こ
の変型ニユクレオチド配列は、ブラント末端連結での末
変型の同族ニユクレオチドに結合し、５′‐GATGATGATG
ATAATGATGATGATGATAAA-3′とする。

上記の配列の例１のHindIIIリンカーに結合させ、さら
に例１のコード断片に結合する。

例２記載のような融合蛋白質として発現させる時に、リ
ンカーにより、融合蛋白質は、かなりの長さのポリ陰イ
オン性部分を含有する。この融合蛋白質は、従つて、実
質的にすべての細胞融解物中の蛋白質が溶出されるよう
なイオン強度でも、ジエチルアミノエチルセルローズの
ような陰イオン交換材料に強く結合する。

融合蛋白質は、ついでイオン交換体から溶出するかまた
はその場でエンテロキナーゼで処理する。後者の場合、
接続結合に優先的な切断がおこり、望む蛋白質がイオン
交換体より放出される。ポリアニオン部分を有する原核
部分は、イオン交換体に結合したままである。エンテロ
キナーゼ処理より前にイオン交換体より融合蛋白質を溶
出する時には、エンテロキナーゼとインキユベーシヨン
すると、接続結合が優先的に切断されるので、原核部分
をイオン交換体に優先的に結合させて除去する。上記の
操作で、望む蛋白質は、実質的に定量的に精製される。

例４この例では、ヒトプロインシユリンをコードするような
コード配列の発現が、リボゾーム結合部位リンカーの使
用で容易となる。上記引用のItakura等の方法で、ニユ
クレオチド配列AGGAを化学的に合成する。合成配列は、
New England BioLads,Cambridge,Massachusettesより市
販されているBam HIリンカーGGATCCに、化学的にかまた
はブラント末端連結で結合する。生ずる断片AGGAGGATCC
はBam HIエンドニユクレアーゼで処理し、ついでDNAポ
リメラーゼＩで一重鎖の突き出している末端を充填する
ように処理して、AGGAGGATCとする。同様にコード断片
をまずBam HIリンカーを加えついでリンカーをBam HIエ
ンドニユクレアーゼおよびDNAポリメラーゼＩで変型処
理する。変型断片は、ついでブラント末端連結で相互に
結合し、AGGAGGATCGATCC-コード断片配列とする。それ
でコード断片の出発点は、リボゾーム結合部位より８個
の塩基だけ隔つている。

リボゾーム結合部位‐スペーサー‐コード断片（ヒトプ
ロインシユリン）の配列は、望む挿入部位に応じて、適
当な制限リンカーを付着させてさらに変型する。たとへ
ばEco RIリンカーを、β‐ガラクトシダーゼをコードす
る遺伝子中に挿入する。しかし従来の結果と対照的に、
発現の結果として融合蛋白質は生じない。この理由は、
リボゾーム結合部位リンカーが翻訳を再開始するように
作用し、ヒトプロインシユリンをコードする断片が、そ
れ自体として発現されるからである。

例５例４のリボゾーム結合部位リンカー、例３の特異的精製
断片および例１の特異的切断断片をブラント末端連結に
より結合し、配列AGGAGGATCGATCCATGGATGATGATGATAATGA
TGATGATGATAAAの配列の複合リンカーとする。機能的に
記載すると、この複合リンカーはリボゾーム結合部位‐
スペーサースタートコドン‐精製部分‐特異的切断部位
‐コード断片の配列となる。この複合物はEco RIリンカ
ーを付着させて、上記引用のPolisky,B.,等の文献に記
載の、pBGP120のようなプラスミドのR₁部位への挿入を
容易にする。生ずる導入ベクターで転換すると、ポリ陰
イオン性N-末端部分を有するヒトプロインシユリンが発
現される。発現生成物はついで例３記載のように精製
し、ついでエンテロキナーゼで特異的に切断する。この
ような技術の組合わせで、高度に精製されたヒトプロイ
ンシユリンが得られる。この組合わせ技術の主な利点と
して、適当なリンカーがひとたびコード断片に付着して
しまえば、コード断片の発現および発現生成物の特異性
精製は、比較的簡単な操作で達成でき、これは大きい規
模でも困難なく実施しうる。

さらに別の方法として、制限部位リンカーを添加するよ
り前に、上記複合リンカーに、プロモーターとして機能
しうる配列、たとえばTATGATGを添加してさらに変型し
うる。上記したようなリンカー断片と組合わせてそのよ
うなプロモーター配列を用いると、正常ではサイレント
である部位を含めて、導入ベクター上のきわめて多様な
導入部位上での発現をうることができる。

本発明を具体例を用いて記載して来たが、さらに変型す
ることも可能であり、この出願は、本発明の原則に一般
的に従い、本発明が関係する技術内の既知のまたはふつ
うに用いられている方法の範囲内に入り、前記したよう
な不可欠な特徴に適用され、特許請求の範囲内に入る変
法、用途または適用も、本発明の範囲内に含めるものと
する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えDNAであって、天然状態では隣接し
ていない三つの断片からなり、第一の断片は真核タンパ
ク質をコードし、かつ少なくとも二つのアミノ酸の特異
的に開裂しうるアミノ酸配列をコードする第二の断片に
隣接し、この第二の断片は第三の断片に隣接しており、
前記DNAの発現生成物は真核タンパク質と特異的に開裂
しうるアミノ酸配列とを連結するペプチド結合を少なく
とも一つの酵素試薬または化学試薬で特異的に切断さ
れ、そして第三の断片は宿主ペプチドをコードし、この
ペプチドはポリカチオンペプチド、ポリアニオンペプチ
ドおよび疎水性ペプチドからなる群から選択され、そし
てこの第三の断片によりコードされるペプチドは天然に
は前記真核タンパク質とは関連のないものである、組換
えDNA。
【請求項２】酵素試薬がエンテロキナーゼ、カリクレイ
ンＢおよびキモシンからなる群から選択される特許請求
の範囲第１項の組換えDNA。
【請求項３】組換えDNAであって、天然状態では隣接し
ていない三つの断片からなり、第一の断片は真核タンパ
ク質をコードし、かつ少なくとも二つのアミノ酸の特異
的に開裂しうるアミノ酸配列をコードする第二の断片に
隣接し、この第二の断片は第三の断片に隣接しており、
前記DNAの発現生成物は真核タンパク質と特異的に開裂
しうるアミノ酸配列とを連結するペプチド結合を少なく
とも一つの酵素試薬または化学試薬で特異的に切断さ
れ、そして第三の断片は宿主ペプチドをコードし、この
ペプチドはポリカチオンペプチド、ポリアニオンペプチ
ドおよび疎水性ペプチドからなる群から選択され、そし
てこの第三の断片によりコードされるペプチドは天然に
は前記真核タンパク質とは関連のないものである、組換
えDNAの発現を適当な宿主細胞中で行うことができる組
換えDNA断片。