CS238645B2 - Design method of plasmide capable to separate heterological gen - Google Patents

Description

Nástup technologie využívající rekombinované kyseliny desoxyribonukleové (=DNA) umožnil kontrolovanou bakteriální produkci enormní řady užitečných polypeptidů. V současné době jsou již к dispozici bakterie modifikované touto technologií, které umožňují výrobu takových polypeptidických produktů, jako jsou somatostatin [viz K. Itakura a spolupracovníci, Science 198, 1 056 (1977)], komponenty А а В řetězců lidského insulinu [viz D. V. Goeddel a spolupracovníci, Proč. Naťl. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979)] a lidský růstový hormon [viz D. V. Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544 (1979)]. Nověji bylo rekombinačních DNA technologií použito к bakteriální produkci thymosinu alfa 1, imunopotenciační substance produkované thymem (publikovaná přihláška evropského patentu č. 0 035 454).

Význam této« technologie je tak velký, že bakteriálně lze skutečně vyrábět každý potřebný polypeptid, přičemž je v dosahu kontrolovaná výroba hormonů, enzymů, protilátek a vakcín proti nejrůznějším onemocněním. Citované publikace, ve kterých jsou podrobněji popsány shora uvedené typické příklady bakteriální výroby polypeptidů, jsou na tomto místě uváděny, stejně tak jako další níže uvedené publikace, za účelem bližšího objasnění podstaty vynálezu.

Výkonným útvarem rekombinační DNA technologie je plasmid, chromosomů prostá smyčka dvouvláknová DNA nalezená v bakteriích, často v mnohonásobných kopiích v jedné bakteriální buňce. V informaci zakódované v plasmidické DNA je včleněna informace potřebná к reprodukci plasmidu do dceřinné buňky (tzv. „replikón“] a obvykle jedna nebo více selekčních charakteristik, jako je rezistence vůči antibiotikům, které umožňují, že klony hostitelské buňky obsahující plasmid, který je předmětem našeho zájmu, mohou být rozpoznány, selektivně vybrány a přednostně pěstovány v selektivním růstovém prostředí.

Užitečnost bakteriálních plasmidů spočívá ve skutečnosti, že je lze specificky štěpit jednou nebo druhou restrikční endonukleázou neboli „restrikčním enzymem“, přičemž každá z těchto endonukleáz rozpoznává na plasmidické DNA odlišné místo. Po rozštěpení lze vpravit do plasmidu heterologické geny nebo fragmenty genů buď přímým připojením v místě rozštěpení, nebo připojením na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpení. Pod pojmem „heterologický“ používaným v popisu vynálezu se rozumí gen, který se obvykle nenachází v bakteriích E. coli, nebo polypeptidická sekvence, která není těmito bakteriemi obvykle produkována, zatímco pojem „homologický“ se vztahuje na gen nebo polypeptid, který je produkován divoce rostoucím typem bakterií E. coli. Rekombinace DNA se provádí vně bakterií, ale vzniklý „rekombinovaný“ plasmid lze zavěsti do bakterií postupem známým jako transformace a kultivací získaného transformantu lze připravit velká množství rekombinovaného plasmidu obsahujícího heterologický gen. Kromě toho, podle toho* kam se gen vhodně zavede vzhledem к částem plasmidu, které řídí transkripci („přepis“) a translaci (,,překlad“) zakódovaných DNA informací, lze získaný vylučovací prostředek použít к aktuální produkci polypeptidické sekvence, pro kterou je vestavěný gen kódován; tento postup se v popisu vynálezu označuje jako vylučování (exprese).

Exprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která se vyznačuje tím, že je místem připojení RNA-polymerázy. V některých případech, jako v níže diskutovaném případu tryptofánového (trp) operónu, jsou oblasti promotoru překryty oblastmi „operátoru“ a vytváří se kombinovaný promotor — operátor. Operátory jsou sekvence DNA, které lze rozpoznat přítomností tak zvaných represorových proteinů, které slouží к regulování frekvence iniciace transkripce u specifického promotoru. Polymerasa se pohybuje podél řetězce DNA, transkribuje informace obsažené v kódovacím vláknu DNA z jěho 5‘ místa na 3' konec informační kyseliny ribonukleové (m-RNA) a tyto informace ihned překládá do polypeptidické sekvence, která má takové pořadí aminokyselin, které je v DNA zakódované. Každá aminokyselina je zakódována jediným tripletem nukleotidů, neboli „kodcnem“, pro který je v popisu vynálezu používán termín „strukturální gen“ a označuje tu část DNA, ve které je zakódována sekvence aminokyselin vyloučeného peptidického produktu.

Poté, co se RNA-polymeráza naváže na promotor, transkribuje nejprve nukleotidy kódováním na ribozómové vazebné místo, pak dojde к iniciaci translace neboli к signálu „start“ (obyčejně kodónem ATG, který se ve vzniklé informační RNA stane AUG) a poté к translaci nukleotidických kodónů do samotného strukturálního genu. Na konec strukturálního genu se transkribují tak zvané stop-kodóny a polymeráza může poté vytvářet další sekvenci informační RNA, která vzhledem к přítomnosti stop-signálu zůstává nepřenesena do ribozómů.

Ribozčmy se naváží na vazebné místo připravené na informační RNA, v bakteriích obvykle poté, co se mRNA vytvoří, a samy produkují polypeptidy podle zakódované sekvence, počínaje start-signálem translace a konče zmíněným stop-signálem. Žádaný produkt se tvoří jen tehdy, když jsou sekvence kódující vazebné místo ribozómů umístěny správně vzhledem к AUG iniciačnímu kodónu a když všechny zbývající kodóny následují za iniciačním kodónem ve fázi. Vzniklý produkt lze získat lýzou hostitelské buňky a jeho oddělením od ostatních bílkovin vhodnou čisticí metodou.

Polypeptidy získané expresí za použití rekombinační DNA technologie mohou být

S zcela heterologické, jako v případě přímého vylučování lidského růstového· hormonu, nebo se alternativně mohou skládat z heterologického polypeptidu, na který je navázána (fúzována) alespoň část aminokyselinové sekvence homologického peptidů, jako v případě přípravy meziproduktů pro so.matostatin a složek lidského insulinu. V posléze uvedeném případu obsahuje například homologický peptid navázanou část aminokyselinové sekvence pro betagalaktosidázu. V takovýchto případech je žádaný bioaktivní produkt biologicky inaktivován navázaným homologickým polypeptidem do té doby, dokud není posléze uvedený peptid odštěpen působením extracelulárních prostředků. Fúzované bílkoviny, jako ty, které byly zmíněny výše, lze pokládat za prekursory žádaných bílkovin, které se z nich dají získat vysoce specifickým štěpením, jako například působením bromkyanu obsahují-li methionin, nebo alternativně enzymatickým štěpením; viz například britský patent číslo· 2 007 676 A.

Má-li rekombinační DNA technologie splnit očekávané naděje, musí se nalézti systémy, které optimalizují expresi vložených genů a umožňují získávat žádané polypeptidické produkty ve vysokých výtěžcích. Beta-laktamázové a laktózové promotor-operátové systémy, kterých se v minulosti nejběžněji používalo, poněvadž byly užitečné, nevyužívaly plně kapacitu technologie z hlediska výtěžků. Bylo třeba nalézt prostředek pro bakteriální vylučování peptidů, který by umožňoval kontrolovatelnou expresi žádaných polypeptidických produktů ve vysokých výtěžcích.

Tryptofan je aminokyselina produkovaná bakteriemi a používaná jimi jako komponenta Pomologických polypeptidů.

Biosyntéza probíhá následujícím způsobem: kyselina chorismová - kyselina antranilová -> kyselina fosforibosylantranilová -> CDRP (enol-1- (o-karbonylf enylamino)-1-desoxy-D-ribulosa-5-fosfát] -> uidol-3-glycerolfosfát a posléze samotný tryptofan.

Enzymatické reakce této biosyntézy jsou katalyzovány produkty tryptofánového operónu, což je polycistrónový úsek DNA, který je transkribován pod řízením trp promotorového-operátorového systému. Vzniklá polycistrónová informační RNA kóduje tak zvané hlavní tryptofanové sekvence a pak, v níže uvedeném pořadí, polypeptidy označované zde jako trp E, trp D, trp C, trp B a trp A. Tyto polypeptidy v různé míře katalyzují a kontrolují individuální stupně biosyntézy tryptofanu z kyseliny chorismové.

V divokém typu bakterií E. coli je tryptofanový operón pod vlivem alespoň tří různých forem regulačních kontrol. V případě represe promotoru-operátoru působí sám tryptofan jako korepresor, váže se na svůj aporepresor a vytváří aktivní represorový komplex, který se ihned poté váže na operátor a ukončuje biosyntézu v jejím celku.

Za druhé, mechanismem inhibice zpětné vazby, se tryptofan váže na komplex · trp E a trp D polypeptidů a zamezuje tím jejich účast na biosyntéze. Posléze se provádí regulace mechanismem známým jako útlumový faktor, pod kontrolou „útlumové oblasti“ genu, oblasti, která je uvnitř hlavní trp sekvence.

Viz obecně G. F. Miozzari a spolupracovníci v časopise J. Bacteriology 133, 1457 (1978); monografie „The Operou“, str. 263 až 302, vydavatelé Miller a Reznikoff, Cold Spring Harbor Laboratory (1978); F. Lee a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, 4365 (1977); a K. Bertrand a spolupracovníci, J. Mol. Biol. 103, 319 (1976).

Zdá se, že stupeň útlumu je ovládán intracelulární koncentrací tryptofanu, a u divokého typu bakterií E. coli ukončuje útlumový článek expresi přibližně v devíti z deseti případů, pravděpodobně vytvářením sekundární struktury neboli „terminační smyčky“ v informační RNA, což má za následek, že se RNA-polymeráza předčasně vyprostí z připojení k DNA.

Jiní pracovníci použili trp-operón za účelem, aby získali nějaké měřítko pro expresi heterologických peptidů.

