ES2306480T3 - Polipeptido dcr3, un homologo de tnfr. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-DcR3 aislado que (a) se une a un polipéptido DcR3 que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido DcR3 de secuencia nativa, que comprende los residuos de aminoácidos 1-300 de la figura 1 (SEC ID No: 1); y (b) inhibe la unión del ligando de Fas al polipéptido DcR3 de (a).

Description

Polipéptido DcR3, un homólogo de TNFR.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación y al aislamiento de un polipéptido, designado en la presente invención como "DcR3", a los anticuerpos anti-DcR3 y sus usos.

Antecedentes de la invención

Se han identificado como miembros de la familia del factor de necrosis de tumoral ("TNF") de citoquinas varias moléculas, tales como el factor-\alpha de necrosis tumoral ("TNF-\alpha"), el factor-\beta de necrosis tumoral ("TNF-\beta" o "linfotoxina"), el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando de Fas (también llamado ligando Apo-1 o ligando CD95), y el ligando Apo-2 (también llamado TRAIL) [Véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Wiley et al., Immunity, 3: 673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)]. Entre estas moléculas, se ha descrito que TNF-\alpha, TNF-\beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando de Fas, y el ligando Apo-2 (TRAIL) están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que tanto el TNF-\alpha como el TNF-\beta inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]. Zheng et al. han descrito que el TNF-\alpha está implicado en la apoptosis post-estimulación de células T CD8-positivas [Zheng et al., Nature, 377:348-351 (1995)]. Otros investigadores han descrito que el ligando CD30 puede estar implicado en la supresión de las células T auto-reactivas en el timo (Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. Nº 10, (1995)).

El ligando de Fas parece regular fundamentalmente tres tipos de apoptosis: (a) la muerte celular inducida por activación (AICD) de linfocitos T maduros; (b) la eliminación de células inflamatorias de sitios inmuno-privilegiados; y (c) el asesinato de células dañadas por linfocitos citotóxicos [Nagata, Cell, 88:355 (1997)]. Se ha descrito que la AICD de células T ayuda en la desactivación de la respuesta inmune del huésped una vez se ha aclarado una infección. La estimulación repetida del receptor de célula T (TCR) mediante antígeno indujo la expresión del ligando de Fas y Fas en la superficie de las células T auxiliares; posteriormente el ligando de Fas capta el Fas y puede provocar la apoptosis en los linfocitos activados, llevándolos a su eliminación. Los sitios inmuno-privilegiados incluyen tejidos como el ojo, el cerebro o los testículos, en los cuales las respuestas inmunes inflamatorias pueden perturbar la función. Las células en los sitios inmunes privilegiados parecen expresar el ligando de Fas de forma constitutiva, y eliminar los leucocitos infiltrantes que expresan Fas a través la apoptosis dependiente de Fas. Ciertos cánceres incluidos los melanomas [Hahne et al., Science, 274:1363 (1961)] y los carcinomas hepatocelulares [Strand et al., Nature Med., 2:1361-1366 (1996)] utilizan un mecanismo similar dependiente de ligando de Fas para eludir la vigilancia inmune. Se ha descrito que las células asesinas naturales (NK) y los linfocitos T citotóxicos eliminan células que han sido dañadas por infección bacteriana o viral o por transformación oncogénica mediante por lo menos dos mecanismos. Un mecanismo implica la liberación de perforina y grancimas, y un mecanismo alternativo implica la expresión del ligando de Fas y la inducción de la apoptosis mediante la unión de Fas en las células diana [Nagata, supra; Moretta, Cell, 90:13 (1997)].

Se han asociado las mutaciones en los genes del receptor o el ligando de Fas/Apo-1 de ratón (llamados lpr y gld, respectivamente) con algunos trastornos autoinmunes, lo que indica que el ligando de Fas puede jugar un papel en la regulación de la supresión clonal de los linfocitos auto-reactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267:1449-1456 (1995)]. También se describe que el ligando de Fas induce la apoptosis post-estimulación en linfocitos T CD4-positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de los linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales de ratón agonistas que específicamente se unen al receptor de Fas muestran actividad de asesinato celular que es comparable o similar a la de TNF-\alpha [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169:1747-1756 (1989)].

Se cree que la inducción de varias respuestas celulares mediadas por dichas citoquinas de la familia del TNF se inicia mediante su unión con receptores específicos de célula. Se han identificado dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J: Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417,563, publicada el 20 de marzo, 1991] y se han aislado y caracterizado los ADNc de humano y de ratón correspondientes a ambos tipos de receptores. [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Se han asociado polimorfismos extensivos con ambos genes de receptor de TNF [véase, por ejemplo, Takao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)]. Ambos TNFRs comparten la estructura típica de los receptores de superficie celular incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores se encuentran de forma natural también como proteínas de unión de TNF solubles [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990)]. Más recientemente, se ha descrito por Hale et al. la clonación de receptores de TNF solubles recombinantes [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, pág. 113
(P424)].

La parte extracelular de TNFRs de tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón repetitivo de secuencia de aminoácidos de cuatro dominios ricos en cisteína (CRDs) designados del 1 al 4, empezando por el NH_{2} terminal. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de largo y contiene entre 4 y 6 residuos de cisteína en las posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En el TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRDs son tal y como se indican: CRD1-aminoácidos desde el 14 y aproximadamente el 53; CRD2-aminoácidos desde el 54 aproximadamente hasta el 97 aproximadamente; CRD3-aminoácidos desde el 98 aproximadamente hasta el 138 aproximadamente; CRD4- aminoácidos desde el 139 aproximadamente hasta el 167 aproximadamente. En el TNFR2, el CDR1 incluye aminoácidos desde el 17 y el 54 aproximadamente; CRD2-aminoácidos desde el 55 aproximadamente hasta el 97 aproximadamente; CRD3-aminoácidos desde el 98 aproximadamente hasta el 140 aproximadamente; y CRD4-aminoácidos desde el 141 aproximadamente hasta el 179 aproximadamente. [Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)]. El potencial papel de los CRDs en la unión de ligando también se describe en Banner et al., supra.

Existe un patrón repetitivo similar de CRDs en diversas proteínas de la superfície celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)], el antígeno CD40 de célula B [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)], el antígeno OX40 de célula T [Mallet et al., EMBO J., 9:1063 (1990)] y el antígeno de Fas [Yonehara et al., supra e Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)]. También se encuentran CRDs en las proteínas T2 de tipo de TNFR soluble (sTNFR) de los poxvirus de Shope y mixoma [Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al., Virology, 184:370 (1991)]. La alineación óptima de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos de cisteína están bien conservadas. A estos receptores a veces se les hace referencia de forma colectiva como miembros de la superfamilia de receptores de TNF/NGF. Estudios recientes sobre p75NGFR mostraron que la supresión de CRD1 [Welcher, A.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159-163 (1991)] o una inserción de 5 aminoácidos en este dominio [Yan, H. y Chao, M.V., J. Biol. Chem., 266:12099-12104 (1991)] tuvo un efecto pequeño o nulo en la unión de NGF [Yan, H. y Chao, M.V., supra]. La p75NGFR contiene un tramo rico en prolina de aproximadamente 60 aminoácidos, entre su CRD4 y la región transmembrana, que no está implicada en la unión de NGF [Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988); Seckinger, P. et al., J. Biol. Chem., 264:11966-11973
(1989); Yan, H. y Chao, M.V., supra]. En TNFR2 se encuentra una región similar rica en prolina pero no así en TNFR1.

Itoh et al. dan a conocer que el receptor de Fas puede señalar una muerte celular apoptótica similar a la señalada por el TNFR1 de 55 kDa [Itoh et al., supra]. También se ha descrito que la expresión del antígeno de Fas está regulada a la baja junto con la de TNFR1 cuando se tratan las células con TNF-\alpha o anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fas [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Por consiguiente, algunos investigadores han formulado la hipótesis de que las líneas celulares que co-expresan tanto los receptores de Fas como los de TNFR1 pueden mediar en el asesinato celular a través de mecanismos de señalización comunes [Id.]

Los ligandos de la familia del TNF identificados hasta la fecha, a excepción de la linfotoxina-\alpha, son proteínas transmembrana de tipo II, cuyo C-terminal es extracelular. En cambio, la mayoría de los receptores de la familia de receptores del TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son proteínas transmembrana de tipo I. No obstante, tanto en la familia de ligandos como receptores de TNF, se ha observado homología identificada entre los miembros de la familia principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Varias de las citoquinas de la familia del TNF, incluso el TNF-\alpha, el ligando de Fas y el ligando CD40, se dividen proteolíticamente en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma típicamente una molécula homotrimérica que funciona como una citoquina soluble. Las proteínas de la familia de receptores del TNF normalmente también se dividen proteolíticamente para liberar los ECDs de receptores solubles que pueden funcionar como inhibidores de las citoquinas relacionadas.

Recientemente, se han identificado otros miembros de la familia de TNFR. Tales miembros de la familia del TNFR recientemente identificados incluyen CAR1, HVEM y la osteoprotegerina (OPG) [Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al., Cell, 87:427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997); Simonet et al., Cell, 89:309-319 (1997)]. A diferencia de otras moléculas conocidas de tipo TFNR, Simonet et al., supra, describen que la OPG no contiene secuencia que abarca la parte transmembrana hidrofóbica.

En Marsters et al., Curr. Biol., 6:750 (1996), los investigadores describen un polipéptido humano de secuencia nativa de longitud completa, llamado Apo-3, el cual muestra similitud con la familia del TNFR en sus repeticiones extracelulares ricas en cisteína y se parece a TNFR y CD95 en que contiene una secuencia de dominio de muerte citoplasmático [véase también Marsters et al., Curr. Biol., 6:1669 (1996)]. A Apo-3 también se ha hecho referencia por otros investigadores como DR3, wsl-1 y TRAMP [Chinnaiyan et al., Science, 274:990 (1996); Kitson et al., Nature, 384:372 (1996); Bodmer et al., Immunity, 6:79 (1997)].

Pan et al. han dado a conocer otro miembro de la familia del receptor de TNF al que se hace referencia como "DR4" [Pan et al., Science, 276:11-113 (1997)]. Se ha descrito que el DR4 contiene un dominio de muerte citoplasmático capaz de poner en marcha el aparato de suicidio celular. Pan et al. dan a conocer que se cree que DR4 es un receptor para el ligando conocido como ligando Apo-2 o TRAIL.

En Sheridan et al.; Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), se describe otra molécula que se cree que es un receptor para el ligando Apo-2 (TRAIL). A esta molécula se hace referencia como DR5 (alternativamente, también se le ha hecho referencia como Apo-2). Al igual que DR4, se describe que DR5 contiene un dominio de muerte citoplasmático y que es capaz de señalizar la apoptosis.

En Sheridan et al., supra, se describe un receptor llamado DcR1 (o alternativamente, Apo-2DcR) como un receptor de señuelo potencial para el ligando Apo-2 (TRAIL). Sheridan et al. describen que el DcR1 puede inhibir la función del ligando Apo-2 in vitro. Véase también, Pan et al., para la descripción sobre el receptor señuelo al que se hace referencia como TRID.

Para una revisión de la familia del TNF de las citoquinas y sus receptores, véase Gruss y Dower, supra.

Las proteínas de unión a membrana y los receptores pueden jugar un papel importante en la formación, la diferenciación y el mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, está gobernada habitualmente por la información recibida de otras células y/o el medio inmediato. Esta información es transmitida frecuentemente mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) que, a su vez, es recibida e interpretada por diversos receptores de células o proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas de unión a membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, a receptores de citoquina, quinasas receptoras, fosfatasas receptoras, receptores implicados en las interacciones célula-célula, y moléculas de adhesina celular como selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento celular y la diferenciación celular se regula en parte mediante la fosforilación de varias proteínas celulares. También pueden actuar como receptores de factor de crecimiento las proteínas tirosina quinasas, enzimas que catalizan este proceso. Como ejemplos se incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento nervioso.

Las proteínas de unión a membrana y las moléculas receptoras tienen varias aplicaciones industriales, incluso como agentes farmacéuticos y agentes de diagnóstico. Por ejemplo, las inmunoadhesinas receptoras pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor-ligando. Las proteínas de unión a membrana también pueden utilizarse para el cribado de potenciales péptidos o inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción receptor/ligando pertinente.

Los esfuerzos para identificar a las nuevas proteínas receptoras nativas están siendo asumidas tanto por la industria como por los académicos. Muchos esfuerzos se han centrado en el cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamífero para identificar las secuencias codificantes para nuevas proteínas receptoras.

WO 9830694 da a conocer un receptor del tipo TNFR idéntico al DcR3 descrito en la presente invención. Indica sus similitudes estructurales con TNFR y con otros miembros de la familia de receptores de TNF, pero no da a conocer ninguna actividad o papel biológico creíble.

