JPH0724582B2 - トリプトファン・プロモーター―オペレーターを用いる細菌によるポリペプチドの発現用ベクター - Google Patents

トリプトファン・プロモーター―オペレーターを用いる細菌によるポリペプチドの発現用ベクター

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JPH0724582B2
JPH0724582B2 JP56040529A JP4052981A JPH0724582B2 JP H0724582 B2 JPH0724582 B2 JP H0724582B2 JP 56040529 A JP56040529 A JP 56040529A JP 4052981 A JP4052981 A JP 4052981A JP H0724582 B2 JPH0724582 B2 JP H0724582B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 組換えDNA技術の出現により、無数の種類の有用なポリ
ペプチドの細菌による制御生産が可能になってきた。す
でにこの技術によって修飾された細菌にソマトスタチン
（K.Itakura,et.al.,Science198,1056〔1977〕）、ヒト
インシュリンの（成分）Ａ鎖とＢ鎖（D.V.Goeddel,et a
l.,Proc.Natl.Acad.cci.USA76,106〔1979〕）、ヒト成
長ホルモン（D.V.Goeddel et al.,Nature281,544〔197
9〕）のようなポリペプチド生産物を生産させることが
進行している。ごく最近、組換えDNAの技術は胸腺によ
って生産される免疫賦活剤であるサイモシンα１の細菌
による生産の場合にも用いられている。
そのように事実上いかなる有用なポリペプチドも細菌に
よって生産することができるという技術の力は、ホルモ
ン、酵素、抗体及び広い範囲の病気に対するワクチンの
制御生産にまで達している。上に引用した代表例をさら
に詳細に記述している引用文献は、本発明の背景を説明
するために、他のこれ以後に引用する出版物と同様、参
考文献として本明細書中に編入する。
組換えDNAの技術の働き手はプラスミドで、これは細菌
に見つかっている、染色体とは異なる２本鎖DNAの輪で
あり、しばしば細菌の細胞当りに多くのコピーが存在し
ている。プラスミドDNAに暗号化されている情報に含ま
れているものには、娘細胞に於いてこのプラスミドを再
生するのに必要なもの、すなわち「レプリコン」、およ
び通常はたとえば抗生物質耐性のような１つ又はそれ以
上の選択特性があり、これは関心のあるプラスミドを含
む宿主細胞のクローンを認識し、優先的に選択培地で生
育させることを可能にする。細菌プラスミドの有用性
は、プラスミドのDNAの異った部位をそれぞれに認識す
る１つ又はいくつかの制限エンドヌクレアーゼ即ち「制
限酵素」によってプラスミドを特異的に切断することが
できるという事実に存在する。それによって、異種遺伝
子または遺伝子断片は、切断個所又は切断個所に隣接す
る再構成された末端に末端結合させることによってプラ
スミドに挿入することができる。本発明書で用いる「異
種」という用語は、通常大腸菌に見られない遺伝子、又
は大腸菌によって通常生産されないポリペプチド配列を
示し、他方「同種」という用語は大腸菌野生株で生産さ
れる遺伝子又はポリペプチドをさす。DNAの組換えは細
菌の細胞外で行なわれるが、しかし結果として生ずる
「組換え」プラスミドは細菌細胞内へ形質転換として知
られる方法で移入することが可能であり、多量の、異種
遺伝子を含んでいる組換えプラスミドが形質転換株を増
殖させることによって得られる。さらに遺伝子が、暗号
化されたDNAメッセージの転写と翻訳を支配するプラス
ミド上の適切な位置に挿入されれば、できあがった発現
媒体は、発現として知られる過程で、移入された遺伝子
が暗号化しているポリペプチド配列を実際生産させるの
に使用することができる。
発現は、RNAポリメラーゼが認識しそして結合する、プ
ロモーターとして知られる領域で開始される。ある場合
には、下記に論議するトリプトファンオペロン（tpr op
eron）のようにプロモーター領域が「オペレーター（op
erator）」領域と重複していてプロモーター−オペレー
ター結合型を形成している。オペレーターは、ある特定
のプロモーターにおける転写開始の頻度を調節するのに
役立つ、いわゆるリプレッサー（抑制）タンパク質によ
って認識されるDNA配列である。ポリメラーゼはDNAに沿
って移動し、その暗号鎖に含まれている情報を５′から
３′未満へとメッセンジャーRNAに転写し、今度はこのm
RNAが、このDNAがコードしているアミノ酸配列を持った
ポリペプチドに翻訳される。
本明細書に於いて「構造遺伝子」と呼ぶものに含まれる
独自のヌクレオチド３重連又は「コドン」によって各々
のアミノ酸は暗号化されている。即ちこの「構造遺伝
子」は発現される生産物のアミノ酸配列を暗号化してい
る部分である。プロモーターに結合後、RNAポリメラー
ゼは最初にリボソーム結合個所を暗号化しているヌクレ
オチドを転写し、次に翻訳開始又は「スタート」信号
（通常はATG、これはできあがったメッセンジャーRNAで
はAUGになる）及び構造遺伝子それ自身の中のヌクレオ
チド・コドンを転写する。いわゆる終止コドンは、構造
遺伝子の末端で転写され、それ以後もポリメラーゼは追
加の配列を生成することがあるが、これは、終止シグナ
ルの存在のためにリボソームによって翻訳されない。リ
ボソームは、細菌では普通メッセンジャーRNA生成が行
なわれているときに、メッセンジャーRNA上に用意され
た結合個所に結合し、それ自身によって翻訳を翻訳開始
信号から始め、そして前述の終止信号で終り、暗号化さ
れていたポリペプチドを生産する。もしリボソーム結合
個所を暗号化している配列がAUGの開始コドンに関して
適切な位置にあれば、そして残りの全てのコドンが開始
コドンに（解読）相が一致して続いていれば、希望する
生産物が生産される。できあがった生産物は、宿主細胞
を溶菌することにより、そしてバクテリアの他の蛋白質
からの適切な精製によって生産物を回収することにより
得られる。
組換えDNAの技術の利用によって発現されたポリペプチ
ドは、ヒト成長ホルモンの直接発現の場合のように全く
異種であるか、それでなければ、ソマトスタチンの中間
体やヒトインシュリンの成分の生産の場合のように、異
種ポリペプチドと同種ペプチドのアミノ酸配列の少なく
とも一部分とを配合させたものから成る。例えば、後者
の場合は、融合した同種ポリペプチドはβ−ガラクトシ
ダーゼのアミノ酸配列の一部分から成る。それらの場
合、目的とする生物活性のある生産物は、融合した同種
ポリペプチドによって、それを細胞外の環境で切り離さ
ない限り不活性化されている。今述べたような融合蛋白
質は、メチオニン部位でのシアン化臭素との反応、ある
いは酵素的切断の様に、所望の生産物から前駆体蛋白質
を極めて特異的に切断し得る様に設計することができ
る。例えば英国特許公告第2,007,676A号参照。
組換えDNA技術がその約束を充分に支持するためには、
システムは、目的のポリペプチド生産物が多量に入手で
きうるために、移入された遺伝子の発現が最適となるよ
うなシステムを工夫しなければならない。β−ラクタマ
ーゼ及びラクトースのプロモーター−オペレーター系は
過去において最もよく使用されたが、有用とはいえ収率
の観点からはこの組換え技術の能力を充分に利用しては
いない。従って、目的とするポリペプチド生産物を高い
収量で制御発現できる細菌の発現ベクターが要望されて
いた。
トリプトファンは同種ポリペプチドの構成成分として使
用されるために、以下の生合成経路によって細菌で生産
されるアミド酸である；コリスミン酸→アントラニル酸
→ホスホリボシルアントラニル酸→CDRP〔エノール−１
−（Ｏ−カルボキシフェニルアミノ）−１−デスオキシ
−Ｄ−リブロース−５−ホスフェート〕→インドール−
３−グリセロールリン酸→そして最後にトリプトファン
それ自体。
この経路の酵素反応はトリプトファン・オペロン、即ち
“trp"オペロン−これはtrpプロモーター−オペレータ
ー系の支配下で転写される多シストロン性DNA断片であ
る−の生産物によって触媒される。できあがった多シス
トロン性メッセンジャ−RNAはいわゆるtrpのリーダー配
列、それから順にtrpE、trpD、trpC、trpBそしてtrpAと
名づけられたポリペプチドを暗号化している。これらの
ポリペプチドはコリスミン酸からトリプトファンへの経
路の個々のステップをそれぞれに触媒し、調節してい
る。
大腸菌野性株ではトリプトファン・オペロンは少なくと
も３つの別個の調節型式の支配下にある。プロモーター
−オペレーター抑制の場合は、トリプトファンが抑制補
体（コリプレッサー）として働き、主抑制体（アポリプ
レッサー）に結合して活性ある抑制因子複合体（リプレ
ッサー）を形成し、次にこれがオペレーターに結合して
この系を全体的に閉じる。２番目はフィードバック阻害
の作用によってトリプトファンはtrpE及びtrpDポリペプ
チド複合体に結合し、その結果、その複合体が合成経路
