DE60313168T2 - Antagonisten für cxcr3-bindende cxc-chemokine - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Struktur und die Eigenschaften von Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine und besonders von menschlichem CXCL11.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bei Chemokinen handelt es sich um sezernierte proentzündliche Proteine mit kleinen Größen (70 – 130 Aminosäuren), die hautpsächlich an der gerichteten Migration und Aktivierung von Zellen beteiligt sind, besonders an der Extravasation von Leukozyten aus dem Blut zu Orten im Gewebe, welche die Rekrutierung dieser Zellen benötigen (Baggiolini M et al., 1997; Fernandez EJ und Lolis E, 2002).
  • Je nach Anzahl und Position der konservierten Cysteine in der Sequenz werden Chemokine in C-, CC-, CXC- und CX3C-Chemokine klassifiziert. Eine Reihe von Zellmembranrezeptoren, alles heptahelikale G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, sind die Bindungspartner, die Chemokinen ermöglichen, ihre biologische Aktivität auf die Zielzellen auszuüben, die je nach ihrem Zustand und/oder Typ spezifische Rezeptorkombinationen präsentieren. Die physiologischen Wirkungen von Chemokinen ergeben sich aus einem komplexen und integrierten System gleichzeitiger Wechselwirkungen: die Rezeptoren haben oft eine überlappende Ligandenspezifität, so dass ein einzelner Rezeptor unterschiedliche Chemokine binden kann, sowie ein einzelnes Chemokin unterschiedliche Rezeptoren binden kann.
  • Normalerweise werden Chemokine an der Stelle einer Verletzung, Entzündung oder anderen Gewebeveränderung auf parakrine oder autokrine Weise hergestellt. Zelltypspezifische Migration und Aktivierung bei entzündlichen Vorgängen und Immunvorgängen ist jedoch nicht die alleinige Aktivität von Chemokinen, sondern andere physiologische Aktivitäten, wie zum Beispiel Hämatopoese oder Angiogenese, scheinen durch bestimmte dieser Proteine reguliert zu werden.
  • Obwohl es beim Verwenden von Chemokinen als therapeutischen Mitteln potenzielle Nachteile gibt (besonders eine Tendenz zu aggregieren und promiskuitives Binden) bieten Chemokine die Möglichkeit für therapeutische Interventionen bei pathologischen Leiden, die mit derartigen Vorgängen in Verbindung stehen, besonders durch Hemmen spezifischer Chemokine und deren Rezeptoren, um die übermäßige Rekrutierung und Aktivierung von Zellen, besonders Leukozyten, zu verhindern (Proudfoot A, 2000; Baggiolini M, 2001; Haskell CA et al., 2002).
  • Unter den Chemokinrezeptoren handelt es sich bei CXCR3 (auch als G-Proteingekoppelter Rezeptor 9 oder GPR9 bekannt) um einen Membranrezeptor, der in IL-2-aktivierten T-Zellen (zum Beispiel CD4+ CDB+ T-Lymphozyten), natürlichen Killerzellen, B-Zellen und (auf niedrigeren Niveaus und/oder in einer auf den Zellzyklus beschränkten Weise) in anderen nicht hämatopoetischen Zelltypen, wie zum Beispiel Neuronen, Brustdrüsenzellen und proximalen Tubuluszellen stark exprimiert ist.
  • Die Besonderheit von CXCR3 ist, dass er, im Unterschied zu anderen Chemokinrezeptoren, eine verringerte Anzahl spezifischer CXC-Chemokinliganden (CXCLs) zeigt: CXCL9 (auch als durch gamma-Interferon induziertes Monokin, MIG, Mitglied 9 der Subfamilie kleiner induzierbarer Cytokine oder SCYB9 bekannt), CXCL10 (auch als Interferon-gamma-induzierbares Protein 10, IP-10, Mitglied 10 der Subfamilie kleiner induzierbarer Cytokine oder SCYB10 bekannt) und CXCL11 (auch als Interferon-induzierbarer chemischer T-Zell-alpha-Lockstoff, I-TAC, Interferon-gamma-induzierbares Protein 9, IP-9, H174, beta-R1, Mitglied 11 der Subfamilie kleiner induzierbarer Cytokine oder SCYB11 bekannt).
  • Diese drei Chemokine haben nicht nur eine Affinität im nanomolaren Bereich für CXCR3, sondern teilen sich andere wichtige Merkmale: viele Aminosäuren sind unter ihren Sequenzen konserviert, allen fehlt das „ELR"-Motiv am Aminoterminus, sie werden alle durch gamma-Interferon induziert und alle scheinen eine herausragende Rolle nicht nur bei der Migration von Leukozyten (Th1-Zellen) in Beziehung nicht nur mit Entzündung und Autoimmunität sondern auch mit Transplantatabstoßung und Ischämie zu spielen. Diese Aktivitäten sind in Tiermodellen, wie zum Beispiel Knockout-Mausen und Mäusen, die mit für das Chemokin oder den Rezeptor spezifischen Antikörpern behandelt werden, demonstriert worden. Zum Beispiel führt die Verabreichung von Antikörpern, die gegen die extrazellulären Domänen von CXCR3 oder gegen seine Liganden gerichtet sind, zur spezifischen Hemmung der entzündlichen Reaktionen, die durch diesen Rezeptor vermittelt werden (WO 01/72334, WO 01/78708, WO 02/15932).
  • Der Stand der Technik zeigt viele Beweise für die molekularen Mechanismen, die mit der Wechselwirkung zwischen CXCR3 und seinen Liganden in Verbindung stehen, und für ihre Wichtigkeit für die menschliche Physiologie. Im Vergleich zu CXCL9 und CXCL10 scheint CXCL11 der stärkste Induktor von CXCR3-vermittelter Aktivierung, Internalisierung und von transendothelialer Migration bei menschlichen und Maus-Leukozyten zu sein (Cole K et al., 1998; Lu B, et al., 1999, Sauty A et al., 2001). Die Aktivität oder die Expression dieser Moleküle kann in Beziehung zu verschiedenen pathologischen Leiden beträchtlich hochreguliert und moduliert werden, wie in Tiermodellen oder klinischen Proben gezeigt wurde, die mit Transpiantatabstoßung (Meyer M et al., 2001), Tuberkulose (Sauty A et al., 1999), Transplantat-Herzkranzerkrankung (Kao J et al., 2003), HIV-1-Replikation (Lane BR et al., 2003), Typ-1-Diabetes (Frigerio S et al., 2002), Geschwürbildung des Darmepithels (Sasaki S et al., 2002), mikrobieller Infektion (Cole A et al., 2001), sarcoidgranulomatösen Reaktionen (Agostini C et al., 1998), atherosklerotischen Läsionen (Mach F et al., 1999), multipler Sklerose (Sorensen T et al., 1999; WO 02/098346), Krebs (Trentin L et al., 1999; Robledo MM et al., 2001), Hauterkrankungen (WO 02/43758, Flier J et al., 2001), Nephropathien (Romagnani P et al., 1999), Schilddrüsenerkrankungen (Romagnani P et al., 2002), Gehirn- oder Rückenmarksverletzungen (WO 03/006045) und vielen anderen Autoimmun- oder entzündlichen Erkrankungen in Verbindung stehen.
  • Darüberhinaus ist auch beobachtet worden, dass die Proliferation endothelialer Zellen durch die Wechselwirkung zwischen CXCR3 und seinen Liganden moduliert werden kann (Luster A et al., 1995; Romagnani P et al., 2001). CXCR3-bindende CXC-Chemokine zeigen eine angiostatische Aktivität auf Endothelzellen, die durch anti-CXCR3-Antikörper gehemmt werden kann, was eine strenge Beziehung zwischen der Aktivierung dieses Rezeptors und der Zellzyklusregulierung, zumindest im Endothel, nahelegt.
  • Untersuchungen über Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zeigen an, dass Chemokine zwei Hauptstellen der Wechselwirkung mit ihren Rezeptoren haben, die flexible aminoterminale Region und die konformativ rigide Schleife, die dem zweiten Cystein folgt. Man denkt, dass Chemokine mittels der Schleifenregion an Rezeptoren andocken, und man glaubt, dass dieser Kontakt das Binden der aminoterminalen Region erleichtert, das zu einer Rezeptoraktivierung führt. Diese Wichtigkeit der aminoterminalen Region ist auch durch Testen natürlicher und synthetischer Chemokine demonstriert worden, bei denen diese Domäne modifiziert oder gekürzt ist. Dieses Prozessieren, das entweder einem proteolytischen Verdau, einer Mutagenese oder einer chemischer Modifizierung von Aminosäuren folgt, kann diese Moleküle entweder aktivieren oder sie völlig inaktiv machen, wodurch Verbindungen mit agonistischer und/oder antagonistischer Aktivität erzeugt werden ( US 5.739.103 ; WO 02/59301).
  • Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Regulation der Leukozytenrekrutierung während entzündlicher Reaktionen oder Immunreaktionen auf einer Kombination derartiger agonistischer und antagonistischer Wirkungen beruht, wie für die CXCR3-bindenden CXC-Chemokine und viele andere Chemokine gezeigt wurde (Loetscher P und Clark-Lewis I, 2001; Lambeir A et al., 2001). Somit werden Chemokine mit spezifischen Modifikationen in der aminoterminalen Region als solche erachtet, die therapeuti sches Potenzial für entzündliche Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen haben (Schwarz und Wells, 1999).
  • Wie viele andere zellsignalisierende lösliche Moleküle (Interleukine, Wachstumsfaktoren) zeigen Chemokine physiologische Wechselwirkungen nicht nur mit Zellrezeptoren sondern auch mit Glycosaminoglycanen (GAGs), jedoch mit variierenden Affinitäten. Diese negativ geladenen Moleküle werden durch Disaccharidwiederholungen gebildet (wie zum Beispiel Heparin, Chondroitinsulfat, Heparansulfat, Dermatansulfat und Hyaluronsäure) und kommen in der Natur auf Zelloberflächen, in der extrazellulären Matrix oder im Kreislauf vor. Sie können in isolierten Formen oder nach der posttranslationalen Hinzufügung von GAGs an Serinreste mit Proteinen (Proteoglycanen oder PGs) verknüpft vorliegen.
  • Wie die anderen GAG-bindenden Proteine haben Chemokine basische, in kleinen Anteilen ihrer Sequenz gehäufte Reste (hauptsächlich Arginin und Lysin), die für diesen Zweck geeignet sind, aber derartige Motive sind für jedes Chemokin oder jede Gruppe hoch homologer Chemokine auf andere Weise strukturiert. Manche dieser LAG-bindenden Stellen sind mit einem spezifischen Konsensus, wie zum Beispiel BBXB-Motiven (wo B einen basischen Rest und X jeden anderen Rest darstellt) oder anderen Arrangements, in Verbindung gebracht worden (Kuschert G et al., 1999; Proudfoot A et al., 2001).