Descripción resumida de la invención

Los solicitantes han identificado un clon de ADNc denominado DNA30942 (ATCC depósito nº 209254). Éste codifica un polipéptido designado en la presente solicitud como "DcR3". Los solicitantes han descubierto que el DcR3 interacciona con el ligando de Fas, y que el gen de DcR3 se amplifica en cierto tipos de cáncer. Los solicitantes también han obtenido anticuerpos dirigidos contra DcR3, los cuales inhiben su interacción con el ligando de Fas, y han demostrado que el polipéptido DcR3 puede utilizarse como un señuelo para modular la acción del ligando de Fas.

Por consiguiente, en una primera realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-DcR3 aislado que (a) se une a un polipéptido DcR3 que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido DcR3 de secuencia nativa, que comprende los residuos de aminoácidos 1-300 de la figura 1 (SEC ID No: 1); y (b) inhibe la unión del ligando de Fas a la proteína DcR3 de (a). De modo opcional, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. También se proporcionan composiciones, artículos de fabricación y usos en la fabricación de medicamentos que implican a dichos anticuerpos.

En una segunda realización, la invención proporciona líneas celulares de hibridomas que producen dichos anticuerpos.

En una tercera realización, la invención proporciona el uso de un polipéptido DcR3 tal y como se ha definido anteriormente en la primera realización, en la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de la actividad del ligando de Fas.

En una cuarta realización, la invención proporciona un procedimiento in vitro de detección o diagnóstico del cáncer en un mamífero que comprende el análisis de células de mamífero para la amplificación de un gen de DcR3.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos derivada de un DcR3 de secuencia nativa.

La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc de DcR3 de secuencia nativa.

La figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos EST (SEC ID No: 3).

La figura 4 muestra varias ESTs (SEC ID Nos: 3-10) utilizadas en el montaje de la secuencia de consenso.

La figura 5 muestra una alineación de DcR3 y TNFR2 humano (hTNFR2). Se muestran cuatro dominios ricos en cisteína (CRD) como CRD1, CRD2, CRD3, y CRD4.

La figura 6 muestra una alineación de DcR3 y OPG humana. Se identifican cuatro dominios ricos en cisteína (CRD) como CRD1, CRD2, CRD3, y CDR4.

La figura 7 muestra la expresión de ARNm de DcR3 en tejidos humanos y en líneas celulares de cáncer humano tal y como se determina mediante análisis de hibridación de transferencia Northern.

La figura 8A muestra los resultados de un análisis FACS para determinar la unión específica de DcR3 al ligando de Fas.

La figura 8B muestra los resultados de un ensayo de co-inmunoprecipitación para determinar la unión específica de DcR3 al ligando de Fas soluble.

Las figuras 9A-C muestran los resultados de los ensayos in vitro para determinar la inhibición de la actividad del ligando de Fas por DcR3.

La figura 10 muestra los resultados de los ensayos para determinar la amplificación del gen de DcR3 en varios tumores de pulmón y de colon y en varias líneas celulares tumorales de colon.

Las figuras 11A-11C muestran los resultados de los ensayos para determinar el efecto de DcR3 en la inducción de la proliferación de linfocitos en una reacción mixta linfocitaria (MLR) o ensayos de coestimulación.

Las figuras 12 y 13 ilustran la especificidad de antígeno de ciertos anticuerpos de DcR3 a los que se hace referencia como 4C4.1.4; 5C4.14.7; 11C5.2.8; 8D3.1.5; y 4B7.1.1.

Las figuras 12 y 14 ilustran los resultados de un ELISA para determinar la actividad de bloqueo de ciertos anticuerpos de DcR3 a los que se hace referencia como 4C4.1.4; 5C4.14.7; 11C5.2.8; 8D3.1.5; y 4B7.1.1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "polipéptido DcR3" y "DcR3" cuando se utilizan en la presente invención engloban a DcR3 de secuencia nativa y a las variantes de DcR3 (que se definen más adelante en la presente). El DcR3 puede aislarse a partir de una serie de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de alguna otra fuente, o prepararse mediante procesos de recombinación o sintéticos.

Un "DcR3 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un DcR3 derivado de la naturaleza. Dicho DcR3 de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "DcR3 de secuencia nativa" abarca específicamente las formas de DcR3 natural truncadas o secretadas (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales del DcR3. En una realización de la presente invención, el DcR3 de secuencia nativa es un DcR3 de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 300 de la figura 1 (SEC ID No: 1). Alternativamente, el DcR3 comprende los aminoácidos 1 a 215 de la figura 1 (SEC ID No: 1).

La "variante de DcR3" significa un DcR3 tal y como se define a continuación que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el DcR3 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 1) para un DcR3 humano de secuencia nativa de longitud completa o las secuencias de dominio identificadas en la presente invención. Dichas variantes de DcR3 incluyen, por ejemplo, polipéptidos DcR3 en los que se añaden o se eliminan uno o más residuos de aminoácidos en los extremos N o C-terminal de la secuencia de la Figura 1 (SEC ID No: 1) o las secuencias de dominio identificadas en la presente invención. Normalmente, una variante de DcR3 tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID No:1).

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de DcR3 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de DcR3, respectivamente, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de DcR3 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de DcR3, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

El término "epítopo etiquetado" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico que comprende DcR3, o una secuencia de dominio del mismo, fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene residuos suficientes para proporcionar un epítopo contra el que se puede fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto de manera que no interfiere en la actividad del DcR3. El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo sustancialmente no reacciona de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos).

El término "aislado" cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente invención, significa polipéptidos que se han identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural de DcR3 no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" de DcR3 es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico de DcR3. Una molécula de ácido nucleico aislada de DcR3 está en una forma o disposición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas de DcR3 se distinguen de la molécula de ácido nucleico de DcR3 ya que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada de DcR3 incluye moléculas de ácido nucleico de DcR3 contenidas en células que normalmente expresan DcR3, cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales anti-dcR3 individuales (incluyendo agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes o de bloqueo) y composiciones de anticuerpo anti-DcR3 con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades.

Para los propósitos de la presente invención "activo" o "actividad" se refieren a la forma o formas de DcR3 que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas del DcR3 nativo o natural.

Los términos "apoptosis" y "actividad apoptótica" se utilizan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que está acompañada habitualmente por uno o más cambios celulares característicos, incluyendo la condensación del citoplasma, la pérdida del microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis del ADN, todos ellos conocidos en la técnica.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma y la leucemia. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el blastoma, el cáncer gastrointestinal, el cáncer renal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el neuroblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de estómago, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el cáncer endométrico, el cáncer de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de próstata, el cáncer de vulva, el cáncer tiroidal, el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" tal como se utilizan en la presente invención se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva.

El término "mamífero" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluyendo humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la presente invención el mamífero es un humano.

II. Composiciones y procedimientos de la invención

En la presente invención se dan a conocer secuencias de nucleótidos aisladas que codifican polipéptidos a los que la presente solicitud hace referencia como DcR3. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado el ADNc que codifica un polipéptido DcR3, tal y como se describe con mayor detalle en los Ejemplos más adelante. Utilizando los programas informáticos de alineación de secuencias BLAST y FastA, los solicitantes descubrieron que un DcR3 de secuencia nativa de longitud completa (mostrado en la Figura 1 y la SEC ID No: 1) tiene aproximadamente un 28% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el TNFR2 humano. Por consiguiente, actualmente se cree que el DcR3 descrito en la presente solicitud probablemente es un nuevo miembro identificado de la familia de TNFR y puede poseer actividades o propiedades típicas de la familia de la proteína TNFR. Al igual que el OPG, otro miembro de la familia de la TNFR, [Simonet et al., supra], actualmente parece que la molécula de DcR3 carece de una región transmembrana y puede ser un polipéptido secretado.

Actualmente se cree que el DcR3 puede ser un receptor señuelo soluble que es capaz de unir el ligando de Fas y/o inhibir la actividad del ligando de Fas, incluso inhibir la inducción de la apoptosis mediante el ligando de Fas. Tal y como se muestra en los Ejemplos más adelante, los experimentos de amplificación génica revelaron que el gen del DcR3 se amplifica en un número considerable de cánceres primarios de pulmón primario y colon, sugiriendo que ciertos cánceres pueden escapar al ataque inmuno-citotóxico mediante la expresión de un receptor señuelo como por ejemplo el DcR3 que bloquea la apoptosis inducida por el ligando Fas. Los Ejemplos también muestran que el DcR3 está capacitado para la actividad inmuno-inhibitoria, sugiriendo su uso, por ejemplo, en el tratamiento de las enfermedades mediadas por células T. Pueden utilizarse anticuerpos para el DcR3 para sensibilizar a los cánceres que producen DcR3 ante el ataque inmuno-citotóxico y para aumentar la proliferación de los linfocitos reactivos al tumor.

B. Modificaciones de DcR3

El polipéptido dcR3 descrito en la presente invención se puede modificar covalentemente. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de aminoácidos marcados del DcR3 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del DcR3. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular DcR3 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-DcR3, y viceversa. Entre los agentes de reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido DcR3 incluido en el alcance de la presente invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en DcR3 de secuencia nativa y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el DcR3 de secuencia nativa.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido DcR3 se puede realizar alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en el DcR3 de secuencia nativa (para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de DcR3 puede alterarse opcionalmente a través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido DcR3 en bases preseleccionadas, de manera que los codones que se generan se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otros medios para aumentar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido DcR3 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306 (1981).

La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el polipéptido DcR3 se puede realizar química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de grupos carbohidrato del polipéptido se puede conseguir mediante la utilización de un conjunto de endo- y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al. Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de DcR3 comprende la unión del polipéptido DcR3 a uno de un conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.

El DcR3 de la presente invención también se puede modificar de manera que forme una molécula quimérica que comprenda DcR3 fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión del DcR3 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo etiqueta se sitúa generalmente en el extremo terminal amino o carboxilo del DcR3. La presencia de dichas formas de epítopo etiquetadas del DcR3 se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la disposición del epítopo etiqueta permite que el DcR3 se purifique fácilmente mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une al epítopo etiqueta. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del DcR3 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. En particular, la molécula quimérica puede comprender una ECD de DcR3 que incluye los aminoácidos 1 a 215 de la figura 1 (SEC ID No. 1) fusionada a una molécula IgG. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser la región Fc de una molécula IgG.

En la técnica se conocen varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido-Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el péptido-etiqueta de la proteína T7 del gen 10 [Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].

C. Preparación de DcR3

La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de DcR3 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de DcR3. Naturalmente, se prevé que para preparar DcR3 se puedan utilizar procedimientos alternativos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de DcR3, o partes de la misma, se pueden producir mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewan et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del DcR3 de forma separada y se pueden combinar utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir DcR3 de longitud completa.

1. Aislamiento del ADN que codifica DcR3

El ADN que codifica DcR3 se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm de DcR3 y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de DcR3 humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica DcR3 también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos para DcR3 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica DcR3 es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los siguientes Ejemplos describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente inequívoca para que se minimicen los falsos positivos. El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en los bancos de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otras bases de datos de secuencias. La identidad en la secuencia (a nivel de aminoácidos o nucleótidos) en las regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede determinar a través de la alineación de secuencias utilizando programas de software informático, tales como ALIGN, DNAstar e INHERIT que utilizan varios algoritmos para medir la homología.

El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de forma inversa en el ADNc.

Las variantes de DcR3 se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de DcR3, respectivamente, o mediante la síntesis de los polipéptidos DcR3 deseados. Los expertos en la materia entenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales del DcR3, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclamiento a la membrana.

Las variaciones en el DcR3 de secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios del DcR3 descritos en la presente invención, se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una eliminación o una inserción de uno o más codones que codifican el DcR3 que dan lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del DcR3 en comparación con el DcR3 de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de la molécula de DcR3. Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de alanina, y mutágenesis por PCR. Para producir el ADN de la variante de DcR3 se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

El análisis de aminoácidos por rastreo también se puede utilizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está implicada en la interacción con un ligando o receptor concreto. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es el aminoácido de rastreo preferido entre este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina es también preferida ya que es el aminoácido más habitual. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isotérico.

Una vez se producen variantes de DcR3 seleccionadas, éstas pueden entrar en contacto con, por ejemplo, el ligando de Fas, y puede determinarse la interacción, si la hay. La interacción entre la variante de DcR3 y el ligando de Fas puede medirse mediante un ensayo in vitro, tal como el que se describe en los Ejemplos más adelante. Aunque puede usarse cualquier número de mediciones analíticas para comparar las actividades y las propiedades entre un DcR3 de secuencia nativa y una variante de DcR3, una medición adecuada para la unión es la constante de disociación K_{d} del complejo formado entre la variante de DcR3 y el ligando de Fas en comparación con la K_{d} del DcR3 de secuencia nativa.

Opcionalmente, los sitios representativos en la secuencia de DcR3 apropiados para la mutagénesis (como por ejemplo la supresión de uno o más aminoácidos) incluirían sitios dentro de uno o más dominios ricos en cisteína. Dichas variaciones pueden llevarse a cabo utilizando los procedimientos descritos anteriormente.

