ES2282666T3 - Antagonistas de quimiocinas cxc de union a cxcr3. - Google Patents

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Abstract

Antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que consisten en mutantes de CXCL11, CXCL10 ó CXCL9 en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 46, 62, 66 y 70.

Description

Antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3.
Antecedentes de la invención
Las quimiocinas son proteínas secretadas proinflamatorias de pequeñas dimensiones (70-130 aminoácidos) principalmente implicadas en la migración direccional y la activación de células, especialmente la extravasación de leucocitos desde la sangre a localizaciones tisulares que necesitan el reclutamiento de estas células (Baggiolini M et al., 1997; Fernández EJ y Lolis E, 2002).
Dependiendo del número y de la posición de las cisteínas conservadas en la secuencia, las quimiocinas se clasifican en quimiocinas C, CC, CXC y CX_{3}C. Una serie de receptores de membrana celular, todos receptores heptahelicoidales acoplados a proteína G, son las moléculas de unión que permiten que las quimiocinas ejerzan su actividad biológica en las células objetivo, que presentan combinaciones específicas de receptores dependiendo de su estado y/o tipo. Los efectos fisiológicos de las quimiocinas resultan de un sistema complejo e integrado de interacciones concurrentes: los receptores a menudo tienen especificidades solapadas por el ligando, de forma que un único receptor puede unir diferentes quimiocinas, así como una única quimiocina se puede unir a diferentes receptores.
Normalmente las quimiocinas se producen en la localización de una lesión, inflamación u otra alteración tisular de forma paracrina o autocrina. Sin embargo, la migración y la activación específica del tipo celular en los procesos inflamatorios e inmunes no es la única actividad de las quimiocinas, ya que otras actividades fisiológicas, tales como la hematopoyesis o la angiogénesis, parecen estar reguladas por algunas de estas proteínas.
Aunque existen desventajas potenciales al usar las quimiocinas como agentes terapéuticos (tendencia a agregarse y unión inespecífica, en particular), las quimiocinas ofrecen la posibilidad de intervención terapéutica en estados patológicos asociados a tales procesos, en particular mediante la inhibición de quimiocinas específicas y de sus receptores con el propósito de evitar el reclutamiento y la activación excesiva de células, en particular leucocitos (Proudfoot A, 2000; Baggiolini M, 2001; Haskell CA et al., 2002).
Entre los receptores de quimiocinas, CXCR3 (también conocido como receptor 9 acoplado a proteína G o GPR9) es un receptor de membrana que se expresa en cantidades elevadas en las células T activadas por IL-2 (por ejemplo linfocitos T CD4+ CD8+), células citolíticas naturales, células B y (a niveles inferiores y/o de una manera restringida por el ciclo celular) en otros tipos de células no hematopoyéticas, tales como neuronas, células de la glándula mamaria y células del túbulo proximal.
La peculiaridad de CXCR3 es que, a diferencia de otros receptores de quimiocinas, muestra un número reducido de ligandos de quimiocinas CXC (CXCLs) específicos: CXCL9 (también conocido como monocina inducida por interferón \gamma, MIG, miembro 9 de la subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas o SCYB9), CXCL10 (también conocido como proteína 10 inducible por interferón \gamma, IP-10, miembro 10 de la subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas, o SCYB10), y CXCL11 (también conocido como quimioatrayente \alpha para células T inducible por interferón, I-TAC, proteína 9 inducible por interferón \gamma, IP-9, H174, \beta-R1, miembro 11 de la subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas, o SCYB11).
Estas tres quimiocinas no solamente tienen afinidad en el intervalo nanomolar por CXCR3, sino que comparten otras características importantes: muchos aminoácidos están conservados entre sus secuencias, todas carecen del motivo "ELR" en su extremo aminoterminal, todas se inducen mediante interferón \gamma, y todas parecen tener un papel prominente en la migración de leucocitos (células Th1) en relación no solamente con la inflamación y la autoinmunidad, sino también con el rechazo de injertos y la isquemia. Estas actividades se han demostrado en modelos animales, tales como ratones con genes inactivados y ratones tratados con anticuerpos específicos para la quimiocina o el receptor. Por ejemplo, la administración de anticuerpos dirigidos contra los dominios extracelulares de CXCR3, o contra sus ligandos, da como resultado la inhibición específica de las respuestas inflamatorias mediadas por este receptor (documento WO 01/72334; documento WO 01/78708; documento WO 02/15932).
El estado de la técnica muestra muchos datos sobre los mecanismos moleculares asociados a la interacción entre CXCR3 y sus ligandos, y de su importancia para la fisiología humana. Cuando se compara con CXCL9 y CXCL10, CXCL11 parece ser el inductor más potente de la activación, interiorización y migración transendotelial mediada por CXCR3 en leucocitos humanos y de ratón (Cole K et al., 1998; Lu B, et al. 1999, Sauty A et al., 2001). La actividad o la expresión de estas moléculas puede estar considerablemente regulada y modulada en relación con diversos estados patológicos, como se demostró en modelos animales o en muestras clínicas asociadas a rechazo de injertos (Meyer M et al., 2001), tuberculosis (Sauty A et al., 1999), arteriopatía coronaria por trasplante (Kao J et al., 2003), replicación de VIH-1 (Lane BR et al., 2003), diabetes tipo 1 (Frigerio S et al., 2002), ulceración del epitelio intestinal (Sasaki S et al., 2002), infección microbiana (Cole A et al., 2001), reacciones granulomatosas sarcoideas (Agostini C et al., 1998), lesiones ateroescleróticas (Mach F et al., 1999), esclerosis múltiple (Sorensen T et al., 1999; documento WO02/098346), cáncer (Trentin L et al., 1999; Robledo MM et al., 2001), enfermedades cutáneas (documento WO 02/43758; Flier J et al., 2001), nefropatías (Romagnani P et al., 1999), enfermedades del tiroides (Romagnani P et al., 2002), lesiones cerebrales o de la médula espinal (documento WO 03/006045), y muchas otras enfermedades autoinmunes o inflamatorias.
Además, también se ha observado que la proliferación de las células endoteliales se puede modular mediante la interacción entre CXCR3 y sus ligandos (Luster A et al., 1995; Romagnani P et al., 2001). Las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 muestran una actividad angiostática sobre las células endoteliales, que se puede inhibir mediante anticuerpos anti-CXCR3, lo que sugiere una relación estricta entre la activación de este receptor y la regulación del ciclo celular, al menos en el endotelio.
Los estudios sobre las relaciones estructura-actividad indican que las quimiocinas tienen dos sitios principales de interacción con sus receptores, la región aminoterminal flexible y el bucle conformacionalmente rígido que sigue a la segunda cisteína. Se cree que las quimiocinas se unen a los receptores por medio de la región del bucle, y se cree que este contacto facilita la unión de la región aminoterminal que da como resultado la activación del receptor. Esta importancia de la región aminoterminal se ha demostrado también ensayando quimiocinas naturales y sintéticas en las que este dominio está modificado o acortado. Este procesamiento, tras digestión proteolítica, mutagénesis o modificación química de los aminoácidos, puede activar o dejar a estas moléculas completamente inactivas, por lo que se generan compuestos con actividad agonista y/o antagonista (documento US 5.739.103; documento WO 02/59301).
Estas observaciones sugieren que la regulación del reclutamiento de leucocitos durante las reacciones inflamatorias o inmunitarias se basa en una combinación de tales efectos agonistas y antagonistas, como se demostró para las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 y muchas otras quimiocinas (Loetscher P y Clark-Lewis I, 2001; Lambeir A et al., 2001). Así, se considera que las quimiocinas con modificaciones específicas en la región aminoterminal tienen potencial terapéutico para las enfermedades inflamatorias y autoinmunes (Schwarz y Wells, 1999).
Como muchas otras moléculas solubles señalizadoras de células (interleucinas, factores de crecimiento), las quimiocinas muestran interacciones fisiológicas no solamente con los receptores celulares, sino también con los glucosaminoglucanos (GAGs), aunque con diversas afinidades. Estas moléculas cargadas negativamente están formadas por repeticiones de disacáridos (tales como heparina, sulfato de condroitina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano y ácido hialurónico), y se dan de forma natural en las superficies celulares, en la matriz extracelular o en la circulación. Pueden estar presentes en formas aisladas o unidas a proteínas (proteoglicanos, o PGs) después de la adición postraduccional de GAGs en los residuos de serina.
Las quimiocinas, como las otras proteínas de unión a GAG, tienen residuos básicos (principalmente arginina y lisina) agrupados en porciones cortas de su secuencia que son adecuadas para este propósito, pero tales motivos están estructurados de diferentes maneras para cada quimiocina, o grupo de quimiocinas sumamente homólogas. Algunos de estos sitios de unión a GAG se han asociado a secuencias consenso específicas, tales como motivos BBXB (en los que B representa un residuo básico, y X cualquier otro residuo) u otras disposiciones (Kuschert G et al., 1999; Proudfoot A et al., 2001).