Tento· pracovní směr se pokouší řešit problémy represe a útlumu přidáváním kyseliny indolylakrylové, induktoru a analogu, který soutěží s tryptofanem o· trp represory v molekule, a směřuje k vyvolání dereprese pomocí kompetitivní inhibice. Induktor zmenšuje současně útlum inhibicí enzymatické konverze indolu na tryptofan a tak účinně zbavuje buňky tryptofanu. Výsledkem je, že více polymeráz úspěšně transkribuje přes útlumový článek. Tento· přístup se však zdá problematický z hlediska důsledného dokončení translace a provedení ve vysokém výtěžku, neboť syntéza bílkovinové sekvence obsahující tryptofan se předčasně ukončí v důsledku nedostatku využitelného tryptofanu. Účinné snížení útlumu při tomto· přístupu je ovšem úplně závislé na silném tryptofanovém hladovění.

Předložený vynález se věnuje problémům spojeným s represí a útlumem· biosyntézy tryptofanu odlišným způsobem. Vynález zahrnuje

1) způsob získávání plasmidických vylučovacích prostředků určených pro přímou expresi heterologických genů z trp-promotoru-operátu,

2) způsoby získávání plasmidických vylučovacích prostředků určených pro expresi, z · tryptofanového operátoru-promotoru, specificky štěpitelných polypeptidů kódovaných fúzemi homologických a heterologických genů, a

3) způsob výroby heterologických polypeptidů bakteriální expresí, vyznačující se tím, že ho lze provádět kontrolovatelně, účinně a ve vysokých výtěžcích, a způsob výroby potřebných prostředků.

Předmětem vynálezu je způsob sestrojování plasmidu schopného vylučovat heterologický gen polypeptidu, jehož podstata spočívá v tom, že se současně naváže ve správné fázi první lineární dvojvláknový fragment DNA obsahující replikón a gen, který vylučuje charakteristický znak pro selekci umístěním pod kontrolu bakteriálního promotoru, přičemž však uvedenému fragmentu jakýkoliv takový promotor chybí, druhý lineární dvojvláknový DNA fragment obsahující shora uvedený heterologický gen a třetí dvojvláknový fragment DNA, který obsahuje bakteriální promotor, přičemž záchytné konce zmíněných fragmentů mají konfiguraci, s níž se po vzájemném navázání utvoří replikace schopný plasmid a oba geny, jak gen pro charakteristický znak vhodný pro selekci plasmidu, tak heterologický gen, jsou řízeny promotorem za účelem využití zmíněného charakteristického znaku pro výběr kolonií transformovaných bakterií, schopných exprese heterologického genu.

Buňky se transformují přidáním plasmidů připravených způsobem podle vynálezu a obsahujících trp promotor-operátor, kterým však chybí útlumový článek, a kultivují se v přítomnosti záměrně přidaného tryptofanu. Použití živného prostředí bohatého na tryptofan umožňuje, aby dostatek tryptofanu v podstatě úplně potlačil interakce trp promotor-operátoru s trp-represorem, takže růst buněk může postupovat bez inhibice předčasným vylučováním velkých množství heterologických polypeptidů zakódovaných ve vloženém genu, jinak pod kontrolou trp promotorového-operátorového systému.

Když se rekombinovaná kultura vypěstuje na úroveň vhodnou pro průmyslovou produkci polypeptidu, vnější zdroj tryptofanu se naopak odstraní a buňky se nechají odkázány pouze na tryptofan, který mohou samy produkovat. Výsledkem je slabé omezení tryptofanu, v důsledku tobo je potlačena biosyntéza a dojde к vysoce účinnému vylučování vloženého heterologického genu, nebráněné útlumem, protože útlumová oblast je ze systému vypuštěna. Tímto způsobem nejsou buňky nikdy příliš zbaveny tryptofanu a všechny bílkoviny, ať obsahují tryptofan nebo ne, mohou být produkovány ve vysokých výtěžcích.

Vynález rovněž zahrnuje způsoby štěpení dvojvláknové DNA vhodnými prostředky v kterémkoliv žádaném místě, dokonce i v nepřítomnosti restrikčního enzymového místa; uvedená pracovní technika je vhodná, mimo jiné, к sestrojení trp operónů majících deletovaný útlumový článek, a to jiným způsobem, než byly získávány dříve selekcí mutantů.

Posléze vynález umožňuje výrobu různých užitečných meziproduktů a konečných produktů, včetně specificky štěpitelných heterologicky^homologických fúzovaných bílko vin, které jsou stabilizovány vůči odbourávání za podmínek vylučování.

Způsob podle vynálezu, jeho podstata a výhody jsou blíže objasněny v následujícím podrobném popisu a na přiložených výkresech na obr. 1 až 13.

Obr. 1 a 2 ilustrují výhodné schéma přípravy plasmidů schopných exprese heterologických genů ve formě fúzí s částí trp D polypeptidu; z těchto fúzovaných bílkovin je lze později specificky odštěpit.

Obr. 3 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny obsahující homologické (trp D‘) a heterologické (somatostatin nebo thymosin αΐ) fúzované bílkoviny, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 4, 5 a 6 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojení plasmidu schopného přímého vylučování heterologického' genu (lidského růstového hormonu — HGH-gen) za kontroly trp promotorového-operátorového' systému.

Obr. 7 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny obsahující lidský růstový hormon [HGH) přímo vylučovaný za kontroly trp promotorového-operátorového systému, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 8, 9 [a ažb) a 10 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojování plasmidů schopných vylučování heterologických genů (ve znázorněném případě somatostatinu) ve formě fúzí s částí trp E polypeptidu; z těchto fúzovaných bílkovin lze heterologické peptidy později specificky odštěpit.

Na obr. 9a (a) znamená 5‘->3‘· digescí komplementárního vlákna LE‘ strukturálního genu lambda-exonukleázou, (b) znamená připojení oligonukleotidu 26, ³²pCCTGTGCATGAT na vzdálenější konec LE‘ kódujícího vlákna a (c) znamená Klenowovu polymerázu I (5‘->3‘-polymeráza) + 4 dNTP (a 3‘->5‘ exonukleáza).

Obr. 11 znázorňuje výsledky dělení buněčné bílkoviny obsahující homologické (trp E) a heterologické fúzované bílkoviny vhodné pro produkci například somatostatinu, thymocinu alfa 1, lidského proinsulinu а А а В řetězců lidského insulinu, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.

Obr. 12 a 13 znázorňují postupné stupně způsobu, při kterém plasmid vytvořený postupem znázorněným na obr. 8 až 10 včetně je zpracován tak, aby vytvořil systém, ve kterém se mohou zaměnitelně vylučovat jiné heterologické geny ve formě fúzí s polypeptidickými sekvencemi trp E peptidu.

Na uvedených obrázcích jsou z důvodu jasnosti ilustrace zobrazeny ve většině případů jen kódovací řetězce dvojvláknového; plasmidu a lineárních DNA. Geny kódující resistenci vůči antibiotikům jsou označeny ap^R (resistence vůči ampicilinu), a tc^R (re· sistence vůči tetracyklinu). Označení tc^s znamená gen pro teracyklinovou resistenci, který není pod kontrolou promotorovéhooperátorového systému, takže plasmldy obsahující tento gen nemohou být nikdy citlivé na tetracyklin. Legenda ,,aps“ značí ampicilinovou citlivost vzniklou vynecháním části genu kódující ampicilinovou citlivost. Plasmidické promotory a operátory jsou označeny „p“ a . ,,o“. Písmena A, T, F a C označují nukleotidy obsahující báze adenin, thymin, guanin a popřípadě cytosin. Význam dalších legend uvedených v obrázcích bude vysvětlen v následujícím textu.

Výhodná provedení způsobu podle vynálezu popsaná níže zahrnují použití řady běžně dostupných restrikčních endonukleáz identifikovaných v dalším popisu; jejich odpovídající rozpoznávací sekvence a vzory štěpení (místa štěpení jsou označeena šipkami) jsou znázorněny níže:

Označení	nukleotidové sekvence	Označení	nukleoiidové sekvence
endonukleázy	a místo štěpení	endonukleázy	a místo štěpení .
Xbal	1 TCTAGA	Taql	τ TCGA
' 'L* - ’г	AGATCT		AGCT
EcoRI	4- Ť GAATTC	HindlII	A Ť AAGCTT
	CTTAAG		TTCGAA
	Ť		t
	AGATCT
BglII	Hpal	GTTAAC
	TCTAGA GAGCTG		CAATTG
PvuII		Ť i
GTCGAC	Pstl	CTGCAG
BamHI	GGATCC		GACGTC 1
	CCTAGG

Když jsou body štěpení prostorově umístěny odděleně na příslušných řetězcích, jsou rozštěpené konce „lepivé“ (záchytné), tj. schopné opětovné anelace [uzavření kruhu) nebo schopné připojení na jiné komplementární DNA zakončené lepivým . koncem, podle Watsonova-Crickova principu párování bází (A s T a G s C) na principu drážky a čepu.

Některé restrikční enzymy, jako shora uvedený Hpal a PvulI štěpí řetězec DNA za vzniku „otupených“ konců. Shora uvedené nukleotidové sekvence jsou znázorněny v souhlase s běžnými konvencemi: vrchní řetězec je řetězec kódující bílkoviny a při postupu zleva doprava po zmíněném řetězci jde o. pohyb z jeho 5‘-konce na 3‘-konec, tj. ve směru transkripce od „bližšího“ ke vzdálenějšímu“ bodu.

Posléze v souhlase s konvencemi, symbol „A“ značí deleci (vynechání určité sekvence). Tak například označení plasmidů „AEcoRI—Xbal“ popisuje plasmid, ze kterého byla odstraněna nukleotidická sekvence mezi místy působení restrikčních enzymů EcoRI a Xbal digescí těmito enzymy. Pro lepší názornost jsou některé delece označena čísly.