  • Die Hauptkonsequenz dieser Wechselwirkung ist die Aggregation der Chemokine, ein Zustand, von dem man glaubt, dass er einen Schutz vor Proteolyse sowie einen Mechanismus zur kontrollierten und gradientenerzeugenden Freisetzung der Chemokine bereitstellt, der daran teilnimmt, die Chemokine zu erkennen und den Rezeptoren als Oligomere zu präsentieren (Hoogewerf AJ et al., 1997; Kuschert G et al., 1999). Die Wechselwirkung mit GAGs und die Bildung dieser Gradienten ist für viele Chemokine klar demonstriert worden und die relative Affinität ist gemessen worden. Deshalb ist nahe gelegt worden, dass auch die Modulation derartiger Wechselwirkungen einen therapeutischen Ansatz bei entzündlichen Erkrankungen darstellen kann (Alp S et al., 2001; Patel D et al., 2001).
  • Auf dem Fachgebiet bekannte Mittel zum Erreichen einer therapeutischen Wirkung auf der Grundlage der Wechselwirkungen zwischen GAGs und Chemokinen bezie hen die Erzeugung von GAG-Analoga, welche die Wechselwirkung zwischen endogenen GAGs und Chemokinen modulieren (WO 94/20512), die Verwendung von Heparanase zum Entfernen von GAGs (WO 97/11684), die Verabreichung von Komplexen aus Chemokin und GAGs (WO 99/62535), die Modifizierung der Bindungsdomäne von GAGs mit Polymeren (WO 02/04015) oder die Substitution von Resten, die an der GAG-Bindungsaktivität beteiligt sind (WO 02/28419), ein.
  • Obwohl ausführliche Untersuchungen über manche Chemokine durchgeführt worden sind, ist gut etabliert, dass es nicht möglich ist, auf Grundlage der Sequenzhomologie mit einem Chemokin mit beschränkter Ähnlichkeit oder bekannten GAG-bindenden Proteinmotiven vorherzusagen, welche spezifischen basischen Reste mit nicht konservativen Substitutionen modifiziert werden müssen, um die GAG-Bindung zu beeinträchtigen, da es eine signifikante strukturelle Diversität GAG-bindender Domänen in der Proteinfamilie der Chemokine gibt (Lortat-Jacob H et al., 2002). Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren von Liganden, Inhibitoren oder Promotoren von CXCR3 sind auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt ( US 6.140.064 ). Keiner dieser Ansätze kann jedoch tatsächlich zum Erzeugen und Untersuchen von CXCL9, CXCL10 oder CXCL11 mit fehlerhafter GAG-Bindung angewendet werden. Weder strukturelle Anforderungen für die Wechselwirkung mit GAGs noch ihre dreidimensionale Struktur sind für CXCR3 und für dessen Liganden bekannt. Es gibt im Stand der Technik keine Offenbarung darüber, was die Reste dieser Chemokine, die an der GAG-Bindung beteiligt sind, sowie die in-vivo-Wirkungen, die sich aus deren nicht konservativer Substitution in mutanten Proteinen ableiten, sein können.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist festgestellt worden, dass spezifische basische Reste im Carboxylterminus eines menschlichen CXCR3-bindenden CXC-Chemokins (CXCL11) für die Wechselwirkung mit Glycosaminoglycanen (GAGs) verantwortlich sind.
  • Die Entfernung dieser basischen Reste durch nicht konservative Substitutionen (zum Beispiel mit Alaninen) führt zur Erzeugung von CXCL11-Mutanten, die nicht nur eine beträchtliche verringerte Tendenz dazu, mit GAGs in Wechselwirkung zu treten, sondern auch eine antagonistische in-vivo-Aktivität auf CXCL11 haben. Derartige Beweise können ausgenutzt werden, um Mutanten von CXCL11 und den ähnlichsten CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen (CXCL10 und CXCL9) als Antagonisten der entsprechenden natürlichen Chemokine zu verwenden. Verbindungen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, können verwendet werden, um die Aktivität CXCR3-bindender CXC-Chemokine auf CXCR3-exprimierenden Zellen zu blockieren und dadurch therapeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, die mit übermäßiger aktivierter T-Zell-Migration in Beziehung stehen, wie zum Beispiel Transplantatabstoßung und Autoimmunerkrankungen (rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Typ-1-Diabetes), von Krebs, von einer HIV-1-Infektion und von Erkrankungen, die eine Zunahme der Vaskularisierung benötigen, wie zum Beispiel eine ischämische Herzerkrankung, bereitzustellen.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich sein.
  • BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1: (A) Aminosäuresequenzen von reifem menschlichem CXCL11 (CXCL11-WT, SEQ ID NO: 1) und von den auf der Grundlage dieser Sequenz erzeugten Mutanten, die wie in den Beispielen beschrieben exprimiert und getestet worden sind (mutierte Aminosäuren sind fett und unterstrichen, SEQ ID NO: 2 – 5). Die Nummerierung beruht auf der reifen menschlichen Sequenz, der ein 21 Aminosäuren langes Signalpeptid fehlt. (B) Alignment der den reifen Formen der folgenden CXCR3-bindenden CXC-Chemokine gemeinsamen Sequenz: Maus CXCL11 (mCXCL11, SWISSPROT Zugangsnr. Q9JHH5, SEQ ID NO: 8), menschliches CXCL11 (hCXCL11, SWISSPROT Zugangsnr. O14625, SEQ ID NO: 1), menschliches CXCL10 (hCXCL10, SWISSPROT Zugangsnr. P02778, SEQ ID NO: 6) und menschliches CXCL9 (hCXCL9, SWISSPROT Zugangsnr. Q07325, SEQ ID NO: 7). Fette und unterstrichene Reste in der menschlichen CXCL11-Sequenz sind in den unterschiedlichen Varianten, die in den Beispielen vorgelegt werden, zu Alanin mutagenisiert worden (die Reste 5, 6, 8, 46, 49, 52, 57, 59, 62, 66, 67, 70 und 71). Die anderen basischen Reste des menschlichen CXCL11 und alle basischen Reste in Maus-CXCL11, menschlichem CXCL10 und menschlichem CXCL9 sind unterstrichen. Cysteine und basische Reste, die unter menschlichen CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen konserviert sind, werden in der eingerahmten Linie unter dem Alignment als C bzw. B angezeigt. Die Nummerierung beruht auf den reifen menschlichen Sequenzen, denen ein Signalpeptid einschließlich der N-terminalen 21 (mCXCL11, hCXCL11 und hCXCL10) oder 22 (hCXCL9) Aminosäuren fehlt. Die reife Form von mCXCL11, hCXCL11 und hCXCL10 wird gänzlich gezeigt, während die reife Form von hCXCL9 am Carboxylterminus 25 weitere Aminosäuren hat.
  • 2: Graph, der die Ergebnisse des mit [3H]-Heparin durchgeführten Heparinbindungsassays darstellt, der die Aktivität von CXCL11-WT und den angezeigten CXCL11-Mutanten im mikromolaren Bereich vergleicht.
  • 3: Graph, der die Ergebnisse des Gleichgewichts-Kompetitions-Rezeptorbindungsassays darstellt, der durch Überwachen des Prozentsatzes von [125I]-CXCL11 durchgeführt wird, das von Membranen CXCR3-exprimierender HEK- Zellen nach der Zugabe von CXCL11-WT und den angegebenen CXCL11-Mutanten im pico-/mikromolaren Konzentrationsbereich verdrängt wird.
  • 4: Graph, der die Ergebnisse des Chemotaxis-Assays darstellt, der an CXCR3-exprimierenden L1.2-Zellen unter Verwendung von CXCL11-WT oder den angegezeigten CXCL11-Mutanten durchgeführt wird.
  • 5: Graph, der die Ergebnisse des peritonealen Zellrekrutierungsassays zusammenfasst, der bei weiblichen Balb/C-Mäusen unter Verwendung von CXCL11-WT oder den anderen angegebenen CXCL11-Mutanten durchgeführt wurde, verglichen mit einer Kontrolle mit Kochsalzpuffer. Das statistische Signifikanzniveau wird durch die Anzahl der Sterne dargestellt.
  • 6: Graph, der die Ergebnisse zur Fähigkeit von CXCL11-3B3, die durch CXCL11-WT induzierte Zellrekrutierung zu hemmen (beide in einer Menge von 10 μg verabreicht), zusammenfasst. Kochsalzlösung oder CXCL11-3B3 wurde 30 Minuten vor der Verabreichung von CXCL11-WT verabreicht.
  • 7: Graph, der die Ergebnisse zum Assay der verzögerten Kontakthypersensitivität unter Verwendung von Kochsalzlösung als Kontrolle oder CXCL11-3B3 in einer Dosis von 0,5 mg/kg zusammenfasst. Die Wirkung wird im Hinblick auf das Volumen der Ohrschwellung in den Tagen nach der Behandlung (D5, D6, D7 usw.) mit einer Dickenmessuhr gemessen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist, neue Antagonisten von CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen bereitzustellen, die aus Mutanten dieser Chemokine bestehen, die in Bezug auf die GAG-Bindung fehlerhaft sind, bei denen einer oder mehrere der konservierten basischen Reste im Carboxylterminus durch nicht konservative Substitutionen entfernt worden sind. Insbesondere handelt es sich bei Mutanten von CXCL11, CXCL10 oder CXCL9 mit antagonistischen Eigenschaften um solche, bei denen mindestens einer der folgenden basischen Reste, ausgewählt aus 46, 62, 66 und 70, wie auf der Sequenz von menschlichem, reifem CXCL11 nummeriert, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist.
  • Basische Reste, die in bevorzugten Mutanten zusätzlich mutiert werden können, sind diejenigen, die in einem oder mehreren spezifischen CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen (in menschlichen Chemokinen oder über Arten hinweg) konserviert sind und/oder diejenigen, die diese konservierten basischen Reste umgeben. Mehrfache Mutanten werden vorzugsweise durch Substituieren von mindestens zwei aufeinanderfolgenden, konservierten basischen Resten auf nicht konservative Weise erzeugt, aber andere mögliche Kombinationen werden durch die vorliegende Erfindung offenbart.
  • Die vorliegende Patentanmeldung stellt in-vivo- und in-vitro-Daten zum Binden und zu antagonistischen Aktivitäten neuer, rekombinanter CXCL11-Mutanten bereit, bei denen spezifische Kombinationen basischer Reste auf nicht konservative Weise durch Alanine substituiert wurden. Diese Beweise, kombiniert mit der Kenntnis der Sequenz und der Eigenschaften anderer hoch konservierter CXCR3-bindender CXC-Chemokine, legen nahe, dass spezifische konservierte basische Stellen nicht nur eine allgemeine Rolle bei der biologischen Aktivität dieser Chemokine spielen können, sondern gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, um eine Reihe von Molekülen mit antagonistischen Eigenschaften gegen das natürliche Chemokin zu erhalten.
  • In einer Hauptausführungsform bestehen Antagonisten von menschlichem CXCL11 aus Mutanten von menschlichem CXCL11, bei denen mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 49, 52, 57, 59, 67 oder 71. Stärker bevorzugt haben die CXCL11-Mutanten eine der folgenden Kombinationen basischer Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert:
    • a) 46, zusammen mit 49 und/oder 52,
    • b) 62, zusammen mit 57 und/oder 59,
    • c) 66 und 70, zusammen mit 67 und/oder 71, oder
    • d) 62 und 66, zusammen mit einem oder mehreren der Folgenden: 57, 59, 67, 70 oder 71.