に参加するのを阻害する。最後はtrpのリーダー配列内
に存在する遺伝子のアテニュエーター領域の支配下で
の、アテニュエーションとして知られる作用によるコン
トロールである。概説はG.F.Miozzari et al.,J.Bacter
iology 133,1457（1978）;The Operon263−302,Cold Sp
ring Harbor Laboratory（1978）,Miller及びReznikof
f,eds.;F.Lee et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,4365
（1977）並びにK.Bertrand et al.,J.Mol.Biol.103,319
（1976）参照。
アテニュエーションの程度は細胞内のトリプトファンの
濃度によって支配されていると見られ、そして大腸菌の
野性株では、アテニュエーターはだいたい十中八、九ま
で、以下の機構で発現を停止させる。それは恐らくRNA
ポリメラーゼを、結合しているDNAから未成熟のうちに
遊離してしまう二次構造、即ち「終止ループ（terminat
ion loop）」がメッセンジャーRNA内に形成されること
による。
他の研究者は異種ポリペプチドの発現のある種の手段と
してtrpオペロンを使ったことがある。この研究は、イ
ンドールアクリル酸の添加により抑制とアテニュエーシ
ョンの問題を解決しようと試みたものと考えられる。イ
ンドールアクリル酸は誘導因子であり、トリプトファン
のアナログで、trp抑制因子に対し（トリプトファン
と）競合し競合阻害によって脱抑制の方向へ向けるもの
である。同時に、この誘導因子はインドールからトリプ
トファンへの酵素的転換を阻害し、そのために細胞を効
果的にトリプトファン欠乏させることによってアテニュ
エーションを減少させる。結果として、より多くのポリ
メラーゼがアテニュエーターを首尾よく読みぬける。
しかしながら、トリプトファンの欠乏のために、トリプ
トファンを含む蛋白質の配列の合成が中途で停止してし
まうために、このアプローチは一貫した翻訳の完成と高
収率の観点から問題があることが分った。実際にこのア
プローチによるアテニュエーションの効果的な軽減は厳
しいトリプトファン飢餓に完全に依存している。
本発明は、トリプトファンの抑制及びアテニュエーショ
ンに伴った問題を異った方法で処置し、そして（１）tr
pプロモーター−オペレーターによる異種遺伝子の直接
発現のためにデザインされた発現媒体（ベクター）を得
るための方法；（２）トリプトファンのオペレーター−
プロモーターから、異種−同種遺伝子融合体によって暗
号化されている特異的に切断されうるポリペプチドの発
現のためにデザインされたベクターを得るための方法；
（３）異種のポリペプチドを効率的にそして高収率に制
御可能な方法で発現できる方法、並びにそれらに関与す
る手段を提供するものである。
本発明の概要 本発明は、細菌による異種ポリペプチド産物の生産のた
めの新規なプラスミド発現媒体を提供するものであり、
この媒体は、暗号鎖の最初の５′末端から第二の３′末
端までの相においてtrpプロモーター−オペレーター、t
rpリーダー内のリボソーム結合部位及び異種ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を暗号化している構造遺伝子の発現の
ための翻訳開始を暗号化しているヌクレオチドから成る
２本鎖DNA配列を持っている。ここで言うDNA配列はtrp
アティニュエーター領域もtrpEリボソーム結合部位を暗
号化しているヌクレオチドも含んでいない。その代わり
に、trpリーダー内のリボソーム結合部位が、挿入され
た遺伝子に暗号化されている情報の発現を達成するため
に効果的に使用される。
trpプロモーター−オペレーターを含むが、アティニュ
エーターを欠く本発明のプラスミドを加えることにより
細胞を形質転換し、添加トリプトファンの存在下で増殖
させる。トリプトファンに富む培地を使用することによ
り、trp/リプレッサーの相互作用によってtrpプロモー
ター−オペレーターを実質的に完全に抑制するのに充分
なトリプトファンを供給することになり、その結果、そ
うでなければtrpプロモーター−オペレーター系の制御
下にある挿入遺伝子によって暗号化されている多量の異
種ポリペプチドが中途半端に発現されることによる阻害
をうけることなしに、細胞増殖が進行する。組換え体の
培養がだいたいポリペプチドの工業生産のレベルまで増
殖した時、外から供給したトリプトファンを除き、細胞
をそれ自体で生産するトリプトファンのみに頼らせるよ
うにする。この結果は軽いトリプトファン制限になり、
従って経路は脱抑制され、異種挿入物の発現が、アティ
ニュエーター領域がこの系から欠失しているのでアティ
ニュエーションによって妨げられず、高い頻度で生じ
る。この方法では細胞は決してトリプトファンが著しく
欠乏した状態にはならず、全ての蛋白質は、それがトリ
プトファンを含むと否とにかかわらず、多量に生合成さ
れうる。
本発明はさらに制限酵素部位がなくても任意の所望の個
所で２本鎖DNAを切断する方法を提供するものであり、
この技術はとりわけ、従来の変異株選択によって取得さ
れるもの以外の、アティニュエーター欠失trpオペロン
を創作する点で、特に役に立つものである。
最後に、本発明は発現条件下で、分解に対して安定化さ
れている、特異的に切断できる異種−同種融合蛋白質を
含む多様な有用中間体と最終産物を提供するものであ
る。
どのようにすれば本発明の目的が達成され、その利点が
得られるかは、以下の記載及び添付図面からより明確に
なるであろう。
図において図解を明確にするために、ほとんどの場合、
二本鎖であるプラスミド及び線状DNAは、その暗号鎖の
みを描いている。抗生物質耐性を暗号化している遺伝子
はapR（アンピシリン）とtcR（テトラサイクリン）で示
す。図面の説明において、tcSはプロモーター−オペレ
ーター系の制御下にないテトラサイクリン耐性遺伝子を
意味し、従ってこの遺伝子を含むプラスミドは、この遺
伝子があるにもかかわらずテトラサイクリン感受性にな
る。図の説明で“apS"はアンピシリン耐性を暗号化して
いる遺伝子が一部欠失した結果アンピシリン感受性とな
ったことを意味する。プラスミドのプロモーター及びオ
ペレーターは“P"と“O"で表される。Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ
の文字は各々アデニン、チミン、グアニンとシトシンを
含むヌクレオチドを意味する。他の図の凡例は本明細書
から明らかである。他に述べる発明の好適具体例は、以
下に示す対応するいくつかの認識配列と切断形式（矢印
によって示される）を持つ一般に入手可能な制限エンド
ヌクレアーゼを利用したものである。
切断点が各々の鎖で食い違う切断末端は「粘着（Stick
y）」になる、すなわち、これは再アニーリングするこ
ともできるし、又はほぞあな（mortise）とほぞさし（t
enon）の様に、ワトソン−クリック（Watson−Crick）
塩基対（ＡとＴ及びＧとＣ）の法則により他の相補性
「粘着」末端DNAとアニーリングすることもできる。上
述のHpaIやPvuIIのようにいくつかの制限酵素は「平滑
（blunt）」末端を残して切断される。上述のヌクレオ
チド配列は広く使用されている慣習に従って表現されて
いる：上方の鎖は蛋白質を暗号化している鎖で、その鎖
上を左から右へ進むことは５′末端から３′末端へ移動
することで、これはすなわち「基（近接）部（proxima
l）」点から「末（遠位）部（distal）」点へ向かう転
写の方向である。
最後に、慣習によると“△”の記号は欠失を意味する。
それ故例えばプラスミドに“△EcoRI−Xbai"がついてい
れば、EcoRIとXbaIの制限酵素（作用）部位の間のヌク
レオチド配列がこれらの酵素の切断によって除去された
プラスミドを表わしている。便宜上、ある種の欠失は数
字で示される。したがって、pBR322親プラスミドのテト
ラサイクリン耐性遺伝子に先行するEcoRI認識部位の第
１塩基対（“bp"）から数えて“△1"はbp1−30の塩基の
欠失（つまり△EcoR I−Hind III）となり、結果として
テトラサイクリン・プロモーター−オペレーター系の不
能化を意味する。“△2"はbp1−375の欠失（つまり△Ec
oR I−BamH I）で、結果としてテトラサイクリン・プロ
モーター−オペレーターとテトラサイクリン耐性を暗号
化している構造遺伝子の両方の除去を意味する。そして
“△3"はbp3611−4359の欠失（つまり△Pst I−EcoR
I）とアンピシリン耐性の欠如を意味する。“△4"はtrp
オペロンの断片５（第１図）からbp〜900−〜1500の除
去及びその結果trpDポリペプチドの構造遺伝子の欠如を
意味するのに用いられる。
詳細な記述 trpのリーダー配列は、trpメッセンジャーRNAの出発点
からはじまる塩基対（“bp"）１−162から成る。14のア
ミノ酸からなる想定のtrpリーダーポリペプチドは、翻
訳開始信号を暗号化しているATGヌクレオチドにつづくb
p27−71により暗号化されている。trpのアティニュエー
