ES2316182T3 - Ligando apo-2. - Google Patents
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Polipéptido ligando Apo-2 aislado que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% con los aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A (SEC ID nº 1), en el que el polipéptido comprende una sustitución por un residuo alanina del residuo ácido aspártico en una o más de las posiciones 203, 218 ó 269, lo que incrementa la actividad inductora de apóptosis del polipéptido ligando Apo-2 en comparación con el ligando Apo-2 consistente de los aminoácidos 91 a 281 de la SEC ID nº 1 en un ensayo in vitro utilizando células de carcinoma pulmonar humano SK MES-1 (ATCC nº HTB58).
Description
Ligando Apo-2.
La presente invención se refiere de manera
general a la identificación, aislamiento y producción recombinante
de una nueva citoquina, denominada en la presente invención
"ligando Apo-2", y a procedimientos de
utilización de dichas composiciones.
El control del número de células en mamíferos se
cree que está determinado, en parte, por un equilibrio entre
proliferación y muerte celulares. Una forma de muerte celular, en
ocasiones denominada muerte celular necrótica, se caracteriza
típicamente como una forma patológica de muerte celular que resulta
en cierto nivel de traumatismo o daño celular. Por el contrario,
existe otra forma de muerte celular, "fisiológica", que
habitualmente se produce de una manera ordenada o controlada. Esta
forma ordenada o controlada de muerte celular con frecuencia se
denomina "apóptosis" [ver, por ejemplo, Barr et al.,
Bio/Technology 12:487-493, 1994]. La muerte celular
apoptótica se produce naturalmente en muchos procesos fisiológicos,
incluyendo el desarrollo embrionario y la selección clonal en el
sistema inmunológico [Itoh et al., Cell
66:233-243, 1991]. Sin embargo, se han asociado los
niveles reducidos de muerte celular apoptótica a una diversidad de
condiciones patológicas, incluyendo cáncer, lupus e infección por
virus herpes [Thompson, Science 267:1456-1462,
1995].
La muerte celular apoptótica típicamente se ve
acompañada por uno o más cambios morfológicos y bioquímicos
característicos en las células, tales como la condensación del
citoplasma, la pérdida de microvilli de la membrana plasmática, la
segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la
pérdida de función mitocondrial. Se cree que una diversidad de
señales extrínsecas e intrínsecas desencadenan o inducen dichos
cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature
356:397-400, 1992; Steller, Science
267:1445-1449, 1995; Sachs et al., Blood
82:15, 1993]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos
hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para los timocitos
inmaduros, así como la retirada de determinados factores de
crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature
356:314-317, 1992]. Además, algunos oncogenes
identificados, tales como myc, rel y E1A, y supresores
tumorales, tales como p53, se ha informado que presentan un papel
en la inducción de la apóptosis. De manera similar, determinados
fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación se ha
observado que presentan actividad inductora de apóptosis [Thompson,
supra].
Se han identificado numerosas moléculas, tales
como el factor \alpha de necrosis tumoral
("TNF-\alpha"), el factor \beta de
necrosis tumoral ("TNF-\beta" o
"linfotoxina"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40,
ligando OX-40, ligando 4-1 BB y
ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o
ligando CD95), como miembros de la familia de citoquinas del factor
de necrosis tumoral ("TNF") [ver, por ejemplo, Gruss y Dower,
Blood 85:3378-3404, 1995]. De entre dichas
moléculas, TNF-\alpha,
TNF-\beta, ligando CD30, ligando
4-1BB y ligando Apo-1 se ha
informado que están implicados en la muerte celular apoptótica.
Tanto TNF-\alpha como TNF-\beta
se ha informado que inducen la muerte apoptótica en células
tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 83:1881, 1986; Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17:689,
1987]. Zheng et al. han informado de que TNF- \alpha se
encuentra implicado en la apóptosis
post-estimulatoria de las células T
CD8-positivas [Zheng et al., Nature
377:348-35, 1995]. Otros investigadores han
informado que el ligando CD30 podría estar implicado en la deleción
de células T autorreactivas en el timo [Amakawa et al., Cold
Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, resumen
nº 10, 1995].
Las mutaciones en los genes de receptor o
ligando Fas/Apo-1 de ratón (denominados lpr y
gld, respectivamente) se han asociado a algunos trastornos
autoinmunológicos, indicando que el ligando Apo-1
podría desempeñar un papel en la regulación de la deleción clonal
de los linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammeret et
al., Curr. Op. Immunol. 6:279-28, 1994; Nagata
et al., Science 267:1449-1456, 1995].
También se ha informado de que el ligando Apo-1
induce la apóptosis post-estimulatoria en linfocitos
T CD4-positivos y en linfocitos B y que podría
estar implicado en la eliminación de los linfocitos activados cuando
su función ya no resulte necesaria [Krammer et al., supra;
Nagata et al., supra]. Los anticuerpos monoclonales de ratón
agonistas que se unen específicamente al receptor
Apo-1 se ha informado de que muestran actividad
citocida que es comparable o similar a la de
TNF-\alpha [Yonehara et al., J. Exp. Med.
169:1747-1756, 1989].
La inducción de diversas respuestas celulares
mediadas por dichas citoquinas de la familia TNF se cree que
resulta iniciada por su unión a receptores celulares específicos. Se
han identificado y caracterizado dos receptores TNF diferentes, de
aproximadamente 55 kDa (TNF-R1) y 75 kDa
(TNF-R2) [Hohman et al., J. Biol. Chem.
264:14927-14934, 1989; Brockhaus et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3127-3131, 1990; patente
EP nº 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991] y ADNc humano y de
ratón correspondientes a ambos tipos de receptor [Loetscher et
al., Cell 61:351, 1990; Schall et al., Cell 61:361, 1990;
Smith et al., Science 248:1019-1023, 1990;
Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
88:2830-2834, 1991; Goodwin et al., Mol.
Cell. Biol. 11:3020-3026, 1991].
Itoh et al. dan a conocer que el receptor
Apo-1 puede señalizar una muerte celular apoptótica
similar a la señalizada por TNF-R1 de 55 kDa [Itoh
et al., supra]. También se ha informado de que la expresión
del antígeno Apo-1 se encuentra regulado
negativamente junto con el antígeno de TNF-R1 al
tratar las células con TNF-\alpha o con
anticuerpo monoclonal de ratón
anti-Apo-1 [Krammer et al.,
supra; Nagata et al., supra]. Por consiguiente, algunos
investigadores han planteado la hipótesis de que las líneas que
coexpresan los receptores Apo-1 y
TNF-R1 podrían mediar en la eliminación celular a
través de rutas de señalización comunes [Id.].
Los ligandos de la familia de TNF identificados
hasta el momento, con la excepción de la
linfotoxina-\alpha, son proteínas
transmembranales de tipo II, el extremo C-terminal
de las cuales es extracelular. En contraste, los receptores en la
familia de receptores TNF (TNFR) identificados hasta el momento son
proteínas transmembranales de tipo I. Sin embargo, tanto en la
familia de ligandos como de receptores de TNF, la homología
identificada entre los miembros de la familia se ha encontrado
principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Algunas de
las citoquinas de la familia de TNF, incluyendo
TNF-\alpha, el ligando de Apo-1 y
el ligando de CD40, se cortan proteolíticamente en la superficie
celular; la proteína resultante en cada caso típicamente forma una
molécula homotrimérica que funciona como citoquina soluble. Las
proteínas de la familia de los receptores TNF habitualmente también
se cortan proteolíticamente para liberar ECDs de receptores solubles
que pueden funcionar como inhibidores de citoquinas afines. Para
una revisión de la familia TNF de citoquinas y los receptores de las
mismas, ver Gruss y Dower, supra.
Los solicitantes han identificado clones de ADNc
que codifican una nueva citoquina, denominada "ligando
Apo-2". En la actualidad se cree que el ligando
Apo-2 es un miembro de la familia de citoquinas TNF;
el ligando Apo-2 está relacionado en secuencia de
aminoácidos con algunas proteínas conocidas de tipo TNF, incluyendo
el ligando de Apo-1. Sin embargo, los solicitantes
han descubierto que el ligando Apo-2 no resulta
apreciablemente inhibido por los receptores solubles de
Apo-1 o de TNF, tales como los receptores de
Fas/Apo-1, TNF-R1 o
TNF-R2.
En la presente invención se describe el ligando
Apo-2 aislado. Éste incluye ligando
Apo-2 aislado que incluye una secuencia de
aminoácidos que comprende los residuos 114 a 281 de la figura 1A, el
ligando Apo-2 que incluye una secuencia de
aminoácidos que comprende los residuos 91 a 281 de la figura 1A, el
ligando Apo-2 que incluye una secuencia de
aminoácidos que comprende los residuos 41 a 281 o 15 a 281 de la
figura 1A, y el ligando Apo-2 que incluye una
secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 281 de la
figura 1A (SEC ID nº 1).
El ligando Apo-2 aislado de la
invención son variantes por sustitución de las secuencias
anteriormente indicadas según las reivindicaciones. En particular,
en una realización, se proporcionan variantes por sustitución del
liando de Apo-2 que comprenden los aminoácidos 91 a
281 de la figura 1A en las que por lo menos uno de los aminoácidos
en las posiciones 203, 218 ó 269 se sustituyen por un residuo
alanina. En particular, dichas variantes por sustitución se
identifican como "D203A", "D218A" y "D269A". Esta
nomenclatura se utiliza para identificar los polipéptidos ligando
Apo-2 que comprenden, por ejemplo, los aminoácidos
91 a 281 de la figura 1A, en la que los residuos de ácido aspártico
en las posiciones 203, 218 y/o 269 (utilizando la numeración
mostrada en la figura 1A) se sustituyen por residuos de alanina.
Opcionalmente, las variantes por sustitución pueden incluir una o
más de dichas sustituciones.
En otra realización, la invención proporciona
moléculas quiméricas que comprenden ligando Apo-2
fusionado con otro polipéptido heterólogo. Un ejemplo de dicha
molécula quimérica comprende el ligando Apo-2
fusionado con una secuencia de polipéptido etiqueta.
En otra realización, la invención proporciona
una molécula de ácido nucleico aislada codificante de ligando
Apo-2. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico
es ARN o ADN que codifica un ligando Apo-2 o es
complementaria a una secuencia de ácido nucleico codificante de
dicho ligando Apo-2, y permanece establemente unida
al mismo bajo condiciones por lo menos moderadamente astringentes.
En una realización, la secuencia parental de ácido nucleico de
ligando Apo-2 se selecciona de entre:
- (a)
- la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de la figura 1A que codifica la proteína de longitud completa entre el residuo 1 y el residuo 281 (es decir, los nucleótidos 91 a 933), ambos inclusive, o los nucleótidos 211 a 933 que codifican la proteína extracelular de residuos 41 a 281, ambos inclusive, o los nucleótidos 364 a 933 que codifican la proteína extracelular de residuos 92 a 281, ambos inclusive, o los nucleótidos 430 a 933 que codifican la proteína extracelular de residuos 114 a 281, ambos inclusive, de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 1A (SEC ID nº 2), o
- (b)
- una secuencia correspondiente a la secuencia de (a) dentro del alcance de la degeneración del código genético.
En una realización adicional, la invención
proporciona un vector replicable que comprende la molécula de ácido
nucleico codificante del ligando Apo-2 operablemente
ligado a secuencias de control reconocidas por una célula huésped
transfectada o transformada con el vector. Asimismo, se proporciona
una célula huésped que comprende el vector o la molécula de ácido
nucleico. También se proporciona un procedimiento para producir
ligando Apo-2 que comprende cultivar una célula
huésped que comprende la molécula de ácido nucleico y recuperar la
proteína a partir del cultivo de la célula huésped.
En otra realización, la invención proporciona
una composición que comprende ligando Apo-2 y un
portador. La composición puede ser una composición farmacéutica
útil para inducir o estimular la apóptosis.
En otra realización, la invención proporciona
células, la utilización del ligando Apo-2
reivindicado para la preparación de un medicamento para la
inducción de apóptosis en células de cáncer de mamífero. La
variante por sustitución del ligando Apo-2 también
puede administrarse en el mamífero conjuntamente con una o más
otras terapias, tales como la quimioterapia, la terapia de radiación
u otros agentes capaces de ejercer actividad antitumoral.
La figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos
del ADNc del ligando Apo-2 humano y la secuencia de
aminoácidos derivada el mismo.
La figura 1B muestra una alineación de la región
C-terminal del ligando humano de
Apo-2 con la región correspondiente de miembros
conocidos de la familia de citoquinas TNF humanas:
4-1BBL, OX40L, CD27L, CD30L,
TNF-\alpha, LT-\beta, LT-
\alpha, CD40L y Apo-L.
Las figuras 1C-1E muestran (C)
la topología celular del ligando Apo-2 etiquetado
con epítopo myc recombinante de longitud completa
C-terminal, expresado en células 293 humanas, según
se determina mediante análisis FACS utilizando anticuerpo
anti-epítopo myc; (D) el tamaño y estructura de
subunidades de Apo-2 soluble etiquetado con epítopo
His10 recombinante expresado en células de insecto infectadas por
baculovirus recombinante y purificados mediante cromatografía de
afinidad de Ni^{2+}-quelato, según se determina
con (carriles 2, 3) o sin (carril 1) entrecruzamiento químico
seguido de SDS-PAGE y tinción de plata; (E) el
tamaño y estructura de subunidades del ligando Apo-2
soluble etiquetado con epítopo gD recombinante expresado en células
293 humanas marcadas metabólicamente, según se determina mediante
inmunoprecipitación con anticuerpo anti-epítopo gD,
seguido de SDS-PAGE y autorradiografía.
Las figuras 2A-2E muestran la
inducción de apóptosis en líneas celulares de linfocitos B y T por
parte del ligando Apo-2. Las células apoptóticas se
identificaron a partir de cambios morfológicos característicos (A);
mediante tinción de fluorescencia positiva con yoduro de propidio
(PI) y anexina V conjugada con FITC, mediante citometría de flujo
(B-D), y mediante análisis de la fragmento del ADN
internucleosómico (E).
Las figuras 3A-3C muestran el
curso temporal y la dependencia de dosis de la apóptosis inducida
por el ligando Apo-2 y la falta de inhibición de la
apóptosis inducida por ligando Apo-2 por parte de
las proteínas de fusión de receptor soluble-IgG
basada en el receptor Fas/Apo-1, el receptor
TNF-R1 o el receptor TNF-R2.
La figura 4 muestra la expresión del ARNm del
ligando Apo-2 en tejidos fetales humanos y en
tejidos adultos humanos, según medición mediante análisis de
transferencia northern.
La figura 5 muestra el efecto in vivo del
ligando Apo-2, administrado mediante inyección
intratumoral, solo o en combinación con doxorubicina, sobre el peso
de tumores de tipo carcinoma mamario MDA231 humano cultivado en
ratones desnudos.
La figura 6 muestra el efecto in vivo del
ligando Apo-2, administrado mediante inyección
intratumoral, solo o en combinación con 5-FU, sobre
el peso de tumores de tipo carcinoma de colon HCT 116 humano
cultivados en ratones desnudos.
La figura 7 muestra el efecto in vivo del
ligando Apo-2, administrado mediante inyección
intraperitoneal, solo o en combinación con 5-FU,
sobre el tamaño de tumores de tipo carcinoma de colon HCT116 humano
cultivados en ratones desnudos.
La figura 8 muestra el efecto in vivo del
ligando Apo-2, administrado mediante inyección
intraperitoneal, solo o en combinación con 5-FU,
sobre el peso de tumores de tipo carcinoma de colon HCT116 humano
cultivados en ratones desnudos.
La figura 9 es un gráfico de columnas que
ilustra que CrmA, aunque no FADD negativo dominante, bloquea la
apóptosis inducida por el ligando Apo-2 en células
HeLa-S3.
La figura 10 muestra el análisis FACS de la
apóptosis inducida por el ligando Apo-2 y el efecto
de cuatro anticuerpos anti-ligando
Apo-2: 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 (células 9D apoptóticas
detectadas utilizando anexina V conjugada con FITC -línea en
negrita; células vivas no teñidas- línea delgada).
La figura 11 es un gráfico de columnas que
ilustra la especificidad de antígeno de los anticuerpos monoclonales
1D1, 2G6, 2E11 y 5C2.
La figura 12 muestra un gráfico de columnas que
ilustra los resultados de un ensayo de mapado de epítopos de los
anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2.
La figura 13 es un gráfico de columnas que
ilustra los resultados de un ensayo que somete a ensayo la capacidad
del anticuerpo monoclonal 1D1 de unirse a varios péptidos sintéticos
diferentes que consisten de regiones específicas de aminoácidos del
ligando Apo-2.
Las figuras 14A-14D muestran
células HeLa cultivadas tratadas con sobrenadante de cultivo de
células CHO que contienen ligando Apo-2 expresado
(dilución 1:10, 1:20, 1:40) o medio no condicionado; la figura 14E
es un gráfico de columnas que ilustra el número de células
apoptóticas en cada campo.
La figura 15 muestra el cambio en porcentaje (%)
de volumen tumoral del carcinoma de colon HCT116 en ratones desnudos
en los que se ha administrado, mediante una minibomba osmótica,
polipéptido ligando Apo-2 que se expresó en E.
coli (tal como se describe en el Ejemplo 16).
La figura 16 muestra un mapa de restricción del
plásmido pAPOK5.
La figura 17 ilustra la capacidad de las
variantes por sustitución del ligando Apo-2 D218A,
D269A y V207A de inducir la muerte celular apoptótica en un
bioensayo en comparación con el ligando Apo-2 que
consiste los aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A
("Apo2L.2").
La figura 18 ilustra la capacidad de la variante
por sustitución del ligando Apo-2 denominada D203A
de inducir la muerte celular apoptótica en un bioensayo en
comparación con el ligando Apo-2 que consiste de los
aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A ("Apo2L.2").
La figura 19 es una taba que muestra las
constantes de disociación (K_{D}) de las variantes por sustitución
del ligando Apo-2 denominadas D203A, D218A y D269A
en comparación con el ligando Apo-2 que consiste de
los aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A ("Apo2L.2") según se
determina mediante análisis cinético de unión utilizando BIAcore
(Pharmacia).
Las expresiones "ligando
Apo-2" y "Apo-2L" se
utilizan intercambiablemente para referirse a una secuencia de
polipéptido que incluye los residuos aminoácidos 114 a 281, ambos
inclusive, los residuos 92 a 281, ambos inclusive, los residuos 91
a 281, ambos inclusive, los residuos 41 a 281, ambos inclusive, los
residuos 15 a 281, ambos inclusive, o los residuos 1 a 281, ambos
inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A,
así como las variantes por deleción, por inserción o por sustitución
de las secuencias anteriormente indicadas. En una realización, la
secuencia del polipéptido presenta por lo menos los residuos 114 a
281 de la figura 1A. Opcionalmente, la secuencia del polipéptido
presenta por lo menos los residuos 92 a 281 o los residuos 91 a 281
de la figura 1A. En otra realización preferente, las variantes son
biológicamente activas y presentan una identidad de secuencia de
aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, más preferentemente
una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 90%, y
todavía más preferentemente, una identidad de secuencia de por lo
menos aproximadamente 95%, con cualquiera de las secuencias
anteriormente indicadas. La definición comprende variantes por
sustitución del ligando Apo-2 que comprende los
aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A en la que por lo menos uno de
los aminoácidos en las posiciones 203, 218 ó 269 se sustituye por
un residuo de alanina. La definición también comprende un ligando
Apo-2 de secuencia nativa aislado de un fuente de
ligando Apo-2, tal como de los tipos de tejido
humano indicados en la presente invención (ver el Ejemplo 8) o de
otra fuente, o preparado mediante procedimientos de recombinación o
de síntesis. La presente definición del ligando
Apo-2 excluye las secuencias de EST conocidas, tales
como las secuencias de GenBank HHEA47M, T90422, R31020, H43566,
H44565, H44565, H54628, H44772, H54629, T82085 y T10524.
La expresión "etiquetado con epítopo"
cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un
polipéptido quimérico que comprende ligando Apo-2,
o una parte del mismo, fusionado con un "polipéptido etiqueta".
El polipéptido etiqueta presenta suficientes residuos para
proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un
anticuerpo, aunque suficientemente corto para que no interfiera con
la actividad del ligando Apo-2. El polipéptido de
etiqueta preferentemente también es único, de manera que el
anticuerpo no reacciona cruzadamente en grado sustancial con otros
epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente presentan
por lo menos seis residuos aminoácidos y habitualmente entre
aproximadamente 8 y aproximadamente 50 residuos aminoácidos
(preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20
residuos).
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir las diversas proteínas dadas a conocer en la presente
invención, se refiere a una proteína que ha sido identificada y
separada y/o recuperada de un componente del ambiente natural de la
misma. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son
materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos
o terapéuticos de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y
otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones
preferentes, la proteína se purifica (1) en un grado suficiente
para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos
N-terminal o interna mediante la utilización de un
secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante
SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o
reductoras utilizando azul de Coomassie, o preferentemente tinción
de plata. Entre las proteínas aisladas se incluyen proteínas in
situ dentro de células recombinantes, debido a que por lo menos
un componente del ambiente natural del ligando Apo-2
no se encontrará pre-
sente. Habitualmente, sin embargo, la proteína aislada se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.
sente. Habitualmente, sin embargo, la proteína aislada se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico de ligando
Apo-2 "aislada" es una molécula de ácido
nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula
de ácido nucleico contaminante con la que habitualmente se
encuentra asociada en la fuente natural del ácido nucleico del
ligando Apo-2. Una molécula de ácido nucleico del
ligando Apo-2 aislado es otra que la forma o
contexto en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las
moléculas de ácido nucleico del ligando Apo-2 se
distinguen de la molécula de ácido nucleico del ligando
Apo-2 tal como existe en las células naturales. Sin
embargo, una molécula de ácido nucleico de ligando
Apo-2 aislado incluye moléculas de ácido nucleico de
ligando Apo-2 contenidas en células que
habitualmente expresan ligando Apo-2 en las que,
por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una
localización cromosómica diferente de aquélla en las células
naturales.
naturales.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias
identificadas en la presente invención se define como el porcentaje
de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son
idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia del ligando
Apo-2 tras alinear las secuencias e introducir
huecos, en caso necesario, para conseguir el porcentaje máximo de
identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución
conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los valores de
% de identidad pueden generarse con WU-BLAST2 que
pueden obtenerse a partir de Altschul et al., Methods in
Enzymology 266:460-480, 1996;
http://blast.wustl/edu/blast/README.html.WU-BLAST2
utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se
fija en los valores por defecto. Los parámetros ajustables pueden
fijarse en los valores siguientes: overlap scan=1, overlap
fraction=0.125, word threshold (T)=11. De manera similar, el
"porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos"
con respecto a la secuencia de nucleótidos de los polipéptidos
ligando Apo-2 se define como el porcentaje de
nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los
nucleótidos en la secuencia codificante del ligando
Apo-2. Los valores de identidad pueden generarse
con el módulo BLASTN de WU-BLAST-2
fijado en los parámetros por defecto, fijando los parámetros overlap
scan y overlap fraction en 1 y 0,125, respectivamente.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped
particular. Entre las secuencias de control que resultan adecuadas
para los procariotas, por ejemplo, se incluyen un promotor,
opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión
ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan
promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.
