ES2282666T3 - Antagonistas de quimiocinas cxc de union a cxcr3. - Google Patents
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Abstract
Antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que consisten en mutantes de CXCL11, CXCL10 ó CXCL9 en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 46, 62, 66 y 70.
Description
Antagonistas de quimiocinas CXC de unión a
CXCR3.
Las quimiocinas son proteínas secretadas
proinflamatorias de pequeñas dimensiones (70-130
aminoácidos) principalmente implicadas en la migración direccional
y la activación de células, especialmente la extravasación de
leucocitos desde la sangre a localizaciones tisulares que necesitan
el reclutamiento de estas células (Baggiolini M et al.,
1997; Fernández EJ y Lolis E, 2002).
Dependiendo del número y de la posición de las
cisteínas conservadas en la secuencia, las quimiocinas se clasifican
en quimiocinas C, CC, CXC y CX_{3}C. Una serie de receptores de
membrana celular, todos receptores heptahelicoidales acoplados a
proteína G, son las moléculas de unión que permiten que las
quimiocinas ejerzan su actividad biológica en las células objetivo,
que presentan combinaciones específicas de receptores dependiendo de
su estado y/o tipo. Los efectos fisiológicos de las quimiocinas
resultan de un sistema complejo e integrado de interacciones
concurrentes: los receptores a menudo tienen especificidades
solapadas por el ligando, de forma que un único receptor puede unir
diferentes quimiocinas, así como una única quimiocina se puede unir
a diferentes receptores.
Normalmente las quimiocinas se producen en la
localización de una lesión, inflamación u otra alteración tisular
de forma paracrina o autocrina. Sin embargo, la migración y la
activación específica del tipo celular en los procesos
inflamatorios e inmunes no es la única actividad de las quimiocinas,
ya que otras actividades fisiológicas, tales como la hematopoyesis
o la angiogénesis, parecen estar reguladas por algunas de estas
proteínas.
Aunque existen desventajas potenciales al usar
las quimiocinas como agentes terapéuticos (tendencia a agregarse y
unión inespecífica, en particular), las quimiocinas ofrecen la
posibilidad de intervención terapéutica en estados patológicos
asociados a tales procesos, en particular mediante la inhibición de
quimiocinas específicas y de sus receptores con el propósito de
evitar el reclutamiento y la activación excesiva de células, en
particular leucocitos (Proudfoot A, 2000; Baggiolini M, 2001;
Haskell CA et al., 2002).
Entre los receptores de quimiocinas, CXCR3
(también conocido como receptor 9 acoplado a proteína G o GPR9) es
un receptor de membrana que se expresa en cantidades elevadas en las
células T activadas por IL-2 (por ejemplo
linfocitos T CD4+ CD8+), células citolíticas naturales, células B y
(a niveles inferiores y/o de una manera restringida por el ciclo
celular) en otros tipos de células no hematopoyéticas, tales como
neuronas, células de la glándula mamaria y células del túbulo
proximal.
La peculiaridad de CXCR3 es que, a diferencia de
otros receptores de quimiocinas, muestra un número reducido de
ligandos de quimiocinas CXC (CXCLs) específicos: CXCL9 (también
conocido como monocina inducida por interferón \gamma, MIG,
miembro 9 de la subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas o
SCYB9), CXCL10 (también conocido como proteína 10 inducible por
interferón \gamma, IP-10, miembro 10 de la
subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas, o SCYB10), y CXCL11
(también conocido como quimioatrayente \alpha para células T
inducible por interferón, I-TAC, proteína 9
inducible por interferón \gamma, IP-9, H174,
\beta-R1, miembro 11 de la subfamilia B de
citocinas inducibles pequeñas, o SCYB11).
Estas tres quimiocinas no solamente tienen
afinidad en el intervalo nanomolar por CXCR3, sino que comparten
otras características importantes: muchos aminoácidos están
conservados entre sus secuencias, todas carecen del motivo
"ELR" en su extremo aminoterminal, todas se inducen mediante
interferón \gamma, y todas parecen tener un papel prominente en
la migración de leucocitos (células Th1) en relación no solamente
con la inflamación y la autoinmunidad, sino también con el rechazo
de injertos y la isquemia. Estas actividades se han demostrado en
modelos animales, tales como ratones con genes inactivados y ratones
tratados con anticuerpos específicos para la quimiocina o el
receptor. Por ejemplo, la administración de anticuerpos dirigidos
contra los dominios extracelulares de CXCR3, o contra sus ligandos,
da como resultado la inhibición específica de las respuestas
inflamatorias mediadas por este receptor (documento WO 01/72334;
documento WO 01/78708; documento WO 02/15932).
El estado de la técnica muestra muchos datos
sobre los mecanismos moleculares asociados a la interacción entre
CXCR3 y sus ligandos, y de su importancia para la fisiología humana.
Cuando se compara con CXCL9 y CXCL10, CXCL11 parece ser el inductor
más potente de la activación, interiorización y migración
transendotelial mediada por CXCR3 en leucocitos humanos y de ratón
(Cole K et al., 1998; Lu B, et al. 1999, Sauty A et
al., 2001). La actividad o la expresión de estas moléculas
puede estar considerablemente regulada y modulada en relación con
diversos estados patológicos, como se demostró en modelos animales o
en muestras clínicas asociadas a rechazo de injertos (Meyer M et
al., 2001), tuberculosis (Sauty A et al., 1999),
arteriopatía coronaria por trasplante (Kao J et al., 2003),
replicación de VIH-1 (Lane BR et al., 2003),
diabetes tipo 1 (Frigerio S et al., 2002), ulceración del
epitelio intestinal (Sasaki S et al., 2002), infección
microbiana (Cole A et al., 2001), reacciones granulomatosas
sarcoideas (Agostini C et al., 1998), lesiones
ateroescleróticas (Mach F et al., 1999), esclerosis múltiple
(Sorensen T et al., 1999; documento WO02/098346), cáncer
(Trentin L et al., 1999; Robledo MM et al., 2001),
enfermedades cutáneas (documento WO 02/43758; Flier J et al.,
2001), nefropatías (Romagnani P et al., 1999), enfermedades
del tiroides (Romagnani P et al., 2002), lesiones cerebrales
o de la médula espinal (documento WO 03/006045), y muchas otras
enfermedades autoinmunes o inflamatorias.