La consecuencia principal de esta interacción es la agregación de las quimiocinas, un estado que se cree que proporciona protección contra la proteolisis, así como un mecanismo para la liberación controlada y que genera un gradiente de quimiocinas, que participa en el reconocimiento y en la presentación de las quimiocinas a los receptores en forma de oligómeros (Hoogewerf AJ et al., 1997; Kuschert G et al., 1999). La interacción con GAGs y la formación de estos gradientes se ha demostrado claramente para muchas quimiocinas, y se ha medido la afinidad relativa. Por lo tanto, se ha propuesto que la modulación de tales interacciones también puede representar una aproximación terapéutica en la enfermedad inflamatoria (Ali S et al., 2001; Patel D et al., 2001).
Los medios para conseguir un efecto terapéutico basándose en las interacciones GAGs-quimiocinas conocidas en la técnica implican la generación de análogos de GAGs que modulan la interacción entre los GAGs endógenos y las quimiocinas (documento WO 94/20512), el uso de heparanasa para eliminar los GAGs (documento WO 97/11684), la administración de complejos quimiocina-GAGs (documento WO 99/62535), la modificación del dominio de unión a GAGs con polímeros (documento WO 02/04015), o la sustitución de los residuos implicados en la actividad de unión a GAG (documento WO 02/28419).
Aunque se han realizado estudios exhaustivos sobre ciertas quimiocinas, está establecido que no es posible prever, a partir de la homología de secuencias con una quimiocina que tiene una similitud limitada o motivos de proteína de unión a GAG, qué residuos básicos específicos se tienen que modificar con sustituciones no conservativas para reducir la unión a GAG, ya que hay una diversidad estructural significativa de dominios de unión a GAG en la familia de proteínas quimiocinas (Lortat-Jacob H et al., 2002). Los métodos para detectar o identificar ligandos, inhibidores o promotores de CXCR3 se conocen también en la técnica (documento US 6.140.064). Sin embargo, ninguna de estas aproximaciones se puede aplicar realmente para generar y estudiar CXCL9, CXCL10 o CXCL11 deficientes de unión a GAG. No se conocen los requerimientos estructurales para la interacción con GAGs, ni su estructura tridimensional, para CXCR3 y para sus ligandos. No hay ninguna descripción en el estado de la técnica de cuáles pueden ser los residuos de estas quimiocinas implicados en la unión a GAG, así como los efectos in vivo que se derivan de su sustitución no conservativa en las proteínas mutantes.
Resumen de la invención
Se ha descubierto que los residuos básicos específicos en el extremo carboxiterminal de una quimiocina humana CXC de unión a CXCR3 (CXCL11) son responsables de la interacción con glucosaminoglucanos (GAGs).
La eliminación de estos residuos básicos mediante sustituciones no conservativas (por ejemplo, con alaninas) conduce a la generación de mutantes de CXCL11 que no solamente tienen una tendencia considerablemente reducida a interaccionar con GAGs, sino también una actividad antagonista in vivo sobre CXCL11. Tales datos se pueden aprovechar para usar mutantes de CXCL11 y de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 más similares (CXCL10 y CXCL9) como antagonistas de las quimiocinas naturales correspondientes. Los compuestos preparados de acuerdo con la presente invención se pueden usar para bloquear la actividad de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 sobre las células que expresan CXCR3, por lo que se proporcionan composiciones terapéuticas para el uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con una migración excesiva de células T activadas, tales como rechazo de injertos y enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo 1), cáncer, infección por VIH-1, y enfermedades que necesitan un incremento de la vascularización, tales como cardiopatía isquémica.
Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada.
Descripción de las figuras
Figura 1: (A) Secuencias de aminoácidos de CXCL11 humano maduro (CXCL11-TN; ID SEC Nº: 1) y de los mutantes generados a partir de esta secuencia, que se han expresado y ensayado como se describe en los ejemplos (los aminoácidos mutados están en negrita y subrayados; ID SEC Nº: 2-5). La numeración se basa en la secuencia humana madura, que carece de un péptido señal de 21 aminoácidos de longitud. (B) Alineación de la secuencia común para las formas maduras de las siguientes quimiocinas CXC de unión a CXCR3: CXCL11 de ratón (mCXCL11; Nº Acc. SWISSPROT Q9JHH5; ID SEC Nº: 8), CXCL11 humano (hCXCL11; Nº Acc. SWISSPROT O14625; ID SEC Nº: 1), CXCL10 humano (hCXCL10; Nº Acc. SWISSPROT P02778; ID SEC Nº: 6), y CXCL9 humano (hCXCL9; Nº Acc. SWISSPROT Q07325; ID SEC Nº: 7). Los residuos en negrita y subrayados en la secuencia de CXCL11 humano se han mutado a alanina en las diferentes variantes presentadas en los ejemplos (residuos 5, 6, 8, 46, 49, 52, 57, 59, 62, 66, 67, 70 y 71). Los otros residuos básicos de CXCL11 humano, y todos los residuos básicos en CXCL11 de ratón, CXCL10 humano y CXCL9 humano están subrayados. Las cisteínas y los residuos básicos conservados entre las quimiocinas humanas CXC de unión a CXCR3 se indican en la línea recuadrada debajo de la alineación, respectivamente, como C y B. La numeración se basa en las secuencias humanas maduras, que carecen de un péptido señal que incluye los 21 (mCXCL11, hCXCL11 y hCXCL10) o 22 (hCXCL9) aminoácidos N-terminales. La forma madura de mCXCL11, hCXCL11 y hCXCL10 se muestra totalmente, mientras la forma madura de hCXCL9 tiene 25 aminoácidos más en el extremo carboxiterminal.
Figura 2: Gráfico que representa los resultados del ensayo de unión a heparina realizado con [^{3}H]-heparina, que compara la actividad de CXCL11-TN y la de los mutantes de CXCL11 indicados en el intervalo micromolar.
Figura 3: Gráfico que representa los resultados del ensayo de unión competitiva a receptor en equilibrio realizado monitorizando el porcentaje de [^{125}I]-CXCL11 desplazado de membranas de células HEK que expresan CXCR3, tras la adición de CXCL11-TN y de los mutantes de CXCL11 indicados en el intervalo de concentraciones pico/micro-molar.
Figura 4: Gráfico que representa los resultados del ensayo de quimiotaxis realizado en células L1.2 que expresan CXCR3 mediante el uso de CXCL11-TN o de los mutantes de CXCL11 indicados.
Figura 5: Gráfico que resume los resultados del ensayo de reclutamiento celular peritoneal, realizado en ratones Balb/C hembra mediante el uso de CXCL11-TN o de los otros mutantes de CXCL11 indicados, comparado con un control con tampón de solución salina. El nivel de significación estadística se representa con el número de asteriscos.
Figura 6: Gráfico que resume los resultados de la capacidad de CXCL11-3B3 para inhibir el reclutamiento celular inducido por CXCL11-TN (ambos administrados en una cantidad de 10 \mug). Se administró solución salina o CXCL11-3B3 30 minutos antes de la administración de CXCL11-TN.
Figura 7: Gráfico que resume los resultados del ensayo de hipersensibilidad retardada por contacto mediante el uso de solución salina, como control, o de CXCL11-3B3 a una dosis de 0,5 mg/kg. El efecto se mide en cuanto al volumen de inflamación de la oreja en los días posteriores al tratamiento (D5, D6, D7, etc.) con un calibre de espesor con escala circular.
Descripción detallada de la invención
El objetivo principal de la presente invención es proporcionar antagonistas nuevos de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que consisten en mutantes deficientes de unión a GAG de estas quimiocinas, en los que uno o más de los residuos básicos conservados en el extremo carboxiterminal se han eliminado mediante sustituciones no conservativas. En particular, los mutantes de CXCL11, CXCL10 o CXCL9 que tienen propiedades antagonistas son aquellos en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos elegidos entre 46, 62, 66 y 70, como se enumeran en la secuencia de CXCL11 humano maduro, está sustituido por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina.
Los residuos básicos que se pueden mutar adicionalmente en los mutantes preferidos son aquellos conservados en una o más quimiocinas CXC de unión a CXCR3 específicas (en quimiocinas humanas o de otra especie), y/o aquellos que rodean a los residuos básicos conservados. Se generan preferiblemente múltiples mutantes sustituyendo al menos dos residuos básicos conservados consecutivos de una manera no conservativa, pero se describen otras combinaciones posibles en la presente invención.
La presente solicitud de patente proporciona datos in vivo e in vitro sobre las actividades de unión y de antagonismo de los mutantes de CXCL11 recombinantes nuevos en los que se sustituyeron de forma no conservativa combinaciones específicas de residuos básicos por alaninas. Estos datos, combinados con el conocimiento de la secuencia y de las propiedades de otras quimiocinas CXC de unión a CXCR3 sumamente conservadas, sugieren que el sitio básico conservado específico no solamente puede desempeñar un papel general en la actividad biológica de estas quimiocinas, sino que se puede modificar, según la presente invención, para obtener una serie de moléculas que tienen propiedades antagonistas contra la quimiocina natural.