Tak například, počínaje prvním párem bází („bp“) rozpoznávacího místa enzymu EcoRI, který předchází genu pro tetracyklinovou resistenci v rodičovském plasmidů pBR322, značí „Δ1“ vynechání párů bp 1 až 30 (tj. AEcoRI až HindlII) a z toho· vyplývající eliminaci tetracyklinového promotorového - operátorového systému; „A2“ značí deleci bp 1 až 375 (tj. AEcoRI až BamHI) a z toho vyplývající odstranění jak tetracyklínového promotoru - operátoru, tak strukturálního genu, který kóduje tetracyklinovou resistenci; a „A3“ značí vynechání sledu bp 3 611 až 4 359 (tj. APstl až EcoRI) a v důsledku toho eliminaci ampicilinové resistence. Symbolu „A4“ se používá k označení odstranění sekvence bp --· 900 až ~ 1 500 z trp operónového fragmentu 5 (viz obr. 1) a v důsledku toho* eliminaci strukturálního genu pro polypeptid trp D.

Hlavní trp sekvence je vytvářena páry bází (bp) 1 až 162, počínaje od výchozího bodu pro trp mRNA. Čtrnáct aminokyselin uvedeného hlavního trp polypeptidu je zakódováno páry bp 27 až 71, následujících za ATG nukleotidy, které kódují startovní signál pro translaci. Oblast trp útlumového článku zahrnuje postupně GC-bohaté a AT238645

-bohaté nukleotidové sekvence, ležící mezi bp 114 až 156, a útlum je zřejmě způsobován inRNA nukleotidy zakódovanými páry ~ 134 až 141 hlavní sekvence. Aby došlo k expresi heterologického polypeptidu za řízení trp hlavním ribozómovým vazebným místem a současně aby se zamezilo útlumu, musí být sledována následující kritéria:

1. páry bází 134 až 141 nebo ještě následující musí být vynechány;

2. ATG kodón vloženého* genu musí být umístěn ve správné relaci vzhledem k ribozómovému vazebnému místu, jak je popsáno v literatuře [viz například kapitolu J. A. Steitze „Genetické signály a nukleotidické sekvence v informační RNA“ v monografii „Biological Regulation and Control“ (vydavatel R. Goldberger), Plenům Press, N. Y. (197^3)];

3. mají-li být produkovány homologicko-heterologické fúzované bílkoviny, musí zůstat dostupný startovní signál pro· translaci homologické polypeptidické sekvence, a kodóny pro homologickou část fúzované bílkoviny musí být včleněny ve fázi, aniž by zasahovaly do stop-signálů pro translaci.

Tak například vynecháním všech párů bází uvnitř hlavní sekvence, vzdálenějších od bp 70, se odstraní oblast útlumu, ponechá se ATG kodón, který kóduje startovní signál pro translaci a eliminuje se mezi nimi ležící stop-signál pro translaci kódovaný sekvencí TCA (bp 69 až 71], eliminací nukleotidu A a následujících nukleotidů. Vynechání takové sekvence má za následek expresi fúzovaných bílkovin začínajících hlavním polypeptidem· a končících proteinem zakódovaným příslušnou heterologickou vložkou, a včetně vzdálenější oblasti jednoho z polypeptidů za vedoucím trp operónem, určeného rozsahem vynechání sekvence ve směru k 3‘-konci.

Tak například vynechání zasahující do E genu vede k expresi homologického prekursoru obsahujícího sekvenci L a vzdálenější oblast sekvence E (za konečným bodem vynechané sekvence), fúzovaných se sekvencí kódovanou následující vložkou, a tak dále.

Dva zvláště vhodné plasmidy, ze kterých

a] ..............________ byla odstraněna oblast útlumu, jsou plasmidy pGMl a pGM3; viz publikaci G. F. Mozzariho a . spolupracovníků v časopise J. Bacteriology 133, 1457 (1978).

Tyto plasmidy mají popřípadě delece · trp ALE 1413 a trp ALE 1417 a vylučují (za kontroly trp promotoru - operátoru ] polypeptidy obsahující přibližně prvních šest aminokyselin hlavní trp sekvence a vzdálenější oblasti polypeptidu E. V nejvýhodnějším· případě, u plasmidu pGMl, je vylučována pouze asi poslední třetina polypeptidu E, zatímco plasmid pGM3 vylučuje · téměř celou vzdálenější polovinu kodónů polypeptidu E. Bakterie E. coli K—12, kmen W 3110 tna 2Trp- 102 obsahující plasmid pGMl jsou uloženy v americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture Collection) pod označením ATCC číslo 31 622. Plasmid pGMl se může z uvedeného· kmene odstranit obvyklým způsobem a lze ho pak používat v níže popsaných postupech.

Alternativně lze· delece některých sekvencí provádět způsoby podle vynálezu, které umožňují specifické štěpení dvojvláknové DNA na kterémkoliv žádaném místě. Jeden příklad této štěpící pracovní techniky je zřejmý z příkladu 4 uvedeného níže. Tak například se dvojvláknová DNA rozdělí na jednotlivá vlákna DNA v okolí oblasti zamýšleného místa štěpení, například reakcí s lambda-exonukleázou. K takto předem vytvořené jednovláknové části DNA se pak hybridizuje syntetický nebo jiný jednovláknový DNA primér, pomocí Watsonova-Crickova principu párování bází, přičemž sekvence priméru musí být účelně taková, aby zaručovala, že jeho 5‘-konec bude koterminální s nukleotidem na prvním vláknu DNA právě před určeným bodem štěpení. Primér se pak prodlouží směrem k 3‘-konci reakcí s DNA polymerázou, a tak se znovu sestaví ta část původní dvouvláknové DNA, která je před určeným místem štěpení a která byla v prvním stupni ztracena.

Současně nebo poté se část prvního vlákna DNA za určeným místem štěpení odstraní digescí vhodným enzymem. Postup je shrnut graficky v následujícím schématu, ve kterém „v“ označuje určené místo štěpení DNA:

určené místo· štěpení řetězce DNA „v“ • i._b) ....... v vytvoření jednovláknové DNA

....... v okolí „v“ ___ у_____ hybridizace priméru prodloužení priméru

digesce jednovláknové DNA za místem štěpení „v“

Ϊ4

Při výhodném způsobu provedení se stupně d) a ej znázorněného· postupu provádějí současně, za použití polymerázy, která současně digeruje vyčnívající jednoviákriový konec DNA ve směru 3‘ -> 5‘ a prodlužuje primér ve směru 5‘-> 3‘ (v přítomnosti dATP, dGTP, dTTP a dCTP). Vhodným materiálem pro uvedený účel je Klenowova polymeráza I, tj. fragment získaný proteolytickým štěpením DNA polymerázy I, který vykazuje 5‘ 3‘ polymerizační účinnost a 3‘ 5‘ exonukleolytickou aktivitu rodičovského enzymu, ale kterému chybí její 5‘ -> 3‘ exonukleolytická účinnost; viz A. Kornberg v monografii „DNA Synthesis“, str. 98, W. H. Freeman and Co., SFO [1974].

Za použití právě popsaného postupu lze provádět delece útlumové oblasti z plasmidu obsahujícím trp-opeerón, po jeho předchozí linearizaci, například štěpením v místě žádané restrikce, položeném níže od bodu, ve kterém má být molekula zakončena otupeným koncem (viz shora uvedené „v“). Opětovné uvedení plasmidu do kruhového tvaru následující po odstranění útlumové oblasti lze uskutečnit například navázáním „tupého“ konce molekuly nebo jinými způsoby, které jsou odborníkům známé.

Ačkoliv způsob podle vynálezu zahrnuje přímé vylučování heterologických polypeptidů za řízení trp promotorem - operátorem, týká se přednostní způsob jeho provedení vylučování fúzovaných bílkovin obsahujících jak homologické, tak heterologické sekvence, přičemž posléze uvedené polypeptidy se s výhodou dají odštěpit od prvých v extracelulárních prostředích. Zvláště výhodnými jsou takové fúze bílkovin, ve kterých se homologická část skládá z jedné nebo více aminokyselin z trp hlavního polypeptidu a asi z jedné třetiny nebo více trp E aminokyselinové sekvence (ze vzdálenějšího koncej. Takto získané fúzované bílkoviny se jeví podstatně stálejší vůči degradaci za podmínek exprese.

Bakterií E. coli K—12, kmene W 3110 tna 2Mrp- A 102 (pGMl), ATCC číslo 31 622, lze používat k rozšiřování kmenů plasmidu pGMl, kterých se podle vynálezu s výhodou používá k sestrojování trp-promotorových - operátorových systémů zbavených útlumové oblasti.

Tento kmen je v přítomnosti anthranilátu fenotypicky trp + a lze ho pěstovat na minimální živné půdě, jako například na půdě LB doplněné 50 ^g/ml anthranilátu. Všechny bakteriální kmeny používané při expresi řízené trp promotorem - operátorem podle vynálezu jsou trp represory+ („trp R+“) jako v případě divokého typu bakterií E. coli, čímž je zajištěna represe až do doby zamýšleného heterologického vylučování.

Při výhodném způsobu provedení se rekombinace DNA provádí v bakteriích E.

coli K—12, kmenu 294 (zakončení A, thl , hsr^_, hsm_k ⁺), ATCC číslo 31 446, což je bakteriální kmen, jehož membránové charakteristiky usnadňují transformace. Blasmidy produkující heterologické polypeptidy, vypěstované v kultuře kmene 294, se běžným způsobem extrahují a uchovávají v prostředí vhodného roztoku [například v roztoku 10 mmol tris (= tris/h.ydroxymethyl/aminomethan) a 1 mmol EDTD ( kyselina ethylendlamintetraoctová), pH 8] při teplotě v rozmezí asi od —20 °C do 4 °C. Na druhé straně, pro expresi peptidů za průmyslových podmínek, se podle vynálezu dává přednost odolnějšímu kmenu, tj. kmenu E. coli K—12 A_F~ RV 308 str¹’, gal 308 ' , označenému ATCC číslem 31 608.