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción de DcR3 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por un técnico en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

Los procedimientos de transfección son conocidos por el técnico en la materia, por ejemplo, CaPO y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento de calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se utilizan generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras célula-pared sustanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transformaciones de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en la levadura se llevan a cabo habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, véase Keown et al., Methods in enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352 (1988).

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero so se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635).

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican DcR3. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente.

Las células huésped adecuadas para la expresión de DcR3 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insectos, tales como Droshophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO. Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se estima que está dentro de la técnica.

3. Selección y uso de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), que codifica DcR3 se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por un técnico en la materia.

El DcR3 se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específica en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de DcR3 que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de las secuencias líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa (incluyendo secuencias líderes de factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias líderes virales secretores.

Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levaduras, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.

Los vectores de clonación y expresión contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico de DcR3, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo natural es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de clonación y expresión contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de DcR3 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales son conocidos. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica DcR3.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73.657.

La transcripción de DcR3 desde vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente del Reino Unido 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Se puede incrementar la transcripción de un ADN que codifica el DcR3 por eucariotas superiores mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante de DcR3, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' respecto al promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica DcR3.

En Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de DcR3 en cultivos de células de vertebrados recombinantes.

4. Detección de la Amplificación/Expresión Génica

La amplificación y/o expresión de los genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluyendo cadenas dobles de ADN, cadenas dobles de ARN, cadenas dobles de híbridos de ADN-ARN o cadenas dobles de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la doble cadena está unida a una superficie, de manera que tras la formación de cadenas dobles en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos unidos a la cadena doble.

La expresión génica se puede medir, alternativamente, mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo de células o fluidos del organismo, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido DcR3 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de DcR3 y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación de polipéptido

Las formas de DcR3 se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisatos de células huésped. Si está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Tritón X-100) o mediante división enzimática. Las células utilizadas en la expresión de DcR3 se pueden romper mediante diversos medios físicos o químicos, tales como el ciclo congelación-descongelación, sonicación, destrucción mecánica, o agentes para lisar células.

Se puede desear purificar DcR3 a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del DcR3. Se pueden utilizar varios procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el DcR3 concreto producido.

D. Usos del DcR3

Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican DcR3 tienen diversas aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN anti-sentido. El ácido nucleico de DcR3 también será útil para la preparación de polipéptidos DcR3 mediante técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

El gen de DcR3 de secuencia nativa de longitud completa (Figura 2; SEC ID No:2), o partes del mismo, pueden utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de DcR3 de longitud completa o para aislar incluso otros genes (por ejemplo, aquellos que codifican variantes naturales de DcR3 o DcR3 de otras especies) que tienen una identidad en la secuencia deseada con la secuencia de DcR3 descrita en la Figura 2 (SEC ID No: 2). De modo opcional, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivar de la secuencia de nucleótidos de SEC ID No: 2 o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos potenciadores e intrones de DcR3 de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento de la región codificante del gen de DcR3 utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante una variedad de marcadores, incluyendo radionucleótidos como el ^{32}P o el ^{35}S, o marcadores enzimáticos como la fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de DcR3 de la presente invención pueden utilizarse para cribar bibliotecas de ADNc, ADN genómico o ARNm humanos para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los Ejemplos de más adelante.

Las ESTs descritas y reivindicadas en la presente solicitud pueden emplearse de modo similar como sondas, utilizando los procedimientos descritos en la presente invención.

Las sondas también se pueden utilizar en técnicas de PCR para generar un conjunto de secuencias para la identificación de secuencias de DcR3 estrechamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un DcR3 también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen que codifica ese DcR3 y para el análisis genético de individuos con enfermedades genéticas. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención pueden mapearse en un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de enlace contra marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de hibridación con bibliotecas. El ejemplo 12 de más adelante describe en detalle una técnica de mapeo cromosómico seleccionada e identifica que el gen de DcR3 se ha mapeado en el cromosoma 20 humano.

Tal y como se describe en la presente invención, el gen de DcR3 puede amplificarse en células y tejidos cancerosos. El ejemplo 13 de más adelante, por ejemplo, describe que se descubrió que el gen de DcR3 se amplifica en diferentes cánceres de colon y pulmón. Por consiguiente, las moléculas de la presente invención pueden utilizarse como diagnosis para detectar la presencia de cáncer o el riesgo de aparición de cáncer mediante el análisis de tejido por amplificación del gen de DcR3. La detección de la amplificación del gen DcR3 en los tejidos del paciente también puede emplearse por parte de médicos expertos en la selección de modalidades de tratamiento preferentes para el paciente, tales como la identificación de una modalidad de tratamiento de anticuerpo anti-DcR3 para el paciente. Dichos métodos o ensayos de diagnóstico se pueden realizar utilizando diversas técnicas, incluyendo las técnicas PCR o FISH conocidas en el sector. Los tejidos también pueden analizarse utilizando las técnicas descritas en el Ejemplo 13 para la determinación de la amplificación del gen de DcR3.

Cuando las secuencias codificantes de DcR3 codifican una proteína que se une a otra proteína (por ejemplo, cuando el DcR3 es un receptor), el DcR3 se puede utilizar en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, se pueden identificar los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones de unión también se pueden utilizar para cribar inhibidores o agonistas de péptidos o moléculas pequeñas de la interacción de unión. Además, el receptor DcR3 se puede utilizar para aislar el ligando o ligandos correlativos. Los ensayos de cribado se pueden diseñar para encontrar compuestos candidatos que imitan la actividad biológica de un DcR3 nativo o un receptor para DcR3. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de cribar con un alto rendimiento bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas como fármacos candidatos. Entre las pequeñas moléculas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican DcR3 o sus formas modificadas también se pueden utilizar para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o en un antecesor del animal en estado prenatal, por ejemplo, una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica DcR3 se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica DcR3 según las técnicas establecidas y las secuencias genómicas se pueden utilizar para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica DcR3. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, se marcarían células concretas para la incorporación del transgén de DcR3 con potenciadores específicos de tejido. Se pueden utilizar animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica DcR3 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria, para examinar el efecto de la expresión aumentada de ADN que codifica DcR3. Dichos animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos pensados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de la invención, el tratamiento de un animal con el reactivo y la reducción de la incidencia de la condición patológica, en comparación con animales no tratados que llevan el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial en la condición patológica.

Alternativamente, se pueden utilizar homólogos no humanos de DcR3 para construir un animal "knock out" con DcR3 que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica DcR3 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica DcR3 y el ADN genómico alterado que codifica DcR3 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica DcR3 se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica DcR3 según las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica DcR3 se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para controlar la integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5' y 3')
[véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea de células madres embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que seel ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADn endógeno [véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]. A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teralocarcinomas y Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas 113-152]. A continuación, un embrión quimérico se puede implantar en un animal criado hembra pseudopreñada adecuado y se produce un embrión para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales knock out se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido DcR3.

El DcR3, tal como se describe en la presente memoria, se puede utilizar terapéuticamente para regular la apoptosis por el ligando de Fas o por otro ligando al que se une DcR3 en células de mamífero, así como para modular otras funciones del ligando de Fas. Esta terapia se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando técnicas de terapia génica in vivo o ex vivo. El ácido nucleico que codifica DcR3 se puede utilizar en terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en células con el fin de conseguir una síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, la sustitución de un gen defectuoso. "Terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional donde se consigue un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos génicos, lo cual implica la administración de una vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los ARN y ADN antisentido se pueden utilizar como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Se ha observado anteriormente que se pueden importar oligonucleótidos antisentido cortos en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus concentraciones intracelulares bajas causadas por su captación limitada por la membrana celular. [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 4143-4146 (1986)]. Los oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación, por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen la utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas actuales de transferencia génica in vivo preferidas se incluyen la transfección con vectores virales (habitualmente retrovirales) y la transfección mediada por liposomas con proteínas de la cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que marca las células diana, tales como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie de la célula o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie de la célula asociada con endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclado, proteínas que dirigen la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe en, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica, véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

Se contempla que se pueden utilizar terapéuticamente como moléculas agonistas o antagonistas los polipéptidos DcR3 y formas modificadas de DcR3 (así como anticuerpos de DcR3, descritos a continuación). Por ejemplo, las moléculas de DcR3 que pueden actuar como antagonistas se pueden utilizar para inhibir o bloquear el ligando de Fas o la actividad inducida por el ligando de Fas o, alternativamente, la actividad de otro ligando al que se une DcR3. Entre los ejemplos de dichas formas de DcR3 se incluyen las moléculas quiméricas descritas anteriormente que comprenden una fusión del DcR3 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Esto incluye moléculas quiméricas que contienen una secuencia de dominio extracelular de DcR3 y una inmunoglobulina. Estas moléculas de DcR3, tal como se describen en la presente invención, pueden inhibir la actividad inducida por el ligando de Fas, tal como la apoptosis inducida por el ligando de Fas o la actividad de linfocitos inducida por el ligando de Fas, así como suprimir la proliferación de linfocitos en respuesta a una estimulación antigénica. En base a los datos del ensayo de reacción mixta linfocitaria descritos en los ejemplos, se cree que la respuesta inmune inducida no necesita ser exclusivamente mediada por el ligando de Fas.

Por lo tanto, esta inhibición o actividad antagonista tiene aplicaciones en enfermedades que están mediadas por el sistema inmune e implican, por lo menos como componente de su inducción y mecanismo, la activación de linfocitos T que posteriormente orquestan una serie de eventos intra e intercelulares que en estas enfermedades son perjudiciales para el mamífero. Entre dichas enfermedades mediadas por el sistema inmune que se cree que implican o dependen de la activación de linfocitos T se incluyen, pero no se limitan a, asma y otras enfermedades alérgicas incluyendo, por ejemplo, rinitis alérgica y enfermedades atópicas, artritis reumatoide y artritis juvenil crónica, psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino incluyendo la enfermedad de Crown y la colitis ulcerosa, enteropatía sensible al gluten, y la enfermedad de Whipple, esclerosis múltiple y otras enfermedades desmielinizantes del SNC mediadas por el sistema inmune, y enfermedades relacionadas con trasplantes incluyendo el rechazo de injerto y la enfermedad de injerto contra huésped.

Se cree que estas enfermedades están mediadas por el sistema inmune directamente como, por ejemplo, mediante un efecto de mejora demostrable de la terapia inmunosupresora en mamíferos, o indirectamente, como por ejemplo, mediante la manifestación de linfocitos T o B o autoanticuerpos en lesiones de pacientes con la enfermedad o a través de la deducción a partir de los datos obtenidos a través del uso experimental de modelos de animales de la enfermedad humana. [Véase, en general, Samter's Immunological Diseases, 5ª Ed., Volúmenes I y II, Little, Brown and company (1995)].

Los portadores y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Ed., 1980, Mack Publishing Co. Editado por Oslo et al. Habitualmente, se utiliza una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para conseguir una formulación isotónica. Entre los ejemplos de portador se incluyen tampones, tales como tampón salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,8. Entre portadores adicionales se incluyen preparados de liberación controlada, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para los expertos en la materia que ciertos portadores serán más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración de la molécula de DcR3 que se administra.

La administración a un mamífero se puede realizar mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular) o mediante otros procedimientos tales como la infusión que aseguran la liberación al torrente sanguíneo en una forma eficaz.

Las dosis eficaces y pautas de administración se pueden determinar empíricamente y la realización de dichas determinaciones está dentro de la técnica.

E. Anticuerpos anti-DcR3

La presente invención proporciona anticuerpos anti-DcR3. Entre los anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-DcR3 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido DcR3 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida para que sea inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes se pueden incluir el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización se puede seleccionar por un experto en la materia sin una gran experimentación.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti-DcR3 pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente inmunizante incluirá habitualmente el polipéptido DcR3 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PLBs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o se utilizan células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), las cuales evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, soportan un nivel de expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas, 51-63].

A continuación, se puede analizar el medio de cultivo en el que las células de hibridoma se cultivan por la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el DcR3. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en el sector. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente U.S. No. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención se puede aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas [Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se puede sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

Tal como se describe en los ejemplos siguientes, se han preparado anticuerpos monoclonales anti-DcR3. Varios de estos anticuerpos, a los que se hace referencia como 4C4.1.4; 5C4.14.7; 11C5.2.8; 8D3.1.5; y 4B7.1.1 se han depositado con la ATCC y se les ha designado el número de acceso de depósito HB-12573, HB-12574, HB-12572, HB-12571 y HB-12575, respectivamente. En una realización, los anticuerpos monoclonales de la presente invención tendrán las mismas características biológicas que uno o más de los anticuerpos secretados por las líneas celulares de hibridoma depositadas bajo los números de acceso HB-12573, HB-12574, HB-12572, HB-12571 o HB-12575.

El término "características biológicas" se utiliza para referirse a las actividades o propiedades in vitro o in vivo de los anticuerpos monoclonales, tales como la capacidad de unirse a DcR3 o de bloquear sustancialmente la unión ligando de Fas/DcR3. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal se unirá al mismo epítopo que al menos uno de los anticuerpos descritos específicamente anteriormente. Dicha unión a epítopo se puede determinar mediante la realización de varios ensayos, como los descritos en la presente invención y en los ejemplos.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias conocidas en la técnica.

3. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos de DcR3 de la presente invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o la estructura importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos se indican frecuentemente como residuos "importados", que se adquieren habitualmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en el sector, incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol., 147(1): 86-95 (1991)].

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el DcR3, el otro es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie celular.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210 (1986).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP 03089]. Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 9.676.980.

F. Usos de los anticuerpos de DcR3

Los anticuerpos de DcR3 de la presente invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos de DcR3 se pueden utilizar en ensayos de diagnóstico para DcR3, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos, suero o tumores. Se pueden utilizar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el sector, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC PRess, Inc. (1987) páginas 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico se pueden marcar con un grupo detectable. El grupo detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al grupo detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982).

Los anticuerpos de DcR3 también son útiles para la purificación por afinidad de DcR3 a partir de un cultivo de células recombinantes o de origen natural. En este proceso, los anticuerpos contra DcR3 se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el DcR3 a purificar, y posteriormente se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra a excepción del DcR3, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el DcR3 del anticuerpo.

Los anticuerpos de DcR3 de la presente invención también tienen utilidad terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos de DcR3 se pueden utilizar para antagonizar la actividad de DcR3 que bloquea la apoptosis inducida por el ligando de Fas o que bloquea los potenciales efectos autoinmunes/autoinflamatorios. Los antagonistas de DcR3 pueden actuar en la terapia contra el cáncer mediante, por ejemplo, evitando que DcR3 inhiba la muerte inmunocitotóxica de células cancerígenas. Eso se puede realizar, por ejemplo, bloqueando la unión de ligando de Fas-DcR3 o aumentando o potenciando la depuración o eliminación de DcR3. Los expertos en la materia entenderán que existen moléculas que pueden suprimir la activación o estimulación de una respuesta inmune y, de este modo, que tienen la capacidad de provocar un cierto nivel de inmunosupresión y así tener la capacidad de ayudar a las células cancerígenas en la evasión del sistema y respuesta de vigilancia inmune del mamífero. Un ejemplo de un inhibidor natural del sistema inmune es CTLA4 que puede inhibir la activación de linfocitos T mediante la inhibición de un mecanismo de coestimulación de linfocitos T. Se ha observado que el antagonismo de esta inhibición in vivo potencia la capacidad del mamífero para rechazar inmunológicamente el cáncer. Se ha descrito que bloqueando CTLA4 con un anticuerpo in vivo se producía un aumento de la respuesta inmune a un cáncer establecido y se causaba el posterior rechazo a este cáncer. [Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 8099-81033 (1997); Leach et al., Science, 271: 1734-1736 (1996)].

Se pueden utilizar composiciones terapéuticas y modos de administración (tales como los descritos anteriormente para DcR3). Las dosis eficaces y las pautas de administración del antagonista se pueden determinar empíricamente y la realización de estas determinaciones está dentro de la técnica. Los expertos en la materia entenderán que la dosificación del antagonista que se debe administrar dependerá, por ejemplo, del mamífero que recibirá el antagonista, la vía de administración, el tipo concreto de antagonista utilizado y otros fármacos que se administran al mamífero. En la bibliografía se puede encontrar una guía para la selección de las dosis apropiadas de antagonistas de anticuerpos en el uso terapéutico de anticuerpos, por ejemplo Handbook of Monoclonal ANtibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985), capítulo 22 y pág. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, Nueva York (1977) páginas 365-389. Una dosis diaria habitual del antagonista utilizado solo podría variar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

En los procedimientos de tratamiento del cáncer que utilizan los antagonistas de DcR3 descritos en la presente invención, se considera que se pueden administrar otras terapias adicionales al mamífero, y éstas incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia y radioterapia, inmunoadyuvantes, citoquinas y terapias basadas en anticuerpos. Entre los ejemplos de interleuquinas se incluyen (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6), factores inhibidores de la leucemia, interferones, TGF-beta, eritropoyetina, trombopoyetina, anticuerpo HER-2 y anticuerpo anti-CD20. También se pueden utilizar otros agentes conocidos para inducir la apoptosis en células de mamífero y dichos agentes incluyen TNF-\alpha, TNF-\beta (linfotoxina-\alpha), ligando CD30 y ligando 4-1BB.

Las quimioterapias consideradas por la presente invención incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente, tales como Doxorubicina, 5-Fluoroacilo, la citosina arabinósido ("Ara-C"), la ciclofosfamida, el tiotepa, el busulfán, el citoxín, el taxol, el metotrexato, el cisplatino, el melfalan, la vinblastina, y el carboplatino. La preparación y pautas de dosificación para dicha quimioterapia se pueden utilizar según las instrucciones del fabricante o tal como se determina empíricamente por el técnico en la materia. La preparación y pautas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). La quimioterapia se administra preferiblemente en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como los descritos anteriormente. El antagonista se puede administrar de forma secuencial o conjuntamente con uno o más agentes terapéuticos. Las cantidades de antagonista y agente terapéutico dependen, por ejemplo, de qué tipo de fármacos se utilizan, el cáncer en tratamiento y las pautas y vías de administración, pero generalmente serán inferiores que si se utilizan cada uno de manera individual.

Tras la administración de antagonista al mamífero, se puede controlar el cáncer del mamífero y la condición fisiológica de diversas maneras conocidas por el técnico en la materia. Por ejemplo, se puede observar la masa tumoral físicamente o mediante técnicas de imagen por rayos X estándar.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo contrario. El origen de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de acceso de la ATCC pertenece a la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc que codifican DcR3 humano

Se utilizaron secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia de la señal de secreción, si existe) de aproximadamente 950 proteínas conocidas secretadas de la base de datos de proteínas pública Swiss-Prot para buscar bases de datos de etiquetas de secuencias expresadas (EST). Las bases de datos de EST incluían bases de datos públicas de EST (por ejemplo, GenBank) y una base de datos de EST privada (LIFESEQ*, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) y ESTs propiedad de Genentech. La búsqueda se realizó utilizando el programa informático BLAST o BLAST-2 [Altshul et al. Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)] como comparación de las secuencias de proteínas de ECD con una traducción de 6 marcos de las secuencias de EST. Aquellas comparaciones que daban lugar a un resultado BLAST de 70 (o en algunos casos de 90) o superior que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en las secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, Universidad de Washington, Seattle, Washington).

Utilizando varias ESTs se ensambló una secuencia de ADN de consenso. Las ESTs incluían una EST propiedad de Genentech (Sec ID No. 3; véase las figuras 3 y 4), seis ESTs de la base de datos privada (SEC ID No. 4; SEC ID No. 5; SEC ID No. 6; SEC ID No. 7; SEC ID No. 8; SEC ID No. 9; véase la figura 4) y una EST de la base de datos pública (SEC ID No. 10).

En base a la secuencia de consenso, se sintetizaron oligonucleótidos para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contuviera la secuencia de interés y para utilizar como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para DcR3.

Se sintetizó una pareja de cebadores del PCR (directos e inversos):

CACGCTGGTTTCTGCTTGGAG	(SEC. ID. No: 11)
AGCTGGTGCACAGGGTGTCATG	(SEC. ID. No: 12)

También se sintetizó un cebador:

CCCAGGCACCTTCTCAGCCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCC

(SEC ID No. 13)

Con el fin de cribar diversas bibliotecas para un origen de clon de longitud completa, se cribó ADN de las bibliotecas mediante amplificación con la pareja de cebadotes de PCR identificada anteriormente. A continuación, se utilizó una biblioteca positiva para aislar clones que codificaban el gen de DcR3 utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los cebadores de PCR.

El ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc se aisló de tejido de pulmón fetal. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles, tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT que contenía un sitio NotI, unido por extremo romo a adaptadores con hemoquinasa Sall, se dividieron con NotI, se separaron por tamaño de manera adecuada mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; véase Holmes et al., Science 253: 1278-1280 (1991)) en los sitios únicos XhoI y NotI.

La secuenciación del ADN de los clones aislados tal y como se ha descrito anteriormente produjo la secuencia de ADN de longitud completa para DcR3 (figura 2; SEC ID No. 2) y la secuencia de proteína derivada para DcR3 (figura 1; SEC ID No: 1).

La secuencia de nucleótidos completa de DcR3 se muestra en la figura 2 (SEC. ID. No: 2). El clon DNA30942 contiene un único marco de lectura abierto con un sitio de iniciación de traducción claro en las posiciones de nucleótidos 101-103 [Kozak et al., supra] (figura 2; SEC ID No. 2). El precursor del polipéptido estimado tiene 300 aminoácidos de longitud. El extremo N terminal de la secuencia contiene una señal de secreción típica (aminoácidos 1-23 de la figura 1; SEC ID No. 1). El análisis de la secuencia de aminoácidos de DcR3 reveló la presencia de cuatro CRDs, tal como se muestra en las figuras 5 y 6. Se cree que el DcR3 carece de un dominio transmembrana. También se cree que los aminoácidos 1 a 215 de la figura 1 (SEC ID No. 1) representa un ECD que incluye cuatro CRDs (figura 5). El DcR3 tiene un potencial sitio de glicosilación unido a N en el residuo 173 de la figura 1. El clon DNA 30942 se ha depositado con la ATCC (identificado como DNA30942-1134) y se le asignó el depósito de ATCC no. 209254.

En base al análisis de alineación de secuencias BLAST y FastA de la secuencia de longitud completa, el DcR3 muestra alguna identidad en la secuencia de aminoácidos con TNFR2 (28,7%) y OPG (31%). Véase las figuras 5 y 6. Todas las cisteínas de las cuatro CRDs de DcR3 y OPG se conservan; sin embargo, la parte C-terminal de DcR3 es aproximadamente 100 residuos más corta.

Ejemplo 2 Análisis de transferencia Northern

Se examinó la expresión de ARNm de DcR3 en tejidos humanos y líneas de células cancerígenas humanas mediante análisis de transferencia Northern. Los "blots" de ARN humano se hibridaron a una sonda de ADN marcado con ^{32}P basado en el ADNc de DcR3 de longitud completa. Se incubaron "blot" de ARN fetal MTN (Clontech), "blot" de ARN adulto humano MTN-II (Clontech) y "blots" de líneas de células cancerígenas humanas (Clontech) con las sondas de ADN. A continuación, los "blots" se incubaron con las sondas en tampón de hibridación (5X SSPE; 2X solución de Denhardt; 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado fragmentado; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 60 horas a 42ºC. Los "blots" se lavaron varias veces en 2X SSc; SDS al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 30 minutos en 0,1 x SSC; SDS al 0,1% a 50ºC. Los "blots" se reevlaron después de una exposición durante toda la noche mediante análisis con "phosphorimager" (Fuji).

Se detectó un transcrito predominante de DcR3 de aproximadamente 1,2 kB en pulmón, cerebro e hígado fetal y en bazo, colon y pulmón adulto (figura 7). Además, se detectó un nivel de ARNm de DcR3 relativamente elevado en la línea celular de carcinoma de colon humano, SW480 (véase la figura 7).

Ejemplo 3 Utilización de DcR3 como sonda de hibridación

El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica una DcR3 como sonda de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia que codifica DcR3 (tal y como se muestra en la figura 2, SEC ID No: 2) se utiliza como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes naturales de DcR3) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y el lavado de filtros que contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las siguientes condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la sonda radiomarcada derivada de DcR3 a los filtros se realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

A continuación, se pueden identificar los ADNs que tienen una identidad secuencial deseada con el ADN que codifica una DcR3 de secuencia nativa de longitud completa utilizando las técnicas estándar conocidas en la técnica.

Ejemplo 4 Expresión de DcR3 en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de DcR3 mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica DcR3 (SEC ID No. 2) se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para las enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase Bolivar et.al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y se desfosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia poli-His líder (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poli-His, y sitio de división para la enteroquinasa), la región que codifica DcR3, el finalizador transcripcional lambda, y un gen argU.

A continuación, la mezcla de unión se utiliza para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et. al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido se puede aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciación del ADN.

Los clones seleccionados se pueden desarrollar durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la expresión se activa.

Después de cultivar las células durante muchas más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El residuo celular obtenido mediante la centrifugación se puede solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y la proteína DcR3 solubilizada se puede purificar a continuación utilizando una columna quelante de metal en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.

Ejemplo 5 Expresión de DcR3 en células de mamíferos

Este ejemplo ilustra la preparación de DcR3 mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.

A. El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de DcR3 se une a pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de DcR3 utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en Sambrook et. al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-DcR3.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan para unirse en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-DcR3 con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen del ARN de VA [Thimmappaya et. al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl_{2}. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml ^{35}S- metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de giro y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para revelar la presencia del polipéptido DcR3. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.