En una realización principal, los antagonistas de CXCL11 humano consisten en mutantes de CXCL11 humano en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 49, 52, 57, 59, 67 ó 71. Más preferiblemente, los mutantes de CXCL11 tienen una de las siguientes combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
a) 46, junto con 49 y/o 52;
b) 62, junto con 57 y/o 59;
c) 66 y 70, junto con 67 y/o 71; o
d) 62 y 66, junto con uno o más de los siguientes: 57, 59, 67, 70 ó 71.
Los ejemplos describen los mutantes incluidos en la definición de las combinaciones (a), (b) o (c), mientras la combinación (d) incluye dos residuos básicos conservados consecutivos, junto con residuos básicos cercanos.
Finalmente, los residuos básicos de CXCL11 que se pueden mutar adicionalmente son los conservados en otra quimiocina CXC de unión a CXCR3 y/o de otra especie (tal como ratón). Por lo tanto, en otros mutantes de CXCL11 preferidos al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 6, 8, 17, 20, 26 ó 38.
En otra realización principal, los antagonistas de CXCL10 humano consisten en mutantes de CXCL10 humano en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 47, 48, 51, 52, 59, 74 ó 75. Más preferiblemente, los mutantes de CXCL10 tienen una de las siguientes combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
a) 46 y 52, junto con 47, 48 ó 51;
b) 59 y 62;
c) 66 y 70, junto con 74 y/o 75; o
d) 62 y 66, junto con 59 y/o 70.
Finalmente, los residuos básicos de CXCL10 que se pueden mutar adicionalmente son los conservados en otra quimiocina CXC de unión a CXCR3 y/o de otra especie (tal como ratón). Por lo tanto, en otros mutantes de CXCL10 preferidos al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 8, 22, 26 ó 38.
En una realización principal adicional, los antagonistas de CXCL9 humano consisten en mutantes de CXCL9 humano en los que el residuo básico 67, numerado de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina. Más preferiblemente, los mutantes de CXCL9 tienen una de las siguientes combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
a) 62, junto con 66 y/o 67;
b) 66 y 67; o
c) 66 y 70, junto con uno o más de los siguientes: 67, 74 ó 75.
Finalmente, los residuos básicos de CXCL9 que se pueden mutar adicionalmente son los conservados en otra quimiocina CXC de unión a CXCR3 y/o de otra especie (tal como ratón). Por lo tanto, en otros mutantes de CXCL9 preferidos al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 6, 8, 25, 28 ó 38.
El aminoácido que sustituye al residuo básico es preferiblemente un aminoácido pequeño apolar como alanina o glicocola, pero son apropiados otros aminoácidos, con tal de que tengan una carga y unas dimensiones que sean incompatibles con la unión a GAG y, al mismo tiempo, interfieran escasamente con otras propiedades de la proteína. Los aminoácidos adecuados para las sustituciones son serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina. Los antagonistas de CXCL11 humano que tienen sustituciones por alanina en combinación con residuos básicos como se definen en la presente invención (Fig. 1A) tienen las secuencias descritas como CXCL11-2B3 (ID SEC Nº: 3), CXCL11-3B3 (ID SEC Nº: 4) o CXCL11-4B4 (ID SEC Nº: 5). Los ejemplos demuestran cómo estos mutantes de CXCL11 son deficientes de unión a heparina y actúan como antagonistas de la quimiocina natural correspondiente, siendo CXCL11-3B3 particularmente eficaz.
La expresión "mutantes deficientes de unión a GAG" o "mutantes deficientes de unión a heparina" significa que los mutantes tienen menor capacidad para unirse a GAGs en los ensayos descritos en la presente invención (es decir, se une un porcentaje menor de cada uno de estos mutantes, con respecto a la molécula natural correspondiente, tanto a GAGs como a heparina).
En el sentido de la presente solicitud, "quimiocinas CXC de unión a CXCR3" son las quimiocinas humanas sin ELR mostradas en la Figura 1B: CXCL11 humano (también conocido como H174, quimioatrayente \alpha para células T inducible por interferón, I-TAC, o proteína 9 inducida por interferón \gamma), CXCL10 humano (también conocido como IP-10 o proteína 10 inducida por interferón \gamma), CXCL9 humano (también conocido como MIG o monocina inducida por interferón \gamma). Esta definición incluye también los ortólogos de mamíferos de estas secuencias (tal como CXCL11 de ratón, mostrado en la Fig. 1B).
En vista del estado de la técnica, no existe indicación de que las combinaciones anteriormente indicadas de aminoácidos básicos en el extremo carboxiterminal de CXCL11 definan un sitio de unión a GAGs/heparina, y de que la sustitución no conservativa de estos residuos proporcione moléculas que tienen actividad antagonista sobre la molécula natural correspondiente. Además, dada la conservación de algunos residuos básicos incluidos en estas combinaciones entre las quimiocinas humanas de unión a CXCR3 conocidas (CXCL10 y CXCL9), se puede deducir que los antagonistas de este grupo de quimiocinas se pueden obtener mediante la sustitución no conservativa de residuos que corresponden a los caracterizados funcionalmente para CXCL11 humano en la presente solicitud de patente. Por lo tanto, la presente invención proporciona mutantes de proteínas de unión a CXCR3 que contienen una combinación de las mutaciones definidas anteriormente, y que actúan como antagonistas para las quimiocinas naturales correspondientes. Los compuestos preparados de acuerdo con la presente invención se pueden usar para bloquear la actividad de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 en células que expresan CXCR3, por lo que proporcionan composiciones terapéuticas para el uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la producción excesiva o incontrolada de quimiocinas CXC de unión a CXCR3, tales como trastornos autoinmunes o rechazo de injertos, o para contrarrestar sus efectos angiostáticos.
Los objetivos adicionales de la presente invención son moléculas alternativas basadas en la estructura y la actividad de los antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de la presente invención.
Una primera clase de moléculas alternativas está representada por mutantes activos de los antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 definidos anteriormente. Estas proteínas deberían mantener, o incluso potenciar, las propiedades antagonistas de los mutantes ejemplificados en la presente solicitud de patente.
Esta categoría de moléculas incluye análogos naturales o artificiales de dicha secuencia, en los que uno o más residuos de aminoácidos se han añadido, eliminado o sustituido, con tal de que exhiban la misma actividad biológica caracterizada en la presente invención a niveles comparables o superiores, como se determina mediante los medios conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos más adelante. Por ejemplo, los mutantes específicos pueden tener uno o más aminoácidos añadidos, eliminados o sustituidos en la región aminoterminal, que se sabe que afecta a la unión al receptor. En particular, estas mutaciones pueden incluir a uno o más de los nueve primeros aminoácidos de la quimiocina CXC de unión a CXCR3 humana madura, posicionados en la región aminoterminal justo antes del motivo CXC conservado (Fig. 1B). Tales moléculas, finalmente, pueden contener uno o más aminoácidos que se han mutado, con lo que se obtiene una variante que tiene una tendencia disminuida a la agregación, como se ha demostrado para otras quimiocinas (documento WO 98/13495).
De acuerdo con la presente invención, los cambios preferidos en estos mutantes activos se conocen habitualmente como sustituciones "conservativas" o "seguras", e implican residuos que no son básicos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son aquellas con aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente similares, para conservar la estructura y la función biológica de la molécula. Está claro que las inserciones y deleciones de aminoácidos se pueden hacer también en las secuencias definidas anteriormente sin alterar su función, particularmente si las inserciones o deleciones solamente implican unos pocos aminoácidos, p.ej., por debajo de diez, y preferiblemente por debajo de tres, y no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para la conformación funcional de una proteína o de un péptido.
La bibliografía proporciona muchos modelos sobre los que se puede realizar la selección de sustituciones conservativas de aminoácidos, en base a estudios estadísticos y fisicoquímicos sobre la secuencia y/o la estructura de la proteína natural (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001). Los experimentos de diseño de proteínas han demostrado que el uso de subgrupos específicos de aminoácidos puede producir proteínas plegables y activas, lo que ayuda en la clasificación de las sustituciones "sinónimas" de aminoácidos que se pueden acomodar más fácilmente en la estructura de la proteína, y que se pueden usar para detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales (Murphy LR et al., 2000). Los grupos aminoácidos sinónimos y los grupos sinónimos más preferidos son los definidos en la Tabla I.
Los mutantes activos producidos mediante sustituciones hechas de acuerdo con estas enseñanzas, así como los mutantes activos en los que se eliminaron o se añadieron uno o más aminoácidos, están entre los objetivos de la presente invención, es decir, mutantes nuevos de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que tienen propiedades escasas de unión a GAG y actividad antagonista sobre las quimiocinas de unión a CXCR3 correspondientes, comparables a las de los mutantes inicialmente seleccionados, o incluso mejoradas si es posible. Pueden resultar compuestos similares a partir del método de mutagénesis convencional del ADN codificante, a partir de técnicas combinatorias a nivel de la secuencia de ADN codificante (tal como reordenamiento de ADN, exposición/selección en fagos), o a partir de estudios de diseño asistido por ordenador, seguidos de la validación de las actividades deseadas como se describe en el estado de la técnica y en los ejemplos más adelante.