Además, también se ha observado que la
proliferación de las células endoteliales se puede modular mediante
la interacción entre CXCR3 y sus ligandos (Luster A et al.,
1995; Romagnani P et al., 2001). Las quimiocinas CXC de
unión a CXCR3 muestran una actividad angiostática sobre las células
endoteliales, que se puede inhibir mediante anticuerpos
anti-CXCR3, lo que sugiere una relación estricta
entre la activación de este receptor y la regulación del ciclo
celular, al menos en el endotelio.
Los estudios sobre las relaciones
estructura-actividad indican que las quimiocinas
tienen dos sitios principales de interacción con sus receptores, la
región aminoterminal flexible y el bucle conformacionalmente rígido
que sigue a la segunda cisteína. Se cree que las quimiocinas se unen
a los receptores por medio de la región del bucle, y se cree que
este contacto facilita la unión de la región aminoterminal que da
como resultado la activación del receptor. Esta importancia de la
región aminoterminal se ha demostrado también ensayando quimiocinas
naturales y sintéticas en las que este dominio está modificado o
acortado. Este procesamiento, tras digestión proteolítica,
mutagénesis o modificación química de los aminoácidos, puede activar
o dejar a estas moléculas completamente inactivas, por lo que se
generan compuestos con actividad agonista y/o antagonista
(documento US 5.739.103; documento WO 02/59301).
Estas observaciones sugieren que la regulación
del reclutamiento de leucocitos durante las reacciones inflamatorias
o inmunitarias se basa en una combinación de tales efectos
agonistas y antagonistas, como se demostró para las quimiocinas CXC
de unión a CXCR3 y muchas otras quimiocinas (Loetscher P y
Clark-Lewis I, 2001; Lambeir A et al.,
2001). Así, se considera que las quimiocinas con modificaciones
específicas en la región aminoterminal tienen potencial terapéutico
para las enfermedades inflamatorias y autoinmunes (Schwarz y Wells,
1999).
Como muchas otras moléculas solubles
señalizadoras de células (interleucinas, factores de crecimiento),
las quimiocinas muestran interacciones fisiológicas no solamente
con los receptores celulares, sino también con los
glucosaminoglucanos (GAGs), aunque con diversas afinidades. Estas
moléculas cargadas negativamente están formadas por repeticiones de
disacáridos (tales como heparina, sulfato de condroitina, sulfato de
heparano, sulfato de dermatano y ácido hialurónico), y se dan de
forma natural en las superficies celulares, en la matriz
extracelular o en la circulación. Pueden estar presentes en formas
aisladas o unidas a proteínas (proteoglicanos, o PGs) después de la
adición postraduccional de GAGs en los residuos de serina.
Las quimiocinas, como las otras proteínas de
unión a GAG, tienen residuos básicos (principalmente arginina y
lisina) agrupados en porciones cortas de su secuencia que son
adecuadas para este propósito, pero tales motivos están
estructurados de diferentes maneras para cada quimiocina, o grupo de
quimiocinas sumamente homólogas. Algunos de estos sitios de unión a
GAG se han asociado a secuencias consenso específicas, tales como
motivos BBXB (en los que B representa un residuo básico, y X
cualquier otro residuo) u otras disposiciones (Kuschert G et
al., 1999; Proudfoot A et al., 2001).
La consecuencia principal de esta interacción es
la agregación de las quimiocinas, un estado que se cree que
proporciona protección contra la proteolisis, así como un mecanismo
para la liberación controlada y que genera un gradiente de
quimiocinas, que participa en el reconocimiento y en la presentación
de las quimiocinas a los receptores en forma de oligómeros
(Hoogewerf AJ et al., 1997; Kuschert G et al., 1999).
La interacción con GAGs y la formación de estos gradientes se ha
demostrado claramente para muchas quimiocinas, y se ha medido la
afinidad relativa. Por lo tanto, se ha propuesto que la modulación
de tales interacciones también puede representar una aproximación
terapéutica en la enfermedad inflamatoria (Ali S et al.,
2001; Patel D et al., 2001).
Los medios para conseguir un efecto terapéutico
basándose en las interacciones GAGs-quimiocinas
conocidas en la técnica implican la generación de análogos de GAGs
que modulan la interacción entre los GAGs endógenos y las
quimiocinas (documento WO 94/20512), el uso de heparanasa para
eliminar los GAGs (documento WO 97/11684), la administración de
complejos quimiocina-GAGs (documento WO 99/62535),
la modificación del dominio de unión a GAGs con polímeros
(documento WO 02/04015), o la sustitución de los residuos implicados
en la actividad de unión a GAG (documento WO 02/28419).
Aunque se han realizado estudios exhaustivos
sobre ciertas quimiocinas, está establecido que no es posible
prever, a partir de la homología de secuencias con una quimiocina
que tiene una similitud limitada o motivos de proteína de unión a
GAG, qué residuos básicos específicos se tienen que modificar con
sustituciones no conservativas para reducir la unión a GAG, ya que
hay una diversidad estructural significativa de dominios de unión a
GAG en la familia de proteínas quimiocinas
(Lortat-Jacob H et al., 2002). Los métodos
para detectar o identificar ligandos, inhibidores o promotores de
CXCR3 se conocen también en la técnica (documento US 6.140.064).
Sin embargo, ninguna de estas aproximaciones se puede aplicar
realmente para generar y estudiar CXCL9, CXCL10 o CXCL11
deficientes de unión a GAG. No se conocen los requerimientos
estructurales para la interacción con GAGs, ni su estructura
tridimensional, para CXCR3 y para sus ligandos. No hay ninguna
descripción en el estado de la técnica de cuáles pueden ser los
residuos de estas quimiocinas implicados en la unión a GAG, así como
los efectos in vivo que se derivan de su sustitución no
conservativa en las proteínas mutantes.