Kmen RV 308 je nutričně divokým typem, roste dobře na minimální půdě a syntetizuje všechny nezbytné makromolekuly z běžných směsí amonných, fosforečnanových a horečnatých solí, stop kovů a glukózy. Po transformaci kultury RV 308 plasmidem odvozeným z kmene 294 se kultura pěstuje na agarových deskách v prostředí selektivním pro znak nesený plasmidem (jako; je například resistence vůči antibiotikům) a kolonie transformantů se vyberou a kultivují v baňkách. · Alikvotní díly posléze uvedené baňkové kultury v 10% roztoku dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo glycerolu (ve sterilních lékovkách] se rychle zmrazí v lázni z ethanolu a suchého ledu a uchovávají se při —80 °C. Za účelem produkce zakódovaného heterologického polypeptidů. se vzorky takto uložené kultury pěstují v prostředí obsahujícím tryptofan, čímž se potlačí trp-promotor - operátor, pak se systém zbaví přídatného· tryptofanu a tím dojde k vylučování peptidu.

Pro první stupeň kultivace se dá použít například LB živného prostředí (viz J. H. Miller v monografii „Experiments in Molecular Genetics“, str. 433, Cold Spring Harbor Laboratory 1972), které obsahuje na každý litr roztoku 10 g tryptonu, 5 g kvasničného extraktu, a 10 g chloridu sodného; Inokulant se s výhodou kultivuje do· optické hustoty (dále označované zkratkou „o. d.“) o hodnotě 10 nebo více (při 550 nm), výhodněji do o. d. 20 a nej výhodně ji do o. d. 30 nebo více, nicméně na o. d. menší, než má stacionární fáze.

Za účelem dereprese a exprese polypeptidických produktů se ionkulant poté kultivuje za podmínek, které zbavují buňky přidaného tryptofanu. Jedno z vhodných živných prostředí pro· tento druh kultivace je půda M9 [viz J. H. Miller, shora uvedená monografie, str. 431), připravená následujícím způsobem (uvedeno množství substancí na jeden litr roztoku):

dihydrogenfosforečnan draseln ý 3g hydrogenfosforečnan sdduý 6g chlorid sodný0,5 g chlorid amonný 1g

Roztok se autoklávuje a pak se přidá:

ml 0,01 M roztoku bezvodélio chloridu vápenatého, ml 1 M roztoku bezvodého síranu horečnatého, ml 20% roztoku glukózy, ^g/ml vitamínu B_b jíg/ml kaseinového aminokyselinového hydrolyzátu.

Posléze uvedený aminokyselinový dodatek živné půdy je hydrolyzát kaseinu prostý tryptofanu.

Aby se dosáhlo vylučování heterologického polypeptidu, zředí se inokulant vypěstovaný na živné půdě bohaté na tryptofan například větším objemem prostředí neobsahujícím další tryptofan (například 2- až 10násobné zředění) a pěstujee se až do dosažení žádané hladiny (výhodně krátce po stacionární fázi růstu); žádaný produkt se získá běžným způsobem lýzou, centrifugací a dalším· čištěním. Ve fázi kultivace, při které se buňky zbavují tryptofanu, se buňky pěstují s výhodou od stupně o. d. vyšší než 10, ještě výhodněji do o. d. vyšší než 20 a nejvýhodněji do o. d. 30, nebo vyšší (měřeno při 550 nm) a pak se izoluje žádaný produkt.

Všechny rekornbinace DNA popsané v následujících příkladech byly provedeny v souhlase se směrnicemi Národních zdravotnických ústavů pro výzkum rekombinovaných DNA.

př_íklad 1

Exprese bílkoviny fúzované s trp D polypeptidem

Výhodný způsob vylučování fúzovaných bílkovin obsahujících žádané polypeptidy a na ně navázanou část aminokyselinové sekvence trp D polypeptidu, kterou lze oddělit in vitro prostřednictvím aminokyseliny methionlnu, specificky citlivé na štěpení bromkyanem, je popsán ve vztahu k obr. 1 až 3.

A. Konstrukce plasmidu pBRHtrp

Plasmid pGMl (1 na obr. 1) nese tryptofanový operón E. coli mající vynechanou oblast Δ LE 1 413 [ viz G. F. Miozzari a spolupracovníci, časopis J. Bacteriology (1978), 1457 až 1466], a proto vylučuje fúzovanou bílkovinu obsahující prvních 6 aminokyselin hlavní trp sekvence a přibližně poslední třetinu trp E polypeptidu (dále označovanou jako· LE‘) a rovněž trp D polypeptid ve svém celku, vše pod kontrolou promotorového - operátorového systému.

Plasmid (20 ₍ag) se digeruje restrikčním enzymem PvulI, který štěpí plasmid na pěti místech. Fragmenty 2 genu se poté kombinují s EcoRI články (obsahujícími vlastní komplementární oligonukleotid 3 o sekvenci pCATGAATTCATG), čímž se umožní za pojit EcoRI mísíte·' štěpení posléze uvedeného fragmentu a vytvořit plasmid obsahující oblast EcoRI (20).

Na 20 ug DNA--ragmentů 2 získaných z pGMl shora uvedeným způsobem se nechá působit 10 jednotek T4 DNA-hgázy v přítomnosti 200 pmol syntetického 5‘-fosforylovaného oligonukleotidu pCATGAATTCATG (3) a 20 μΐ T4 DNA ligázového pufru (20 mmol tris o pH 7,6, 0,5 mmol ATP, 10 mmol bezvodého chloridu horečnatého a 5 mmol dithiothreitolu) při teplotě 4 °C přes noc. Roztok se pak 10 minut zahřívá na 70 °C, aby se přerušilo spojování. Získané konjugáty se poté rozštěpí digescí s restrikčním enzymem EcoRI a fragmenty, obsahující nyní EcoRI konce, se izolují za použití elektroforézy na 5% polyakrylamidovém gelu (tento postup je v dalším popisu označován jako „PAGE - elektroforéza“).

Tři největší fragmenty se z gelu izolují, po předchozím obravení ethidiumbromidem a určení jejich polohy v ultrafialovém světle, vyříznutím příslušných částí gelové vrstvy obsahujících žádané produkty. Každý vyříznutý fragment gelové vrstvy se umístí spolu s 300 ₍al 0,1 x TBE pufru do dialyzační komory a podrobí se elektroforéze při 100 V po dobu 1 hodiny v 0,1 x TBE pufru (TBE pufr obsahuje 10,8 g tri-báze, 5,5 g kyseliny borité, 0,09 g Na^EDTA v 1 litru vody).

Vodný roztok z dialyzační komory se spojí, extrahuje se fenolem a chloroformem, pak se upraví chloridem sodným na 0,2 M roztok a žádaný fragment DNA se získá po· vysrážení ethanolem ve vodném roztoku. (Všechny izolace DNA fragmentů popsané dále byly prováděny pomocí PAGE elektroforézy a následující elektroelucí právě uvedeným způsobem). Získaný gen obsahující trp-promotor - operátor a EcoRI „lepivé“ konce 5 byl identifikován dále popsaným postupem, který spočívá v zavedení zmíněných fragmentů do plasmidu 6 citlivého na tetracyklin, který se po uvedeném včlenění promotoru - operátoru stane resistentním vůči tetracyklinu.

B. Sestrojení plasmidu pBRHtrp vylučujícího· residenci vůči tetracyklinu za kontroly trp-promotoru - operátoru a identifikace a rozmnožení DNA fragmentu obsahujícího trp-promotor - operátor, který byl izolován shora popsaným způsobem (A.)

Plasmid pBRHl 6 [viz R. I. Rodriguez a spolupracovníci v časopise Nucleic Acids Research 6, 3267 až 3287 (1978)] vylučuje residenci vůči ampicilinu a obsahuje gen pro retistenci vůči tetracyklinu, který však, poněvadž není připojen na promotor, nevylučuje posléze zmíněnou resistenci. Plasmid je proto· citlivý vůči tetracyklinu. Zavedením promotorového - operátorového· systému přítomnoého v EcoRI oblasti se plas238645

18 mid může stát resistentním vůči tetracyklinu.

Plasmid pBRH! se digeruje restrikčním enzymem EcoRI, enzym se odstraní fenolovou extrakcí a následující extrakcí chloroformem a po: vysrážení ethanolem se DNA získá ve vodném prostředí. Vzniklá molekula DNA 7 se pomocí T₄ DNA ligázy váže shora popsaným způsobem, v oddělených reakčních směsích, s každým ze tří jednotlivých DNA fragmentů, získaných postupem DNA přítomná v reakční směsi se použije uvedeným výše v části A. Rekombinovaná k transformaci příslušných bakterií E. coli K—T2, kmene 294, popsaných K. Backmanem a spolupracovníky v časopisu Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 73, 4 T74 až 4T98 (T976) a označených ATCC číslem 3T 448, standardní pracovní technikou; bakterie se naočkují na misky s agarem s minimální LB-půdou obsahující 20 ^g/ml ampicilinu a 5 ,ug/ml tetracyklinu. Vyrostlé tetracyklin-rezistentní kolonie se vyberou, plasmidická DNA se vyizoluje a přítomnost žádaného fragmentu se potvrdí restrikční enzymatickou analýzou.

Získaný plasmid 8, označený pBRHtrp, vylučuje Ř-laktamázu, která mu uděluje rezistenci vůči ampicilinu, a obsahuje fragment DNA zahrnující trp-promotor - operátor a kódující první bílkovinu složenou z prvních šesti aminokyselin hlavní trp sekvence fúzovaných s přibližně poslední třetinou trp E polypeptidu (tato: část polypeptidu je označena LE‘j, a druhou bílkovinu odpovídající přibližně první polovině trp D polypeptidu (tato část polypeptidu je označena D‘], a třetí bílkovinu kódovanou pro tetracyklinovou rezistenci genu.

C. Začlenění genů pro různé konečné polypeptidické produkty a vylučování posléze uvedených produktů ve formě fúzovaných bílkovin složených z konečného polypeptidu a specificky odštěpitelného trp D polypeptidického prekursoru (obr. 2]

Z plasmidu pBRHtrp se získá fragment DNA obsahující trp-promotor - operátor a kodóny pro LE‘ a D‘ polypeptidy, který se vloží do plasmidu obsahujícího strukturální geny pro tvorbu různých žádaných polypeptidů, jak je dále ukázáno na příkladu somatostatinu (viz obr. 2).