  • Die Beispiele offenbaren Mutanten, die in der Definition der Kombination (a), (b) oder (c) eingeschlossen sind, während Kombination (d) zwei aufeinanderfolgende konservierte basische Reste zusammen mit umgebenden basischen Resten einschließt.
  • Schließlich handelt es sich bei basischen Resten von CXCL11, die weiter mutiert werden können, um diejenigen, die in einem anderen CXCR3-bindenden CXC-Chemokin und/oder über Arten hinweg (wie zum Beispiel bei der Maus) konserviert sind. Deshalb ist in anderen bevorzugten CXCL11-Mutanten mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert: 5, 6, 8, 17, 20, 26 oder 38.
  • In einer anderen Hauptausführungsform bestehen Antagonisten von menschlichem CXCL10 aus Mutanten von menschlichem CXCL10, bei denen mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 47, 48, 51, 52, 59, 74 oder 75. Stärker bevorzugt haben die CXCL10-Mutanten eine der folgenden Kombinationen basischer Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert:
    • a) 46 und 52, zusammen mit 47, 48 oder 51,
    • b) 59 und 62,
    • c) 66 und 70, zusammen mit 74 und/oder 75, oder
    • d) 62 und 66, zusammen mit 59 und/oder 70.
  • Schließlich handelt es sich bei basischen Resten von CXCL10, die weiter mutiert werden können, um diejenigen, die in einem anderen CXCR3-bindenden CXC-Chemokin und/oder über Arten hinweg (wie zum Beispiel bei der Maus) konserviert sind. Deshalb ist in anderen bevorzugten CXCL10-Mutanten mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert: 5, 8, 22, 26, oder 38.
  • In einer weiteren Hauptausführungsform bestehen Antagonisten von menschlichem CXCL9 aus Mutanten von menschlichem CXCL9, bei denen der basische Rest 67, der auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert ist, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist. Stärker bevorzugt haben die CXCL9-Mutanten eine der folgenden Kombinationen basischer Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert:
    • a) 62, zusammen mit 66 und/oder 67;
    • b) 66 und 67, oder
    • c) 66 und 70, zusammen mit einem oder mehreren der Folgenden: 67, 74 oder 75.
  • Schließlich handelt es sich bei basischen Resten von CXCL9, die weiter mutiert werden können, um diejenigen, die in einem anderen CXCR3-bindenden CXC-Chemokin und/oder über Arten hinweg (wie zum Beispiel bei der Maus) konserviert sind. Deshalb ist in anderen bevorzugten CXCL9-Mutanten mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert: 5, 6, 8, 25, 28 oder 38.
  • Bei der Aminosäure, die den basischen Rest ersetzt, handelt es sich vorzugsweise um eine nicht polare, kleine Aminosäure wie Alanin oder Glycin, aber andere Aminosauren sind geeignet, vorausgesetzt, dass sie eine Ladung und Größe haben, die mit der GAG-Bindung inkompatibel sind und gleichzeitig eine schwache Auswirkung auf andere Eigenschaften des Proteins haben. Für die Substitutionen geeignete Aminosäuren sind Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin. Antagonisten von menschlichem CXCL11 mit Alanin-Substitutionen in Kombination mit basischen Resten, wie in der vorliegenden Erfindung definiert (1A), haben die als CXCL11-2B3 (SEQ ID NO: 3), CXCL11-3B3 (SEQ ID NO: 4) oder CXCL11-4B4 (SEQ ID NO: 5) offenbarten Sequenzen. Die Beispiele zeigen, wie diese CXCL11-Mutanten in Bezug auf die Heparinbindung fehlerhaft sind und als Antagonisten der entsprechenden natürlichen Chemokine wirken, wobei CXCL11-3B3 besonders wirksam ist.
  • Die Formulierung „in Bezug auf die GAG-Bindung fehlerhafte Mutanten" oder „in Bezug auf die Heparinbindung fehlerhafte Mutanten" bedeutet, dass die Mutanten eine geringere Fähigkeit haben, GAGs in den in der vorliegenden Erfindung offenbarten Assays zu binden (d. h. ein geringerer Prozentsatz jeder dieser Mutanten, mit Bezug auf das entsprechende Wildtypmolekül, bindet an GAGs wie Heparin).
  • Im Sinne der vorliegenden Anmeldung handelt es sich bei „CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen" um die in 1B gezeigten menschlichen nicht-ELR-Chemokine: menschliches CXCL11 (auch als H174, Interferon-induzierbarer chemischer T-Zell-alpha-Lockstoff, I-TAC oder Interferon-gamma-induziertes Protein 9 bekannt), menschliches CXCL10 (auch als IP-10 oder Interferon-gamma-induziertes Protein 10 bekannt), menschliches CXCL9 (auch als MIG oder Interferon-gamma-induziertes Monokin bekannt). Diese Definition schließt ebenfalls Säuger-Orthologe dieser Sequenzen (wie zum Beispiel Maus-CXCL11, gezeigt in 1B) ein.
  • Im Hinblick auf den Stand der Technik gibt es kein Anzeichen, dass die vorstehend angegebenen Kombinationen basischer Aminosäuren im Carboxylterminus von CXCL11 eine Bindungsstelle für GAGs/Heparin definieren und dass die nicht konservative Substitution dieser Reste zu Molekülen mit antagonistischer Aktivität gegen das entsprechende natürliche Molekül führt. Darüberhinaus kann angesichts der Konservativität mancher in diesen Kombinationen eingeschlossener basischer Reste unter bekannten menschlichen CXCR3-bindenden Chemokinen (CXCL10 und CXCL9) gefolgert werden, dass die Antagonisten dieser Gruppe von Chemokinen durch die nicht konservative Substitution von Resten erhalten werden können, die denjenigen entsprechen, die in der vorliegenden Patentanmeldung für menschliches CXCL11 funktionell charakterisiert werden. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung Mutanten CXCR3-bindender Proteine bereit, die eine Kombination der vorstehend definierten Mutationen enthalten und die als Antagonisten für die entsprechenden natürlich vorkommenden Chemokine wirken. Verbindungen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können verwendet werden, um die Aktivität CXCR3-bindender CXC-Chemokine auf CXCR3-exprimierenden Zellen zu blockieren, wodurch sie therapeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen bereitstellen, die mit übermäßiger oder unkontrollierter Produktion von CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen in Beziehung stehen, wie zum Beispiel Autoimmunstörungen oder Transplantatabstoßung, oder um ihren angiostatischen Wirkungen entgegenzuwirken.
  • Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung sind alternative Moleküle, die auf der Struktur und Aktivität der Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine der vorliegenden Erfindung beruhen.
  • Eine erste Klasse alternativer Moleküle wird durch aktive Mutanten der vorstehend definierten Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine dargestellt. Diese Proteine sollten die antagonistischen Eigenschaften der Mutanten, die in der vorliegenden Patentanmeldung beispielhaft aufgeführt sind, aufrechterhalten oder sogar verstärken.
  • Diese Molekülkategorie schließt natürliche oder künstliche Analoga der Sequenz ein, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt, deletiert oder substituiert worden sind, vorausgesetzt, dass sie die gleiche biologische Aktivität, die in der vorliegenden Erfindung charakterisiert wird, auf vergleichbaren oder höheren Niveaus aufzeigen, wie durch auf dem Fachgebiet bekannte und in den nachstehenden Beispielen offenbarte Mittel bestimmt wird. Zum Beispiel können spezifische Mutanten eine oder mehrere Aminosäuren haben, die in der aminoterminalen Region, von der bekannt ist, dass sie die Rezeptorbindung beeinflusst, hinzugefügt, deletiert oder substituiert werden. Diese Mutationen können insbesondere eine oder mehrere der ersten neun Aminosäuren des reifen menschlichen CXCR3-bindenden CXC-Chemokins einbeziehen, die sich in der aminoterminalen Region befinden, gerade vor dem konservierten CXC-Motiv (1B). Derartige Moleküle können letztendlich eine oder mehrere Aminosäuren enthalten, die mutiert worden sind, wodurch eine Variante erhalten wird, die eine geringere Tendenz zur Aggregation hat, wie für andere Chemokine gezeigt wurde (WO 98/13495).
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind bevorzugte Änderungen bei diesen aktiven Mutanten allgemein als „konservative" oder „sichere" Substitutionen bekannt und betreffen nicht basische Reste. Bei konservativen Aminosäuresubstitutionen handelt es sich um diejenigen mit Aminosäuren, die ausreichend ähnliche chemische Eigenschaften haben, um die Struktur und die biologische Funktion des Moleküls zu erhalten. Es ist klar, dass Insertionen und Deletionen von Aminosäuren in den vorstehend definierten Sequenzen auch gemacht werden können, ohne deren Funktion zu verändern, insbesondere falls die Insertionen oder Deletionen nur wenige Aminosäuren betreffen, z. B. unter zehn und vorzugsweise unter drei, und keine Aminosäuren entfernen oder verdrängen, die für die funktionelle Konformation eines Proteins oder Peptids entscheidend sind.
  • Die Literatur stellt viele Modelle bereit, an denen die Auswahl konservativer Aminosäuresubstitutionen auf der Grundlage statistischer und physikochemischer Untersuchungen zur Sequenz und/oder Struktur des natürlichen Proteins durchgeführt werden kann (Rogov SI und Nekrasov AN, 2001). Proteingestaltungsexperimente haben gezeigt, dass die Verwendung spezifischer Untergruppen von Aminosäuren faltbare und aktive Proteine herstellen kann, was bei der Klassifizierung "synonymer" Aminosäuresubstitutionen hilft, die leichter in der Proteinstruktur untergebracht werden können und die verwendet werden können, um funktionelle und strukturelle Homologe und Paraloge nachzuweisen (Murphy LR et al., 2000). Die Gruppen synonymer Aminosäuren und Gruppen stärker bevorzugter Synonyme sind diejenigen, die in Tabelle 1 definiert werden.
  • Aktive Mutanten, die durch Substitutionen auf der Grundlage dieser Lehren hergestellt worden sind, sowie aktive Mutanten, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren entfernt oder hinzugefügt wurden, gehören zu den Zielen der vorliegenden Erfindung, das heißt, neuen Mutanten CXCR3-bindender CXC-Chemokine mit schwachen GAG-bindenden Eigenschaften und antagonistischer Aktivität gegen die entsprechenden CXCR3-bindenden Chemokine, vergleichbar mit denjenigen der ursprünglich ausgewählten Mutanten oder gegebenenfalls noch verbessert. Ähnliche Verbindungen können sich aus herkömmlicher Mutagenesetechnik der kodierenden DNA, aus kombinatorischen Technologien auf der Ebene der kodierenden DNA-Sequenz (wie zum Beispiel DNA-Shuffling, Phagenpräsentierung/Selektion) oder aus computerunterstützten Gestaltungsuntersuchungen, gefolgt von der Validierung auf die gewünschten Aktivitäten hin, wie im Stand der Technik und in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird, ergeben.