Se ha descubierto que los residuos básicos
específicos en el extremo carboxiterminal de una quimiocina humana
CXC de unión a CXCR3 (CXCL11) son responsables de la interacción con
glucosaminoglucanos (GAGs).
La eliminación de estos residuos básicos
mediante sustituciones no conservativas (por ejemplo, con alaninas)
conduce a la generación de mutantes de CXCL11 que no solamente
tienen una tendencia considerablemente reducida a interaccionar con
GAGs, sino también una actividad antagonista in vivo sobre
CXCL11. Tales datos se pueden aprovechar para usar mutantes de
CXCL11 y de las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 más similares
(CXCL10 y CXCL9) como antagonistas de las quimiocinas naturales
correspondientes. Los compuestos preparados de acuerdo con la
presente invención se pueden usar para bloquear la actividad de las
quimiocinas CXC de unión a CXCR3 sobre las células que expresan
CXCR3, por lo que se proporcionan composiciones terapéuticas para el
uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con una
migración excesiva de células T activadas, tales como rechazo de
injertos y enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, esclerosis
múltiple, diabetes tipo 1), cáncer, infección por
VIH-1, y enfermedades que necesitan un incremento de
la vascularización, tales como cardiopatía isquémica.
Otras características y ventajas de la invención
serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada.
Figura 1: (A) Secuencias de aminoácidos de
CXCL11 humano maduro (CXCL11-TN; ID SEC Nº: 1) y de
los mutantes generados a partir de esta secuencia, que se han
expresado y ensayado como se describe en los ejemplos (los
aminoácidos mutados están en negrita y subrayados; ID SEC Nº:
2-5). La numeración se basa en la secuencia humana
madura, que carece de un péptido señal de 21 aminoácidos de
longitud. (B) Alineación de la secuencia común para las formas
maduras de las siguientes quimiocinas CXC de unión a CXCR3: CXCL11
de ratón (mCXCL11; Nº Acc. SWISSPROT Q9JHH5; ID SEC Nº: 8), CXCL11
humano (hCXCL11; Nº Acc. SWISSPROT O14625; ID SEC Nº: 1), CXCL10
humano (hCXCL10; Nº Acc. SWISSPROT P02778; ID SEC Nº: 6), y CXCL9
humano (hCXCL9; Nº Acc. SWISSPROT Q07325; ID SEC Nº: 7). Los
residuos en negrita y subrayados en la secuencia de CXCL11 humano se
han mutado a alanina en las diferentes variantes presentadas en los
ejemplos (residuos 5, 6, 8, 46, 49, 52, 57, 59, 62, 66, 67, 70 y
71). Los otros residuos básicos de CXCL11 humano, y todos los
residuos básicos en CXCL11 de ratón, CXCL10 humano y CXCL9 humano
están subrayados. Las cisteínas y los residuos básicos conservados
entre las quimiocinas humanas CXC de unión a CXCR3 se indican en la
línea recuadrada debajo de la alineación, respectivamente, como C y
B. La numeración se basa en las secuencias humanas maduras, que
carecen de un péptido señal que incluye los 21 (mCXCL11, hCXCL11 y
hCXCL10) o 22 (hCXCL9) aminoácidos N-terminales. La
forma madura de mCXCL11, hCXCL11 y hCXCL10 se muestra totalmente,
mientras la forma madura de hCXCL9 tiene 25 aminoácidos más en el
extremo carboxiterminal.
Figura 2: Gráfico que representa los resultados
del ensayo de unión a heparina realizado con
[^{3}H]-heparina, que compara la actividad de
CXCL11-TN y la de los mutantes de CXCL11 indicados
en el intervalo micromolar.
Figura 3: Gráfico que representa los resultados
del ensayo de unión competitiva a receptor en equilibrio realizado
monitorizando el porcentaje de [^{125}I]-CXCL11
desplazado de membranas de células HEK que expresan CXCR3, tras la
adición de CXCL11-TN y de los mutantes de CXCL11
indicados en el intervalo de concentraciones
pico/micro-molar.
Figura 4: Gráfico que representa los resultados
del ensayo de quimiotaxis realizado en células L1.2 que expresan
CXCR3 mediante el uso de CXCL11-TN o de los mutantes
de CXCL11 indicados.
Figura 5: Gráfico que resume los resultados del
ensayo de reclutamiento celular peritoneal, realizado en ratones
Balb/C hembra mediante el uso de CXCL11-TN o de los
otros mutantes de CXCL11 indicados, comparado con un control con
tampón de solución salina. El nivel de significación estadística se
representa con el número de asteriscos.
Figura 6: Gráfico que resume los resultados de
la capacidad de CXCL11-3B3 para inhibir el
reclutamiento celular inducido por CXCL11-TN (ambos
administrados en una cantidad de 10 \mug). Se administró solución
salina o CXCL11-3B3 30 minutos antes de la
administración de CXCL11-TN.
Figura 7: Gráfico que resume los resultados del
ensayo de hipersensibilidad retardada por contacto mediante el uso
de solución salina, como control, o de CXCL11-3B3 a
una dosis de 0,5 mg/kg. El efecto se mide en cuanto al volumen de
inflamación de la oreja en los días posteriores al tratamiento (D5,
D6, D7, etc.) con un calibre de espesor con escala circular.
El objetivo principal de la presente invención
es proporcionar antagonistas nuevos de quimiocinas CXC de unión a
CXCR3 que consisten en mutantes deficientes de unión a GAG de estas
quimiocinas, en los que uno o más de los residuos básicos
conservados en el extremo carboxiterminal se han eliminado mediante
sustituciones no conservativas. En particular, los mutantes de
CXCL11, CXCL10 o CXCL9 que tienen propiedades antagonistas son
aquellos en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos
elegidos entre 46, 62, 66 y 70, como se enumeran en la secuencia de
CXCL11 humano maduro, está sustituido por alanina, glicocola,
serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido
aspártico o asparagina.