Una segunda clase de moléculas alternativas de la invención está representada por los antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que comprenden una de las secuencias de aminoácidos definidas anteriormente y una secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia proteica distinta de la quimiocina CXC de unión a CXCR3 correspondiente. Esta última secuencia heteróloga debería proporcionar propiedades adicionales sin afectar significativamente a la actividad antagonista o mejorar las propiedades de unión a GAG. Los ejemplos de tales propiedades adicionales son un procedimiento de purificación más sencillo, una semivida de mayor duración en los fluidos del cuerpo, un resto de unión adicional, la maduración por medio de una digestión endoproteolítica o la localización extracelular. Esta última característica es de importancia particular para definir un grupo específico de proteínas de fusión o quiméricas incluidas en la anterior definición, ya que permite que las moléculas definidas como antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de esta solicitud de patente estén localizadas en un espacio en el que no solamente se facilita el aislamiento y la purificación de estos polipéptidos, sino también en el que las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 y su receptor interaccionan de forma natural.
El diseño de los restos, ligandos y espaciadores, así como de los métodos y estrategias para la construcción, purificación, detección y uso de proteínas de fusión se discute ampliamente en la bibliografía (Nilsson J et al., 1997; "Applications of chimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol. vol. 326-328, Academic Press, 2000; documento WO 01/77137). Las secuencias de proteínas adicionales que se pueden usar para generar los antagonistas de la presente invención se eligen entre los dominios extracelulares de proteínas unidas a membrana, región constante de inmunoglobulinas, dominios de multimerización, proteínas extracelulares, proteínas que contienen péptidos señal, proteínas que contienen señales de exportación. La elección de una o más de estas secuencias para fusionarla con el mutante deficiente de unión a GAG de la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es funcional para el uso específico y/o el protocolo de purificación de dicho agente.
Se pueden generar conjugados o complejos útiles de los antagonistas de la presente invención mediante el uso de moléculas y métodos conocidos en la técnica de la interacción con receptores u otras proteínas (marcadores radiactivos o fluorescentes, biotina), la eficacia terapéutica (agentes citotóxicos), o mediante la mejora de los agentes en cuanto a la eficacia de la administración del fármaco, tal como con polietilenglicol y otros polímeros naturales o sintéticos (Pillai O y Panchagnula R, 2001). En este último caso, los antagonistas se pueden producir después de la modificación dirigida de un residuo apropiado en la secuencia natural o mutada en una posición interna o terminal.
La bibliografía proporciona ejemplos de técnicas para generar quimiocinas modificadas o conjugadas con polímeros (documento WO 02/04015; documento WO 02/20033; documento WO 02/02132). Se puede usar cualquier residuo para la unión, con tal de que tenga una cadena lateral adecuada para la unión del polímero (es decir, la cadena lateral de un aminoácido que alberga un grupo funcional, p.ej., lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, histidina, etc.). De forma alternativa, un residuo en estos lugares se puede sustituir con un aminoácido diferente que tiene una cadena lateral adecuada para la unión del polímero. Además, las cadenas laterales de los aminoácidos codificados genéticamente se pueden modificar químicamente para la unión del polímero, o se pueden emplear aminoácidos que no son naturales con grupos funcionales apropiados en la cadena lateral. La unión del polímero puede ser no solamente en la cadena lateral del aminoácido que se da de forma natural en una posición específica del antagonista, o en la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural que sustituye al aminoácido que se da de forma natural en una posición específica del antagonista, sino también en un carbohidrato u otro resto que está unido a la cadena lateral del aminoácido en la posición de interés.
Los polímeros adecuados para estos propósitos son biocompatibles, a saber, son atóxicos para los sistemas biológicos, y se conocen muchos de tales polímeros. Los polímeros pueden ser de naturaleza hidrófoba o hidrófila, biodegradables, no biodegradables, o una combinación suya. Estos polímeros incluyen polímeros naturales (tales como colágeno, gelatina, celulosa, ácido hialurónico), así como polímeros sintéticos (tales como poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos). Los ejemplos de polímeros hidrófobos no biodegradables incluyen polidimetilsiloxanos, poliuretanos, politetrafluoroetilenos, polietilenos, poli(cloruro de vinilo), y polimetilmetacrilatos. Los ejemplos de polímeros hidrófilos no biodegradables incluyen poli(2-hidroxietil metacrilato), poli(alcohol vinílico), poli(N-vinil pirrolidona), polialquilenos, poliacrilamida y sus copolímeros. Los polímeros preferidos comprenden como unidad repetitiva secuencial óxido de etileno, tal como polietilenglicol (PEG).
El método preferido de unión emplea una combinación de síntesis de péptidos y ligadura química. De forma ventajosa, la unión de un polímero hidrosoluble será a través de un espaciador biodegradable, especialmente en la región aminoterminal de la proteína. Tal modificación actúa para proporcionar la proteína en una forma precursora (o "profármaco"), que tras la degradación del espaciador libera la proteína sin modificación del polímero.
Los antagonistas de la invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye técnicas relacionadas con el ADN recombinante y técnicas de síntesis química.
Otro objetivo de la invención son las moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 descritos anteriormente, que incluyen secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales. "Secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales" incluye todas las otras secuencias de ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican las secuencias de aminoácidos dadas. Aún otro objetivo de la invención son vectores de expresión que comprenden los ADNs anteriores, las células hospedadoras transformadas con tales vectores, y el proceso de preparación de los antagonistas descritos anteriormente, que comprende cultivar estas células transformadas y recoger las proteínas expresadas. Cuando el vector expresa los antagonistas en forma de una proteína de fusión con proteínas extracelulares que contienen señales de exportación o péptidos señal, los antagonistas de quimiocina CXC de unión a CXCR3 se pueden secretar al espacio extracelular, y se pueden recoger y purificar más fácilmente a partir de las células cultivadas con el fin de un procesamiento adicional o, de forma alternativa, las células se pueden usar o administrar directamente.
Estos objetivos de la invención se pueden realizar combinando la descripción proporcionada por la presente solicitud de patente sobre antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3, con el conocimiento de los métodos habituales de biología molecular. Muchos libros y revistas proporcionan enseñanzas sobre cómo clonar y producir proteínas recombinantes mediante el uso de vectores y células hospedadoras procariotas o eucariotas, tales como algunos títulos de la serie "A Practical Approach" publicada por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
La secuencia de ADN que codifica las proteínas de la invención se puede insertar y ligar en un vector adecuado episomal o de integración no homóloga, que se puede introducir en las células hospedadoras apropiadas mediante cualquier medio adecuado para transformarlas (transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). Los factores de importancia para seleccionar un plásmido o vector viral particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector se pueden reconocer y seleccionar de las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en un hospedador particular; y si es deseable poder "trasladar" el vector entre células hospedadoras de diferentes especies.
Los vectores deberían permitir la expresión de la proteína aislada o de fusión que incluye el antagonista de la invención en la célula hospedadora procariota o eucariota bajo control de las secuencias reguladoras de la iniciación/terminación transcripcional, que se eligen para que sean activas o inducibles de forma constitutiva en dicha célula. Después se puede aislar una línea celular sustancialmente enriquecida en tales células para proporcionar una línea celular estable.
Para los hospedadores eucariotas, (p.ej. levaduras, células de insecto o de mamífero), se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Estas pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, papilomavirus bovino, virus del simio o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un elevado nivel de expresión. Son ejemplos el promotor TK del virus herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4 de levaduras, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras de la iniciación transcripcional que permiten la represión y la activación, de forma que se puede modular la expresión de los genes. Las células que se han transformado de manera estable mediante el ADN introducido se pueden seleccionar introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador también puede proporcionar fototrofía a un hospedador auxótrofo, resistencia a biocidas, p.ej. antibióticos, o metales pesados tales como cobre, o similares. El gen del marcador seleccionable se puede unir directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o introducirlo en la misma célula mediante cotransfección. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la invención.
Las células hospedadoras pueden ser procariotas o eucariotas. Se prefieren hospedadores eucariotas, p.ej. células mamíferas, tales como células de humano, de mono, de ratón y de ovario de hámster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones postraduccionales a las moléculas de proteína, que incluyen el plegamiento correcto o la glicosilación en los lugares correctos. Además, las células de levadura pueden llevar a cabo las modificaciones peptídicas postraduccionales, que incluyen la glicosilación. Existen varias estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y un número elevado de copias de plásmidos que se pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en la levadura. La levadura reconoce las secuencias líder en los productos génicos mamíferos clonados y secreta los péptidos que albergan las secuencias líder (es decir, pre-péptidos).