Plasmid pBRHtrp se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a získaný fragment 5 se izoluje za použití PAGE elektroforézy a elektroeluce. Produkt 10, získaný EcoRI digescí plasmidu pSom TT 9 [viz K. Itakura a spolupracovníci v časopisu Science T98, T 056 (T977)]; britský patent č. 2 007 676 A, se kombinuje s fragmentem 5.

Na směs se působí T> DNA ligázou, jak bylo popsáno: výše, a získanou DNA se transformují shora uvedeným způsobem bakterie E. coli K—T2, kmene 294. Selekce transformovaných bakterií se provede na aga.rových deskách obsahujících ampicilin. Získané vůči ampicilinu resistentní kolonie se hybridizují sloupcovou pracovní technikou [viz M. Gruenstein a spolupracovníci v časopise Proč. Naťl. Acad. Sci. USA ,72, 3 95T až 3 965 (T975)], za použití vzorku fragmentu 5 obsahujícího trp-promotor - operátor, izolovaného z pBRHtrp, který byl radioaktivně značen fosforem P4

Provede se selekce kolonií, které jsou pozitivní při sloupcové hybridizaci, plasmidická DNA se izoluje a umístění vložených fragmentů se stanoví restrikční analýzou za použití restrikčních anzymů Bglll a BamHl při dvojité digesci.

Bakterie E. coli 294 obsahující plasmid označený pSOM7 A2 TT, který obsahuje trp promotorový - operátorový fragment v žádané orientaci, se kultivují v živné půdě LB obsahující T0 ^g/ml ampicilinu. Buňky se pěstují do dosažení hustoty o. d. T (při 550 nm), pak se odcentrifugují a suspendují se znovu v desetinásobném zředění do živné půdy M9. Buňky se kultivují 2 až 3 hodiny, opět do optické hustoty T, pak se lyžují a celková buněčná bílkovina se analyzuje za použití elektroforézy na PAGE obsahujícím T5 % SDS-močoviny (SDS := dodecylsulfát sodný) [viz J. V. Maizel a spolupracovníci v časopise Meth. Viral 5. T80 až 246 (T97T)]. '

Na obr. 3 je znázorněna gelo-vá analýza bílkovin, při které byla celková bílkovina získaná z různých kultur rozdělena na jednotlivé složky. Hustota jednotlivých pásů je měřítkem množství, ve kterém jsou jednotlivé bílkoviny přítomny. Na uvedeném obrázku představují dráhy .1 a 7 kontrolní vzorky zahrnující různé bílkoviny s předem stanovenou polohou, které slouží je^k^o· body pro srovnávání. Dráhy 2 a 3 znázorňují dělení celulární bílkoviny získané z kolonií E. coli 294 transformovaných plasmidem pSom7 Δ2, kultivovaných jednak na : živné půdě LB (dráha 2), jednak na půdě M9 [dráha 3).

Dráhy 4 a 5 znázorňují dělení celulární bílkoviny získané z analogických buněk E. coli 294 transformovaných plasmidem pThr-7 Δ2, tj. plasmidem vylučujícím thymosin; uvedený plasmid se získá v podstatě stejnými postupy jak již bylo popsáno výše, počínaje plasmidem· pThal (viz publikovaná přihláška evropského patentu č. 0 035 454],

Dráha 4 znázorňuje dělení buněčné bílkoviny získané z bakterií E. coli 294/pTh«7 Δ2 kultivovaných na LB půdě, a dráha 5 znázorňuje dělení buněčné bílkoviny získané ze stejného transformanta kultivovaného na půdě M9. Dráha 6 je další kontrola a znázorňuje rozdělení rodičovské bílkoviny z bakterií E. coli 294/pBR322, pěstovaných na LB půdě.

Ze srovnání s kontrolami vyplývá, že nejhořejší ze dvou největších párů v každé z drah 3 a 5 patří předpokládaným polohám

1· bílkovin vylučovaných ve formě fúzovaného proteinu skládajícího se z D‘ polypeptidu a somatostatinu, popřípadě thymosinu (další hlavní pásy představují LE‘ polypeptid vznikající vynecháním útlumové oblasti). Obr. 3 potvrzuje, že exprese je v živné půdě bohaté na tryptofan potlačena, ale naopak uvolněna za podmínek s nedostatkem tryptofanu v půdě.

D. Štěpení bílkovin bromkyanem a radioimunostanovení hormonálního produktu

V obou případech, jak u bílkoviny obsahující thymosin, tak u bílkoviny obsahující somatostatin, byla celková buněčná bílkovina rozštěpena bromkyanem, rozštěpený produkt izolován a po vysušení suspendován v pufru a analyzován radioimunometodou; bylo potvrzeno, že získané produkty jsou imunologicky identické se somatostatinem, popřípadě hymosinem. Štěpení bromkyanem je popsáno D. V. Goeddelem a spolupracovníky v časopise Proč. Nat‘1. Acad Sci. USA 76, str. 106 až 110 (1979).

Příklad 2

Konstrukce plasmidů pro přímé vylučování heterologických genů za kontroly trp-promotorového - operátorového systému

Pro strategii přímého vylučování je nezbytné sestavit plasmid obsahující jediné restrikční místo vzdálené od všech kontrolních prvků trp-operónu, do kterého mohou být začleněny heterologické geny místo hlavní trp-sekvence a ve vhodné prostorové relaci k ribozómovému vazebnému místu pro hlavní trp polypeptid.

Přístup k dosažení přímého vylučování heterologických peptidů je v dalším popsán na příkladu vylučování lidského růstového hormonu.

Plasmid pSom7 Δ2 (10 ^g) se rozštěpí restrikčním enzymem EcoRI a DNA fragment 5, obsahující tryptofanové genetické prvky, se izoluje pomocí PAGE elektroforézy a elektroeluce. Získaný fragment [2 ug) se digeruje 10 minut při 37 °C dvěma jednotkami restrikční endonukleázy Taq I tak, aby se v každé molekule rozštěpilo v průměru pouze jedno z přibližně pěti Taq I restrikčních míst. Získaná směs částečně rozštěpených fragmentů se rozdělí PAGE elektroforézou a fragment 12 (viz obr. 4), který obsahuje přibližně 300 párů bází, jeden den EcoR I konec a jeden Taq I konec, se izoluje elektroelucí. Příslušné Taq I restrikční místo je umístěno mezi místy pro· start transkripce a pro start translace a je o 5 nukleotidů vzdálené od ATG kodónu hlavního· trp peptidu.

DNA sekvence okolo tohoto místa je znázorněna na obr. 4. Uvedeným postupem lze izolovat fragment obsahující všechny kontrolní prvky trp-operónu, tj. promotorový

- operátorový systém, signál pro· iniciaci transkripce a trp-hlavní ribosomové vazebné místo.

Zbytek Taq I na konci 3‘ získaného fragmentu, sousedící se signálem pro start translace pro hlavní trp-sekvenci, se poté převede do· Xba I místa plasmidů pHS₃2 s vynechanou sekvencí EcoR I — Xba I, způsobem znázorněným na obr. 5. Tato operace se provede navázáním fragmentu 12, získaného shora uvedeným postupem, na plasmid obsahující ' jediné (to znamená jen jedno) EcoR I a jediné Xba I restrikční místo. Pro tento účel lze použít v podstatě jakéhokoliv plasmidu obsahujícího, v následujícím pořadí, replik m, selektivní znak, jeho resistenci vůči antibiotikům, a EcoRI, Xbal a BamHI restrikční místa. Tak například lze Xbal restrikční místo zavést mezi EcoRI a BamHI místa plasmidů pBR322 [viz F. Bolivar se spolupracovníky v časopisu Gene 2, 95 až 119 (1977)], například rozštěpením plasmidů v jeho jediném Hind III restrikčním místě pomocí enzymu Hind III, následující digescí vzniklých „lepivých“ konců specifickou jednovláknovou nukleázou a navázáním „tupých“ konců samoanelujícího dvouvláknového syntetického nukleotidu obsahujícího žádané rozpoznávací místo, jako sekvenci CCTCTAGAGG. Alternativně lze použít DNA fragmentů získaných z přirozených plasmidů, jak je tomu v dále popsaném případě, které obsahují jediné · Xbal restrikční místo mezi EcoRI a BamHI štěpnými zbytky. Tak například digescí virového genúmu hepatitidy B enzymy EcoRI a BamHI se obvyklým způsobem získá produkt, který se začlení do EcoRI a BamHI restrikčních míst plasmidů pGH6 [viz D. V. Goeddel a spolupracovníci v časopisu Nátuře · 281, 544 (1979)] za vzniku plasmidů pHS32.

Získaný plasmid pHS32 se rozštěpí enzymem Xbal, směs se extrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a soli se vysráží ethanolem. Na rozštěpený plasmid se působí 1 μΐ E. coli polymerázy I, Klenowovým fragmentem v prostředí 30 μ1 polymerázového· pufru (tj. 50 mmol fosforečnanu draselného o pH 7,4, 7 mmol chloridu hořečnatého bezv. a 1 mmol ,6-merkaptoethanolu) obsahujícího 0,1 mmol dTTP a 0,1 mmol dCTP, po dobu 30 minut při 0 °C a pak 2 hodin při 37 °C. Při této reakci se doplní dva ze 4 nukleotidů, komplementárních k 5‘ vyčnívajícímu konci Xbal štěpícímu místu:

5‘ CTAGA— 5 ‘ CTAGA—

3‘ T— 3‘ TCT— .