Un ácido nucleico se encuentra "operablemente
ligado" cuando se encuentra situado en una relación funciona con
otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o un líder secretorio se encuentra operablemente
ligado a ADN para un polipéptido si se expresa en forma de una
preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una
secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia;
o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a
una secuencia codificante si se sitúa de manera que facilite la
traducción. Generalmente, la expresión "operablemente ligado"
se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y,
en el caso de un líder secretorio, son contiguas y se encuentran en
la misma fase de lectura. Sin embargo, no resulta necesario que los
intensificadores sean contiguos. La unión se consigue mediante
ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no
existen, se utilizan oligonucleótidos adaptadores o línkers
sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales
anti-ligando Apo-2 individuales
(incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas) y composiciones de
anticuerpo anti-ligando Apo-2 con
especificidad poliepitópica.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal
como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo
obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la
población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales
que puedan encontrarse presentes en cantidades menores. Los
anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose
contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las
preparaciones convencionales de anticuerpo (policlonal) que
típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se
dirige contra un único determinante en el antígeno.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos
mediante el procesamiento de un dominio variable (incluyendo
hipervariable) de un anticuerpo anti-ligando
Apo-2 con un dominio constante (por ejemplo
anticuerpos "humanizados") o una cadena ligera con una cadena
pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie,
o fusiones con proteínas heterólogas, con independencia de la
especie de origen o la denominación de clase o subclase de
inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo
Fab, F(ab')_{2} y Fv), con la condición de que muestren la
actividad deseada (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567 y
Mage et al. en Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, páginas 79 a 97 (Marcel Dekker, Inc.: New York,
1987).
De esta manera, el modificador "monoclonal"
indica el carácter del anticuerpo, indicando que se ha obtenido de
una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe
interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante
ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos
monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la presente
invención pueden prepararse mediante el procedimiento del hibridoma
descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256:495,
1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN
recombinante tal como se describe en la patente US nº 4.816.567. Los
"anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de
bibliotecas fágicas generadas utilizando las técnicas descritas en
McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990,
por ejemplo.
Las formas "humanizadas" de los anticuerpos
no humanos (por ejemplo "murinos" son inmunoglobulinas
quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de
las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras
subsecuencias de unión de antígeno de anticuerpos) que contienen una
secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana.
Mayoritariamente los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas
humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen
por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo
donante), tal como ratón rata o conejo, que presenten la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los
residuos de la región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana
se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además,
el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se
encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la secuencias de CDR
o de marco importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar
y optimizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En
general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la
totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios
variables, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad
de las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina
no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las
regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado ópticamente
también comprende por lo menos una parte de una región constante de
inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
La expresión "biológicamente activo" para los fines de la
presente invención se refiere a: (a) presentar la capacidad de
inducir o de estimular la apóptosis en por lo menos un tipo de
célula de mamífero in vivo o ex vivo; (b) presentar la
capacidad de inducir la producción de un anticuerpo, es decir es
inmunogénico, o (c) conservar la actividad de un polipéptido
Apo-2L nativo o natural.
Los términos "apóptosis" o "actividad
apoptótica" se utilizan en un sentido amplio y se refieren a la
forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que
típicamente se ve acompañada por uno o más cambios celulares
característicos, incluyendo la condensación del citoplasma, la
pérdida de los microvilli de la membrana plasmática, la
segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la
pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede
determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad
celular, análisis FACS o electroforesis de ADN.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se
caracteriza típicamente por el crecimiento celular no reglado. Entre
los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos,
el carcinoma, el linfoma, la leucemia, el blastoma y el sarcoma.
Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen
el carcinoma de células escamosas, el cáncer pulmonar de células
pequeñas, el cáncer pulmonar de células no pequeñas, el cáncer
gastrointestinal, el cáncer renal, el cáncer ovárico, el cáncer
hepático, el cáncer colorrectal, el cáncer endometrial, el cáncer
renal, el cáncer de próstata, el cáncer del tiroides, el
neuroblastoma, el cáncer pancreático, el glioblastoma multiforme, el
cáncer cervical, el cáncer de estómago, el cáncer de vejiga, el
hepatoma, el cáncer de mama, el carcinoma de colon y el cáncer de
cabeza y cuello. En una realización, el cáncer incluye el linfoma
folicular, el carcinoma con mutaciones de p53 o el cáncer
hormono-dependiente, tal como el cáncer de mama, el
cáncer de próstata o el cáncer de ovario.
Los términos "tratar", "tratamiento" y
"terapia" tal como se utilizan en la presente invención se
refieren a la terapia curativa, a la terapia profiláctica y a la
terapia preventiva.
El término "mamífero" tal como se utiliza
en la presente invención se refiere a cualquier mamífero
clasificado como mamífero, incluyendo el ser humano, vacas,
caballos, perros y gatos. En una realización preferente de la
invención, el mamífero es un ser humano.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona una nueva
citoquina relacionada con la familia de ligandos TNF, la citoquina
identificada en la presente invención como "ligando
Apo-2". La secuencia madura de aminoácidos
predicha del ligando Apo-2 humano contiene 281
aminoácidos y presenta un peso molecular calculado de
aproximadamente 32,5 kDa y un punto isoeléctrico de aproximadamente
7,63. No existe ninguna secuencia de señal aparente en el extremo
N-terminal, aunque el análisis de hidropatía indica
la presencia de una región hidrofóbica entre los residuos 15 y 40.
La ausencia de una secuencia de señal y la presencia de una región
hidrofóbica interna sugiere que el ligando Apo-2 es
una proteína transmembranal de tipo II. Un sitio de glucosilación
N-ligado potencial se encuentra localizado en el
residuo 109 en la región extracelular putativa. La región
citoplasmática putativa comprende los residuos aminoácidos 1 a 14,
la región transmembranal comprende los residuos aminoácidos 15 a 40
y la región extracelular comprende los residuos aminoácidos 41 a
281, mostrados en la figura 1A. Los polipéptidos solubles ligandos
de Apo-2 de dominio extracelular se encuentran
comprendidos dentro del alcance de la invención e incluyen, aunque
sin limitación, polipéptidos ligandos de Apo-2 que
comprenden los residuos aminoácidos 114 a 281, 92 a 281 ó 91 a 281
de la región extracelular, mostrados en la figura 1A.
La presente invención también proporciona
variantes por sustitución de Apo-2L. Tal como se
describe en la presente invención, las técnicas de escaneo de
alaninas se utilizaron para identificar varias moléculas variantes
de sustitución que presentan actividad biológica. Unas variantes por
sustitución particulares del ligando Apo-2
comprenden los aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A en la que por lo
menos uno de los aminoácidos en las posiciones 203, 218 ó 269 se ha
sustituido por un residuo de alanina. Estas variantes por
sustitución se identifican como "D203A", "D218A" y
"D269A". Esta nomenclatura se utiliza para identificar los
polipéptidos ligandos de Apo-2 que comprenden, por
ejemplo, los aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A, en la que los
residuos de ácido aspártico en las posiciones 203, 218 y/o 269
(utilizando la numeración mostrada en la figura 1A) se han
sustituido por residuos de alanina. Opcionalmente, las variantes por
sustitución pueden incluir una o más de dichas tres sustituciones de
sitio diferente.
La descripción posterior se refiere
principalmente a la producción de ligando Apo-2
mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un
vector que contiene el ácido nucleico del ligando
Apo-2 y a la recuperación del polipéptido a partir
del cultivo celular. Evidentemente se contempla que procedimientos
alternativos, que son bien conocidos de la técnica, puedan
utilizarse para preparar el ligando Apo-2.
El ADN codificante del ligando
Apo-2 puede obtenerse a partir de cualquier
biblioteca de ADNc preparad a partir de tejido que se cree posee el
ARNm del ligando Apo-2 y que lo expresa a un nivel
detectable. Por consiguiente, el ADN de ligando
Apo-2 humano puede obtenerse convenientemente a
partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejidos
humanos, tales como la biblioteca de bacteriófagos de ADNc
placentario humano descrita en el Ejemplo 1. El gen codificante del
ligando Apo-2 también puede obtenerse a partir de
una biblioteca genómica o mediante la síntesis de
oligonucleótidos.
Las bibliotecas pueden cribarse con sondas
(tales como anticuerpos del ligando Apo-2 u
oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20 a 80 bases)
diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína
codificada por el mismo. Los ejemplos de sondas oligonucleótidas se
proporcionan en el Ejemplo 1. El cribado de la biblioteca de ADNc o
genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando
procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo
para aislar el gen codificante del ligando Apo-2 es
la utilización de metodología de PCR [Sambrook et al., supra;
Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Un procedimiento preferente de cribado utiliza
secuencias oligonucleótidas seleccionadas para cribar bibliotecas
de ADNc de diversos tejidos humanos. El Ejemplo 1 posteriormente
describe técnicas para cribar una biblioteca de ADNc con dos sondas
oligonucleótidas diferentes. Las secuencias oligonucleótidas
seleccionadas como sondas deberían ser de suficiente longitud y
suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. El
oligonucleótido preferentemente se marca de manera que pueda
detectarse tras la hibridación con ADN en la biblioteca que se
criba. Los procedimientos de marcaje son bien conocidos de la
técnica, e incluyen la utilización de marcajes radioactivos, tales
como ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcaje
enzimático.
Puede obtenerse ácido nucleico que presenta la
totalidad de la secuencia codificante de proteína mediante el
cribado de bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionados utilizando
la secuencia de aminoácidos deducida que se da a conocer en la
presente invención y, en caso necesario, utilizando procedimientos
convencionales de extensión de cebador tal como describen Sambrook
et al., supra, para detectar precursores y procesar
intermediarios de ARNm que pueden no haberse transcrito inversamente
en ADNc.
Las variantes de secuencia de aminoácidos del
ligando Apo-2 pueden prepararse mediante la
introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ADN del
ligando Apo-2, o mediante la síntesis del
polipéptido ligando Apo-2 deseado. Dichas variantes
representan inserciones, sustituciones y/o deleciones de residuos en
el interior, en un extremo o en ambos extremos de la región
intracelular, de la región transmembranal o de la región
extracelular, o de la secuencia de aminoácidos mostrada para el
ligando Apo-2 de longitud completa en la figura 1A.
Puede prepararse cualquier combinación de inserción, sustitución
y/o deleción para llegar al constructo final, con la condición de
que el constructo final posea, por ejemplo, la actividad apoptótica
deseada tal como se define en la presente invención. En una
realización preferente, las variantes presentan una identidad e
secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, más
preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos
aproximadamente 90% y todavía más preferentemente una identidad de
secuencia de por lo menos aproximadamente 95% con las secuencias
identificadas en la presente invención para las regiones
intracelular, transmembranal o extracelular del ligando
Apo-2 o la secuencia de longitud completa del
ligando Apo-2. Los cambio de aminoácidos también
pueden alterar los procesos post-traduccionales del
ligando Apo-2, tales como el cambio del número o la
posición de los sitios de glucosilación o la alteración de las
características de anclaje a membrana.
Las variaciones en la secuencia del ligando
Apo-2 tales como las descritas anteriormente pueden
realizarse utilizando cualquiera de las técnicas y guías para las
mutaciones conservativas y no conservativas proporcionadas en la
patente US nº 5.364.934. Entre éstas se incluyen la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (sitio-dirigida), el
escaneo de alaninas y la mutagénesis por PCR.
El análisis de escaneo de aminoácidos puede
utilizarse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una
secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferentes son
aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre dichos
aminoácidos se incluyen la alanina, la glicina, la serina y la
cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de escaneo
preferente de entre dicho grupo debido a que elimina la cadena
lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la
conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham
et al., Science 244:101, 1989]. La alanina también es
típicamente preferente debido a que es el aminoácido más común.
Además, frecuentemente se encuentra en posiciones tanto enterradas
como expuestas [Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co.,
NY); Chothia, J. Mol. Biol. 50:1, 1976].
Las variaciones en la secuencia del ligando
Apo-2 también comprendidas dentro del alcance de la
invención se refieren a derivados aminoterminales o a formas
modificadas. Entre dichas secuencias de ligando
Apo-2 se incluyen cualquiera de los polipéptidos
ligandos de Apo-2 indicados en la presente invención
que presentan una metionina o una metionina modificada (tal como
formil-metionilo u otras especies de metionilo
bloqueadas) en el extremo N-terminal de la secuencia
del polipéptido.
El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN
genómico) codificante de un ligando Apo-2 nativo o
variante puede insertarse en un vector replicable para la clonación
adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. Diversos
vectores se encuentran disponibles públicamente. Los componentes de
vector generalmente incluyen, aunque sin limitarse a ellos, uno o
más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de
replicación, uno o más genes marcadores, un elemento
intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de
transcripción, cada uno de los cuales se describe
posteriormente.
El ligando Apo-2 puede
producirse por recombinación no sólo directamente, sino también en
forma de un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo,
que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que
presente un sitio de corte específico en el extremo
N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En
general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o
puede ser una parte del ADN del ligando Apo-2 que
se ha insertado en el vector. La secuencia de señal heteróloga
seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada
(es decir, cortada por una peptidasa de señal) por la célula
huésped. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal
procariótica seleccionada, por ejemplo de entre el grupo de la
fosfatasa alcalina, la penicilinasa, el lpp o los líderes de
enterotoxina II termoestables. Para la secreción en levaduras la
secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder de invertasa de
levadura, el líder de factor alfa (incluyendo los líderes de factor
\alpha de Saccharomyces y de Kluyveromyces, descrito
éste último en la patente US nº 5.010.182) o el líder de fosfatasa
ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (patente EP nº
362.179, publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en la
patente WO nº 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la
expresión de las células de mamífero la presecuencia del ligando
Apo-2 nativo que normalmente dirige la inserción
del ligando Apo-2 en la membrana celular de las
células humanas in vivo es satisfactoria, aunque pueden
utilizarse otras secuencias de señal de mamífero para dirigir la
secreción de la proteína, tal como secuencias de señal de
polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie
relacionada, así como líderes secretorios víricos, por ejemplo la
señal de glucoproteína D de herpes simplex.
El ADN para dicha región precursora
preferentemente se liga en el mismo marco de lectura del ADN
codificante del ligando Apo-2.
Los vectores tanto de expresión como de
clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que
el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas.
Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una
que permite que el vector se replique independientemente del ADN
cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o
secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien
conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El
origen de replicación procedente del plásmido pBR322 resulta
adecuado para la mayoría de las bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu
resulta adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para clonar
vectores en células de mamífero. Generalmente el componente origen
de replicación no resulta necesario para los vectores de expresión
de mamífero (típicamente resulta posible utilizar el origen de SV40
debido a que contiene el promotor temprano).
La mayoría de los vectores de expresión son
vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicación en
por lo menos una clase de organismo, pero pueden transfectarse en
otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona
en E. coli y después el mismo vector se transfecta en células
de levadura o de mamífero para la expresión aunque no es capaz de
replicarse independientemente del cromosoma de la célula
huésped.
El ADN también puede amplificarse mediante
inserción en el genoma huésped. Esto se consigue fácilmente
utilizando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo
mediante inclusión en el vector de una secuencia de ADN que es
complementaria a una secuencia que se encuentra en el ADN genómico
de Bacillus. La transfección de Bacillus con este
vector resulta en la recombinación homóloga con el genoma y en la
inserción del ADN del ligando Apo-2. Sin embargo,
la recuperación del ADN genómico codificante del ligando
Apo-2 es más compleja que la de un vector
exógenamente replicado debido a que resulta necesaria la digestión
con enzima de restricción para extraer el ADN del ligando
Apo-2.
Los vectores de expresión y de clonación
típicamente contienen un gen de selección, también denominado
marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria
para la supervivencia o el crecimiento de las células huésped
transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las
células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen
de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de
selección típicos codifican proteínas que: (a) proporcionan
resistencia a antibióticos o a otras toxina, por ejemplo
ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan
deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no
disponibles de medios complejos, por ejemplo el gen codificante de
la D-alanina racemasa para los Bacilli.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un
fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas
células que resultan transformadas con éxito con un gen heterólogo
producen una proteína que proporciona resistencia a fármaco y de
esta manera sobreviven el régimen de selección. Los ejemplos de
dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina [Southern
et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:327, 1982], ácido
micofenólico [Mulligan et al., Science 209:1422, 1980] o
higromicina [Sugden et al., Mol. Cell. Biol.
5:410-413, 1985]. Los tres ejemplos proporcionados
anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control eucariótico
para proporcionar resistencia frente al fármaco apropiado: G418 o
neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina,
respectivamente.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de células componentes para incorporar el ácido
nucleico del ligando Apo-2, tal como DHFR o
timidina quinasa. Las células de mamífero transformantes se sitúan
bajo una presión selectiva que sólo los transformantes se
encuentran específicamente adaptados para sobrevivir en virtud de
que han incorporado el marcador. Se impone presión selectiva
mediante el cultivo de los transformantes bajo condiciones en las
que la concentración del agente de selección en el medio se
modifica sucesivamente, conduciendo de esta manera a la
amplificación de tanto el gen de selección como el ADN que codifica
el ligando Apo-2. La amplificación es el
procedimiento por el que los genes en mayor demanda para la
producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran
en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de
células recombinantes. Se sintetizan cantidades incrementadas de
ligando Apo-2 a partir del ADN amplificado. Entre
otros ejemplos de genes amplificables se incluyen metalotioneína I y
II, adenosina deaminasa y ornitina descarboxilasa.
Las células transformadas con l gen de selección
DHFR pueden identificarse en primer lugar mediante el cultivo de la
totalidad de los transformantes en un medio de cultivo que contenga
metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula
huésped apropiado en el caso de que se utilice DHFR de tipo salvaje
es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en
actividad de DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. A
continuación, las células transformadas se exponen a niveles
incrementados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de
múltiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, a múltiples
copias de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tal
como DN codificante del ligando Apo-2. Esta técnica
de amplificación puede utilizarse con cualquier huésped de otra
manera adecuado, por ejemplo ATCC nº CCL61 CHO-K1,
no obstante la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, sutiliza
un gen DHFR mutante que sea altamente resistente a Mtx (patente EP
nº 117.060).
Alternativamente, las células huésped
(particularmente los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR
endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN
codificante del ligando Apo-2, proteína DHFR de
tipo salvaje y otro marcador seleccionable, tal como
aminoglucósido-3'-fosfotransferasa
(APH), pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en medio
que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable,
tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo canamicina,
neomicina o G418 (ver la patente US nº 4.965.199).
Un gen de selección adecuado para la utilización
en levaduras es el gen trp1 presentes en el plásmido de levadura
YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et
al., Gene 7:141, 1979; Tschemper et al., Gene 10:157,
1980]. El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una
cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en
triptófano, por ejemplo ATCC nº 44076 o PEP4-1
[Jones, Genetics 85:23-33, 1977]. La presencia de
la lesión en trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura
proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la
transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano.
De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2
(ATCC nº 20.622 o nº 38.626) se complementan con plásmidos conocidos
que portan el gen Leu2.
Además, los vectores derivados del plásmido
circular pKD1 de 1,6 \mum pueden utilizarse para la transformación
de levaduras Kluyveromyces [Bianchi et al., Curr.
Genet. 12:185, 1987]. Más recientemente, se ha informado de un
sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina
bovina recombinante para K. lactis [Van den Berg,
Bio/Technology 8:135, 1990]. También se ha dado a conocer vectores
de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina
sérica recombinante madura por cepas industriales de
Kluyveromyces [Fleer et al., Bio/Technology
9:968-975, 1991].
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de expresión y de clonación
habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el
organismo huésped y se encuentra operablemente ligado a la secuencia
de ácido nucleico del ligando Apo-2. Los promotores
son secuencias no traducidas situadas cadena arriba (5') del codón
de inicio de un gen estructural (generalmente a menos de
aproximadamente 100 a 1.000 pb) que controlan la transcripción y la
traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, tal como
la secuencia de ácido nucleico del ligando Apo-2, al
que se encuentran operablemente ligados. Dichos promotores
típicamente se clasifican en dos grupos: inducibles y
constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician
niveles incrementados de transcripción a partir del ADN bajo su
control en respuesta a alguna modificación en las condiciones de
cultivo, por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un
cambio de temperatura. En la actualidad son bien conocidos un gran
número de promotores reconocidos por una diversidad de potenciales
células huésped. Estos promotores se ligan operablemente a ADN
codificante del ligando Apo-2 mediante la
eliminación del promotor del ADN fuente mediante la digestión con
enzimas de restricción y la inserción de la secuencia aislada de
promotor en el vector. Tanto la secuencia de promotor del ligando
Apo-2 nativo y muchos promotores heterólogos pueden
utilizarse para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN
del ligando Apo-2.