  • Eine zweite Klasse alternativer Moleküle der Erfindung wird durch Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine dargestellt, die eine der wie vorstehend definierten Aminosäuresequenzen und eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu einer anderen Proteinsequenz als dem entsprechenden CXCR3-bindenden CXC-Chemokin gehört. Diese letztere heterologe Sequenz sollte zusätzliche Eigenschaften bereitstellen, ohne die antagonistische Aktivität signifikant zu stören oder die GAG-bindenden Eigenschaften zu verbessern. Beispiele für derartige zusätzliche Eigenschaften sind ein leichteres Reinigungsverfahren, eine länger anhaltende Halbwertszeit in Körperflüssigkeiten, eine zusätzliche Bindungseinheit, die Reifung mittels eines endoproteolytischen Verdaus oder die extrazelluläre Lokalisierung. Dieses letztere Merkmal ist von besonderer Bedeutung für das Definieren einer spezifischen Gruppe von Fusions- oder chimären Proteinen, die in der vorstehenden Definition eingeschlossen sind, da es den als Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine in dieser Patentanmeldung definierten Molekülen ermöglicht, in dem Raum lokalisiert zu werden, wo nicht nur die Isolierung und Reinigung dieser Polypeptide erleichtert ist, sondern auch wo CXCR3-bindende CXC-Chemokine und ihr Rezeptor in der Natur in Wechselwirkung treten.
  • Die Gestaltung der Einheiten, Liganden und Linker, sowie Verfahren und Strategien für die Konstruktion, Reinigung, den Nachweis und die Verwendung von Fusionsproteinen werden in der Literatur weithin diskutiert (Nilsson J et al., 1997, "Applications of chimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol. Band 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137). Zusätzliche Proteinsequenzen, die verwendet werden können, um die Antagonisten der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, werden unter extrazellulären Domänen membrangebundener Proteine, der konstanten Immunglobulinregion, Multimerisierungsdomänen, extrazellulären Proteinen, Proteinen, die ein Signalpeptid enthalten, Proteinen, die ein Exportsignal enthalten, gewählt. Die Wahl einer oder mehrerer dieser Sequenzen, die an die für die GAG-Bindung fehlerhafte Mutante eines CXCR3-bindenden CXC-Chemokins fusioniert werden sollen, ist für eine spezifische Verwendung und/oder ein spezifisches Reinigungsprotokoll dieses Mittels zweckmäßig.
  • Nützliche Konjugate oder Komplexe der Antagonisten der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet der Wechselwirkung mit einem Rezeptor oder anderen Proteinen bekannten Molekülen und Verfahren (radioaktive oder fluoreszierende Markierungen, Biotin), der therapeutischen Wirksamkeit (cytotoxische Mittel) oder unter Verbesserung der Mittel im Hinblick auf Wirksamkeit der Arzneistoffabgabe, wie zum Beispiel Polyethylenglycol und andere natürliche oder synthetische Polymere (Pillai O und Panchagnuia R, 2001), erzeugt werden. Im letzteren Fall können die Antagonisten nach einer ortsgerichteten Modifikation eines geeigneten Restes in der natürlichen oder mutierten Sequenz an einer internen oder terminalen Position hergestellt werden.
  • Die Literatur stellt Beispiele für Technologien zum Erzeugen Polymer-modifizierter oder konjugierter Chemokine bereit (WO 02/04015, WO 02/20033, WO 02/02132). Jeder Rest kann für das Ankoppeln verwendet werden, vorausgesetzt sie haben eine Seitenkette, die für eine Polymer-Ankoppelung zugänglich ist (d. h. die Seitenkette einer Aminosäure, die eine funktionelle Gruppe trägt, z. B. Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Cystein, Histidin usw.). Alternativ dazu kann ein Rest an diesen Stellen durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, die eine Seitenkette hat, die für eine Polymer-Ankoppelung zugänglich ist. Die Seitenketten der genetisch kodierten Aminosäuren können zur Polymer-Ankoppelung auch chemisch modifiziert werden, oder nicht natürliche Aminosäuren mit geeigneten funktionellen Gruppen der Seitenkette können eingesetzt werden. Die Polymer-Ankoppelung kann nicht nur an die Seitenkette der Aminosäure stattfinden, die in der Natur an einer spezifischen Position des Antagonisten vorkommt, oder an die Seitenkette einer natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäure, welche die Aminosäure ersetzt, die in der Natur an einer spezifischen Position des Antagonisten vorkommt, sondern auch an eine Kohlenhydrat- oder andere Einheit, die an der Zielposition an die Seitenkette der Aminosäure angekoppelt ist.
  • Für diese Zwecke geeignete Polymere sind biokompatibel, sie sind nämlich für biologische Systeme nicht toxisch, und viele derartige Polymere sind bekannt. Derartige Polymere können in der Beschaffenheit hydrophob oder hydrophil, bioabbaubar, nicht bioabbaubar oder eine Kombination davon sein. Diese Polymere schließen natürliche Polymere (wie zum Beispiel Kollagen, Gelatine, Cellulose, Hyaluronsäure) sowie synthetische Polymere (wie zum Beispiel Polyester, Polyorthoester, Polyanhydride) ein. Beispiele für hydrophobe, nicht abbaubare Polymere schließen Polydimethylsiloxane, Polyurethane, Polytetrafluorethylene, Polyethylene, Polyvinylchloride und Polymethylmethacrylate ein. Beispiele für hydrophile, nicht abbaubare Polymere schließen Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), Polyvinylalkohol, Poly(N-vinylpyrrolidon), Polyalkylene, Poly acrylamid und deren Kopolymere ein. Bevorzugte Polymere umfassen als aufeinanderfolgende Wiederholungseinheit Ethylenoxid, wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG).
  • Das bevorzugte Ankoppelungsverfahren setzt eine Kombination von Peptidsynthese und chemischer Ligation ein. Zweckmäßigerweise findet die Ankoppelung eines wasserlöslischen Polymers durch einen bioabbaubaren Linker statt, besonders an der aminoterminalen Region eines Proteins. Eine derartige Modifikation wirkt, indem sie das Protein in einer Vorläufer-(oder „Prodrug") Form bereitstellt, die nach dem Abbau des Linkers das Protein ohne Polymermodifikation freisetzt.
  • Die Antagonisten der Erfindung können durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden, einschließlich Technologien, die mit rekombinanter DNA in Beziehung stehen, und chemischen Synthesetechnologien.
  • Ein anderes Ziel der Erfindung sind die DNA-Moleküle, umfassend die DNA-Sequenzen, welche die vorstehend beschriebenen Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine kodieren, einschließlich im Wesentlichen gleicher Nucleotidsequenzen. „Im Wesentlichen gleiche Nucleotidsequenzen" schließt alle anderen Nucleinsäuresequenzen ein, die kraft der Degeneriertheit des genetischen Codes auch die angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren. Noch ein anderes Ziel der Erfindung sind Expressionsvektoren, welche die vorstehenden DNAs, Wirtszellen, die mit derartigen Vektoren transformiert sind, und das Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Antagonisten umfassen, welches das Züchten der Zellen und Gewinnen der exprimierten Proteine umfasst. Wenn der Vektor die Antagonisten als Fusionsprotein mit extrazellulären Proteinen exprimiert, die ein Exportsignal oder ein Signalpeptid enthalten, können die Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine in den extrazellulären Raum sezerniert werden und können im Hinblick auf weiteres Prozessieren aus gezüchteten Zellen leichter gewonnen und gereinigt werden oder alternativ dazu können die Zellen direkt verwendet oder verabreicht werden.
  • Diese Ziele der Erfindung können durch Kombinieren der durch die vorliegende Patentanmeldung über Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine bereitgestellten Offenbarung mit der Kenntnis allgemeiner Molekularbiologietechniken erreicht werden. Viele Bücher und Übersichtsartikel stellen Lehren darüber bereit, wie man rekombinante Proteine unter Verwendung von Vektoren und prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen kloniert und herstellt, wie zum Beispiel manche Titel in der Reihe „A Practical Approach", veröffentlicht von Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression"", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
  • Die DNA-Sequenz, welche die Proteine der Erfindung kodiert, kann in einen geeigneten episomalen oder nicht episomalen/homolog integrierenden Vektor eingefügt und ligiert werden, der in die geeigneten Wirtszellen durch alle geeigneten Mittel, um sie zu transformieren, eingeführt werden kann (Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, direkte Mikroinjektion usw.). Faktoren von Bedeutung beim Auswählen eines bestimmten Plasmid- oder viralen Vektors schließen ein: die Leichtigkeit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und aus denjenigen Empfängerzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten, die Kopienzahl des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht wird, und, ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Arten „hin- und herbewegen" zu können.
  • Die Vektoren sollten die Expression des isolierten oder Fusionsproteins, das den Antagonisten der Erfindung einschließt, in der prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle unter der Kontrolle von regulatorischen Transkriptionsinitiations-/-terminationssequenzen ermöglichen, die so gewählt werden, dass sie in der Zelle konstitutiv aktiv oder induzierbar sind. Eine wesentlich für derartige Zellen angereicherte Zelllinie kann dann isoliert werden, um eine stabile Zelllinie bereitzustellen.
  • Für eukaryotische Wirte (z. B. Hefen, Insekten- oder Säugerzellen) können unterschiedliche transkriptionelle und translationale regulatorische Sequenzen eingesetzt werden, je nach der Beschaffenheit des Wirtes. Sie können aus viralen Quellen, wie zum Beispiel Adenovirus, Rinderpapiliomavirus, Simian-Virus oder dergleichen abgeleitet sein, wo die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen in Verbindung stehen, das ein hohes Expressionsniveau hat. Beispiele sind der TK-Promotor des Herpes Virus, der frühe Promotor von SV40, der Promotor des Gal4-Gens von Hefe usw. Regulatorische Transkriptionsinitiationssignale können ausgewählt werden, die Repression und Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der Gene moduliert werden kann. Die Zellen, die durch die eingeführte DNA stabil transformiert worden sind, können selektiert werden, indem auch einer oder mehrere Marker eingeführt werden, welche die Selektion von den Expressionsvektor enthaltenden Wirtszellen emöglichen. Der Marker kann auch Phototrophie für einen auxotrophen Wirt, Biocidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle, wie zum Beispiel Kupfer und dergleichen, bereitstellen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den DNA-Gensequenzen verknüpft werden, die exprimiert werden sollen, oder durch Kotransfektion in die gleiche Zelle eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können für eine optimale Synthese von Proteinen der Erfindung auch benötigt werden.
  • Wirtszellen können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Eukaryotische Wirte werden bevorzugt, z. B. Säugerzellen, wie zum Beispiel menschliche, Affen-, Maus- und Quarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), weil sie den Proteinmolekülen posttranslationale Modifikationen bereitstellen, einschließlich der korrekten Faltung oder Glycosylierung an korrekten Stellen. Auch Hefezellen können posttranslationale Peptidmodifikationen, einschließlich Glycosylierung, ausführen. Etliche rekombinante DNA-Strategien existieren, die starke Promotorsequenzen und eine hohe Kopienzahl von Plasmiden benutzen, die zur Herstellung der gewünschten Proteine in Hefe benutzt werden können. Hefe erkennt Leader-Sequenzen in klonierten Säuger-Genprodukten und sezerniert Peptide, die Leader-Sequenzen tragen (d. h. Prä-Peptide).