Inkorpurují se dva nukleotidy, dC a dT, a vznikne konec se dvěma 5‘ vyčnívajícími nukleotidy. Tento lineární zbytek plasmidů pHS32 (izolovaný po extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vysrážení ethanolem ve vodném prostředí) se štěpí restrikč238645 ním enzymem EcoRI. Velký plasmidický fragment 13 se oddělí od menšího EcoRI — — Xbal fragmentu PAGE elektroforézou a izoluje se elektroelucí. Tento DNA-fragment plasmidu pHS32 (0,2 ^g] se naváže, za podmínek podobných těm, které byly popsány výše, na shora uvedeným způsobem získaný EcoRI — Taql fragment tryptofanového operónu 12 (-0,01 ^g), jak je znázorněno na obr. 5. Při tomto postupu se Taql vyčnívající konec naváže na Xbal zbývající vyčnívající konec naváže na Xbal zbývající vyčnívající konec, i když jeho báze nejsou kompletně spárovány podle Watsonova a Crickova principu:

- T CTAGA— —TCTAGA— —AGO ⁺ TCT- · ' —AGCTCT—

Částí takto získané reakční směsi ligantů se transformují buňky bakterií E. coli 294 stejným způsobem, jak bylo popsáno výše v příkladu 1, pak se na kulturu působí teplem a přeočkuje se na agarové desky s LB půdou obsahující ampicilin. Selekcí se získá 24 kolonií resistentních vůči ampicilinu, které se kultivují ve 3 ml LB půdy a plasmid se izoluje. Šest z těchto plasmidů má Xbal místo regenerované cestou bakkteriemi E. coli katalyzovaným přepárováním a replikací DNA:

—TCTAGA— —TCTAGA- —AGCTCT— — AG ATCT - .

Bylo rovněž nalezeno, že se tyto plasmidy štěpí jak restrikčním enzymem EcoRI tak Hpal, a poskytují očekávané štěpné fragmenty. Jednoho z těchto plasmidů 14, označeného pTrp 14, lze použít pro vylučování heterologických polypeptidů, jak je popsáno dále.

Plasmid pHGLI 107 [18 na obr. 6; viz publikaci D. V. Goeddela a spolupracovníků v časopisu Nátuře 281, 544 (1979)] obsahuje gen pro lidský růstový hormon, složený z 23 aminokyselinových kodónů produkovaných ze syntetických DNA fragmentů, a ze 163 aminokyselinových kodónů získaných z komplementární DNA vytvořené cestou reverzní transkripce informační RNA pro lidský růstový hormon. Tento gen 21, i když mu schází kodóny předcházející sekvence (,,pre“sekvence) lidského růstového hormonu, obsahuje ATG kodón pro iniciaci translace. Gen se izoluje z 10 ₍ug plasmidu pHOH 107 nejprve působením restrikčního enzymu EcoRI a poté připojením dTTP a dATP na získaný fragment působením Klenowo-vy E. coli polymerázy I, jak bylo již popsáno výše (viz obr. 6).

Vzniklý plasmid se extrahuje fenolem, pak chloroformem a soli se vysráží ethanolem a poté se rozštěpí enzymem BamHI (viz obr. 6). Vzniklý fragment 21, obsahující gen pro lidský růstový hormon („HGH“) se izoluje PAGE elektroforézou a následující elektoelucí. Výsledný DNA-fragment obsahuje rovněž prvních 350 nukleotidů strukturálního genu pro resistenci vůči tetracyklinu, ale chybí mu tetracyklino-vý promotorový - operátorový systém, takže když se v následujícím postupu začlení do plasmidu, který je schopný exprese, lze plasmidy obsahující tuto vložku určit podle obnovení tetracyklinové resistence. Protože EcoRI zakončení fragmentu 21 je doplněno postupem za použití Klenawovy polymerázy I, má zmíněný fragment jeden „tupý“ a jeden ,,lepivý“ konec, což mu zajišťuje správnou orientaci, když je později včleněn do plasmidu schopného exprese; viz obr. 6.

V dalším se upraví plasmid pTrp 14 schopný exprese tak, aby mohl přijmou shora uvedeným způsobem připravený fragment 21 obsahující HGH-gen. Plasmid pTrp 14 se za tím účelem digeruje enzymem Xbal a získané „lepivé“ konce fragmentu doplní za použití postupu s Klenowovou poiymerázou I a trifosfátů dATP, dTTP, dGTP a dCTP. Po extrakci reakční směsi fenolem, extrakci chloroformem a vysrážení ethanolem se na získanou DNA 16 působí enzymem BamHI a vzniklý velký fragment plasmidu 17 se izoluje PAGE elektroforézou a elektroelucí. Uvedený fragment 17 odvozený od pTrp 14 má jeden „tupý“ a jeden „lepivý“ konec, které mu zajišťují správnou orientaci při rekombinaci s fragmentem 21 obsahujícím HGH-gen a popsaným výše.

Fragment 21 obsahující HGH-gen a fragment 17 pTrp 14 AXba — BamHI se zkombinují a navzájem naváží za podmínek podobných těm, které byly popsány výše. Doplněné Xbal a EcoRI konce se naváží spolu s tupými konci za obnovení obou Xbal a EcoRI štěpících míst:

„„ TlCMGHATTCLAT G — —TCTAG —AGATC

AATTCTATG— TTAAGATAC— agatc\ttaa<gatac —

Xbal doplněný konec

EcoRI doplněný konec

Xbal EcoRI iniciace HGH-genu.

Touto konstrukcí se rovněž obnoví resistence genu vůči tetracyklinu. Jelikož plasmid pHGH 107 vylučuje tetracyklinovou re sistenci z promotoru ležícího dále od IIGH-genu (lac promotor), umožňuje výsledná konstrukce plasmidu 22, označená jako pHGH 207, vylučování genu pro tetracyklinovou resistenci za kontroly tryptofanového promotoru - operátoru. Směsí ligantů, produktů rekombinace, se transformují bakterie E. coli 294 a provede se selekce resistentních kolonií na agarových deskách s LB-půdou obsahující 5 ^g/ml tetracyklinu.

Aby se potvrdilo přímé vylučování lidského růstového hormonu plasmidem pHGH 207, byla celková buněčná bílkovina, která byla získaná z bakterií E. coli 294/pHGH 207, které byly kultivovány do optické hustoty 1 na LB půdě obsahující 10 ^g/ml ampicilinu, zředěny 1 : 10 do M9 půdy a kultivovány opět do o. d. 1, podrobena SDS-gelové elektroforéze jako ve shora uvedeném příkladu 1, a získaná data srovnána s analogickými výsledky elektroforézy lidského růstového' hormonu, získaného již dříve expresí postupem podle jiných autorů [D. V. Goeddel se spolupracovníky, časopis Nátuře 281, 544 (1979)]. Na obr. 7 je uveaena fotografie získané, obarvené gelové vrstvy po PAGE elektroforéze: Dráhy 1 a 7 obsahují standardy bílkovin o· různých známých polohách na elektrogramu. ·

Dráha 2 je kontrola a znázorňuje rozdělení celkové buněčné bílkoviny z bakterií E. coli, kmene 294 pBR322; dráha 3 znázorňuje rozdělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 107, kultivovaných na LB půdě; dráha 4 ukazuje dělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 107 kultivovaných na M9 půdě; dráha 5 znázorňuje dělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 207 pěstovaných na LB půdě; a dráha 6 znázorňuje rozdělení bílkovin z bakterií E. coli 294/pHGH 207 kultivovaných na M9 půdě.

Hustý pás v dráze B je lidský růstový hormon, jak je zřejmé ze srovnání s podobnými pásy v drahách 2 až 4. Jak je podle vynálezu předpokládáno, produkují mikroorganismy E. coli 294/pHGH 207 při kultivaci na LB půdě bohaté na typtofan méně lidského růstového hormonu z důvodu interakcí tryptofanového represoru s trp operátorem, a při kultivaci na M9 půdě produkují podstatně více zmíněného HGH než bakterie E. coli 294/pHGH 107 vzhledem k indukci silnějšího tryptofanového - přomotorového - operátorového systému vůči lac-promotorovému - operátorovému systému v pHGH 107.

Příklad 3

Sestavení plasmidu s obecnou expresí pro přímé vylučování heterologických genů pod kontrolou tryptofanového' - promotoru - operátoru

Plasmid pHGH 207 sestrojený v předcházejícím příkladu 2 se v dalším použije k získání fragmentu DNA obsahujícího kontrolní prvky tryptofanového operónu (s vynechanou útlumovou oblastí) a k sestrojení plasmidického „vylučovacího vektoru“ vhodného pro přímou expresi genových vložek o různé struktuře. Strategie pro sestavení plasmidu s obecnou expresí zahrnuje odstranění tryptofanové kontrolní oblasti z plasmidu pHGH 207 digescí restrikčním enzymem EcoRI a vsunutí získaného fragmentu do enzymem EcoRI digerovaného plasmidu pBRHl, používaného výše v příkladu 1.

Plasmid pBRHl je, jak již bylo výše uvedeno, plasmideem resistentním vůči ampicilinu a obsahujícím gen pro tetracykli.novou resistenci, ale je vůči tetracyklinu citlivý, nebol není přítomen vhodný promotorový -

- operátorový systém.

Výsledný plasmid pHKY 1, jehož zkonstruování je podrobněji popsáno níže a znázorněno na obr. 8, je resistentní jak vůči ampicilinu, tak vůči tetracyklinu, obsahuje tryptofanový - promotorový - operátorový systém, chybí mu tryptofanový útlumový článek a obsahuje jediné Xbal restrikční místo vzdálené od tryptofanového promotoru -

- operátoru.

Tryptofanový promotor - operátor a jediné Xbal místo jsou vázány mezi dvěma EcoRI štěpícími místy, takže uvedený fragment obsahující trp-promotor - operátor - Xbal místo lze odstranit a vsunout do plasmidu obsahujících jiné strukturální geny. Alternativně lze do tohoto· plasmidu vsunout další heterologické strukturální geny, buď do Xbal štěpícího místa, nebo (po parciální digesci enzymem EcoRI) do EcoRI restrikčního místa vzdálenějšího od tryptofanové kontrolní oblasti, v každém případě tak, aby přišel pod kontrolu tryptofanového· promotorového - operátorového systému.

Plasmid pHGH 207 se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a získaný trp promotorový fragment 23 obsahující EcoRI štěpící místo se izoluje za použití PAGE elektroforézy a následující elektroelucí.

Plasmid pBRHl se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a z konců rozštěpené molekuly se působením, bakteriální alkalické fosfatázy (,,ΒΑΡ“) (1 μξ, v prostředí 50 m-mol tris-pufru o pH 8 a 10 mmol bezvodého chloridu horečnatého, po dobu 30 minut při 65 °C) odstraní fosfátové skupiny na vyčnívajících EcoRI koncích. Přebytek bakteriální alkalické fosfatázy se odstraní extrakcí fenolem a extrakcí chloroformem a soli se vysráží ethanolem. Získá se lineární DNA 7a, které chybí fosfátové skupiny na vyčnívajících koncích a která přijímá a váže pouze vložky, jejichž komplementární „lepivé“ konce jsou fosforylovány, ale sama se neuzavírá do kruhového tvaru a dovoluje proto· snadnější zkoušení plasmidů obsahujících různé vložené části.