Los promotores adecuados para la utilización con
huéspedes procarióticos incluyen los sistemas de promotor
\beta-lactamasa y lactosa [Chang et al.,
Nature 275:615, 1997; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979],
fosfatasa alcalina, un sistema de promotor triptófano (trp)
[Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980; patente EP nº 36.776] y
promotores híbridos, tales como promotor tac [deBoer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983]. Sin
embargo, resultan adecuados otros promotores bacterianos conocidos.
Las secuencias de nucleótidos de los mismos han sido publicadas,
permitiendo de esta manera que un experto en la materia las ligue
operablemente a ADN codificante del ligando Apo-2
[Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980] utilizando línkers o
adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción
requerido. Los promotores para la utilización en sistemas
bacterianos también contienen una secuencia de
Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN
codificante del ligando Apo-2.
Son conocidas secuencias de promotor para
eucariotas. Prácticamente la totalidad de los genes eucarióticos
presentan una región rica en AT situada aproximadamente 25 a 30
bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripción.
Otra secuencia que se encuentra 70 a 80 bases cadena arriba del
inicio de transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en la
que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría
de genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede
ser la señal para la adición de la cola poli-A en
el extremo 3' de la secuencia codificante. La totalidad de dichas
secuencias se insertan convenientemente en los vectores de expresión
eucarióticos.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para la utilización con huéspedes levadura se incluyen
los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
[Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980] u otros
enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149,
1968; Holland, Biochemistry 17:4900, 1978], tal como la enolasa, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que presentan la ventaja adicional de que la
transcripción está controlada por las condiciones de cultivo, son
las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el
isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos
asociados al metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la
glideraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y los enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
la utilización en la expresión en levaduras se describen
adicionalmente en la patente EP nº 73.657. Los intensificadores de
levadura también se utilizan ventajosamente con los promotores de
levadura.
La transcripción de ligando
Apo-2 a partir de vectores en células huésped de
mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de
genomas de virus, tales como el virus del polioma, el virus de la
viruela aviar (patente UK nº 2.211.504, publicada el 5 de julio de
19), el adenovirus (tal como el adenovirus 2), el virus del
papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un
retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el
virus 40 del simio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos,
por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, de
promotores de choque térmico, y del promotor normalmente asociado
con la secuencia del ligando Apo-2, con la condición
de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la
célula huésped.
Los promotores temprano y tardío del virus SV40
se obtienen convenientemente en forma de un fragmento de
restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación
vírico de SV40 [Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Mulligan
y Berg, Science 209:1422-1427, 1980; Pavlakiset
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:7398-7402, 1981]. El promotor temprano inmediato
del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente en forma de
un fragmento de restricción HindII [Greenaway et al., Gene
18:355-360, 1982]. Un sistema para expresar ADN en
huéspedes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como
vector se da a conocer en la patente US nº 4.419.446. Una
modificación de este sistema se describe en la patente US nº
4.601.978 [ver también Gray et al., Nature
295:503-508, 1982, sobre la expresión de ADNc
codificante de interferón inmunológico en células de mono; Reyes
et al., Nature 297:598-601, 1982, sobre la
expresión de ADNc de \beta-interferón humano en
células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa
del virus del herpes simplex; Canaani y Bergi, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79:5166-5170, 1982, sobre la expresión del
gen del interferón \beta1 humano en células de ratón y de conejo
en cultivo; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79:6777-6781, 1982, sobre la expresión de secuencias
CAT bacterianas en células renales de mono CV-1,
fibroblastos de embrión de polo, células de ovario de hámster
chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón
utilizando la repetición terminal larga del virus del sarcoma de
Rous como promotor].
La transcripción de un ADN codificante del
ligando Apo-2 por eucariotas superiores puede
incrementarse mediante la inserción de una secuencia
intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de
ADN que actúan en cis, habitualmente de entre aproximadamente 10 y
300 pb, que actúan sobre un promotor incrementando su
transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes
de la orientación y la posición, observándose en orientación 5'
[Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993, 1981] y
3' [Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3:1108, 1983] respecto a
la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji et
al, Cell 33:729, 1983], así como dentro de la secuencia
codificante misma [Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4:1293,
1984]. En la actualidad se conocen muchas secuencias
intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo,
típicamente se utiliza un intensificador de un virus de célula
eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de
SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el
intensificador de promotor temprano de citomegalovirus, el
intensificador del polioma en el lado tardío del origen de
replicación y los intensificadores de adenovirus (ver también Yaniv,
Nature 297:17-18, 1982) sobre elementos
intensificadores para la activación de promotores eucarióticos. El
intensificador puede introducirse en el vector en una posición 5' ó
3' respecto a la secuencia codificante del ligando
Apo-2, aunque preferentemente se localiza en un
sitio 5' respecto al
promotor.
promotor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de expresión utilizados en las
células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, células de
insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros
organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias
para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm.
Dichas secuencias se encuentran comúnmente disponibles de las
regiones 5', y ocasionalmente 3', no traducidas de ADNs o ADNcs
eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótidos transcrito como fragmentos poliadenilados en la parte no
traducida del ARNm codificante del ligando
Apo-2.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de los componentes anteriormente indicados
utiliza técnicas de ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos
de ADN aislados se corta, se adaptan y se religan en la forma
deseada para generar los plásmidos requeridos.
Para el análisis de confirmación de las
secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de
ligación pueden utilizarse para transformar la cepa 294 de E.
coli K12 (ATCC nº 31.446) y los transformantes con éxito
seleccionados para la resistencia a ampicilina o a tetraciclina, en
su caso. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se
analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción y/o se
secuencian mediante el procedimiento de Messing et al.,
Nucleic Acids Res. 9:309, 1981, o mediante el procedimiento de Maxam
et al., Methods in Enzymology 65:499, 1980.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden utilizarse vectores de expresión que
permiten la expresión transitoria en las células de mamífero de ADN
codificante de ligando Apo-2. En general, la
expresión transitoria implica la utilización de un vector de
expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula
huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del
vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un
polipéptido deseado codificado por el vector de expresión [Sambrook
et al., supra]. Los sistemas de expresión transitoria, que
comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped,
permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos
codificados por los ADNs clonados, así como el cribado rápido de
dichos polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas
deseadas. De esta manera, los sistemas de expresión transitoria
resultan particularmente útiles en la invención con fines de
identificación de análogos y variantes del ligando
Apo-2 que son ligando Apo-2
biológicamente
activo.
activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros procedimientos, vectores y células huésped
adecuados para la adaptación a la síntesis de ligando
Apo-2 en cultivo celular de vertebrado recombinante
se describen en Gething et al., Nature
293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature
281:40-46, 1979; patente EP nº 117.060 y patente EP
nº 117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión en
cultivo celular de mamífero del ligando Apo-2 es
pRK5 [patente EP nº 307.247, también descrito en el Ejemplo 1] o
pSV16B [patente WO nº 91/08291, publicada el 13 de junio de
1991].
\vskip1.000000\baselineskip
Las células huésped adecuadas para la clonación
o la expresión del ADN en los vectores de la presente invención son
las células procarióticas, de levadura o de eucariota superior
indicadas anteriormente. Entre los procariotas adecuadas para este
fin se incluyen, aunque sin limitación, eubacterias, tales como los
organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo enterobacteriáceas,
tales como EScherichia, por ejemplo E. coli,
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por
ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo
Serratia marcescans, y Shigella, así como
Bacilli, tal como B. subtilis y B.
licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P, dado a
conocer en la patente DD nº 266.710, publicada el 12 de abril de
1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa y
Streptomyces. Preferentemente, la célula huésped debe
secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos.
Además de los procariotas, los microbios
eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras,
resultan huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los
vectores codificantes del ligando Apo-2.
Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es
el microorganismo huésped eucariótico inferior más comúnmente
utilizado. Sin embargo, se encuentran comúnmente disponibles y
resultan útiles en la presente invención varios otros géneros,
especies y cepas.
Las células huésped adecuadas para la expresión
de ligando Apo-2 glucosilado se derivan a partir de
organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de
actividades complejas de procesamiento y glucosilación. En
principio, cualquier cultivo de células eucarióticas superiores es
trabajable, sea de cultivo de vertebrado o de invertebrado. Entre
los ejemplos de células de invertebrado se incluyen células
vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y
variantes baculovíricas y células huésped de insecto permisivas
correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera
frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes
albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de
la fruta) y Bombyx mori [ver, por ejemplo, Luckow et
al., Bio/Technology 6:47-55, 1988; Miller et
al., en: Genetic Engineering, Setlow et al., editores,
vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), páginas 277 a 279, y Maeda et
al., Nature 315:592-594, 1985]. Se encuentran
públicamente disponibles una diversidad de cepas víricas, por
ejemplo la variante L-1 de Autographa
californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx
mori NPV, y dichos virus pueden utilizarse como el virus según
la presente invención, particularmente para la transfección de
células de Spodoptera frugiperda ("Sf9"), descrito en el
Ejemplo 2.
Pueden utilizarse como huéspedes cultivos de
células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y
tabaco. Típicamente las células vegetales se transfectan mediante
incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium
tumefaciens, que ha sido previamente manipulado para que
contenga ADN codificante del ligando Apo-2. Durante
la incubación del cultivo de células vegetales con A.
tumefaciens, el ADN codificante del ligando
Apo-2 se transfiere a la célula vegetal huésped, de
manera que se transfecta y expresará, bajo las condiciones
apropiadas, el ADN codificante del ligando Apo-2.
Además, las secuencias reguladoras y de señal compatibles con las
células vegetales se encuentran disponibles, tal como el promotor de
la nopalina sintasa y las secuencias de señal de poliadenilación
[Depickeret et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:561, 1982]. Además,
los segmentos de ADN aislados de la región del ADN-T
del gen 780 son capaces de activar o de incrementar los niveles de
transcripción de los genes expresables en plantas en tejido vegetal
que contiene ADN recombinante [patente EP nº 321.196, publicada el
21 de junio de 1989].
La propagación de las células de vertebrado en
cultivo (cultivo de tejidos) también es bien conocida de la técnica
[ver, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y
Patterson, editores, 1973]. Son ejemplos de líneas celulares
huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono
transformada con SV40 (COS-7, ATCC nº CRL 1651),
línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas
para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al.,
J. Gen. Virol. 36:59, 1977), células de riñón de hámster neonato
(BHK, ATCC nº CCL 10), células de ovario de hámster chino/-DHFR
(CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980),
células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.
23:243-251, 1980), células de riñón de mono (CV 1,
ATCC nº CCL 70), células de riñón de mono verde africano
(VERO-76, ATCC nº CRL-1587),
células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC nº CCL 2), células
de riñón canino (MDCK, ATCC nº CCL 34), células de hígado de rata
búfalo (BRL 3A, ATCC nº CRL 1442), células pulmonares humanas (W138,
ATCC nº CCL75), células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065), tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC nº CCL51), células TRI (Mather
et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68,
1982), células MRC 5 y células FS4.
Las células huésped se transfectan y
preferentemente se transforman con los vectores de expresión o de
clonación anteriormente indicados, para la producción de ligando
Apo-2 y se cultivan en medio nutritivo convencional
modificado según resulte apropiado para inducir promotores,
seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de
las secuencias deseadas.
La transfección se refiere a la incorporación de
un vector de expresión por una célula huésped, se expresen o no
realmente alguna secuencia codificante. Son conocidos del experto
ordinario en la materia numerosos procedimientos de transfección,
por ejemplo CaPO_{4} y la electroporación. La transfección con
éxito se reconoce generalmente cuando se produce alguna indicación
del funcionamiento de dicho vector dentro de la célula huésped.
La transformación se refiere a introducir ADN en
un organismo, de manera que el ADN es replicable, en forma de un
elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Dependiendo
de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza
utilizando técnicas estándares apropiadas para dichas células. El
tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se
describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación, se
utiliza generalmente para procariotas u otras células que contienen
barreras de pared celular sustanciales. La infección por
Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación
de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et
al., Gene 23:315, 1983, y la patente WO nº 89/05859, publicada
el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden transfectarse
utilizando el tratamiento de ultrasonidos, tal como se describe en
la patente WO nº 91/00358, publicada el 10 de enero de 1991.
Para las células de mamífero sin dichas paredes
celulares, resulta preferente el procedimiento de precipitación con
fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology
52:456-457, 1978. Se han descrito aspectos generales
de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero
en la patente US nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras
típicamente se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen
et al., J. Bact. 130:946, 1977, y Hsiao et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden
utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en células,
tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión
de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por
ejemplo polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas de
transformación de células de mamífero, ver Keown et al.,
Methods in Enzymology 185:527-537, 1990, y Mansour
et al., Nature 336:348-352, 1988.
Las células procarióticas utilizadas para
producir ligando Apo-2 pueden cultivarse en medio
adecuado tal como se describe de manera general en Sambrook et
al., supra.
Las células huésped de mamífero utilizadas para
producir ligando Apo-2 pueden cultivarse en una
diversidad de medios. Entre los ejemplos de medios disponibles
comercialmente se incluyen F10 de Ham (Sigma), medio esencial
mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y
medio de Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma).
Cualquiera de dichos medios puede suplementarse según resulte
necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales
como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico),
sales (tal como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato),
tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y
timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin^{TM}),
elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente
presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y
glucosa o una fuente energética equivalente. También pueden
incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones
apropiadas que resultarán conocidas para el experto en la materia.
Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y
similares, son aquéllas utilizadas anteriormente con la célula
huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para
el experto ordinario en la materia.
En general, pueden encontrarse los principios,
protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de
cultivos de células de mamífero en Mammalian Cell Biotechnology: A
Practical Approach, M. Butler, editor (IRL Press, 1991).
Las células huésped a las que se hace referencia
en la presente exposición comprenden células en cultivo, así como
células que se encuentran dentro de un animal huésped.
La amplificación y/o expresión génicas pueden
medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante
transferencia southern-northern convencional para
cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77:5201-5205, 1980], transferencia por
puntos (análisis del ADN) o hibridación in situ, utilizando
una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias
proporcionadas en la presente invención. Pueden utilizarse diversos
marcajes, más comúnmente isótopos radioactivos, y particularmente
^{32}P. Sin embargo, también pueden utilizarse otras técnicas,
tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina
para la introducción en un polinucleótido. En este caso la biotina
sirve como el sitio para la unión a avidina o a antibióticos, que
pueden marcarse con una amplia diversidad de marcajes, tales como
radionucleótidos, compuestos fluorescentes o enzimas.
Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que puedan reconocer
dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y
dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden
marcarse y el ensayo llevarse a cabo donde el dúplex se encuentra
unido a una superficie, de manera que tras la formación de dúplex
sobre la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo
unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión génica puede
medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la
tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido y el
ensayo de cultivo celular o de líquidos corporales, para
cuantificar directamente la expresión del producto génico. Con las
técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra
celular, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguido de
reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto
génico acoplado, en el que los marcajes habitualmente son
detectables visualmente, tal como marcajes enzimáticos, marcajes
fluorescentes, marcajes luminiscentes y similares.
Los anticuerpos útiles para la tinción
inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra pueden ser
monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier
mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse
contra un polipéptido ligando Apo-2 nativo o contra
un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas
en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada
con ADN del ligando Apo-2 y codificante de un
epítopo de anticuerpo específico
El ligando Apo-2 preferentemente
se recupera del medio de cultivo en forma de polipéptido secretado,
aunque también puede recuperarse de lisados de las células huésped
cuando se produce directamente sin una señal secretoria. Si el
ligando Apo-2 se encuentra unido a membrana, puede
liberarse de la membrana utilizando una solución detergente
adecuada (por ejemplo Triton X-100) o puede
liberarse su región extracelular mediante corte enzimático.
Al producir el ligando Apo-2 en
una célula recombinante que no sea de origen humano, el ligando
Apo-2 se encuentra libre de proteínas o de
polipéptidos de origen humano. Sin embargo, habitualmente resulta
necesario purificar el ligando Apo-2 de proteínas o
polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que
sean sustancialmente homogéneas respecto al ligando
Apo-2. Como primera etapa, el medio de cultivo o
lisado puede centrifugarse para eliminar los residuos celulares
particulados. Después, el ligando Apo-2 se purifica
de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, siendo los
procedimientos siguientes ejemplares de procedimientos de
purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de
intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase reversa;
cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico,
tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por
ejemplo, Sephadex G-75, y columnas de proteína
A-sefarosa para eliminar contaminantes, tales como
IgG.
En una realización preferente, el ligando
Apo-2 puede aislarse mediante cromatografía de
afinidad, tal como se describe en el Ejemplo 3.
Las variantes del ligando Apo-2
en las que los residuos han sido delecionados, insertados o
sustituidos se recuperan de la misma manera que el ligando
Apo-2 nativo, teniendo en cuenta cualquier cambio
sustancial de las propiedades ocasionado por la variación. Por
ejemplo, la preparación de una fusión de ligando
Apo-2 con otra proteína o polipéptido, por ejemplo
un antígeno bacteriano o vírico, facilita la purificación; puede
utilizarse una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpo
contra el antígeno para adsorber el polipéptido de fusión. En una
realización preferente, se fusiona una secuencia extracelular del
ligando Apo-2 con un péptido His_{10} y se
purifica mediante cromatografía de afinidad de
Ni^{2+}-quelato.
Un inhibidor de proteasa, tal como el fenil
metil sulfonil fluoruro (PMSF) también puede resultar útil para
inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y
pueden incluirse antibióticos para impedir el crecimiento de
contaminantes adventicios. Un experto en la materia apreciará que
los procedimientos de purificación adecuados para el ligando
Apo-2 nativo pueden requerir modificaciones para
ajustarse a cambios en el carácter del ligando Apo-2
o las variantes del mismo tras la expresión en cultivo celular
recombinante.
Las modificaciones covalentes del ligando
Apo-2 se encuentran comprendidas dentro del alcance
de la presente invención. Tanto el ligando Apo-2
nativo como las variantes de secuencia de aminoácidos del ligando
Apo-2 pueden modificarse covalentemente. Un tipo de
modificación covalente del liando de Apo-2 se
introduce en la molécula mediante la reacción de los residuos
aminoácidos diana del ligando Apo-2 con un agente
derivatizante que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o con los residuos N-terminales o
C-terminales del ligando Apo-2.
La derivatización con agentes bifuncionales
resulta útil para entrecruzar el ligando Apo-2 con
una matriz de soporte o superficie insoluble en agua para la
utilización en el procedimiento para purificar los anticuerpos
anti-ligando Apo-2 y viceversa.
Entre los agentes entrecruzantes utilizados comúnmente se incluyen,
por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por
ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifucionales, incluyendo disuccinimidilésteres,
tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y
maleimidas bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano.
Los agentes derivatizantes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato
rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar
enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, para la
inmovilización de proteínas se utilizan matrices reactivas
insolubles en agua, tales como carbohidratos activados por bromuro
de cianógeno y los sustratos reactivos indicados en las patentes US
nº 3.969.287, nº 3.691.016, nº 4.195.128, nº 4.247.642, nº 4.229.537
y nº 4.330.440.
Entre otras modificaciones se incluyen la
desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo en los residuos
glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente; la
hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos
hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los
grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de
lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure
and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco,
páginas 79 a 86, 1983], la acetilación de la amina
N-terminal y la amidación de cualquier grupo
carboxilo C-terminal. Las formas modificadas de los
residuos se encuentran comprendidas dentro del alcance de la
presente invención.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido ligando Apo-2 incluido dentro del
alcance de la presente invención comprende alterar el patrón de
glucosilación nativo del polipéptido. La expresión "alterar el
patrón de glucosilación nativo" pretende, para los fines de la
presente invención, referirse a la deleción de uno o más grupos
carbohidrato presentes en el ligando Apo-2 nativo
y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no se
encuentran presentes en el ligando Apo-2 nativo.
La glucosilación de los polipéptidos típicamente
está N-ligada u O-ligada. La
glucosilación N-ligada se refiere a la unión del
grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las
secuencias tripéptido
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, en las que X
es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la
cadena lateral de la asparagina. De esta manera, la presencia de
cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea
un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación
O-ligada se refiere a la unión de uno de los
azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa
a un ácido hidroxilamino, más comúnmente serina o treonina, aunque
también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glucosilación al
polipéptido ligando Apo-2 puede conseguirse mediante
la alteración de la secuencia de aminoácidos e manera que contenga
una o más de las secuencias tripéptido anteriormente indicadas
(para sitios de glucosilación N-ligada). La
alteración también puede realizarse mediante la adición o la
sustitución de uno o más residuos serina o treonina en la secuencia
del ligando Apo-2 nativo (para los sitios de
glucosilación N-ligada). La secuencia de aminoácidos
del ligando Apo-2 opcionalmente puede alterarse
mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mediante la
mutación del ADN codificante del polipéptido ligando
Apo-2 en bases preseleccionadas, de manera que se
genere codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados. La
mutación o mutaciones del ADN pueden realizarse utilizando
procedimientos indicados anteriormente y en la patente US nº
5.364.934, supra.
Otro medio para incrementar el número de grupos
carbohidrato en el polipéptido ligando Apo-2 es
mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al
polipéptido. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el
azúcar o azúcares pueden unirse a: (a) arginina e histidina, (b)
grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como
aquellos de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, tales como
aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos
aromáticos, tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o
triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos
procedimientos se describen en la patente WO nº 87/05330, publicada
el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev.
Biochem., páginas 259 a 306, 1981.
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido ligando Apo-2 puede conseguirse
químicamente o enzimáticamente. Por ejemplo, la desglucosilación
química que expone el polipéptido al compuesto ácido
trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente puede resultar
en la expulsión de la mayoría o de la totalidad de los azúcares,
excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o
N-acetilgalactosamina), dejando el polipéptido
intacto. La desglucosilación química se describe en Hakimuddin
et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987, y por Edge
et al., Anal. Biochem. 118:131, 1981. El corte enzimático de
los grupos carbohidrato en los polipéptidos puede conseguirse
mediante la utilización de una diversidad de endoglucosidasas y
exoglucosidasas, tal como describen Thotakura et al., Meth.