Los ejemplos de técnicas de síntesis química son síntesis en fase sólida y síntesis en fase líquida. Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido que corresponde al extremo carboxiterminal del péptido a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, y mediante la repetición alterna de reacciones, una en la que los aminoácidos con sus grupos amino y sus grupos funcionales de la cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno a uno en orden desde el extremo carboxiterminal hacia el extremo aminoterminal, y una en la que se liberan los aminoácidos unidos a la resina o el grupo protector de los grupos amino de los péptidos, la cadena del péptido se elonga de esta manera. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican en gran parte en el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector usado. Los grupos protectores usados típicamente incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Cl2-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado, se le somete a la reacción de desprotección y se escinde del soporte sólido. Tal reacción de escisión del péptido se puede llevar a cabo con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc, y con TFA para el método Fmoc. Las quimiocinas totalmente sintéticas se describen en la bibliografía (Brown A et al., 1996).
La purificación de los antagonistas sintéticos o recombinantes de la invención se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos para este propósito, es decir, cualquier procedimiento convencional que implica extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación adicional que se puede usar con preferencia para purificar la proteína de la invención es la cromatografía de afinidad mediante el uso de anticuerpos monoclonales o grupos de afinidad, que se unen a la proteína de interés y que se producen y se inmovilizan en una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas se hacen pasar a través de la columna. La proteína se unirá a la columna mediante heparina o mediante el anticuerpo específico, mientras las impurezas pasarán a través de ella. Después de lavar, la proteína se eluye del gel mediante un cambio en el pH o en la fuerza iónica. De forma alternativa, se puede usar HPLC (cromatografía líquida de elevado rendimiento). La elución se puede llevar a cabo mediante el uso de un disolvente basado en agua-acetonitrilo empleado comúnmente para la purificación de proteínas. La invención incluye preparaciones purificadas de los compuestos de la invención. Preparaciones purificadas, como se usa aquí, se refiere a las preparaciones que son al menos del 1%, preferiblemente al menos del 5%, en peso seco de los compuestos de la invención.
Otro objetivo de la presente invención es el uso de antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 como medicamentos, en particular como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas (y formulados en combinación con vehículos, excipientes, estabilizantes, adyuvantes o diluyentes farmacéuticamente aceptables) para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con una actividad indeseable de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que conduce a una migración y activación excesiva de leucocitos que expresan sus receptores, tales como enfermedades autoinmunes e inflamatorias, así como cáncer o infecciones bacterianas/víricas. Ejemplos no limitantes de tales enfermedades son los siguientes: artritis, artritis reumatoide (RA), artritis psoriásica, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis sistémica, escleroderma, polimiositis, glomerulonefritis, fibrosis, fibrosis e inflamación hepática o pulmonar, enfermedades alérgicas o por hipersensibilidad, dermatitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad intestinal inflamatoria (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, choque septicémico, infección por VIH, rechazo de injertos e inflamación vascular relacionada con ateroes-
clerosis.
En vista del estado de la técnica que describe la actividad angiostática específica de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3, los antagonistas de la presente invención se pueden usar como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la prevención de enfermedades que necesitan un incremento de la vascularización, como ocurre en estados patológicos tales como arteriopatía isquémica, ictus y cicatrización retardada de heridas. La estimulación del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos que resulta de antagonizar los factores angiostáticos puede ayudar al tratamiento de estos trastornos restaurando la circulación apropiada.
Otro objetivo de la presente invención son composiciones farmacéuticas que contienen, como ingrediente activo, un antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 en las formas definidas anteriormente: proteínas, así como el ADN que las codifica o las células que las expresan. Los procesos para la preparación de tales composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la migración y activación excesiva de leucocitos, o para enfermedades que necesitan un incremento de la vascularización, comprenden combinar este antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objetivo de la presente invención es también el método para tratar o prevenir cualquiera de las enfermedades mencionadas anteriormente, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener, además del antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3, vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados, vehículos y aditivos biológicamente compatibles que son adecuados para la administración a un animal (por ejemplo, solución salina fisiológica) y finalmente pueden comprender agentes auxiliares (como excipientes, estabilizantes, adyuvantes o diluyentes) que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Tales composiciones se pueden combinar finalmente con otra composición terapéutica que actúe de forma sinérgica o de manera coordinada con el antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de la invención. Por ejemplo, se han demostrado propiedades sinérgicas similares de antagonistas de quimiocinas CC en combinación con ciclosporina (documento WO 00/16796). De forma alternativa, la otra composición puede basarse en un compuesto que se sabe que es terapéuticamente activo contra la enfermedad específica (por ejemplo, IFN-\beta para esclerosis múltiple, receptores solubles de TNF para artritis reumatoide).
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de cualquier manera aceptable para que cumplan las necesidades del modo de administración. Por ejemplo, se describe en la bibliografía el uso de biomateriales y otros polímeros para administración de fármacos, así como los diferentes métodos y modelos para validar un modo específico de administración (Luo B y Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar el curso y la gravedad de la enfermedad, por lo que lleva a la reducción o remisión de tal patología. La cantidad eficaz dependerá de la vía de administración y de la enfermedad del paciente.
"Farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar cualquier vehículo que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que es atóxico para el receptor al que se administra. Por ejemplo, para administración parenteral, los ingredientes activos anteriores se pueden formular en formas farmacéuticas unitarias para inyección en vehículos tales como solución salina, disolución de dextrosa, disolución de albúmina sérica y disolución de Ringer. Los vehículos se pueden seleccionar también de almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato magnésico, estearato sódico, monoestearato de glicerol, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y diversos aceites, que incluyen los de petróleo, animales, vegetales o de origen sintético (aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo).
Los expertos en la técnica pueden usar y determinar cualquier modo de administración aceptado para establecer las concentraciones sanguíneas deseadas de los ingredientes activos. Por ejemplo, la administración puede ser mediante diversas vías parenterales tales como vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, rectal, oral o bucal. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar también en formas farmacéuticas de liberación sostenida o controlada, que incluyen inyecciones de liberación prolongada, bombas osmóticas y similares, para la administración prolongada del polipéptido a una velocidad predeter-
minada, preferiblemente en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración única de dosis precisas.
La administración parenteral puede ser mediante inyección rápida o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo. Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la técnica, y que se pueden preparar según métodos rutinarios. Además, se puede administrar una suspensión de los compuestos activos en forma de suspensiones aceitosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección que pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes. Las composiciones farmacéuticas incluyen disoluciones adecuadas para administración mediante inyección, y contienen de alrededor del 0,01 al 99,99 por ciento, preferiblemente de alrededor del 20 al 75 por ciento de compuesto activo junto con el excipiente. Las composiciones que se pueden administrar de forma rectal incluyen supositorios.
Se entiende que la dosis administrada será dependiente de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si existe, la frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. La dosis se ajustará al sujeto individual, como entiende y determina alguien experto en la técnica. La dosis total necesaria para cada tratamiento se puede administrar mediante dosis múltiples o en una única dosis. La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar sola o en conjunción con otros agentes terapéuticos dirigidos a la enfermedad, o dirigidos a otros síntomas de la enfermedad. Normalmente, una dosis diaria de ingrediente activo está comprendida entre 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal por día. Normalmente, son eficaces de 1 a 40 miligramos por kilogramo por día administrados en dosis divididas o en forma de liberación sostenida para obtener los resultados deseados. Las segundas o posteriores administraciones se pueden realizar a una dosis que es la misma, inferior o superior que la dosis inicial o previa administrada al individuo.
La invención se describirá a continuación por medio de los siguientes ejemplos. Los ejemplos se referirán a las figuras especificadas aquí más adelante.
Ejemplos
Ejemplo 1
Caracterización in vitro de las propiedades de unión a heparina de los mutantes de CXCL11 Materiales y métodos Expresión de los mutantes de CXCL11 humano
Se generaron mutantes de CXCL11 humano mediante mutagénesis por PCR in vitro de la secuencia de ADN que codifica CXCL11 humano (I-TAC; Nº Acc. SWISSPROT 014625), y en particular la forma madura, que corresponde al segmento 22-94 de la molécula precursora, que contiene 73 aminoácidos (CXCL11-TN; Fig. 1; ID SEC Nº: 1).
Los agrupamientos de mutaciones puntuales asociadas a cada muteína (CXCL11-1B3, ID SEC Nº: 2; CXCL11-2B3, ID SEC Nº: 3; CXCL11-3B3, ID SEC Nº: 4; CXCL11-4B4, ID SEC Nº: 5; Fig. 1A) se introdujeron en la secuencia codificante de CXCL11-TN mediante el uso de una o dos etapas de PCR de 25 ciclos (ADN polimerasa Pwo con corrección de errores; Boehringer-Mannheim). El molde fue un plásmido basado en el vector comercial pET-24d (Novagen), en el que la secuencia de CXCL11 humano maduro se expresa como una proteína de fusión que tiene una señal aminoterminal (MKKKWP) seguida de un sitio de escisión de caspasa 8 (LETD). Los fragmentos de ADN de 0,3 Kb resultantes obtenidos mediante PCR se digirieron con BspHI y XhoI, y se subclonaron en un plásmido pET-24d vacío entre los sitios XhoI y NcoI. CXCL11-TN y todas las muteínas, que carecen de la metionina de inicio en la forma madura, se pueden producir como proteínas que contienen 73 residuos sin ningún otro residuo adicional, ya que la señal aminoterminal se elimina mediante el uso de digestión endoproteolítica con caspasa 8.