En una técnica alternativa, se puede introducir DcR3 en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 1575 (1981). Las células 293 se desarrollan hasta una máxima densidad en un matraz giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-DcR3. En primer lugar, las células se concentran del matraz giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el residuo de células durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el matraz giratorio que contiene el medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los debris. La muestra que contiene el DcR3 expresado se puede concentrar a continuación y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.

B. En otra realización, el DcR3 etiquetado con epítopo se expresó en células CHO. El DcR3 se subclonó fuera del vector pRK5. A continuación, la inserción del subclon experimenta una PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta de poli-His en un vector de expresión de Baculovirus. La inserción de DcR3 etiquetado con poli-His se subclonó a continuación en un vector conductor SV40 que contenía un marcador de selección DHFR para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO se transfectaron (tal y como se ha descrito anteriormente) con el vector conductor SV40. El medio de cultivo que contenía el DcR3 etiquetado con poli-His expresado se concentró y purificó mediante cromatografía de afinidad de quelante-Ni^{2+}. El análisis de la proteína purificada mediante SDS-PAGE reveló que la proteína DcR3 secretada tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kDa.

Ejemplo 6 Expresión de DcR3 en levadura

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de DcR3 en levadura.

En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de DcR3 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica DcR3, un péptido señal seleccionado y el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de DcR3. Para la secreción, el ADN que codifica DcR3 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder secretora del factor alfa de la levadura, y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de DcR3.

Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y una separación mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con azul de Coomassie.

El DcR3 recombinante puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y, a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que contiene DcR3 puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en columna concretas.

Ejemplo 7 Expresión de DcR3 en Baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de DcR3 en Baculovirus.

La DcR3 se fusiona en dirección 5' a una etiqueta epítopo contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas etiquetas epítopo incluyen etiquetas de poli-His y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, el DcR3 o la parte deseada del DcR3 (tal como la secuencia que codifica un dominio extracelular, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 215 de la figura 1 (SEC ID No. 1)) se amplifican mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a continuación con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y como se describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

A continuación, el DcR3 etiquetado con poli-His expresada puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a continuación. Los extractos se preparan a partir de las células Sf9 recombinantes infectadas del virus tal y como se ha descrito por Rupert et. al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato: 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de alcanzar la línea base a A_{280} de nuevo, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen DcR3 etiquetada con His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.

Alternativamente, la purificación del DcR3 etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.

Ejemplo 8 Preparación de anticuerpos que se unen a DcR3

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a DcR3.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunogenes que se pueden utilizar se incluyen DcR3 purificado, proteínas de fusión que contienen DcR3, y células que expresan DcR3 recombinante en la superficie celular. La selección del inmunogén puede realizarse por el técnico en la materia sin una gran experimentación.

Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunogén de DcR3 emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogén se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se estimulan 10 a 12 días después con inmunogén adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante varias semanas, los ratones también se pueden estimular con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos de DcR3.

Después de detectar un título de anticuerpo adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de DcR3. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionado, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridomas se cribarán en un ELISA por la reactividad contra DcR3. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra DcR3 está dentro de la técnica.

Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para producir ascitis que contiene los anticuerpos monoclonales anti-DcR3. Alternativamente, las células de hibridoma pueden desarrollarse en matraces o botellas en rodillo de cultivos de tejidos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis se puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede usar la cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.

Ensayos in Vitro para determinar la interacción de DcR3 con el ligando de Fas A. Análisis FACS

Se realizó un ensayo para determinar si el DcR3 se unía a células 293 transfectadas transitoriamente con ligandos individuales de la familia de TNF. Las células 293 humanas (ATCC CRL 1573) se transfectaron transitoriamente con vector pRK5 vacío (véase el ejemplo 5) o pRK5 que codifica TNF-alfa de longitud completa [Penninca et al., Nature, 312: 724-729 (1984)], ligando Fas [Suda et al, Cell, 75: 1169-1178 (1993)], LIGHT [Mauri et al., Immunity, 8:21 (1998)], ligando Apo-2 [(WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997)], ligando Apo-3 (también referido como TWEAK) [Marsters et al., Current biology, 8: 525 (1998); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272: 32401 (1997)] o OPG (también referido como TRANCE, RANKL) [Wong et al., J. Biol. Chem., 272: 25190 (1997); Anderson et al., Nature, 390: 175 (1997); Lacey et al., Cell, 93: 165 (1998)]. A continuación, las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC con un DcR3 etiquetado con Fc recombinante biotinilado (expresado tal como se describe en el ejemplo 7 anterior y purificado mediante cromatografía de Proteína A [Ashkenazi et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 8. 104 (1995)], un ectodominio etiquetado con Fc de TNFR1 (control) o tampón PBS (control). Las células se incubaron adicionalmente durante 30 minutos a 37ºC con estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Gibco BRL) y a continuación se analizaron mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS).

Los resultados mostraron que el DcR3 se unía específicamente a células transfectadas con ligando de Fas, pero no a células transfectadas con TNF-alfa (véase la figura 8A). El DcR3 también mostró una unión significativa con LIGHT, pero no se unía a ligando Apo-2, ligando Apo-3 u OPG (datos no mostrados).

B. Ensayo de coinmunoprecipitación

También se realizó un ensayo de coinmunoprecipitación para determinar si el DcR3 se une a un ligando de Fas soluble.

Se incubó ligando de Fas soluble purificado (Alexis Biochemicals) (1 microgramo) durante 1 hora a temperatura ambiente con el DcR3 etiquetado con Fc (descrito anteriormente), TNFR1 o ectodominio Fas (5 microgramos), y se inmunoprecipitó con proteína A-sefarosa (Repligen). Los precipitados se redisolvieron mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida (gradiente 4-20%) en condiciones reductoras (25 mM de ditiotreitol) y se visualizaron mediante inmunotransferencia, seguido de detección por quimioluminiscencia mejorada (Amersham) con anticuerpo policlonal de conejo anti-ligando de Fas (Oncogene Research Products) a 2 microgramos/ml. El propio ligando de Fas soluble también se cargó directamente para comparación.

Los resultados se muestran en la figura 8B. El DcR3 etiquetado con Fc se unió al ligando de Fas soluble purificado, tal como hico Fas etiquetado con Fc, pero no TNFR1. Los resultados sugieren que DcR3 es otro miembro de la familia de TNFR (además de Fas) que se pueden unir al ligando de Fas.

Ejemplo 10 Ensayos in Vitro para determinar la capacidad de DcR3 de inhibir la actividad de ligando de Fas A. Inhibición de la inducción de apoptosis por ligando de Fas transfectado

Se examinó el efecto de DcR3 sobre la inducción de la apoptosis mediante la transfección transitoria de ligando de Fas de longitud completa en células HeLa que expresan Fas.

Se transfectaron transitoriamente células HeLa S3 humanas (ATCC CCL 22) con pRK5 (véase el Ejemplo 5) pRK5 que codifica ligando de Fas de longitud completa [Suda et al., supra] (1 microgramo/10^{6} células). Las células transfectadas se incubaron a 37ºC/5% de CO_{2} en presencia de tampón PBS, TNFR1 etiquetado con Fc, Fas etiquetado con Fc o DcR3 etiquetado con Fc (véase el ejemplo 9) (50 microgramos/ml) durante 18 horas. A continuación, se analizó la apoptosis mediante FACS para la determinación de la unión de anexina, tal como se ha descrito previamente por Marsters et al., Curr. Biol., 6: 1669-1676 (1996).

Los resultados se muestran en la figura 9A. Los datos representan las medias + SEM de los triplicados. El ligando de FAs indujo apoptosis en aproximadamente el 25% de las células HeLa. El Fas etiquetado con Fc o el DcR3 etiquetado con Fc inhibieron este efecto de forma significativa, mientras que TNFR1 etiquetado con Fc no lo hizo.

B. Inhibición de AICD de células T

Se realizó un ensayo para determinar el efecto de DcR3 sobre AICD de células T, lo que implica la función de ligando de Fas endógeno (véase Nagata, supra).

Se aislaron linfocitos CD3+ de sangre periférica de donantes humanos individuales, se estimularon con fitohemaglutinina (2 microgramos/ml) durante 24 horas y se cultivaron en presencia de IL-2 (100 U/ml) durante 5 días (tal como se ha descrito previamente por Marsters et al., Curr. Biol., supra (1996)). A continuación, las células se pusieron en placas con pocillos recubiertos de tampón PBS o anticuerpo anti-CD3 (Ortho Pharmaceuticals) y se incubaron en presencia de tampón PBS, IgG de control, Fas etiquetado con Fc o DcR3 etiquetado con Fc (10 microgramos/ml) a 37ºC/2% de CO_{2}. Después de 18 horas, se determinó la apoptosis de células CD4+ mediante FACS tal como se ha descrito en la sección A anterior.

Los resultados se muestran en la figura 9B. Los datos representan las medias \pm SEM de los resultados para 5 donantes. La unión de TCR con el anticuerpo anti-CD3 aumentó el nivel de apoptosis en células T CD4+ estimuladas con IL-2 en aproximadamente 2 veces. Véase la figura 9B. En consistencia con los informes anteriores [Dhein et al., Nature, 373: 438 (1995)], Fas etiquetado con Fc bloqueaba este efecto de manera sustancial, mientras que el DcR3 etiquetado con Fc bloqueaba la inducción de apoptosis en una extensión similar.

C. Inhibición de la muerte de células Jurkat por células NK

Se realizó un ensayo para determinar el efecto de DcR3 sobre la muerte de células diana que expresan Fas por células NK de sangre periférica, un proceso que implica la función de ligando de Fas [Arase et al., J. Exp. Med., 181: 1235 (1995); Medvedev et al., Cytokine, 9: 399 (1997)].

Se prepararon células NK de sangre periférica de donantes individuales mediante el enriquecimiento con microgránulos magnéticos anti-Cd56 (Myltenyi Biotech) y se incubaron en medio RPMI 1640/FBS al 10% a 37ºC/5% de CO_{2} durante 24 horas con células T Jurkat de leucemia cargadas con ^{51}Cr en una relación de efector con respecto a la diana de 1:1 y 1:5 en presencia de tampón PBS, IgG de control o Fas etiquetado con Fc o DcR3 etiquetado con Fc (10 microgramos/ml). Se determinó entonces el nivel de muerte celular de las dianas mediante la medición de la liberación de ^{51}Cr en los cocultivos efector-diana en relación con la liberación de ^{51}Cr mediante lisis con detergente de números equivalentes de células Jurkat.

Los resultados se muestran en la figura 9C. Los datos representan las medias \pm SD para 2 donantes, cada uno examinado por triplicado. Las células NK desencadenaron una muerte celular significativa en las células T Jurkat. Fas y Dc3R etiquetados con Fc inhibieron la muerte de células diana de forma sustancial, mientras que la IgG de control no lo hizo. Los resultados indican que la unión de DcR3 inhibe la actividad del ligando de Fas.

Ejemplo 12 Mapeo cromosómico

La localización cromosómica del gen de DcR3 humano se examinó mediante un análisis de paneles de híbridos de radiación (RH). El mapeo RH se realizó mediante PCR utilizando un panel de híbridos de radiación de células de humano-ratón (Research Genetics) y cebadores basados en la región que codifica el ADNc de DcR3 [Gelb et al., Hum. Genet., 98: 141 (1996)]. El análisis de los datos de la PCR utilizando el Stanford Human Genome Center Database indica que el DcR3 se une al marcador AFM218xe7, con LOD de 5,4 y que se observa en la banda distal del brazo largo del cromosoma 20 (20q13).

Ejemplo 13 Ensayo de amplificación génica

Este ejemplo muestra que el gen que codifica DcR3 se amplifica en el genoma de cánceres de pulmón y colon. La amplificación se asocia con la sobreexpresión del producto génico, lo que indica que el polipéptido DcR3 es una diana útil para la intervención terapéutica en algunos cánceres. Dichos agentes terapéuticos pueden tomar la forma de antagonistas de genes que codifican DcR3, por ejemplo, anticuerpos quiméricos murinos-humanos, humanizados o humanos contra DcR3.

El material de partida para el cribado fue el ADN genómico aislado (utilizando reactivos Qiagen) a partir de tejido de tumor primario de cánceres de pulmón y colon y líneas de células tumorales. El ADN se cuantificó de forma fluorimétricamente utilizando un fluorímetro de intercalación de colorante Hoechst 33258. Como control de normalización, se aisló ADN de los leucocitos de sangre periférica de 10 individuos sanos normales que se agruparon y utilizaron como controles del ensayo para la copia génica en individuos sanos ("NorHu").