Enzymol. 138:350, 1987.
La glucosilación en los potenciales sitios de
glucosilación puede impedirse mediante la utilización del compuesto
tunicamicina, tal como describen Duskin et al., J. Biol.
Chem. 257:3105, 1982. La tunicamicina bloquea la formación de los
enlaces proteína-N-glucósido.
Otro tipo de modificación covalente del ligando
Apo-2 comprende la unión del polipéptido ligando
Apo-2 a uno de entre una diversidad de polímeros
proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o
polioxialquilenos, de la manera indicada, por ejemplo, en las
patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417,
nº 4.791.192 o nº 4.179.337.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona
polipéptidos quiméricos que comprenden ligando Apo-2
fusionado con otro polipéptido heterólogo. En una realización, el
polipéptido quimérico comprende la fusión del ligando de
Apo-2 con un polipéptido etiqueta que proporciona un
epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo
anti-etiqueta. La etiqueta epítopo generalmente se
sitúa en el extremo aminoterminal o
carboxilo-terminal del ligando
Apo-2. La presencia de dichas formas etiquetadas con
epítopo del ligando Apo-2 pueden detectarse
utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la
provisión de la etiqueta epítopo permite que el ligando
Apo-2 se purifique con facilidad mediante
purificación de afinidad utilizando un anticuerpo
anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que
se une a la etiqueta epítopo.
Son bien conocidos de la técnica diversos
polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Entre los
ejemplos se incluyen el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su
anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol.
8:2159-2165, 1988]; la etiqueta
c-myc y los anticuerpos del mismo 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology
5:3610-3616, 1985]; y la etiqueta glucoproteína D
(gD) del virus del herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et
al., Protein Engineering 3(6):547-553,
1990]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido
Flag [Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210,
1988]; el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science
255:192-194, 1992]; un péptido epítopo
\alpha-tubulina [Skinneret et al., J.
Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991]; y la etiqueta
péptido de la proteína del gen 10 de T7
[Lutz-Freyermuthet et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:6393-6397, 1990]. Tras la selección del
polipéptido etiqueta, puede generarse un anticuerpo del mismo
utilizando las técnicas dadas a conocer en la presente
invención.
\newpage
Generalmente, el ligando Apo-2
etiquetado con epítopo puede construirse y producirse de acuerdo con
los procedimientos descritos anteriormente para el ligando
Apo-2 nativo y variante. Las fusiones de ligando
Apo-2-polipéptido etiqueta
preferentemente se construyen mediante la fusión de la secuencia de
ADNc codificante de la parte de ligando Apo-2 en el
mismo marco de lectura de la secuencia de ADN del polipéptido
etiqueta y mediante la expresión del constructo de fusión de ADN
resultante en células huésped apropiadas. Habitualmente, al
preparar las quimeras de ligando
Apo-2-polipéptido etiqueta de la
presente invención, el ácido nucleico codificante del ligando
Apo-2 se fusiona en su extremo 3' del ácido nucleico
codificante del extremo N-terminal del polipéptido
etiqueta, sin embargo las fusiones 5' también resultan posibles. Se
describen ejemplos de ligando Apo-2 etiquetado con
epítopo en más detalle en el Ejemplo 2, posteriormente.
El ligando Apo-2 etiquetado con
epítopo puede purificarse mediante cromatografía de afinidad
utilizando el anticuerpo anti-etiqueta. La matriz a
la que se une el anticuerpo de afinidad puede incluir, por ejemplo,
agarosa, vidrio de poro controlado o
poli(estirenodivinil)benceno). El ligando
Apo-2 etiquetado con epítopo seguidamente puede
eluirse de la columna de afinidad utilizando técnicas conocidas de
la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando Apo-2, tal como se da
a conocer en la presente especificación, puede utilizarse
terapéuticamente. Por ejemplo, el ligando Apo-2
puede utilizarse para inducir la apóptosis en las células de cáncer
de mamífero. Generalmente, los procedimientos para inducir la
apóptosis en las células de cáncer de mamífero comprenden exponer
las células a una cantidad eficaz de ligando Apo-2.
Esto puede conseguirse in vivo o ex vivo de acuerdo,
por ejemplo, con los procedimientos descritos posteriormente y en
los Ejemplos. Se contempla que los procedimientos para inducir la
apóptosis puedan utilizarse en terapias para condiciones patológicas
particulares que se caracterizan por niveles reducidos de
apóptosis. Entre los ejemplos de dichas condiciones patológicas se
incluyen trastornos autoinmunológicos como el lupus y la nefritis
glomerular mediada inmunológicamente, y el cáncer. La aplicación
terapéutica del ligando Apo-2 para el tratamiento
del cáncer se describe en detalle posteriormente.
En los procedimientos para tratar el cáncer, el
ligando Apo-2 se administra en un mamífero que se ha
diagnosticado que presenta cáncer. Evidentemente se contempla que
el ligando Apo-2 pueda utilizarse en combinación
con todavía otras composiciones y técnicas terapéuticas, incluyendo
otros agentes inductores de apóptosis, quimioterapia, terapia de
radiación y cirugía.
El ligando Apo-2 preferentemente
se administra en el mamífero en un portador. Los portadores
adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16a edición, 1980, Mack Publishing Co.,
editado por Oslo et al. Típicamente se utiliza una cantidad
apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación
para que la formulación sea isotónica. Entre los ejemplos de
portador farmacéuticamente aceptable se incluyen solución salina,
solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución
preferentemente se encuentra comprendido entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 8, y más preferentemente entre aproximadamente 7,4
y aproximadamente 7,8. Resultará evidente para los expertos en la
materia que determinados portadores pueden resultar más preferentes
dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la
concentración de ligando Apo-2 que se
administra.
El ligando Apo-2 puede
administrarse en el mamífero mediante inyección (por ejemplo
intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular) o mediante
otros procedimientos, tales como la infusión que garantizan su
administración en el flujo sanguíneo de una forma eficaz (ver, por
ejemplo, la figura 15). También se encuentra contemplado que el
ligando Apo-2 pueda administrarse mediante terapia
génica in vivo o ex vivo.
Las dosis y programas eficaces para administrar
el ligando Apo-2 pueden determinarse empíricamente
y la realización de dichas determinaciones se encuentra comprendida
dentro de los conocimientos de la técnica. En la actualidad se cree
que una dosis o cantidad eficaz de ligando Apo-2
utilizado solo puede encontrarse comprendida entre aproximadamente
1 \mug/kg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más al
día. El escalado interespecífico de dosis puede llevarse a cabo de
una manera conocida de la técnica, por ejemplo tal como dan a
conocer Mordenti et al., Pharmaceut. Res. 8:1351, 1991. Los
expertos en la materia entenderán que la dosis de ligando
Apo-2 que debe administrarse variará dependiendo,
por ejemplo, del mamífero que recibirá el ligando
Apo-2, de la vía de administración y de otros
fármacos o terapias administradas en el mamífero.
La otra u otras terapias administradas en el
mamífero pueden incluir, aunque sin limitarse a ellas,
quimioterapia y/o radioterapia, inmunoadyuvantes, citoquinas y
terapias basadas en anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen
interleuquinas (por ejemplo IL-1,
IL-2, IL-3, IL-6),
factor inhibidor de la leucemia, interferones,
TGF-beta eritropoyetina, trombopoyetina, anticuerpo
anti-VEGF y anticuerpo HER-2.
También pueden utilizarse otros agentes que es conocido que inducen
la apóptosis en células de mamífero, y entre estos agentes se
incluyen TNF-\alpha, TNF-\beta
(linfotoxina-\alpha), ligando CD30, ligando
4-1BB y ligando Apo-1.
Entre las quimioterapias contempladas por la
invención se incluyen sustancias químicas o fármacos conocidos de
la técnica y que se encuentran comercialmente disponibles, tales
como doxorubicina, 5-fluorouracilo
("5-FU"), etopósido, camptotecina,
leucovorina, citosina arabinósido ("Ara-C"),
ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, metotrexato,
cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino. Los programas de
preparación y de dosificación para dicha quimioterapia pueden
utilizarse siguiendo las instrucciones del fabricante o según
determine empíricamente el experto en la materia. Los programas de
preparación y de dosificación para dicha quimioterapia también se
describen en: Chemotherapy, Service Ed., M.C. Perry, Williams &
Wilkins, Baltimore, MD, 1992.
La quimioterapia preferentemente se administra
en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como los indicados
anteriormente para el ligando Apo-2. La vía de
administración de la quimioterapia puede ser la misma que la
utilizada para el ligando Apo-2 o puede
administrarse en el mamífero por una vía diferente. Las vías de
administración de quimioterapia en combinación con ligando
Apo-2 se describen en más detalle en los Ejemplos 9
a 12, posteriormente.
La terapia de radiación puede administrarse en
el mamífero siguiendo los protocolos comúnmente utilizados en la
técnica y que son conocidos para el experto en la materia. Entre
dichas terapias se incluyen la radiación de cesio, iridio, yodo o
cobalto. La terapia de radiación puede ser irradiación de cuerpo
completo o puede dirigirse localmente a un sitio o tejido
específico dentro o sobre el cuerpo. Típicamente la terapia de
radiación se administra en pulsos a lo largo de un periodo de
tiempo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 semanas. Sin
embargo, la terapia de radiación puede administrarse a lo largo de
periodos de tiempo más prolongados. Opcionalmente la terapia de
radiación puede administrarse en forma de dosis única o en forma de
múltiples dosis secuenciales.
El ligando Apo-2 y una o más
otras terapias pueden administrarse en el mamífero simultáneamente o
secuencialmente. Tras la administración del ligando
Apo-2 y una o más otras terapias en el mamífero,
puede realizarse el seguimiento del cáncer y condición fisiológica
del mamífero de diversas maneras bien conocidas para el experto en
la materia. Por ejemplo, puede observarse la masa tumoral
físicamente, mediante biopsia o mediante técnicas de formación de
imágenes de rayos X.
Se encuentra contemplado que pueda utilizarse el
ligando Apo-2 para tratar células de cáncer ex
vivo. Este tratamiento ex vivo puede resultar útil en el
trasplante de médula ósea y particularmente el trasplante de médula
ósea autóloga. Por ejemplo, el tratamiento de las células o tejido o
tejidos que contienen células d cáncer con ligando
Apo-2 y opcionalmente con una o más otras terapias,
tales como las indicadas anteriormente, puede utilizarse para
inducir la apóptosis y reducir sustancialmente el número de células
de cáncer antes del trasplante en un mamífero receptor.
Las células o tejido o tejidos que contienen
células de cáncer en primer lugar se obtienen a partir de un animal
donante. Las células o tejido o tejidos pueden obtenerse
quirúrgicamente y preferentemente se obtienen asépticamente. En el
procedimiento de tratamiento de la médula ósea para el trasplante,
la médula ósea se obtiene del mamífero mediante aspiración con
aguja. Las células o tejido o tejidos que contienen células de
cáncer seguidamente se tratan con ligando Apo-2 y
opcionalmente con una o más otras terapias, tales como las
indicadas anteriormente. La médula ósea preferentemente se fracciona
para obtener una fracción de células mononucleares (por ejemplo
mediante centrifugación en un gradiente de
Ficoll-hypaque) previamente al tratamiento con
ligando Apo-2.
Las células o tejido o tejidos tratados
seguidamente pueden infusionarse o trasplantarse en un mamífero
receptor. El mamífero receptor puede ser el mismo individuo donante
o puede ser otro individuo mamífero heterólogo. Para un trasplante
de médula ósea autóloga, el mamífero se trata previamente al
trasplante con una dosis eficaz de radiación o de quimioterapia,
como es conocido de la técnica y se describe, por ejemplo, en:
Autologous Bone Marrow Transplantation: Proceedings of the Third
International Symposium, Dicke et al., editores, University
of Texas, M.D. Anderson Hospital and Tumor Institute, 1987.
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El ligando Apo-2 de la invención
también presenta utilidad en aplicaciones no terapéuticas. Las
secuencias de ácidos nucleicos codificantes del ligando
Apo-2 pueden utilizarse como herramienta diagnóstica
para el tipado específico de tejido. Por ejemplo, procedimientos
tales como la hibridación in situ, la transferencia northern
y southern y el análisis de PCR pueden utilizarse para determinar si
el ADN y/o el ARN codificante del ligando Apo-2 se
encuentran presentes en el tipo o tipos celulares que se están
evaluando. El ácido nucleico del ligando Apo-2
también puede resultar útil para la preparación del polipéptido
Apo-2 mediante las técnicas recombinantes descritas
en la presente invención.
El ligando Apo-2 aislado puede
utilizarse en ensayos diagnósticos cuantitativos como control frente
al que pueden prepararse muestras que contienen cantidades
desconocidas de ligando Apo-2. Las preparaciones de
ligando Apo-2 también resultan útiles para generar
anticuerpos, como estándares en ensayos para el ligando
Apo-2 (por ejemplo mediante marcaje del ligando
Apo-2 para la utilización como estándar en un
radioinmunoensayo, ensayo de radiorreceptor o inunoensayo ligado a
enzima), en técnicas de purificación por afinidad, por ejemplo en
la identificación o en el aislamiento de un receptor que se une al
ligando Apo-2, y en ensayos de unión de receptor de
tipo competitivo al marcarse con, por ejemplo, radioyodo, enzimas o
fluoróforos.
Los ácidos nucleicos que codifican el ligando
Apo-2 también pueden resultar útiles para generar
animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez,
resultan útiles en el desarrollo y cribado de reactivos
terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón
o una rata) es un animal que presenta células que contienen un
transgén, el cual se introdujo en el genoma de una célula a partir
de la que se desarrolla un animal transgénico. En una realización,
puede utilizarse ADNc codificante del ligando Apo-2
o una secuencia apropiada del mismo, para clonar ADN genómico
codificante del ligando Apo-2 de acuerdo con
técnicas establecidas, y utilizarse las secuencias genómicas para
generar animales transgénicos que contienen células que expresan
ADN codificante del ligando Apo-2 Los procedimientos
para generar animales transgénicos, particularmente animales tales
como ratones o ratas, se han convertido en convencionales de la
técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes US nº
4.736.866 y nº 4.870.009. Típicamente se focaliza la incorporación
del transgén del ligando Apo-2 en células
particulares con intensificadores específicos de tejido. Los
animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén
codificante del ligando Apo-2 introducido en la
línea germinal del animal en un estadio embrionario pueden
utilizarse para examinar el efecto de la expresión incrementada del
ADN codificante del ligando Apo-2.
Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no
humanos del ligando Apo-2 para construir un animal
"knock out" para el ligando Apo-2 que presenta
un gen defectuoso o alterado codificante del ligando
Apo-2 como resultado de la recombinación homóloga
entre el gen endógeno codificante del ligando Apo-2
y ADN genómico alterado codificante del ligando
Apo-2 introducido en una célula embrionaria del
animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc codificante del ligando
Apo-2 para clonar ADN genómico codificante del
ligando Apo-2 de acuerdo con técnicas establecidas.
Una parte del ADN genómico del ligando Apo-2 puede
delecionarse o sustituirse por otro gen, tal como un gen
codificante de un marcador seleccionable que puede utilizarse para
seguir la integración. Típicamente se incluyen en el vector varias
kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5'
como en el 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capechi, Cell 51:503,
1987, para una descripción de los vectores de recombinación
homóloga]. El vector se introduce en una línea celular madre
embrionaria (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan
las células en las que el ADN introducido se ha recombinado
homólogamente con el ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et
al., Cell 69:915, 1992]. A continuación, se inyectan las
células seleccionadas en un blastocito de un animal (por ejemplo un
ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [ver, por
ejemplo, Bradley, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A
Practical Approach, E.J. Robertson, editor (IRL, Oxford, 1987),
páginas 113 a 152]. A continuación, puede implantarse un embrión
quimérico en una hembra pseudoembarazada nodriza adecuada y llevarse
el embrión a término para crear un animal "knock out". La
progenie que porta el ADN recombinado homólogamente en sus células
germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y
utilizarse para criar animales en los que todas las células del
animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales
knockout pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de
defenderse frente a determinadas condiciones patológicas y por el
desarrollo en los mismos de condiciones patológicas debidas a la
ausencia del polipéptido ligando Apo-2.
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Asimismo, la presente invención proporciona
anticuerpos anti-Apo-2. Los
anticuerpos contra el ligando Apo-2 pueden
prepararse de la manera siguiente. Entre los anticuerpos ejemplares
se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados,
biespecíficos y heteroconjugados.
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Los anticuerpos del ligando
Apo-2 pueden comprender anticuerpos policlonales.
Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son
conocidos para el experto en la materia. Pueden cultivarse
anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo mediante una o
más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un
adyuvante. Típicamente el agente inmunizante y/o adyuvante se
inyectan en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas
o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el
polipéptido ligando Apo-2 o una proteína de fusión
del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizante con
una proteína que es conocido que es inmunogénica en el mamífero que
se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas
que pueden utilizarse se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la
hemocianina de lapa americana, la albúmina sérica, la tiroglobulina
bovina y el inhibidor de tripsina de soja. También puede utilizarse
un agente agregante, tal como alum, para potenciar la respuesta
inmunológica del mamífero. Entre los ejemplos de adyuvantes que
pueden utilizarse se incluyen adyuvante completo de Freund y
adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A,
dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de
inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia
sin experimentación indebida. A continuación, puede sangrarse el
mamífero y someterse a ensayo el suero para el título de
anticuerpos. Si se desea, el mamífero puede recibir un refuerzo
hasta que el título de anticuerpo se incrementa o alcance un nivel
máximo.
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Los anticuerpos del ligando
Apo-2 pueden ser, alternativamente, anticuerpos
monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden preparase
utilizando procedimientos de hibridoma, tales como aquellos
descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975. En un
procedimiento de hibridoma, típicamente se inmuniza (tal como se ha
descrito anteriormente) un ratón, hámster u otro animal huésped
apropiado con un agente inmunizante para inducir linfocitos que
producen, o son capaces de producir, anticuerpos que se unirán
específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los
linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante típicamente incluye el
polipéptido ligando Apo-2 o una proteína de fusión
del mismo. También pueden utilizarse células que expresan ligando
Apo-2 en la superficie de las mismas. Generalmente
se utilizan linfocitos sanguíneos periféricos ("PBLs") si se
desean células de origen humano, o se utilizan células de bazo o
células de nódulo linfático si se desean fuentes de mamífero no
humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea
celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal
como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
1986, páginas 59 a 103]. Las líneas celulares inmortalizadas
habitualmente son células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y
humano. Habitualmente se utilizan líneas celulares de mieloma de
rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un
medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen del enzima hipoxantina guanina
fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los
hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y
timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento
de las células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferentes
son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan niveles de
expresión elevados estables de anticuerpo por parte de las células
productoras de anticuerpo seleccionadas, y que son sensibles a un
medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más
preferentes son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse,
por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas,
Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma
de ratón-humano también han sido descritos para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol.
133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New
York, 1987, páginas 51 a 63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma seguidamente puede someterse a ensayo para la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el ligando
Apo-2. Preferentemente, la especificidad de unión
de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de
hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un
ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo
(RIA), la separación celular activada por fluoresceína (FACS) o el
ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA). Estas técnicas y
ensayos son conocidos de la técnica y se describen adicionalmente
en los Ejemplos, posteriormente. La afinidad de unión del
anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el
análisis de Scatchard de Munson y Rodbard, Anal. Biochem. 107:220,
1980.
Tras identificarse las células de hibridoma
deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de
dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares
[Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para
este fin se incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por
Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente,
las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma
de ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de
cultivo o líquido ascites mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
En una realización de la invención, entre los
anticuerpos monoclonales se pueden incluir los anticuerpos 1D1,
2G6, 2E11 o 5C2, indicados en la presente invención y en los
Ejemplos, posteriormente. Entre los anticuerpos monoclonales
también se pueden incluir anticuerpos que presentan las mismas
características biológicas que los anticuerpos monoclonales 1D1,
2G6, 2E11 o 5C2 secretados por las líneas celulares de hibridoma
depositadas bajo los números de acceso de la American Type Culture
Collection ATCC nº HB-12256,
HTB-12257, HB-12258 o
HB-12259, respectivamente. La expresión
"características biológicas" se utiliza para referirse a las
actividades in vitro y/o in vivo del anticuerpo
monoclonal, por ejemplo la capacidad de reducir o inhibir
sustancialmente la apóptosis inducida por el ligando
Apo-2, o de reducir sustancialmente o bloquear la
unión del ligando Apo-2 a su receptor. El
anticuerpo preferentemente se une al mismo epítopo, o
sustancialmente el mismo epítopo, que los anticuerpos 1D1, 2G6,
2E11 o 5C2 dados a conocer en la presente invención. Lo anterior
puede determinarse mediante la ejecución de ensayos descritos en la
presente invención y en los Ejemplos.
Los anticuerpos monoclonales también pueden
prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los descritos en la patente US nº 4.816.567. El ADN codificante de
los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y
secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales
(por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que
son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las
cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de
hibridoma de la invención son una fuente preferente de dicho ADN.
Tras su aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de
expresión, que después se transfectan en células huésped, tales
como las células COS de simio, células de ovario de hámster chino
(CHO) o células de mieloma que de otra manera no producirían
proteína inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
ADN también puede modificarse, por ejemplo mediante la sustitución
de la secuencia codificante de los dominios constante de cadena
pesada y ligera humanas en sustitución de las secuencias murinas
homólogas [patente US nº 4.816.567; Morrison et al., supra]
o mediante unión covalente a la secuencia codificante de
inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia codificante
de un polipéptido no inmunoglobulina. Este polipéptido no
inmunoglobulina puede sustituir los dominios constantes de un
anticuerpo de la invención o puede sustituir los dominios variables
de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la
invención, creando un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera de
inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada se
trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc de manera
que se impide el entrecruzamiento de la cadena pesada.