  • Beispiele für chemische Synthesetechnologien sind Festphasensynthese und Flüssigphasensynthese. Als Festphasensynthese wird zum Beispiel die Aminosäure, die dem Carboxylterminus des zu synthetisierenden Peptids entspricht, an einen Träger gebunden, der in organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, und durch abwechselnde Wiederholung von Reaktionen, einer, bei der Aminosäuren, deren Aminogruppen und funktionelle Seitenkettengruppen mit geeigneten Schutzgruppen geschützt sind, eine nach der anderen der Reihe nach vom Carboxylterminus zum Aminoterminus kondensiert werden, und eine, bei der die an den Harz gebundenen Aminosäuren oder die Schutzgruppen der Aminogruppen der Peptide freigesetzt werden, wird somit die Peptidkette auf diese Weise verlängert. Festphasensyntheseverfahren sind weitgehend durch das tBoc- und das Fmoc-Verfahren klassifiziert, je nach dem Typ der verwendeten Schutzgruppe. Typischerweise verwendete Schutzgruppen schließen tBoc (t-Butoxycarbonyl), Cl-Z (2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Br-Z (2-Brombenzyloxycarbonyl), Bzl (Benzyl), Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), Mbh (4,4'-Dimethoxydibenzhydryl), Mtr (4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl), Trt (Trityl), Tos (Tosyl), Z (Benzyloxycarbonyl) und Cl2-Bzl (2,6-Dichlorbenzyl) für die Aminogruppen, NO2 (Nitro) und Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl) für die Guanidingruppen und tBu (t-Butyl) für die Hydroxylgruppen ein. Nach der Synthese des gewünschten Peptids wird es der Entschützungsreaktion unterworfen und aus der Festphase ausgeschnitten. Eine derartige Peptidausschneidereaktion kann mit Fluorwasserstoff oder Trifluormethansulfonsäure für das Boc-Verfahren und mit TFA für das Fmoc-Verfahren ausgeführt werden. Vollständig synthetische Chemokine werden in der Literatur offenbart (Brown A et al., 1996).
  • Eine Reinigung der synthetischen oder rekombinanten Antagonisten der Erfindung kann durch jedes der für diesen Zweck bekannten Verfahren, d. h. jedes herkömmliche Verfahren, das Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen einbezieht, ausgeführt werden. Bei einem weiteren Reinigungsverfahren, das bevorzugt zum Reinigen des Proteins der Erfindung verwendet werden kann, handelt es sich um Affinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper oder Affinitätsgruppen, die das Zielprotein binden und die auf einer Gelmatrix, die innerhalb einer Säule enthalten ist, hergestellt und immobilisiert werden. Verunreinigte Herstellungen, welche die Proteine enthalten, werden durch die Säule geleitet. Das Protein wird durch Heparin oder durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während die Verunreinigungen hindurchwandern. Nach dem Waschen wird das Protein durch eine Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke aus dem Gel eluiert. Alternativ dazu kann HPLC (Hochleistungs-Flüssigchromatographie) verwendet werden. Die Flution kann unter Verwendung eines auf Wasser-Acetonitril beruhenden Lösungsmittels, das gewöhnlich zur Proteinreinigung eingesetzt wird, ausgeführt werden. Die Erfindung schließt gereinigte Herstellungen der Verbindungen der Erfindung ein. Wie hierin verwendet, bezeichnet gereinigte Herstellungen Herstellungen, die zu mindestens 1%, vorzugsweise mindestens 5% nach dem Trockengewicht, aus den Verbindungen der Erfindung bestehen.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine als Medikamente, besonders als Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen (und in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, Exzipienten, Stabilisatoren, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln) zum Behandeln oder Verhindern von mit einer unerwünschten Aktivität CXCR3-bindender CXC-Chemokine in Beziehung stehenden Erkrankungen, die zu einer übermäßigen Migration und Aktivierung von Leukozyten, die deren Rezeptoren exprimieren, führen, wie zum Beispiel Autoimmun- und entzündliche Erkrankungen, sowie Krebs oder bakteriellen/viralen Infektionen. Nicht beschränkende Beispiele für derartige Erkrankungen sind die Folgenden: Arthritis, rheumatoide Arthritis (RA), psoriatische Arthritis, Osteoarthritis, systemischer Lupus erythematodes (SLE), systemische Sklerose, Skleroderma, Polymyositis, Glomerulonephritis, Fibrose, Leber- oder Lungenfibrose und -entzündung, allergische oder Hypersensitivitäts-Erkrankungen, Dermatitis, Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD), entzündliche Darmerkrankung (IBD), Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, multiple Sklerose, septischer Schock, HIV-Infektion, Transplantatabstoßung und mit Atherosklerose in Beziehung stehende vaskuläre Entzündung.
  • Angesichts des Stands der Technik, der die spezifische angiostatische Aktivität CXCR3-bindender CXC-Chemokine offenbart, können die Antagonisten der vorliegenden Erfindung als Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung oder Verhinderung von Erkrankungen verwendet werden, die eine Zunahme der Vaskularisierung benötigen, wie es in pathologischen Leiden wie zum Beispiel ischämischer Arterienerkrankung, Schlaganfall und verzögerter Wundheilung vorkommt. Die Stimulierung des Wachstums neuer Blutgefäße, die sich aus antagonisierenden angiostatischen Faktoren ergibt, kann bei der Behandlung dieser Leiden durch Wiederherstellen eines richtigen Kreislaufs helfen.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff einen Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine in den vorstehend definierten Formen enthalten: Proteine, sowie DNA, welche sie kodiert, oder Zellen, welche sie exprimieren. Das Verfahren zur Herstellung derartiger pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung oder Verhinderung von Erkrankungen, die mit übermäßiger Leukozytenmigration und -aktivierung in Beziehung stehen, oder mit Erkrankungen, die eine Zunahme der Vaskularisierung benötigen, umfasst das Kombinieren dieses Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist auch das Verfahren zum Behandeln oder Verhindern jeder der vorstehend erwähnten Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine der vorliegenden Erfindung.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können, zusätzlich zu dem Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine, geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger, biologisch kompatible Vehikel und Zusatzstoffe enthalten, die für die Verabreichung an ein Tier (zum Beispiel physiologische Kochsalzlösung) geeignet sind und letztendlich Hilfsmittel (wie Exzipienten, Stabilisatoren, Hilfsstoffe oder Verdünnungsmittel) umfassen, welche das Prozessieren der Wirkstoffe zu Herstellungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Derartige Zusammensetzungen können letztendlich mit anderen therapeutischen Zusammensetzungen, die synergistisch oder auf koordinierte Weise mit dem Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine der Erfindung wirken, kombiniert werden. Zum Beispiel sind ähnliche synergistische Eigenschaften von CC-Chemokin-Antagonisten in Kombination mit Cyclosporin demonstriert worden (WO 00/16796). Alternativ dazu können die anderen Zusammensetzungen auf einer Verbindung beruhen, die als therapeutisch aktiv gegen die spezifische Erkrankung (zum Beispiel IFN-beta für multiple Sklerose, lösliche TNF-Rezeptoren für rheumatoide Arthritis) bekannt ist.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede verträgliche Weise formuliert werden, um den Bedürfnissen der Verabreichungsweise gerecht zu werden. Zum Beispiel sind die Verwendung von Biomaterialien und anderen Polymeren zur Arzneistoffabgabe sowie die unterschiedlichen Techniken und Modelle, um eine spezifi sche Verabreichungsweise zu validieren, in der Literatur offenbart (Luo B und Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).
  • Eine „wirksame Menge" bezeichnet eine Menge des Wirkstoffes, die ausreicht, um den Verlauf und den Schweregrad der Erkrankung zu beeinflussen, was zur Verringerung oder Remission einer derartigen Pathologie führt. Die wirksame Menge hängt vom Verabreichungsweg und vom Zustand des Patienten ab.
  • „Pharmazeutisch verträglich" soll jeden Träger umfassen, der die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffes nicht stört und für den Wirt, an den er verabreicht wird, nicht toxisch ist. Zur parenteralen Verabreichung können zum Beispiel die vorstehenden Wirkstoffe zur Injektion in Vehikeln wie zum Beispiel Kochsalzlösung, Dextroselösung, Serumalbumin und Ringerscher Lösung in Form einer Dosierungseinheit formuliert werden. Träger können auch aus Stärke, Cellulose, Talkum, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silicagel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Natriumchlorid, entrahmter Trockenmilch, Glycerin, Propylenglycol, Wasser, Ethanol und verschiedenen Ölen, einschließlich derjenigen, die aus Erdöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung stammen (Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl) ausgewählt werden.
  • Jeder akzeptierte Verabreichungsmodus kann verwendet und durch Fachleute bestimmt werden, um die gewünschten Blutniveaus der Wirkstoffe zu etablieren. Zum Beispiel kann die Verabreichung auf verschiedenen parenteralen Wegen wie zum Beispiel subkutanen, intravenösen, intradermalen, intramuskulären, intraperitonealen, intranasalen, transdermalen, rektalen, oralen oder bukkalen Wegen geschehen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur verlängerten Verabreichung des Polypeptids in einer vorbestimmten Geschwindigkeit auch in Dosierungsformen mit verzögerter oder kontrollierter Freisetzung verabreicht werden, einschließlich Depotinjektionen, osmotischen Pumpen und dergleichen, vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten, die zur einmaligen Verabreichung genauer Dosierungen geeignet sind.
  • Eine parenterale Verabreichung kann durch Bolusinjektion oder durch allmähliche Perfusion mit der Zeit durchgeführt werden. Herstellungen zur parenteralen Verabreichung schließen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein, die auf dem Fachgebiet bekannte Hilfsmittel oder Exzipienten enthalten können und gemäß Routineverfahren hergestellt werden können. Zusätzlich können Suspensionen aktiver Verbindungen, wie geeignete Injektionssuspensionen mit Öl, verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle, zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride ein. Wässrige Injektionssuspensionen, die Substanzen enthalten können, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, schließen zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran ein. Gegebenenfalls kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen schließen geeignete Lösungen zur Verabreichung durch Injektion ein und enthalten von etwa 0,01 bis 99,99 Prozent, vorzugsweise von etwa 20 bis 75 Prozent des Wirkstoffes zusammen mit dem Exzipienten. Zusammensetzungen, die rektal verabreicht werden können, schließen Zäpfchen ein.
  • Es ist selbstverständlich, dass die verabreichte Dosierung vom Alter, Geschlecht, von der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der gleichzeitigen Behandlung, falls vorhanden, der Häufigkeit der Behandlung und der Beschaffenheit der gewünschten Wirkung abhängig ist. Die Dosierung wird auf die einzelne Versuchsperson zugeschnitten, wie für einen Fachmann selbstverständlich ist und durch ihn bestimmt werden kann. Die für jede Behandlung erforderliche Gesamtdosis kann durch mehrere Dosen oder in einer einzelnen Dosis verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann allein oder in Verbindung mit anderen Therapeutika verabreicht werden, die auf das Leiden gerichtet sind oder auf andere Symptome des Leidens gerichtet sind. Normalerweise besteht eine tägliche Wirkstoffdosierung zwischen 0,01 und 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Gewöhnlich sind 1 bis 40 Milligramm pro Kilogramm pro Tag, die in aufgeteilten Dosen oder in einer Form mit verzögerter Freisetzung gegeben werden, wirksam, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Zweite oder anschließende Verabreichungen können bei einer Dosierung durchgeführt werden, die gleich, geringer oder größer als die anfängliche oder vorherige Dosis ist, die dem Individuum verabreicht wurde.