El ensayo de la nucleasa 5' (TaqMan^{TM}) y la PCR cuantitativa a tiempo real (Gelmini et al., Clin. Chem., 43: 752-758 (1997); ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^{TM}, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) se utilizaron para determinar el número de copias relativo del gen de DcR3 en cada uno y si el ADN que codifica DcR3 está sobrerrepresentado en cualquiera de los cánceres de pulmón y colon que se cribaron. Las muestras quirúrgicas del tumor primario de pulmón fueron proporcionadas por la Universidad de Iowa y las muestras de tumor primario de colon fueron proporcionadas por la Universidad de Leeds. El panel de tejidos de tumor de pulmón incluía 8 adenocarcinomas, 7 carcinomas de células escamosas, 1 carcinoma de célula no pequeña, 1 carcinoma de célula pequeña y 1 adenocarcinoma bronquial. El panel de tejidos de tumor de colon incluía 17 adenocarcinomas. Las líneas celulares cancerígenas se obtuvieron de ATCC: adenocarcinoma de colon SW480 (ATCC CCL 228); adenocarcinoma COLO320DM (ATCC CCL 220); adenocarcinoma SK-CQ-1 (ATCC HTB 39); adenocarcinoma SW403 (ATCC CCL 230); y adenocarcinoma de colon HT29.

Los resultados se expresan como números de copias de genes relativo en unidades delta Ct. Una unidad delta Ct corresponde a 1 ciclo de PCR o a aproximadamente a una amplificación de 2 veces respecto a la normal; dos unidades corresponden a 4 veces; 3 unidades a una amplificación de 6 veces, etc. La cuantificación se obtuvo utilizando cebadores y una sonda fluorescente TaqMan^{TM} derivada del gen que codifica el DcR3. Las regiones de DcR3 que seguramente contienen secuencias de ácido nucleico único y que son las menos probables de tener intrones ayustados son las preferidas para la derivación del cebador, por ejemplo, la región 3' no traducida. Las secuencias para los cebadores y las sondas utilizadas para la amplificación del gen de DcR3 fueron las siguientes:

hu.DcR3.TMP (sonda)	ACACGATGCGTGCTCCAAGCAGAA	(SEC ID NO: 14)
hu.DcR3.TMF (cebador directo)	CTTCTTCGCGCACGCTG	(SEC ID NO: 15)
HU.dCr3.tmr (cebador inverso)	ATCACGCCGGCACCAG	(SEC ID NO: 16)

La reacción del ensayo de la 5'nucleasa es una técnica basada en la PCR fluorescente que utiliza la actividad 5'-exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para controlar la amplificación a tiempo real. Se utilizan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar una secuencia nucleotídica localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extensible por la enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con colorante fluorescente reportero y un colorante fluorescente inhibidor. Cualquier emisión inducida por láser del colorante reportero es inhibido por el colorante inhibidor cuando los dos colorantes se localizan muy próximos como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa corta la sonda de forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante reportero de liberación se libera del efecto inhibidor del segundo fluoróforo. Una molécula del colorante reportero se libera de cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reportero no inhibido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los resultados.

El procedimiento de la 5'nucleasa se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real como el de ABI Prizm 7700^{TM} Sequence Detection System. El sistema consiste en un termociclador, un láser, una cámara de dispositivo acoplado a la carga (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por el láser se recoge a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos, y se detecta en la CCD. El sistema incluye el programa para poner en marcha el instrumento y para analizar los resultados.

Los resultados del ensayo de 5' nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el umbral del ciclo. Esto se define como el ciclo en el que se acumula la señal del reportero sobre el nivel de fondo de la fluorescencia. Los valores de Ct se utilizan como una medición cuantitativa del número relativo de copias iniciales de una secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico.

Los resultados se muestran en la figura 10. Ocho de los 18 tumores de pulmón y 9 de los 17 tumores de colon mostraron una amplificación genómica de DcR3 que variaba de 2 a 18 veces (ver la figura 10). Para verificar el resultado, se analizaron los ADN de tumor de colon mediante PCR cuantitativa con 3 grupos independientes adicionales de cebadores y sondas basados en DcR3. Esencialmente se observó la misma amplificación (datos no mostrados).

El análisis de amplificación génica de las líneas de células tumorales de colon humano revelaron que 3 de 5 líneas celulares mostraron una amplificación genómica significante de DcR3 (figura 10), consistente con la amplificación de DcR3 en los tejidos de tumor primario.

También se analizó el nivel de amplificación de las regiones flanqueantes de DcR3. Se aisló un clon genómico humano que porta DcR3 de una biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) (Genome Systems). Se determinó la amplificación de las regiones flanqueantes de BAC (68374inv y 68374dir) junto con el nivel de amplificación de dos marcadores genómicos disponibles más próximos, AFM218xe7 (T160) y SHGC-36269/T159) (que mapea aproximadamente 500 kb de AFM218xe7) en el panel de tumor de colon.

DcR3 mostró la mayor amplificación, seguido de 68374inv, a continuación 68374dir y T160, que mostraron el mismo grado de amplificación, mientras que T159 no mostró amplificación (figura 10). Los resultados sugieren que el DcR3 puede ser el epicentro de una región del cromosoma 20 que se amplifica en el cáncer, consistente con la posibilidad de que DcR3 puede provocar la supervivencia al tumor.

Ejemplo 14 Ensayo de Reacción mixta linfocitaria (MLR) para determinar la actividad de inhibición por DcR3

Los ensayos MLR se realizaron para evaluar la función de linfocito T CD4+ analizando la capacidad de los linfocitos T de proliferar en la respuesta a la presentación de aloantígeno. En el ensayo de MLR de "una vía", la población donante de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se estimula con una población estimuladora irradiada de PBMCs. Los protocolos de MLR se describen en Coligan et al., Current Protocols in Immunology, publ. John Wiley & Sons, Inc. (1994). A continuación, los resultados de los ensayos identifican las moléculas que pueden aumentar o inhibir la proliferación de los linfocitos T de respuesta en respuesta a la estimulación con el aloantígeno presentado.

A. Ensayo MLR de PBMCs humanas

Se aislaron PBMCs de dos donantes humanos utilizando procedimientos de leucoforesis estándar. Se utiliza un donante para suministrar las PBMCs estimuladoras y las células del otro donante se utilizan para suministrar las PBMCs de respuesta. A continuación, los respectivos preparados celulares se congelan en suero bovino fetal al 50% y DMSO al 50% hasta realizar el ensayo.

A continuación, las células se descongelaron toda la noche en un medio de ensayo a 37ºC/5% de CO_{2}. El medio de ensayo contenía medio RPMI; suero bovino fetal al 10%; penicilina/estreptomicina al 1%; glutamina al 1%; HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% y piruvato al 1%. Después del lavado, las células se resuspendieron en medio de ensayo hasta una concentración de 3 x 10^{6} células/ml. Las células donantes utilizadas como células estimuladoras se irradiaron utilizando aproximadamente 3000 Rads.

Las células PBMC se pusieron en placas de cultivo (por triplicado) tal como se indica: 100 microlitros de muestra de prueba (DcR3 etiquetado con Fc, descrito en el ejemplo 9 anterior, utilizado a las concentraciones de 2, 40, 1000 y 25.000 ng/ml determinadas mediante D.O.) diluidos al 1% o al 0,1%; 50 microlitros de células estimuladoras irradiadas; 50 microlitros de células PBMC de respuesta. Como control se utilizaron 100 microlitros de medio de cultivo celular o 100 microlitros de CD4-IgG. A continuación, se incubaron las placas de cultivo a 37ºC/5% de CO_{2} durante 4 días. En el día 5, se pulsó cada pocillo con timidina tritiada (1 micro-Curie/pocillo; Amersham). Después de 6 horas, se lavaron las células 3 veces y se evaluó mediante recuento por centelleo la captación de marcador.

Los resultados se muestran en la figura 11A. Los datos de la figura 11A muestran que existe un efecto inhibidor dependiente de la dosis de DcR3-IgG en la respuesta de los linfocitos T en la MLR humana. A medida que se aumentaba el nivel de DcR3-IgG desde 2 ng/ml a 25.000 ng/ml en el medio de reacción, hubo una reducción significativa en la proliferación de linfocitos T tal como se muestra mediante una reducción en la captación del marcador de timidina tritiada cuando se añadió DcR3-IgG en 40 ó 1000 ó 25.000 ng/ml. Esta inhibición de la MLR era dependiente de la dosis y fue significativa en comparación con un control positivo y con el efecto de una proteína de fusión IgG de control (Cd4-IgG) que no presentó efecto en la MLR.

B. Ensayo de MLR de PBMCs murinas

Se aislaron PBMCs de los bazos de dos cepas diferentes de ratones, Balb/c y C57B6. Las células se extrajeron de bazos recogidos recientemente y se colocaron en un medio de ensayo (tal como se describe en la Sección A anterior). A continuación, se aislaron las PBMCs mediante el recubrimiento de las células con Lympholyte M^{TM} (Organon Teknika) y la centrifugación a 2000 rpm durante 20 minutos. Se recogió la capa de células mononucleares y se lavó en un medio de ensayo y se resuspendió en un medio de ensayo hasta una concentración de 1 x 10^{7} células/ml. Se utilizó un donante para suministrar PBMCs estimuladoras y las otras células del donante se utilizaron para suministrar las PBMCs de respuesta.

Las células donantes utilizadas como células estimuladoras se irradiaron utilizando aproximadamente 3000 Rads. Las células PBMC se pusieron en placas de cultivo (por triplicado) tal como se indica: 100 microlitros de muestra de prueba (DcR3 etiquetado con Fc, utilizado a las concentraciones de 25, 250, 2500 y 25.000 ng/ml determinadas mediante D.O.) diluidos al 1% o al 0,1%; 50 microlitros de células estimuladoras irradiadas; 50 microlitros de células PBMC de respuesta. Como control se utilizaron 100 microlitros de medio de cultivo celular o 100 microlitros de CD4-IgG. A continuación, se incubaron las placas de cultivo a 37ºC/5% de CO_{2} durante 4 días. En el día 5, se pulsó cada pocillo con timidina tritiada (1 micro-Curie/pocillo; Amersham). Después de 6 horas, se lavaron las células 3 veces y se evaluó mediante recuento por centelleo la captación de marcador.

Los resultados se muestran en la figura 11B. Los datos de la figura 11B muestran que existe un efecto inhibidor dependiente de la dosis de DcR3-IgG en la respuesta de los linfocitos T en la MLR murina. A medida que se aumentaba el nivel de DcR3-IgG desde 25 ng/ml a 25.000 ng/ml en el medio de reacción, hubo una reducción significativa en la proliferación de linfocitos T tal como se muestra mediante una reducción en la captación del marcador de timidina tritiada. Esta inhibición de la MLR era dependiente de la dosis y fue significativa en comparación con un control positivo y con el efecto de una proteína de fusión IgG de control (Cd4-IgG) que no presentó efecto en la
MLR.

C. Ensayo de coestimulación

Se aislaron PBLs de donantes humanos utilizando procedimientos de leucoforesis estándar. A continuación, los preparados celulares se congelan en suero bovino fetal al 50% y DMSO al 50% hasta realizar el ensayo.

A continuación, las células se descongelaron toda la noche en un medio de ensayo a 37ºC/5% de CO_{2}. El medio de ensayo contenía medio RPMI; suero bovino fetal al 10%; penicilina/estreptomicina al 1%; glutamina al 1%; HEPES 10 mM, y 50 microgramos/ml de Gentamicina. Después del lavado, las células se resuspendieron en medio de ensayo y se incubaron a 37ºC/5% de CO_{2} durante toda la noche.

Para preparar las placas de cultivo, se recubrieron placas de base plana de 96 pocillos (Nunc) con CD3 murino anti-humano (adquirido de Amac) o CD28 murino anti-humano (adquirido de Biodesign) o ambos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Ambos anticuerpos se diluyeron en Hiclona D-PBS sin calcio ni magnesio. El anticuerpo anti-CD3 se añadió a una concentración de 10 ng/pocillo y el anticuerpo anti-CD28 se añadió a una concentración de 25 ng/pocillo en un volumen total de 100 microlitros/pocillo. Las placas se incubaron toda la noche en PBS a 4ºC.

A continuación, las placas recubiertas se lavaron dos veces con PBS. Los PBLs lavados se resuspendieron en medio hasta una concentración de 1 x 10^{6} células/ml y se añadieron a las placas a 100 microlitros/pocillo. A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 microlitros de la muestra de prueba (DcR3 etiquetado con Fc, utilizado a las concentraciones de 25, 250, 2.500 y 25.000 ng/ml, determinadas mediante D.O.) o control para obtener un volumen total de 200 microlitros en cada pocillo. Como control se utilizaron 100 microlitros de medio de cultivo celular o 100 microlitros de CD4-IgG. A continuación, las placas de cultivo se incubaron a 37ºC/5% de CO_{2} durante 72 horas. Posteriormente, se pulsó cada pocillo con timidina tritiada (1 micro-Curie/pocillo; Amersham). Después de 6 horas, se lavaron las células 3 veces y se evaluó mediante recuento por centelleo la captación de marcador.

Los resultados se muestran en la figura 11C. Los datos de la figura 11C muestran que existe un efecto inhibidor dependiente de la dosis de DcR3-IgG en la respuesta de los linfocitos T en el ensayo de coestimulación humana. A medida que se aumentaba el nivel de DcR3-IgG desde 25 ng/ml a 25.000 ng/ml en el medio de reacción, hubo una reducción significativa en la proliferación de linfocitos T tal como se muestra mediante una reducción en la captación del marcador de timidina tritiada. Esta inhibición del ensayo de coestimulación humana era dependiente de la dosis y fue significativa en comparación con un control positivo y con el efecto de una proteína de fusión IgG de control (Cd4-IgG) que no presentó efecto en el ensayo de coestimulación humana.