CXCL11-TN y las muteínas se expresaron y se ensayaron según los métodos conocidos en la técnica ("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, vol. 138, Humana Press, 2000). Todas las construcciones se obtuvieron y se controlaron mediante técnicas estándar de biología molecular (mutagénesis y amplificación mediante PCR, secuenciación de ADN, digestión de restricción), y después se mantuvieron en la cepa TG1 de E. coli durante el proceso de clonación. Las secuencias codificantes se eligieron para tener un uso óptimo de los códones para la expresión en E. coli (Kano JF et al., 1995).
Los plásmidos basados en pET-24d que codifican CXCL11-TN o uno de sus mutantes se transfirieron a células de E. coli competentes BL21 (DE3) pLysS, en las que la expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM al cultivo. Las células se recogieron 3,5 horas después de la inducción y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris/HCl 50 mM pH 8, MgCl_{2} 10 mM, Benzamidina/HCl 5 mM, DTT 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, 20 mg/L de ADNasa). Las células se rompieron mediante tres pasos por una prensa de French. La suspensión se centrifugó después a 10.000x g durante 60 minutos a 4ºC. El sedimento de cuerpos de inclusión que contiene CXCL11-TN o una de las muteínas se solubilizó (a una concentración inferior a 1 mg/ml) en Tris/HCl 0,1 M, pH 8,0, que contenía guanidina/HCl 6M y DTT 1 mM, y se agitó durante 30 minutos a 60ºC. Las proteínas se renaturalizaron mediante dilución gota a gota en un volumen de 10 veces el de la disolución de guanidina de Tris/HCl 0,1 M, pH 8,0, que contenía glutatión oxidado 0,01 mM y glutatión reducido 0,1 mM. La disolución se agitó durante la noche a 4ºC. Después se ajustó el pH a 4,5 con ácido acético, y se disminuyó la conductividad a 20 miliSiemens mediante dilución con agua. La disolución se aplicó a una columna de intercambio catiónico (SP-Sepharose) previamente equilibrada con acetato sódico 50 mM (pH 4,5), y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 2 M en el mismo tampón. Las fracciones que contienen la proteína de interés se mezclaron y se dializaron con 3 cambios de ácido acético al 1%. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 10.000x g durante 30 minutos, y el sobrenadante se liofilizó.
La secuencia líder aminoterminal común a CXCL11-TN y a todas las muteínas (MKKKWPLETD) se escindió con caspasa 8 mediante el uso del siguiente procedimiento. Las proteínas liofilizadas se disolvieron en 15-20 ml de H_{2}O y se aplicaron a columnas PD-10 previamente equilibradas con tampón de escisión con caspasa 8 (15% de glicerol, NaCl 150 mM, Tris 25 mM de pH 7,5, EDTA 2 mM). Después de la incubación de las proteínas con enzima proteolítica (1:100, enzima: sustrato, p/p) durante 4-5 horas a temperatura ambiente, se ajustó el pH de la disolución de escisión a 4,5, y se disminuyó la conductividad a 1-2 miliSiemens mediante dilución con urea 6 M (la reacción se repitió dos o tres veces si fue necesario). Las proteínas escindidas se separaron de la proteína sin escindir mediante cromatografía de intercambio catiónico en una columna de SP-Sepharose previamente equilibrada con acetato sódico 50 mM (pH 4,5) que contenía urea 6 M, y las proteínas se eluyeron con un gradiente de NaCl de 0 a 2 molar en el mismo tampón. Las fracciones escindidas se mezclaron y se dializaron con tres cambios de ácido acético al 1%, se liofilizaron, se solubilizaron en ácido trifluoroacético al 0,1%, y finalmente se liofilizaron de nuevo para el almacenamiento a largo plazo.
La identidad de todas las proteínas así expresadas se verificó mediante espectrometría de masas, y se determinó la pureza mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
Construcción de líneas celulares que expresan de forma estable CXCR3 humano
Se clonó CXCR3 humano a partir del ARN total extraído de leucocitos aislados de membrana sinovial de artritis reumatoide mediante transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) mediante el uso de cebadores basados en la secuencia de ARNm de CXCR3 humano que cubre toda la secuencia codificante (Genbank Nº X95876; nucleótidos del 69 al 1175). Todos los reactivos para las reacciones de RT-PCR están disponibles comercialmente (Trizol^{TM} y Superscript^{TM} de Life Technologies; oligodT_{15} de Promega) y se usaron según las instrucciones del fabricante. El producto de PCR resultante de 1,1 kb se subclonó en el vector de expresión de células mamíferas pCDNA3.1zeo (Invitrogen) para crear pZeo-CXCR3.
Se transfectaron células HEK293/EBNA y L1.2 humanas con ADN plasmídico purificado de pZeo-CXCR3 mediante precipitación con fosfato cálcico mediante el uso de un equipo de transfección con fosfato cálcico (Life Technologies), y los clones positivos se seleccionaron mediante el uso de Zeocin (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La expresión de CXCR3 se confirmó mediante análisis de FACS (separación de células activada por fluorescencia) de los clones individuales mediante el uso de un anticuerpo monoclonal comercial contra CXCR3 humano marcado con un fluoróforo de FITC (R&D Systems; nº de cat. MAB160), y mediante un ensayo de unión en equilibrio de radioligando (véase más adelante).
Ensayos cromatográficos de CXCL11-TN y de sus mutantes
CXCL11-TN, o cada uno de sus mutantes, se cargó en una columna de heparina-Sepharose (usando 50 microgramos de proteína) o en una columna de intercambio catiónico SP-Sepharose (usando 50 microgramos de proteína). En ambos casos la columna se equilibró en Tris/HCl 50 mM, pH 7,5 y NaCl 50 mM, y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 - 2 M en el mismo tampón.
Ensayo de unión a heparina de CXCL11-TN y de sus mutantes
Se incubaron diluciones en serie de CXCL11-TN o de sus mutantes en solución salina tamponada con fosfato (PBS), que cubrían el intervalo de 0,02-30 \muM, con 2,5 \mug/ml de [^{3}H]-heparina durante 1 hora a 37ºC. Se transfirieron triplicados de 20 \mul de cada muestra a una placa Unifilter P81 de 96 pocillos (Whatman Inc.) equipada con un filtro de fosfato de celulosa. La placa se lavó tres veces con 200 \mul de PBS mediante el uso de una bomba de vacío para eliminar la heparina marcada sin unir. Se añadió líquido de centelleo (50 \mul) a cada pocillo y se contó la radiactividad (1 minuto/pocillo) en un contador \beta. Los datos se analizaron mediante el uso del programa informático Prism® (GraphPad).
Ensayos de unión competitiva a receptor en equilibrio
Los ensayos se llevaron a cabo en membranas de células HEK que expresaban de forma estable CXCR3 mediante el uso de un ensayo de proximidad de centelleo (SPA) con [^{125}I]-CXCL11 como marcador. Se generó CXCL11 radiomarcado (I-TAC humano recombinante; Peprotech) y se ensayó según las instrucciones del proveedor de [^{125}I] (Amersham; actividad especifica de 2200 mCi/moles), también para comprobar los clones de HEK y L1.2 que expresan CXCR3 teñidos de forma positiva durante el análisis de FACS.
Los competidores se prepararon mediante diluciones en serie (intervalo de 10^{-6} a 10^{-12} M) de CXCL11 sin marcar, o de uno de sus mutantes, en el tampón de unión (HEPES 50 mM, pH 7,2, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 M y 0,5% de albúmina de suero bovino). Se solubilizaron esferas de SPA de germen de trigo (Amersham) en PBS hasta 50 mg/ml, y se diluyeron en el tampón de unión hasta 10 mg/ml, y la concentración final en el ensayo fue de 0,25 mg/pocillo. Las membranas celulares que expresan CXCR3 se almacenaron a -80°C y se diluyeron en el tampón de unión hasta 20 \mug/ml. Se mezclaron volúmenes iguales de reservas de membrana y de esferas antes de realizar el ensayo para reducir el fondo. La concentración final de membrana fue de 5 \mug/pocillo, y la de [^{125}I]-CXCL11 fue 0,05 nM. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 4 horas. Se contó la radiactividad (1 minuto/pocillo) en un contador \beta. Los datos de las muestras triplicadas se analizaron mediante el uso del programa informático Prism® (GraphPad).
