DE60036199T2

DE60036199T2 - Proteaseresistente flint-analoge

Info

Publication number: DE60036199T2
Application number: DE60036199T
Authority: DE
Inventors: Radmila Indianapolis MICANOVIC; Radhakrishnan Carmel RATHNACHALAM; Derrick Ryan Fishers WITCHER
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2000-03-20
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2020-03-21
Also published as: EP1165781B1; JP2002539829A; WO2000058466A2; DE60036199D1; WO2000058466A3; EP1165781A2; ATE371737T1; AU3739500A; CA2368767C; JP4590504B2; ES2291197T3; CA2368767A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Es wurden in den letzten Jahren mehrere Tumornekrosefaktorrezeptorproteine ("TNFR" Proteine") mit vielen potenten biologischen Effekten isoliert. Eine außer Kontrolle geratene Aktivität dieser Proteine ist bei vielen Krankheitszuständen impliziert.
Ein solches TNFR Homologes, das hierin als "FAS Liganden inhibierendes Protein" oder "FLINT" bezeichnet wird, bindet FAS Liganden (FasL) und verhindert hierdurch die Wechselwirkung von FASL mit FAS (siehe US Patentanmeldung 60/112 577, 60/112 993 und 60/113 407 jeweils vom 17, 18. und 22. Dezember 1998).
Eine erhöhte Aktivierung dieses FAS-FAS Ligandensignalübertragungswegs ist bei mehreren pathologischen Zuständen beteiligt, einschließlich Runaway Apoptose (Kondo et al., Nature Medicine 3(4): 409-413 (1997), Galle et al., J. Exp. Med. 182: 1223-1230 (1995) und Entzündungserkrankung, die von einer Neutrophilenaktivierung resultiert (Miwa et al., Nature Medicine 4: 1287 (1998)).
"Runaway Apoptose" ist ein Maß an Apoptose, das höher ist als normal oder eine Apoptose, die zu eine unpassenden Zeit auftritt. Pathologische Zustände, die durch eine Runaway Apoptose verursacht werden, umfassen beispielsweise Organversagen der Leber, der Nieren und des Pankreas. Entzündliche Erkrankungen, die mit übermäßiger Neutrophilenaktivierung assoziiert sind, umfassen Sepsis, ARDS, SIRS und MODS.
Verbindungen, wie FLINT, die die Bindung von FAS an FASL und LIGHT an LT^®R und/oder TR2/HVEM Rezeptoren hemmen, können verwendet werden, um Krankheiten oder Zustände zu verhindern, die mit diesen Bindungswechselwirkungen assoziiert sind. Die therapeutische Brauchbarkeit von FLINT kann durch FLINT Analoga erhöht werden, die modifizierte pharmakologische Eigenschaften (beispielsweise erhöhte Stärke und/oder längere in vivo Halbwertszeiten und/oder höhere Affinität für FASL), modifizierte pharmazeutische Eigenschaften zeigen (beispielsweise verringerte Aggregation und Oberflächenabsorption, erhöhte Löslichkeit und leichtere Formulierung) und/oder modifizierte physikalische Eigenschaften, wie Empfindlichkeit gegenüber Proteolyse.
Zusammenfassung der Erfindung
Das FLINT Polypeptid macht in vivo eine Proteolyse unter Bildung von mindestens zwei Hauptpeptidfragmenten durch. Eines der Fragmente besteht aus den Resten 1 bis 218 der SEQ ID Nr. 1 (alternativ Reste 1 bis 247 der SEQ ID Nr. 3), das hierin "FLINT Metabolit" genannt wird und das andere besteht aus den Resten 219 bis 271 der SEQ ID Nr. 1 (alternativ Reste 248 bis 300 der SEQ ID Nr. 3). Die Spaltung an der Position 218 in vitro kann erreicht werden, wenn natives FLINT (SEQ ID Nr. 3) oder reifes FLINT (SEQ ID Nr. 1) mit einem Trypsin-ähnlichen Enzym behandelt wird, beispielsweise Thrombin, Trypsin oder einer anderen Serinprotease. Daher ist es wahrscheinlich, dass eine Serinprotease für die in vivo Proeolyse von FLINT verantwortlich ist.
In vitro Studien legen nahe, dass der FLINT Metabolit FasL mit einer scheinbar niedrigeren Affinität bindet, als FLINT. Daher kann die pharmazeutische Brauchbarkeit von FLINT durch ein Analogon erhöht werden, dass gegenüber einer Proteolyse bei oder nahe der Position 218 resistent ist. Die hierin beschriebene Erfindung liefert solche Analoga.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein FLINT Analogon, das gegenüber einer Proteolyse durch eine Trypsin-ähnliche Protease zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 und/oder zwischen den Positionen 247 und 248 der SEQ ID Nr. 3 resistent und bei der Bindung des Fas Liganden (FasL) und oder LIGHT aktiv ist, worin Arg an der Position 218 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 247 der SEQ ID Nr. 3 durch Gln ersetzt ist, wobei das Analogon ein Polypeptid umfasst, das mindestens zu 97 % identisch ist, alternativ mindestens zu 98 % identisch ist alternativ dazu mindestens zu 99 % identisch ist mit der SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 3.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein FLINT Analogon nach der obigen Ausführungsform, worin Arg an der Position 34 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 63 der SEQ ID Nr. 3 durch Asn ersetzt ist und Asp an der Position 36 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 65 der SEQ ID Nr. 3 durch Thr ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein FLINT Analogon gemäß einem der obigen Ausführungsformen, worin Asp an der Position 194 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 223 der SEQ ID Nr. 3 durch Asn ersetzt ist, Ser an der Position 196 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 225 der SEQ ID Nr. 3 durch Thr ersetzt ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein FLINT Analogen gemäß einer der obigen Ausführungsformen, worin Thr an der Position 216 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 245 der SEQ ID Nr. 3 durch Pro ersetzt ist.
Eine weitere Ausführungsform betrifft eine Nukleinsäure, die für ein Protease-resistentes FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorligende Erfindung einen Vektor, der eine Nukleinsäure umfasst, die für ein Protease-resistentes FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine rekombinante Wirtszelle, die diesen Vektor umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung therapeutische und klinische Verwendungen eines Protease-resistenten FLINT Analogons der vorliegenden Erfindung zur Prävention oder Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands bei einem Säuger, der einer solchen Prävention oder Behandlung bedarf.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung therapeutische und klinische Verwendungen eines Protease-resistenten FLINT Analogons der vorliegenden Erfindung zur Prävention oder Behandlung der akuten Lungenverletzung (ALI), des akuten Atemstressyndroms (ARDS) oder der Colitis ulcerosa.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protease-resistentes FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung umfasst.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung

SEQ ID Nr. 1 – Reifes humanes FLINT, das heißt natives FLINT minus die Signalsequenz.
SEQ ID Nr. 2 – Nukeinsäure/cDNA, die für reifes, humanes FLINT kodiert.
SEQ ID Nr. 3 – Natives, humanes FLINT
SEQ ID Nr. 4 – Humane FLINT Signalsequenz
SEQ ID Nr. 5 – Oligonukleotidprimer A, CF107
SEQ ID Nr. 6 – Oligonukleotidprimer B, CF111
SEQ ID Nr. 7 – Oligonukleotidprimer C, CF112
SEQ ID Nr. 8 – Oligonukleotidprimer D, CF110
SEQ ID Nr. 9 – Nukleinsäure/cDNA, die für natives, humanes FLINT kodiert.