ター領域はbp114−156間に存在する連続したGC塩基の多
い配列とAT塩基の多い配列から成り、アティニュエーシ
ョンは明らかにリーダー配列のbp〜134−141で暗号化さ
れているメッセンジャーRNAのヌクレオチド上で起こ
る。trpのリーダーリボソーム結合部位の支配下に異種
ポリペプチドを発現させ、同時にアティニュエーション
を防ぐために次の基準が守られなければならない： 1.塩基対134−141又はそれ以上を除去しなければならな
い。
2.挿入された遺伝子のATGコドンは、周知の如く、リボ
ソームの結合部位に対して適切な関係に位置することが
必要である〔例えば、J.A.Steitz“Genetic signals an
d nucleotide sequences in messenger RNA"in Biologi
cal Regulation and Control（ed,R.Goldberger）Plenu
m Press.N.Y.（1980）を参照〕。
3.同種−異種融合蛋白を生産しようとする場合には同種
のポリペプチド配列の翻訳開始信号が使用可能なまま残
されるべきであり、そして融合蛋白質の同種部分のコド
ンは、翻訳終止信号に割って入り込むことなく、相内に
挿入されなければならない。
例えば、リーダー配列中、bp70から遠位末端へかけての
全ての塩基対を除去すると、アティニュエーター領域が
除去されるが、翻訳開始信号を暗号化しているATG配列
は残る。そしてＡとそれに続くヌクレオチドの除去によ
りTCA（bp69−71）によって暗号化される介在翻訳終止
が除去される。そのような除去により、リーダーポリペ
プチドで始まり、異種挿入物によって暗号化されたポリ
ペプチドで終わる融合蛋白が発現される。この蛋白は
３′方向への欠失の程度によって決まる、trpオペロン
のリーダー後位の一つのポリペプチドの遠位末端部を含
む。かくて、Ｅ遺伝子中にまで延びた欠失により、後に
続く挿入体によってコードされた配列と融合したＥの末
端部（欠失の終点以降の）とＬ配列から成る同種前駆体
が発現される。
アティニュエーター領域が欠失している、２つの特に有
用なプラスミドはpGM1とpGM3である。G.F.Miozzari et
al.,J.Bacteriology,133,1457（1978）参照。これらは
各々trp△LE1413とtrp△LE1417の欠失を持っており、そ
して（trpのプロモーター・オペレーターの制御下で）t
rpのリーダー部分の最初の６つのアミノ酸とE.ポリペプ
チドの遠位末端部からなるポリペプチドを発現する。最
も好適な場合ではpGM1はＥポリペプチドの最後の約３分
の１のみを発現し、一方pGM3はＥポリペプチドコドンの
1/2の遠位末端部分のほとんどを発現する。pGM1を含有
する大腸菌Ｋ−12株W3110tna2-trp-△102はアメリカン
・タンプ・カルチュア・コレクション（the American T
ype Culture Collection）に寄託されている（ATCC No.
31622）。pGM1は後述する方法で、使用するに際し菌株
から常法により取ることができる。
あるいはまた、欠失は任意の所望の個所でDNA2本鎖を特
異的に切断する本発明によって提供される方法によって
成しとげられる。この切断技術の１つの例は後述の実験
区分、第IV部にでてくる。即ち、λエクソヌクレアーゼ
との反応によって目的とする切断点の周辺領域のDNA2本
鎖を１本鎖DNAに換える。合成された又は他の方法によ
る１本鎖DNAのプライマーを、ワトソン−クリックの塩
基対合によって、先に形成した１本鎖にハイブリダイズ
させる。プライマー配列はその５′末端が、所望とする
切断点の直前の第１鎖のヌクレオチドと一緒になって端
末を形成する様な配列となっている。プライマーを次に
DNAポリメラーゼとの反応によって３′方向へ伸長さ
せ、最初の段階で失われた、目的とする切断点の前にあ
る本来の２本鎖DNAの部分を再合成する。同時に又はそ
の後で、目的とする切断点より以後の第１鎖の部分を消
化し去る。要約すると、以下の通りである（ここで“
∨”印の個所は目的とする切断点を示す）： 最も好適な具体例は、（ｄ）と（ｅ）の段階を同時に行
なうことであり、これはポイメラーゼを使い、突き出た
１本鎖を３′→５′の方向に消化し、同時に５′→３′
の方向へ（dATP、dGTP、dTTP、dCTPの存在下に）プライ
マーを伸長する。この目的に対して好適な材料はKlenow
ポリメラーゼＩで、これはDNAポリメラーゼＩの蛋白分
解的切断によって得られるフラグメントであり、親酵素
の５′→３′への重合活性と３′→５′へのエキソヌク
レアーゼ的（exonucleolytic）活性を持つが、５′→
３′へのエキソヌクレアーゼ的活性は欠如している。A.
Kornberg,DNA Synthesis,98,W H Freeman and Co,SFO,
（1974）参照。
trpオペロン含有プラスミド分子を、その平滑末端にし
たい点（上記の“∨”）より下流の制限部位で切断する
ことにより線状化したプラスミドは、上に述べた方法に
より、所望通りにアティニュエーターを欠失させること
ができる。アティニュエーター領域欠失に続く再環状化
は、平滑末端の連結又はその他の当業者によく知られて
いる方法によってなしとげられる。
本発明はtrpプロモーター−オペレーターの支配下での
異種ポリペプチドの直接発現を包含するが、好適な態様
は同種及び異種配列の両方からなる融合蛋白を発現し、
好ましくは異種配列を細胞外の環境で同種配列から特異
的に切除するものである。特に好適なものは、trpリー
ダー・ポリペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸とtr
pEのアミノ酸配列の末端部の約３分の１又はそれ以上か
らなる同種配列との配合物である。そのようにして得ら
れた融合蛋白質は発現条件下での分解に対して極めて安
定である。
細菌、大腸菌Ｋ−12W3110株tna2-trp-△102（pGM1）（A
TCC Nob31622）を、本発明のアティニュエーター欠損tr
pプロモーター＝オペレーター系の構築に使用するのに
好適なpGM1プラスミドの増幅に用いることができる。こ
の株の表現型はアントラニル酸の存在下でtrp+であり、
50μg/mlのアントラニル酸を補足した、例えばLBのよう
な最小培地で生育できる。
本発明によるtrpプロモーター−オペレーター支配によ
る発現に使われるすべての細菌菌株は、大腸菌野性株の
場合のように、異種配列を発現するまで抑制を確実にす
るためにtrpリプレッサー＋（“trpR+"）である。
好適な具体的では、DNA組換え（実験）は、膜の性質が
形質転換に向いている細菌株である大腸菌Ｋ−12 294
株（endA,thi-,hsr-,hsmk+）（ATCC No.31446）を用い
て行なう。294株中で増殖させた、異種ポリペプチド産
生プラスミドを常法により抽出し、約−20℃から約４℃
までの温度で溶液（例えば10mMトリス 1mM EDTA pH8）
中に保存する。一方、工業的条件下での発現のためには
もっと丈夫な菌株である大腸菌Ｋ−12 λ-F-RV308 str
r,gal308-（ATCC No.31608）を選ぶ。RV308は栄養的に
は野性株であり、最小培地で良好に生育し、アンモニウ
ム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、微量金属及びグルコ
ースの常用の混合物から全ての必須な巨大分子を合成す
る。294株由来のプラスミドによりRV308培養菌を形質転
換した後、この培養菌を、プラスミドの持っているマー
カー（抗生物質耐性のような）について選択能力を有す
る培地にプレートし、形質転換体コロニーを拾い、フラ
スコ培養で増殖させる。この培養物の一部を10％DMSO又
はグリセロール溶液に入れ（滅菌したWheatonのバイア
ル中）、エタノール−ドライアイス浴槽につけて薄層状
に凍らし−80℃で凍結しておく。暗号化されている異種
ポリペプチドを生産するには、培養サンプルを、trpプ
ロモーター−オペレーターの抑制のため、トリプトファ
ンを含む培地で増殖させ、次いで添加したトリプトファ
ンを系から除いて発現させる。
生育の第１段階のために、例えばLB培地（J.H.Miller,E
xperiments in Molecular Genetics,p433 Cold Spring
Harbor Laboratory 1972）−水溶液１中に10gのバク
ト・トリプトン（Bacto tryptone）、5gのバクト・イー
スト・エクストラクト（Bacto yeast extract）及び10g
のNaClを含む−を使用してもよい。好ましくは、接種し
た培養物は、定常期より少ないけれども、550mMにおけ
る光学密度（“o.d."）が10又はそれ以上、さらに好ま
しくはo.d.が20又はそれ以上、そして一層好ましくはo.
d.が30又はそれ以上になるまで生育させる。
次いで、脱抑制および発現のため、接種した培養物を、
添加トリプトファンを細胞からとり去る条件下で生育さ
せる。このような生育に適している培地の１つにM9（J.