Resultados
Se expresó CXCL11 humano en cuatro formas mutadas para identificar la secuencia y las propiedades de las variantes que no se unen a heparina. El objetivo de las mutaciones fueron cuatro agrupaciones de residuos básicos, y se
incluyó al menos un residuo básico conservado en todas las quimiocinas de unión a CXCR3 en cada muteína (Fig. 1).
La forma madura de CXCL11 humano (CXCL11-TN) y las cuatro muteínas correspondientes se expresaron en E. coli, (Fig. 1A). Una primera muteína, CXCL11-1B3, contiene tres sustituciones por alanina que eliminan una agrupación básica en el extremo aminoterminal de CXCL11-TN (lisina 5, arginina 6 y lisina 8). Una segunda muteína (CXCL11-2B3) contiene tres sustituciones por alanina que eliminan una agrupación básica que rodea al residuo 50 de CXCL11-TN (lisina 46, lisina 49 y arginina 52). Una tercera muteína (CXCL11-3B3) contiene tres sustituciones por alanina que eliminan una agrupación básica que rodea al residuo 60 de CXCL11-TN (lisina 57, lisina 59 y arginina 62). Finalmente, una cuarta muteína (CXCL11-4B4) contiene cuatro sustituciones por alanina que eliminan una agrupación básica que rodea al residuo 70 de CXCL11-TN (lisina 66, lisina 67, arginina 70 y lisina 71).
Los efectos de las sustituciones sobre las propiedades de las muteínas de CXCL11-TN se ensayaron primero mediante cromatografía con heparina e intercambio catiónico. La comparación de los perfiles de elución de tales medios cromatográficos proporciona una indicación cualitativa sobre la contribución de las interacciones electrostáticas inespecíficas debidas a los aminoácidos básicos con respecto a las propiedades de unión a heparina (Proudfoot A et al., 2001). Como se muestra en la Tabla III, la diferencia en la concentración de NaCl de elución entre CXCL11-TN y cada muteína se calcula en una columna de intercambio catiónico (Mono S) y en una columna de heparina. Los valores obtenidos en la columna Mono S se restan después de los obtenidos en la columna de heparina. Si el valor resultante es positivo, esto indica que los residuos mutados contribuyen a la interacción con heparina. A partir de este análisis, parece que los residuos mutados en CXCL11-1B3 no contribuyen a la unión a heparina, mientras los mutados en CXCL11-2B3, CXCL11-3B3 y CXCL11-4B4 están implicados en el reconocimiento específico de GAGs.
Después se realizó una medida directa de la unión a heparina mediante el uso de heparina tritiada y una dilución en serie de los mutantes de CXCL11-TN recombinantes (Fig. 2). Los complejos radiomarcados resultantes se separaron de la [^{3}H]-heparina sin unir poniendo en contacto la mezcla de reacción con filtros de fosfato de celulosa, que son capaces de retener eficazmente las proteínas, por lo que permiten una evaluación directa de la cantidad de heparina unida. Este ensayo demostró que CXCL11-1B3 tiene propiedades de unión a heparina similares a las de CXCL11-TN, mientras todos los demás mutantes mostraron propiedades de unión a heparina reducidas (hasta un 50% menos de heparina unida), lo que confirma los resultados obtenidos mediante el uso de ensayos cromatográficos (Tabla III). Estos datos son de interés particular, ya que la agrupación básica mutada en CXCL11-1B3 está dispuesta en forma de un motivo (BBXB) muy parecido a otro motivo de unión a heparina conocido, como el de RANTES (Proudfoot A et al., 2001), lo que confirma la observación sobre la notable diversidad estructural y la escasa previsibilidad de los sitios de unión a GAG en las quimiocinas (Lortat-Jacob H et al., 2002).
Finalmente, se realizó un ensayo de unión competitiva al receptor en equilibrio para comparar las propiedades de las muteínas sobre la unión al receptor específico CXCR3 (Fig. 3). Se mezclaron muestras que contenían una cantidad constante de CXCL11 comercial radiomarcado con diluciones en serie de CXCL11-TN, o de una de las muteínas, y después se incubaron con membranas preparadas a partir de células HEK que expresan CXCR3. Aunque la muteína que se une a heparina CXCL11-1B3 muestra una reducción de más de dos órdenes de magnitud (variación de sub-nanomolar a sub-micromolar) en la afinidad por CXCR3, las otras muteínas muestran solamente una caída limitada de afinidad por CXCR3, y permanecen en el intervalo nanomolar (reducción de un orden de magnitud, o menos). Por lo tanto, la afinidad por el receptor se mantiene sustancialmente en los mutantes del extremo carboxiterminal de CXCL11-TN deficientes de unión a heparina, mientras las mutaciones en el extremo aminoterminal afectan de forma específica a la unión al receptor, una característica que parece claramente distinta.
Ejemplo 2
Ensayo basado en células para la caracterización de muteínas de CXCL11 deficientes de unión a heparina Materiales y métodos Ensayo de quimiotaxis
El ensayo se llevó a cabo mediante el uso de la línea de células pre-B de linfoma (células L1.2) transfectadas con un plásmido que permite la expresión de CXCR3 en estas células, y microplacas de 96 pocillos (sistema ChemoTX, Neuroprobe).
Las células L1.2 que expresan CXCR3 (véase la descripción anterior) se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía un 5% de suero bovino fetal (FCS) inactivado, L-glutamina, HEPES 25 mM, \beta-mercaptoetanol 0,05 mM y 0,8 mg/ml de geneticina G-418. El día antes del ensayo se añadió ácido n-butírico 5 mM al medio de cultivo. Las células se recogieron mediante centrifugación a 600x g a temperatura ambiente y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640 que contenía un 5% de FCS inactivado sin rojo fenol. La expresión del receptor se comprobó mediante análisis de FACS mediante el uso de un anticuerpo anti-CXCR3 marcado con un fluoróforo de FITC, como se describió anteriormente.
Las muteínas de CXCL11 recombinantes se diluyeron en serie (intervalo de 10^{-6} a 10^{-12} M) en 30 \mul de medio RPMI sin rojo fenol y se pusieron en los pocillos inferiores, y se colocó un filtro (8 \mum de tamaño de poro) sobre ellos, asegurándose de que no había burbujas de aire retenidas, antes de sellar el sistema. Las células L1.2 que expresan CXCR3 (25 \mul de una suspensión de células a 2,5 x 10^{4} células/ml en el mismo medio) se colocaron en los pocillos superiores. La cámara se incubó durante 4 horas a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. La suspensión celular se desechó después de los pocillos superiores y se extrajo el filtro. Las células de los pocillos inferiores se transfirieron a una placa negra de 96 pocillos y se congelaron durante al menos 1 h a -80ºC. La placa se descongeló y se añadieron 200 \mul/pocillo de una mezcla de tinción CyQUANT/tampón de lisis celular (Molecular Probes) para determinar el número de células que migraron. La fluorescencia se contó con un lector de placas Victor^{2} Wallac. Los datos se analizaron mediante el uso del programa informático Prism® (GraphPad).
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Resultados
Las propiedades de las muteínas de CXCL11-TN se ensayaron mediante el uso de un ensayo basado en células. Los resultados obtenidos en el ensayo de quimiotaxis en células L1.2 modificadas para expresar CXCR3 se corresponden con los obtenidos en el ensayo de unión a receptor descrito anteriormente. De acuerdo con su baja afinidad por CXCR3, el mutante CXCL11-1B3 fue incapaz de reclutar células L1.2 que expresan CXCR3 (Fig. 4). Los otros tres mutantes fueron menos activos que CXCL11-TN, pero todavía fueron capaces de provocar una respuesta medible en este ensayo de quimiotaxis.
Ejemplo 3
Ensayo basado en animales para la caracterización de muteínas de CXCL11 deficientes de unión a heparina Materiales y métodos Reclutamiento celular peritoneal
Se sensibilizaron ratones Balb/C hembra de 8 a 12 semanas de edad en el día 0. Todos los ratones recibieron 5 inyecciones subcutáneas (4 x 50 \mul en cada extremidad y 1 x 100 \mul en la nuca) de CpG-ODN 10 nM (Microsynth) mezclado con 100 \mug de ovoalbúmina (Sigma, grado V) en PBS estéril. Después de una semana, se indujo el reclutamiento celular en los ratones Balb/C mediante inyección intraperitoneal de 10 \mug (0,5 mg/kg) de proteína CXCL11 recombinante diluida en 0,2 ml de solución salina estéril exenta de lipopolisacáridos (0,9%). Al ensayar las propiedades de los mutantes de CXCL11, las cantidades indicadas de la proteína, diluida de 0,2 ml de la misma disolución estéril, se administraron 30 minutos antes de la administración del agonista. Los ratones se sacrificaron mediante CO_{2} en aerosol 4 horas más tarde, y se realizó el lavado peritoneal con 5 ml de PBS tres veces. Los lavados se mezclaron y se centrifugaron a 1500x g durante 5 minutos, y las células sedimentadas se resuspendieron en un volumen final de 1 mililitro. Se contó el número total de leucocitos obtenidos para cada muestra con un hemocitómetro.