  • Die Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele beschrieben. Die Beispiele beziehen sich auf die hierin nachstehend spezifizierten Abbildungen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: In-vitro-Charakterisierung der Heparinbindungseigenschaften von CXCL11-Mutanten
  • Material und Methoden
  • Expression der menschlichen CXCL11-Mutanten
  • Menschliche CXCL11-Mutanten wurden durch in-vitro-PCR-Mutagenese der DNA-Sequenz erzeugt, die menschliches CXCL11 (I-TAC, SWISSPROT Zugangsnr. 014625) und besonders die reife Form kodiert, die dem Abschnitt 22 – 94 des Vorläufermoleküls entspricht, das 73 Aminosäuren enthält (CXCL11-WT, 1; SEQ ID NO: 1).
  • Die Cluster von Punktmutationen, die mit jedem Mutein in Verbindung stehen (CXCL11-1 B3, SEQ ID NO: 2; CXCL11-2B3, SEQ ID NO: 3; CXCL11-3B3, SEQ ID NO: 4; CXCL11-4B4, SEQ ID NO: 5; 1A) wurden unter Verwendung von einem oder zwei PCR-Schritten mit 25 Zyklen (korrekturlesende Pwo DNA-Polymerase, Boehringer, Mannheim) in die kodierende Sequenz von CXCL11-WT eingeführt. Bei der Matrize handelte es sich um ein Plasmid, das auf dem kommerziellen Vektor pET-24d (Novagen) beruht, bei dem die Sequenz von reifem, menschlichem CXCL11 als Fusionsprotein mit einem aminoterminalen Anhang (MKKKWP), gefolgt von einer Spaltungsstelle für Caspase 8 (LETD), exprimiert wird. Die sich ergebenden 0,3 kb großen DNA-Fragmente, die durch PCR erhalten wurden, wurden mit BspHI und XhoI verdaut und in ein leeres Plasmid pET-24d zwischen die XhoI und NcoI Stellen subkloniert. CXCL11-WT und alle Muteine, denen in der reifen Form ein startendes Methionin fehlt, können als Proteine hergestellt werden, die 73 Reste ohne zusätzliche Reste enthalten, da der aminoterminale Anhang unter Verwendung eines endoproteolytischen Verdaus mit Caspase 8 entfernt wird.
  • CXCL11-WT und die Muteine wurden gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren exprimiert und getestet („Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, Band 138, Humana Press, 2000). Alle Konstrukte wurden durch Standardtechnologien der Molekularbiologie (PCR-Mutagenese und -Amplifikation, DNA-Sequenzierung, Restriktionsverdau) erhalten und kontrolliert und dann während des Klonierungsvorgangs im Stamm TG1 von E. coli erhalten. Die kodierenden Sequenzen wurden gewählt, um eine optimale Codon-Verwendung zur Expression in E. coli zu haben (Kane JF et al., 1995).
  • Die auf pET-24d beruhenden Plasmide, die CXCL-11-WT oder eine seiner Mutanten, kodieren wurden in kompetente BL21 (DE3) pLysS-Zellen von E. coli transferiert, in denen die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zur Kultur induziert wurde. Die Zellen wurden 3,5 Stunden nach der Induktion geerntet und in Lysepuffer (50 mM Tris/HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 5 mM Benzamidin/HCl, 1 mM DTT, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), DNAse 20mg/l) resuspendiert. Die Zellen wurden mit drei Durchgängen durch die French Press aufgebrochen. Die Suspension wurde dann bei 10.000 × g 60 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Das Einschlusskörperpellet, das CXCL-WT oder eines der Muteine enthielt, wurde (bei einer Konzentration von weniger als 1 mg/ml) in 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, das 6 M Guanidin/HCl und 1 mM DTT enthielt, solubilisiert und 30 Minuten lang bei 60 °C gerührt. Die Proteine wurden durch tropfenweise Verdünnung in ein Volumen, welches das 10-fache von dem der Guanidinlösung betrug, 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, das 0,01 mM oxidiertes Glutathion und 0,1 mM reduziertes Glutathion enthielt, renaturiert. Die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt. Dann wurde der pH-Wert mit Essigsäure auf 4,5 eingestellt und die Leitfähigkeit durch Verdünnung mit Wasser auf 20 Millisiemens gesenkt. Die Lösung wurde auf eine Kationenaustauschersäule (SP-Sepharose), die vorher in 40 mM Natriumacetat (pH 4,5) äquilibriert worden war, aufgetragen und das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl im gleichen Puffer eluiert. Die Fraktionen, die das Protein von Interesse enthielten, wurden vereinigt und gegen 3 Wechsel von 1% Essigsäure dialysiert. Unlösliches Material wurde durch 30 Minuten lange Zentrifugation bei 10.000 × g entfernt und der Überstand wurde lyophilisiert.
  • Die CXCL11-WT und allen Muteinen gemeinsame aminoterminale Leader-Sequenz (MKKKWPLETD) wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens mit Caspase 8 abgespalten. Die lyophilisierten Proteine wurden in 15 – 20 ml H2O aufgelöst und auf PD-10-Säulen aufgetragen, die vorher mit Caspase 8 Spaltungspuffer (15% Glycerin, 150 mM NaCl, 25 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA) äquilibriert worden war. Nach 4 – 5 Stunden langer Inkubation der Proteine bei Raumtemperatur mit dem proteolytischen Enzym (1 : 100, Enzym : Substrat, Gew./Gew.) wurde der pH-Wert der Spaltungslösung auf 4,5 eingestellt und die Leitfähigkiet durch Verdünnung mit 6 M Harnstoff auf 1 – 2 Millisiemens gesenkt (die Reaktion wurde gebenenfalls zwei- oder dreimal wiederholt). Die gespaltenen Proteine wurden von ungespaltenem Protein durch Kationenaustauschchromatographie auf einer SP-Sepharosesäule getrennt, die vorher mit 50 mM Natriumacetat (pH 4,5), das 6 M Harnstoff enthielt, äquilibriert worden war, und Proteine wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 2 molar im gleichen Puffer eluiert. Die gespaltenen Fraktionen wurden vereinigt und gegen drei Wechsel von 1% Essigsäure dialysiert, lyophilisiert, in 0,1% Trifluoressigsäure solubilisiert und schließlich zur Langzeitlagerung wieder lyophilisert.
  • Die Identität aller so exprimierten Proteine wurde durch Massenspektrometrie und die Reinheit durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) verifiziert.
  • Konstruktion von Zelllinien, die menschliches CXCR3 stabil exprimieren
  • Menschliches CXCR3 wurde aus Gesamt-RNA, die aus Leukozyten extrahiert wurde, die aus der Synovialis eines Patienten mit rheumatoider Arthritis isoliert wurden, durch eine reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung von Primern kloniert, die auf der menschlichen mRNA-Sequenz für CXCR3 beruhen, welche die gesamte kodierende Sequenz abdeckt (Genbank Nr. X95876; Nucleotid von 69 bis 1175). Alle Reagenzien für die RT-PCR-Reaktionen sind im Handel erhältlich (TrizolTM und SuperscriptTM von Life Technologies, oligodT15 von Promega) und wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers verwendet. Das so erhaltene 1,1 kb große PCR-Produkt wurde in den Säugerzell-Expressionsvektor pCDNA3.1zeo (Invitrogen) subkloniert, um pZeo-CXCR3 zu erzeugen.
  • Menschliche HEK293/EBNA- und L1.2-Zellen wurden durch Calciumphosphatpräzipitation unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionskits (Life Technologies) mit gereinigter Plasmid-DNA für pZeo-CXCR3 transfiziert, und positive Klone wurden unter Verwendung von Zeocin (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers selektiert. Die Expression von CXCR3 wurde durch FACS-Analyse (Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren) einzelner Klone unter Verwendung eines kommerziellen monoklonalen Antikörpers gegen menschliches CXCR3, der mit einem FITC-Fluorophor markiert war (R & D Systems; Kat. Nr. MAB160) und durch einen Radioliganden-Gleichgewichtsbindungsassay (siehe unten) bestätigt.
  • Chromatographische Assays von CXCL11-WT und von seinen Mutanten
  • CXCL11-WT oder jede seiner Mutanten wurde entweder auf eine Heparinsepharosesäule (unter Verwendung von 50 Mikrogramm Protein) oder eine SP-Sepharose-Kationenaustauschersäule (unter Verwendung von 50 Mikrogramm Protein) geladen. In beiden Fällen wurde die Säule in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 und 50 mM NaCl äquilibriert und das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 – 2 M NaCl im gleichen Puffer eluiert.
  • Heparin-Bindungsassay von CXCL11-WT und von seinen Mutanten
  • Serielle Verdünnungen von CXCL11-WT oder von seinen Mutanten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die den Bereich von 0,02 bis 30 μM abdeckten, wurden mit 2,5 μg/ml [3H]-Heparin 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Dreifache Ausführungen von 20 μl jeder Probe wurden auf eine P81 Unifilter-Platte mit 96 Vertiefungen (Whatman Inc), die mit einem Cellulosephosphatfilter ausgestattet war, transferiert. Die Platte wurde unter Verwendung einer Vakuumpumpe dreimal mit 200 μl PBS gewaschen, um nicht gebundenes, markiertes Heparin zu entfernen. Die Szintillationsflüssigkeit (50 μl) wurde zu jeder Vertiefung gegeben und die Radioaktivität in einem beta-Zähler gezählt (1 Minute/Vertiefung). Die Daten wurden unter Verwendung der Prism®-Software (GraphPad) analysiert.
  • Gleichgewichts-Kompetitions-Rezeptorbindungsassays
  • Die Assays wurden auf Membranen von HEK-Zellen, die CXCR3 stabil exprimierten, unter Verwendung eines Scintillation-Proximity-Assays (SPA) mit [125I]-CXCL11 als Tracer ausgeführt. Radioaktiv markiertes CXCL11 (rekombinantes menschliches I-TAC, Peprotech) wurde gemäß dem [125I]-Lieferanten (Amersham, spezifische Aktivität 2200 mCi/mol) erzeugt und getestet, auch um auf CXCR3-exprimierende HEK- und L1.2-Klone zu prüfen, die während der FACS-Analyse positiv gefärbt wurden.