H.Miller前述p431）があり、次のように調製される（１
当たり）： KH2PO4 3g Na2HPO4 6g NaCl 0.5g NH4Cl 1g オートクレーブした後、次の分を添加する： 10ml 0.01M CaCl2 1ml 1M MgSO4 10ml 20％グルコース ビタミンB1 １μg/ml Humko hycase amino又はDIFCO cas.アミノ酸40μg/ml。
この補足アミノ酸はトリプトファンを欠いたカゼインの
酸加水分解物である。
異種ポリペプチドの発現を始めるため、トリプトファン
の豊富な培地で生育させた接種培養物を、例えばトリプ
トファンが添加されていない多量の培地で希釈し（例え
ば２〜10倍希釈）、目的とするレベルまで生育させ（で
きれば定常生長期に入らないところまで）、そして目的
生産物を常法により溶菌、遠心そして精製することによ
って得る。トリプトファンを除去した生育段階において
は、好ましくはodが10以上になるまで、さらに好ましく
はod20を越えるまで、最も好ましくはod30またはそれ以
上（すべて550nMにおいて）になるまで細胞を生育させ
た後、生産物を回収する。
以下に続く実験の部において記述するすべてのDNA組換
え実験は、N.I.H.の組換えDNAの研究に対するガイドラ
インに沿ってジェネンテェク社（Genentech Inc.）で行
なわれたものである。
1.D−ポリペプチド融合蛋白の発現 所望のポリペプチド及びそれと融合したtrpDポリペプチ
ドのアミノ酸配列の一部−これは、CNBr切断に対して特
異的な感受性を有するアミノ酸であるメチオニンにより
生体外で分離することができる−から成る融合蛋白の発
現の好ましい方法を第１〜３図を参照しながら記述す
る。
A.pBRHtrpの構築 プラスミドpGM1（第１図の１）は△LE1413の欠失を含む
大腸菌トリプトファン・オペロンを持っており〔GFMioz
zari et al.（1978）,J.Bacteriology,133,1457−146
6〕、従ってtrpプロモーター−オペレーター系の支配下
にある、trpDポリペプチドの全部、ならびにtrpリーダ
ーの最初の６つのアミノ酸およびtrpEポリペプチドの終
りの約３分の１の部分（これ以後は両者を合せてLE′と
呼ぶ）から成る融合蛋白を発現する。このプラスミド20
μｇを、このプラスミドを５個所で切断する制限酵素Pv
u IIにより消化する。次いで、この遺伝子断片２をEcoR
Iリンカー（pCATGAATTCATGの配列の自己相補的オリゴ
ヌクレオチド３から成る）と結合させ、後にEooR I部位
を含有するプラスミド（20）中にクローニングするため
のEcoR I切断部位を得る。pGM1から得られた20μｇのDN
A断片２を、５′−リン酸化された合成オリゴヌクレオ
チドpCATGAATTCATG（３）の200ピコモルの存在下、20μ
のT4DNAリガーゼ緩衝液（20mMトリス、pH7.6、0.5mM
ATP、10mM MgCl2、5mM ジチオスレイトール）中、４℃
で一晩、10単位のT4DNAリガーゼで処理する。次いで、
連結を停止させるため、溶液を70℃で10分間加熱する。
リンカーをEcoR I消化によって切断し、そしてEcoR I未
満を持つ様になった断片を５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（以後“PAGE"という）により分離し、大きい
３つの断片を、まずエチジウムブロマイドで染色し、紫
外線によって断片の位置を決め、そして所望の部分をゲ
ルから切り出すことにより、ゲルから単離する。各々の
ゲル断片を300μの0.1×TBEとともに透析袋に入れ
て、そして0.1×TBE緩衝液で１時間100Vで電気泳動する
（TBE緩衝液:10.8gmトリス塩基、5.5gmホス酸、0.09gm
Na2EDTAを１のH2Oに含む）。水溶液を透析袋から集
め、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、そして0.
2M NaClとし、エタノール沈澱後DNAを水に回収する。
［以後に記述するすべてのDNA断片の単離は、上に述べ
たPAGEとそれに続く電気溶出法により行なった］。EcoR
I粘着末端を持つtrpプロモーター−オペレーターを含
んでいる遺伝子５は次に記述する方法、すなわちテトラ
サイクリン感受性プラスミド６へ断片を挿入することに
よって同定した（このプラスミドはプロモーター−オペ
レータが挿入されることによってテトラサイクリン耐性
となる）。
B.trpプロモーター−オペレータの制御下でテトラサイ
クリン耐性を発現するプラスミドpBRHtrpの創製並びに
上記（Ａ）で単離されたtrpプロモーター−オペレータ
ー含有DNAフラグメント５の同定及び増幅。
プラスミドpBRH1（６）［R.I.Rodriguezet al:Nucleic
acids Research６p3267−3287（1979）］はアンピシリ
ン耐性を発現し、そしてテトラサイクリン耐性の遺伝子
を含んでいるが、これに結合しているプロモーターがな
いのでその耐性を発現しない。従って、このプラスミド
はテトラサイクリン感受性である。EcoR I部位にプロモ
ーター−オペレーター系を導入することにより、このプ
ラスミドをテトラサイクリン耐性にすることができる。
pBRH1をEcoR Iにより消化し、酵素をフェノール抽出、
次いでクロロホルム抽出によって取り除き、そして水溶
液中、エタノール沈澱して回収する。得られたDNA分子
７を上記Ａ−で得られた３つのDNA断片の各々と、別々
の反応混合物中で混合し、前述したようにしてT4DNAリ
ガーゼでつなぐ。反応混合物中に存在するDNAを使って
形質転換能を持つ（コンピテント）大腸菌Ｋ−12 294
株［K.Backman et al,Proc Natl Acad Sci USA73,4174
−4198（1976）］（ATCC no.31448）を標準的な技術
［V.Hershfield et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA71,345
5−3459（1974）］によって形質転換し、その細菌を20
μg/mlのアンピシリンと５μg/mlのテトラサイクリンを
含むLBプレート上に蒔いた。いくつかのテトラサイクリ
ン耐性コロニーを選択し、プラスミドDNAを単離し、所
望の断片の存在を制限酵素解析によって確認した。得ら
れたプラスミド８はpBRHtrpと称され、β−ラクタマー
ゼを発現し、アンピシリン耐性を与える。さらにこのプ
ラスミドは、trpプロモーター−オペレーターを含む、t
rpリーダーの最初の６つのアミノ酸とtrpEポリペプチド
の終わりの約３分の１の融合からなる第１の蛋白（この
ポリペプチドをLE′と称する）、trpDポリペプチドの最
初の約半分に相当する第２の蛋白（このポリペプチドは
Ｄ′と称される）およびテトラサイクリン耐性遺伝子に
よってコードされた第３の蛋白とを暗号化しているDNA
断片を含んでいる。
C.種々の最終生産物ポリペプチドのための遺伝子のクロ
ーニング並びに最終生産物と特異的に切除できるtrpDポ
リペプチド前駆体から成る融合蛋白としてのこれらの発
現（第２図）。
trpプロモーター−オペレーター並びにLE′及びＤ′ポ
リペプチドのコドンから成るDNA断片をプラスミドpBRHt
rpから得、これを種々の所望ポリペプチドの構造遺伝子
を含むプラスミドに挿入した。次にソマトスタチンの場
合を例として挙げる（第２図）。
pBRHtrpをEcoR I制限酵素によって消化し、得られた断
片５をPAGEと電気溶出により単離した。EcoR Iで消化し
たプラスミドpSomll［K.Itakura et al.,Science198p10
56（1977年）；英国特許公告第2007676A号］を断片５と
混合した。この混合物を前述のようにしてT4DNAリガー
ゼで連結し、そして得られたDNAによって大腸菌Ｋ−12
294株を前述のように形質転換した。形質転換された
細菌をアンピシリンを含むプレートで選択した。得られ
たアンピシリン耐性コロニーを、pBRHtrpから単離しP32
で放射能ラベルしたtrpプロモーター−オペレーター含
有断片５をプローブとして用いるコロニー・ハイブリダ
イゼーション（colony hybridization）によってスクリ
ーニングした［M.Gruenstein et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA72,3951−3965（1975）］。コロニー・ハイブリ
ダイゼーションで陽性を示す幾つかのコロニーを選択
し、プラスミドDNAを単離し、挿入された断片の方向
を、制限酵素Bgl IIとBamH Iの２重消化による制限酵素
解析により決定した。trpプロモーター−オペレーター
断片が所望の方向で入っているpSOM7△２（11）と称さ
れるプラスミドを含んでいるE.coli294を、10μg/mlア
ンピシリンを含むLB倍地で増殖させた。光学密度が１
（550nmで）になるまでこの細胞を増殖し、遠心によっ