Alternativamente, los residuos cisteína relevantes se sustituyen
por otro residuo aminoácido o se delecionan, de manera que se impide
el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro también
resultan adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La
digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos,
particularmente los fragmentos Fab, puede conseguirse utilizando
técnicas rutinarias conocidas de la técnica. Por ejemplo, la
digestión puede llevarse a cabo utilizando papaína. Se describen
ejemplos de digestión con papaína en la patente WO nº 94/29348,
publicada el 22/12/1994 y en la patente US nº 4.342.566. La
digestión con papaína típicamente produce dos fragmentos ligantes
de antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un
único sitio de unión a antígeno, y un fragmento Fc residual. El
tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que
presenta dos sitios de unión a antígeno y que todavía es capaz de
entrecruzarse con antígeno.
Los fragmentos Fab producidos en la digestión
del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la
cadena ligera y del primer dominio constante (CH_{1}) de la cadena
pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la
adición de unos cuantos residuos en el extremo
carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada,
incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación en la presente invención
de Fab' en el que el residuo o residuos cisteína de los dominios
constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo
F(ab')_{2} originalmente se produjeron en forma de pares
de fragmentos Fab' que presentaban cisteínas de bisagra entre ellos.
También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de
anticuerpo
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos de ligando Apo-2
de la invención también pueden comprender adicionalmente anticuerpos
humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de
anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas
quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas
(tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras
subsecuencias ligantes de antígeno de los anticuerpos) que contienen
una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre
los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen
por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo
donante), tal como el ratón, la rata o el conejo, que presentan la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos se
sustituyen residuos del marco Fv de la inmunoglobulina humana por
los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos
humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran
ni el anticuerpo receptor ni en las secuencias importadas de CDR o
de marco. En general, el anticuerpo humanizado comprende
sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y
típicamente de dos, en el que la totalidad o sustancialmente la
totalidad de las regiones CDR corresponden a aquéllas de una
inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la
totalidad de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de
consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
óptimamente también comprende por lo menos una parte de una región
constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una
inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature
321:522-525, 1986; Reichmann et al., Nature
332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
2:593-596, 1992].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos de la técnica. Generalmente, en un
anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos
aminoácidos procedentes de una fuente no humana. Estos residuos
aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos
"importados", típicamente obtenidos de un dominio variable
"importado". La humanización puede realizarse esencialmente
según el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et
al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et
al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et
al., Science 239:1534-1536, 1988], y el
procedimiento de Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
86:10029-10033, 1989, utilizando modelado
informático, mediante la sustitución de CDRs de roedor o secuencias
de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano.
Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son
anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que se ha
sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano
intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana.
En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos
en los que algunos residuos de CDR, y posiblemente algunos residuos
de FR, se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos
de roedor.
La elección de dominios variables humanos, tanto
ligeros como pesados, que deben utilizarse para preparar los
anticuerpos humanizados es importante para reducir la antigenicidad.
De acuerdo con el procedimiento de "ajuste óptimo", la
secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba
frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable
humanas conocidas. La secuencia humana más similar a la del roedor
se acepta como el marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado
[Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia y Lesk, J.
Mol. Biol. 196:901, 1987]. Otro procedimiento utiliza un marco
particular derivado de la secuencia de consenso de todos los
anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o
pesada. Puede utilizarse el mismo marco para varios anticuerpos
humanizados diferentes [Carter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623,
1993].
\newpage
También es importante que los anticuerpos se
humanicen con retención de elevada afinidad para el antígeno y
otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este fin,
según un procedimiento preferente, los anticuerpos humanizados se
preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias
parentales y de diversos productos humanizados conceptuales
utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y
humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas se
encuentran disponibles comúnmente y resultarán familiares para el
experto en la materia. Se encuentran disponibles programas
informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales
tridimensionales probables de las secuencias candidatas de
inmunoglobulina seleccionadas. La inspección de estas
visualizaciones permite analizar el papel probable de los residuos
en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata,
es decir el análisis de los residuos que influyen sobre la
capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno.
De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y
combinarse de la secuencia de consenso y de la secuencia importada
de manera que se consigue la característica deseada del anticuerpo,
tal como afinidad incrementada para el antígeno o antígenos diana.
En general, los residuos de CDR se encuentran directa y más
sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión de
antígeno [ver la patente WO nº 94/04679, publicada el 3 de marzo de
1994].
Pueden utilizarse animales transgénicos (por
ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir
un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de
producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha
descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión
de la cadena pesada (J_{H}) del anticuerpo en ratones mutantes
quiméricos y de la línea germinal resulta en la inhibición completa
de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la
serie génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana en
dichos ratones mutantes de línea germinal resulta en la producción
de anticuerpos humanos tras el reto con antígeno [ver, por ejemplo,
Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:2551-255, 1993; Jakobovits et al., Nature
362:255-258, 1993; Bruggemann et al., Year in
Immunol. 7:33, 1993]. También pueden producirse anticuerpos humanos
en bibliotecas de expresión fágica [Hoogenboom y Winter, J. Mol.
Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:58,
1991]. Las técnicas de Cole et al. y Boerne et al.
también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos
monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies y
Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, y Boemer et
al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991].
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que presentan
especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el
ligando Apo-2, la otra es para cualquier otro
antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor o subunidad
de receptor de superficie celular.
Los procedimientos para preparar anticuerpos
biespecíficos son conocidos de la técnica. Tradicionalmente, la
producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos se basa en
la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas presentan
diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature
305:537-539, 1983]. Debido a la selección aleatoria
de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de
anticuerpo diferentes, de entre los que únicamente uno presenta la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía
de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la
patente WO nº 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659,
1991.
De acuerdo con un enfoque diferente y más
preferente se fusionan dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de
anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio
constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un
dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que
comprende por lo menos parte de las regiones de bisagra CH2 y CH3.
Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada
(CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena
ligera se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADN codificantes de las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se
cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto permite mayor
flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres
fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que las
proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido
utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin
embargo, resulta posible insertar las secuencias codificantes para
dos o la totalidad de las tres cadenas de polipéptido en un vector
de expresión en el caso de que la expresión de por lo menos dos
cadenas de polipéptido en proporciones iguales resulte en
rendimientos elevados o en el caso de que las proporciones no
resulten particularmente importantes. En una realización preferente
de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de
una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena
pesada/cadena ligera de inmunoglobulina (que proporciona una segunda
especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta
estructura asimétrica facilita la separación del compuesto
biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina
no deseadas, debido a que la presencia de una cadena ligera de
inmunoglobulina en únicamente una mitad de la molécula biespecífica
proporciona una manera fácil de separación. Este enfoque se da a
conocer en la patente WO nº 94/04690, publicada el 3 de marzo de
1994. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos
biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in
Enzymology 121:210, 1986.
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Los anticuerpos heteroconjugados también se
encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente
invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos
anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto que dichos
anticuerpos, por ejemplo, dirigen las células del sistema
inmunológico a células no deseadas [patente US nº 4.676.980] y para
el tratamiento de la infección por VIH [patente WO nº 91/00360;
patente WO nº 92/200373, patente EP nº 03089]. Se encuentra
contemplado que los anticuerpos puedan prepararse in vitro
utilizando procedimientos conocidos en química sintética de
proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes entrecruzantes.
Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una
reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un
enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este
fin se incluyen iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y
aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la patente US nº
4.676.980.
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Pueden utilizarse los anticuerpos de ligando
Apo-2 en ensayos diagnósticos para el ligando
Apo-2, por ejemplo mediante la detección de su
expresión en células específicas, tejidos o suero. Pueden utilizarse
diversas técnicas de ensayo diagnóstico conocidas de la técnica,
tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos de
sándwich directo o indirecto y los ensayos de inmunoprecipitación
llevados a cabo en fases heterogéneas u homogéneas [Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.,
1987, páginas 147 a 158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos
diagnósticos pueden marcarse con un grupo detectable. El grupo
detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente,
una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un
isótopo radioactivo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S
o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal
como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o un
enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la
beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano
picante. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido de la
técnica para conjugar el anticuerpo con el grupo detectable,
incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et
al., Nature 144:945, 1962; David et al., Biochemistry
13:1014, 1974; Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981; y
Nygren, J. Histochem. y Cytochem. 30:407, 1982.
Los anticuerpos de ligando Apo-2
también resultan útiles para la purificación por afinidad del
ligando Apo-2 a partir de un cultivo celular
recombinante o de fuentes naturales. En este procedimiento, los
anticuerpos contra el ligando Apo-2 se inmovilizan
sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de
filtro, utilizando procedimientos bien conocidos de la técnica. A
continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con
una muestra que contiene el ligando Apo-2 que debe
purificarse, y después el soporte se lava con un solvente adecuado
que eliminará sustancialmente la totalidad de la materia en la
muestra excepto el ligando Apo-2, que se encuentra
unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con
otro solvente adecuado que liberará el ligando
Apo-2 del anticuerpo. Los anticuerpos de ligando
Apo-2 también resultan útiles para la purificación
por afinidad de un receptor solubilizado de Apo-2 o
para la clonación por expresión de un receptor de
Apo-2.
Los anticuerpos dados a conocer en la presente
invención también pueden utilizarse como terapéuticos. Por ejemplo,
los anticuerpos anti-ligando Apo-2
que bloquean la actividad de ligando Apo-2 (por
ejemplo la apóptosis inducida por ligando Apo-2)
para tratar las condiciones patológicas o enfermedades asociadas con
la apóptosis incrementada [ver Thompson, supra].
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional de la invención, se
proporcionan productos de fabricación y kits que contienen ligando
Apo-2 o anticuerpos de ligando Apo-2
que pueden utilizarse, por ejemplo, para las aplicaciones
terapéuticas o no terapéuticas indicadas anteriormente. El producto
de fabricación comprende un recipiente con un marcaje. Entre los
recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales y
probetas. Los recipientes pueden formarse a partir de una
diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El
recipiente contiene una composición que incluye un agente activo
que resulta eficaz para aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas,
tales como las indicadas anteriormente. El agente activo en la
composición es ligando Apo-2 o un anticuerpo de
ligando Apo-2. La etiqueta en el recipiente indica
que la composición se utiliza para una terapia específica o
aplicación no terapéutica, y también puede indicar instrucciones
para la utilización in vivo o in vitro, tales como
aquéllas indicadas anteriormente.
El kit de la invención típicamente comprende el
recipiente indicado anteriormente y uno o más otros recipientes que
comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y
del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas,
jeringas e impresos insertados en el paquete con instrucciones de
utilización.
Los ejemplos siguientes se ofrecen con fines
ilustrativos únicamente, y no pretenden limitar el alcance de la
presente invención en modo alguno.
\newpage
La totalidad de los enzimas de restricción a los
que se hace referencia en los Ejemplos se adquirieron de New
England Biolabs y se utilizaron siguiendo las instrucciones del
fabricante. La totalidad de los demás reactivos disponibles
comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se
utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante a menos que
se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas
en los ejemplos siguientes, y en toda la especificación, con los
números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection,
Manassas, Virginia.
Para aislar un ADNc de longitud completa del
ligando Apo-2, se cribó una biblioteca de
bacteriófago lambda gt1 de ADNc placentario humano (aproximadamente
1 x 10^{6} clones) (HL10756 disponible comercialmente de
Clontech) mediante hibridación con sondas oligonucleótidas
sintéticas basadas en una secuencia EST (GenBank locus HHEA47M),
que mostraba algún grado de homología con el ligando
Fas/Apo-1 humano. La secuencia EST de HHEA7M es de
390 pb y al traducirse en su marco +3, muestra 16 identidades con
una región de 34 aminoácidos del ligando Apo-1
humano. La secuencia de HHEA47M es la siguiente:
En el cribado se utilizó una sonda
oligonucleótida de 60 pb con la secuencia siguiente:
La hibridación se llevó a cabo durante la noche
a temperatura ambiente en tampón que contenía formamida al 20%, 5x
SSC, sulfato de dextrano al 10%, NaPiPO_{4} al 0,1%, NaPO_{4}
0,05 M, 0,05 mg de ADN de esperma de salmón y dodecilsulfato sódico
al 0,1%, seguido de varios lavados a 42ºC en 5x SSC, y después en 2x
SSC. Se identificaron doce clones positivos en la biblioteca de
ADNc y los clones positivos se cribaron nuevamente mediante
hibridación con una segunda sonda oligonucleótida de 60 pb (no
solapante con la primera sonda) que presentaba la secuencia
siguiente:
La hibridación se llevó a cabo tal como se ha
descrito anteriormente.
Se identificaron cuatro clones positivos
resultantes y se amplificaron mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando un cebador basado en la secuencia de
vector 5' flanqueante y añadiendo un sitio de restricción ClaI
externo y un cebador basado en la secuencia de vector 3' flanqueante
y añadiendo un sitio de restricción HindIII externo. Los productos
de PCR se purificaron en gel y se subclonaron en
pGEM-5 (disponible comercialmente de Promega)
mediante ligación T-A. A continuación, se sometieron
a secuenciación dideoxi de ADN tres clones independientes de PCRs
diferentes. El análisis de secuencias de ADN de estos clones
demostró que eran esencialmente idénticos, con alguna variación de
longitud en sus regiones 5'.
La secuencia de nucleótidos de la región
codificante del ligando Apo-2 se muestra en la
figura 1A. La secuenciación de la región 3' terminal cadena abajo
de uno de los clones reveló un sitio de poliadenilación
característico (datos no mostrados). El ADNc contenía un marco de
lectura abierta largo con un sitio de inicio asignado al codón ATG
en las posiciones nucleótidas 91 a 93. La secuencia circundante en
este sito presenta un acuerdo razonable con la secuencia de
consenso propuesta para los sitios de inicio [Kozak, J. Cell. Biol.
115:887-903, 1991]. El marco de lectura abierto
acaba en el codón de terminación TAA en las posiciones nucleótidas
934 a 936.
La secuencia de aminoácidos madura predicha del
ligando Apo-2 humano contiene 281 aminoácidos y
presenta un peso molecular calculado de aproximadamente 32,5 kDa y
un punto isoeléctrico de aproximadamente 7,63. No existe ninguna
secuencia de señal aparente en el extremo
N-terminal, aunque el análisis de hidropatía (datos
no mostrados) indicó la presencia de una región hidrofóbica entre
los residuos 15 y 40. La ausencia de una secuencia de señal y la
presencia de una región hidrofóbica interna sugiere que el ligando
Apo-2 es una proteína transmembranal de tipo II.
Las regiones citoplasmática, transmembranal y extracelular putativas
presenta longitudes de 14, 26 y 241 aminoácidos, respectivamente.
La región transmembranal putativa está subrayada en la figura It.
Un sitio de glucosilación N-ligada potencial se
encuentra situado en el residuo 109 en el dominio extracelular
putativo.
Una alineación (utilizando el programa
informático Align^{TM}) de la secuencia de aminoácidos de la
región C-terminal del ligando Apo-2
con otros miembros conocidos de la familia de citoquinas TNF mostró
que, dentro de la región C-terminal, el ligando
Apo-2 mostraba una identidad de 23,2% con el ligando
Apo-1 (figura 1B). El análisis de alineación mostró
un grado menor de identidad con otros miembros de la familia TNF:
CD40L (20,8%), LT-\alpha (20,2%),
LT-\beta (19,6%), TNF-\alpha
(19,0%), CD30L y CD27L (15,5%), OX-40L (14,3%) y
4-1BBL (13,7%). En la familia de citoquinas TNF, los
residuos dentro de las regiones que se predice que formarán cadenas
\beta, basándose en las estructuras cristalinas de
TNF-\alpha y LT-\alpha [Eck
et al., J. Bio. Chem. 264:17595-17605, 1989;
Eck et al., J. Bio. Chem. 267:219-2122,
1992], tienden a encontrarse más altamente conservadas con otros
miembros de la familia TNF que los residuos en los bucles de
conexión predichos. Además, el bucle que conecta las cadenas \beta
putativas, B y B', es marcadamente más largo en el ligando
Apo-2.
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Se constó un ADNc de longitud completa de
ligando Apo-2 fusionado con una etiqueta epítopo myc
de la manera siguiente. La inserción de ADNc de ligando
Apo-2 se extrajo el plásmido pGEM-T
parental de ligando Apo-2 (descrito en el Ejemplo
1) mediante digestión con ClaI e HindIII, y se insertó en un
plásmido de expresión pRK5 de mamífero [Schall et al., Cell
61:361-370, 1990; Suva et al., Science
237:893-896, 1987] que se digirió con los mismos
enzimas de restricción. A continuación, se insertó una secuencia
codificante de una etiqueta epítopo myc de 13 aminoácidos Ser Met
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn SEC ID nº 6 [Evan et
al., Mol. Cell. Biol. 5:3610-3616, 1985] entre
el codón 281 y el codón de parada (codón 282) en el extremo 3' de
la secuencia codificante del ligando Apo-2 mediante
mutagénesis dirigida por oligonucleótido [Zoller et al.,
Nucleic Acids Res. 10:6487-6496, 1982],
proporcionando el plásmido pRK5 ligando
Apo-2-myc.
El plásmido pRK5 ligando
Apo-2-myc se cotransfectó en células
293 humanas (ATCC nº CRL 1573) con un plásmido pRK5 que portaba un
gen de resistencia a la neomicina, mediante precipitación con
fosfato de calcio. Se seleccionaron los clones estables que
expresaban ligando Apo-2-myc por su
capacidad de crecer en 50% medio F12 de Ham/50% DMEM (GIBCO) en
presencia del antibiótico, G418 (0,5 mg/ml) (GIBCO).
Para investigar la topología del ligando
Apo-2, se analizó un clon resistente a G418 mediante
FACS tras tinción con el clon 9E10 de anticuerpo monoclonal
anti-myc (mAb) [Evan et al., supra;
disponible comercialmente de Oncogene Science] y después con un
anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con
ficoeritrina (PE) (disponible comercialmente de Jackson
ImmunoResearch). El análisis FACS reveló un desplazamiento
específico de tinción positiva en el clon transfectado con ligando
Apo-2-myc, en comparación con las
células falsamente transfectadas (fig. 1C), demostrando que el
ligando Apo-2 se expresa en la superficie celular,
con su extremo carboxi-terminal expuesto. Por
consiguiente, se cree que el ligando Apo-2 es una
proteína transmembranal de tipo II.
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Se prepararon dos constructos de fusión solubles
de dominio extracelular ("ECD") de ligando
Apo-2, en los que otra secuencia se fusionó cadena
arriba de la región C-terminal del ligando
Apo-2.
En un constructo, 27 aminoácidos del péptido de
señal glucoproteína D ("gD") del virus herpes [descrito en
Lasky et al., DNA 3:23-29, 1984; Pennica
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:1142-1146,
1995; Paborsky et al., Protein Engineering
3:547-553, 1990] y la secuencia de etiqueta epítopo
Lys Tyr AL Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met ala Asp Pro Asn Arg Phe
Arg Gly Ly Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln SEC ID nº 7, se fusionaron
cadena arriba de los codones 114 a 281 del ligando
Apo-2 dentro de un plásmido de expresión de mamífero
pRK5. Brevemente, se amplificó la secuencia de gD a partir de un
plásmido parental, pCHAD (Genentech, preparado sustancialmente tal
como se describe en Lasky et al., Science
233:209-212, 1986) en una PCR en la que el cebador
3' era complementario a la región 3' de la secuencia de gD, así como
a los codones 114 a 121 del ligando Apo-2. El
producto se utilizó como cebador 5' junto con un cebador 3'
complementario al extremo 3' de la región codificante del ligando
Apo-2 en una PCR posterior en la que se utilizó el
plásmido pRK5 del ligando Apo-2 como molde. El
producto, codificante de la fusión de gD- ECD de ligando
Apo-2, seguidamente se subclonó en un plásmido
pRK5, proporcionando el plásmido pRK5 gD-ECD del
ligando Apo-2.
Se transfectaron transitoriamente células 293
embrionarias de riñón humano (ATCC nº CRL 1573) con el plásmido pRK
gD-ECD de ligando Apo-2 o con pRK5,
mediante precipitación con fosfato de calcio. Se evaluó la
expresión de la proteína soluble gD-ligando
Apo-2 mediante marcaje metabólico de las células
transfectadas con ^{35}S-Cys y
^{35}S-Met. Se recogieron los sobrenadantes
celulares tras 24 horas y se clarificaron mediante centrifugación.
Para la inmunoprecipitación, se incubaron 5 ml de sobrenadante con
anticuerpo monoclonal 5B6 anti-gD (Genentech) a una
concentración de 1 \mug/ml durante la noche a 4ºC. A continuación,
se añadieron 25 \mug de pansorbina (Sigma) durante una hora
adicional a 4ºC. Se centrifugaron los tubos y se lavaron los
pellets en PBS y se hirvieron durante 5 minutos en tampón de
muestras SDS. Las muestras hervidas se centrifugaron nuevamente y
los sobrenadantes se sometieron a SDS-PAGE y
autorradiografía.
La inmunoprecipitación con el anticuerpo
anti-gD reveló tres bandas predominantes de
proteínas en los sobrenadantes de las células transfectadas con el
plásmido gD-ligando Apo-2 (fig. 1E).
Estas bandas migraron con masas moleculares relativas (Mr)
de 23, 48 y 74 kDa. El peso molecular calculado del polipéptido
gD-Apo-2 maduro es de
aproximadamente 22,5 ka. Por lo tanto, las bandas observadas podrían
representar formas monoméricas (23 kDa), diméricas (48 kDa)y
triméricas (74 kDa) de la proteína de fusión, e indican que el
ligando Apo-2 puede expresarse en células de
mamífero en forma de una proteína de fusión de gD soluble
secretada.