Ejemplo 15 Preparación de anticuerpos monoclonales para DcR3

Se inmunizaron ratones Balb/c (obtenidos de los laboratorios Charles River) mediante la inyección de 0,5 \mug/0,5 \mul de una proteína inmunoadhesina de DcR3 (diluida en adyuvante MPL-TDM adquirida de Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 11 veces en cada almohadilla de las patas traseras en intervalos de 1 día por semana. La proteína inmunoadhesina de DcR3 se generó mediante la fusión de los residuos de aminoácidos 1-300 de DcR3 (figura 1) a las regiones bisagra y Fc de la cadena pesada de la inmunoglobulina G_{1} humana en pRK5 tal como se ha descrito previamente [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)]. La proteína de inmunoadhesina se expresó en células de insectos y se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A, tal como se ha descrito por Ashkenazi et al, supra.

Tres días después de la estimulación final, se extrajeron los nódulos de la linfa polipteal de los ratones y se preparó una suspensión de células individuales en medio DMEM (obtenido de BioWhitakker Corp.) suplementado con penicilina-estreptmicina al 1%. A continuación, se fusionaron las células de los nódulos linfáticos con células de mieloma murinas P3X63AgU.1 (ATCC CRL 1597) utilizando polietilenglicol al 3,5% y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos. Los hibridomas resultantes de la fusión se seleccionaron en medio HAT. Diez después de la fusión, se cribaron los sobrenadantes del cultivo de hibridomas en un ELISA para analizar la presencia de anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína inmunoadhesina de DcR3 o a la proteína IgG-CD4.

En el ELISA de captura, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) mediante la adición a cada pocillo de 50 \mul de 2 \mug/ml de Fc de IgG de cabra anti-humano (adquirido de Cappel Laboratories) en PBS y la incubación a 4ºC durante toda la noche. A continuación, se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%). A continuación, se bloquearon los pocillos en las placas de microtitulación con 200 \mul de albúmina de suero bovino al 2,0% en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado.

Después de la etapa de lavado, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de proteína inmunoadhesina de DcR3 0,4 \mug/ml (tal como se ha descrito anteriormente) en tampón de ensayo (PBS que contenía BSA al 0,5% y Tween 20 al 0,05%). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de agitación, seguido de un lavado por tres veces con tampón de lavado.

Tras las etapas de lavado, se añadieron a los pocillos designados 100 \mul de los sobrenadantes del hibridoma o anticuerpo purificado (utilizando columnas de Proteína G-sefarosa) en tampón de ensayo. A otros pocillos designados como controles se añadieron 100 \mul medio acondicionado con células de mieloma P3X63AgU.1. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato de agitación y, a continuación, se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado.

A continuación, 50 \mul de Fc de IgG de cabra anti-ratón conjugado con HRP (adquirido de Cappel Laboratories) diluidos 1:10000 en tampón de ensayo se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de agitación. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, seguido de la adición de 50 \mul de sustrato (sustrato para peroxidasa TMB en micropocillo, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de la solución de detención de 1 componente para TMB (dietil glicol, Kirkegaard & Perry) a cada pocillo y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación automático.

De los sobrenadantes del hibridoma cribados en el ELISA, 17 sobrenadantes dieron positivo (calculado como aproximadamente 4 veces por encima de la base). Los hibridomas seleccionados se analizaron en un ELISA (descrito a continuación) por su capacidad para bloquear la unión de DcR3 al ligando de Fas. Los potenciales hibridomas secretores de bloqueo y no bloqueo se clonaron dos veces mediante la limitación de la dilución.

Ejemplo 16 Ensayo ELISA para determinar la especificidad de los anticuerpos DcR3

Se realizó un ELISA para determinar si los anticuerpos monoclonales descritos en el ejemplo 15 eran capaces de unirse a otros receptores conocidos además de DcR3. Específicamente, se ensayaron los anticuerpos 4C4.1.4; 11C5.2.8; 8D3.1.5; 5C4.14.7; y 4B7.1.1, respectivamente, para la unión al DcR3 descrito en la presente invención y a DR4 [Pan et al., supra], DR5 [Sheridan et al., supra y Pan et al., supra], DcR1 [Sheridan et al., supra] y OPG [Simonet et al., supra]. El ELISA se desarrolló esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 15 anterior. Se determinó la especificidad de antígeno utilizando 10 microgramos/ml de anticuerpo de DcR3.

Los resultados se muestran en la figura 12. Los cinco anticuerpos de DcR3 se unieron específicamente a DcR3 (véase también la figura 13). Ninguno de los cinco anticuerpos de DcR3 mostró una reactividad cruzada con los otros receptores en el ensayo.

Ejemplo 17 Prueba de ELISA para determinar la actividad de bloqueo de anticuerpos de DcR3

En el ELISA, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) mediante la adición a cada pocillo de 50 \mul de 2 \mug/ml de Fc de IgG anti-humano de cabra (adquirido de Cappel Laboratories) en tampón de carbonato y la incubación a 4ºC durante toda la noche. A continuación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%). A continuación, se bloquearon los pocillos en las placas de microtitulación con 200 \mul de albúmina de suero bovino al 2,0% en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se lavaron las placas de nuevo tres veces con tampón de
lavado.

Después de la etapa de lavado, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de proteína inmunoadhesina de DcR3 0,5 \mug/ml (tal como se describe en el ejemplo 15 anterior) o Fas-IgG en tampón de ensayo (PBS que contenía BSA al 0,5% y Tween 20 al 0,5%). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de agitación, seguido del lavado por tres veces con tampón de lavado.

Tras las etapas de lavado, se añadieron a los pocillos designados 100 \mul de los anticuerpos purificados 4C4.1.4; 11C5.2.8; 8D3.1.5; 5C4.14.7; o 4B7.1.1 en tampón de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se lavaron tres veces con tampón de lavado.

A continuación, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de ligando de Fas etiquetado con Flag (Alexis Pharmaceuticals) (a una concentración de 35 ng/ml) y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, seguido de la adición de 100 \mul de HRP-estreptavidina (Zymed) a una dilución 1:2000 a los pocillos durante una incubación de 1 hora. Las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron 50 \mul de sustrato TMB (sustrato para peroxidasa TMB en micropocillo, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de la solución de detención de 1 componente para TMB (dietil glicol, Kirkegaard & Perry) a cada pocillo y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación automático.

Los resultados se muestran en la figura 12. Se determinó el % de bloqueo en un exceso de 100 veces de anticuerpo de DcR3 con respecto a ligando de Fas. Tres de los anticuerpos, 4B7.1.1; 11C5.2.8; y 5C4.14.7 mostraron una actividad de bloqueo significativa. (véase también la figura 14).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18 Estudio de los isotipos de anticuerpos

Se determinó el isotipo de los anticuerpos de DcR3 (tal como se ha descrito anteriormente en los ejemplos 15-17) mediante el recubrimiento de las placas de microtitulación con Ig anti-ratón de cabra de un isotipo específico (Fisher Biotech; Pittsburgh, PA) durante toda la noche a 4ºC. A continuación, las placas se lavaron con tampón de lavado (tal como se describe en el ejemplo 15 anterior). A continuación, se bloquearon los pocillos en las placas de microtitulación con 200 \mul de albúmina de suero bovino (BSA) al 2% y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron a los pocillos designados 100 \mul de sobrenadante del cultivo de hibridomas o 5 \mug/ml de anticuerpo purificado. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (tal como se describe anteriormente ene el ejemplo 15). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se detectó el nivel de HRP unida a la placa utilizando sustrato de HRP tal como se ha descrito anteriormente.

El análisis de los isotipos mostró que los anticuerpos 8D3.1.5; 11C5.2.8 y 4B7.1.1 son anticuerpos IgG1. El análisis también mostró que el anticuerpo 5C4.14.7 es un anticuerpo IgG2b y que el anticuerpo 4C4.1.4 es un anticuerpo IgG2a. Estos resultados también se muestran en la figura 12.

Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia USA (ATCC):

1

Estos depósitos se realizaron según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. El depósito estará disponible mediante la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y está sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al uso público tras la publicación de la respectiva patente estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para alquien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC \NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas (incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente reemplazados en una notificación por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet EP 417563 A [0005]

\bullet WO 9830694 A [0019]

\bullet WO 8705330 A [0048]

\bullet US 4640835 A [0050]

\bullet US 4496689 A [0050]

\bullet US 4301144 A [0050]

\bullet US 4670417 A [0050]

\bullet US 4791192 A [0050]

\bullet US 4179337 A [0050]

\bullet US 5364934 A [0060]

\bullet WO 8905859 A [0065]

\bullet US 4399216 A [0065]

\bullet US 5010182 A [0070]

\bullet EP 362179 A [0070]

\bullet WO 9013646 A [0070]

\bullet EP 36776 A [0074]

\bullet EP 73657 A [0076]

\bullet GB 2211504 A [0077]

\bullet EP 117060 A [0080]

\bullet EP 117058 A [0080]

\bullet US 4736866 A [0092]

\bullet US 4870009 A [0092]

\bullet US 4816567 A [0110] [0110] [0116]

\bullet WO 9308829 A [0119]

\bullet US 4676980 A [0121]

\bullet WO 9100360 A [0121]

\bullet WO 92200373 A [0121]

\bullet EP 03089 A [0121]

\bullet US 9676980 B [0121]

\bullet EP 307247 A [0150]

\bullet WO 9725428 A [0166]

\vskip1.000000\baselineskip

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bulletGRUSS; DOWER. Blood, 1995, vol. 85, 3378-3404 [0002]

\bulletWILEY et al. Immunity, 1995, vol. 3, 673-682 [0002]

\bulletPITTI et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 12687-12690 [0002]

\bulletSCHMID et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, vol. 83, 1881 [0002]

\bulletDEALTRY et al. Eur. J. Immunol., 1987, vol. 17, 689 [0002]

\bulletZHENG et al. Nature, 1995, vol. 377, 348-351 [0002]

\bulletAMAKAWA et al. Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, 1995 [0002]

\bulletNAGATA. Cell, 1997, vol. 88, 355 [0003]

\bulletHAHNE et al. Science, 1961, vol. 274, 1363 [0003]

\bulletSTRAND et al. Nature Med., 1996, vol. 2, 1361-1366 [0003]

\bulletMORETTA. Cell, 1997, vol. 90 [0003]

\bulletKRAMMER et al. Curr. Op. Immunol., 1994, vol. 6, 279-289 [0004]

\bulletNAGATA et al. Science, 1995, vol. 267, 1449-1456 [0004]

\bulletYONEHARA et al. J. Exp. Med., 1989, vol. 169, 1747-1756 [0004]

\bulletHOHMAN et al. J: Biol. Chem., 1989, vol. 264, 14927-14934 [0005]

\bulletBROCKHAUS et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, vol. 87, 3127-3131 [0005]

\bulletLOETSCHER et al. Cell, 1990, vol. 61, 351 [0005]

\bulletSCHALL et al. Cell, 1990, vol. 61, 361 [0005]

\bulletSMITH et al. Science, 1990, vol. 248, 1019-1023 [0005]

\bulletLEWIS et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 2830-2834 [0005]

\bulletGOODWIN et al. Mol. Cell. Biol., 1991, vol. 11, 3020-3026 [0005]

\bulletTAKAO et al. Immunogenetics, 1993, vol. 37, 199-203 [0005]

\bulletNOPHAR, Y. et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 3269 [0005]

\bulletKOHNO, T. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, vol. 87, 8331 [0005]

\bulletHALE et al. J. Cell. Biochem., 1991, 113 [0005]

\bulletBANNER et al. Cell, 1993, vol. 73, 431-435 [0006]

\bulletJOHNSON et al. Cell, 1986, vol. 47, 545 [0007]

\bulletRADEKE et al. Nature, 1987, vol. 325, 593 [0007]

\bulletSTAMENKOVIC et al. EMBO J., 1989, vol. 8, 1403 [0007]

\bulletMALLET et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 1063 [0007]

\bulletITOH et al. Cell, 1991, vol. 66, 233-243 [0007]

\bulletUPTON et al. Virology, 1987, vol. 160, 20-29 [0007]

\bulletSMITH et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, vol. 176, 335 [0007]

\bulletUPTON et al. Virology, 1991, vol. 184, 370 [0007]

\bulletWELCHER, A.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 159-163 [0007]

\bulletYAN, H.; CHAO, M.V. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 12099-12104 [0007]

\bulletPEETRE, C. et al. Eur. J. Hematol., 1988, vol. 41, 414-419 [0007]

\bulletSECKINGER, P. et al. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 11966-11973 [0007]

\bulletBROJATSCH et al. Cell, 1996, vol. 87, 845-855 [0010]

\bulletMONTGOMERY et al. Cell, 1996, vol. 87, 427-436 [0010]