Los residuos básicos que se pueden mutar
adicionalmente en los mutantes preferidos son aquellos conservados
en una o más quimiocinas CXC de unión a CXCR3 específicas (en
quimiocinas humanas o de otra especie), y/o aquellos que rodean a
los residuos básicos conservados. Se generan preferiblemente
múltiples mutantes sustituyendo al menos dos residuos básicos
conservados consecutivos de una manera no conservativa, pero se
describen otras combinaciones posibles en la presente
invención.
La presente solicitud de patente proporciona
datos in vivo e in vitro sobre las actividades de
unión y de antagonismo de los mutantes de CXCL11 recombinantes
nuevos en los que se sustituyeron de forma no conservativa
combinaciones específicas de residuos básicos por alaninas. Estos
datos, combinados con el conocimiento de la secuencia y de las
propiedades de otras quimiocinas CXC de unión a CXCR3 sumamente
conservadas, sugieren que el sitio básico conservado específico no
solamente puede desempeñar un papel general en la actividad
biológica de estas quimiocinas, sino que se puede modificar, según
la presente invención, para obtener una serie de moléculas que
tienen propiedades antagonistas contra la quimiocina natural.
En una realización principal, los antagonistas
de CXCL11 humano consisten en mutantes de CXCL11 humano en los que
al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de
acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano
maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está
sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
49, 52, 57, 59, 67 ó 71. Más preferiblemente, los mutantes de
CXCL11 tienen una de las siguientes combinaciones de residuos
básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento
con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC
Nº: 1), sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina:
a) 46, junto con 49 y/o 52;
b) 62, junto con 57 y/o 59;
c) 66 y 70, junto con 67 y/o 71; o
d) 62 y 66, junto con uno o más de los
siguientes: 57, 59, 67, 70 ó 71.
Los ejemplos describen los mutantes incluidos en
la definición de las combinaciones (a), (b) o (c), mientras la
combinación (d) incluye dos residuos básicos conservados
consecutivos, junto con residuos básicos cercanos.
Finalmente, los residuos básicos de CXCL11 que
se pueden mutar adicionalmente son los conservados en otra
quimiocina CXC de unión a CXCR3 y/o de otra especie (tal como
ratón). Por lo tanto, en otros mutantes de CXCL11 preferidos al
menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo
con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro,
como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido
adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina,
ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 6, 8,
17, 20, 26 ó 38.
En otra realización principal, los antagonistas
de CXCL10 humano consisten en mutantes de CXCL10 humano en los que
al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de
acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano
maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está
sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina:
47, 48, 51, 52, 59, 74 ó 75. Más preferiblemente, los mutantes de
CXCL10 tienen una de las siguientes combinaciones de residuos
básicos, numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento
con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC
Nº: 1), sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina:
a) 46 y 52, junto con 47, 48 ó 51;
b) 59 y 62;
c) 66 y 70, junto con 74 y/o 75; o
d) 62 y 66, junto con 59 y/o 70.
Finalmente, los residuos básicos de CXCL10 que
se pueden mutar adicionalmente son los conservados en otra
quimiocina CXC de unión a CXCR3 y/o de otra especie (tal como
ratón). Por lo tanto, en otros mutantes de CXCL10 preferidos al
menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo
con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro,
como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido
adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina,
ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 8, 22,
26 ó 38.
En una realización principal adicional, los
antagonistas de CXCL9 humano consisten en mutantes de CXCL9 humano
en los que el residuo básico 67, numerado de acuerdo con las
posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se
muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido
adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina,
ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina. Más
preferiblemente, los mutantes de CXCL9 tienen una de las siguientes
combinaciones de residuos básicos, numerados de acuerdo con las
posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se
muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), sustituidos por alanina,
glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina,
ácido aspártico o asparagina:
a) 62, junto con 66 y/o 67;
b) 66 y 67; o
c) 66 y 70, junto con uno o más de los
siguientes: 67, 74 ó 75.
Finalmente, los residuos básicos de CXCL9 que se
pueden mutar adicionalmente son los conservados en otra quimiocina
CXC de unión a CXCR3 y/o de otra especie (tal como ratón). Por lo
tanto, en otros mutantes de CXCL9 preferidos al menos uno de los
siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo con las posiciones
en el alineamiento con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la
Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido adicionalmente por
alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico,
glutamina, ácido aspártico o asparagina: 5, 6, 8, 25, 28 ó 38.
El aminoácido que sustituye al residuo básico es
preferiblemente un aminoácido pequeño apolar como alanina o
glicocola, pero son apropiados otros aminoácidos, con tal de que
tengan una carga y unas dimensiones que sean incompatibles con la
unión a GAG y, al mismo tiempo, interfieran escasamente con otras
propiedades de la proteína. Los aminoácidos adecuados para las
sustituciones son serina, treonina, prolina, ácido glutámico,
glutamina, ácido aspártico o asparagina. Los antagonistas de CXCL11
humano que tienen sustituciones por alanina en combinación con
residuos básicos como se definen en la presente invención (Fig. 1A)
tienen las secuencias descritas como CXCL11-2B3 (ID
SEC Nº: 3), CXCL11-3B3 (ID SEC Nº: 4) o
CXCL11-4B4 (ID SEC Nº: 5). Los ejemplos demuestran
cómo estos mutantes de CXCL11 son deficientes de unión a heparina y
actúan como antagonistas de la quimiocina natural correspondiente,
siendo CXCL11-3B3 particularmente eficaz.
La expresión "mutantes deficientes de unión a
GAG" o "mutantes deficientes de unión a heparina" significa
que los mutantes tienen menor capacidad para unirse a GAGs en los
ensayos descritos en la presente invención (es decir, se une un
porcentaje menor de cada uno de estos mutantes, con respecto a la
molécula natural correspondiente, tanto a GAGs como a
heparina).