En un segundo constructo, una secuencia Met Gly
His_{10} (derivada del plásmido pET19B, Novagen), seguida de un
sitio de corte de enteroquinasa de 12 aminoácidos: Met Gly His His
His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp
Lys His Met SEC ID nº 8, se fusionó cadena arriba de los codones 114
a 281 del ligando Apo-2 dentro de un plásmido de
expresión baculovirus (pVL1392, Pharmingen). Brevemente, la región
de codones 114 a 281 del ligando Apo-2 se amplificó
mediante PCR a partir del plásmido pRK5 de ligando
Apo-2 (descrito en el Ejemplo 1) con cebadores
complementarios a las regiones 5' y 3' que incorporan los sitios de
restricción flanqueantes NdeI y BamHI, respectivamente. El producto
se subclonó en GEM-T (Promega) mediante ligación
T-A y se confirmó la secuencia del ADN. A
continuación, se extrajo la inserción mediante digestión con NdeI y
BamHI, y se subclonó en un vector de expresión baculovirus
modificado pVL1392 (disponible comercialmente de Pharmingen) que
contenía una etiqueta aminoterminal Met Gly His10 y un sitio de
corte de enteroquinasa.
Se generó un baculovirus recombinante mediante
la cotransfección del plásmido His_{10}-ECD de
Ap-2 y ADN vírico BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en
celulas de Spodoptera frugiperda ("Sf9") utilizando
lipofectina (disponible comercialmente de
GIBCO-BRL). Tras 4 a 5 días de incubación a 28ºC,
los virus liberados se recolectaron y se utilizaron para
amplificaciones posteriores. La infección vírica y la expresión de
proteínas se llevó a cabo tal como describen O'Reilley et
al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual,
Oxford: Oxford University Press, 1994. Las proteínas se purificaron
mediante cromatografía de afinidad de
Ni^{2+}-quelato, tal como se describe en el
Ejemplo 3, a continuación.
Se prepararon extractos a partir de células Sf9
infectadas por virus recombinante y falsamente infectadas (ver el
Ejemplo 2, sección B, anteriormente) tal como describen Rupert et
al., Nature 362:175-179, 1993. Brevemente, se
lavaron células Sf9, se resuspendieron en tampón de sonicación (25
ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al
10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se sonicaron dos
veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se
clarificaron mediante centrifugación y el sobrenadante se diluyó 50
veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al
10%, pH 7,8) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se
preparó una columna de Ni^{2+}-NTA agarosa
(disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5
ml, se lavó con 25 ml de agua y se equilibró con 25 ml de tampón de
carga. El extracto celular filtrado se cargó en la columna a un
caudal de 0,5 ml por minuto. La columna se lavó hasta la línea base
de A_{280} con tampón de carga, momento en el que se inició la
recolección de fracciones. A continuación, la columna se lavó con
un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol
al 10%, pH 6,0), que eluyó proteína unida no específicamente. Tras
alcanzar nuevamente la línea base A_{280}, la columna se reveló
con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado
secundario. Se recogieron fracciones de un ml y se analizaron
mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia
western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa
alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían la proteína eluída
His_{10}-ligando Apo-2 se
agruparon y se dializaron frente al tampón de carga.
Se repitió un procedimiento idéntico con células
Sf9 falsamente transfectadas como material de partida, y se
agruparon, dializaron y utilizaron las mismas fracciones como
control para Apo-2 humano purificado.
El análisis SDS-PAGE de la
proteína purificada reveló una banda predominante de Mr 24
kDa, correspondiente al peso molecular calculado de 22,4 kDa para
el monómero His10-ligando Apo-2
(fig. 1D, carril 3); el microanálisis de la secuencia proteica
(datos no mostrados) confirmó que la banda de 24 kDa representa el
polipéptido His10-ligando Apo-2.
También se observaron bandas menores n 48 kDa y 66 kDa, y
probablemente representan homodímeros y homotrímeros solubles del
ligando Apo-2. El entrecruzamiento químico de
His_{10}-ligando Apo-2 purificado
mediante incubación con sulfo-NHS (5 mM) (Pierce
Chemical) y ECD (Pierce Chemical) a 25 mM y a 50 mM (fig. 1D,
carriles 1 y 2, respectivamente) desplazó la proteína hacia la
banda de 66 kDa principalmente. Estos resultados sugieren que la
forma predominante del ligando Apo-2 en solución es
homotrimérica y que estos trímeros se disocian en dímeros y
monómeros en presencia de SDS.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se examinó la actividad apoptótica del ligando
Apo-2 soluble purificado (descrito en el Ejemplo 3)
utilizando varías líneas celulares linfoides humanas. En un primer
estudio, se examinó el efecto del ligando Apo-2
sobre las células 9D (Genentech, Inc.), derivado de células B de
sangre periférica humanas transformadas con virus de
Epstein-Barr (EBV). Las células 9D (5 x 10^{4}
células/pocillo en medio RPMI 1640 más suero de feto bovino al 10%)
se incubaron durante 24 horas con un medio de control, ligando
Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se ha
descrito en el Ejemplo 3, anteriormente) o anticuerpo monoclonal
anti-Apo-1, CH11 (1 \mug/ml)
[descrito por Yonehara et al., J. Exp. Med.
169:1747-1756, 1989; disponible comercialmente de
Medical and Biological Laboratories Co.]. El anticuerpo
anti-Apo-1 CH11 es un anticuerpo
agonista que imita la actividad de Fas/ligando
Apo-1.
Tras la incubación, las células se recogieron
sobre portaobjetos de vidrio Cytospin y se fotografiaron bajo un
microscopio óptico invertido. Tanto el ligando Apo-2
como el anticuerpo monoclonal
anti-Apo-1 indujeron un efecto
apoptótico similar, caracterizado por la condensación citoplasmática
y la reducción del número de células (ver la fig. 2A).
Los efectos del ligando Apo-2
sobre las células 9D, así como sobre las células Raji (línea celular
de linfoma B de Burkitt, ATCC nº CCL 86) y células Jurkat (línea
celular de leucemia humana de las células T, ATCC nº TIB 152) se
analizaron adicionalmente mediante FACS. El análisis FACS se llevó a
cabo utilizando criterios establecidos para la muerte celular
apoptótica, es decir la relación entre la tinción fluorescente de
las células con dos marcadores: (a) pigmento de yoduro de propidio
("PI"), que tiñe las células apoptóticas pero no las células
vivas, y (b) un derivado fluorescente de la proteína, anexina V, que
se une a la fosfatidilserina expuesta que se encuentra sobre la
superficie de las células apoptóticas pero no sobre las células
vivas [Darzynkiewicz et al., Methods in Cell Biol.
41:15-38, 1994; Fadok et al., J. Immunol.
148:2207-2214, 1992; Koopman et al., Blood
84:1415-1420, 1994].
Se incubaron las células 9D (fig. 2B), las
células Raji (fig. 2C) y las células Jurkat (fig. 2D) (1 x 10^{6}
células/pocillo) durante 24 horas con un medio de control (paneles
izquierdos), con ligando Apo-2 (3 \mug/ml,
preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 3) (paneles
centrales) o con anticuerpo anti-ligando
Apo-2, CH11 (1 \mug/ml) (paneles derechos). A
continuación, las células se lavaron, se tiñeron con PI y con
anexina V conjugada con tiocianato de fluoresceína (FITC) (adquirida
de Brand Applications) y se analizaron mediante citometría de
flujo. Las células negativas para tanto PI como anexina V (cuadrante
3) representan las células vivas; las células no teñidas con PI y
teñidas con anexina V (cuadrante 4) representan las células
apotóticas tempranas; las células teñidas con PI y con anexina V
(cuadrante 2) representan principalmente las células en etapas
tardías de la apóptosis.
Las células 9D tratadas con ligando
Apo-2 mostraron un nivel de unión incrementado de la
anexina V extracelular, así como un marcado incremento de la
incorporación de PI (fig. 2), indicando que el ligando
Apo-2 inducía la apóptosis en las células. Se
obtuvieron resultados comparables con el anticuerpo
anti-Apo-1, CH11 (Fig. 2B). El
ligando Apo-2 indujo una respuesta similar en las
células Raji y Jurkat, al igual que el anticuerpo
anti-Apo-1 (ver las figuras 2C y
2D). La inducción de la apóptosis (medida como % de células
apoptóticas) en estas líneas celulares por el ligando
Apo-2, en comparación con el control y con el
anticuerpo anti-Apo-1, también se
muestra en la Tabla 1, posteriormente.
También se analizó la activación de la
fragmentación del ADN internucleosómico por el ligando
Apo-2. Se incubaron células Jurkat (carriles
izquierdo) y células 9D (carriles derechos) (2 x 10^{6}
células/pocillo) durante 6 horas con un medio de control o con
ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se
describe en el Ejemplo 3). A continuación, se extrajo el ADN de las
células y se marcó con ^{32}P-ddATP utilizando
transferasa terminal. Las muestras de ADN marcado se sometieron a
electroforesis en geles de agarosa al 2% y después se analizaron
mediante autorradiografía [Moore et al., Cytotechnology
17:1-11, 1995]. El ligando Apo-2
indujo la fragmentación del ADN internucleosómico tanto en células
Jurkat como en células 9D (fig. 2E). Dicha fragmentación del ADN es
característica de la apóptosis [Cohen, Advances in Immunol.
50:55-85, 1991].
Para examinar el curso temporal de la actividad
apoptótica del ligando Apo-2, se incubaron células
9D en placas de microtitulación (5 x 10^{4} células/pocillo) con
un medio de control o con ligando Apo-2 (3
\mug/ml, preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 3)
durante un periodo de tiempo comprendido entre 0 horas y 50 horas.
Tras la incubación, se determinó el número de células muertas y el
número de células vivas mediante examen microscópico utilizando un
hemocitómetro.
Tal como se muestra en la fig. 3A, se indujeron
niveles máximos de muerte celular en las células 9D dentro de las 24
horas.
Para determinar la dependencia de la dosis de la
muerte celular inducida por el ligando Apo-2, se
incubaron células 9D (5 x 10^{4} células/pocillo) durante 24
horas con diluciones seriadas de un medio de control o con ligando
Apo-2 (preparado tal como se ha descrito en el
Ejemplo 3). Se determinó el número de células muertas y de células
vivas tras la incubación tal como se ha descrito anteriormente. Los
resultados se ilustran en la fig. 3B. Se determinó la apóptosis
específica restando el % de apóptosis en el control del % de
apóptosis en las células tratadas con ligando
Apo-2. Se alcanzó la mitad de la activación máxima
de apóptosis a una concentración de aproximadamente 0,1 \mug/ml
(aproximadamente 1 nM), y la inducción máxima se produjo a una
concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3
\mug/ml (aproximadamente 10 a 30 nM).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se examinó el efecto del ligando
Apo-2 sobre líneas celulares de tumor no linfoide
humano utilizando las líneas celulares siguientes:
HeLa (derivada del carcinoma cervical humano,
ATCC nº CCL 22); ME-180 (derivada del carcinoma
cervical humano, ATCC nº HTB 33); MCF7 (derivada del carcinoma
mamario humano, ATCC nº HTB 22); U-937 (derivada del
linfoma histiocítico humano, ATCC nº CRL 1593); A549 (derivada del
carcinoma pulmonar humano, ATCC nº CCL 185) y 293 (derivada de una
línea de células renales embrionarias humanas transformadas por
adenovirus, ATCC nº CCL 1573).
En el ensayo, se incubaron 1 x 10^{6} células
de cada línea celular durante 24 horas con un medio de control, con
ligando Apo-2 (3 \mug/ml), preparado tal como se
ha descrito en el Ejemplo 3), o con anticuerpo monoclonal
anti-Apo-1, CH11 (1 \mug/ml). Tras
la incubación, se midió la apóptosis mediante análisis de FACS, tal
como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se muestran los resultados a
continuación, en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células HeLa y MCF7 eran igualmente
sensibles a la inducción de la apóptosis por el ligando
Apo-2 en comparación con el anticuerpo
anti-Apo-1 CH11. En contraste, las
células U-937 y A549 eran marcadamente más
sensibles a la inducción de la apóptosis por el ligando
Apo-2. Las células ME-180 eran
bastante sensibles al ligando Apo-2, aunque
relativamente resistentes al anticuerpo
anti-apo-1. Las células 293 eran
resistentes al ligando Apo-2 y respondían débilmente
al anticuerpo anti-Apo-1.
De esta manera, el ligando Apo-2
era capaz de inducir apóptosis en células de origen no linfoide, así
como en células de origen linfoide (ver el Ejemplo 4). Además,
aunque no se entiende por completo y sin respaldo teórico, los
Solicitantes en la actualidad creen que el ligando
Apo-2 actúa mediante un receptor que es diferente
de Apo-1. Esta creencia se apoya en los datos de la
presente invención que demuestran que las líneas celulares
indicadas anteriormente muestran patrones diferenciales de
sensibilidad al ligando Apo-2 y al anticuerpo
anti-Apo-1 (ver también el Ejemplo
7, posteriormente).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica ("PBMC") de sangre de donantes humanos mediante
centrifugación en gradiente de densidad Ficoll utilizando medio de
separación de linfocitos (LSM®, Organon Teknika). Se preparó una
población aislada de células T a partir de las PBMC mediante
eliminación de las células B mediante unión de las Ig superficiales
a una columna anti-Ig y eliminación de los monocitos
mediante unión del receptor Fc a una columna de Ig (R & D
Systems). Se preparó una población aislada de células B a partir de
las PBMC mediante eliminación mediada por el complemento de las
células T que se hicieron reaccionar con el anticuerpo
anti-CD3 producido por el mieloma OKT3 (ATCC nº CRL
8001) y de monocitos que se habían hecho reaccionar con un
anticuerpo específico de monocitos producido por el hibridoma 4F2C13
(ATCC nº HB 22). Se consiguió la eliminación adicional de los
monocitos mediante la adherencia a plástico.
Las células sanguíneas periféricas B o T recién
aisladas (1 x 10^{6} células/pocillo) se cultivaron durante 3
días en presencia de un medio de control o de ligando
Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se describe
en el Ejemplo 3). Para la activación, se trataron las células B
simultáneamente con lipopolisacárido ("LPS", 1 \mug/ml) y
las células T se trataron con acetato de miristato de forbol
("PMA", 10 ng/ml) más yonomicina (1 \mug/ml) (Sigma). Para
el pretratamiento de interleuquina 2 ("IL-2"),
se cultivaron las células T durante 3 a 5 días en presencia de
IL-2 (50 U/ml) (Genzyme) previamente a la exposición
al ligando Apo-2. La apóptosis se determinó
utilizando análisis de FACS, esencialmente tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 4. Sin embargo, las células B
encontraron una ventana con los anticuerpos
anti-CD19/CD20 (Jackson Immunoreserach) y las
células T con los anticuerpos anti-CD4/CD8 (Jackson
Immunoresearch). Los resultados se muestran en la Tabla 2,
posteriormente, representando medias \pm SE de experimentos
independientes [linfocitos B-9 experimentos;
linfocitos T-8 experimentos; linfocitos T más
IL-2-5 experimentos], en los que se
analizaron 50.000 células por punto de datos. El análisis
estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba t de Student. En la
Tabla 2, a=p<0,05 y b=p<0,02 respecto al control
respectivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando Apo-2 indujo
apóptosis significativa en células B no estimuladas, en células B
activadas por LPS y en células T activadas con PMA y yonomicina.
Previamente se ha informado de que las células T periféricas pueden
predisponerse a la apóptosis mediante el cultivo de las células en
presencia de IL-2 [Lenardo et al., Nature
353:858-861, 1991]. El presente estudio ha
demostrado que el pretratamiento de IL-2 sensibilizó
a las células T periféricas frente a la muerte inducida por ligando
Apo-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un ensayo para determinar si el
receptor Fas/Apo-1, así como los receptores TNF de
tipo 1 y de tipo 2 (TNF-R y TNF-R2)
se encontraban implicados en la mediación de la actividad apoptótica
del ligando Apo-2 mediante el ensayo de si las
formas solubles de dichos receptores son capaces de inhibir la
actividad apoptótica de ligando Apo-2 soluble
purificado (descrito en el Ejemplo 3).
Se incubaron células 9D (5 x 10^{4}
células/pocillo) durante 24 horas con un medio de control o con
ligando Apo-2 (0,3 \mug/ml, preparado tal como se
ha descrito en el Ejemplo 3) en presencia de tampón de control,
control CD4-IgG (25 \mug/ml),
Apo-1-IgG soluble (25 \mug/ml),
TNFR1-IgG soluble (25 \mug/ml) o proteína de
fusión TNFR2-IgG (25 \mug/ml). Se produjeron
derivados solubles de los receptores Fas/Apo-1,
TNF-R1 y TNF-R2 en forma de
proteínas de fusión de IgG tal como se describe en Ashkenazi et
al., Methods 8:104-115, 1995. Se produjo
CD4-IgG en forma de una proteína de fusión de IgG
tal como se describe en Bym et al., Nature
344:667-670, 1990, y se utilizó como control.
Tal como se muestra en la fig. 3C, ninguna de
las moléculas de fusión de receptores inhibió la actividad
apoptótica del ligando Apo-2 sobre las células 9D.
Estos resultados indican que la actividad apoptótica del ligando
Apo-2 es independiente de Fas/Apo-1
y de TNF-R1 y TNF-R2.
Se examinó la expresión del ARNm del ligando
Apo-2 en tejidos humanos mediante análisis de
transferencia northern (fig. 4). Se hibridaron filtros de ARN con
una sonda de ADN marcada con ^{32}P basada en el ADNc del ligando
de Apo-2 de longitud completa, o a una sonda de ARN
marcada con ^{32}P basada en la secuencia EST de GenBank, HHEA47M
(ver el Ejemplo 1). Se incubaron el filtro MTN de ARN fetal humano
(Clontech) y el filtro MTNII de ARN adulto humano (Clontech) con la
sonda de ADN, mientras que el filtro MTN-I de ARN
adulto humano (Clontech) se incubó con la sonda de ARN. Los filtros
se incubaron con las sondas en tampón de hibridación (5 x SSPE; 2 x
solución de Denhardt; 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado
desnaturalizado; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 16 horas a
42ºC. Los filtros se lavaron varias veces en 1 X SSPE; SDS al 2%
durante 1 hora a 65ºC y formamida al 50% recién desionizada; 1 X
SSPE; SDS al 0,2% durante 30 minutos a 65ºC. Los filtros se
revelaron tras la exposición durante la noche, utilizando un aparato
Phosphorimager (Fuji).
Se muestran los resultados en la figura 4. En
los tejidos humanos fetales, se detectó la expresión de ARNm de
ligando Apo-2 en pulmón, hígado y riñón, pero no en
el tejido cerebral. En los tejidos humanos adultos, se detectó la
expresión de ARNm de ligando Apo-2 en bazo, timo,
próstata, ovario, intestino delgado, linfocitos de sangre
periférica, corazón, placenta, pulmón y riñón. Se detectó poca o
ninguna expresión en testículo, cerebro, músculo esquelético y
páncreas. El perfil de expresión observado para el ligando
Apo-2, tal como se ha descrito anteriormente, no es
idéntico al del ligando Apo-2, que se expresa
principalmente en células T y en el testículo [Nagata et al.,
supra].
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó adicionalmente la actividad
apoptótica del ligando Apo-2 (descrito en el Ejemplo
3) sobre líneas celulares tumorales humanas en presencia o en
ausencia de uno de entre varios agentes quimioterapéuticos.
Se sometieron a ensayo las líneas celulares
tumorales humanas siguientes: A549 (carcinoma pulmonar; ATCC nº CCL
185); HCT116 (carcinoma de colon, ATCC nº CCL 247); SW480
(adenocarcinoma de colon, ATCC nº CCL 228; MDA231 (carcinoma, ATCC
nº HTB 33); T24 (carcinoma de vejiga, ATCC nº HTB 4);
SK-N-AS (neuroblastoma, White et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5520-5524, 1995).
Varias de estas líneas celulares expresan p53 de tipo salvaje,
mientras que otras no lo expresan debido a mutaciones, tal como se
muestra en la Tabla 3, posteriormente. Las células se sembraron en
placa a una concentración de 2,5 x 10^{6} células/ml en placas de
96 pocillos y se incubaron durante la noche. Las células se
cultivaron en presencia de diluciones de 2 veces de ligando
Apo-2 (comprendidas entre 100 ng/ml y 0,01 ng/ml).
En algunos de estos cultivos, también se añadió un agente
quimioterapéutico durante 24 horas: ciclohexamida ("CHX") (50
\mug/ml; Sigma Chemicals), doxorubicina (10 a 100 \mug/ml;
Pharmacia) o 5-FU (6 mg/ml; Roche).
Tras 24 horas de incubación, las células se
tiñeron con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20%. Se determinó
la viabilidad celular mediante la elución del pigmento de las
células teñidas con citrato sódico 0,1 M (ácido cítrico 0,1 M en
metanol al 50%) y midiendo la absorbancia a 540 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se muestran los resultados en la Tabla a
continuación:
Estos resultados demuestran que el ligando
Apo-2 indujo la muerte celular en líneas celulares
tumorales derivadas de diversos tipos tumorales y que
Apo-2L indujo la muerte celular independientemente
del status de p53 de las células tumorales. Estos resultados
también demuestran que la muerte celular inducida por el ligando
Apo-2 resulta incrementada por varios fármacos
quimioterapéuticos diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron los efectos del ligando
Apo-2 en ratones desnudos que portaban un tumor. En
ratones desnudos (5 a 10 ratones por grupo) (adquiridos de Harlan
Sprague Dawley) se inyectaron (día 0) subcutáneamente células de
carcinoma mamario humano MDA2231 (ATCC nº HTB 26) (2 x 10^{6}
células/ratón). A continuación, se dejó que crecieran los tumores
durante 14 días. Los días 14 y 15, se inyectaron 2 \mug/0,05
ml/ratón de ligando Apo-2 (Ejemplo 3) y/o 10
\mug/0,05 ml/ratón de doxorubicina (Pharmacia) en el sitio
tumoral. Los animales de control recibieron de manera similar
inyecciones de 0,05 m de PBS. El día 21, se sacrificaron los
animales y se extirparon los tumores y se pesaron (gramos):
Se muestran los resultados en la figura 5. Los
datos demuestran que el tratamiento de ligando Apo-2
inhibió el crecimiento tumoral por sí mismo y que el ligando
Apo-2 incrementó los efectos inhibitorios de la
doxorubicina sobre el crecimiento tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
También se examinaron los efectos antitumorales
del ligando Apo-2 en ratones desnudos que portaban
un tumor, tal como se ha descrito en el Ejemplo 10, excepto en que
el día 0 los ratones recibieron una inyección subcutánea de células
de carcinoma de colon humano HCT116 (ATCC nº CCL 247) (2 x 10^{6}
células/ratón). Después, los ratones se dejaron crecer durante 14
días. Los días 14 y 15, se inyectaron 2 \mug/0,05 m/ratón de
ligando Apo-2 y/o 10 \mug/0,05 ml/ratón de
5-FU (Roche) en el sitio tumoral. Los animales de
control de manera similar recibieron una inyección de 0,05 ml de
PBS. El día 21 se sacrificaron los animales y se extirparon los
tumores y se pesaron (gramos).