1 – Zeitverlauf der Thrombinspaltung von nativem FLINT und R218Q Analogon.
2 – FLINT Analogon R218Q hemmt die durch FasL induzierte Apoptose in Jurkat Zellen. FLINT Proben, die aus AV12 gereinigt wurden.
3 – FLINT Analogon R218Q, das aus 293 EBNA Zellen gereinigt wurde, hemmt die durch FasL induzierte Apoptose in Jurkat Zellen.
4 – FLINT Analogon RDDSR hemmt die durch FasL-induzierte Apoptose in Jurkat Zellen.
5 – RP-HPLC Profil der Radioaktivität nach einer in vitro Inkubation von ¹²⁵I FLINT und ¹²⁵I FLINT (R218Q) mit ICR Mausblut. Die Testartikel werden für 1 h bei 37°C inkubiert. Das Serum wird hergestellt und durch RP-HPLC fraktioniert. Die Daten werden als Prozentsatz an Radioaktivität pro Fraktion ausgedrückt, die auf die Säule aufgetragen wird.
6 – RP-HPLC Profil der FLINT Immunreaktivität in Plasma 15 Minuten nach einer intravenösen Verabreichung von FLINT oder FLINT (R218Q) an ICR Mäuse. Die Fraktionen werden gewonnen und durch ELISA analysiert. Die Daten stellen die Ergebnisse aus jedem einzelnen Tier dar.
7 – FLINT und FLINT Analogondosisreaktion im akuten Leberversagensmodell (ALF) der Maus.
Der Ausdruck "Analogon" oder "FLINT Analogon" meint eine FLINT Variante oder ein Fragment hiervon, das gegenüber einer Proteolyse zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 (Positionen 247 und 248 der SEQ ID Nr. 3) resistent ist und das vorzugsweise eine biologische Aktivität aufweist, die im wesentlichen dieselbe ist wie die von FLINT.
Der Ausdruck "negativ geladene Gruppe" oder "negativ geladene Aminogruppe" bezieht sich auf Asp oder Glu.
Der Ausdruck "positiv geladene Gruppe" oder "positiv geladene Aminogruppe" bezieht sich auf His, Arg oder Lys.
Der Ausdruck "polar ungeladen" oder "polar ungeladene Aminosäure" bezieht sich auf Cys, Thr, Ser, Gly, Asn, Gln und Tyr.
Der Ausdruck "unpolar" oder "unpolare Aminosäure" bezieht sich auf Ala, Pro, Met, Leu, Ile, Val, Phe oder Trp.
Der Ausdruck "natürlich vorkommende Aminosäure" bezieht sich auf jede der 20 L-Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden.
Der Ausdruck "natives FLINT" bezieht sich auf SEQ ID Nr. 3.
Der Ausdruck "reifes FLINT" bezieht sich auf SEQ ID Nr. 1.
Der Ausdruck "FLINT" bezieht sich auf natives und reifes FLINT vom Menschen oder anderen Primaten und anderen Säuger- und Nicht Säugerquellen.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Halbwertszeit" auf die Zeit, die benötigt wird, um etwa die Hälfte der FLINT oder FLINT Analogon Moleküle in einer Probe proteolytisch zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 in vitro und/oder in vivo zu spalten, wie dies durch geeignete Mittel bestimmt wird.
Der Ausdruck "Protease-resistent" oder "resistent" bezieht sich auf ein FLINT Analogon, das bei einem Vergleich mit FLINT oder einem FLINT Fragment resistenter gegenüber einer Proteolyse zwischen den Resten 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 ist. Protease-resistente Analoga unterscheiden sich von FLINT durch ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Inversionen, Additionen und/oder Veränderungen in den Glycosylierungsstellen oder -muster im Vergleich mit oder gegen nativem FLINT oder reifem FLINT oder einem anderen FLINT Fragment. Vorzugsweise treten diese Veränderungen in der Region von etwa Position 214 bis Position 222 der SEQ ID Nr. 1 auf.
Der Ausdruck "Protease-resistent" umfasst ein Maß an Resistenz gegenüber Proteolyse an der Position 218 von einer vollständigen Resistenz bis zu einer partiellen Resistenz. Daher zeigt ein "im wesentlichen resistentes" Analogon ein Maß an Resistenz gegenüber einer Proteolyse an der Position 218, beispielsweise einem Analogon mit einer Halbwertszeit, die mindestens etwa 25 % größer ist als natives FLINT, wenn es mit einer geeigneten Protease behandelt wird oder ihr gegenüber ausgesetzt wird. Vorzugsweise besitzt ein im wesentlichen resistentes FLINT Analogon eine Proteaseresistenzhalbwertszeit, die mindestens etwa zweimal höher ist als die von nativem FLINT.
Die Empfindlichkeit gegenüber der Proteolyse hängt von Faktoren ab, wie der Aminosäuresequenz an oder nahe der Spaltstelle und/oder der Erkennungsstelle des bestimmten beteiligten proteolytischen Enzyms und der physikalischen und chemischen Umgebung des bestimmten in Betracht gezogenen Analogons. Solche Faktoren können den K_M und/oder die Geschwindigkeit der Proteolyse durch ein proteolytisches Enzym beeinflussen.
Die Erkennungsschnittstelle für die Serinproteasen, einschließlich Thrombin, wurden untersucht. Thrombin spaltet an mehreren Stellen einschließlich LVPR/und Stellen, die zu LVPR/ähnlich sind, beispielsweise VDPR/wie auch anderen. Die Ladungsdichte und die sterischen Eigenschaften, die an einem aktiven Zentrum eines Enzyms wirken, bestimmen das Ausmaß, indem die Proteolyse stattfindet. Daher umfasst die vorliegende Erfindung Protease-resistente Analoga von FLINT, die ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen innerhalb eines Fensters umfassen, das durch die Reste 215 bis 218 der SEQ ID Nr. 1 definiert ist. Solche Analoga werden leicht durch den Fachmann mittels bekannter rekombinanter Techniken konstruiert und in vitro auf die Resistenz gegenüber der Proteolyse an der Position 218 getestet. Alle solchen Ausführungsformen liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Proteaseresistenz, wie sie hierin erwähnt wird, bezieht sich auf die Empfindlichkeit eines FLINT Analogons gegenüber einer Proteolyse an der Position 218 in vivo oder in vitro. Beispielsweise wird die Resistenz eines Analogons gegenüber einer Trypsin-ähnlichen Protease, wie Thrombin oder Trypsin oder einer anderen Serinprotease mit der Resistenz verglichen, die durch FLINT unter denselben Bedingungen gezeigt ist. Es ist bevorzugt, dass ein FLINT Analogon eine Halbwertszeit zeigt, die mindestens 5 % größer ist als die von FLINT, alternativ mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 % oder zwischen 50 % und 100 % größer als die von Wildtyp FLINT, wie dies durch die relative Menge an Volllängenmolekülen relativ zu kleineren Verdauprodukten bestimmt wird (beispielsweise Fragmente 1-218 und 219-271 der SEQ ID Nr. 1). Jedes Verfahren zur Herstellung einer qualitativen und/oder quantitativen Untersuchung der relativen Mengen kann verwendet werden, beispielsweise Polyacrylamidgelelektrophorese. Am bevorzugtesten weist ein resistentes Analogon eine Halbwertszeit auf, die einfach bis zweifach größer ist als die von FLINT bis etwa hundertfach oder mehr größer ist als die von FLINT.
"Fragment hiervon" bezieht sich auf ein Fragment, Stück oder eine Subregion einer FLINT Nukleinsäure oder eines Proteinmoleküls oder Analogons der vorliegenden Erfindung, so dass das Fragment 5 oder mehr Aminosäuren oder 10 oder mehr Nukleotide aufweist, die im Ausgangsproteinmolekül oder Ausgangsnukleinsäuremolekül fortlaufend vorkommen.
Der Ausdruck "Fusionsprotein" steht für ein Hybridproteinmolekül, das nicht in der Natur vorkommt und eine Translationsfusion oder enzymatische Fusion umfasst, worin zwei oder mehr unterschiedliche Proteine oder Fragmente hiervon kovalent an eine einzelne Polypeptidkette gebunden sind.
"Funktionelles Fragment" oder funktionell äquivalentes Fragment" bezieht sich, wie es hierin verwendet wird, auf eine Region oder ein Fragment eines Vollängenproteins der vorliegenden Erfindung, welche zur Bereitstellung einer im wesentlichen ähnlichen biologischen Aktivität wie ein Volllängenprotein der Erfindung in vivo und/oder in vitro bezüglich der Kapazität zur Hemmung der Apoptose fähig sind. Funktionelle Fragmente können durch Klonierungstechnologie hergestellt werden oder wie die natürlichen Produkte der alternativen Spleißmechanismen.
"Wirtszelle" bezieht sich auf jede eukaryontische oder prokaryontische Zelle, die zur Vermehrung und/oder Expression eines klonierten Gens oder einer Nukleinsäure fähig ist, die auf einem Vektor enthalten sind, welche in diese Wirtszelle beispielsweise durch Transformation oder Transfektion oder dergleichen eingeführt wurde.
Der Ausdruck "Hybridisierung" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf ein Verfahren, worin ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang über die Nukleotidbasenpaarung zusammengeht. "Selektive Hybridisierung" bezieht sich auf eine Hybridisierung unter Bedingungen hoher Stringenz. Das Ausmaß an Hybridisierung hängt vom Maß an Homologie, der Stringenz der Hybridisierung und der Länge der Hybridisierungsstränge ab.
"Isolierte Nukleinsäureverbindung" bezieht sich auf jede RNA oder DNA Sequenz, die unabhängig von der Konstruktion oder Synthese, örtlich getrennt von ihrer natürlichen Umgebung vorkommt.
Der Ausdruck "Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenzbedingungen benachteiligen die nicht homologe Basenpaarung. Bedingungen mit geringer Stringenz haben den gegenteiligen Effekt. Die Stringenz kann beispielsweise durch die Temperatur und die Salzkonzentration verändert werden.
"Gering stringente" Bedingungen umfassen beispielsweise eine Temperatur von 37°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 50 % und eine moderate bis geringe Salzkonzentration (SSC) oder alternativ dazu eine Temperatur von etwa 50°C oder weniger und eine moderate bis hohe Salzkonzentration (SSPE), beispielsweise 1 M NaCl.
"Hoch stringente" Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und können beispielsweise eine Temperatur von 42°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 20 % und eine geringe Salzkonzentration (SSC) oder alternativ dazu eine Temperatur von etwa 65°C oder weniger und eine geringe Salzkonzentration (SSPE) umfassen. Beispielsweise umfassen Bedingungen mit hoher Stringenz die Hybridisierung in 0,5 M NaHPO₄, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C (siehe beispielsweise F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band I, 1989, Green Inc. New York, bei 2.10.3).
"SSC" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 20fach SSC Stammlösung enthält 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0.
"SSPE" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 1 × SSPE Lösung enthält 180 mM NaCl, 9 mM Na₂HPO₄, 0,9 mM NaH₂PO₄ und 1 mM EDTA, pH 7,4.
"Im wesentlichen rein" meint in Bezug auf ein Peptid oder ein Protein, dass das Peptid oder Protein aus einer großen Fraktion aller anderen zellulären und nicht zellulären Moleküle, einschließlich anderer Proteinmoleküle abgetrennt ist. Eine im wesentlichen reine Präparation ist zumindest zu etwa 85 % rein und vorzugsweise mindestens zu etwa 95 % rein. Beispielsweise kann ein "im wesentlichen reines" Protein, wie dies hierin beschrieben ist, durch das IMAC Proteinreinigungsverfahren hergestellt werden.
Der Ausdruck "Vektor" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf eine Nukleinsäureverbindung, die zur Einführung von exogener oder endogener DNA in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor umfasst eine Nukleotidsequenz, die ein oder mehrere Proteinmoleküle kodieren kann. Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen im natürlichen Zustand oder nach einer rekombinanten Veränderung sind Beispiele für herkömmlich verwendete Vektoren.
Die hierin verwendeten Nukleotide und Aminosäureabkürzungen sind jene, die in der Technik und vom United States Patent and Trademark Office akzeptiert sind, wie dies in 37 C.F.R. 1.822 (b) (2) beschrieben ist.
Die Beschreibungen hierin, die sich auf eine Proteolyse von FLINT und FLINT Analoga zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 beziehen (reifes FLINT) sollen sich auf SEQ ID Nr. 3 (natives FLINT mit Signalsequenz) beziehen, worin die vergleichbare Region zwischen den Positionen 247 und 248 liegt.
Es wurde festgestellt, dass FLINT Polypeptide in vivo zwischen dem Argininrest an der Position 218 und dem Alaninrest an der Position 219 der SEQ ID Nr. 1 gespalten werden, wahrscheinlich durch eine Trypsin-ähnliche Protease. Ein Spaltprodukt dieser Reaktion umfasst die Reste 1 bis 218 der SEQ ID Nr. 1, die "FLINT Metabolit" genannt werden. Der FLINT Metabolit kann in vitro durch die Behandlung eines FLINT Polypeptids mit einer Trypsin-ähnlichen Protease, beispielsweise Thrombin, Trypsin oder einer anderen Serinprotease hergestellt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung von Analoga eines FLINT Polypeptids, die gegenüber einer Proteolyse zwischen den Position 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 resistent sind und eine biologische Aktivität behalten, ist hierin beschrieben. Die biologische Aktivität betrifft die Kapazität eines Analogons zur Bindung von FasL und/oder LIGHT und kann eine Hemmung der Apoptose in vivo und/oder in vitro umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Analoga eines FLINT Polypeptids, die gegenüber einer Proteolyse zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 resistent sind und eine biologische Aktivität behalten. Die biologische Aktivität betrifft die Fähigkeit eines Analogons zur Bindung von FasL und/oder LIGHT und kann eine Hemmung der Apoptose in vivo und/oder in vitro umfassen.
Bevorzugte FLINT Analoga liefern eine Halbwertszeit von mindestens 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 oder zwischen 50 % und 100 % größer als FLINT, wie dies durch das Verhältnis von Vollängen FLINT zu Verdauprodukten über die Zeit bestimmt wird, die den FLINT Metabolit und das Carboxylfragment umfassen (das heißt Reste 219-271 der SEQ ID Nr. 1), am bevorzugtesten ein FLINT Analogon, das eine Halbwertszeit von mindestens zweifach bis hundertfach oder mehr als FLINT aufweist.
FLINT Analoga umfassen eine oder mehrere primäre oder sekundäre Strukturänderungen, beispielsweise Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Inversionen, Additionen oder Veränderungen in den Glycosylierungsstellen oder -mustern und/oder Kombinationen hiervon, die die Proteolyse zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 und/oder die Geschwindigkeit hiervon verhindern oder verringern. Vorzugsweise treten diese Veränderungen bei oder nahe der Thrombin-ähnlichen Erkennungssequenz auf, im Fall von FLINT nämlich PTPR, vor allem bei oder nahe der PR Dipeptidsequenz an den Positionen 217 und 218 der SEQ ID Nr. 1. Wie der Fachmann versteht können die Reste bei oder nahe einer Erkennungsstelle auch die Empfindlichkeit des Substratproteins gegenüber der Proteolyse durch die Veränderung des Ladungsmilieus am aktiven Zentrum und/oder durch Erzeugung von Veränderungen durch sterische Behinderung in der Region des aktiven Zentrums beeinflussen.
Daher betrifft die Erfindung FLINT Analoga, die Aminosäureveränderungen in FLINT umfassen, vorzugsweise in der Region etwa von Position 214 bis Position 222 der SEQ ID Nr. 1 oder der vergleichbaren Region der SEQ ID Nr. 3, worin die Analoga gegenüber der Proteolyse an der Position 218 der SEQ ID Nr. 1 resistent sind.
Wie hierin erwähnt sind Protease-resistente FLINT Analoga solche, die Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Inversionen, Additionen oder Veränderungen in den Glykosylierungsstellen oder -mustern umfassen, die außerhalb des bevorzugten Fensters auftreten, das die Reste 214 bis 222 der SEQ ID Nr. 1 umfasst. Wie der Fachmann versteht können viele Substitutionen und/oder Veränderungen in der Sequenz oder Struktur eines Proteins ausgeführt werden ohne die biologische Aktivität des Proteins wesentlich zu beeinflussen. Beispielsweise ist die Durchführung von konservativen Aminosäuresubstitutionen oder der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere aus der selben Klasse der Aminosäuren, beispielsweise negativ geladenen Resten, positiv geladenen Resten, polar ungeladenen Resten und unpolaren Resten oder jede andere in der Technik annehmbare Klassifikation oft ohne Effekt auf die Funktion. Solche Veränderungen sollen innerhalb des Umfang des Erfindung liegen.
In einer Ausführungsform wird in der Region ein einziger Aminosäureaustausch ausgeführt, alternativ dazu werden in dieser Region mindestens zwei Austausche ausgeführt, alternativ dazu werden in dieser Region mindestens 3 Austausche ausgeführt und alternativ dazu werden in dieser Region mindestens 4 Austausche ausgeführt.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung FLINT Analogapolypeptide und Nukeinsäuren, die in Bezug auf eine prozentuale Identitätsähnlichkeit zu SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und/oder SEQ ID Nr. 3 definiert sind. Die Sequenzidentität bezieht sich auf einen Vergleich zwischen zwei Molekülen mittels einem in der Technik gut bekannten Standardalgorithmus. Obwohl jeder geeignete Sequenzvergleichsalgorithmus für diesen Zweck verwendet werden kann, soll diese Ausführungsform zur Erläuterung in Bezug auf den gut bekannten Smith-Waterman Algorithmus mittels SEQ ID Nr. 1 als Referenzsequenz zur Definition einer prozentualen Identität zu einer Vergleichssequenz beschrieben werden. Wenn die Sequenzidentität in Bezug auf ein Polypeptid verwendet wird, kann das gesamte Polypeptid oder eine definierte Subregion hiervon im Vergleich verwendet werden.
Die Wahl der Parameterwerte für Übereinstimmungen, Nicht-Übereinstimmungen und Insertionen oder Deletionen ist willkürlich. Ein bevorzugter Satz an Werten zur Verwendung mit dem Smith-Waterman Algorithmus ist im Ansatz der "maximalen Ähnlichkeitssegmente" beschrieben, der die Werte 1 für einen übereinstimmenden Rest und –1/3 für einen nicht übereinstimmenden Rest verwendet (siehe Waterman, Bulletin of Mathematical Biology, 46, 473-500, 1984). Die Insertionen und Deletionen (Indels) x werden folgendermaßen gewichtet: Xk = 1 + k/3worin k für die Anzahl an Resten in einer gegebenen Insertion oder Deletion steht.
Beispielsweise hat eine Vergleichssequenz, die 20 Substitutionen und 3 Insertionen relativ zu der Referenzproteinsequenz mit 250 Resten aufweist eine Identität von: [(1 × 250) – (1/3 × 20) – (1 + 3/3)]/250 = 96 %
FLINT Analoga der vorliegenden Verbindung können leicht auf biologische Aktivität und/oder Empfindlichkeit gegenüber Proteolyse getestet werden, wie dies hierin beschrieben ist, siehe beispielsweise Beispiele 11 und 12. Die biologische Aktivität kann entweder mit in vitro (siehe Beispiel 6) oder in vivo (siehe Beispiel 9) Modellen untersucht werden, wie dies hierin beschrieben ist.
FLINT Analoga sind bei der Bindung von FasL und/oder LIGHT aktiv. LIGHT, ein Vertreter der TNF Familie, ist ein membrangebundener Ligand, der bestimmte biologische Reaktionen auslöst. LIGHT kann eine Rolle bei der Immunmodulation spielen und scheint beim Eintritt des Herpes Virus beteiligt zu sein (siehe Zhai et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151, 1998, Montgomery et al. Cell, 87, 427-436, 1996). Lösliches LIGHT hemmt die Proliferation von verschiedenen Tumorzellen und scheint an die Rezeptoren LTβR und TR2 zu binden (auch als Herpes Virus Eintrittsvermittler HVEM bezeichnet). LIGHT wird stark in aktivierten Lymphozyten exprimiert und ruft eine Immunmodulation aus hämatopoetischen Zellen hervor. Beispielsweise stimuliert LIGHT die Sekretion von IFNγ. LIGHT induziert auch die Apoptose von Tumorzellen, die die LTβR und TR2/HVEM Rezeptoren exprimieren. Der cytotoxische Effekt von LIGHT, der durch IFNγ verstärkt wird, kann durch die Zugabe von löslichem LTβR-Fc oder TR2/HVEM-Fc blockiert werden.
Die vorliegende Erfindung betriff ferner die Verwendung des FLINT Analogons zur Bindung von LIGHT, wobei die T Zellaktivierung gehemmt wird. Die T Zellaktivierung kann chronisch supprimiert werden, falls dies vorteilhaft ist, beispielsweise nach einer Organtransplantation, um die Abstoßung zu verhindern, bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und bei der Behandlung der systemischen, entzündlichen Reaktionen.
LIGHT wird primär durch aktivierte T Lymphozyten gebildet. Wenn LIGHT an HVEM auf der Oberfläche von T Zellen bindet stimuliert es die T Zellproliferation (J.A. Harrop et al., J. Biol. Chem. 273, 27548-27556, 1998).
FLINT Analoga der Erfindung können durch rekombinante Techniken oder durch direkte chemische Synthese hergestellt werden. Die Analoga können auch durch rekombinante DNA Mutagenesetechniken hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Siehe beispielsweise K. Struhl, "Reverse Biochemistry: Methods and applications for synthesizing yeast Proteins in vitro", Meth. Enzymol. 194, 520-535. In einem bevorzugten rekombinanten Verfahren wird die ortsspezifische Mutagenese verwendet, um definierte Veränderungen in die Region 214-222 der SEQ ID Nr. 1 oder einer vergleichbaren Region der SEQ ID Nr. 3 einzuführen.