En el sentido de la presente solicitud,
"quimiocinas CXC de unión a CXCR3" son las quimiocinas humanas
sin ELR mostradas en la Figura 1B: CXCL11 humano (también conocido
como H174, quimioatrayente \alpha para células T inducible por
interferón, I-TAC, o proteína 9 inducida por
interferón \gamma), CXCL10 humano (también conocido como
IP-10 o proteína 10 inducida por interferón
\gamma), CXCL9 humano (también conocido como MIG o monocina
inducida por interferón \gamma). Esta definición incluye también
los ortólogos de mamíferos de estas secuencias (tal como CXCL11 de
ratón, mostrado en la Fig. 1B).
En vista del estado de la técnica, no existe
indicación de que las combinaciones anteriormente indicadas de
aminoácidos básicos en el extremo carboxiterminal de CXCL11 definan
un sitio de unión a GAGs/heparina, y de que la sustitución no
conservativa de estos residuos proporcione moléculas que tienen
actividad antagonista sobre la molécula natural correspondiente.
Además, dada la conservación de algunos residuos básicos incluidos
en estas combinaciones entre las quimiocinas humanas de unión a
CXCR3 conocidas (CXCL10 y CXCL9), se puede deducir que los
antagonistas de este grupo de quimiocinas se pueden obtener mediante
la sustitución no conservativa de residuos que corresponden a los
caracterizados funcionalmente para CXCL11 humano en la presente
solicitud de patente. Por lo tanto, la presente invención
proporciona mutantes de proteínas de unión a CXCR3 que contienen
una combinación de las mutaciones definidas anteriormente, y que
actúan como antagonistas para las quimiocinas naturales
correspondientes. Los compuestos preparados de acuerdo con la
presente invención se pueden usar para bloquear la actividad de las
quimiocinas CXC de unión a CXCR3 en células que expresan CXCR3, por
lo que proporcionan composiciones terapéuticas para el uso en el
tratamiento de enfermedades relacionadas con la producción excesiva
o incontrolada de quimiocinas CXC de unión a CXCR3, tales como
trastornos autoinmunes o rechazo de injertos, o para contrarrestar
sus efectos angiostáticos.
Los objetivos adicionales de la presente
invención son moléculas alternativas basadas en la estructura y la
actividad de los antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de
la presente invención.
Una primera clase de moléculas alternativas está
representada por mutantes activos de los antagonistas de
quimiocinas CXC de unión a CXCR3 definidos anteriormente. Estas
proteínas deberían mantener, o incluso potenciar, las propiedades
antagonistas de los mutantes ejemplificados en la presente solicitud
de patente.
Esta categoría de moléculas incluye análogos
naturales o artificiales de dicha secuencia, en los que uno o más
residuos de aminoácidos se han añadido, eliminado o sustituido, con
tal de que exhiban la misma actividad biológica caracterizada en la
presente invención a niveles comparables o superiores, como se
determina mediante los medios conocidos en la técnica y descritos
en los ejemplos más adelante. Por ejemplo, los mutantes específicos
pueden tener uno o más aminoácidos añadidos, eliminados o
sustituidos en la región aminoterminal, que se sabe que afecta a la
unión al receptor. En particular, estas mutaciones pueden incluir a
uno o más de los nueve primeros aminoácidos de la quimiocina CXC de
unión a CXCR3 humana madura, posicionados en la región aminoterminal
justo antes del motivo CXC conservado (Fig. 1B). Tales moléculas,
finalmente, pueden contener uno o más aminoácidos que se han
mutado, con lo que se obtiene una variante que tiene una tendencia
disminuida a la agregación, como se ha demostrado para otras
quimiocinas (documento WO 98/13495).
De acuerdo con la presente invención, los
cambios preferidos en estos mutantes activos se conocen
habitualmente como sustituciones "conservativas" o
"seguras", e implican residuos que no son básicos. Las
sustituciones conservativas de aminoácidos son aquellas con
aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente
similares, para conservar la estructura y la función biológica de la
molécula. Está claro que las inserciones y deleciones de
aminoácidos se pueden hacer también en las secuencias definidas
anteriormente sin alterar su función, particularmente si las
inserciones o deleciones solamente implican unos pocos aminoácidos,
p.ej., por debajo de diez, y preferiblemente por debajo de tres, y
no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para la
conformación funcional de una proteína o de un péptido.
La bibliografía proporciona muchos modelos sobre
los que se puede realizar la selección de sustituciones
conservativas de aminoácidos, en base a estudios estadísticos y
fisicoquímicos sobre la secuencia y/o la estructura de la proteína
natural (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001). Los experimentos de diseño
de proteínas han demostrado que el uso de subgrupos específicos de
aminoácidos puede producir proteínas plegables y activas, lo que
ayuda en la clasificación de las sustituciones "sinónimas" de
aminoácidos que se pueden acomodar más fácilmente en la estructura
de la proteína, y que se pueden usar para detectar homólogos y
parálogos funcionales y estructurales (Murphy LR et al.,
2000). Los grupos aminoácidos sinónimos y los grupos sinónimos más
preferidos son los definidos en la Tabla I.
Los mutantes activos producidos mediante
sustituciones hechas de acuerdo con estas enseñanzas, así como los
mutantes activos en los que se eliminaron o se añadieron uno o más
aminoácidos, están entre los objetivos de la presente invención, es
decir, mutantes nuevos de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 que
tienen propiedades escasas de unión a GAG y actividad antagonista
sobre las quimiocinas de unión a CXCR3 correspondientes, comparables
a las de los mutantes inicialmente seleccionados, o incluso
mejoradas si es posible. Pueden resultar compuestos similares a
partir del método de mutagénesis convencional del ADN codificante, a
partir de técnicas combinatorias a nivel de la secuencia de ADN
codificante (tal como reordenamiento de ADN, exposición/selección en
fagos), o a partir de estudios de diseño asistido por ordenador,
seguidos de la validación de las actividades deseadas como se
describe en el estado de la técnica y en los ejemplos más
adelante.