Se muestran los resultados en la figura 6. Estos
resultados demuestran que el tratamiento de ligando
Apo-2 inhibió el crecimiento tumoral por sí mismo y
que el ligando Apo-2 incrementó los efectos
inhibitorios de 5-FU sobre el crecimiento
tumoral.
Se examinaron los efectos antitumorales del
ligando Apo-2 en ratones desnudos que portaba un
tumor, tal como se describe en el Ejemplo 11, excepto en que los
días 1 y 2, se inyectaron intraperitonealmente 10 \mug/0,05
ml/ratón de ligando Apo-2 y/o 100 \mug/0,05
ml/ratón de 5-FU. Los animales de control de manera
similar recibieron una inyección de PBS. Después, se midió el tamaño
tumoral (mm^{2}) los días 5, 9 y 15. El día 15 se sacrificaron
los animales y se extirparon los tumores y se pesaron (gramos).
Se muestran los resultados en las figuras 7 y 8.
Estos resultados demuestran que el ligando Apo-2 es
capaz de alcanzar el sitio tumoral subcutáneo y de ejercer un efecto
antitumoral cuando se administra mediante una inyección
intraperitoneal. Además, estos resultados confirman la capacidad del
tratamiento de ligando Apo-2 de inhibir el
crecimiento tumoral por sí mismo y de incrementar los efectos
inhibidores de 5-FU sobre el crecimiento
tumoral.
Con el fin de investigar si proteasas tales como
ICE y CPP32/Yama desempeñan un papel en la inducción de la
apóptosis por el ligando Apo-2, se llevó a cabo un
ensayo para determinar si CrmA bloquea la apóptosis inducida por el
ligando Apo-2 [Marsters et al., Current
Biology 6:750-752, 1996]. CrmA es un inhibidor
derivado de poxvirus de las proteasas letales ICE y CPP32/Yama, y
bloquea la señalización de muerte celular por TNFR1 y
Fas/Apo-1. Además, con el fin de investigar si la
proteína adaptadora que contiene el "dominio letal", FADD, que
media en la inducción de la apóptosis por el ligando
Apo-1 y por TNF (Chinnaiyan et al., Cell
81.505-512, 1995; Hsu et al., Cell
84:299-308, 1996], se encontraba implicada en la
apóptosis inducida por ligando Apo-2, se llevó a
cabo un ensayo para determinar si una forma mutante negativa
dominante de FACC, (FADD-DN) [Hsu et al.,
supra], inhibe la función del ligando Apo-2
[Marsters et al., Current Biology 6:750-752,
1996]
Se transfectaron células HeLa-S3
(ATCC nº CCL22) con un plásmido de expresión
pRKS-CrmA (la secuencia de CrmA se informa en Ray
et al., supra) o un plásmido de expresión
pRK-5-FADD-DN (Hsu
et al., Cell 84:299-308, 1996). Se utilizó
pRK5 como control. Las células se cotransfectaron con
pRK5-CD4 (Smith et al., Science
238:1704-1707, 1988) como marcador de la
incorporación del plásmido de ADN. Las células transfectadas se
identificaron mediante tinción con anticuerpo
anti-CD4 conjugado con ficoeritrina (Jackson
Immunoresearch) y se analizó la apóptosis mediante FACS
esencialmente tal como se ha descrito en el Ejemplo 4,
anteriormente.
Se muestran los resultados en la figura 9. CrmA
bloqueó la apóptosis inducida por el ligando Apo-2,
así como la apóptosis inducida por el anticuerpo
anti-Apo-1. En contraste,
FADD-DN presentó un efecto reducido sobre la
apóptosis inducida por el ligando Apo-2, aunque
bloqueó sustancialmente la inducción de apóptosis por el anticuerpo
anti-Apo-1. Por consiguiente, los
resultados del ensayo sugieren que el ligando Apo-2,
TNFR1 y Fas/Apo-1 podrían inducir una ruta distal
común de señalización, activando la muerte celular apoptótica. En
particular, los resultados sugieren que proteasas tales como ICE y
CPP32/Yama podrían resultar necesarias para la apóptosis inducida
por el ligando Apo-2. En contraste, FADD resulta
necesario para la inducción de la muerte celular por parte de TNFR1
y Fas/Apo-1, pero no por parte del ligando
Apo-2.
Se inmunizaron ratones Balb/c (obtenidos de
Charles River Laboratories) mediante la inyección de 1 \mug de
ligando Apo-2 (preparado tal como se ha descrito en
el Ejemplo 3 y diluido en adyuvante MPL-TDM
adquirido de Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) diez
veces en cada almohadilla plantar trasera en intervalos de 1
semana. Tres días después de la inyección de refuerzo final, se
extrajeron los nódulos linfáticos poplíteos de los ratones y se
preparó una suspensión de células individuales en medio DMEM
(obtenida de Biowhitakker Corp.) suplementado con 1% de
penicilina-estreptomicina. A continuación, se
fusionaron las células de los nódulos linfáticos con células de
mieloma murino P3X63AgU.1 (ATCC nº CRL 1597) utilizando
polietilenglicol al 35% [Laskov et al., Cell. Immunol.
55:251, 1980] y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos.
Los hibridomas resultantes de la fusión se seleccionaron en medio
HAT. Diez días después de la fusión, se cribaron los sobrenadantes
de los cultivos de hibridoma en una ELISA [Kim et al., J.
Immunol. Meth. 156:9-17, 1992] para analizar la
presencia de anticuerpos monoclonales ligantes de la proteína
ligando Apo-2.
En la ELISA, se recubrieron placas de
microtitulación de 96 pocillos (Nunc) mediante la adición de 50
\mul de ligando Apo-2 0,5 \mug/ml (ver el
Ejemplo 3) en PBS a cada pocillo e incubando a 4ºC durante la
noche. A continuación, las placas se lavaron tres veces con tampón
de lavado (PBS más Tween-20 al 0,05%).
Seguidamente, los pocillos en las placas de microtitulación se
bloquearon con 200 \mul de albúmina de suero bovino al 2% (BSA) y
se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, las
placas se lavaron nuevamente tres veces con tampón de lavado.
Tras la etapa de lavado, se añadieron 50 \mul
de 2 \mug/ml de anticuerpos de ligando Apo-2 o 100
\mul del sobrenadante del cultivo de hibridoma a los pocillos
asignados. Se añadieron 100 \mul de medio condicionado de células
de mieloma P3X63AgU.1 a otros pocillos asignados como controles. Las
placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un
aparato agitador y después se lavaron tres veces con tampón de
lavado.
A continuación, se añadieron 50 \mul de IgG de
cabra antiratón conjugado con HRP (adquirido de Cappel
Laboratories), diluido 1:1.000 en tampón de ensayo (albúmina de
suero bovino al 0,5%, Tween-20 al 0,05%, Timersol
al 0,01% en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1
hora a temperatura ambiente en un aparato agitador. Las placas se
lavaron tres veces con tampón de lavado, seguido de la adición de 50
\mul de sustrato (TMB,
3,3',5,5'-tetrametilbencidina; obtenida de
Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se
incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción se
detuvo mediante la adición de 50 \mul de solución de parada
(Kirkegaard & Perry) a cada pocillo y se leyó la absorbancia a
450 nm en un lector de placas de microtitulación automático.
Se sometieron a ensayo los sobrenadantes de
hibridoma (99 seleccionados) para actividad de bloqueo de la
eliminación de células 9D inducida por el ligando
Apo-2. Se determinó inicialmente la actividad
mediante el examen del % de viabilidad de las células 9D tratadas
utilizando exclusión de pigmento azul tripán.
También se confirmó la actividad de bloqueo
mediante análisis FACS. Se suspendieron las células 9D (5 x
10^{5} células/0,5 ml) en medio RPMI completo (RMPI más FCS al
10%, glutamina, aminoácidos no esencialmente, penicilina,
estreptomicina, piruvato sódico) y se introdujeron en placas de
macrotitulación de 24 pocillos. Se suspendieron 0,5 ml de ligando
Apo-2 (1 \mug/ml) (preparados tal como se ha
descrito en el Ejemplo 3) en medio RPMI completo, se preincubaron
con 10 \mug de anticuerpos monoclonales purificados o con 100
\mul de sobrenadante de cultivo, y después se añadieron a los 24
pocillos de macrotitulación que contenían las células 9D. Las
placas de macrotitulación se incubaron durante la noche a 37ºC y en
presencia de 7% de CO_{2}. Después, las células incubadas se
recolectaron y se lavaron una vez con PBS. Se determinó la
viabilidad de las células mediante tinción de la unión de
FITC-anexina V a fosfatidilserina siguiendo las
recomendaciones del fabricante (Clontech). Las células se lavaron
en PBS y se resuspendieron en 200 \mul de tampón de unión. Se
añadieron 10 \mul de anexina V-FITC (1 \mug/ml)
y 10 \mul de yoduro de propidio a las células. Tras incubar
durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células 9D
mediante FACS.
Se identificaron ocho hibridomas secretores de
anticuerpos potencialmente bloqueadores y cuatro hibridomas
secretores de anticuerpos no bloqueadores y se clonaron
adicionalmente (dos veces) mediante técnicas de dilución
limitante.
El análisis FACS de cuatro anticuerpos,
denominados anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 se
ilustra en la figura 10 (tal como se indica posteriormente, los
anticuerpos 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 son producidos por los hibridomas
1D1.12.4, 2G6.3.4, 2E11.5. y 5C2.4.9, respectivamente, la totalidad
de los cuales han sido depositados en la ATCC). Las células 9D
tratadas con el ligando Apo-2 (gráfico superior
izquierda) mostraron 50% más células apoptóticas que las células no
tratadas, de control (gráfico superior derecha). Las células 9D
tratadas con ligando Apo-2 más los anticuerpos 2E11,
5C2, 2G6 o 1D1 mostraron 0%, 6%, 26% y 48% más células apoptóticas
que el control no tratado, respectivamente. Estos resultados
demuestran que los anticuerpos 5C2, 2E11 y 2G6 son anticuerpos
bloqueadores, mientras que el anticuerpo 1D1 es un anticuerpo no
bloqueador. La actividad bloqueadora más potente se observó con el
anticuerpo 5C2.
También se sometieron a ensayo en una ELISA las
especificidades de antígeno de los cuatro anticuerpos. Se
recubrieron placas de microtitulación con 2 \mug/ml de linfotoxina
(Genentech Inc., ver también la patente EP nº 164.965; Gray et
al., Nature 312:721-724, 1984), de
TNF-alfa (Genentech, Inc., ver también Pennica
et al., Nature 312:724-729, 1984; Aggarwal
et al., J. Biol. Chem. 260:2345-2354, 1985) o
de ligando Apo-2 (ver el Ejemplo 3). Los
anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 se sometieron a ensayo
a una concentración de 10 \mug/ml.
Los resultados del ensayo se muestran en la
figura 11. Los datos en la figura 11 muestran que los anticuerpos
monoclonales 2G6, 2E11 y 5C2 n específicos para el ligando
Apo-2, mientras que el anticuerpo monoclonal 1D1
mostró una unión cruzada débil a la linfotoxina y a
TNF-alfa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron los isotipos de los anticuerpos
1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 (descritos en la Sección A, anteriormente)
mediante recubrimiento de placas de microtitulación con Ig de cabra
antiratón específico de isotipo (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA)
durante la noche a 4ºC. A continuación, las placas se lavaron con
tampón de lavado tal como se ha descrito anteriormente. Después,
los pocillos en las placas de microtitulación se bloquearon con 200
\mul de albúmina de suero bovino al 2% y se incubaron a
temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron
nuevamente tres veces con tampón de lavado.
A continuación, se añadieron 100 \mul de 5
\mug/ml de los anticuerpo de ligando Apo-2
purificados o 100 \mug del sobrenadante del cultivo de hibridoma
a los pocillos asignados. Las placas se incubaron a temperatura
ambiente durante 30 minutos y después se añadieron a cada pocillo 50
\mul de IgG de cabra antiratón conjugada con HRP (tal como se ha
descrito anteriormente). Las placas se incubaron durante 30 minutos
a temperatura ambiente. Se detectó el nivel de HRP unido a la placa
utilizando sustrato de HRP tal como se ha descrito
anteriormente.
El análisis de isotipado demostró que los
anticuerpos 1D1 y 2G6 son anticuerpos IgG2b, y que los anticuerpos
2E11 y 5C2 son anticuerpos IgG2a.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un mapado de epítopos utilizando
una ELISA de unión competitiva tal como se describen Kim et al.,
supra, utilizando anticuerpos monoclonales biotinilados. Los
anticuerpos monoclonales seleccionados se biotinilaron utilizando
N-hidroxilsuccinimida tal como se describe en:
Antibodies, A Laboratory Manual, editores E. Harlow y D. Lane,
página 342. Se recubrieron pocillos de una placa de microtitulación
con 50 \mul de ligando Apo-2 (ver el Ejemplo 3,
0,1 \mug/ml) y se mantuvieron durante la noche a 4ºC y después se
bloquearon con BSA al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras
lavar los pocillos de microtitulación, se añadió en cada pocillo
una mezcla de una concentración óptima predeterminada de anticuerpos
biotinilados y un exceso de mil veces de anticuerpo no marcado.
Tras una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se
lavaron y se detectó la cantidad de anticuerpo biotinilado mediante
la adición de HRP-estreptavidina. Tras lavar los
pocillos de microtitulación, el enzima unido se detectó mediante la
adición del sustrato (TMB) y las placas se leyeron a 490 nm con un
lector de placas ELISA.
Se muestran los resultados en la figura 12. Los
resultados demuestran que la unión de los anticuerpos conjugados
con HRP fue eficazmente inhibida por la cantidad en exceso de su
propio anticuerpo pero no por los otros anticuerpos sometidos a
ensayo.
Las regiones del ligando Apo-2
reconocidas por los anticuerpos monoclonales se determinaron
utilizando péptidos sintéticos [aminoácidos 128 a 143 (péptido
"APO 14"); aminoácidos 144 a 159 (péptido "APO 15");
aminoácidos 192 a 204 (péptido "APO 17"); aminoácidos 230 a
238 (péptido "APO 18"); aminoácidos 261 a 272 (péptido "APO
19") de la secuencia del ligando Apo-2 tal como
se muestra en la fig. 1A] en una ELISA tal como se describe en
Chuntharapai et al., J. Immunol.
152:1783-1789, 1994. Se muestran los resultados en
la figura 13. Los anticuerpos 1D1 demostraron la unión al péptido
APO 17 que comprendía los residuos aminoácidos 192 a 204 del ligando
Apo-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se insertó en un plásmido pRK5 la inserción de
ADNc de ligando Apo-2 de longitud completa del
plásmido pGEM-T-ligando
Apo-2 (descrito en los Ejemplos 1 y 2,
anteriormente). Este plásmido seguidamente se cotransfectó en
células CHO DP-12 utilizando el procedimiento de
lipofectamina Plus (Gibco/BRL) junto con un plásmido pFD11
(promotor temprano de SV40) que portaba un gen de selección con
DHFR. Se seleccionaron los clones estables que expresaban el
ligando Apo-2 por su capacidad de crecer en medio de
crecimiento selectivo PS21 (G1074)/280 empobrecido en GHT con FBS
dializado al 2,5%.
Las células CHO seleccionadas que expresaban
ligando Apo-2 se incubaron durante 2 a 4 días a
37ºC. A continuación, se recolectó y se filtró el medio de cultivo
celular. La presencia del ligando Apo-2 en el
sobrenadante del cultivo celular se sometió a ensayo mediante
análisis de transferencia western. Para preparar la proteína para
el análisis de transferencia western, los sobrenadantes de cultivo
se incubaron con el 5C2 anti-Apo-2L
dado a conocer en la presente invención unido a perlas de vidrio de
poro controlado. Tras la incubación, las perlas se lavaron y la
proteína unida se eluyó con tampón de muestra
SDS-PAGE que contenía DTT 25 mM. Seguidamente el
eluido se corrió en un gel SDS de gradiente de 4% a 20% de
poliacrilamida y se electrotransfirió sobre un filtro de
nitrocelulosa. El filtro se incubó con un anticuerpo policlonal de
conejo anti-ligando Apo-2 humano
seguido de IgG anticonejo conjugada con peroxidasa de rábano
picante, y se reveló mediante quimioluminiscencia de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (NEB). La muestra de las células
CHO que expresaban ligando Apo-2 dio lugar a una
sola banda en el gel a 22.000 daltons (datos no mostrados).
Para determinar la secuencia del ligando
Apo-2 expresado por las células CHO transfectadas,
se purificaron 25 ml del sobrenadante de cultivo celular utilizando
anticuerpo anti-Apo-2L (anticuerpo
5C2 dado a conocer en la presente ivnención). Para preparar la
columna de purificación, se acoplaron 2,0 mg del anticuerpo 5C2 a
0,5 ml de perlas de vidrio de poro controlado (CPG, Inc., Fairfield,
NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras el
acoplamiento, la resina se lavó con 15 ml de Tris 50 mM, pH 7,5,
seguido de 15 ml de ácido acético 0,1 M/citrato sódico 0,15 M/NaCl
0,05 M.
Previamente a la carga, la columna de 0,5 ml se
equilibró con 15 ml de Tris 50 mM, pH 7,5. Se cargaron
aproximadamente 25 ml del medio de cultivo celular CHO recolectado,
pH 7,2, conductividad de 10,2 mmho, sobre la columna de anticuerpos
en un modo de carga de alimentación por gravedad. El efluente de la
carga se recicló a través de la columna de manera que el tiempo
total de carga fuese una hora. Tras la carga, las proteínas no
específicas se desprendieron por lavado con 2 ml de TMAC 0,5 M/NaCl
0,25 M. La columna se eluyó con 1,5 ml de ácido acético 0,1 M/NaCl
0,15 M, pH 3,0. El eluido de 1,5 ml se recogió en un tubo y se
neutralizó inmediatamente hasta pH 7,0 con 50 \mul de Tris 3 M, pH
9,0.
Se analizó una alícuota del material analizado
en un gel SDS, junto con un control purificado de polipéptido
ligando Apo-2 consistente de los residuos
aminoácidos 96 a 281 de la figura 1A que había sido previamente
expresada en E. coli y purificada. El gel confirmó que el
polipéptido ligando Apo-2 soluble expresado en
células CHO había sido purificado en la columna de afinidad de
anticuerpo 5C2. Se concentró otra alícuota del material eluido, se
corrió en SDS-PAGE, se electrotransfirió sobre una
membrana de PVDF y después se secuenció mediante degradación Edman.
El análisis de la secuencia proteica reveló que las células CHO
expresaban una forma soluble de ligando Apo-2 que
presentaba un aminoácido N-terminal en la posición
92 en la secuencia de la figura 1A. De esta manera, el polipéptido
ligando Apo-2 soluble incluía los aminoácidos 92 a
281 de la figura 1A. En la actualidad se cree que esta forma
soluble de aminoácidos 92 a 281 del ligando Apo-2
comprende la forma naturalmente cortada del ligando
Apo-2.
Se sometió a ensayo la actividad apoptótica del
ligando Apo-2 expresado por las células CHO en
células HeLa cultivadas (ATCC nº CCL 22). Las células HeLa se
sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos en medio F12 de Ham
con FBS al 10% y se incubó durante la noche a 37ºC. El medio se
aspiró y se añadieron 2 ml del sobrenadante del cultivo celular CHO
que contenía el ligando Apo-2 expresado (diluciones
1:10, 1:20, 1:40) a cada pocillo de muestra. Las placas se
incubaron durante la noche a 37ºC. En paralelo bajo las mismas
condiciones se corrió un pocillo de control que contenía 2 ml de
medio no condicionado (sobrenadante de cultivo celular CHO no
transfectado).
A continuación, las células HeLa tratadas se
analizaron bajo un microscopio óptico para la morfología apoptótica
(ver las figuras 14A a 14D). Se muestra en la figura 14E el número
de células apoptóticas en cada campo. Las células HeLa tratadas con
el sobrenadante de cultivo celular CHO que contenía el ligando
Apo-2 expresado mostraron un incremento de dos o
más veces en la morfología apoptótica en comparación con las células
tratadas con medio no condicionado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron los efectos antitumorales del
ligando Apo-2 en ratones desnudos portadores de
tumor. En contraste con los Ejemplos anteriores, el polipéptido
ligando Apo-2 soluble se expresó en E. coli y
después se infusionó en los animales a través de un dispositivo
minibomba implantado.