  • Kompetitoren wurden durch serielle Verdünnungen (Bereich von 10–6 bis 10–12 M) des unmarkierten CXCL11 oder eines seiner Mutanten im Bindungspuffer (50 mM HEPES pH 7,2, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl und 0,5% Rinderserumalbumin) hergestellt. Weizenkeim-SPA-Kugeln (Amersham) wurden in PBS auf 50 mg/ml solubilisiert und in den Bindungspuffer auf 10 mg/ml verdünnt und die Endkonzentration im Assay betrug 0,25 mg/Vertiefung. Zellmembranen, die CXCR3 exprimierten, wurden bei –80 °C gelagert und in den Bindungspuffer auf 20 μg/ml verdünnt. Gleiche Volumina Membran- und Kugel-Stammlösungen wurden vor dem Durchführen des Assays gemischt, um den Hintergrund zu reduzieren. Die Endkonzentration an Membran betrug 5 μg/Vertiefung und die des [125I]-CXCL11 betrug 0,05 nM. Die Platten wurden 4 Stunden lang unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Radioaktivität wurde in einem beta-Zähler gezählt (1 Minute/Vertiefung). Daten von Proben in dreifacher Ausfertigung wurden unter Verwendung der Prism®-Software (GraphPad) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Menschliches CXCL11 wurde in vier mutierten Formen exprimiert, um die Sequenz und die Eigenschaften von Varianten, die Heparin nicht binden, zu identifizieren. Ziel der Mutationen waren vier Cluster basischer Reste und mindestens ein basischer Rest, der in allen CXCR3-bindenden Chemokinen konserviert ist, wurde in jedes Mutein eingeschlossen (1).
  • Die reife Form von menschlichem CXCL11 (CXCL11-WT) und die entsprechenden vier Muteine wurden in E. coli exprimiert (1A). Ein erstes Mutein, CXCL11-1B3, enthält drei Alanin-Substitutionen, die einen basischen Cluster am Aminoterminus von CXCL11-WT entfernen (Lysin 5, Arginin 6 und Lysin 8). Ein zweites Mutein (CXCL11-263) enthält drei Alanin-Substitutionen, die einen basischen Cluster um den Rest 50 von CXCL11-WT entfernen (Lysin 46, Lysin 49 und Arginin 52). Ein drittes Mutein (CXCL11-3B3) enthält drei Alanin-Substitutionen, die einen basischen Cluster um den Rest 60 von CXCL11-WT entfernen (Lysin 57, Lysin 59 und Arginin 62). Schließlich enthält ein viertes Mutein (CXCL11-4B4) vier Alanin-Substitutionen, die ein basisches Cluster um den Rest 70 von CXCL11-WT entfernen (Lysin 66, Lysin 67, Arginin 70 und Lysin 71).
  • Die Wirkungen von Substitutionen auf die Eigenschaften der Muteine von CXCL11-WT wurden zunächst durch Heparin- und Kationenaustauschchromatographie getestet. Der Vergleich der Elutionsprofile auf derartigen chromatographischen Medien stellt ein qualitatives Anzeichen auf den Beitrag unspezifischer elektrostatischer Wechselwirkungen auf Grund von basischen Aminosäuren zu den Heparinbindungseigenschaften bereit (Proudfoot A et al., 2001). Wie in Tabelle III gezeigt wird, wird der Unterschied der NaCl-Elutionskonzentration zwischen CXCL11-WT und jedem Mutein auf einer Kationenaustauschersäule (MonoS) und auf einer Heparinsäule berechnet. Die auf der MonoS-Säule erhaltenen Werte werden dann von denen, die auf den Heparinsäulen erhalten wurden, subtrahiert. Falls der sich ergebende Wert positiv ist, zeigt dies an, dass die mutierten Reste zur Wechselwirkung mit Heparin beitragen. Aus dieser Analyse scheint es, dass die in CXCL11-1B3 mutierten Reste nicht zur Bindung an Heparin beitragen, während die in CXCL11-2B3, CXCL11-3B3 und CXCL11-4B4 mutierten an der spezifischen Erkennung von GAGs beteiligt sind.
  • Eine direkte Messung der Bindung an Heparin wurde dann unter Verwendung von mit Tritium behandeltem Heparin und einer seriellen Verdünnung der rekombinanten Mutanten von CXCL11-WT durchgeführt (2). Die so erhaltenen radioaktiv markierten Komplexe wurden von nicht gebundenem [3H]-Heparin durch In-Kontakt-Bringen der Reaktion mit Cellulosephosphatfiltern, die fähig sind, diese Proteine effizient zurückzuhalten, getrennt, was deshalb eine direkte Auswertung der Menge des gebundenen Heparins ermöglicht. Dieser Assay zeigte, dass CXCL11-1B3 Heparinbindungseigenschaften hat, die denen von CXCL11-WT ähnlich sind, während alle anderen Mutanten verringerte Heparinbindungseigenschaften zeigen (bis zu 50% weniger gebundenes Heparin), was die Ergebnisse, die unter Verwendung chromatographischer Assays erhalten wurden, bestätigt (Tabelle III). Diese Beweise sind von besonderem Interesse, da das in CXCL11-1B3 mutierte basische Cluster als ein Motiv (BBXB) angeordnet ist, das anderen bekannten Heparinbindungsmotiven wie zum Beispiel dem von RANTES (Proudfoot A et al., 2001) viel ähnlicher ist, was die Beobachtung über die bemerkenswerte strukturelle Diversität und schwache Vorhersagbarkeit GAG-bindender Stellen in Chemokinen bestätigt (Lortat-Jacob H et al., 2002).
  • Schließlich wurde ein Gleichgewichts-Kompetitions-Rezeptorbindungsassay durchgeführt, um die Eigenschaften der Muteine bei der Bindung des spezifischen Rezeptors CXCR3 zu vergleichen (3). Proben, die eine konstante Menge radioaktiv markiertes, kommerzielles CXCL11 enthielten, wurden mit seriellen Verdünnungen von CXCL11-WT oder von einem der Muteine gemischt und dann mit Membranen inkubiert, die aus CXCR3-exprimierenden HEK-Zellen hergestellt waren. Während das Heparinbindungsmutein CXCL11-1B3 eine Verringerung der Affinität für CXCR3 von mehr als zwei Größenordnungen zeigt (sie ändert sich von sub-nanomolar zu sub-mikromolar) zeigen die anderen Muteine nur einen beschränkten Abfall in der Affinität für CXCR3, wobei sie im nanomolaren Bereich bleiben (Verringerung von einer Größenordnung oder weniger). Deshalb wird die Affinität für den Rezeptor bei carboxylterminalen Mutanten von CXCL11-WT, die für die Heparinbindung fehlerhaft sind, im Wesentlichen beibehalten, während die Mutationen am Aminoterminus die Rezeptorbindung spezifisch beeinflussen, ein Merkmal, das als klar ausgeprägt erscheint.
  • Beispiel 2: Auf Zellen beruhender Assay zur Charakterisierung eines in Bezug auf die Heparinbindung fehlerhaften CXCL11-Muteins
  • Material und Methoden
  • Chemotaxis-Assay
  • Der Assay wurde unter Verwendung von einer prä-B-Lymphom-Zelllinie (L1.2-Zellen), die mit einem Plasmid transfiziert waren, das die Expression von CXCR3 in diesen Zellen ermöglicht, und von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (ChemoTX-System, Neuroprobe) ausgeführt.
  • CXCR3-exprimierende L1.2-Zellen (siehe die vorstehende Beschreibung) wurden in RPMI-1640 Medium, das 5% inaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), L-Glutamin, 25 mM HEPES, 0,05 mM B-Mercaptoethanol und 0,8 mg/ml Geneticin G-418 enhielt, gezüchtet. Am Tag vor dem Assay wurde 5 mM n-Buttersäure zu dem Kulturmedium gegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 600 × g bei Raumtemperatur gewonnen und bei einer Konzentration von 1 × 106/ml in RPMI-1640 Medium, das 5% inaktiviertes FCS ohne Phenolrot enthielt, resuspendiert. Die Rezeptorexpression wurde, wie vorher beschrieben, durch FACS-Analyse unter Verwendung eines anti-CXCR3-Antikörpers geprüft, der mit einem FITC-Fluorophor markiert war.
  • Die rekombinanten CXCL11-Muteine wurden in 30 μl RPMI-Medium ohne Phenolrot seriell verdünnt (Bereich von 10–6 bis 10–12 M) und in die unteren Vertiefungen gegeben und ein Filter (Porengröße 8 μm) wurde über sie gelegt, wobei sichergestellt wurde, dass keine Luftblasen eingefangen werden, bevor das System verschlossen wurde. CXCR3-exprimierende L1.2-Zellen (25 μl einer Zellsuspension mit 2,5 × 104 Zellen/ml im gleichen Medium) wurde in die oberen Vertiefungen gegeben. Die Kammer wurde 4 Stunden lang unter 5% CO2 bei 37 °C inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann aus den oberen Vertiefungen verworfen und der Filter wurde entfernt. Die Zellen in den unteren Vertiefungen wurden in eine schwarze Platte mit 96 Vertiefungen transferiert und mindestens 1 h bei –80 °C eingefroren. Die Platte wurde aufgetaut und 200 μl/Vertiefung eines CyQUANT Farbstoff/Zelllyse-Puffergemisches (Molecular Probes) wurde zugegeben, um die Anzahl von Zellen, die gewandert waren, zu zählen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Victor2 Wallac Plattenlesegerät gezählt. Die Daten wurden unter Verwendung der Prism®-Software (GraphPad) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Die Eigenschaften von Muteinen von CXCL11-WT wurden getestet, indem von einem auf Zellen beruhenden Assay Gebrauch gemacht wurde. Die in einem Chemotaxis-Assay in L1.2-Zellen, die modifiziert waren, um CXCR3 zu exprimieren, erhaltenen Ergebnisse entsprechen denjenigen gut, die in dem vorstehend beschriebenen Rezeptorbindungsassay erhalten wurden. In Übereinstimmung mit ihrer geringen Affinität für CXCR3 war die Mutante CXCL11-1B3 unfähig, CXCR3-exprimierende L1.2-Zellen zu rekrutieren (4). Die anderen drei Mutanten waren weniger aktiv als CXCL11-WT, waren aber noch fähig, eine messbare Reaktion in diesem Chemotaxis-Assay hervorzurufen.
  • Beispiel 3: Auf Tieren beruhender Assay zur Charakterisierung eines in Bezug auf die Heparinbindung fehlerhaften CXCL11-Muteins
  • Materialien und Methoden
  • Peritoneale Zellrekrutierung
  • Weibliche Balb/C-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden am Tag 0 sensibilisiert. Alle Mäuse erhielten 5 subkutane Injektionen (4 × 50 μl in jede Gliedmaße und 1 × 100 μl ins Genick) von 10 nM CpG-ODN (Microsynth), gemischt mit 100 μg Ovalbumin (Sigma, Reinheitsgrad V) in sterilem PBS. Nach einer Woche wurde in den Balb/C-Mäusen durch intraperitoneale Injektion von 10 μg (0,5 mg/kg) rekombinantem CXCL11-Protein, verdünnt in steriler lipopolysaccharidfreier Kochsalzlösung (0,9%), eine Zellrekrutierung induziert. Wenn die Eigenschaften von CXCL11-Mutanten getestet wurden, wurden die angegebenen Mengen Protein, verdünnt in 0,2 ml der gleichen sterilen Lösung, 30 Minuten vor der Verabreichung eines Agonisten verabreicht. Die Mäuse wurden 4 Stunden später durch aerosolisiertes CO2 getötet und eine Peritonealspülung wurde dreimal mit 5 ml PBS durchgeführt. Die Spülungen wurden vereinigt und 5 Minuten lang bei 1500 × g zentrifugiert und die pelletierten Zellen wurden in einem Endvolumen von 1 Milliliter resuspendiert. Die Gesamtzahl hervorgerufener Leukozyten für jede Probe wurde mit einem Hämazytometer gezählt.