Una segunda clase de moléculas alternativas de
la invención está representada por los antagonistas de quimiocinas
CXC de unión a CXCR3 que comprenden una de las secuencias de
aminoácidos definidas anteriormente y una secuencia de aminoácidos
que pertenece a una secuencia proteica distinta de la quimiocina CXC
de unión a CXCR3 correspondiente. Esta última secuencia heteróloga
debería proporcionar propiedades adicionales sin afectar
significativamente a la actividad antagonista o mejorar las
propiedades de unión a GAG. Los ejemplos de tales propiedades
adicionales son un procedimiento de purificación más sencillo, una
semivida de mayor duración en los fluidos del cuerpo, un resto de
unión adicional, la maduración por medio de una digestión
endoproteolítica o la localización extracelular. Esta última
característica es de importancia particular para definir un grupo
específico de proteínas de fusión o quiméricas incluidas en la
anterior definición, ya que permite que las moléculas definidas como
antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de esta solicitud
de patente estén localizadas en un espacio en el que no solamente
se facilita el aislamiento y la purificación de estos polipéptidos,
sino también en el que las quimiocinas CXC de unión a CXCR3 y su
receptor interaccionan de forma natural.
El diseño de los restos, ligandos y
espaciadores, así como de los métodos y estrategias para la
construcción, purificación, detección y uso de proteínas de fusión
se discute ampliamente en la bibliografía (Nilsson J et al.,
1997; "Applications of chimeric genes and hybrid proteins"
Methods Enzymol. vol. 326-328, Academic Press,
2000; documento WO 01/77137). Las secuencias de proteínas
adicionales que se pueden usar para generar los antagonistas de la
presente invención se eligen entre los dominios extracelulares de
proteínas unidas a membrana, región constante de inmunoglobulinas,
dominios de multimerización, proteínas extracelulares, proteínas
que contienen péptidos señal, proteínas que contienen señales de
exportación. La elección de una o más de estas secuencias para
fusionarla con el mutante deficiente de unión a GAG de la quimiocina
CXC de unión a CXCR3 es funcional para el uso específico y/o el
protocolo de purificación de dicho agente.
Se pueden generar conjugados o complejos útiles
de los antagonistas de la presente invención mediante el uso de
moléculas y métodos conocidos en la técnica de la interacción con
receptores u otras proteínas (marcadores radiactivos o
fluorescentes, biotina), la eficacia terapéutica (agentes
citotóxicos), o mediante la mejora de los agentes en cuanto a la
eficacia de la administración del fármaco, tal como con
polietilenglicol y otros polímeros naturales o sintéticos (Pillai O
y Panchagnula R, 2001). En este último caso, los antagonistas se
pueden producir después de la modificación dirigida de un residuo
apropiado en la secuencia natural o mutada en una posición interna
o terminal.
La bibliografía proporciona ejemplos de técnicas
para generar quimiocinas modificadas o conjugadas con polímeros
(documento WO 02/04015; documento WO 02/20033; documento WO
02/02132). Se puede usar cualquier residuo para la unión, con tal
de que tenga una cadena lateral adecuada para la unión del polímero
(es decir, la cadena lateral de un aminoácido que alberga un grupo
funcional, p.ej., lisina, ácido aspártico, ácido glutámico,
cisteína, histidina, etc.). De forma alternativa, un residuo en
estos lugares se puede sustituir con un aminoácido diferente que
tiene una cadena lateral adecuada para la unión del polímero.
Además, las cadenas laterales de los aminoácidos codificados
genéticamente se pueden modificar químicamente para la unión del
polímero, o se pueden emplear aminoácidos que no son naturales con
grupos funcionales apropiados en la cadena lateral. La unión del
polímero puede ser no solamente en la cadena lateral del aminoácido
que se da de forma natural en una posición específica del
antagonista, o en la cadena lateral de un aminoácido natural o no
natural que sustituye al aminoácido que se da de forma natural en
una posición específica del antagonista, sino también en un
carbohidrato u otro resto que está unido a la cadena lateral del
aminoácido en la posición de interés.
Los polímeros adecuados para estos propósitos
son biocompatibles, a saber, son atóxicos para los sistemas
biológicos, y se conocen muchos de tales polímeros. Los polímeros
pueden ser de naturaleza hidrófoba o hidrófila, biodegradables, no
biodegradables, o una combinación suya. Estos polímeros incluyen
polímeros naturales (tales como colágeno, gelatina, celulosa, ácido
hialurónico), así como polímeros sintéticos (tales como poliésteres,
poliortoésteres, polianhídridos). Los ejemplos de polímeros
hidrófobos no biodegradables incluyen polidimetilsiloxanos,
poliuretanos, politetrafluoroetilenos, polietilenos,
poli(cloruro de vinilo), y polimetilmetacrilatos. Los
ejemplos de polímeros hidrófilos no biodegradables incluyen
poli(2-hidroxietil metacrilato),
poli(alcohol vinílico), poli(N-vinil
pirrolidona), polialquilenos, poliacrilamida y sus copolímeros. Los
polímeros preferidos comprenden como unidad repetitiva secuencial
óxido de etileno, tal como polietilenglicol (PEG).
El método preferido de unión emplea una
combinación de síntesis de péptidos y ligadura química. De forma
ventajosa, la unión de un polímero hidrosoluble será a través de un
espaciador biodegradable, especialmente en la región aminoterminal
de la proteína. Tal modificación actúa para proporcionar la proteína
en una forma precursora (o "profármaco"), que tras la
degradación del espaciador libera la proteína sin modificación del
polímero.
Los antagonistas de la invención se pueden
preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica,
que incluye técnicas relacionadas con el ADN recombinante y técnicas
de síntesis química.
Otro objetivo de la invención son las moléculas
de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los
antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 descritos
anteriormente, que incluyen secuencias de nucleótidos
sustancialmente iguales. "Secuencias de nucleótidos
sustancialmente iguales" incluye todas las otras secuencias de
ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código
genético, también codifican las secuencias de aminoácidos dadas.