Se preparó el ligando Apo-2
mediante la inserción del ADNc codificante de los aminoácidos 91 a
281 (ver la fig. 1A) en un plásmido pS1346 [pS1346 comprende un
plásmido hgh207-1 que presenta un terminador de
transcripción insertado; ver DeBoer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 80:21-25, 1983; Scholtissek et al.,
Nucl. Acids Research 15:3185, 1987]. Este plásmido seguidamente se
transformó en la cepa E. coli 52A7. La cepa 52A7 es una cepa
E. coli K12 W31 10 0 con el genotipo siguiente: fhuA (tonA)
lon galE rpoHts (htpRts) clpP laclq. Se cultivó un cultivo de 25 ml
del E. coli en medio LB hasta una densidad óptica de
aproximadamente 1,0 (DO550) y se recolectó mediante centrifugación
(5.000 rpm durante 15 minutos). El pellet celular se lavó una vez
en NaCl 0,15 M antes de resuspender en 2,5 ml de tampón (caldo B, pH
6,1 con HCl, que contenía 100 g/l de PEG 8000, MgSO_{4} 10 mM,
MgCl_{2} 10 mM y DMSO al 5%). La suspensión celular se dejó sobre
hielo durante 30 a 45 minutos, se dividió en alícuotas y se
almacenó a -80ºC. Esta suspensión celular sirvió como fuente de
células competentes para el proceso de transformación. La
transformación de las células competentes con el plásmido, y la
preparación, selección y aislamiento de transformantes se llevó a
cabo siguiendo los protocolos estándares descritos en Maniatis
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda
edición, vol. 1:1.74-1.84.
Se preparó el inóculo de fermentador mediante la
inoculación de 1 ml de los transformantes en 500 ml de medio LB que
contenía 5 \mug/ml de tetraciclina. Este cultivo se incubó durante
10 horas en un matraz con deflectores de 2 litros a una temperatura
de 30ºC o 37ºC. A continuación, el cultivo resultante se utilizó
para inocular un fermentador de 10 litros que contenía 8 litros de
medio (6,25 g/l de sulfato amónico, 7,5 g/l de fosfato potásico
dibásico, 3,75 g/l de fosfato sódico monobásico dihidrato y 1,25 g/l
de citrato sódico) con 25 g/l de NZ Amina AS, 6,25 g/l de extracto
de levadura, 0,125 g/l de triptófano, 6,25 mg/l de tetraciclina,
0,94 g/l de glucosa, 0,625 g/l de L-isoleucina y 94
mg/l de antiespumante L-61.
La fermentación se llevó a cabo a 30ºC con
agitación vigorosa y aireación y con control de pH a 7,0 utilizando
adiciones de NH4OH. Tras agotarse la glucosa inicial, se alimentó
una solución estéril de glucosa al 50% para mantener el cultivo. A
aproximadamente 30 DO, la temperatura se modificó a 25ºC para
minimizar el espumado. Al alcanzar la DO del cultivo
aproximadamente 50 (A550), se añadieron 25 ml de 1AA (ácido
3-beta-indol acrílico) a una
concentración de 25 mg/ml para la inducción de la expresión de
ligando Apo-2 regulada por el promotor trp. Las
células se recolectaron mediante centrifugación 6 a 10 horas después
de la adición de IAA.
El polipéptido expresado se purificó de la
manera siguiente. La pasta celular que contenía el ligando Apo-
expresado de E. coli se extrajo con tampón Tris 0,1 M, NaCl
0,2 M, EDTA 50 mM, pH 8. A continuación, el extracto se precipitó
utilizando sulfato amónico al 40%. Todas las etapas de la
cromatografía se llevaron a cabo a temperatura ambiente a menos que
se indique lo contrario. El precipitado de sulfato amónico se
disolvió en tampón HEPES 50 mM, Triton X-100 al
0,05%, pH 8 y después se aplicó en una columna de
Macro-prep de hidroxiapatito equilibrada en HEPES
50 mM, Triton X-100 al 0,05%, pH 8, a un caudal de
80 cm/hora. La columna se lavó con tampón de equilibración hasta
que la absorbancia A280 volvió a aproximadamente la línea base. El
ligando Apo-2 se eluyó de la columna con 8
volúmenes de columna con un gradiente lineal de fosfato sódico de 0
a 0,2 M. Las fracciones que contenían el ligando
Apo-2 se agruparon y el pH se ajustó a 6,5. El pool
de pH ajustado se cargó en una columna Ni-NTA
Superflow equilibrada en tampón NaCl 0,35 M/PBS, pH p6,5, a un
caudal de 80 cm/hora. La columna se lavó con tampón de
equilibración hasta una absorbancia próxima a la línea base. El
ligando Apo-2 se eluyó de la columna con 8 volúmenes
de columna con un gradiente lineal de 0 a 50 mM de imidazol/tampón
de equilibración. Las fracciones que contenían el ligando
Apo-2 se agruparon y se concentraron utilizando
membranas Biomax 8 del sistema Millipore Lab TFF. El pool
concentrado se formuló con una columna G-25 en
tampón Tris 20 mM, trehalosa al 8%, Tween-20 al
0,01%. El pool formulado de ligando Apo-2
seguidamente se filtró a través de un filtro de 0,22
micrómetros.
El análisis del material purificado reveló que
contenía (en una proporción aproximada de 50:50) polipéptido
ligando Apo-2 que presentaba los aminoácidos 91 a
281 (mostrado en la figura 1A) y polipéptido ligando
Apo-2 que presentaba los aminoácidos 92 a 281
mostrado en la figura 1A) (esta proporción en la actualidad se cree
que se debe al potencial procesamiento N-terminal;
el residuo aminoácido 91 mostrado en la figura 1A es un residuo de
metionina).
En el experimento, los ratones desnudos
recibieron una inyección subcutánea de células de carcinoma de
colon humano HCT116 (ATCC nº CCL 247) (1 x 10^{6} células) en cada
flanco del animal. A continuación, los tumores se dejaron crecer
hasta alcanzar un diámetro de aproximadamente 1 cm (aproximadamente
10 días). El día 0, se midió el volumen del tumor con un
calibrador. El volumen se calculó como \pi/6 x ab^{2}, donde
a=longitud y b=anchura. Después, se implantaron intraperitonealmente
en cada animal minibombas osmóticas (disponibles de Alza Corp.,
modelo 1003). Las minibombas se cargaron con: (1) vehículo de
control (Tris 20 mM, pH 7,5, trehalosa al 8%,
Tween-20 al 0,01%), o (2) ligando
Apo-2. Cinco animales en cada grupo recibieron el
vehículo de control o el ligando Apo-2. Las
minibombas se calibraron para administrar cada día 10 mg/kg de
ligando Apo-2 (10 mg/ml x 2 \mul/hora) o 2
\mul/hora de vehículo de control.
El día 3, se midió nuevamente el volumen tumoral
y se sacrificaron los animales. El examen e los animales no reveló
ninguna evidencia clara de toxicidad. En la figura 15, los
resultados muestran el porcentaje de cambio del volumen tumoral. El
volumen tumoral no cambió en el grupo de vehículo, pero se observó
una marcada reducción del tamaño tumoral en ratones infusionados
con el Apo-2L. El tratamiento con
Apo-2L encogió los tumores en aproximadamente 50% a
lo largo de 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la mutagénesis por escaneo de
alaninas para descubrir y describir el epítopo o epítopos
importantes para la unión de receptores y la actividad de inducción
de apóptosis. La mutagénesis por escaneo de alaninas puede
utilizarse para identificar epítopos ligantes, tal como se describe
en Kelley et al., Biochemistry
34:10383-10392, 1995, y Cunningham y Wells, Science
244:1081-1085, 1989. En general, se introdujo una
mutación codificante del aminoácido alanina en lugar de otros
residuos mediante procedimientos descritos en la presente
invención. La sustitución seleccionada fue la alanina debido a que
presenta una cadena lateral truncada (un grupo metilo). Además, la
alanina se puede encontrar tanto sobre la superficie como enterrada
en el interior de las proteínas y, por lo tanto, se cree que es
menos probable que perturbe la integridad estructural de la proteína
expresada.
Se construyeron plásmidos codificantes de las
proteínas con sustituciones de alanina utilizando mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos (Kunkel, T.A. et al., Methods
in Enzymology 154:367-382, 1987) en la forma
monocatenaria del plásmido pAPOK5 (ver la figura 16). Este plásmido
se diseñó para la expresión intracelular en E. coli de la
forma 91-281 de Apo-2L controlada
por el promotor triptófano (trp). pAPOK5 se construyó utilizando
PCR para clonar el ADNc de Apo-2L (codificante de
los residuos 91 a 281) en el plásmido pS1162 que porta el promotor
trp. Todas las sustituciones de Ala se confirmaron mediante
secuenciación con dideoxinucleótidos (Sanger, F. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467, 1977).
Los plásmidos codificantes de las proteínas
Apo-2L con sustitución de alaninas seguidamente se
transformaron en E. coli cepa 294 para la expresión. Los
cultivos se cultivaron durante la noche hasta la saturación a 37ºC
en caldo Lura más carbenicilina a una concentración de 50 \mug/ml.
Las células posteriormente se sembraron en medio filtrado a
esterilidad que comprendía Na_{2}HPO_{4} (6 g/l),
KH_{2}PO_{4} (3 g/l), NaCl (0,5 g/l), NH_{4}Cl (1 g/l),
glucosa (4,9 g/l), casaminoácidos (4,9 g/l), MgSO_{4} 27 mM, HCl
de tiamina al 0,003% y c.s. de agua destilada más carbenicilina a
una concentración de 50 \mug/ml a una dilución de 20 veces y se
cultivaron durante 1 hora a 37ºC.
A continuación se indujo la expresión con ácido
3-\beta-indolacrílico (IAA)
(Sigma, St. Louis, MO.) a una concentración de 25 \mug/ml y las
células se cultivaron durante la noche a 30ºC con agitación. Las
células se recolectaron mediante centrifugación y se almacenaron
congeladas a -20ºC para la recuperación posterior del
Apo-2L, tal como se describe posteriormente.
Las proteínas Apo-2L se
extrajeron de los pellets congelados células de E. coli
mediante homogeneización en 10 volúmenes (p/v) de Tris 100 mM, pH
8,0/NaCl 200 mM/EDTA 5 mM/DTT 1 mM utilizando un microfluidificador
modelo M110-F (Microfluidics Corporation, Newton,
MA). Se añadió polietielenimina (PEI) hasta una concentración final
de 0,5% (v/v) al homogenado, que después se centrifugó para eliminar
los residuos celulares. Se añadió sulfato amónico sólido al
sobrenadante de extracción hasta una concentración final de 45% de
la saturación a temperatura ambiente bajo agitación, y el pellet se
recuperó mediante centrifugación. El pellet de sulfato amónico se
lavó con solución al 50% de sulfato amónico para eliminar el EDTA
residual, después se resuspendió en 50 volúmenes (p/v) de EPPS 50
mM, pH 7,5/Triton X-100 al 0,1%. La solución
resultante se clarificó mediante centrifugación y se purificó
mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC)
utilizando una columna de sefarosa quelante HiTrap de 5 ml
(Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna se cargó con níquel en
NiSO_{4} 100 mM/Tris 300 mM, pH 7,5 se equilibró con NaCl 350 mM
en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tras la carga, la
columna se lavó con NaCl 350 mM en PBS y se eluyó con imidazol 50
mM/NaCl 350 mM en PBS. El eluyente IMAC se dializó frente a Tris 20
mM, pH 7,5, se clarificó mediante centrifugación y se purificó
adicionalmente mediante cromatografía de intercambio catiónico
utilizando una columna de sefarosa HiTRap SP de 5 ml (Pharmacia)
que se equilibró y se lavó con Tris 20 mM, pH 7,5. La columna HiTrap
SP se eluyó con Tris 20 mM, pH 7,5/NaCl 0,5 M. El eluido de la
columna SP se redujo con DTT 2 mM y posteriormente se precipitó
mediante la adición de sulfato amónico sólido bajo agitación hasta
una concentración final de 45% de la saturación a temperatura
ambiente. El pellet del sulfato amónico se resuspendió en 3,5 ml de
Tris 20 mM, pH 7,5/NaCl 100 mM y se intercambió en el tampón final
de Tris 20 mM, pH 7,5/NaCl 100 mM mediante cromatografía de
filtración en gel utilizando una columna PD10 (Pharmacia). Las
proteínas Apo-2L purificadas con sustitución de
alaninas se caracterizaron mediante SDS-PAGE teñida
con Coomassie y secuenciación N-terminal y se
almacenaron congeladas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un ensayo in vitro para
determinar la actividad apoptótica de algunas de las variantes por
sustitución del ligando Apo-2 preparadas tal como se
describe en el Ejemplo 17, anteriormente.
Se cultivaron células de carcinoma pulmonar
humano SK-MES (ATCC nº HTB 58) en DMEM:medio
F-12 de Ham (50:50) suplementado con 10% de FBS,
L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100
microgramos de estreptomicina. Se sembraron células
SK-MES-1 en microplacas tratadas de
cultivo de tejidos Falcon de 96 pocillos en un volumen de 0,1 ml a
una densidad de 4,0 x 104 células/pocillo y se dejó que se uniesen
durante la noche a 37ºC. Se indujo la apóptosis mediante la adición
de diversas variantes por sustitución de Apo-2L o de
Apo-2L (consistente de los aminoácidos 91 a 281 de
la figura 1A; denominada Apo2L.2) durante 24 horas. Tras el
tratamiento con las proteínas de ensayo, se eliminó el medio y los
pocillos se tiñeron durante 15 minutos con solución al 0,5% de
cristal violeta en metanol. Se determinó el número celular mediante
la medición de la densidad óptica de las placas secas a 540 nm
utilizando un lector de placas SLT 340 ATC (Salzburg, Austria).
Los resultados se ilustran en las figuras 17 y
18. La figura 17 muestra datos de bioensayo de las variantes D218A,
D269A y V207A en comparación con la molécula Apo2L.2 (V207A es una
variante de sustitución identificada que comprende los aminoácidos
91 a 281 de la figura 1 en la que se ha sustituido por alanina la
valina en la posición 207 en la secuencia de la figura 1A). Las
variantes D218A y D269A mostraron una actividad incrementada de
inducción de apóptosis de aproximadamente 3 veces y 7 veces,
respectivamente, en comparación con Apo-2L.2. V207A
era aproximadamente 9 veces menos activos que
Apo-2L.2 en el bioensayo.
La figura 18 muestra los datos de bioensayo de
D203A en comparación con Apo2L.2. La variante D203A mostró una
actividad incrementada de inducción de apóptosis de aproximadamente
2 veces en comparación con Apo2L.2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas Apo-2L con
sustitución de alaninas (D203A; D218A y D269A a las que se hace
referencia en el Ejemplo 18, anteriormente) se analizaron para su
unión a diversos receptores de Apo-2L descritos en
la literatura: DR4 [Pan et al., Science
276:111-113, 1997], DR5 [Sheridan et al.,
Science 277:818-821, 1997], receptor señuelo, DcR2
[Marsters et al., Current Biology
7:1003-1006, 1997] y OPG [Simonet et al.,
Cell 89:309-319, 1997] utilizando el BIAcore
(Pharmacia). A título de comparación, también se sometió a ensayo
Apo-2L consistente de los aminoácidos 91 a 281 en el
BIAcore para la unión a las moléculas de fusión de
IgG-receptor. Se preparó cada una de las proteínas
receptoras de Apo-2L como inmunoadhesinas
esencialmente tal como describen Ashkenazi et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 88:10535-10539, 1991. Las moléculas
de fusión IgG-receptor se inmovilizaron en el chip
CM5 BIACore, de grado para uso en investigación (Pharmacia),
utilizando química de acoplamiento de aminas de
NHS-EDC. Las proteínas Apo-2L con
sustitución de alaninas se diluyeron en serie 2 veces de 500 nM a
15,625 nM en el tampón de corrido del BIAcore,
PBS/Tween-20 al 0,05% y se pasaron a través de la
superficie del chip sensor con receptor inmovilizado. Se utilizaron
parámetros cinéticos de unión específicos para determinar el valor
KD utilizando el programa informático de evaluación del BIAcore
(siguiendo las instrucciones del fabricante).
Se muestran los resultados en la figura 19. La
tabla muestra las constantes de disociación (K_{D}) de las
variantes D203A, D218A y D269A en comparación con la de Apo2L.2
según se determinó mediante análisis cinético de unión utilizando
el BIAcore (Pharmacia). Los datos no demostraron ningún cambio
significativo (>2 veces) en la unión de las variantes con
sustitución de alaninas a las proteínas de fusión de
IgG-receptor DR4, DR5 y DcR2 en comparación con
Apo2L.2. En el caso de la unión a OPGF-IgG, las
variantes D203A, D218A y D269A mostraron una unión más estrecha que
Apo2L.2 (2<KD_{wt}<KD_{mut.}<4).
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares siguientes han sido
depositados en la American Type Culture Collection, 10801
University Boulevard, Manassas, VA, USA (ATCC):
Este depósito se preparó bajo las disposiciones
del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del
depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia
de procedimiento de patentes y normas del mismo (Tratado de
Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del
depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. La ATCC
pondrá a disposición del público el depósito bajo los términos del
Tratado de Budapest y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la
ATCC, garantizando la disponibilidad permanente y no limitada de la
progenie del cultivo del depósito para el público tras la
publicación de la patente US pertinente o tras la apertura al
público de cualquier solicitud de patente US o foránea, la que sea
la primera, y garantiza la disponibilidad de la progenie para la
persona que determine el comisario US de patentes y marcas que
presenta el derecho para ello según la disposición 35 USC \NAK 122
y las normas del comisario pertinentes (incluyendo la 37 CFR \NAK
1.14, con referencia particular a 886 OG 638).
El cesionario dela presente solicitud ha
acordado que si el cultivo de la línea celular en depósito muriese,
se perdiese o resultase destruida estando en cultivo bajo
condiciones adecuadas, la línea celular será sustituida rápidamente
tras la notificación con otro del mismo plásmido. La disponibilidad
de la línea celular depositada no debe interpretarse como una
licencia para la práctica de la invención en contravención de los
derecho otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo
con su legislación de patentes.
La especificación escrita anterior se considera
suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en
práctica la invención. La presente invención no debe considerarse
limitada en su alcance por el constructo depositado, debido a que
la realización depositada se pretende como una única ilustración de
determinados aspectos de la invención, y cualquier constructo que
sea funcionalmente equivalente se encuentra comprendido dentro del
alcance de la presente invención. El depósito del material de la
presente invención no constituye el reconocimiento de que la
descripción escrita contenida en la presente memoria resulta
inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la
invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe
interpretarse como limitativa del alcance de las reivindicaciones a
las ilustraciones específicas que representa la misma. En efecto,
se pondrán de manifiesto para los expertos en la materia diversas
modificaciones de la invención además de aquéllas mostradas y
descritas en la presente invención, a partir de la descripción
anterior y se encuentran comprendidas dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (21)
1. Polipéptido ligando Apo-2
aislado que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%
con los aminoácidos 91 a 281 de la figura 1A (SEC ID nº 1), en el
que el polipéptido comprende una sustitución por un residuo alanina
del residuo ácido aspártico en una o más de las posiciones 203, 218
ó 269, lo que incrementa la actividad inductora de apóptosis del
polipéptido ligando Apo-2 en comparación con el
ligando Apo-2 consistente de los aminoácidos 91 a
281 de la SEC ID nº 1 en un ensayo in vitro utilizando
células de carcinoma pulmonar humano SK MES-1 (ATCC
nº HTB58).
2. Polipéptido ligando Apo-2
aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido
presenta un residuo alanina en sustitución de un residuo ácido
aspártico en la posición 203.
3. Polipéptido ligando Apo-2
aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido
presenta un residuo alanina en sustitución del residuo ácido
aspártico en la posición 218.
4. Polipéptido ligando Apo-2
aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido
presenta un residuo alanina en sustitución del residuo ácido
aspártico en la posición 269.
5. Polipéptido ligando Apo-2
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho
polipéptido variante comprende los residuos aminoácidos 92 a 281 de
la figura 1A (SEC ID nº 1) con la sustitución por un residuo alanina
de un residuo ácido aspártico en una o más de las posiciones 203,
218 ó 269.
6. Polipéptido ligando Apo-2
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho
polipéptido variante comprende los residuos aminoácidos 91 a 281 de
la figura 1A (SEC ID nº 1) con la sustitución por un residuo alanina
de un residuo ácido aspártico en una o más de las posiciones 203,
218 ó 269.
7. Polipéptido ligando Apo-2
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho
polipéptido variante comprende los residuos aminoácidos 114 a 281 de
la figura 1A (SEC ID nº 1) con la sustitución por un residuo alanina
de un residuo ácido aspártico en una o más de las posiciones 203,
218 ó 269.
8. Polipéptido ligando Apo-2
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho
polipéptido se encuentra unido a un polímero no proteico.
9. Polipéptido ligando Apo-2
según la reivindicación 8, en el que dicho polímero no proteico es
polietilenglicol.
10. Polipéptido quimérico que comprende el
polipéptido ligando Apo-2 según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 fusionado con una secuencia polipeptídica
heteróloga.
11. Ácido nucleico aislado que comprende ADN
codificante del polipéptido ligando Apo-2 según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Vector que comprende el ácido nucleico según
la reivindicación 11.
13. Célula huésped aislada que comprende el
vector según la reivindicación 12.
14. Célula huésped según la reivindicación 13,
en la que dicha célula huésped es una célula CHO.
15. Célula huésped según la reivindicación 13,
en la que dicha célula huésped es una célula de levadura.
16. Célula huésped según la reivindicación 13,
en la que dicha célula huésped es una célula de levadura
17. Procedimiento para producir polipéptido
ligando Apo-2 que comprende cultivar la célula
huésped según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, y
recuperar el polipéptido ligando Apo-2 a partir del
cultivo de células huésped.
18. Composición que comprende el polipéptido
ligando Apo-2 según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 y un portador.
19. Composición según la reivindicación 18, en
ola que la composición resulta útil para estimular la apóptosis de
las células de mamífero.
20. Utilización de un polipéptido ligando
Apo-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9
para la preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en
células de cáncer de mamífero.
21. Utilización según la reivindicación 20, en
la que dicho medicamento se administra mediante infusión en un
mamífero que se ha diagnosticado que presenta cáncer.
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