て集め、10倍希釈のM9倍地に再懸濁した。細胞を２−３
時間増殖させ、再び光学密度１になったら溶菌させ、全
細胞蛋白をSDS（sodium dodecyl sulfate）尿素（15パ
ーセント）ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析
した［J.V.Maizel Jr.et al.,Meth.Viral.５,180−246
（1971）］。
第３図は、いろいろな培養物からの全蛋白を大きさによ
って分別分離する、蛋白のゲル解析結果を示したもので
ある。個々のバンドの濃淡は各々の蛋白が存在する量を
反映している。第３図に関して、レーン１と７は対照で
あり、既に大きさが決定されているいろいろな蛋白を含
んでおり、比較対照点として役立つ。レーン２及び３
は、プラスミドpSom7△２によって形質転換され、LB倍
地（レーン２）とM9倍地（レーン３）でそれぞれ増殖し
た大腸菌294株のコロニーからの細胞蛋白を分別分離し
たものである。レーン４及び５は、プラスミドpThα１
（Mozesら著:Cellular Response to Molecular Modulat
ors,1981,Academic Press参照）から出発して、既述の
ものと本質的に同一の手順によって得られたサイモシン
発現プラスミドであるpThα７△２によって形質転換し
た同様の細胞から得られた細胞蛋白を分別分離したもの
である。レーン４はLB倍地で増殖した大腸菌294株/pTh
α７△２からの細胞蛋白を分別分離したものであり、一
方レーン５はM9倍地で増殖した同じ形質転換株からの細
胞蛋白を分別分離したものである。レーン６は別の対照
であり、LB倍地で増殖させた大腸菌294株/pBR322の蛋白
パターンである。
対照と比較すると、レーン３及び５の各々の２つの最も
顕著なバンドで最大のものは、Ｄ′ポリペプチドとソマ
トスタチンあるいはサイモシンから成る融合蛋白が発現
された場合に予想される大きさの蛋白であることを示し
ている（他の顕著なバンドはアティニュエーターの欠失
によって生じたLE′ポリペプチドを表わす）。第３図
は、トリプトファンの豊富な倍地では発現が抑制される
が、トリプトファン不足条件下では脱抑制されることを
示している。
D.シアン化臭素切断とホルモン生産物の放射線免疫分析 サイモシンとソマトスタチンの両方の場合について、全
細胞蛋白をシアン化臭素で切断し、切断された生産物を
回収して乾燥した後、緩衝液に懸濁して放射線免疫分析
により解析を行ない、それぞれソマトスタチンおよびサ
イモシンと免疫学的に同一の生産物が発現されているこ
とを確認した。シアン化臭素切断はD.V.Goeddel et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,106−110（1979）に記述
されている。
II.trpプロモーター−オペレーター系の制御下での異種
遺伝子の直接発現のためのプラスミドの構築 直接発現のための戦略は、trpオペロンのすべての制御
因子の末端部に唯一の制限部位を含むプラスミドを創作
することであり、その制限部位には、trpリーダーポリ
ペプチドのリボソーム結合部位に対して適切な位置関係
で、trpリーダー配列の代りに異種遺伝子をクローンす
ることができる。この直接発現のアプローチを、ヒト成
長ホルモンの発現の場合を例にとって説明する。
プラスミドpSom7△２ 10μｇをEcoR Iで切断し、トリ
プトファン遺伝子因子を含むDNA断片５をPAGEと電気溶
出により単離した。この断片２μｇを制限酵素Taq I
２ユニットを用いて10分間37℃で消化し、平均して各々
の分子上の約５つのTaq I部位の１つのみが切断される
ようにする。断片のこの部分的消化混合物をPAGEによっ
て分別し、１つのEcoR I末端と１つのTaq I末端を含む
約300塩基対の断片12（第４図）を電気溶出により単離
した。この相当するTaq I部位は転写開始と翻訳開始部
位の間に位置し、そしてtrpリーダー・ペプチドのATGコ
ドンから５ヌクレオチド上流にある。この部位のまわり
のDNA配列を第４図に示す。前述のように処置すること
によって、trpオペロンのすべてのコントロール因子、
即ちプロモーター・オペレーター系、転写開始信号及び
trpリーダーリボソーム結合部位を含む断片を単離でき
た。
trpリーダー配列のための翻訳開始信号に隣接し、得ら
れた断片の３′末端に位置するTaq I部位を、次に第５
図に示すようにしてXba I部位へ転換した。これは、特
異な（即ちただ１つの）EcoR I部位と特異なXba I部位
を含むプラスミドに、上で得られた断片12をつなぐこと
によって行なった。この目的のためには、レプリコン、
抗生物質耐性のような選択マーカー及びEcoR I、Xba
I、BamH I部位を順に含むならば本質的にどんなプラス
ミドでも採用することができる。かくて、たとえばpBR3
22のEcoR IとBamH Iの間にXba I部位を導入することが
できる［F.Bolivar et al.,Gene２,95−119（1977）参
照］。これは例えばプラスミドの特異なHind III部位を
Hind IIIで切断し、続いて１本鎖に特異的なヌクレアー
ゼにより、生成した粘着末端を消化し、そしてCCTCTAGA
GGのような認識部位を含む自己アニーリング性の２本鎖
合成ヌクレオチドと平滑末端結合することによって行な
う。あるいはその代わりに、EcoR IとBamH I切断残基の
間に１つのXba I部位を含んでいる天然由来のDNA断片
を、ここで行なった場合のように、使用することもでき
る。即ち、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム（genome）のEcoR
I及びBamH I消化産物を常法によって得、そしてプラス
ミドpGH6［D.V.Goeddel et al.,Nature281544（197
9）］のEcoR I及びBamH I部位にクローンしてプラスミ
ドpHS32を形成した。プラスミドpHS32をXba Iで切断
し、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、そしてエ
タノール沈澱させた。次いで、0.1mM dTTPと0.1mM dCTP
を含む30μのポリメラーゼ緩衝液（50mM リン酸カリ
ウム、pH7.4、7mM MgCl2、1mM β−メルカプトエタノー
ル）中、０℃で30分間、次いで37℃で２時間、１μの
大腸菌ポリメラーゼＩ、Klenowフラグメント（Boehring
er−Mannheim）で処理する。この処理によって、XBA I
切断部位の５′突出末端に相補的な４ヌクレオチドのう
ちの２つが下記のように満たされる。
２つのヌクレオチドdC及びdTを挿入し、２つの５′突出
ヌクレオチドを持った末端を得た。このプラスミドpHS3
2の線状残余物をフェノール及びクロロホルム抽出し、
水溶液中でエタノール沈澱して回収した後EcoR Iで切断
した。大きなプラスミドの断片13をPAGEによってそれよ
り小さいEcoR I−Xba I断片から分離し、電気溶出して
単離した。pHS32からのこのDNA断片（0.2μｇ）を前述
と同様の条件下で、第５図に示したようにトリプトファ
ン・オペロンのEcoR I−Taq I断片（〜0.01μｇ）と結
合した。この様にして、完全なワトソン−クリック塩基
対ではないが、Taq I突出末端はXba Iの残っている突出
末端と結合する。
この結合反応混合物の一部で、上記Ｉのようにして、大
腸菌294株細胞を刑質転換し、熱処理し、アンピシリン
を含むLBプレートに蒔いた。24のコロニーを選択し、3m
lのLB培地中で生育させ、そしてプラスミドを単離し
た。このうち６つは、大腸菌によって触媒されるDNA修
復及び複製により、再生されたXba I部位を持っている
ことが見出された。
これらのプラスミドはEcoR IとXba Iの両方によって開
裂しそして期待される制限断片を生じることがわかっ
た。一つのプラスミド14はpTrp14と称し、次に論議する
ように、異種ポリペプチドの発現に使用される。
プラスミドpHGH107［第６図の18,D.V.Goeddel et al.,N
ature,281,544（1979）］は、合成DNA断片から得られた
23個のアミノ酸のコドンと、ヒト成長ホルモンのメッセ
ンジャーRNAの逆転写によって作製された相補性DNAから
得られた163個のアミノ酸のコドンから成り立っている
ヒト成長ホルモンの遺伝子を含んでいる。この遺伝子21
は、ヒト成長ホルモンの“pre"配列のコドンを欠失して
いるけれども、ATG翻訳開始コドンを含んでいる。この
遺伝子は、上記のように、10μｇのpHGH107をEcoR Iで
処理し、次いで大腸菌ポリメラーゼＩ Klenowフラグメ
ントとdTTP及びdATPで処理することによって単離した。
続いてフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノー
ル沈澱した後プラスミドをBamH Iで処理した。第６図参
照。
ヒト成長ホルモン（“HGH"）遺伝子を含む断片21をPAGE