Aún otro objetivo de la invención son vectores de expresión que
comprenden los ADNs anteriores, las células hospedadoras
transformadas con tales vectores, y el proceso de preparación de los
antagonistas descritos anteriormente, que comprende cultivar estas
células transformadas y recoger las proteínas expresadas. Cuando el
vector expresa los antagonistas en forma de una proteína de fusión
con proteínas extracelulares que contienen señales de exportación o
péptidos señal, los antagonistas de quimiocina CXC de unión a CXCR3
se pueden secretar al espacio extracelular, y se pueden recoger y
purificar más fácilmente a partir de las células cultivadas con el
fin de un procesamiento adicional o, de forma alternativa, las
células se pueden usar o administrar directamente.
Estos objetivos de la invención se pueden
realizar combinando la descripción proporcionada por la presente
solicitud de patente sobre antagonistas de quimiocinas CXC de unión
a CXCR3, con el conocimiento de los métodos habituales de biología
molecular. Muchos libros y revistas proporcionan enseñanzas sobre
cómo clonar y producir proteínas recombinantes mediante el uso de
vectores y células hospedadoras procariotas o eucariotas, tales
como algunos títulos de la serie "A Practical Approach"
publicada por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression
Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996;
"Protein Expression", 1999; "Protein Purification
Techniques", 2001).
La secuencia de ADN que codifica las proteínas
de la invención se puede insertar y ligar en un vector adecuado
episomal o de integración no homóloga, que se puede introducir en
las células hospedadoras apropiadas mediante cualquier medio
adecuado para transformarlas (transformación, transfección,
conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación
con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). Los factores de
importancia para seleccionar un plásmido o vector viral particular
incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que
contienen el vector se pueden reconocer y seleccionar de las células
receptoras que no contienen el vector; el número de copias del
vector que se desea en un hospedador particular; y si es deseable
poder "trasladar" el vector entre células hospedadoras de
diferentes especies.
Los vectores deberían permitir la expresión de
la proteína aislada o de fusión que incluye el antagonista de la
invención en la célula hospedadora procariota o eucariota bajo
control de las secuencias reguladoras de la iniciación/terminación
transcripcional, que se eligen para que sean activas o inducibles de
forma constitutiva en dicha célula. Después se puede aislar una
línea celular sustancialmente enriquecida en tales células para
proporcionar una línea celular estable.
Para los hospedadores eucariotas, (p.ej.
levaduras, células de insecto o de mamífero), se pueden emplear
diferentes secuencias reguladoras transcripcionales y
traduccionales, dependiendo de la naturaleza del hospedador. Estas
pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus,
papilomavirus bovino, virus del simio o similares, en los que las
señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene
un elevado nivel de expresión. Son ejemplos el promotor TK del
virus herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4
de levaduras, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras de la
iniciación transcripcional que permiten la represión y la
activación, de forma que se puede modular la expresión de los genes.
Las células que se han transformado de manera estable mediante el
ADN introducido se pueden seleccionar introduciendo también uno o
más marcadores que permiten la selección de las células
hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador
también puede proporcionar fototrofía a un hospedador auxótrofo,
resistencia a biocidas, p.ej. antibióticos, o metales pesados tales
como cobre, o similares. El gen del marcador seleccionable se puede
unir directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o
introducirlo en la misma célula mediante cotransfección. También se
pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de
las proteínas de la invención.
Las células hospedadoras pueden ser procariotas
o eucariotas. Se prefieren hospedadores eucariotas, p.ej. células
mamíferas, tales como células de humano, de mono, de ratón y de
ovario de hámster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones
postraduccionales a las moléculas de proteína, que incluyen el
plegamiento correcto o la glicosilación en los lugares correctos.
Además, las células de levadura pueden llevar a cabo las
modificaciones peptídicas postraduccionales, que incluyen la
glicosilación. Existen varias estrategias de ADN recombinante que
utilizan secuencias promotoras fuertes y un número elevado de copias
de plásmidos que se pueden utilizar para la producción de las
proteínas deseadas en la levadura. La levadura reconoce las
secuencias líder en los productos génicos mamíferos clonados y
secreta los péptidos que albergan las secuencias líder (es decir,
pre-péptidos).
Los ejemplos de técnicas de síntesis química son
síntesis en fase sólida y síntesis en fase líquida. Como síntesis
en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido que corresponde al
extremo carboxiterminal del péptido a sintetizar se une a un
soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, y mediante la
repetición alterna de reacciones, una en la que los aminoácidos con
sus grupos amino y sus grupos funcionales de la cadena lateral
protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno a uno
en orden desde el extremo carboxiterminal hacia el extremo
aminoterminal, y una en la que se liberan los aminoácidos unidos a
la resina o el grupo protector de los grupos amino de los péptidos,
la cadena del péptido se elonga de esta manera. Los métodos de
síntesis en fase sólida se clasifican en gran parte en el método
tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector
usado. Los grupos protectores usados típicamente incluyen tBoc
(t-butoxicarbonilo), Cl-Z
(2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z
(2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc
(9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh
(4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr
(4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo),
Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y
Cl2-Bzl (2,6-diclorobencilo) para
los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc
(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo)
para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para
los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado,
se le somete a la reacción de desprotección y se escinde del soporte
sólido. Tal reacción de escisión del péptido se puede llevar a cabo
con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el
método Boc, y con TFA para el método Fmoc. Las quimiocinas
totalmente sintéticas se describen en la bibliografía (Brown A
et al., 1996).