FLINT Analoga umfassen auch modifizierte Derivate hiervon, worin eine oder mehrere Polyethylenglycolgruppen (hierin später "PEG" Gruppen) an den N-Terminus gebunden sind oder an Amingruppen oder Thiolgruppen in den Aminosäureseitenketten. Geeignete PEG Gruppen haben im allgemeinen ein Molekulargewicht zwischen etwa 5000 und 20000 Atommasseeinheiten. Verfahren zur Herstellung von PEGylierten Polpeptiden sind in Mumtaz und Bachawat, Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 28: 346 (1991) und Franciset et al., International Journal of Hematology 68:1 (1998) beschrieben.
Eine weitere Ausführungsform eines FLINT Analogons ist ein Molekül, das zwei oder mehr modifizierte oder unmodifizierte FLINT Analoga umfasst, beispielsweise ein dimerisiertes FLINT Analogon, wie R218Q. Homodimere, die zwei identische Analogauntereinheiten umfassen (beispielsweise R218Q(2)) und Heterodimere, die zwei nicht-identische Analogauntereinheiten umfassen (beispielsweise R218Q/R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q) werden in Betracht gezogen. Die Dimerisierung kann mittels des PEG Polymerkettenverfahrens erreicht werden, wie dies in Espat et al., Journal of Surgical Research 59: 153 (1995) beschrieben ist oder durch eine C-terminale Fusion an eine Domäne, die eine Dimerisierung induziert, wie Leucinzipper, wie dies in O'Shea et al., Science 254: 539 (1991) beschrieben ist.
Fusionsproteine, die ein FLINT Analogon umfassen, werden hierin beschrieben. "Fusionsprotein" bezeichnet ein Hybridproteinmolekül, das nicht in der Natur gefunden wird, welches eine Translationsfusion oder enzymatische Fusion umfasst, worin zwei oder mehr unterschiedliche Proteine oder Fragmente hiervon kovalent an eine einzelne Polypeptidkette gebunden sind. Humanes Serumalbumin und die C-terminale Domäne von Thrombopoetin sind Beispiele für Proteine, die mit einem FLINT Analogon fusioniert werden können. Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen sind in EP 0 394 827 A , Tranecker et al., Nature 331: 84 (1988) und Fares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4304 (1192) beschrieben.
Ein FLINT Analogonfusionsprotein umfasst zwei Proteinsegmente, die miteinander durch eine Peptidbindung fusioniert sind. Das erste Proteinsegment besteht aus mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 oder 275 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten eines Analogons der vorliegenden Erfindung (das heißt Protease-resistente SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3). Das erste Protein kann alternativ ein Vollängenanalogon der vorliegenden Erfindung sein und kann N-terminal oder C-terminal sein.
Das zweite Protein eines FLINT Analogonfusionsproteins kann ein Volllängenprotein oder ein Proteinfragment sein. Proteine, die herkömmlich in Fusionsproteinen verwendet werden, umfassen β Galactosidase, β-Glucuronidase, grün fluoreszierendes Protein (GFP), Thrombopoetin (TPO), Glutathion-S-transferase (GST), Luciferase, Meerrettichperoxidase und Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). Die Epitopanhänge können in Fusionsproteinkonstruktionen verwendet werden, einschließlich Histidin (His) Anhänge, FLAG Anhänge, Influenzahämagglutinin (HA) Anhänge, Myc Anhänge, VSV-G Anhänge und Thioredoxinanhänge. Andere Fusionskonstruktionen können Maltosebindeprotein, S-Tag, Lex A DNA Bindedomäne, GAL4 DNA Bindedomänenfusionen und Herpes simplex Virus BP16 Proteinfusionen umfassen.
Die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung können glykosyliert oder unglykosyliert sein. Ein glykosyliertes Polypeptid ist mit einem oder mehreren Monosacchariden oder Oligosacchariden modifiziert. Ein Monosaccharid ist ein chirales Polyhydroxyalkanol oder Polyhydroxyalkanon, das typischerweise in Hemiacetalform existiert. Ein "Oligosaccharid" ist ein Polymer mit etwa 2 bis etwa 10 Monosacchariden, die im allgemeinen durch Acetalbindungen verbunden sind. Ein Typ an Glykosylgruppe, der her kömmlich in glykosylierten Proteinen gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure. Ein glykosyliertes Polypeptid kann N-glykosyliert und/oder O-glykosyliert sein, vorzugsweise N-glykosyliert.
Der Ausdruck "N-glykosyliertes Polypeptid" bezieht sich auf Polypeptide, die ein oder mehrere NXS/T Motive aufweisen, worin das Stickstoffatom im Seitenkettenamid von Asparagin kovalent an eine Glykosylgruppe gebunden ist. "X" bezieht sich auf jeden natürlich vorkommenden Aminosäurerest außer Prolin. Die "natürlich vorkommenden Aminosäuren" sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Serin, Threonin, Cystein, Methionin, Lysin, Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutamin, Asparagin, Phenylalanin, Histidin, Tyrosin und Tryptophan. N-glykosylierte Proteine sind optional O-glykosyliert.
Der Ausdruck "O-glykosyliertes Polypeptid" bezieht sich auf Polypeptide mit einem oder mehreren Serinen und/oder Threonin, worin das Sauerstoffatom in der Seitenkette kovalent an eine Glykosylgruppe gebunden ist. O-glykosylierte Proteine sind optional N-glykosyliert.
Glykosylierte Polypeptide und Analoga der Erfindung können rekombinant durch Expression eines Gens, das für ein Polypeptid kodiert, in einer geeigneten Säugerwirtszelle hergestellt werden, was zur Glykosylierung der Seitenkettenamide führt, die in zugänglichen NXT/S Motiven auf der Polypeptidoberfläche gefunden werden und von Seitenkettenalkoholen der auf der Oberfläche zugänglichen Serine und Threonine. Spezifsche Verfahren zur rekombinanten Expression von Genen in Säugerzellen werden hierin später bereitgestellt. Andere Verfahren zur Herstellung von glykosylierten Proteinen sind in EP 0 640 619 A von Elliot und Burn beschrieben. Unglykosylierte Polypeptide können rekombinant durch Expression eines Gens, das für ein Polypeptid kodiert, in einer geeigneten prokaryontischen Wirtszelle hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren, beispielsweise cDNAs, DNAs oder RNAs, die für ein FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kodieren und Vektoren, die diese Nukleinsäuren enthalten. Der Fachmann versteht, dass diese Nukleinsäuren synthetisch durch die Mutation einer Nukleinsäurematrize, die für FLINT kodiert hergestellt werden können, beispielsweise durch die Einführung geeigneter Punktmutationen in eine cDNA, die für FLINT kodiert durch mehrere geeignete Mutagenesetechniken, die dem Fachmann bekannt sind, um ein Protease-resistentes oder im wesentlichen Proteaseresistentes Analogon der vorliegenden Erfindung herzustellen. Alternativ dazu können die Nukleinsäuren synthetisch de novo basierend auf der Kenntnis des genetischen Codes und des bestimmten Analogons der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3 hergestellt werden, in jemanden interessiert ist. Die Codonpräferenz kann beim Entwerfen einer geeigneten Nukleinsäure in Betracht gezogen werden.
Beispielsweise werden die Aminosäuresequenzen der Analoga der vorliegenden Erfindung an anderer Stelle in der Anmeldung beschrieben, die Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen an und um die Position 218 der SEQ ID Nr. 1 oder an anderer Stelle in der FLINT Sequenz umfassen. Der Fachmann versteht, dass die Verwendung des genetischen Codes in Kombination mit dem Wissen der bevorzugten Codonverwendung für die Beschreibung ausreicht und die Konstruktion einer beliebigen Anzahl an Nukleinsäuren zu ermöglichen, die für jedes bestimmte gewünschte Analogon kodieren. Beispielsweise ist das Codon, das für Arginin an der Position 218 der SEQ ID Nr. 1 in nativem FLINT kodiert, "agg". Eines der erfindungsgemäßen Analoga verändert das Arginin an dieser Position zu Glutamin, das durch die Veränderung des Codons von "agg" zu "caa" oder "cag" erreicht werden kann. Die Wahl, welches Codon für eine bestimmte Aminosäure verwendet werden kann, kann auf dem Wissen der bevorzugten Codonverwendung und/oder Versuch und Irrtum in Bezug auf die Expression des Analogons be ruhen. Andere Analoga, die von der Erfindung in Betracht gezogen werden, sind beschreibend und werden auf dieselbe Weise ermöglicht.
Eine FLINT cDNA kann durch RT-PCR mittels herkömmlicher Techniken synthetisiert werden. Beispielsweise wird die PolyA RNA aus einem Gewebe mittels Standardverfahren hergestellt, von dem bekannt ist, dass es das FLINT Gen exprimiert (beispielsweise Menschenlunge). Die Erststrang FLINT cDNA Synthese wird in einer reversen Transkriptasereaktion mittels einer FLINT Sequenz erreicht, die von einem "stromabwärts" liegenden Primer abgeleitet wird. Ein im Handel erhältlicher Kit, wie GENEAMP von Perkin Elmer kann verwendet werden. In einer anschließenden PCR werden FLINT spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimer verwendet, um die cDNA zu amplifizieren. Die amplifizierte Probe kann dann durch Agarosegelelektrophorese zur Überprüfung der Länge des amplifizierten Fragments analysiert werden.
FLINT cDNA, die auf diese Weise erzeugt wird, wird als Matrize zur Einführung geeigneter Punktmutationen verwendet (das heißt Konstruktion von FLINT Analoga cDNAs). Ein geeignetes Protokoll wird im Detail in "Current Protocols in Molecular Biology", Band 1, Abschnitt 8.5.7 (Verleger John Wiley and Sons, Inc.) beschrieben. Kurz gesagt werden synthetische Oligonukleotide entworfen, um eine oder mehrere Punktmutationen an einem Ende eines amplifizierten Fragments einzuführen, beispielsweise an der Position 218 der SEQ ID Nr. 1. Nach der Erststrang PCR werden die amplifizierten Fragmente, die die Mutation umfassen, miteinander aneliert und durch gemeinsam geprimte Synthese verlängert. Nach der Anelierung erfolgt ein zweiter PCR Schritt unter Verwendung von 5' vorwärts und 3' rückwärts Endprimern, bei dem das gesamte mutagenisierte Fragment amplifiziert wird und zur Subklonierung in den geeigneten Vektor fertig ist.
Der Fachmann versteht, dass die Degeneriertheit des genetischen Codes in manchen Fällen mehrere Codons für eine gegebene Aminosäure bereitstellt. Alle solchen Nukleinsäuresequenzvarianten sollen im Umfang der Erfindung liegen.
Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Information, wie die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3 oder der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 oder Varianten hiervon kann ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das für ein FLINT Analogon kodiert, mittels gut bekannter Verfahren erhalten werden.
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können in Form von RNAS vorliegen, wie mRNA, hnRNA oder jeder anderen Form oder in Form von DNA, einschließlich unter anderem cDNA und genomischer DNA, die durch Klonierung erhalten oder synthetisch hergestellt wurde oder jede Kombination hiervon. Die DNA kann dreisträngig, doppelsträngig oder einzelsträngig oder jede Kombination hiervon sein. Jeder Teil zumindest eines Strangs der DNA oder RNA kann der kodierende Strang sein, der auch als Sense-Strang bekannt ist oder es kann der der nicht-kodierende Strang sein, der auch als Antisense-Strang bezeichnet wird.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner isolierte Nukleinsäuren, die für ein proteaseresistentes FLINT Analogon kodieren und die unter selektiven Bedingungen an ein hierin beschriebenes und/oder in Betracht gezogenes Polynukleotid hybridisieren, beispielsweise SEQ ID Nr. 2 und/oder Derivate hiervon.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner isolierte Nukleinsäuremoleküle, die FLINT Analogonpolynukleotide umfassen, worin die Polynukleotide komplementär zu den erfindungsgemäßen Polynukleotiden sind. Komplementäre Sequenzen bilden Basenpaare über die gesamte Länge mit solchen Poly nukleotiden (das heißt weisen 100 % Sequenzidentität über ihre gesamte Länge auf). Komplementäre Basen assoziieren durch Wasserstoffbindung zu doppelsträngigen Nukleinsäuren. Beispielsweise sind die folgenden Basenpaare komplementär: Guanin und Cytosin, Adenin und Thymin und Adenin und Uracil. (Siehe beispielsweise Ausubel, obige Litertaurstelle oder Sambrook, obige Literaturstelle).
Konstruktion von Nukleinsäuren
Die isolierten Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können mittels (a) Standardrekombinationsverfahren, (b) Synthesetechniken, (c) Reinigungstechniken oder Kombinationen hiervon hergestellt werden, wie dies in der Technik bekannt ist.
Die Nukleinsäuren können bequemerweise Sequenzen zusätzlich zu einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfassen. Beispielsweise kann eine Multiklonierungsstelle, die ein oder mehrere Restriktionsendonukleasen umfasst, in die Nukleinsäure inseriert werden, um bei der Isolierung des Polynukleotids zu helfen. Beispielsweise liefert eine Hexahistidinmarkersequenz ein bequemes Mittel zur Reinigung der erfindungsgemäßen Proteine.
Rekombinante Verfahren zur Konstruktion von Nukleinsäuren
Die isolierten Nukleinsäurezusammensetzungen der Erfindung, wie RNA, cDNA, genomische DNA oder ein Hybrid hiervon können aus biologischen Quellen mittels mehrerer dem Fachmann bekannten Klonierungsverfahren erhalten werden. In manchen Ausführungsformen werden Oligonukieotidsonden, die unter stringenten Bedingungen selektiv hybridisieren, zur Identifizierung der gewünschten cDNA oder genomischen DNA Bank verwendet. Die Isolierung von RNA und die Konstruktion von cDNA und genomischen Banken ist dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Ausubel, obige Literaturstelle oder Sambrook, obige Literaturstelle).
Nukleinsäurescreenings- und Isolierungsverfahren
Eine cDNA Bank oder genomische Bank kann mittels einer Sonde auf der Grundlage der Sequenz eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung gescreent werden, wie dies hierin beschrieben ist. Die Sonden können zur Hybridisierung mit genomischen DNA oder cDNA Sequenzen zur Isolierung von homologen Genen im gleichen oder einem unterschiedlichen Organismus verwendet werden. Der Fachmann erkennt, dass unterschiedliche Ausmaße an Stringenz der Hybridisierung im Test verwendet werden können und entweder die Hybridisierung oder das Waschmedium stringent sein können. Wenn die Bedingungen für die Hybridisierung stringenter werden, muss ein größeres Ausmaß an Komplementarität zwischen der Sonde und dem Ziel vorhanden sein, damit eine Doppelstrangbildung auftritt. Das Ausmaß der Stringenz kann durch Temperatur, Ionenstärke, pH und dem Vorkommen eines teilweise denaturierenden Lösemittels kontrolliert werden, wie Formamid. Beispielsweise variiert die Stringenz der Hybridisierung bequemerweise durch die Veränderung der Polarität der Reaktionslösung beispielsweise durch die Veränderung der Formamidkonzentration im Bereich von 0 % bis 50 %. Das Ausmaß an Komplementarität (Sequenzidentität), das für eine detektierbare Bindung erforderlich ist, variiert gemäß der Stringenz des Hybridisierungsmediums und/oder Waschmediums. Das Ausmaß an Komplementarität ist optimalerweise 100 %, jedoch sollte verstanden werden, dass geringe Sequenzvariationen in den Son den und Primern durch die Verringerung der Stringenz des Hybridisierungsmediums und/oder Waschmediums kompensiert werden können.
Verfahren zur Amplifizierung der RNA oder DNA sind in der Technik gut bekannt und können gemäß der vorliegenden Erfindung ohne unmäßige Experimente auf der Grundlage der hierin bereitgestellten Beschreibung und Anleitung verwendet werden. Bekannte Verfahren der DNA oder RNA Amplifizierung umfassen unter anderem die Polymerasekettenreaktion (PCR) und verwandte Amplifizierungsprozesse (siehe beispielsweise US 4 683 195 A , US 4 683 202 A , US 4 800 159 A , US 4 965 188 A von Mullis et al., US 4 795 699 A und US 4 921 794 A von Tabor et al., US 5 142 033 A von Innis, US 5 122 464 A von Wilson et al., US 5 091 310 A von Innis, US 5 066 584 A von Gyllensten et al., US 4 889 818 A von Gelfand et al. US 4 994 370 A von Silver et al., US 4 766 067 A von Biswas, US 4 656 134 A von Ringold) und RNA-vermittelte Amplifikation, die eine Antisense-RNA zur Zielsequenz als Matrize für die doppelsträngige DNA Synthese verwendet ( US 5 130 238 A von Malek et al., mit dem Handelsnamen NASBA), Ausubel, siehe obige Literaturstelle und Sambrook, siehe obige Literaturstelle.
Beispielsweise kann die Polymerasekettenreaktionstechnologie (PCR) zur Amplifizierung der Polynukleotidsequenzen und der verwandten Gene direkt aus den genomischen DNA, cDNA Banken oder klonierter DNA oder RNA verwendet werden. Die PCR und andere in vitro Amplifizierungsmethoden sind beispielsweise auch brauchbar zur Klonierung von Nukleinsäuresequenzen, die für zu exprimierende Proteine kodieren, um Nukleinsäuren zur Verwendung als Sonden zur Detektion des Vorkommens gewünschter mRNA in Proben herzustellen, zur Nukleinsäuresequenzierung oder für andere Zwecke. Beispiele für Techniken, die zur Anleitung von Fachleuten bei in vitro Amplifikationsverfahren ausreichen, finden sich in Berger, Sambrook und Ausubel, wie auch Mullis et al., US 4 683 202 A (1987) und Innis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Herausgeber, Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Im Handel erhältliche Kits für die genomische PCR Amplifizierung sind in der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Das T4 Gen 32 Protein (Boehringer Mannheim) kann zur Verbesserung der Ausbeute an langen PCR Produkten verwendet werden.
Syntheseverfahren zur Konstruktion von Nukleinsäuren
Die isolierten Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können durch direkte chemische Synthese durch Verfahren hergestellt werden, wie dem Phosphotriesterverfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979), dem Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol.68: 109-151 (1979), dem Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (1981), dem Festphasenphosphoramidittriesterverfahren, das von Beaucage und Caruthers, Tetra. Letts. 22 (20): 1859-1862 (1981) beschrieben ist, beispielsweise mittels eines automatisierten Synthesegeräts, wie dies in Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984) beschrieben ist und dem Festphasenverfahren von US 4 458 066 A . Die chemische Synthese bildet im allgemeinen ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das durch DNA Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch die Polymerisation mit einer DNA Polymerase unter Verwendung des Einzelstrangs als Matrize in eine doppelstrangige DNA umgewandelt werden kann. Der Fachmann erkennt, dass die chemische Sequenz von DNA auf etwa 100 oder mehr Basen beschränkt ist und längere Sequenzen durch die Ligation von kürzeren Sequenzen erhalten werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die die isolierten Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit den rekombinanten Vektoren genetisch verändert sind und die Bildung von FLINT Analoga, wie dies in der Technik bekannt ist (siehe Sambrook et al., 1989, Ausubel et al., 1987-1998).
"Vektor" bezieht sich auf eine Nukleinsäureverbindung, die zur Einführung von exogener oder endogener Nukleinsäure in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor umfasst eine Polydesoxynukleotidsequenz, die für ein FLINT Analogon oder ein Fusionsprotein hiervon kodiert. Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen sind in einem natürlichen Zustand oder nach einer rekombinanten Veränderung nicht-beschränkende Beispiele von herkömmlich verwendeten Vektoren zur Herstellung rekombinanter Vektoren, die zumindest ein gewünschtes isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassen.
"Wirtszelle" bezieht sich auf jede eukaryontische, prokaryontische oder andere Zelle oder Pseudozelle oder Membran-enthaltendes Konstrukt, welche zur Vermehrung und/oder Expression einer isolierten Nukleinsäure geeignet sind, die in eine Wirtszelle durch jedes geeignete in der Technik bekannte Mittel eingeführt (beispielsweise Transformation oder Transfektion oder dergleichen) oder zur Expression einer endogenen Polydesoxynukleinsäure induziert wurden. Die Zelle kann Teil eines Gewebes oder Organismus sein, in Kultur isoliert oder in jeder anderen geeigneten Form vorliegen.