Ensayo de hipersensibilidad retardada por contacto
Se realizó el ensayo de inflamación de la oreja de ratón para medir la hipersensibilidad por contacto como se describió (Garrigue JL et al., 1994). Brevemente, los ratones se pre-sensibilizaron de forma tópica aplicando 25 \mul de disolución del 0,5% de 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB; Sigma Chemical Co.) en acetona/aceite de oliva (4:1) en el abdomen afeitado. Cinco días después, se aplicaron 20 \mul de DNFB al 0,2% en el mismo vehículo en la oreja derecha, y solamente vehículo en la oreja izquierda. Los ratones se trataron diariamente desde el día 5 al 9 con una administración intraperitoneal de 0,5 mg/kg de CXCL11-3B3 o vehículo solamente en el grupo de control. El primer tratamiento se administró 1 hora antes de la exposición a DNFB. Se midió el grosor de la oreja con un calibre de espesor con escala circular (Mitutoyo Corp.), y se estimó la inflamación de la oreja restando el valor pre-exposición del valor post-exposición, y sustrayendo además cualquier inflamación detectada en la oreja contralateral expuesta al vehículo.
Resultados
Se obtuvieron datos adicionales de las propiedades in vivo de las muteínas de CXCL11-TN haciendo uso de dos modelos animales.
Un primer ensayo fue un ensayo de reclutamiento celular peritoneal (Fig. 5). Ya que CXCR3 se expresa en células Th1 activadas, se sensibilizó a los ratones antes del ensayo con CpG-ODN para inducir una respuesta Th1. De acuerdo con su escasa actividad como proteína de unión a CXCR3 y su incapacidad para reclutar células in vitro, el mutante CXCL11-1B3 fue incapaz de reclutar células in vivo cuando se administró en el peritoneo. Tanto CXCL11-2B3 como CXCL11-4B4 mostraron una actividad débil, pero CXCL11-3B3 no fue capaz de provocar reclutamiento (Fig. 5).
Después se ensayó la capacidad de este último mutante para inhibir CXCL11-TN in vivo (Fig. 6). CXCL11-3B3 no muestra propiedades de reclutamiento por sí solo, sino actividad antagonista considerable sobre CXCL11-TN, con respecto a la inducción del reclutamiento celular en el peritoneo, cuando se administra antes a la misma dosis (10 \mug/ratón). Por lo tanto, la abrogación de la unión a heparina en CXCL11 produce un antagonista capaz de inhibir in vivo el reclutamiento celular inducido por CXCL11.
Finalmente, las propiedades de CXCL11-3B3 se ensayaron en un modelo de inflamación cutánea, el ensayo de hipersensibilidad retardada por contacto. Esta inflamación cutánea específica de haptenos está mediada por las células T, y genera una inflamación medible después de exponer a los ratones al sensibilizador por contacto 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) como hapteno. La inflamación inducida fue significativamente inferior en los ratones tratados con una administración intraperitoneal de CXCL11-3B3, cuando se compara con el efecto observado en los ratones tratados con vehículo solamente, a lo largo del periodo de tratamiento (Fig. 7).
Dados los resultados obtenidos en los ejemplos de la presente invención, los antagonistas nuevos de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 se pueden diseñar de acuerdo con los hallazgos de esta solicitud de patente, en particular los mutantes deficientes de unión a heparina de CXCL11 humano, CXCL10 humano y CXCL9 humano que contienen sustituciones simples o múltiples de los aminoácidos básicos conservados en el extremo carboxiterminal, y, finalmente, de otros residuos básicos conservados en una o más quimiocinas CXC de unión a CXCR3 específicas y/o uno o más residuos básicos que los rodean.
Las propiedades de las moléculas alternativas descritas en la presente solicitud se pueden ensayar mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente, o haciendo uso de otras aproximaciones de validación conocidas en la técnica, como se analiza exhaustivamente en la bibliografía ("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, vol. 138, Humana Press, 2000; "Chemokine Receptors", Methods in Enzymology, vol. 288, Academic Press, 1997).
TABLA I
1
TABLA II
2
TABLA III
3
Referencias
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<120> ANTAGONISTAS NUEVOS DE QUIMIOCINAS CXC DE UNIÓN A CXCR3
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<130> WO513
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<170> PatentIn versión 3.0
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<400> 8
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11

Claims (28)

1. Antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que consisten en mutantes de CXCL11, CXCL10 ó CXCL9 en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 46, 62, 66 y 70.
2. Los antagonistas de la reivindicación 1, en los que la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es CXCL11 humano, y al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 49, 52, 57, 59, 67 ó 71.
3. Los antagonistas de la reivindicación 2, en los que una de las siguientes combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), están sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
a)
46, junto con 49 y/o 52;
b)
62, junto con 57 y/o 59;
c)
66 y 70, junto con 67 y/o 71; o
d)
62 y 66, junto con uno o más de los siguientes: 57, 59, 67, 70 ó 71.
4. Los antagonistas de la reivindicación 2 ó 3, en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1) está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 6, 8, 17, 20, 26 ó 38.
5. Los antagonistas de la reivindicación 1, en los que la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es CXCL10 humano, y al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1) está sustituido adicionalmente por alanina, gli-
cocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 47, 48, 51, 52, 59, 74 ó 75.
6. Los antagonistas de la reivindicación 5, en los que una de las siguientes combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), están sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
a)
46 y 52, junto con 47, 48 ó 51;
b)
59 y 62;
c)
66 y 70, junto con 74 y/o 75; o
d)
62 y 66, junto con 59 y/o 70.
7. Los antagonistas de la reivindicación 5 ó 6, en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1) está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 8, 22, 26 ó 38.
8. Los antagonistas de la reivindicación 1, en los que la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es CXCL9, y el residuo básico 67, numerado de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina.
9. Los antagonistas de la reivindicación 8, en los que una de las siguientes combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), están sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
a)
62, junto con 66 y/o 67;
b)
66 y 67; o
c)
66 y 70, junto con uno o más de los siguientes: 67, 74 ó 75.
10. Los antagonistas de la reivindicación 8 ó 9, en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 6, 8, 25, 28 ó 38.
11. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 10, en los que los residuos básicos están sustituidos por alanina o glicocola.
12. Los antagonistas de la reivindicación 11 que consisten en las secuencias de CXCL11-2B3 (ID SEC Nº: 3), CXCL11-3B3 (ID SEC Nº: 4) o CXCL11-4B4 (ID SEC Nº: 5).
13. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 11, en los que uno o más aminoácidos que se han añadido, eliminado o sustituido pertenecen a los primeros nueve aminoácidos del dominio aminoterminal de la quimiocina CXC de unión a CXCR3 humana madura.
14. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 13, en los que se han mutado uno o más aminoácidos para disminuir las propiedades de agregación de dicho antagonista.
15. Los antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que comprenden los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 14, y una secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia proteica distinta de la que corresponde a quimiocina CXC de unión a CXCR3.
16. Los antagonistas de la reivindicación 15, que comprenden una secuencia de aminoácidos que pertenece a una o más de estas secuencias proteicas: dominios extracelulares de proteína unida a membrana, región constante de inmunoglobulinas, dominios de multimerización, proteínas extracelulares, proteínas que contienen péptidos señal, proteínas que contienen señales de exportación.
17. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 16, en los que dicho antagonista está en forma de conjugado o complejo activo con una molécula elegida entre moléculas radiactivas, biotina, moléculas fluorescentes, agentes citotóxicos o agentes de administración de fármacos.
18. Las moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 16.
19. Los vectores de expresión que comprenden las moléculas de ADN de la reivindicación 18.
20. Una célula hospedadora transformada con un vector de la reivindicación 19, en la que la célula hospedadora no es una célula embrionaria humana.
21. El uso de cualquiera de los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 17, del ADN de las reivindicaciones 18 ó 19, o de la célula de la reivindicación 20, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la migración y activación excesiva de leucocitos.
22. El uso de la reivindicación 21, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune o una infección.
23. El uso de la reivindicación 22, en el que la enfermedad es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, infección por VIH-1, diabetes tipo I o rechazo de injertos.
24. El uso de cualquiera de los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 17, del ADN de las reivindicaciones 18 ó 19, o de la célula de la reivindicación 20, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de enfermedades que necesitan un incremento de la vascularización.
25. El uso de la reivindicación 24, en el que la enfermedad es una cardiopatía isquémica.
26. El uso de cualquiera de los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 17, del ADN de las reivindicaciones 18 ó 19, o de la célula de la reivindicación 20, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer.
27. Un proceso de preparación de los antagonistas de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende cultivar las células transformadas de la reivindicación 20 y recoger las proteínas expresadas.
28. Una composición farmacéutica que contiene un antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de las reivindicaciones 1 a 17, el ADN de las reivindicaciones 18 ó 19, o la célula de la reivindicación 20, como ingrediente activo.
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