とそれに続く電気溶出によって単離した。生じたDNA断
片をテトラサイクリン耐性構造遺伝子の最初の350個の
ヌクレオチドを含んではいるが、テトラサイクリン・プ
ロモーター−オペレーター系を欠失している。従って、
次いでこれを発現のためのプラスミドにクローン化する
と、この挿入物を含むプラスミドはテトラサイクリン耐
性を回復し、それによって所在がわかる様になる。断片
21のEcoR I末端がKlenowのポリメラーゼＩ法によって満
たされているので、この断片は１つの平滑末端と１つの
粘着末端を持つことになり、発現のためのプラスミドへ
後に挿入されたときに適切な方向性が確保される。第６
図参照。
次に、発現プラスミドpTrp14を、上で調製したHGH遺伝
子を含む断片を受容し得る様に調製した。即ち、pTrp14
をXba Iで消化し、生じた粘着末端をdATP、dTTP、dGTP
およびdCTPを用いるKlenowポリメラーゼＩ法により満た
した。フェノール及びクロロホルム抽出そしてエタノー
ル沈澱の後、得られたDNA16をBamH Iで処理し、その結
果生じた大きなプラスミド断片17をPAGE及び電気溶出に
よって単離した。このpTrp14由来の断片17は１つの平滑
末端と１つの粘着末端を持ち、前に述べたHGH遺伝子含
有断片21との適切な方向での組換えが可能であった。
HGH遺伝子断片21とpTrp14△Xba−BamH I断片17を混合
し、前記と同様の条件下で結合した。（突出部分を対応
する塩基で）充填したXba IとEcoR I末端を平滑末端結
合することにより、Xba I及びEcoR I部位の両方を再生
した。
この構築により、テトラサイクリン耐性遺伝子も再生さ
れる。プラスミドpHGH107はHGH遺伝子の上流に存在する
プロモーター（lacプロモーター）からテトラサイクリ
ン耐性を発現するので、pHGH207と命名したこの構成物2
2は、トリプトファン・プロモーター−オペレーターの
制御下でテトラサイクリン耐性遺伝子の発現を可能にす
る。かくて、この連結混合物で大腸菌294株を形質転換
し、テトラサイクリン５μg/mlを含むLBプレートでコロ
ニーを選択した。
プラスミドpHGH207からのヒト成長ホルモンの直接発現
を確かめるために、アンピシリン10μg/mlを含むLB培地
で光学密度が１に達するまで増殖させ、M9倍地で10倍に
希釈し、再び光学密度が１に達するまで増殖させた大腸
菌294株/pHGH207からの全細胞蛋白を、前述の第１部の
場合のようにSDゲル電気泳動にかけ、すでに他の者が発
表しているヒト成長ホルモンで得られた同様の電気泳動
のデータと比較した［D.V.Goeddel et al.,Nature,2815
44（1979）］。第７図は得られた染色ゲルの写真であ
る：レーン１と７は種々の既知の大きさの蛋白マーカー
を含んでいる；レーン２は大腸菌294株/pBR322の全細胞
蛋白を分離した対照；レーン３はLB培地で増殖させた大
腸菌294株/pHGH107からの蛋白を分離したもの；レーン
４はM9培地で増殖させた大腸菌294株/pHGH107からの蛋
白を分離したもの；レーン５はLB培地で増殖させた大腸
菌294株/pHGH207からの蛋白を分離したもの；レーン６
はM9培地で増殖させた大腸菌294株/pHGH207からの蛋白
を分離したもの。レーン６の濃いバンドは、レーン２−
４の類似のバンドと比較して示されているヒト成長ホル
モンである。本発明によって予想されるように、トリプ
トファンの豊富なLB培地で増殖させた場合、この微生物
大腸菌294株/pHGH207によって生産されるヒト成長ホル
モンはトリプトファンの抑制因子／オペレーターの相互
作用によって少なくなる。しかし、M9培地で増殖させた
場合、pHGH107のlacプロモーター−オペレーター系と比
較したときのトリプトファン・プロモーター−オペレー
ター系のより強力な誘導のために大腸菌294株/pHGH107
よりかなり多量にHGHが生産される。
III.トリプトファン・プロモーター−オペレーターの制
御下にある異種遺伝子の直接発現のための一般的発現プ
ラスミドの創製 前の節で創製したプラスミドpHGH207を用い、次にトリ
プトファンオペロン（アティニュエーターを欠失してい
る）の制御因子を含むDNA断片を得、そして各種構造遺
伝子の挿入物の直接発現に適したプラスミド「発現ベク
ター」を創製した。この一般的発現プラスミドの創製の
戦略は、EcoR I消化によるpHGH207からのトリプトファ
ン制御領域の除去と前述の第Ｉ部で使われたプラスミド
pBRH1のEcoR I消化物への挿入であった。前述したよう
に、pBRH1はテトラサイクリン耐性遺伝子を含むアンピ
シリン耐性プラスミドであるが、しかし適切なプロモー
ター−オペレーター系の欠失のためにテトラサイクリン
感受性である。得られたプラスミドpHKY1の組立て法に
ついては、第８図を参照しながら後に詳述するが、この
プラスミドは、アンピシリン及びテトラサイクリンの両
者に耐性であり、トリプトファン・アティニュエーター
を欠失し、トリプトファン・プロモーター−オペレータ
ー系を含み、さらにトリプトファン・プロモーター−オ
ペレーターの遠位に唯一のXba I部位を含んでいる。ト
リプトファンプロモーター−オペレーターと唯一のXba
I部位は（２つの）EcoR I部位によって囲まれており、
その結果このプロモーター−オペレーター−Xba Iを含
む断片を切り取り、他の構造遺伝子を含むプラスミドへ
挿入することができる。逆に異種構造遺伝子を、Xba I
部位か又は（部分的EcoR I消化後）トリプトファン制御
領域の遠位のEcoR Iへ挿入することができ、いずれの場
合でもトリプトファン・プロモーター−オペレーター系
の制御下に置くことができる。
プラスミドpHGH207をEcoR Iで消化し、trpプロモーター
含有EcoR I断片23をPAGEとそれに続く電気溶出によって
回収した。
プラスミドpBRH1をEcoR Iで消化し、突出したEcoR I末
端にあるホスフェート基の除去のために、細菌アルカリ
・ホスファターゼ（“BAP"）（50mMトリスpH8及び10mM
MgCl2中に１μｇ、30分、65℃）で切断末端を処理し
た。過剰の細菌アルカリホスファターゼをフェノール抽
出、クロロホルム抽出及びエタノール沈澱によって除去
した。生じた線状DNA7aは突出末端のリン酸を欠失して
いるので、連結においてリン酸化された相補的な粘着末
端を持った挿入物しか受容できず、それ自体の再環状化
は起こらず、従って挿入物を含むプラスミドのさらに容
易な選別が可能になる。pHGH207由来のEcoR I断片とpBR
H1から得られた線状DNAを前述のようにT4リガーゼの存
在下で混合し連結した。生じた混合物の一部分を使っ
て、前述のように大腸菌294株を形質転換し、テトラサ
イクリン５μg/mlを含むLB培地上にプレートし、そして
12のテトラサイクリン耐性コロニーを選択した。プラス
ミドを各々のコロニーから単離し、そしてEcoR IとXba
Iを使用する制限エンドヌクレアーゼ分析によってDNA挿
入物の存在を調べた。挿入物を含んだ１つのプラスミド
をpHKY1と命名した。
IV.trpのリーダーペプチドの６つのアミノ酸とtrpEポリ
ペプチドの終わりの３分の１（LE′と称す）と異種構造
遺伝子産物から成る特異的に切断し得る融合蛋白を発現
することが可能な、トリプトファンオペロンを含むプラ
スミドの創製 LE′融合蛋白の発現プラスミドの創製のための戦略を実
施するには次の工程が必要であった。
a.暗号化鎖の５′末端にBgl II、３′末端にEcoR I粘着
末端を持ったLE′ポリペプリドの遠位領域のためのコド
ンから成る遺伝子断片の準備。
b.LE′遺伝子断片の遠位領域からのそのコドンの除去及
びプラスミドSOM7△２からのtrpD遺伝子のコドンの除
去、および段階１で形成された断片を挿入し、ソマトス
タチンのための異種遺伝子のすぐ上流にLE′コドン配列
を再構成すること。
1.第９（ａ）図に示した様に、プラスミドpSom7△２をH
ind IIIで消化し、続いてLE′暗号化領域内のBgl II制
限部位を越えて消化する様に選択された条件下で、λエ
キソヌクレアーゼ（５′から３′へのエキソヌクレアー
ゼ）により消化した。20μｇのHing III−消化pSom7△
２を緩衝液（20mM グリシン緩衝液pH9.6、1mM MgCl2、
1mM β−メルカプトエタノール）に溶解した。生じた混
合物を、５単位のλエキソヌクレアーゼで60分間室温に
て処理した。得られた反応混合物をフェノール抽出、ク
ロロホルム抽出及びエタノール沈澱にかけた。
最終的にLE′遺伝子断片の遠位末端にEcoR I残基をつく
るため、改良ホスホトリエステル法［R.Crea et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA75、5765（1978）］によってプラ
イマー32PCCTGTGCATGATを合成し、そしてこれを、λエ
キソヌクレアーゼ消化によって得られたLE′遺伝子断片
の１本鎖末端へハイブリダイズした。このハイブリダイ