  • Assay der verzögerten Kontakthypersensitivität
  • Der Maus-Ohrschwellungstest zum Messen von Kontakthypersensitivität wurde wie beschrieben durchgeführt (Garrigue JL et al., 1994). Kurz gesagt, Mäuse wurden durch Auftragen von 25 μl einer 0,5% Lösung von Dinitrofluorbenzol (DNFB, Sigma Chemical Co.) in Azeton/Olivenöl (4 : 1) auf das rasierte Abdomen topisch vorsensibilisiert. Fünf Tage später wurden 20 μl 0,2% DNFB im gleichen Vehikel auf die rechten Ohren aufgetragen, und nur Vehikel auf die linken Ohren. Die Mäuse wurden von Tag 5 bis 9 täglich mit einer intraperitonealen Verabreichung von entweder 0,5 mg/kg CXCL11-3B3 oder nur Vehikel in der Kontrollgruppe behandelt. Die erste Behandlung wurde 1 Stunde vor der DNFB-Belastung verabreicht. Die Ohrdicke wurde mit einer Dickenmessuhr (Mitutoyo Corp.) gemessen und die Ohrschwellung wurde durch Subtrahieren des Wertes vor der Belastung von dem nach der Belastung und durch weiteres Subtrahieren jeder Schwellung des mit Vehikel belasteten gegenüberliegenden Ohrs geschätzt.
  • Ergebnisse
  • Weitere Beweise der in-vivo-Eigenschaften von Muteinen von CXCL11-WT wurden durch zwei Tiermodelle erhalten.
  • Beim ersten Assay handelte es sich um einen peritonealen Zellrekrutierungsassay (5). Da CXCR3 auf aktivierten Th1-Zellen exprimiert wird, wurden Mäuse vor dem Assay mit CpG-ODN sensibilisert, um eine Th1-Reaktion zu induzieren. In Übereinstimmung mit ihrer schwachen Aktivität als CXCR3-bindendes Protein und ihrer Unfähigkeit, Zellen in vitro zu rekrutieren, war die Mutante CXCL11-1B3 unfähig, Zellen in vivo zu rekrutieren, wenn sie in das Peritoneum verabreicht wurde. Sowohl CXCL11-2B3 als auch CXCL11-4B4 zeigten eine schwache Aktivität, aber CXCL11-3B3 war nicht fähig, eine Rekrutierung hervorzurufen (5).
  • Dann wurde die Fähigkeit dieser letzteren Mutante getestet, CXCL11-WT in vivo zu hemmen (6). CXCL11-3B3 zeigt keine eigenen Rekrutierungseigenschaften, aber beträchtliche antagonistische Aktivitäten gegenüber CXCL11-WT hinsichtlich der Induktion von Zellrekrutierung im Peritoneum, wenn es vorher in der gleichen Dosis verabreicht wurde (10 μg/Maus). Deshalb stellt die Außerkraftsetzung der Heparinbindung bei CXCL11 einen Antagonisten her, der fähig ist, die durch CXCL11 induzierte Zellrekrutierung in vivo zu hemmen.
  • Schließlich wurden die Eigenschaften von CXCL11-3B3 in einem Hautentzündungsmodell, dem Assay der verzögerten Kontakthypersensitivität, getestet. Diese Hapten-spezifische Hautentzündung wird durch T-Zellen vermittelt und erzeugt eine messbare Schwellung nach dem Belasten von Mäusen mit dem Kontaktsensibilisator 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) als Hapten. Die induzierte Schwellung war bei Mäusen, die mit einer intraperitonealen Verabreichung von CXCL11-3B3 behandelt worden waren, während des ganzen Behandlungszeitraums signifikant niedriger, wenn sie mit der Wirkung verglichen wurde, die in Mäusen beobachtet wurde, die mit Vehikel allein behandelt wurden (7).
  • Angesichts der Ergebnisse, die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können neue Antagonisten CXCR3-bindender CXC-Chemokine auf der Grundlage der Erkenntnisse dieser Patentanmeldung gestaltet werden, besonders bei Mutanten von menschlichem CXCL11, menschlichem CXCL10 und menschlichem CXCL9, die in Bezug auf die Heparinbindung fehlerhaft sind, die einzelne oder mehrfache Substitutionen der konservierten basischen Aminosäuren im Carboxylterminus und, letztendlich, anderer basischer Reste, die in einem oder mehreren spezifischen CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen konserviert sind, und/oder eines oder mehrerer basischer Reste, die sie umgeben, enthalten.
  • Die Eigenschaften alternativer Moleküle, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart werden, können durch jedes der vorstehend beschriebenen Verfahren getestet werden, oder indem von anderen validierenden, auf dem Fachgebiet bekannten Ansätzen Gebrauch gemacht wird, wie ausführlich in der Literatur rezensiert wird („Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, Band 138, Humana Press, 2000; „Chemokine Receptors", Methods in Enzymology, Band 288, Academic Press, 1997). TABELLE I
    Figure 00310001
    TABELLE II
    Figure 00320001
    TABELLE III
    Figure 00330001
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001

Claims (28)

  1. Antagonisten von CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen, bestehend aus Mutanten von CXCL11, CXCL10 oder CXCL9, bei denen mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 46, 62, 66 und 70.
  2. Antagonisten nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem CXCR3-bindenden CXC-Chemokin um menschliches CXCL11 handelt und mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 49, 52, 57, 59, 67 oder 71.
  3. Antagonisten nach Anspruch 2, wobei eine der folgenden Kombinationen basischer Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: a) 46, zusammen mit 49 und/oder 52, b) 62, zusammen mit 57 und/oder 59, c) 66 und 70, zusammen mit 67 und/oder 71, oder d) 62 und 66, zusammen mit einem oder mehreren der Folgenden: 57, 59, 67, 70 oder 71.
  4. Antagonisten nach Anspruch 2 oder 3, wobei mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit mensch lichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 5, 6, 8, 17, 20, 26 oder 38.
  5. Antagonisten nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem CXCR3-bindenden CXC-Chemokin um menschliches CXCL10 handelt und mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 47, 48, 51, 52, 59, 74 oder 75.
  6. Antagonisten nach Anspruch 5, wobei eine der folgenden Kombinationen basischer Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: a) 46 und 52, zusammen mit 47, 48 oder 51, b) 59 und 62, c) 66 und 70, zusammen mit 74 und/oder 75, oder d) 62 und 66, zusammen mit 59 und/oder 70.
  7. Antagonisten nach Anspruch 5 oder 6, wobei mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 5, 8, 22, 26 oder 38.
  8. Antagonisten nach Anspruch 1, wobei es sich bei den CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen um menschliches CXCL9 handelt und der basische Rest 67, der auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert ist, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist.
  9. Antagonisten nach Anspruch 8, wobei eine der folgenden Kombinationen basischer Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: a) 62, zusammen mit 66 und/oder 67; b) 66 und 67, oder d) 66 und 70, zusammen mit einem oder mehreren der Folgenden: 67, 74 oder 75.
  10. Antagonisten nach Anspruch 8 oder 9, wobei mindestens einer der folgenden basischen Reste, die auf der Grundlage der Positionen im Alignment mit menschlichem, reifem CXCL11, wie in 1B (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, nummeriert sind, zusätzlich durch Alanin, Glycin, Serin, Threonin, Prolin, Glutaminsäure, Glutamin, Asparaginsäure oder Asparagin substituiert ist: 5, 6, 8, 25, 28 oder 38.
  11. Antagonisten nach den Ansprüchen 1 bis 10, wobei die basischen Reste mit Alanin oder Glycin substituiert sind.
  12. Antagonisten nach Anspruch 11, bestehend aus der Sequenz von CXCL11-2B3 (SEQ ID NO: 3), CXCL11-3B3 (SEQ ID NO: 4) oder CXCL11-4B4 (SEQ ID NO: 5).
  13. Antagonisten nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei eine oder mehrere Aminosäuren, die zugefügt, deletiert oder substituiert worden sind, zu den ersten neun Aminosäuren in der aminoterminalen Domäne des menschlichen, reifen CXCR3-bindenden CXC-Chemokins gehören.
  14. Antagonisten nach den Ansprüchen 1 bis 13, wobei eine oder mehrere Aminosäuren mutiert worden sind, um die Aggregationseigenschaften des Antagonisten zu senken.
  15. Antagonisten von CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen, umfassend die Antagonisten nach den Ansprüchen 1 bis 14, und eine Aminosäuresequenz, die zu einer anderen Proteinsequenz als das entsprechende CXCR3-bindende CXC-Chemokin gehört.
  16. Antagonisten nach Anspruch 15, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu einer oder mehrerer dieser Proteinsequenzen gehört: extrazelluläre Domänen von membrangebundenem Protein, konstante Immunglobulinregion, Multimerisierungsdomänen, extrazelluläre Proteine, Proteine, die ein Signalpeptid enthalten, Proteine, die ein Exportsignal enthalten.
  17. Antagonisten nach den Ansprüchen 1 bis 16, wobei der Antagonist in Form eines aktiven Konjugats oder Komplexes mit einem Molekül vorliegt, das unter radioaktiven Markierungen, Biotin, fluoreszierenden Markierungen, zytotoxischen Mitteln oder Mitteln zur Arzneistoffabgabe ausgewählt ist.
  18. DNA-Moleküle, umfassend die DNA-Sequenzen, welche die Antagonisten nach den Ansprüchen von 1 bis 16 kodieren.
  19. Expressionsvektoren, umfassend die DNA-Moleküle nach Anspruch 18.
  20. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Wirtszelle nicht um eine menschliche embryonale Zelle handelt.
  21. Verwendung eines der Antagonisten nach den Ansprüchen von 1 bis 17, der DNA nach den Ansprüchen 18 oder 19 oder der Zelle nach Anspruch 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention von Erkrankungen, die mit übermäßiger Leukozytenmigration und -aktivierung in Beziehung stehen.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei es sich bei der Erkrankung um eine entzündliche Erkrankung, eine Autoimmunerkrankung oder eine Infektion handelt.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Erkrankung um multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, HIV-1-Infektion, Typ-1-Diabetes oder Transplantatabstoßung handelt.
  24. Verwendung eines der Antagonisten nach den Ansprüchen von 1 bis 17, der DNA nach den Ansprüchen 18 oder 19 oder der Zelle nach Anspruch 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention von Erkrankungen, die eine Zunahme der Vaskularisierung benötigen.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich bei der Erkrankung um eine ischämische Herzerkrankung handelt.
  26. Verwendung eines der Antagonisten nach den Ansprüchen von 1 bis 17, der DNA nach den Ansprüchen 18 oder 19 oder der Zelle nach Anspruch 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention von Krebs.
  27. Verfahren zur Herstellung von Antagonisten nach den Ansprüchen von 1 bis 14, umfassend das Züchten der transformierten Zellen nach Anspruch 20 und das Gewinnen der exprimierten Proteine.
  28. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antagonisten von CXCR3-bindenden CXC-Chemokinen nach den Ansprüchen von 1 bis 17, die DNA nach den Ansprüchen 18 oder 19 oder die Zelle nach Anspruch 20 als wirksamen Bestandteil enthält.
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