Die Nukleinsäuren der Erfindung, einschließlich cDNAs, können optional an einen Vektor gebunden werden, der einen Selektionsmarker zur Vermehrung in einem Wirt enthält. Im allgemeinen wird ein Plasmidvektor in einen Niederschlag, wie einem Caiciumphosphatniederschiag oder in einem Komplex mit einem geladenen Lipid (beispielsweise Lipofectamin) eingebracht. Falls der Vektor ein Virus ist, kann es in vitro mittels einer geeigneten Verpackungszelllinie verpackt und dann in die Wirtszellen transduziert werden.
Das DNA Insert kann operativ an einen geeigneten Promotor gebunden werden wie an den PL Promotor des Phagen Lamda, dem T7 Phagenpromotor, den E. coli lac, trp und tac Promotoren, den frühen und späten SV40 Promotoren und Promotoren der retroviralen LTRs oder jeden anderen geeigneten Promotor. Andere geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Die Expressionskonstrukte enthalten ferner Stellen zur Transkriptionsinitiation, -termination und in der transkribierten Region eine Ribosomenbindungsstelle zur Translation. Der kodierende Teil der reifen Transkripte, die durch die Konstrukte exprimiert werden, umfasst vorzugsweise eine Translationsinitiation am Beginn und ein Terminationscodon (beispielsweise UAA, UGA oder UAG) geeignet am Ende der zu translatierenden mRNA positioniert, wobei UGA und UAA zur Expression in Säugerzellen oder eukaryontischen Zellen bevorzugt sind.
Die Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise mindestens einen Selektionsmarker. Solche Marker umfassen beispielsweise Dihydrofolatreduktase, Neomycin-, Zeocin-, Hygromycin B- oder Puromycinresistenz für die eukaryontische Zellkultur und Kanamycin- oder Ampicillinresistenzgene zur Kultivierung in E. coli und anderen Bakterien oder Prokaryonten. Repräsentative Beispiele geeigneter Wirte umfassen unter anderem Bakterienzellen, wie E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis und Salmonella typhimurium Zellen, Hefezellen, wie Saccaromyces cerevisiae, Saccharomyces pombe oder Pichia pastoris, Insektenzellen, wie Drosophila S2, Spodoptera Sf9 Zellen oder Sf21 und High Five (BTI-TN-5B1-4) Zellen, Tierzellen, wie 293, 293EBNA, CHO, COS und COS7, BHK, AV12, 3T3, HeLa und Bowes Melanomzellen und Pflanzenzellen. Geeignete Kulturmedien und Bedingungen für die oben beschriebenen Wirtszellen sind in der Technik bekannt. Vektoren, die zur Verwendung in Bakterien bevorzugt sind, umfassen pET15 und pET30, die von Novagen erhältlich sind, pQE70, pQE60 und pQE-9, die von Qiagen erhältlich sind, pBS Vektoren, Phagscript Vektoren, Bluescript Vektoren, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, die von Stratagene erhältlich sind und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, die von Pharmacia erhältlich sind. Bevorzugte eukaryontische Vektoren umfassen pWLNEO, pSV''CAT, pOG44, pXT1 und pSG sind von Stratagene erhältlich, pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL sind von Pharmacia erhältlich und der herkömmlich verwendete Vektor pcDNA3.1, der von Invitrogen erhältlich ist. Andere geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt.
Die Einführung eines Vektorkonstrukts in eine Wirtszelle kann durch eine Calciumphosphattransfektion, eine DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, durch kationische Lipide vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder andere Verfahren bewirkt werden. Solche Verfahren sind in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Sambrook, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 1-4 und 16-18 und Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 1, 9, 13, 15 und 16.
Fusionsproteine, die FLINT Analoga umfassen, sind hierin ebenfalls beschrieben. Beispielsweise kann eine Region zusätzliche Aminosäuren, beispielsweise ein Hexahistidinanhang (His)₆ an den Amino- oder Carboxyterminus eines FLINT Analogons hinzugefügt werden, um die Reinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor der schließlichen Reinigung eines Analogons entfernt werden, falls dies gewünscht ist. Solche Verfahren sind in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Sambrook, obige Literaturstelle, Kapitel 17.29-17.42 und 18.1-18.74 und Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 16,17 und 18.
Expression von FLINT Analoga in Wirtszellen
Unter Verwendung der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung kann man ein FLINT Analogon in einer rekombinant veränderten Zelle exprimieren, wie Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen.
Der Fachmann kennt mehrere Expressionssysteme, die zur Expression einer Nukleinsäure verfügbar sind, die für ein FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kodiert. Es wird kein Versuch unternommen, die verschiedenen Verfahren im Detail zu beschreiben, die zur Expression von Proteinen in Prokaryonten oder Eukaryonten bekannt sind.
Kurz zusammengefasst wird die Expression von isolierten Nukleinsäuren, die für FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kodieren, typischerweise erreicht durch die operative Verknüpfung der DNA oder cDNA, die für ein Analogon kodieren, mit einem Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist), wonach ein Einbau in einen Expressionsvektor erfolgt. Die Vektoren können zur Replikation und Integration in entweder Prokaryonten oder Eukaryonten geeignet sein. Typische Expressionsvektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Initiationssequenzen und Promotoren, die zur Regulation der Expression der DNA brauchbar sind, die ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert. Um eine starke Expression eines klonierten Gens zu erhalten, ist es erwünscht, Expressionsvektoren zu konstruieren, die mindestens einen starken Promotor zur Transkriptionssteuerung, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptions- Translationsterminator enthalten. Der Fachmann erkennt, dass Modifizierungen eines erfindungsgemäßen Proteins ohne Zerstörung der biologischen Aktivität ausgeführt werden können. Einige Modifizierungen können ausgeführt werden, um die Klonierung, Expression oder den Einbau des Zielmoleküls in ein Fusionsprotein zu erleichtern. Solche Modifikationen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise ein Methionin, das am Aminoterminus unter Bereitstellung einer Initiationsstelle angefügt wird oder zusätzliche Aminosäuren (beispielsweise Poly His), die an einem der Enden unter Bildung bequem liegender Restriktionsschnittstellen oder Terminationskodons oder Reinigungssequenzen liegen können.
Expression in Prokaryonten
Prokaryontische Zellen können als Wirte zur Expression von FLINT Analoga verwendet werden. Prokaryonten werden am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert, jedoch können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden. Herkömmlich verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen, die hierin definiert sind, um Promotoren für die Transkriptionsinitiation, optional mit einem Operator, zusammen mit Ribosomenbindungssequenzen einzubauen, umfassen die herkömmlich verwendeten Promotoren, wie die beta Lactamase (Penicillinase) und Lactose (lac) Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)), das Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)), den T7 Phagenprornotor (F.W. Studier, Methods in Enzymology, 185, 60-89, (1990) und den von Lambda stammenden PL Promotor und N-Gen Ribosomenbindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292: 128 (1981)). Der Einbau von Selektionsmarkern in DNA Vektoren, die in E. coli transfiziert werden, ist ebenfalls brauchbar. Beispiele für solche Marker umfassen Gene, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol oder Kanamycin spezifizieren.
Der Vektor wird ausgewählt, um eine Einführung in die geeignete Wirtszelle zu erlauben. Bakterielle Vektoren haben typischerweise einen Plasmid- oder Phagen-ursprung. Geeignete Bakterienzellen werden mit Phagenvektorpartikeln infiziert oder mit nackter Phagenvektor DNA transfiziert. Falls ein Plasmidvektor verwendet wird, werden die Bakterienzellen mit der Plasmidvektor DNA transformiert. Expressionssysteme zur Expression eines Proteins der vorliegenden Erfindung sind mittels Bacillus subtilis und Salmonella erhältlich (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983), Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)).
Expression in Eukaryonten
Dem Fachmann ist eine Vielzahl an eukaryontischen Expressionssystemen bekannt, wie Hefe, Insektenzelllinien, Pflanzen- und Säugerzellen. Wie im folgenden erklärt, kann eine Nukleinsäure, die für ein FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kodiert, in diesen eukaryontischen Systemen exprimiert werden.
Die Synthese von heterologen Proteinen in Hefe ist gut bekannt. F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laborstory (1982) ist eine gut bekannte Arbeit, die die verschiedenen Verfahren beschreibt, die zur Herstellung von Protein in der Hefe verfügbar sind. Zwei zur Herstellung von eukaryontischen Proteinen verbreitet verwendete Hefen sind Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Vektoren, Stämme und Protokolle für die Expression in Saccharomyces und Pichia sind in der Technik bekannt und von kommerziellen Herstellern erhältlich (beispielsweise Invitrogen). Geeignete Vektoren haben gewöhnlich Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder Alkoholoxidase, und einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen und dergleichen, wie dies gewünscht ist.
Ein FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung, das in Hefe exprimiert wird, kann durch Standardproteinisolierungstechniken isoliert werden. Die Verfolgung des Reinigungsverfahrens kann mittels SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blot Techniken oder Radioimmuntest von anderen Standardimmuntesttechniken, wie ELISA, erreicht werden.
Die für FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung kodierenden Nukleinsäuresequenzen können auch in verschiedene Expressionsvektoren zur Transfektion in Zellkulturen von beispielsweise Säuger-, Insekten- oder Pflanzenursprung ligiert werden. Beispielsgemäß für Zellkulturen, die zur Herstellung der Peptide brauchbar sind, sind Säugerzellen. Säugerzellsysteme liegen oft in Form von Monoschichten von Zellen vor, obwohl Säugerzellsuspensionen auch verwendet werden können. Es wurden viele geeignete Wirtszellinien entwickelt, die intakte Proteine exprimieren und diese umfassen AV12, HEK293, BHK21 und CHO Zellinien. Die Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen umfassen, wie einen Replikatiosursprung, einen Promotor (beispielsweise vorzugsweise den CMV Promotor, einen HSV tk Promotor oder den pgk Promotor (Phosphoglyceratkinase), einen Enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) und Prozessierungsinformationsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen (beispielsweise eine Poly-A-Anfügungsstelle des Rinderwachstumshormons) und Transkriptionsterminationssequenzen. Andere Tierzellen, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen brauchbar sind, sind beispielsweise erhältlich von American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (8. Ausgabe 1994).
Geeignete Vektoren für die Expression eines FLINT Analogons der vorliegenden Erfindung in Insektenzellen werden gewöhnlich vom SF9 Baculovirus abgeleitet. Geeignete Insektenzellinien umfassen Zellinien von Moskitolarven, Seidenspinnerraupe, Heerwurm, Motte und Drosophilazellinien, wie eine Schneiderzellinie (siehe Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365 (1987).
Wie bei der Hefe werden bei der Verwendung von Wirtszellen höherer Tiere oder Pflanzen die Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminationssequenzen typischerweise in den Vektor eingearbeitet. Ein Beispiel für eine Terminatorsequenz ist die Polyadenylierungssequenz des Rinderwachstumshormongens. Die Sequenzen für die genaue Prozessierung des Transkripts können ebenfalls eingearbeitet werden. Ein Beispiel für eine Spleißsequenz ist das VP1 Intron von SV40 (Sprague et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Zusätzlich können Gensequenzen zur Kontrolle der Replikation in der Wirtszelle in den Vektor eingearbeitet werden, wie die, die in Vektoren vom Rinderpapillomavirus gefunden werden. M. Saveria-Campo, Bovine Papillorna Virus DNA, a Eukaryontic Cloning Vector in DNA Cloning Vol. II, a Practical Approach, D.M. Glover, Herausgeber, IRL Press, Arlington, VA, Seiten 213-238 (1985).
Proteinreinigung
Ein FLINT Analogon der vorliegenden Erfindung kann aus rekombinanten Zellen, die ein Analogon exprimieren (beispielsweise E. coli, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellkulturen) durch gut bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, einschließlich immobilisierter Metallionenchelatpeptidtechnologie, "IMAC", wie dies in US 4 569 974 A beschrieben ist, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylappatitchromatographie und Lektinchromatographie. Am bevorzugtesten wird für die Reinigung Hochleistungsflüssigchromatographie ("HPLC") verwendet.
Erfindungsgemäße Analoga können durch chemische Syntheseverfahren oder durch rekombinante Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt werden, einschließlich Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen. Solche Methoden sind in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Sambrook, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 17.37-17.42, Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 10, 12, 13, 16, 18 und 20. In Abhängigkeit des verwendeten Wirts können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Zusätzlich umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide auch einen initial modifizierten Methioninrest, in manchen Fällen als Ergebnis eines durch den Wirt vermittelten Prozesses.
Therapeutische Anwendungen
Das Apoptose hervorrufende Molekül FasL ist ein wichtiger homeostatischer Regulator des Immunsystems, der eine autoreaktive periphere T Zelldeletion und Schwächung der zellvermittelten Immunreaktion auslöst (das heißt Aktivierungs-induzierter Zelltod). FasL scheint auch ein wichtiger apoptotischer Stimulus bei Nicht-Immunzellen unter bestimmten Bedingungen zu sein (beispielsweise Entzündung). FasL existiert in zwei Formen: Membrangebunden und sekretiert. Das letztere stammt von einer proteolytischen Spaltung und spielt wahrscheinlich eine zusätzliche Rolle bei der Anziehung von Neurophilen. FLINT bindet beide Formen von FasL, hemmt FasL Interaktionen mit dem membrangebundenen Fas Rezeptor und mit LIGHT, einem sekretierten Aktivator von T Zellen und ist möglicherweise auch ein Auslöser für bestimmte Krebszellen, durch Apoptose zu sterben. Eine konstitutive Zelloberflächenexpression von FasL auf bestimmten Geweben verleiht einen Immunprevilegstatus, so dass die zellvermittelte Immunität nicht oder nur schwach auftritt (aufgrund einer Zerstörung von eindringenden Immunzellen, die auf ihrer Oberfläche Fas tragen). Die FasL Expression ist möglicherweise in allen anderen Geweben reguliert, wobei Fas und Fas Signalweginhibitoren (beispielsweise FLIP, FAIM) ebenfalls hoch reguliert sind.
Im folgenden sind einige der Faktoren und/oder Zustände aufgeführt, die die FasL Expression bei Menschen regulieren: Entzündung (beispielsweise akute Lungenverletzung), Carzinogenese (beispielsweise Melanom, Koloncarzinom), Virusinfektion (beispielsweise Hepatitis C, HIV), Autoimmunstimulatoren (beispielsweise Colitis ulcerosa, Hashimoto Thyreoiditis) und Ischämie/Reperfusion (beispielsweise Spinalstrangverletzung). Unzweifelhaft existieren viele andere Regulatoren der FasL Expression und es ist wahrscheinlich, dass die FasL Expression und Sekretion in jedem anderen Gewebe unter bestimmten Bedingungen induziert wird.
Die klinische Brauchbarkeit für FLINT Analoga dürfte substanziell sein. Viele Krankheiten und/oder Zustände, die FasL/Fas involvieren, sind potententiell einer Therapie mit FLINT Analogon zugänglich. Beispiele für geeignete Erkrankungen und/oder Zustände umfassen:
Entzündliche/autoimmune Erkrankungen – Rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Graft-versus-Host Erkrankung, Insulin-abhängiger Diabetes, SIRS/Sepsis MODS, Pankreatitis, Psoriasis, multiple Sklerose, Hashimoto Thyreoiditis, Grave Erkrankung, Transplantatabstoßung, SLE, autoimmune Gastritis und fibrotische Lungenerkrankung.
Infektionskrankheiten – HIV induzierte Lyphopenie, fulminante virale Heptitis B/C, chronische Hepatitis/Cirrhose, H. pylori-assoziierte Ulcera.
Ischämie/Reperfusionszustände – Akutes koronares Syndrom, akuter Myokardinfarkt, kongestives Herzversagen, Atherosklerose, akute cerebrale Ischämie/Infarkt, Hirn/Spinalstrangtrauma, Organkonservierung während der Transplantation.
Andere – Cytoprotektion während der Krebsbehandlung, Adjuvans zur Chemotherapie, Alzheimer, chronische Glomerulonephritis, Osteoporose, TTP HUS, aplastische Anämie und Myelodysplasie. Ebenfalls von Interesse sind die Behandlung und Prävention der akuten Lungenverletzung (ALI)/des akuten Atemstresssyndroms (ARDS), Colitis ulcerosa und Morbus Crohn.
FLINT Analoga hemmen die Bindung von Fas an FasL und LIGHT an LTβR und TR2/HVEM Rezeptoren und können zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung und/oder eines Zustands verwendet werden, der mit einer solchen Bindung assoziiert ist.
Die Runaway Apoptose ist ein Beispiel eines Zustands, der durch eine übermäßige Aktivierung des Fas/FasL Signalübertragungswegs verursacht ist, welche mit den FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung behandelt werden können (siehe US 60/112 577 vom 18. Dezember 1998, Kondo et al., Nature Medicine 3 (4): 409-413 (1997) und Galle et al., J. Exp. Med. 182: 1223-1230 (1995). Die Runaway Apoptose führt zu mehreren pathologischen Zuständen, einschließlich Organversagen, akutem Leberversagen (beispielsweise Leberversagen, das mit viralen Infektionen assoziiert ist, die die Leber betreffen, bakteriellen Infektionen, die die Leber betreffen, Hepatitis, hepatozellulare Verletzung und/oder andere Zustände, worin die Hepatozyten eine massive Apoptose oder Zerstörung durchmachen), Nierenversagen und Versagen der Pankreasfunktion.
Die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung sind im allgemeinen klinisch und/oder therapeutisch brauchbar für Erkrankungen, die mit FLINT behandelt werden können (siehe US 09/280 567 und Miwa et al., Nature Medicine 4: 1287 (1998)). Ein Beispiel ist eine Entzündung, die durch eine durch FasL induzierte Neutrophilenaktivierung verursacht wird. Entzündungserkankungen, die mit einer Neutrophilenaktivierung assoziiert sind, umfassen Sepsis, ARDS, SIRS und MODS.
Andere Erkrankungen, für die das FLINT Analogon therapeutisch brauchbar ist, umfassen rheumatoide Arthritis (Elliott et al., Lancet 344: 1105-1110 (1994)), fibroproliferative Lungenerkankung, fibrotische Lungenerkrankung, HIV (Dockrell et al., J. Clin. Invest. 101: 2394-2405 (1998)), Ischämie (Sakurai et al. 1998, Brain Res. 797: 23-28), Hirntrauma/-verletzung (Ertel et al., 1997, J. Neuroimmunol. 80: 93-96), chronisches Nierenversagen (Schelling et al., 1998, Lab. Invest. 78: 813-824), Graft-vs-Host Erkrankung (GVDH) (Hattori et al., 1998, Blood 11: 4051-4055), Hautentzündung (Orteu et al. 1998, J. Immunol. 161: 1619-1629), vaskuläres Lecksyndrom (Rafi et al., 1998, J. Immunol. 161: 3077-3086), Helicobacter pylori Infektion (Rudi et al., 1998, J. Clin. Invest. 102: 1506-1514), Goiter (Tamura et al., 1998, Endocrinology 139: 3646-3653), Atherosklerose (Sata und Walsh, 1998, J. Clin. Invest. 102: 1682-1689), IDDM (Itoh et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 613-618), Osteoporose (Jilka et al., 1998, J. Bone. Min. Res. 13: 793-802), Morbus Crohn (van Dullemen et al., 1995 Gastroenterology 109: 129-135), Organkonservierung und Transplantationsabstoßung (Lau et al.,) 1996, Science 273: 109-112), Sepsis (Faist und Kim, 1998, New Horizons 6: S97-102), Pankreatitis (Neotolemos et al., 1998 Gut 42: 886-891), Krebs (Melanom, Kolon und Ösophagus) (Bennett et al., 1998, J. Immunol. 160: 5569-5675), Autoimmunkrankheit (IBD, Psoriasis, Down Syndrom (Seidi et al., Neuroscience Lett. 260: 9 (1999) und multiple Sklerose (D'Souza et al. 1996, J. Exp. Med. 184: 2361-2370).