Fragment 23, získaný z plasmidu pHGH 207 a obsahující EcoRI, a lineární DNA získaná z plasmidu pBRHl 7a se zkombinují a vzájemně naváží v přítomnosti ligázy, způsobem, popsaným výše. Částí získané směsi se transformují bakterie E. coli kme2.3 8 64 5 ne 294, analogicky jak je popsáno výše, a mikroorganismy se kultivují na agarových deskách s LB půdou obsahující 5 ^g/ml tetracyklinu a touto selekcí se získá 12 kolonií resistentních na teracyklin. Z každé kolonie se izoluje plasmid a hodnotí se na přítomnost vsunutého fragmentu DNA restrikční endonukleázovou analýzou za použití štěpících enzymů EcoRI a Xbal. Jeden z takto získaných plasmidů obsahující žádanou vložku byl označen jako plasmid pHKYl.

P říklad 4

Sestrojení plasmidů obsahujícího tryptofanový operón, schopného exprese specificky štěpitelné fúzované bílkoviny obsahující 6 aminokyselin hlavního trp-peptidu, poslední třetinu trp E polypeptidu (označenou LE‘) a heterologický strukturální gen

Strategie pro sestrojení plasmidu vylučujícího fúzovanou bílkovinu s LE‘ polypeptidem zahrnuje následující stupně:

aj Zajištění genového fragmentu obsahujícího kodóny pro vzdálenou oblast LE‘ polypeptidu a majícího Bgl II, popřípadě EcoRI záchytné konce na 5‘ a 3‘ koncích kódujícího vlákna;

e] Eiiminace kodónů ze vzdálené o-bl^sii LE‘ genového fragmentu a kodónů pro trp D gen z plasmidů SOM 7 Δ2, vsunutí fragmentu získaného ve stupni aj a obnovení LE‘ kodóunvé sekvence bezprostředně za sekvencí heterologického genu pro somatostatin.

Jak je znázorněno na obr. 9a, plasmid pSom 7 Δ2 se digeruje enzymem Hind III a pak se digeruje lambda-exonukleázou (5'-> ->3‘ exonuklcáza] za podmínek zvolených tak, aby štěpení probíhalo za Bgl II restrikčním místem s LE‘ kódující oblastí; 20 /.g plasmidů pSom 7 Δ2 digerovaného enzymem Hind III se rozpustí v pufru (20 mmol glycinového pufru o pH 9,6, 1 mmol bezvodého chloridu horečnatého a 1 mmol ,β-merkaptoethanolu] a na směs se působí 60 minut při teplotě místnosti 5 jednotkami lambda-exonukleážy. Získaná reakční směs se extrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem.

Aby se posléze vytvořil EcoRI zbytek na vzdálenějším konci LE‘ genového fragmentu, syntetizuje se zlepšenou fosfortriesterovou metodou [viz R. Crea se spolupracovníky, časopis Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1979]] primér o složení 32pCCTGTGCATGAT a hybridizuje se s jednovláknovým koncem LE‘ genového fragmentu, získaným digescí lambda-exonukleázou. Hybridizace se provádní níže popsaným způsobem.

gg fragmentu, získaného· působením lambda-exonukleázy na produkt digesce plasmidů pSom7 Δ2 enzymem Hind III, se rozpustí ve 20 μ! vody a k roztoku se přidá 6 μΐ roztoku obsahujícího asi 80 pmol shora popsaného 5‘-fosforylovaného- oligonukleotidu. Syntetický fragment se hybridizuje na 3‘ konec LE‘ kódující sekvence a zbývající jednovláknová část LE· fragmentu se doplní výše popsaným postupem s Klenowovou polymerázou I, za použití trifosfátů dATP, dTTP, dGTP a dCTP.

Reakční směs se zahřeje na 50 ^f'C a pak se nechá zvolna vychladnout na 10 °C; poté se přidá Klenowova polymeráza.. Po 15 minutách inkubace při teplotě místnosti a následujících 30 minutách inkubace při 37 °C se reakce zastaví přidáním 5 μΐ 0,25 M EDTA. Reakční směs se vyextrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží se ethanolem. Získaná DNA 28 se poté štěpí restrikčním enzymem Bgl II a fragmenty se rozdělí PAGE elektroforézou. Pomocí autoradiogramu gelové vrstvy se zjistí poloha 'Označeného fragmentu o očekávané délce řetězce přibližně 470 bp, a tento fragment se izoluje elektroelucí. Jak již bylo nastíněno výše, tento- fragment LE‘ (d) má · Bgl II konec a druhý konec „tupý“, koincidující se začátkem priméru.

Plasmid pThal popsaný výše v příkladu 1, části C, · nese, strukturální gen pro· thymosin alfa jedna, zakódovaný svým 5‘ koncem kódujícího vlákna do EcoRI místa a svým 3‘ koncem do BamHI místa. Jak je znázorněno na obr. 9b, obsahuje thymoclnový gen rovněž Bgl II štěpící místo.

Plasmid pTlnal obsahuje též gen specifikující resistenci vůči ampicilinu. Za účelem sestrojení plasmidů schopného¹ přijmout shora uvedeným způsobem připravený fragment LE‘ (d] 29, se pThrd digeruje restrikčním enzymem EcoRI a pak se provede reakce s trifofsáty dTTP a dATP v přítomnosti Klenowovy polymerázy, aby se „otupily“ EcoRI zbytky. Digescí získaného produktu enzymem Bgl II se získá lineární DNA fragment 33 obsahující gen pro· ampicilinovou resistenci a na opačném konci „lepivý“ Bgl II zbytek a na bližším konci „tupé“ zakončení. Vzniklý produkt se dá znovu uzavířt do kruhu reakcí s LE‘ (d) fragmentem 29 obsahujícím Bgl II záchytný konec a „tupý“ konec, v přítomnosti T4 DNA-ligázy, a získá se plasmid pTrp 24 (34 viz obr. 9b]. Při tom se znovu vytvoří EcoRI štěpné místo v· té poloze, kde dojde k vazbě s „tupým“ koncem.

Jak je znázorněno na obr. 10, postupná digesce plasmidů pTrp 24 restrikčními enzymy Bgl II a EcoRI a následující izolace produktu, za použití PAGE elektroforézy a elektroeluce, poskytne fragment mající kodcny pro LE‘ (d) polypeptid s Bgl II „lepivým“ koncem a EcoRI „lepivým“ koncem sousedícím s jeho 3' kódujícím zakončením. Získaný LE‘ (d) fragment 38 se dá začlenit do Bgl II místa plasmidů pSom7 Δ2 za vytvoření fúzované bílkoviny složené z LE‘ polypeptidu a somatostatinu, která je vylučována za kontroly tryptofanového promotoru - operátoru, jak je znázorněno na obr. 10. Aby se shora popsané začlenění fragmentu 38 dalo provést, je třeba 1) částečně digerovat enzymem EcoRI plasmid pSom7 Δ2 za účelem jeho· rozštěpení v EcoRI místě vzdálenějším od tryptofanového promotoru - operátoru, jak je znázorněno na obr. 10, a 2] vhodně zvolit sekvenci priméru (viz obr. 9a), za účelem udržení správné translační stavby kodónu a znovu sestavit plasmid v EcoRI štěpném místě.

Tak například se 16 ^g plasmidu pSom7 Δ2 zředí do 200 μ! pufru obsahujícího 20 mmol tris o pH 7,5, 5 mmol bezvodého chloridu hořečnatého, 0,02 mmol detergentu NP 40 a 100 mmol chloridu sodného, a působí se na něj 0,5 jednotkami restrikčního enzymu EcoRI. Po 15 minutách působení při 37 stupních Celsia se reakční směs vyextrahuje fenolem, extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem a produkt se poté digeruje enzymem Bgl II. Vzniklý větší fragment 36 se izoluje za použití PAGE elektroforézy a elektroeluce. Tento fragment obsahuje kodóny LE‘ (p) pro bližší konec LE‘poíypeptidu, tj. kodóny, které leží za Bgl II štěpícím místem.

Fragment 36 se pak naváže na fragment 38 v přítomnosti T^ DNA ligázy za vzniku plasmidu pSom7 Δ2 Δ4, kterým se pak transformují bakterie E. coli kmene 294 způsobem popsaným výše a účinně se tok produkuje, pocl kontrolou tryptofanového promotoru - operátoru, fúzovaná bílkovina skládající se z plně rekonstituovaného LE‘ polypeptidu a ze somatostatinu.

Fúzovaná bílkovina, ze které může být somatostatin specificky odštěpen vzhledem к přítomnosti methioninu na 5‘ konci somatostatinové sekvence, se oddělí shora popsaným způsobem, za použití elektroforézy na sodiumdodecylsulfát-polyakrylamidovém genu.

Na obr. 11 je fúzovaný protein patrný jako· nejzřetelnější pás v dráze 6 (bližší podrobnosti к obr. 11 jsou uvedeny v níže uvedeném příkladu 5).

Příklad 5

Sestrojení systému pro vylučování trp LE^ť polypeptidických fúzí, ve kterých je umístěna resistence vůči tetracyklinu, za kontroly tryptofanového promotoru - operátoru

Strategie pro sestrojení vylučovacího prostředku schopného přijímat rozličné heterologické polypeptidické geny pro expresi odpovídajících bílkovin ve formě fúzí s trp-LE‘ polypeptidem pod kontrolou tryptofanového' operónu, zahrnuje zkonstruování plasmidu majícího následující charakteristiky:

1) Resistenci vůči tetracyklinu, která se však může ztratit v případě, že se od straní promotorový - operátorový systém kontrolující geny specifikující takovou resistenci;

2) Odstranění promotorového - operátorového systému, který kontroluje resistenci vůči tetracyklinu, a opětovné uzavření získaného lineárního fragmentu do kruhového tvaru navázáním zvoleného heterologického genu a tryptofanového promotorového - operátorového systému ve vhodné translační fázi vzhledem к němu, čímž se obnoví resistence vůči tetracyklinu a v důsledku toho se umožní identifikace plasmidu obsahující vložený heterologický gen.