ゼーションは次に述べる方法で行なった。
プラスミドpSom7△２由来のλエキソヌクレアーゼ処理
したHind III消化生産物20μｇを20μの水に溶解し、
そして上記の５′−リン酸化オリゴヌクレオチド約80ピ
コモルを含む溶液６μと混合した。この合成された断
片をLE′暗号化配列の３′末端にハイブリダイズし、残
ったLE′断片の１本鎖部分を、dATP、dTTP、dGTPそして
dCTPを使用する前述のKlenowポリメラーゼＩ法によって
満たした。
反応混合物を50℃まで熱し、ゆっくりと10℃まで冷やし
た後、Klenow酵素４μを加えた。15分間室温でインキ
ュベートし、次に30分間37℃でインキュベートし、0.25
モルEDTA ５μの添加によって反応を止めた。この反
応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出そしてエ
タノール沈澱した。次にこのDNAを制限酵素Bgl IIで切
断し、断片をPAGEで分けた。ゲルから得られたオートラ
ジオグラムは約470bpの予想された長さの32Pでラベルさ
れた断片の存在を示しており、これを電気溶出によって
回収した。略述したように、この断片LE′（ｄ）はBgl
IIとプライマーの開始部に一致する平滑末端を持つ。
前記第Ｉ部（Ｃ）に既述したプラスミドpThαｌは、暗
号鎖の５′末端がEcoR I部位に、そしてその３′末端が
BamH I部位にクローンされたサイモシンα１の構造遺伝
子を持っている。第９図に示した様に、サイモシン遺伝
子はBgl II部位をも含む。プラスミドpTHα１はまたア
ンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。上で調製してLE′
（ｄ）断片の受容能力を持つプラスミドを創製するため
にpThα１をEcoR Iで消化し、次にdTTPとdATPを用いたK
lenowポリメラーゼＩ反応でEcoR I残基を平滑にした。
生じた生産物のBgl II消化により、アンピシリン耐性遺
伝子を含み、そしてその両末端に粘着Bgl II残基と平滑
末端を持った線状DNA断片33を作成した。生じた生産物
を、T4リガーゼの存在下で、Bgl II粘着末端と平滑末端
を持ったLE′（ｄ）断片と反応させることによって再環
状化することができ、この様にしてプラスミドpTrp24を
作成した（第9b図）。このようにすることにより、平滑
末端連結が行なわれた位置でEcoR I部位が再生する。
第10図に示した様に、Bgl IIとEcoR IによるpTrp24の連
続的消化、それに続くPAGEと電気溶出によって、３′暗
号化末端に隣接したEcoR I粘着末端とBal II粘着末端を
持ったLE′（ｄ）ポリペプチドのためのコドンを持つ断
片が得られる。第10図に示した様に、このLE′（ｄ）断
片38をプラスミドpSom7△２のBgl II部位にクローンす
ることができ、トリプトファンプロモーター−オペレー
ターの制御下で発現させてLE′ポリペプチド／ソマトス
タチン融合蛋白を得ることができる。それを行なうため
に次の事が必要である。（１）第10図に示されるよう
に、トリプトファン・プロモーター−オペレーターから
遠位のEcoR I部位を切断するために、pSom7△２を部分
的にEcoR I消化すること、及び（２）コドンの読み取り
枠を適切に維持するため、及びEcoR I切断部位を再生す
るためにプライマー配列（図９）を適切に選択するこ
と。
即ち、16μｇのプラスミドpSom7△２を20mM トリス pH
7.5、5mM MgCl2、0.02NP40清浄剤、100mM NaClを含む緩
衝液200μで希釈し、0.5ユニットのEcoR Iで処理し
た。37℃で15分後、反応混合物をフェノール抽出し、ク
ロロホルム抽出しそしてエタノール沈澱させ、そして続
いてBgl IIで消化した。生じた大きな断片36をPAGE法と
それに続く電気溶出によって単離した。この断片はBgl
II部位から上流にあるLE′ポリペプチドの近接部末端に
対するコドン“LE'（ｐ）”を含んでいる。断片36を断
片38とT4DNAリガーゼの存在下で連結してプラスミドpSo
m7△２△４を形成せしめ、これで前述のごとく大腸菌29
4株を形質転換すると、トリプトファン・プロモーター
−オペレーターの制御下で、完全に再構築されたLE′ポ
リペプチドとソマトスタチンから成る融合蛋白が効率的
に生産された。融合蛋白からソマトスタチンは、ソマト
スタチン配列の５′末端のメチオニンの存在のために特
異的に切断し得るが、この融合蛋白を前述のようにSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。融
合蛋白生産物は第11図のレーン６に明確なバンドとして
観察される。これについては下記第VI部でもっと詳細に
論議する。
V.テトラサイクリン耐性がトリプトファン・プロモータ
ー−オペレーターの制御下に置かれているtrpLE′ポリ
ペプチド融合物発現系の創製 トリプトファン・オペロンの支配下にLE′融合蛋白とし
て発現させるための広範囲の異種ポリペプチド遺伝子を
受け入れ得る発現媒体創製のための戦略には次の性質を
持つプラスミドの構築が必要である。
1.テトラサイクリン耐性を指定している遺伝子を制御す
るプロモーター−オペレーター系が切除された場合に
は、失われるであろうテトラサイクリン耐性。
2.テトラサイクリン耐性を制御するプロモーター−オペ
レーター系を除去し、異種遺伝子およびこれに対して適
切な解読相内にあるトリプトファン・プロモーター−オ
ペレーター系と連結することにより再環状化して、テト
ラサイクリン耐性を回復し、かくして異種遺伝子挿入物
を含むプラスミドの同定ができること。
簡単に、そして意図する挿入物の性質に照らして言うな
らば、ここでの目的は、その３′末端にPst残基を持ち
且つその５′末端にBgl II残基を持ち、かつ、プロモー
ター−オペレーター系の制御下に置いた時テトラサイク
リン耐性を指定し得る遺伝子を囲んでいる、線状DNA片
を創製することである。
即ち、第13図を参照しながら説明すると、プラスミドpB
R322をHind IIIで消化しそして突出したHind III末端
を、こんどはS1ヌクレアーゼで消化した。S1ヌクレアー
ゼ消化は、10μｇのHind III切断したpBR322を30μの
S1緩衝液（0.3M NaCl、1mM ZnCl2、25mM 酢酸ナトリウ
ム pH4.5）に含まれる300単位のS1ヌクレアーゼで30分
間15℃で処理することからなる。30×S1ヌクレアーゼ停
止溶液（0.8M トリス塩基、50mM EDTA）１μの添加に
よって反応を停止させた。混合物をフェノール抽出し、
クロロホルム抽出しそしてエタノール沈澱させ、次に前
に記述したようにしてEcoR I消化し、そして大きな断片
46をPAGE法とそれに続く電気溶出によって単離した。得
られた断片は第１のEcoR I粘着末端と第２の平滑末端を
持ち、後者の暗号化鎖はヌクレオチド、チミジンで始ま
る。後述するが、チミジンで始まるS1消化したHind III
残基は、KlenowポリメラーゼＩ処理したBgl II残基と連
結することができ、この連結によってBgl II制限部位を
再生させることができる。
上記第１部で調製したプラスミドpSom7△２を、Bgl II
で消化し、そして生成したBgl II粘着末端を、４つのデ
オキシヌクレオチドトリホスフェートすべてを使用し
て、KlenowポリメラーゼＩ法で２本鎖にした。生成した
生産物をEcoR I切断し、続いてPAGE及び電気溶出によっ
て得た小断片42は、トリプトファンプロモーター−オペ
レーター及びBgl II部位から上流にあるLE′“基部”配
列のコドン（“LE'（ｐ）”）を含む線状DNA断片であ
る。この生産物はEcoR I末端と、Bgl II部位を満たして
生じた平滑末端を持つ。しかしながらこのBgl II部位は
断片42の平滑末端と断片46の平滑末端との連結によって
再生される。即ち、２つの断片をT4DNAリガーゼの存在
下で連結して再環状化したプラスミドpHKY10（第13図参
照）を形成させ、これをコンピテントな大腸菌294細胞
へ形質転換することによって増殖した。組み換えプラス
ミドpHKY10を持つテトラサイクリン耐性細胞を増殖さ
せ、プラスミドDNAを抽出し、そしてBgl IIとPstで順に
消化し、つづいてPAGE法と電気溶出によってPstとBgl I
I粘着末端を持つ大断片である線状DNA片を単離した。こ
のDNA断片49は複製起源を含んでおり、これは、trpLE′
ポリペプチド融合蛋白暗号化遺伝子とテトラサイクリン
耐性遺伝子の両者がtrpプロモーター／オペレーターの
制御下にあるプラスミドの構築における第１の構成分と
して有用であることがわかった。
すでに第IV部で調製したプラスミドpSom7△２△４は、
多種多様の異種構造遺伝子を受容し得る系のための第２
の構成分となるよう操作することができた。第12図を参
照しながら説明すると、このプラスミドを部分的にEcoR
I消化し（第IV部参照）、次にpstで消化し、trpプロモ
ーター／オペレーターを含む断片51をPAGEとつづく電気