Die Parallelanmeldung US 09/280567 mit dem Titel "Therapeutic Applications of mFLINT Polypeptides" vom 30. März 1999 beschreiben andere Erkrankungen, die mit FLINT Analoga behandelt werden können. Beispiele umfassen Alzheimersche Erkrankung, Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD), Mononukleose, EBV, Herpes, Antikörper-abhängige Cytotoxizität, hämolytische und hyperkoagulative Störungen, wie vaskuläre Blutungen, DIC (disseminierte, intervaskuläre Koagulation), Eklampsie, HELLP (Präeklampsie, die durch Thrombocytopenie, Hämolyse und gestörter Leberfunktion kompliziert ist), HITS (durch Heparin induzierte Thrombocytopenie), HUS (hämolytisch urämisches Syndrom) und Präeklarnpsie, hämatopoetische Störungen, wie aplastische Anämie, Thrombocytopenie (TTP) und Myelodysplasie und hämolytisches Fieber, das beispielsweise durch Ebola verursacht wird.
Im Fall einer Organkonservierung bei der Präparation zur Entnahme ist das FLINT Analogon beispielsweise prophylaktisch brauchbar, um die Apoptose zu verhindern, die mit einer Ischämiereperfusionsverletzung am Organ assoziiert ist, wenn das Organ vom Donor entfernt wird. Ein FLINT Analogon kann einem Organdonor vor der Entnahme des Organs verabreicht werden. Nach der Entnahme des Organs wird das FLINT Analogon zu einem geeigneten Medium zum Transport/Lagerung des Organs zugegeben. Alternativ dazu wird das entnommene Organ mit einem Medium perfundiert, das ein FLINT Analogon enthält, bevor eine Transplantation in einen Empfänger vorgenommen wird. Geeignete Medien für diesen Zweck sind bekannt, beispielsweise die in EP 0 356 367 A2 beschriebenen Medien. Das Verfahren kann auch die Behandlung des Transplantationsempfängers mit einem FLINT Analogon vor und/oder nach der Transplantationsoperation umfassen.
Ein typisches Verfahren umfasst die Vorbehandlung des Organdonors mit einer wirksamen Menge an FLINT Analogon vor der Organentnahme. Alternativ dazu oder gleichzeitig dazu kann das entnommene Organ in einer FLINT Analogon enthaltenden Lösung perfundiert oder gebadet werden. Dieses Verfahren kann beispielsweise mit der Niere, dem Herzen, der Lunge oder anderen Organen und Geweben ausgeführt werden.
Die Fähigkeit von FLINT Analoga zur Verzögerung der Apoptose unter ischämischen Bedingungen ist zur Konservierung von Organen und Geweben brauchbar, die zur Transplantation gewonnen werden. Ischämische Bedingungen umfassen unter anderem neuronale Ischämie, Gliedmaßenbruchverletzungen, Spinalstrangverletzungen, Myokardinfarkt einschließlich akuter, subakuter und chronischer Leiden und verwandter klinischer Syndrome und kongestives Herzversagen. Ebenso können unbeteiligte danebenstehende Gewebe, die während Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, toxischer Arzneimittel, Trauma, Operation und anderer Stresseinwirkungen beschädigt werden, mit FLINT Analoga behandelt werden. Ein Beispiel für eine solche Erkrankung ist eine Mukositis, die eine lebensbedrohende Nebenwirkung einer Krebsbehandlung sein kann.
Akute Lungenverletzung und akutes Atemstresssyndrom
Akute Lungenverletzung (ALI) und akutes Atemstressyndrom (ARDS) stellen Krankheitseinheiten dar, die sich nur in der Schwere der Hypoxie unterscheiden, die bei der Diagnose vorkommt. Ein breit akzeptierter Parameter zur Diagnose ist das PaO₂ oder FiO₂ Verhältnis gemäß dem ARDS Patienten ein Verhältnis von kleiner oder gleich 200 mm Hg zeigen, während ALI Patienten Werte von kleiner oder gleich 300 mm Hg zeigen. ARDS ist eine schwerere Form von ALI. Es dürften mehrere Mediatoren zur Pathogenese von ARDS/ALI beitragen, wobei die Neutrophilen eine prominente Rolle haben. Während mehrere beitragende Faktoren bei der Entwicklung von ARDS sowohl direkt als auch indirekt beteiligt sein dürften, scheint die Hauptursache Sepsis und das systemische Entzündungssyndrom zu sein, was etwa 40 % der Fälle ausmacht. Die Mortalität ist bei ARDS hoch und reicht bis zu 40 %, wobei die meisten Toten innerhalb der ersten 2 bis 3 Wochen auftreten. Es besteht derzeit keine verfügbare, zugelassene pharmakologische Therapie für ARDS und die Behandlung ist derzeit auf eine aggressive unterstützende Behandlung beschränkt.
Es besteht eine Evidenz, dass ARDS durch eine lösliche FasL Fas Wechselwirkung beim Menschen vermittelt werden kann (Matute-Bello et al., J. Immunol. 163, 2217-2225, 1999). Das FLINT Analogon kann durch die Bindung an FasL die durch FasL vermittelte Apoptose von Pneumozyten und/oder Endothelzellen hemmen und so die Progression von der akuten entzündlichen Erkrankung zu ALI und von ALI zu ARDS hemmen oder verhindern.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung des FLINT Analogons der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ALI und/oder ARDS.
Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist die vierte Hauptursache eines nicht unfallbedingten Todes in den Vereinigten Staaten nach Herzerkrankung, Krebs und cerebraler, vaskulärer Erkrankung. COPD ist eine obstruktive Atemwegsstörung, die mehrere Zustände umfasst, einschließlich chronische Bronchitis, Emphysem, Bronchiektase und chronisches Asthma. COPD ist langsam progressiv und bildet eine nicht umkehrbare Abnahme der Lungenfunktion. Chronische Hypoxämie und Hyperkapnie sind die letztlichen Ergebnisse der Störungen. Der Mechanismus, durch den COPD die Lungenfunktion zerstört, scheint die disregulierte Apoptose zu umfassen. Plasmaproben aus Patienten, die an COPD leiden, zeigen höhere Konzentrationen an löslichem Fas im Vergleich mit gesunden Kontrollindividuen (siehe Yasuda et al. Resp. Med. 92, 993-999, 1998). Die erhöhten Mengen an löslichem Fas in COPD Patienten spiegeln eine erhöhte durch Fas induzierte Apoptose wider.
Die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Hemmung der COPD verwendet werden.
Lungenfibrose (PF)
Die Lungenfibrose (auch bekannt als fibrotische Lungenerkrankung) tritt als Endergebnis des Prozesses einer versuchten Heilung während einer akuten oder chronischen Lungenverletzung auf. Der pathologische Mechanismus einer solchen Lungenverletzung kann einer von mehreren Faktoren sein, die zuerst eine entzündliche Reaktion in den Alveoli oder dem umgebenden Intestitium hervorrufen und anschließend eine alveolare/interstitielle Fibrose auslösen (das heißt die Reparaturreaktion). Die Fibrose führt in anderen Geweben, wie der Epidermis oder dem Peritoneum jeweils zu sichtbarer Narbenbildung oder Adhäsionen. Die Lungenfibrose führt im Gegensatz dazu zu einer restriktiven Lungenerkrankung (verringerte Lungenkapazitäten und verringerte Sauerstoffdiffusion). Zustände, die mit der Lungenfibrose assoziiert sind, umfassen unter anderem: Idiopathische Lungenfibrose, Bindegewebserkrankungen (beispielsweise Lupus, Sklerodermie), Arzneimittel-induzierte Lungenerkrankung (beispielsweise Bleomycin), Pneumoconiosen (beispielsweise Asbestose), Sarkoidose, Eosinophilengranulomatose, Hypersensitivitätspneumonitis und andere Erkrankungen, die mit schwerer Lungenentzündung assoziiert sind, die zu einer akuten Lungenverletzung und/oder akuten Atemstressyndrom führen können (beispielsweise Trauma, Sepsis, beinahe Ertrinken, Magensaftaspiration, Schock etc.). Die Fibrose der Atemwege ist auch ein Merkmal der chronischen Entzündung bei COPD.
Die Ätiologie von PF kann durch FasL/Fas ausgelöste Apoptose umfassen. Tatsächlich ist ein intaktes FasL/Fas System bei der Ätiologie von Bleomycin-induzierter PF bei Mäusen essentiell (siehe K. Kuwano et al., J. Clin. Invest. 104, 13-19 (1999).
Die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Hemmung der PF verwendet werden. Beispielsweise kann ein FLINT Analogon akut zum Zeitpunkt eines Entzündungsereignisses an die Lunge (beispielsweise während einer Bleomycinbehandlung) verabreicht werden, um das Auftreten der PF zu verhindern.
Ein "Individuum" ist ein Säuger, der einer Behandlung bedarf, vorzugsweise ein Mensch, kann auch ein Tier sein, das einer tiermedizinischen Behandlung bedarf, beispielsweise Haustiere (beispielsweise Hunde, Katzen und dergleichen), Farmtiere (beispielsweise Kühe, Schafe, Schweine, Pferde und dergleichen) und Labortiere (beispielsweise Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und dergleichen).
Eine "wirksame Menge" eines FLINT Analogons ist eine Menge, die zu einer ausreichenden Hemmung von einem oder mehreren Prozessen führt, die durch die Bindung von FAS an den FAS Liganden oder LIGHT an LT^®R und/oder TR2/HVEM führt, so dass ein gewünschter therapeutischer oder prophylaktischer Effekt bei einem Individuum mit einer Erkrankung oder einem Zustand erreicht wird, der mit einer gestörten Fas/Fas Ligandenbindung und/oder durch LIGHT vermittelten Bindung assoziiert ist. Ein Beispiel eines solchen Verfahrens ist eine Runaway Apoptose. Alternativ dazu ist eine "wirksame Menge" eines FLINT Analogons eine Menge, die zur Erreichung eines gewünschten therapeutischen und/oder prophylaktischen Effekts bei einem Individuum mit Entzündung ausreicht, welche durch eine Fas Liganden bedingte Neutrophilenaktivierung ausgelöst wurde oder jede der anderen vorher erwähnten Erkrankungen, die mit einer gestörten FAS Ligandenaktivität assoziiert sind.
Ein "gewünschter therapeutischer und/oder prophylaktischer Effekt" bei einem Individuum mit einer Erkrankung oder einem Zustand umfasst die Linderung von Symptomen oder die Verzögerung des Einsetzens der mit einer solchen Krankheit assoziierten Symptome. Alternativ dazu umfasst ein "gewünschter therapeutischer und/oder prophylaktischer Effekt" eine erhöhte Überlebensrate oder eine verlängerte Lebensdauer für das Individuum mit der Erkrankung.
Die Menge an FLINT Analogon, die an das Individuum verabreicht wird, hängt vom Typ und der Schwere der Erkrankung und von den Eigenschaften des Individuums ab, wie allgemeine Gesundheit, Alter, Geschlecht, Körpergewicht und Toleranz gegenüber Arzneimitteln. Sie hängt auch vom Ausmaß, der Schwere und des Typs der Erkrankung ab. Der Fachmann ist fähig, geeignete Dosierungen in Abhängigkeit dieser und anderer Faktoren zu bestimmen.
Als allgemeiner Vorschlag liegt die gesamte pharmazeutisch wirksame Menge der FLINT Analoga der Erfindung, die parenteral pro Dosis verabreicht wird, im Bereich von etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag des Körpergewicht des Patienten, insbesondere 2 mg/kg/Tag bis 8 mg/kg/Tag, bevorzugter 2 mg/kg/Tag bis 4 mg/kg/Tag, noch bevorzugter 2,2 mg/kg/Tag bis 3,3 mg/kg/Tag und schließlich 2,5 mg/kg/Tag, wobei dies wie oben erwähnt der therapeutischen Beurteilung unterliegt. Bevorzugter beträgt dieses Dosis mindestens 0,01 mg/kg/Tag. Falls sie kontinuierlich verabreicht werden, werden die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung typischerweise mit einer Dosisgeschwindigkeit von etwa 1 μg/kg/Stunde bis etwa 50 μg/kg/Stunde entweder durch 1 bis 4 Injektionen pro Tag oder durch kontinuierliche subkutane Infusionen beispielsweise unter Verwendung einer Minipumpe verabreicht. Eine Lösung mit einem intravenösen Beutel kann ebenfalls verwendet werden. Die Länge der Behandlung, die erforderlich ist, um die Veränderungen zu beobachten und das Intervall nach der Behandlung für das Auftreten von Reaktionen scheint in Abhängigkeit des gewünschten Effekts zu variieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung enthalten, können oral, rektal, intrakranial, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (wie als Pulver, Salben, Tropfen oder Transdermalpflaster), transdermal, intrathekal, bukkal oder als orales oder nasales Spray verabreicht werden. Mit "pharmazeutisch annehmbarer Träger" ist ein nicht toxischer, fester, halbfester oder flüssiger Füllstoff, Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder Hilfsformulierung jedes Typs gemeint. Der Ausdruck "parenteral" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Arten der Verabreichung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intraartikuläre Injektion, Infusion und Implantate, die die FLINT Analoga enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls passend verabreicht durch verzögerte Freisetzungssysteme. Geeignete Beispiele für verzögerte Freisetzungszusammensetzungen schließen semi-permeable Polymermatrices in Form von geformten Artikeln ein, beispielsweise Filme oder Mikrokapseln. Verzögert freisetzende Matrices umfassen Polylactide ( US 3 773 919 A , EP 0 058 481 A ), Copolymere der L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat (R. Langer et al., J. Biomed. Mater: Res. 15:167-277 (1981) und R. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., obige Literaturstelle) oder Poly-D-3-hydroxybuttersäure ( EP 0 133 988 A ). Andere verzögert freisetzende Zusammensetzungen umfassen auch liposomal eingeschlossenes FLINT Analogon. Solche Liposomen werden gemäß Verfahren die an sich bekannt sind hergestellt: DE 3 218 121 , Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985), Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1980), EP 0 052 322 A , EP 0 036 676 A , EP 0 088 046 A , EP 0 143 949 A , EP 0 142 641 A , Japanische Patentanmeldung 83-118008 , US 4 485 045 A und US 4 544 545 A und EP 0 102 324 A . Im allgemeinen sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Angstrom) unilammellären Typ, wobei der Lipidgehalt größer als etwa 30 Molprozent Cholesterin beträgt und das ausgewählte Verhältnis für die optimale TNFR Polypeptidtherapie eingestellt wird.
Zur parenteralen Verabreichung werden die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung im allgemeinen durch Mixen bei dem gewünschten Reinheitsgrad in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, das heißt einem, der nicht toxisch für den Empfänger der Dosis und der verwendeten Konzentrationen ist und der mit anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist, formuliert. Beispielsweise schließt die Formulierung vorzugsweise oxidierende Mittel und andere Verbindungen die dafür bekannt sind, dass sie Polypeptide zerstören, nicht mit ein.
Im allgemeinen werden die Formulierungen durch Zusammenbringen der FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung gleichmäßig und eng mit Flüssigträgern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem hergestellt. Dann wird das Produkt, wenn es nötig ist, in die gewünschte Formulierung verwandelt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isoton ist. Beispiele für solche Trägervehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer Lösung und Dextroselösung. Nicht wässrige Vehikel, wie fixierte Öle und Ethyloleate sind hierbei ebenfalls nützlich, ebenso wie Liposomen.
Der geeignete Träger enthält kleinere Mengen an Zusatzstoffen, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität hemmen. Solche Materialien sind nicht toxisch für den Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, niedermolekulare Polypeptide (weniger als 10 Reste), beispielsweise Polyarginine oder Tripeptide, Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline, hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidin, Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Cellulose oder deren Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine, Chelatbildner wie EDTA, Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit, Gegenionen wie Natrium und/oder nicht ionische oberflächenaktive Mittel wie Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
Die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung werden typischerweise in solchen Trägern bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1-10 mg/ml bei einem pH von etwa 3 bis 8 formuliert. Es ist verständlich, dass die Verwendung von bestimmten der vorhergehenden Hilfsstoffen, Trägern oder Stabilisatoren zur Bildung von Salzen der FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung führt.
Polypeptide zur therapeutischen Verwendung müssen steril sein. Die Sterilität wird leicht durch die Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (beispielsweise, 0,2 Micron Membranen) erhalten. Therapeutische Polypeptidzusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einem sterilen Einlass gegeben, beispielsweise in einem intravenösen Lösungsbeutel oder in ein Gefäß, das einen mit einer Hypodermisinjektionsnadel durchstechbaren Verschluss enthält.
Die FLINT Analoga können in Einmal- oder Mehrfachdosenbehältern, beispielsweise, verschlossenen Ampullen oder Gefäßen, wie einer wässrigen Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution, gelagert werden. Als Beispiel für eine lyophilisierte Formulierung werden 10 ml Gefäße mit 5 ml einer steril filtrierten 1 % (G/V) wässrigen Lösung befüllt und das entstehende Gemisch wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstitution des lyophilisierten Polypeptids, mittels eines bakteriostatischen Wassers für Injektionszwecke, hergestellt.
Pharmazeutische Verpackungen oder Kits, die einen oder mehrere Behälter enthalten, welche mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen gefüllt sind, sind hierin beschrieben. Zusammen mit solchen Behältern kann ein Hinweis in der Form angebracht sein, wie dies von einer Behörde vorgeschrieben wird, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, wobei der Hinweis die Genehmigung der Herstellung, Verwendung oder des Verkaufs für eine Anwendung am Menschen zeigt. Zusätzlich können die FLINT Analoga der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht beschränkend wirken sollen.
Beispiel 1
Herstellung eines Vektors zur Expression des FLINT Analogons R218Q
Die FLINT Variante R218Q wird durch mutagene PCR ausgehend von einer Wildtyp FLINT Matrize konstruiert. Siehe beispielsweise R. K. Saiki et al., Science 239: 487-491 (1988) und "Current Protocols in Molecular Biology", Band 1, Abschnitt 8.5.7 (Herausgeber John Wiley und Sons, Inc.). Die R218Q Mutante substituiert einen Argininrest, der an der Aminosäure 218 gefunden wird, durch Glutamin.
Das mutagene PCR Verfahren verwendet eine SOEing Reaktion (das heißt Strangüberlappungsverlängerung), um spezifische Mutationen in der nativen FLINT Matrize zum Austausch der Aminosäuresequenz an der Position 218 und ferner zur Einführung von Restriktionsenzymanhängen zu Identifizierungszwecken zu erzeugen.
Im allgemeinen erfordern SOEing Reaktionen die Verwendung von 4 Primern, zwei in der Vorwärtsorientierung (genannt A mit SEQ ID Nr. 5 und C mit SEQ ID Nr. 7) und zwei in der Rückwärtsorientierung (genannt B mit SEQ ID Nr. 6 und D mit SEQ ID Nr. 8). Die SOEing Reaktion amplifiziert eine Nukleinsäuresequenz (beispielsweise Gensequenz) in zwei Stufen. Die erste Stufe ist die Amplifikation der "Hälfte" des Gens durch die Ausführung einer A nach B Reaktion, gefolgt von einer getrennten C nach D Reaktion. Bei der Konstruktion der R218Q Mutante werden die B und C Primer auf dieselbe Region des Gens gerichtet, aber auf entgegengesetzten Strängen. Das Fehlpaarungspriming von beiden Oligonukleotidprimern erzeugt die Mutation. Nachdem diese zwei Reaktionen vollständig sind, werden die Produkte isoliert und zur Verwendung als Matrize für die A nach D Reaktion verwendet, was das gewünschte mutierte Produkt ergibt.
Die bei der Klonierung von R218Q beteiligten Primer sind:
Primer A: CF 107 (39 Nukleotide)
GCACCAGGGTACCAGGAGCTGAGGAGTGTGAGCGTGCCG
Primer B: CF 111 (44 Nukleotide)
TCAGCTGCAAGGCGGCGCGCCCCGCTTGTGGTGTCGGACCCCAG
Primer C: CF 112 (44 Nukleotide)
GGGGTCCGACACCACAAGCGGGGCGCGCCGCCTTGCAGCTGAAG
Primer D: CF 110 (43 Nukleotide)
GCACAGAATTCATCAGTGCACAGGGAGGAAGCGCTCACGGACG
Die in fett gezeigten Nukleotide stellen die Veränderungen dar, die gegenüber der Wildtypsequenz gemacht wurden. Unter Verwendung des Vorwärtsprimers C als Referenz zeigen die in fett gedruckten G und C die stillen Veränderungen, die zur Einführung einer Ascl Schnittstelle erforderlich sind. Diese Erkennungsstelle ist in den Primern B und C unterstrichen. Das fette CAA zeigt die Aminosäuresubstitution von Glutamin (CAA) anstelle von Arginin (AGG).
Das 311 Basenpaare lange amplifizierte Fragment, das die R218Q Mutation trägt, wird mittels einer 5' KpnI Schnittstelle (GGTACC) und einer 3 EcoRI Schnittstelle (GAATTC) subkloniert. Die native FLINT Sequenz weist eine natürlich vorkommende interne KpnI Schnittstelle um die Aminosäureposition 176 auf. Die EcoRI Schnittstelle wird zu Subklonierungszwecken eingeführt und liegt stromabwärts der Stopcodons. Diese Stellen sind in den Primern A und D jeweils unterstrichen. Das 311 bp Fragment wird in die Volllängen FLINT Sequenz eingebaut. Dies wird durch die folgenden Schritte erreicht:

I. Das 311 bp Fragment wird in einen Zwischenvektor gesetzt, nämlich pCR2.1 – TOPO, der die Adeninüberhänge verwendet, die nach der PCR zur Ligation erzeugt wurden.
II. Einmal eingebaut entfernt ein KpnI und EcoRI Verdau ein 289 bp Fragment. (Anmerkung: Die Größe des PCR Fragments verringert sich durch den Verdau von 311 bp auf 289 bp). Das mutierte Fragment wird verwendet, um das entsprechende Segment in das FLINT Wildtypgen durch eine gerichtete Ligation zu ersetzen.
III. FLINT/pJB03 wird mit KpnI und EcoRI unter Bildung von zwei Fragmenten verdaut: Fragment 1: 6070 bp Fragment 2: 289 bp
IV. Das 6070 bp Fragment, das das FLINT Gen trägt, wird isoliert und mit dem 289 bp PCR Produkt, das aus dem pCR 2.1 – TOPO Vektor entfernt wurde, unter Bildung von R218Q/pJB03 ligiert. Positive Klone werden durch Restriktionsanalyse identifiziert und durch Sequenzanalyse bestätigt.

Das R218Q Analogon, das in R218Q/pJB03 enthalten ist, wird in den pIG3 Vektor durch eine ungerichtete NheI und XbaI Ligation überführt. R218Q/pJB03 wird mit NheI und XbaI unter Bildung der Fragmente mit 932 bp und 5427 bp verdaut. Das 932 bp FLINT R218Q enthaltende Fragment wird isoliert. Das 932 bp NheI und XbaI Fragment von R218Q wird mit dem linearisierten 8510 bp pIG 3 Vektor unter Bildung von Klonen sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsorientierungen ligiert.
Beispiel 2
Prokaryontische Expression und Reinigung der rekombinanten FLINT Analoga
Ein Expressionsvektor, der einen offenen Leserahmen (ORF) trägt, der für das FLINT Analogon R218Q kodiert, wird in den kompetenten E. coli Stamm BL21 (DE3) (hsdS gal clts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV5 – T7 Gen 1), der von Novagen (Madison, WI) erhältlich ist, unter Verwendung von Standardverfahren transformiert. Es werden mehrere Transformanden, die bezüglich Resistenz auf Kanamycin selektiert wurden, zufällig ausgewählt und zur Beimpfung von LB/Kanamycin Medien verwendet. Die Kulturen werden bei 37°C unter Schütteln auf eine Zelldichte von OD₆₀₀ = 0,8 – 1,0 angezogen, wo die FLINT Proteinsynthese mit 1 mM IPTG induziert wird. Die Kulturen werden bei 37°C für 3 Stunden nach der Induktion angezogen, bevor die Zellen geerntet werden. Das FLINT Analogonprodukt, das durch den im Vektor enthaltenden ORF kodiert wird, wird aus der unlöslichen Fraktion des Zelllysats, den Einschlusskörperchen, gereinigt. Kurz gesagt besteht die Reinigung aus der Praparation und Solubilisierung der Einschlusskörperchen und der Proteinrückfaltung, wonach jeweils Kationenaustausch- und Größenausschlusschromatographieverfahren erfolgen.
Beispiel 3
Konstruktion des Vektors pIG3 zur Expression der FLINT Analoga in Sängerzellen
Es wird ein bicistronischer Expressionsvektor durch die Insertion eines PCR Fragments, das für eine "interne Ribosomeneintrittsstelle"/verbessertes grün fluoreszierendes Polypeptid (IRES/eGFP) kodiert, in den Säugerexpressionsvektor pGTD (B. Gerlitz et al., 1993, Biochemical Journal 295: 131) konstruiert. Dieser neue Vektor, der als pIG3 bezeichnet wird, enthält die folgenden Sequenzelemente: Den auf E1a ansprechenden GBMT Promotor (D.T. Berg et al., 1993, BioTechniques 14: 972, D.T. Berg et al., 1992, Nukleic Acids Research 20: 5485), einen Polylinker (MCS), die IRES Sequenz aus dem Encephalomyokarditisvirus (EMCV), die für eGFP kodierende Sequenz (Cormack et al., 1996, Gene 173: 33, Clontech), die Sequenzen der kleinen SV40 "t" Antigenspleißstelle/Polyadenylierung, den frühen SV40 Promotor und Replikationsursprung, die für Dihydrofolatreduktase (dhfr) kodierende Sequenz und das Ampicillinresistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322.
Basierend auf der humanen FLINT cDNA Sequenz werden die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer synthetisiert, die BclI Restriktionsschnittstellen an ihren jeweiligen 5' Enden enthalten. Diese Primer werden verwendet, um die cDNA des FLINT Analogons durch PCR zu amplifizieren. Die Orientierung und Nukleotidsequenz der humanen FLINT cDNA werden durch einen Restrikionsverdau und eine doppelsträngige Sequenzierung des Inserts bestätigt. Das etwa 900 Rasenpaare lange amplifizierte FLINT Analogon PCR Produkt wird jeweils mit Restriktionsendonukleasen NheI und XbaI unter Bildung eines Fragments geschnitten, das klebrige NheI und XbaI Enden aufweist. Dieses Fragment wird anschließend in eine XbaI Einzelschnittstelle von pIG3 unter Bildung des rekombinanten Plasmids pIG3-FLINT ligiert. Das für das Insert kodierende Analogon kann am C-Terminus des Analogons modifiziert werden, um eine abspaltbare Hexahistidinkassette (His6) einzuführen, um die Reinigung des Analogons zu erleichtern.
Beispiel 4
Isolierung des stark FLINT Analogon-produzierenden Klons von AV12 RGT18 Transfektanden
Das rekombinante Plasmid, das das FLINT Gen trägt, kodiert für eine Resistenz gegenüber Methotrexat. Zusätzlich enthält das Konstrukt ein Gen, das für ein fluoreszierendes Polypeptid kodiert, nämlich GFP, auf demselben Transkript und unmittelbar 3' zum FLINT Gen. Da eine starke Expression von GFP ein hohes Maß an Expression der FLINT-GFP mRNA erfordert, haben stark fluoreszierende Klone eine höhere Wahrscheinlichkeit, große Mengen an FLINT zu bilden.
AV12 RGT18 Zellen werden mittels eines Calciumphosphatverfahrens mit rekombinanten pIG1 Plasmiden transfiziert, die FLINT Analoga enthalten. Zellen, die gegenüber 250 nM Methotrexat resistent sind, werden selektiert und vereinigt. Der Pool an resistenten Klonen wird einer Fluoreszenz-gestützten Zellsortierung (FACS) unterzogen und Zellen mit Fluoreszenzwerten in den Top 5 % der Population werden in einen Pool und als einzelne Zellen sortiert. Stark fluoreszierende Pools werden zwei weiteren Sortierzyklen unterzogen. Pools und einzelne Klone aus den ersten und zweiten Zyklen werden auf die Bildung des FLINT Analogons durch ELISA analysiert. Pools oder Klone, die FLINT Analogon in der größten Menge exprimieren werden zum Scale-Up und zur Reinigung des FLINT Analogons ausgewählt.
Beispiel 5
Quantifizierung der FLINT Analoga
FLINT Analoga können in rohen Medien transfizierter Zellen und während des Reinigungsverfahrens durch einen entwickelten FLINT ELISA quantifiziert werden. ELISA verwendet den polyklonalen anti-FLINT Antikörper TDK-028 (1494) als Fangantikörper und biotinylierten anti-FLINT TDK-076A als primären Antikörper in einem "Sandwichtest". Der ELISA wird durch Streptavidin derivatisierter Meerrettichperoxidase (SA-HRP) mittels OPD als Substrat und der Verfolgung der Absorption bei 490 nm entwickelt. Der brauchbare Bereich eines solchen ELISA reicht von 0,2 bis 20 ng/ml.
Beispiel 6
FLINT Analoga hemmen die durch FasL induzierte Jurkat Zellapoptose
Ein Biotest, der die Prävention der Apoptose misst (das heißt das Überleben der Zellen) wird mittels FLINT und einer Vielzahl an FLINT Analoga ausgeführt, die in Säugerzellkultur hergestellt werden.
Für diesen Zweck werden 25 μl an Jurkat Zellen (5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und mit 25 μl an rekombinantem, humanem FasL (Endkonzentration 150 ng/ml) und entweder 50 μl FLINT oder FLINT Analogon gemischt. Serielle Verdünnungen, die von 0 bis 1 mg/ml reichen, werden im Test getestet. Die Zellen werden bei 37°C über Nacht inkubiert. 20 μl an MTS Tetrazoliumverbindung (Promega Corporation, Madison, WI) werden zu jeder Vertiefung gegeben und die Inkubation wird für 2 Stunden bei 37°C ausgeführt. Die Absorption bei 490 nm wird mittels eines Plattenlesegeräts aufgezeichnet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle und in den 2 bis 4 zusammengefasst. Analoga, die an Position 218 ein zu Glutamin verändertes Arginin aufweisen, zeigen eine Aktivität in diesem Test. Die Bioaktivität ist keine Funktion des Zelttyps, als dem die Probe hergestellt wurde. Beispielsweise ist R218Q, das aus AV12 Zellen (2) oder aus 293 EDNA Zellen (3) gereinigt wurde, in diesem Test aktiv.
Eine Doppelmutante, die Threonin an der Position 216 durch Prolin ersetzt und Arginin an der Position 218 durch Glutamin, ist in diesem Test aktiv. Ebenfalls in diesem Test aktiv ist das Multisubstitutionsanalogon [[R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q] (4).