Ve stručnosti lze shrnout, že v souhlase s povahou uvažovaných vložených sekvencí je účelem sestrojit DNA mající Pst zbytek na svém 3‘ konci, zbytek na svém 5‘ konci a vlastnící gen specificky schopný vytvářet resistenci vůči tetracyklinu, když se uvede pod kontrolu promotorového - operátaorového systému.

Tak například, jak je znázorněno na obr. 12, se plasmid pBR322 digeruje enzymem Hind III a vyčnívající Hind III konce se poté digerují S1 nukleázou.

Posléze uvedená digesce spočívá v tom, že se na 10 vg plasmidu pBR322 rozštěpeného enzymem Hind III působí v prostředí 30 μ\ pufru S1 (0,3 mol chloridu sodného, 1 mmol bezvodého chloridu zinečnatého, 25 mmol octanu sodného, pH 4,5) 300 jednotkami nukleázy S1 po· dobu 30 minut při 15 stupních Celsia.

Reakce se zastaví přidáním 1 μΐ 30 X S1 přerušovacího roztoku pro S1 nukleázou (0,8 mol tris-báze a 50 mmol EDTA), směs se vyextrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem. Získaný produkt 45 se digeruje výše popsaným způsobem štěpícím enzymem EcoRI a ze vzniklé směsi štěpů se velký fragment 46 izoluje PAGE elektroforézou a elektroelucí. Takto získaný fragment má jeden EcoRI „lepivý“ konec a druhý „tupý“ konec, jehož kódovací vlákno začíná nukleotidem thymidinem.

Jak bude ukázáno v dalším popisu, může se S1 digerovaný Hind III zbytek začínající thymidinem připojit na Bgl II zbytek vzniklý působením Klenowovy polymerázy I a po navázání rekonstituovat Bgl II restrikční místo.

Plasmid pSom7 Δ2, připravený způsobem popsaným výše v příkladu 1, se digeruje enzymem Bgl II a získaný fragment s Bgl II záchytnými konci se převede postupem s Klenowovou polymerázou I, za použití všech čtyř desoxynukleotidthifosfátů, na dvouvláknový.

Vzniklý produkt se rozštěpí enzymem EcoRI a následující izolací menšího· fragmentu 42 pomocí PAGE elektroforézy a elektroeluce se získá lineární část DNA obsahující tryptofanový promotor - operátor a kodóny nejbližší LE‘ sekvence za Bgl II štěpícím místem [,,LE‘ (p)“J.

Tento lineární fragment má jednak EcoRI konec, a jednak „tupý“ konec vzniklý doplněním v Bgl II místě. Bgl II místo se však rekonstituuje navázáním „tupého“ konce fragmentu 42 na „tupý“ konec fragmentu 46.

Oba posléze zmíněné fragmenty se uvedeným způsobem naváží v přítomnosti T₄ DNA ligázy za vzniku znovu do kruhu uzavřeného· plasmidů pHKY 10 (viz obr. 12), který se rozmnoží tranformací do buněk bakterií E. coli kmene 294. Vypěstované vůči tetracyklinu resistentní buňky nesoucí rekombinovaný plasmid pHKY 10 se vyizolují, plasmidická DNA se vyextrahuje a poté se postupně digeruje restrikčními enzymy Bgl II a Pst, velký fragment získaný štěpením se izoluje РАСЕ elektroforézou a elektroelucí. Získá se lineární část DNA mající Pst a Bgl II záchytné konce. Tento DNA fragment 49 obsahuje počáteční replikaci a je proto vhodný jako první komponenta pro konstrukci plasmidů, ve kterých oba geny, gen kódující bílkoviny fúzované s trp LE‘ polypeptidem a gen kódující resistenci vůči tetracyklinu, jsou kontrolovány trp-promotorem - operátorem.

Plasmid pSom7 Δ2 Δ4, připravený způsobem popsaným v příkladu 4, lze zpracovat tak, aby poskytnul druhou komponentu potřebnou pro sestrojení systému schopného přijímat rozličné heterologické strukturální geny. Jak je uvedeno na obr. 13, podrobí se zmíněný plasmid částečné digesci restrikčním enzymem EcoRI (viz příklad 4) a pak digesci enzymem Pst, a fragment 51 obsahující trp-promotor - operátor se izoluje PAGÉ elektroforézou a následující elektroelucí.

Parciální digesce enzymem EcoRI se musí provádět proto, aby se získal fragment rozštěpený v sousedství 5⁴ konce somatostatinového genu, ale nerozštěpený v EcoRI místě přítomném mezi genem pro ampicilinovou resistenci a trp promotorem - operátorem.

Ampicilinová resistence ztracená štěpením enzymem Pst I v ap'* genu se dá znovu obnovit po vazbě s fragmentem 51.

Jako první ukázka třetí komponenty potřebné pro konstrukci nového plasmidů je uveden strukturální gen pro thymocin alfa jedna. Připraví se tak, že se plasmid pThal podrobí digesci enzymem EcoRI a BamHI a získaný fragment 52 se čistí PAGE elektroforézou a elektroelucí.

Uvedené tři genové fragmenty 49, 51 a 52 se navzájem naváží ve správné orientaci, jak je znázorněno na obr. 13, za vzniku plasmidů pTh#7 Δ1 Δ4, který lze při kultivaci vybrat na základě jeho obnovené ampicilinové a tetracyklinové resistence. Po transformaci bakterií E. coli kmene 294 a po kultivaci buněk za podmínek analogických těm, které byly popsány v příkladu 1, se získá plasmid vylučující fúzovanou bílkovinu s trp polypeptidem LE‘, ze kterého lze specificky odštěpit thymosin alfa jedna působením bromkyanu.

Když se podobným způsobem naváží jiné strukturální heterologické geny mající EcoRI a BamHI zakončení s komponentami odvozenými z plasmidů pHKY 10 a pSOM7 Δ2 Δ4, získají se analogicky účinně fúzované bílkoviny s trp LE‘ polypeptidem, obsahující polypeptidy, pro které jsou příslušné heterologické geny kódovány.

Na obr. 11 jsou znázorněny výsledky dělení celkové buněčné bílkoviny získané z transformantů E. coli kmene 294, elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, přičemž nejintenzívnější pásy v každém z uvedených případů představují produkty fúzovaných bílkovin vzniklé pod kontrolou tryptofánového promotorového - operátorového systému. Na dráze 1 obr. 11 je pro kontrolu znázorněno rozdělení celkové buněčné bílkoviny získané z bakterií E. coli 294/ /pBR322. Dráha 2 znázorňuje rozdělení fúzovaného produktu obsahujícího somatostatin, získaného z plasmidů pSom7 Л2 Δ4 připraveného způsobem popsaným v příkladu

4. Dráha 3 znázorňuje rozdělení produktu vylučování z plasmidů pSom7 AI Δ4, obsahujícího somatostatin. Dráha 4 znázorňuje rozdělení produktu exprese z plasmidů pTh«7 Δ1 Δ4, a dráha 5 znázorňuje rozdělení produktu vylučovaného z plasmidů získaného spojením shora popsaných fragmentů odvozených z plasmidů pHKY 10 a pSom7 Δ2 Δ4 se strukturálním genem kódujícím lidský proinsulin, zakončeným EcoRI a BamHI konci a připraveným částečně jedním z autorů tohoto vynálezu. Dráhy 6 a 7 znázorňují, jako nejintenzívnější pás, bílkovinu fúzovanou s trp LE⁴ polypeptidem, ze které lze specificky odštěpit В a A řetězce lidského insulinu.

Strukturální geny pro insulin В a A se získají digesci plasmidů pIBl, popřípadě pIAll, restrikčními enzymy EcoRI a BamHI; konstrukci uvedených plasmidů popsali D. V. Goeddel se spolupracovníky v časopisu Proč. Naťl. Acal. Sci. USA 76, 106 (1979). V dráze 8 je znázorněna poloha standardů.

Ačkoliv je způsob podle vynálezu popsán v jeho nejvýhodnějším provedení za použití bakterií E. coli, lze jako hostitelských buněk pro vylučování a jako zdrojů pro trp operóny použít i jiných enterobakterií, ze kterých lze uvést například Salmonella typhimurium a Serratia marcesans. Způsob podle vynálezu není proto omezen na popsané výhodné provedení, ale jen na právní rozsah vyplývající z následujících bodů předmětu vynálezu.

Claims (4)

1. Způsob sestrojování plasmidu schopného exprese heterologického genu polypeptidů, vyznačující se tím, že se současně naváže ve správné fázi první lineární dvojvláknový fragment DNA obsahující replikón a gen, schopný exprese charakteristického znaku vhodného pro selekci umístěním pod kontrolu bakteriálního promotoru, přičemž však uvedenému fragmentu jakýkoliv takový promotor chybí, druhý lineární dvojvláknový DNA fragment obsahující shora uvedený heterologický gen a třetí dvojvláknový fragment DNA, který obsahuje bakteriální promotor, přičemž záchytné konce zmíněných fragmentů mají konfiguraci, s níž se po vzájemném navázání utvoří replikace schopný plasmid a oba geny, jak gen pro charakteristický znak vhodný pro selekci plasmidu, tak heterologický gen, jsou říze ny promotorem za účelem využití zmíněného charakteristického znaku pro výběr kolonií transformovaných bakterií, schopných exprese heterologického genu.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se současně naváže ve správné fázi první lineární dvojvláknový fragment DNA obsahující replikón a gen pro resistenci vůči antibiotikům.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se současně naváže ve správné fázi první lineární dvojvláknový fragment DNA obsahující replikón a gen pro resistenci vůči tetracyklinu, přičemž se umístí pod kontrolu tryptofanového promotoru.

4. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že po vzájemném navázání fragmentů se rovněž rekonstituuje operón pro expresi resistence vůči ampicilinu.