溶出により単離した。部分的EcoR I消化は、ソマトスタ
チン遺伝子の５′末端に隣接したところは切断されてい
るが、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーター−オ
ペレーターの間に存在するEcoR I部位は切断されていな
い断片を得るために必要であった。アンピシリン耐性遺
伝子内のPst I切断によって失われたアンピシリン耐性
は、断片51との連結によって回復することができた。
第３構成分の最初の実例として、EcoR IとBamH1による
プラスミドpThα１の消化によってサイモシンα１の構
造遺伝子を得た。この断片52はPAGEと電気溶出によって
調製した。
３つの遺伝子断片49、51及び52を第12図に描写されてい
る適切な方向で連結し、プラスミドpThα７△１△４を
形成することができた。これはアンピシリンとテトラサ
イクリン耐性の回復によって選択することができた。こ
のプラスミドを大腸菌294株へ形質転換し、第Ｉ部に記
述したような条件下で増殖させるとtrpLE′ポリペプチ
ド融合蛋白を発現し、それからサイモシンα１をシアン
化臭素処理によって特異的に切り出すことができた。同
様にして、EcoR I及びBamH1末端を持つ他の異種構造遺
伝子をpHKY−10由来の、およびpSOM7△２△４由来の構
成成分と連結した場合も、それらの異種遺伝子が暗号化
しているポリペプチドを含むtrpLE′ポリペプチド融合
蛋白が効率良く得られた。第11図は大腸菌294株の形質
転換株からの全細胞蛋白のSDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分離を示しており、各々の場合の最も黒
いバンドがトリプトファン・プロモーター−オペレータ
ー系の制御下で生産された融合蛋白生産物を表わしてい
る。
第11図においてトーン１は大腸菌294/pBR322からの全細
胞蛋白を分離した対照である。レーン２は第IV部で調製
されたプラスミドpSom7△２△４からのソマトスタチン
融合生産物を含んでいる。レーン３はpSom7△１△４の
ソマトスタチンを含む発現生産物である。レーン４はpT
hα７△１△４の発現生産物を含み、一方レーン５はす
でに論じたpHKY−10由来の断片およびpSom7△２△４由
来の断片を、本発明者らのうちある者が一部調製したヒ
トプロインシュリンを暗号化しているEcoR I/BamH I末
端の構造遺伝子と連結して得たプラスミドから発現され
た生産物を含んでいる。レーン６及び７は、ヒトインシ
ュリンのＢ及びＡ鎖を切り出すことができるtrpLE′ポ
リペプチド融合蛋白を、各々最も黒いバンドとして含ん
でいる。インシュリンのＢ及びＡ構造遺伝子は各々プラ
スミドpIB1およびpIA11のEcoR IとBamH Iの消化によっ
て得られた。これらの構築は、D.V.GoeddelらのProc.Na
tl.Acad.Sci.USA、76、106（1979）に記載されている。
レーン８は記述した如く、サイズマーカーを含んでい
る。
以上、本発明の最も好適な具体例を、大腸菌を例にとっ
て記述したが、他の腸内細菌も同様に発現のための宿主
細胞として、およびtrpオペロン源として使用すること
ができる。これら細菌の例として、サルモネラ・テフィ
ムリウム（Salmonella typhimurium）そしてセラチア・
マルセスセンス（Serratia marcesens）が挙げられる。
それ故、本発明は記述した好適具体例にのみ限定される
ものではなく、前述の特許請求の範囲によってのみ限定
されるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は、trpDポリペプチドの一部と融合し
た異種遺伝子（これらは後で切り離される）を発現する
能力を持つプラスミドを形成するための好適な計画図で
あり； 第３図は同種（trpD′）−異種（ソマトスタチン又はサ
イモシンα１）融合蛋白を含む細胞蛋白のポリアクリル
アミドゲル分離の結果を示す図であり； 第４図，第５図及び第６図はtrpプロモーター−オペレ
ーター系の制御下に異種遺伝子（ヒト成長ホルモン）を
直接発現できるプラスミドの創製の好適な計画の逐次段
階図であり； 第７図はtrpプロモーター−オペレーター系の制御下で
直接発現されたヒト成長ホルモンを含む細胞蛋白のポリ
アクリルアミドゲルによる分離の結果を示す図であり； 第８図、第9a、9b図及び第10図は後刻、融合物から切除
しうるtrpEポリペプチド部分と融合した異種遺伝子（図
の場合はソマトスタチン）を発現する能力を持つプラス
ミドの創製の好適な計画の逐次段階図であり； 第11図はそれぞれソマトスタチン、サイモシンα１、ヒ
トプロインシュリン並びにヒトインシュリンのＡおよび
Ｂ鎖の生産のための、同種（trpE）−異種融合蛋白を含
む細胞蛋白のポリアクリルアミドゲルによる分離の結果
を示す図であり； 第12図及び第13図は、第８〜10図までの計画によって創
製したプラスミドを操作して、他の異種遺伝子をtrpEポ
リペプチド配列との融合物として、交換可能の型で発現
する系とする方法の逐次段階図である。 図中、trp p.o＝trpプロモーター−オペレーター、 ApR＝アンピシリン耐性、 TcS＝テトラサイクリン感受性、 TcR＝テトラサイクリン耐性、 SOM＝ソマトスタチン遺伝子、 lac p.o.＝ラクトース・オペロンのプロモーター−オペ
レーター、 HGHgene＝ヒト成長ホルモン遺伝子。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ギウセツペ・エフ・ミオザリ スイス国ツエ−ハ−−4310ラインフエルダ −・アウガルテン・イム・フエ−バ−ブツ シユ９

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】大腸菌において異種ポリペプチド生産物を
    製造するためのプラスミド発現ベクターであって、以下
    の要素： （ｉ）細菌のtrpプロモーター−オペレーター系； （ii）要素（iv）の翻訳のためのリボソーム結合部位を
    暗号化しているヌクレオチド； （iii）要素（iv）の翻訳のための翻訳開始信号を暗号
    化しているヌクレオチド；及び （iv）異種ポリペプチドのアミノ酸配列を暗号化 している構造遺伝子； を暗号鎖の最初の５′末端から３′未満までの相内に含
    有しているが、trpのアティニュエーション能及びtrpE
    のリボソーム結合部位を暗号化しているヌクレオチドを
    両者とも含有していない２本鎖DNA配列を有するベクタ
    ー。
  2. 【請求項２】該構造遺伝子によって発現されるポリペプ
    チドが完全に異種のものである特許請求の範囲第１項記
    載のベクター。
  3. 【請求項３】発現されるポリペプチドが異種ポリペプチ
    ドと同種ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部
    分から成る融合蛋白である特許請求の範囲第１項記載の
    ベクター。
  4. 【請求項４】該一部分がコリスミン酸からトリプトファ
    ンへの生合成経路に関与する酵素のアミノ酸配列の一部
    分である特許請求の範囲第３項記載のベクター。
  5. 【請求項５】異種ポリペプチドが生物活性なポリペプチ
    ドであり、融合した同種ポリペプチドが特異的に切断し
    得る生物不活性なポリペプチドである特許請求の範囲第
    ４項記載のベクター。
  6. 【請求項６】同種ポリペプチドがtrpEポリペプチドであ
    り、リボソーム結合部位がtrpリーダ−・ポリペプチド
    のためのリボソーム結合部位である特許請求の範囲第３
    項記載のベクター。
  7. 【請求項７】同種ポリペプチドがtrpDポリペプチドであ
    る特許請求の範囲第３項記載のベクター。
  8. 【請求項８】融合蛋白が異種ポリペプチドと同種ポリペ
    プチドから成り、同種ポリペプチドそれ自体がtrpリー
    ダ−・ポリペプチドの最初の約６つのアミノ酸とtrpEポ
    リペプチド遺伝子の遠位の少なくとも約３分の１によっ
    て暗号化されているアミノ酸配列との融合物を構成して
    いる特許請求の範囲第６項記載のベクター。
  9. 【請求項９】プラスミドpHGH207である特許請求の範囲
    第１項記載のベクター。
  10. 【請求項１０】プラスミドpSOM7△２△４である特許請
    求の範囲第１項記載のベクター。
  11. 【請求項１１】プラスミドpThyα７△１△４である特許
    請求の範囲第１項記載のベクター。
  12. 【請求項１２】異種ポリペプチドがヒト成長ホルモン、
    ヒトプロインシュリン、ソマトスタチン、サイモシンα
    １、ヒトインシュリンＡ鎖及びヒトインシュリンＢ鎖か
    ら成る群より選ばれる回収可能なポリペプチドから成る
    特許請求の範囲第１項記載のベクター。
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