FLINT/FLINT Analogon Hemmung der Jurkat Zellapoptose

FLINT ++

R218Q ++

R34N, D36T, R218Q +

R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q +

T216P, R218Q ++
Referenzbeispiel 7
Test auf FLINT Analoga zur Hemmung der Apoptose von Jurkat Zellen, die durch FasL induziert wird
Ein Biotest, der die Prävention der Apoptose (das heißt Überleben der Zellen) misst, wird mittels FLINT und einer Vielzahl an FLINT Analoga (siehe folgende Tabelle) ausgeführt, die in Säugerzellkultur hergestellt wurden. Zu testende FLINT Analoga umfassen: G214 (1), G214 (2), G214 (3), G214 (4), G214 (5), P215 (1), P215 (2), P215 (3), P215 (4), P215 (5), T216 (1), T216 (2), T216 (3), T216 (4), T216 (5), P217 (1), P217 (2), P217 (3), P217 (4), P217 (5), R218 (1), R218 (2), R218 (3), R218 (4), R218 (5), A219 (1), A219 (2), A219 (3), A219 (4), A219 (5), G220 (1), G220 (2), G220 (3), G220 (4), G220 (5), R221 (1), R221 (2), R221 (3), R221 (4), R221 (5), A222 (1), A222 (2), A222 (3), A222 (4), A222 (5). Die Zahlen in Klammern zeigen spezifische Aminosäuresubgruppen wie im folgenden an, mit der Maßgabe, dass der Austauschrest nicht derselbe ist, wie im nativen FLINT:

(1) Jede der 20 Aminosäuren,
(2) Asp oder Glu,
(3) His, Arg oder Lys,
(4) Cys, Thr, Ser, Gly, Asn, Gln, Tyr,
(5) Ala, Pro, Met, Leu, Ile, Val, Phe, Trp

Für diesen Zweck werden 25 μl Jurkat Zellen (5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und mit 25 μl rekombinantem, humanem FasL (Endkonzentration 150 ng/ml) und entweder 50 μl FLINT oder ein FLINT Analogon gegeben. Serielle Verdünnungen, die von 0 bis 1 mg/ml reichen, werden im Test getestet. Die Zellen werden bei 37°C über Nacht inkubiert. 20 μl an MTS Tetrazoliumverbindung (Promega Corporation, Madison, WI) werden zu jeder Vertiefung gegeben und die Inkubation wird bei 37°C für 2 Stunden ausgeführt. Die Absorption bei 490 nm wird mittels eines Plattenlesegeräts aufgezeichnet.

Test repräsentativer FLINT Analoga auf biologische Aktivität

G214D, G214H, G214T, G214A

P215D, P215H, P215T, P215A

T216D, T216H, T216S, T216A

P217D, P217H, P217T, P217A

A219D, A219H, A219T, A219M

G220D, G220H, G220T, G220A

R221D, R221H, R221T, R221A

A222D, A222H, A222T, A222M

Beispiel 8
FLINT Analogapolypeptidreinigung im großen Maßstab
Eine Produktion des FLINT Analogons (enthält einen Histidinanhang mit 6 Resten) wird durch die Anzucht von stabilen Pools in Rollflaschen ausgeführt. Nach dem Erreichen der Konfluenz werden die Zellen weiter in serumfreiem Medium für 5 bis 7 Tage inkubiert, um maximale Mengen des FLINT Analogons in das Medium zu sekretieren. Medium, das ein FLINT Analogon enthält, wird in einem Amicon ProFlux M12 Tangentialfiltrationssystem auf 350 ml konzentriert. Das konzentrierte Medium wird über eine IMAC Säule (Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (Pharmacia, 5 bis 10 ml Säule) bei einer Flussrate von 1 ml/min gegeben. Die Säule wird mit Puffer A (PBS, 0,5 M NaCl, pH 7,4) gewaschen, bis die Absorption (280 nm) auf die Grundlinie zurückkehrt und das gebundene Polypeptid wird mit einem linearen Gradienten von 0,025 M bis 0,5 M Imidazol (in Puffer A) über 60 Minuten eluiert. Fraktionen, die das FLINT Analogon enthalten, werden vereinigt. Dieses Material wird über eine Benzamidinsepharose säule (1 bis 5 ml) bei einer Flussrate von 1 ml/min gegeben, um das Thrombin zu entfernen. Das Säuleneluat, das das FLINT Analogon enthält, wird mittels einer Ultrafree Zentrifugationsfiltereinheit (Millipore) auf 2 ml konzentriert. Dieses Material wird über eine 16/60 Superdex 200 Größenausschlusssäule (Pharmacia) gegeben, die mit PBS und 0,5 M NaCl, pH 7,4 äquilibriert ist. Fraktionen, die das FLINT Analogon enthalten, werden durch SDS-PAGE analysiert und die N-terminale Sequenz des gereinigten Polypeptids bestätigt, dass es FLINT ist.
Beispiel 9
Biophysikalische Charakterisierung der gereinigten FLINT Analoga
Die strukturelle Integrität und die physikalische und chemische Stabilität von FLINT Analoga werden folgendermaßen charakterisiert.
Die Strukturanalyse der Proteine umfasst eine Untersuchung der Sekundärstruktur, die normalerweise durch CD Analyse mit fernem UV erhalten wird. Gewöhnlich werden 100 μl an 1 mg/ml FLINT Analogon in Phopshatpuffer pH 7,4 verwendet, um von 240 bis 180 nm in 0,5 nm Schritten mit 1 nm Bandbreite, mit 3 Sekunden Zeitkonstante, einem Mittel von 3 Scans in einer 0,01 cm Zelle bei Raumtemperatur zu scannen. CD Spektren im nahen UV, die Informationen über die Tertiärstruktur liefern, werden von 240 bis 350 nm, 0,5 nm Schritte, 1 nm Bandbreite, 5 Sekunden Zeitkonstante mit einem Mittel von 3 Scans bei Raumtemperatur ausgeführt.
Die intrinsische Tryptophanfluoreszenz wird mit den folgenden Parametern gemessen: Anregung durch eine Zelle mit einer Pfadlänge von 1 cm bei 298 nm mit einer 2/2 nm Spaltbreite, wobei die Emission von 305 bis 400 nm mit Spaltbreite von 2/2 nm in 0,5 nm Schritten über eine Pfadlänge von 0,4 cm mit 1 Sekunde Integrationszeit gewonnen wird. Ein "Blaushift" zeigt normalerweise an, dass aromatische Reste tiefer in der Proteinstruktur vergraben sind und wird oft mit verbesserten pharmazeutischen Eigenschaften begleitet.
Die quarternäre Struktur von FLINT Analoga kann durch Gleichgewichtssedimentationsanalyse untersucht werden, die in einer Ultrazentrifuge mit 3 mm breiten Zellen ausgeführt wird. Analoga mit ähnlichen Gleichgewichtssedimentationswerten im Vergleich zu nativem FLINT sind bevorzugt.
Die physikalische Stabilitätsanalyse umfasst die Untersuchung einer Anfälligkeit für Aggregation der FLINT Analoga als Reflektion ihrer Oberflächeneigenschaften. Physikalische Stabilitätstests sind in den folgenden Abschnitten beschrieben.
Dynamischer Lichtstreuungstest (DLS): Eine FLINT Analogonlösung wird entweder mit a) PBS pH 7,4 oder b) PBS, 0,5 M NaCl oder c) PBS, pH 7,4 und 3 mg/ml m-Cresol verdünnt, worin 0,1 bis 5 mg/ml Protein enthalten sind. Der pH wird mit HCl/NaOH auf 7,4 (±0,05) eingestellt und es wird in ein 6 × 50 mm Röhrchen aus Borsilikatglas Typ I filtriert. Die mittlere Lichtbrechungsintensität gewichtete Partikelgröße wird auf einem Brookhaven BI900 Gerät gewonnen, das aus einem Goniometer in einem 90° Winkel, einem Digitalkorrelator und einem Lexel Modell 3500 Argonionenlaser besteht, der auf die 488 nm Linie eingestellt ist. Die experimentell bestimmte Autokorrelationsfunktion C(t) wird durch das Kummulationsverfahren analysiert, um den hydrodynamischen Durchmesser zu erhalten. Die Zeit vor einer signifikanten Veränderung der Partikelgröße oder lag-Zeit wird durch Anpassung linearer Linien an die Datenpunkte des Präwachstums und der Wachstumsphase bestimmt. Der Abschnitt wird als lag Phase definiert. Eine verringerte Lichtbrechung durch ein Analog im Vergleich mit nativem FLINT bei derselben Konzentration und Temperatur zeigt normalerweise an, dass das Analog zu einem geringeren Ausmaß aggregiert, als das native Protein.
Differentialscanningkalorimetrie (DSC): Die physikalische Stabilität spiegelt sich auch in der Schmelztemperatur (T_m) des Proteins durch DSC (Differentialscanningkalorimetrie) wider. Gewöhnlich werden FLINT Analoga von 5°C bis 100°C mit einer 60°C/h Scannungrate und einem 16 Sekunden langen Filterparameter gescannt. Höhere Schmelztemperaturen zeigen normalerweise eine physikalische Stabilität an.
Die chemische Stabilität der FLINT Analoga, die auf 0,5 mg/ml verdünnt sind, wird durch Analysen der Umkehrphasen HPLC (RP-HPLC) und Größenausschlusschromatographie verfolgt. Die Umkehrphasenmethode besteht aus Acetonitril/TFA Gradientensystemen, die für FLINT optimiert wurden, mit einer Detektion bei 214 nm unter Verwendung einer Zorbax 300SB-C8 Säule bei 40°C. Das Größenausschlussverfahren besteht aus einer mobilen PBS Phase bei pH 7,4 auf einer Superdex 75 Säule (3,2 × 300 mm) bei Raumtemperatur. Die Veränderungen im Umkehrphasenchromatogramm zeigen im allgemeinen eine chemische Instabilität an.
Beispiel 10
In vivo Tests von FLINT Analoga zur Behandlung der Leberschädigung
Die Leberschädigung wird in einem Mausmodell mittels des Verfahrens von H. Tsuij et al., 1997, Infection and Immunity 65 (5): 1892-1898 induziert. Die Mäuse werden mit einer geringen Lipopolysacchariddosis (LPS) provoziert, um eine akute und massive Leberverletzung hervorzurufen. Es wird die Fähigkeit von FLINT und FLINT Analoga bestimmt, vor einer akuten Entzündung und Apoptose zu schützen. Kurz gesagt werden BALB/c Mäusen (Harlan) intravenöse Injektionen (in die Schwanzvene) an 6 mg an D(+)-Galactosamin (Sigma, 39F-0539) in 100 μl PBS (GIBCO-BRL) und 3 μg Lipopolysaccharid B E. coli 026:B6 (LPS) (Difco, 3920-25-2) in 100 μl PBS verabreicht. Nach der LPS Provokation wird den Tieren intravenös FLINT (1 bis 200 μg) oder ein FLINT Analogon (1 bis 200 μg) 4 Stunden nach der LPS Behandlung injiziert. Die Überlebensraten der Mäuse werden nach 48 Stunden (siehe 7) bestimmt.
Es wird eine Korrelation zwischen der prozentualen Überlebensrate der Tiere und der Menge an verabreichtem FLINT oder Analogon beobachtet. In einer Studie, die 5 Tiere pro Testgruppe umfasst, schützen die Analoga R218Q und [R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q] die Tiere vor eine Leberschädigung in einer dosisabhängigen Weise (siehe 7). In einem zweiten Experiment, das 10 Tiere pro Testgruppe umfasst, überleben 7 von 10 Tieren mit einer 20 ständigen Vorbehandlung mit FLINT, R218Q und [R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q]. Bei einer 24 ständigen Nachbehandlung überleben 7 von 10 Tieren mit einer FLINT Behandlung und 6 von 10 überleben mit R218Q oder [R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q].
Beispiel 11
FLINT Analogon/FasLigandenbindungstest
Mittels der biomolekularen Echtzeitinteraktionsanalyse (hierin später BIA) können die Bindung zwischen den FLINT Analoga und dem Fas Liganden bestätigt werden und die Bindungseigenschaften (beispielsweise Kinetiken, Spezifität, Affinität, Kooperativität, relatives Bindungsmuster) bestimmt werden. Um die biomolekularen Interaktionen zu verfolgen, verwendet BIA das optische Phänomen der Oberflä chenplasmonresonanz. Die Detektion der Bindungsinteraktionen hängt von den Veränderungen in der Massekonzentration der Makromoleküle am biospezifischen Interface ab. Es werden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet.
Biacore^® 2000 Gerät (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754, 50 Uppsala, Schweden)
Sensorchip CM5 (Biacore)
Aminkupplungskit (Biacore)
Waschpuffer: HBS-EP (Biacore)
Guanidinisothiocyanatlösung (GibcoBRL)
Fas Ligand (Kamiya Biomedical Company, 910 Industry Drive, Seattle, WA 98188)
FLINT Analoga
Fas/Fc Chimären (R&D Systems)
Immobilisierungsprotokoll
FasL oder das FLINT Analogon werden über ihre primäre Amingruppe an den Lysinresten auf Carboxymethyldextranpolymer immobilisiert, das auf einer Goldoberfläche angebracht ist (Sensor Chip CM5). Die Immobilisierung wird mittels des Aminkupplungskits (Biacore) gemäß dem Protokoll des Herstellers ausgeführt. Kurz gesagt werden 100 μl an entweder FasL oder FLINT Analogonlösungen (10 bis 25 μg/ml in 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0) auf einen aktivierten CM5 Chip aufgetragen. Nach der Kupplung werden überschüssige reaktive Gruppen auf der Oberfläche mit 1 M Ethanolhydrochlorid pH 8,5 deaktiviert. Der Chip wird dann mit 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0 gewaschen, um nicht-kovalent gebundenes Material zu entfernen.
Um die Wechselwirkung zwischen FasL und FLINT Analoga zu analysieren, werden Lösungen, die FLINT Analoga enthalten, über den Chip mit dem hierauf immobilisierten FasL gegeben. Die Menge an FLINT Analogon, die mit FasL assoziiert ist, wird durch Messen des Oberflächenplasmonresonanzsignals bestimmt (in Reaktionseinheiten, RU). Typischerweise werden FLINT Analogonlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen in HBS-ET Puffer auf den Sensorchip für 10 Minuten bei einer Flussrate von 5 μl/min aufgetragen. Der Chip wird dann mit HBS-ET Puffer (10 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % Tensid P20) für 2 Minuten bei einer Flussrate von 5 μl/min gewaschen. Die bioaktive Oberfläche auf dem Chip wird dann durch die Exposition gegenüber 0,8 M Guanidinisothiocyanat für 2 Minuten bei einer Flussrate von 5 μl/min und dann HBS-EP Puffer für 2 Minuten bei 5 μl/min Flussrate regeneriert.
Die umgekehrte Reaktion kann auch ausgeführt werden, wobei eine FasL Lösung über einen Chip gegeben wird, der hierauf ein FLINT Analogon immobilisiert aufweist. Die Menge an FasL, die mit dem FLINT Analogon assoziiert ist, wird unter Verwendung des Oberflachenplasmonresonanzsignals (in Reaktionseinheiten, RU) bestimmt.
Die Bestimmung der Affinitätskonstanten:
Die Daten werden evaluiert und die Bindeparameter werden mittels BIA Evaluierungssoftware 3.0.2 (Biacore) bestimmt. Der K_d für die Wechselwirkung zwischen FLINT und FasL und zwischen FasL und Fas wird mittels der oben beschriebenen Protokolle bestimmt. Die Ergebnisse sind im folgenden gezeigt: Wechselwirkungsmoleküle:

Immobilisiert in Lösung K_d (nM)

Fas Ligand (Monomer) FLINT 1,13 × 10^–7

Fas Ligand (Monomer) Fas 1,62 × 10^–7

FLINT Analogon Fas Ligand (Trimer) 0,63 × 10^–9
Beispiel 12
Analytischer Thrombinverdau von FLINT und FLINT Analoga
In getrennten Reaktionsröhrchen werden 1 μg an FLINT und 1 μg der FLINT Analoga R218Q, [R34N, D36T] und [R34, D36T, D194N, S196T, R218Q] in einem Puffer inkubiert, der 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 oder PBS, 0,5 M NaCl, 10 % Glycerin und Thrombin in einem Gewichtsverhältnis von 1 zu 100 (Thrombin zu FLINT/Analogon) enthält. Die Reaktionsgemische werden für variierende Zeiten bei entweder 25°C oder 37°C inkubiert. Aliquots aus den Reaktionsgemischen werden durch SDS-PAGE analysiert, um die Spaltung an der Position 218 zu detektieren. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
Wie erwartet wird FLINT durch Thrombin unter Bildung des FLINT Metaboliten verdaut. Beispielsweise sind nach 50 Minuten fast die Hälfte von FLINT und eines Kontrollanalogons [R34N, D36T] proteolytisch verdaut und nach 4 Stunden sind > 90 % proteolytisch verdaut. Im Gegensatz dazu wird die Proteolyse an der Position 218 nicht bei Proben der R218Q und [R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q] Analoga sogar nach dem Zeitpunkt von 4 Stunden detektiert (1).
Beispiel 13
Metabolische Stabilität des FLINT Analogons R218Q in vitro
FLINT, das von AV2 Zellen stammt, wird als Lösung mit 0,16 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/0,5 % M NaCl/10 % Glycerin geliefert. Das FLINT Analogon (R218Q), das aus 293 EBNA Zellen stammt, wird als Lösung mit 0,12 mg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung/0,5 M NaCl/10 % Glycerin geliefert. Die Materialien werden bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. FLINT und FLINT Analogon (R218Q) werden mit ¹²⁵I Nal mittels des IODO-BEADS Iodierungsreagenzes (Pierce) radioaktiv markiert. Radioaktiv markierte Testartikel sind > 90 % in Trichloressigsäure fällbar. Die radioaktiven Proteine werden bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Für die in vitro Analyse werden Mausblutproben durch eine kardiale Punktion in Gerinnungsröhrchen (Serumröhrchen ohne Antikoagulans) von männlichen ICR Mäusen (wiegen 35 g bis 45 g) gewonnen. Unmittelbar danach wird ¹²⁵I FLINT oder ¹²⁵I FLINT Analogon (R218Q) zu den Blutgewinnungsröhrchen gegeben. Die Röhrchen werden dann bei 37°C in ein Wasserbad gestellt und können für 1 Stunde gerinnen. Das Serum wird durch Sedimentierung hergestellt und durch Umkehrphasen HPLC getestet.
Die Serum- oder Plasmaproben werden direkt auf einer Vydac C4 Säule (4,6 × 250 mm) aufgetragen. Die Verbindungen werden von der Säule mit einem linearen Gradienten von 15 bis 55 % B in 40 Minuten bei 1 ml/min eluiert. Lösemittel A = H₂O/0,1 % TFA, Lösemittel B = Acetonitril/0,08 % TFA.
Das Eluat wird bei 214 nm verfolgt. Fraktionen des Säuleneluats (1 ml) werden gewonnen. Die Radioaktivität in Fraktionen wird direkt durch eine gamma-Zählung analysiert.
In vitro Inkubation: Nach einer Inkubation für 1 Stunde mit ICR Mausblut sind etwa 75 % an ¹²⁵I FLINT zu einem Produkt abgebaut, das die Retentionseigenschaften des FLINT Metaboliten aufweist (das heißt Reste 1 bis 218 der SEQ ID Nr. 1) (5A). Im Gegensatz dazu ist das FLINT Analogon (R218Q) gegenüber einem proteolytischen Abbau vollständig resistent (5B).
Beispiel 14
Metabolische Stabilität des FLINT Analogons R218Q in vivo
Studien, die zum Testen der Stabilität und der Resistenz des FLINT Analogons gegenüber einem proteolytischen Verdau in vivo entworfen werden, werden in männlichen ICR Mäusen ausgeführt (Körpergewicht 35 g bis 45 g). FLINT und FLINT Analogon (R218Q) werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/10 % Glycerin unter Bildung der Dosislösungen verdünnt, die eine Endkonzentration von 75 μg/ml aufweisen. FLINT und FLINT Analogon (R218Q) werden ICR Mäusen (n = 2) als einzelner inravenöser Bolus über die Schwanzvene (15 μg/Tier) in einem Volumen von 0,2 ml verabreicht. 0,25 h nach der intravenösen Verabreichung der Testartikel werden die Blutproben durch eine kardiale Punktion in EDTA Röhrchen gewonnen, die 0,01 ml eines Proteaseinhibitorcocktails (0,5 mM AEBSF, 150 nM Aprotinin, 1 μM E-64 und 1 μM Leupeptin) enthalten und das Plasma wird durch Sedimentierung hergestellt. Die Plasmakonzentrationen des FLINT oder FLINT Analogons (R218Q) werden durch ELISA bestimmt und das metabolische Profil der FLINT Immunreaktivität wird mittels Umkehrphasen HPLC bestimmt, wie dies im folgenden beschrieben ist.
FLINT ELISA: Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen werden über Nacht mit gepeinigtem, polyklonalem Antikörper TKD-028-1494 (5 μg/ml, 0,1 ml/Vertiefung) beschichtet. Nach dem Waschen werden die Proben in ein Volumen von 50 μl/Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wird der biotinylierte Ak TKD-076A zugegeben (1:4000 Verdünnung, 50 μl/Vertiefung) und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wird Streptavidin – alkalische Phosphatase (Boehringer Ingelheim) zugegeben (1:1000 Verdünnung, 50 μl/Vertiefung) und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Detektion wird mit Attophos^® Substrat mit 50 μl/Vertiefung erreicht. Die Fluoreszenzintensität wird in 15 Minuten Intervallen bei Raumtemperatur in einem Biolumin gemessen. Die LOQ des Tests wird mit etwa 0,5 ng/ml bestimmt.
Die ELISA Analyse zeigt, dass die Plasmakonzentrationen von FLINT und FLINT Analogon (R218Q) vergleichbar sind (etwa 200 bis 300 ng/ml), wenn dies 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung gemessen wird. Um jedoch zwischen Volllängen FLINT und metabolischem FLINT (das heißt Reste 1 bis 218 der SEQ ID Nr. 1) zu unterscheiden, wird eine RP-HPLC ausgeführt. Die gewonnenen Fraktionen werden in einer Speed-Vac (Savant Instruments) konzentriert, in PBS/0,1 % BSA resuspendiert und durch ELISA getestet.
Eine RP-HPLC Fraktionierung zeigt an, dass der FLINT Metabolit (1 bis 218) etwa 50 % der zirkulierenden Immunreaktivität 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung von nativem FLINT darstellt (6A). Im Gegensatz dazu wird kein FLINT Metabolit im Plasma von Tieren beobachtet, denen FLINT Analogon (R218Q) verabreicht wurde. Im wesentlichen die gesamte Immunreaktivität ist nur dem FLINT Analogon (R218Q) zuzurechnen, was eine Resistenz gegenüber dem proteolytischen Abbau an der Position R218Q anzeigt (6B).
Beispiel 15
Verwendung des FLINT Analogons zur Behandlung des ALI Patienten
Ein 55 Jahre alter Mann wird in der Notaufnahme bewusstlos eingeliefert. Seine Familie gibt an, dass er als Patient auf Bronchitis während der letzten Tage behandelt wurde, dass es sich aber trotz Antibiotika verschlimmert hat. Er weist keine relevante Krankengeschichte auf und die einzige Medikation war ein orales Cephalosporin der dritten Generation. Eine physische Untersuchung zeigt einen obtunded, cyanotischen Mann, der hypotensiv, tachypneu und tachykard ist und der eine bilaterale Lungenkongestion aufweist, die mit einem Lungenödem einhergeht. Es besteht keine Evidenz für ein kongestives Herzversagen. Tests zeigen eine Hypoxämie (basierend auf PaO₂/FiO₂) und die bilaterale Lunge infiltriert ohne Kardiomegalie, was mit einer Diagnose einer akuten Lungenverletzung übereinstimmt. Basierend auf der Krankengeschichte wird geschlossen, dass die Lungenverletzung ein direktes Ergebnis einer in der Gesellschaft erworbenen Pneumonie ist und dass der Patient die Hypoxämiekriterien für ALI innerhalb der letzten 12 Stunden erfüllt hat. Beatmungsmaßnahmen umfassen die Verwendung von PEP und geringem Atemvolumen. Sobald wie möglich wird eine Sauerstoffbehandlung bestätigt, eine Behandlung mit dem FLINT Analogon R218Q wird im ER als i.v. Bolus von 2,5 mg/kg initiiert, wonach eine kontinuierliche Infusion von 0,1 mg/Minute erfolgt. Das FLINT Analogon wird zusammen mit aggressiven unterstützenden Maßnahmen (beispielsweise aktive Beatmung, intravenöse Flüssigkeiten, Blutdruckmittel und Ernährungsunterstützung) für 4 Tage in der ICU fortgesetzt, wonach das FLINT Analogon abgesetzt wird. Während der folgenden 3 Tage beginnt sich der Patient zu erholen und wird am Tag 8 extubiert. Er macht eine Genesung ohne besondere Vorkommnisse durch und 6 Monate nach dem Zusammenbruch besteht keine Evidenz einer verbleibenden Lungenerkrankung durch Blutgase und Spirometrie. Sequenzliste

Claims

FLINT Analogon, das gegenüber einer Proteolyse durch eine Trypsin-ähnliche Protease zwischen den Positionen 218 und 219 der SEQ ID Nr. 1 oder zwischen den Positionen 247 und 248 der SEQ ID Nr. 3 resistent ist und bei der Bindung des Fas Liganden (FasL) und/oder LIGHT aktiv ist, worin Arg an der Position 218 der SEQ ID Nr. 1 oder der Position 247 der SEQ ID Nr. 3 durch Gln ersetzt ist und worin das Analogon zumindest zu 97 % identisch zu SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3 ist.
FLINT Analogon nach Anspruch 1, worin Arg an der Position 34 der SEQ ID Nr. 1 oder der Position 63 der SEQ ID Nr. 3 durch Asn ersetzt ist und Asp an der Position 36 der SEQ ID Nr. 1 oder an der Position 65 der SEQ ID Nr. 3 durch Thr ersetzt ist.
FLINT Analogon nach Anspruch 1 oder 2, worin Asp an der Position 194 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 223 der SEQ ID Nr. 3 durch Asn ersetzt ist und Ser an der Position 196 der SEQ ID Nr. 1 oder Position 225 der SEQ ID Nr. 3 durch Thr ersetzt ist.
FLINT Analogon nach einem der vorangehenden Ansprüche , worin Thr an der Position 216 der SEQ ID Nr. 1 oder der Position 245 der SEQ ID Nr. 3 durch Pro ersetzt ist.
FLINT Analogon nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst, worin Arg an der Position 218 durch Gln substituiert ist.
Nukleinsäure, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 6 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 7 umfasst.
FLINT Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines FLINT Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von akuter Lungenverletzung, akutem Atemstresssyndrom oder Colitis ulcerosa.
Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff ein FLINT Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln hierfür umfasst.