\bulletMARSTERS et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 14029-14032 [0010]

\bulletSIMONET et al. Cell, 1997, vol. 89, 309-319 [0010]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 750 [0011]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 1669 [0011]

\bulletCHINNAIYAN et al. Science, 1996, vol. 274, 990 [0011]

\bulletKITSON et al. Nature, 1996, vol. 384, 372 [0011]

\bulletBODMER et al. Immunity, 1997, vol. 6, 79 [0011]

\bulletPAN et al. Science, 1997, vol. 276, 111-113 [0012]

\bulletSHERIDAN et al. Science, 1997, vol. 277, 818-821 [0013]

\bulletPAN et al. Science, 1997, vol. 277, 815-818 [0013]

\bullet T.E. CREIGHTON. Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co, 1983, 79-86 [0045]

\bulletAPLIN; WRISTON. CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, 259-306 [0048]

\bulletHAKIMUDDIN et al. Arch. Biochem. Biophys., 1987, vol. 259, 52 [0049]

\bulletEDGE et al. Anal. Biochem., 1981, vol. 118, 131 [0049]

\bulletTHOTAKURA et al. Meth. Enzymol., 1987, vol. 138, 350 [0049]

\bulletFIELD et al. Mol. Cell. Biol., 1988, vol. 8, 2159-2165 [0052]

\bulletEVAN et al. Molecular and Cellular Biology, 1985, vol. 5, 3610-3616 [0052]

\bulletPABORSKY et al. Protein Engineering, 1990, vol. 3 (6), 547-553 [0052]

\bulletHOPP et al. BioTechnology, 1988, vol. 6, 1204-1210 [0052]

\bulletMARTIN et al. Science, 1992, vol. 255, 192-194 [0052]

\bulletSKINNER et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 15163-15166 [0052]

\bulletLUTZ-FREYERMUTH et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6393-6397 [0052]

\bulletSTEWART et al. Solid-Phase Peptide Synthesis. W.H. Freeman Co, 1969 [0053]

\bulletMERRIFIELD. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 85, 2149-2154 [0053]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0055]

\bulletDIEFFENBACH et al. PCR Primer:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 [0055]

\bulletCARTER et al. Nucl. Acids Res., 1986, vol. 13, 4331 [0060]

\bulletZOLLER et al. Nucl. Acids. Res., 1982, vol. 10, 6487 [0060]

\bulletWELLS et al. Gene, 1985, vol. 34, 315 [0060]

\bulletWELLS et al. Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 1986, vol. 317, 415 [0060]

\bulletCREIGHTON. The Proteins. W.H. Freeman & Co, [0061]

\bulletCHOTHIA. J. Mol. Biol., 1976, vol. 105, 1 [0061]

\bullet Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach. IRL Press, 1991 [0064]

\bulletSHAW et al. Gene, 1983, vol. 23, 315 [0065]

\bulletGRAHAM; VAN DER EB. Virology, 1978, vol. 52, 956-457 [0065]

\bullet VAN SOLINGEN et al. J. Bact., 1977, vol. 130, 946 [0065]

\bulletHSIAO et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1979, vol. 76, 3829 [0065]

\bulletKEOWN et al. Methods in Enzymology, 1990, vol. 185, 527-537 [0065]

\bulletMANSOUR et al. Nature, 1988, vol. 336, 348-352 [0065]

\bulletGRAHAM et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0068]

\bulletURLAUB; CHASIN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0068]

\bulletMATHER. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0068]

\bulletURLAUB et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0073]

\bulletSTINCHCOMB et al. Nature, 1979, vol. 282, 39 [0073]

\bulletKINGSMAN et al. Gene, 1979, vol. 7, 141 [0073]

\bulletTSCHEMPER et al. Gene, 1980, vol. 10, 157 [0073]

\bulletJONES. Genetics, 1977, vol. 85, 12 [0073]

\bulletCHANG et al. Nature, 1978, vol. 275, 615 [0074]

\bulletGOEDDEL et al. Nature, 1979, vol. 281, 544 [0074]

\bulletGOEDDEL. Nucleic Acids Res., 1980, vol. 8, 4057 [0074]

\bulletDEBOER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 21-25 [0074]

\bulletHITZEMAN et al. J. Biol. Chem, 1980, vol. 255, 2073 [0075]

\bulletHESS et al. J. Adv. Enzyme Reg., 1968, vol. 7, 149 [0075]

\bulletHOLLAND. Biochemistry, 1978, vol. 17, 4900 [0075]

\bulletGETHING et al. Nature, 1981, vol. 293, 620-625 [0080]

\bulletMANTEI et al. Nature, 1979, vol. 281, 40-46 [0080]

\bulletTHOMAS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 5201-5205 [0081]

\bulletDEUTSCHER. Methods in Enzymology, 1990, vol. 182 [0084]

\bulletSCOPES. Protein Purification:Principles and Practice. Springer-Verlag, 1982 [0084]

\bulletTHOMAS; CAPECCHI. Cell, 1987, vol. 51, 503 [0093]

\bulletLI et al. Cell, 1992, vol. 69, 915 [0093]

\bulletBRADLEY. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. IRL, 1987, 113-152 [0093]

\bulletZAMECNIK et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, vol. 83, 4143-4146 [0094]

\bulletDZAU et al. Trends in Biotechnology, 1993, vol. 11, 205-210 [0095]

\bulletWU et al. J. Biol. Chem., 1987, vol. 262, 4429-4432 [0095]

\bulletWAGNER et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, vol. 87, 3410-3414 [0095]

\bulletANDERSON et al. Science, 1992, vol. 256, 808-813 [0095]

\bullet Samter's Immunological Diseases. Brown and Company, 1995, vol. I and II [0098]

\bulletOSLO. Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1980 [0099]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0104]

\bulletGODING. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0105]

\bulletKOZBOR. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0106]

\bulletBRODEUR et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0106]

\bulletMUNSON; POLLARD. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0107]

\bulletJONES et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0115] [0116]

\bulletRIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-329 [0115]

\bulletPRESTA. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0115]

\bulletRIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0116]

\bulletVERHOEYEN et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0116]

\bulletHOOGENBOOM; WINTER. J. Mol. Biol., 1991, vol. 227, 381 [0117]

\bulletMARKS et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0117]

\bulletCOLE et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, 1985, 77 [0117]

\bulletBOERNER et al. J. Immunol., 1991, vol. 147 (1), 86-95 [0117]

\bulletMILSTEIN; CUELLO. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0119]

\bulletTRAUNECKER et al. EMBO J., 1991, vol. 10, 3655-3659 [0119]

\bulletSURESH et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0120]

\bulletZOLA. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0122]

\bulletHUNTER et al. Nature, 1962, vol. 144, 945 [0122]

\bulletDAVID et al. Biochemistry, 1974, vol. 13, 1014 [0122]

\bulletPAIN et al. J. Immunol. Meth., 1981, vol. 40, 219 [0122]

\bulletNYGREN. J. Histochem. and Cytochem., 1982, vol. 30, 407 [0122]

\bulletKWON et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 1997, vol. 94, 8099-8103 [0124]

\bulletLEACH et al. Science, 1996, vol. 271, 1734-1736 [0124]

\bullet Handbook of Monoclonal Antibodies. Noges Publications, 1985, 303-357 [0125]

\bulletSMITH et al. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy. Raven Press, 1977, 365-389 [0125]

\bulletALTSCHUL et al. Methods in Enzymology, 1996, vol. 266, 460-480 [0131]

\bulletHOLMES et al. Science, 1991, vol. 253, 1278-1280 [0135]

\bulletBOLIVAR et al. Gene, 1977, vol. 2, 95 [0146]

\bulletTHIMMAPPAYA et al. Cell, 1982, vol. 31, 543 [0150]

\bulletSOMPARYRAC et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, vol. 12, 7575 [0150]

\bulletO'REILLEY et al. Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual. Oxford University Press, 1994 [0157]

\bulletRUPERT et al. Nature, 1993, vol. 362, 175-179 [0158]

\bulletPENNICA et al. Nature, 1984, vol. 312, 724-729 [0166]

\bulletSUDA et al. Cell, 1993, vol. 75, 1169-1178 [0166]

\bulletMAURI et al. Immunity, 1998, vol. 8, 21 [0166]

\bulletMARSTERS et al. Current Biology, 1998, vol. 8, 525 [0166]

\bulletCHICHEPORTICHE et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 32401 [0166]

\bulletWONG et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 25190 [0166]

\bulletANDERSON et al. Nature, 1997, vol. 390, 175 [0166]

\bulletLACEY et al. Cell, 1998, vol. 93, 165 [0166]

\bulletASHKENAZI et al. Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1995, vol. 8, 104 [0166]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 1669-1676 [0172]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1996 [0175]

\bulletDHEIN et al. Nature, 1995, vol. 373, 438 [0176]

\bulletARASE et al. J. Exp. Med., 1995, vol. 181, 1235 [0177]

\bulletMEDVEDEV et al. Cytokine, 1997, vol. 9, 399 [0177]

\bulletGELB et al. Hum. Genet., 1996, vol. 98, 141 [0180]

\bulletGELMINI et al. Clin. Chem., 1997, vol. 43, 752-758 [0183]

\bulletCOLIGAN et al. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc, 1994 [0192]

\bulletASHKENAZI et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 10535-10539 [0205]

<110> GENENTECH INC.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Polipéptido DcR3 Polypeptide, un homólogo de TNFR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 11669.31WO01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> NUEVA SOLICITUD

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1998-09-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/059,288

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-09-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/094,640

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-07-30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 491

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de organismo desconocido: DESCONOCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

19

Claims (28)

1. Anticuerpo anti-DcR3 aislado que (a) se une a un polipéptido DcR3 que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el polipéptido DcR3 de secuencia nativa, que comprende los residuos de aminoácidos 1-300 de la figura 1 (SEC ID No: 1); y (b) inhibe la unión del ligando de Fas al polipéptido DcR3 de (a).

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido DcR3 consiste en los aminoácidos 1 a 215 o los aminoácidos 1 a 300 de la figura 1 (SEC ID No. 1).

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que antagoniza el efecto inhibidor del polipéptido DcR3 según la reivindicación 1 sobre la actividad del ligando de Fas.

4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el que dicha actividad de ligando de Fas es cualquiera entre la unión a Fas, la inducción de apoptosis, la inducción de AICD de células T y la inducción del asesinato celular por células NK.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que dicha actividad de ligando de Fas es la inducción de la apoptosis en células cancerígenas.

6. Anticuerpo según la reivindicación 5, en el que dichas células cancerígenas son células de cáncer de colon o células de cáncer de pulmón.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano aislado.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo comprende un fragmento Fab.

11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monovalente.

12. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se expresa en una célula huésped recombinante seleccionada del grupo que consiste en una célula CHO, una célula COS de simio o una célula de mieloma.

13. Línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo según la reivindicación 8.

14. Célula de hibridoma según la reivindicación 13 que es:

(i) línea celular de hibridoma 4C4.1.4 depositada como el número de acceso de ATCC HB-12573;

(ii) línea celular de hibridoma 5C4.14.7 depositada como el número de acceso de ATCC HB-12574;

(iii) línea celular de hibridoma 11C5.2.8 depositada como el número de acceso de ATCC HB-12572;

(iv) línea celular de hibridoma 8D3.1.5 depositada como el número de acceso de ATCC HB-12571; o

(v) línea celular de hibridoma 4B7.1.1 depositada como el número de acceso de ATCC HB-12575.

15. Anticuerpo anti-DcR3 aislado según la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal producido por cualquiera de las líneas celulares de hibridoma según la reivindicación 14.

16. Anticuerpo anti-DcR3 aislado según la reivindicación 1, que se une al mismo epítopo del polipéptido DcR3 que el epítopo unido por cualquiera de los anticuerpos monoclonales según la reivindicación 15.

17. Composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, 15 ó 16 y un portador.

18. Artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en dicho recipiente, cuya composición comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, 15 ó 16.

19. Artículo de fabricación según la reivindicación 18, que comprende además instrucciones para el uso de dicho anticuerpo de DcR3 in vivo o ex vivo.

20. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, 15 ó 16, o una composición según la reivindicación 17, para su uso en terapia.

21. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, 15 ó 16, o una composición según la reivindicación 17, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que el gen de DcR3 se amplifica en las células de dicho cáncer.

23. Uso según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que dicho cáncer es cáncer de pulmón o cáncer de colon.

24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que las células de dicho cáncer también se exponen a quimioterapia o radioterapia.

25. Uso de un polipéptido DcR3 según se define en la reivindicación 1(a) en la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de la actividad del ligando de Fas.

26. Uso según la reivindicación 25, en el que dicha actividad de ligando de Fas es la apoptosis inducida por el ligando de Fas.

27. Uso de un polipéptido DcR3 según se define en la reivindicación 1(a) en la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de una respuesta inmune mediada por células T.

28. Procedimiento in vitro de detección o diagnóstico del cáncer en una mamífero que comprende el análisis de las células de mamífero para la amplificación de un gen de DcR3.