La purificación de los antagonistas sintéticos o
recombinantes de la invención se puede llevar a cabo mediante
cualquiera de los métodos conocidos para este propósito, es decir,
cualquier procedimiento convencional que implica extracción,
precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un
procedimiento de purificación adicional que se puede usar con
preferencia para purificar la proteína de la invención es la
cromatografía de afinidad mediante el uso de anticuerpos
monoclonales o grupos de afinidad, que se unen a la proteína de
interés y que se producen y se inmovilizan en una matriz de gel
contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que
contienen las proteínas se hacen pasar a través de la columna. La
proteína se unirá a la columna mediante heparina o mediante el
anticuerpo específico, mientras las impurezas pasarán a través de
ella. Después de lavar, la proteína se eluye del gel mediante un
cambio en el pH o en la fuerza iónica. De forma alternativa, se
puede usar HPLC (cromatografía líquida de elevado rendimiento). La
elución se puede llevar a cabo mediante el uso de un disolvente
basado en agua-acetonitrilo empleado comúnmente para
la purificación de proteínas. La invención incluye preparaciones
purificadas de los compuestos de la invención. Preparaciones
purificadas, como se usa aquí, se refiere a las preparaciones que
son al menos del 1%, preferiblemente al menos del 5%, en peso seco
de los compuestos de la invención.
Otro objetivo de la presente invención es el uso
de antagonistas de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 como
medicamentos, en particular como ingredientes activos en
composiciones farmacéuticas (y formulados en combinación con
vehículos, excipientes, estabilizantes, adyuvantes o diluyentes
farmacéuticamente aceptables) para tratar o prevenir enfermedades
relacionadas con una actividad indeseable de las quimiocinas CXC de
unión a CXCR3 que conduce a una migración y activación excesiva de
leucocitos que expresan sus receptores, tales como enfermedades
autoinmunes e inflamatorias, así como cáncer o infecciones
bacterianas/víricas. Ejemplos no limitantes de tales enfermedades
son los siguientes: artritis, artritis reumatoide (RA), artritis
psoriásica, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico (LES),
esclerosis sistémica, escleroderma, polimiositis, glomerulonefritis,
fibrosis, fibrosis e inflamación hepática o pulmonar, enfermedades
alérgicas o por hipersensibilidad, dermatitis, asma, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad intestinal
inflamatoria (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa,
esclerosis múltiple, choque septicémico, infección por VIH, rechazo
de injertos e inflamación vascular relacionada con ateroes-
clerosis.
clerosis.
En vista del estado de la técnica que describe
la actividad angiostática específica de las quimiocinas CXC de
unión a CXCR3, los antagonistas de la presente invención se pueden
usar como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas para
el tratamiento o la prevención de enfermedades que necesitan un
incremento de la vascularización, como ocurre en estados
patológicos tales como arteriopatía isquémica, ictus y cicatrización
retardada de heridas. La estimulación del crecimiento de nuevos
vasos sanguíneos que resulta de antagonizar los factores
angiostáticos puede ayudar al tratamiento de estos trastornos
restaurando la circulación apropiada.
Otro objetivo de la presente invención son
composiciones farmacéuticas que contienen, como ingrediente activo,
un antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 en las formas
definidas anteriormente: proteínas, así como el ADN que las
codifica o las células que las expresan. Los procesos para la
preparación de tales composiciones farmacéuticas para el
tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la
migración y activación excesiva de leucocitos, o para enfermedades
que necesitan un incremento de la vascularización, comprenden
combinar este antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 junto
con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objetivo de la presente invención es
también el método para tratar o prevenir cualquiera de las
enfermedades mencionadas anteriormente, que comprende la
administración de una cantidad eficaz de un antagonista de
quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener,
además del antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3,
vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados, vehículos y
aditivos biológicamente compatibles que son adecuados para la
administración a un animal (por ejemplo, solución salina
fisiológica) y finalmente pueden comprender agentes auxiliares
(como excipientes, estabilizantes, adyuvantes o diluyentes) que
facilitan el procesamiento de los compuestos activos en
preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Tales
composiciones se pueden combinar finalmente con otra composición
terapéutica que actúe de forma sinérgica o de manera coordinada con
el antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de la invención.
Por ejemplo, se han demostrado propiedades sinérgicas similares de
antagonistas de quimiocinas CC en combinación con ciclosporina
(documento WO 00/16796). De forma alternativa, la otra composición
puede basarse en un compuesto que se sabe que es terapéuticamente
activo contra la enfermedad específica (por ejemplo,
IFN-\beta para esclerosis múltiple, receptores
solubles de TNF para artritis reumatoide).
Las composiciones farmacéuticas se pueden
formular de cualquier manera aceptable para que cumplan las
necesidades del modo de administración. Por ejemplo, se describe en
la bibliografía el uso de biomateriales y otros polímeros para
administración de fármacos, así como los diferentes métodos y
modelos para validar un modo específico de administración (Luo B y
Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).
Una "cantidad eficaz" se refiere a una
cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar
el curso y la gravedad de la enfermedad, por lo que lleva a la
reducción o remisión de tal patología. La cantidad eficaz dependerá
de la vía de administración y de la enfermedad del paciente.
"Farmacéuticamente aceptable" pretende
abarcar cualquier vehículo que no interfiere con la eficacia de la
actividad biológica del ingrediente activo y que es atóxico para el
receptor al que se administra. Por ejemplo, para administración
parenteral, los ingredientes activos anteriores se pueden formular
en formas farmacéuticas unitarias para inyección en vehículos tales
como solución salina, disolución de dextrosa, disolución de albúmina
sérica y disolución de Ringer. Los vehículos se pueden seleccionar
también de almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa,
gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato
magnésico, estearato sódico, monoestearato de glicerol, cloruro
sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua,
etanol y diversos aceites, que incluyen los de petróleo, animales,
vegetales o de origen sintético (aceite de cacahuete, aceite de
soja, aceite mineral, aceite de sésamo).
Los expertos en la técnica pueden usar y
determinar cualquier modo de administración aceptado para establecer
las concentraciones sanguíneas deseadas de los ingredientes
activos. Por ejemplo, la administración puede ser mediante diversas
vías parenterales tales como vía subcutánea, intravenosa,
intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal,
transdérmica, rectal, oral o bucal. Las composiciones farmacéuticas
de la presente invención se pueden administrar también en formas
farmacéuticas de liberación sostenida o controlada, que incluyen
inyecciones de liberación prolongada, bombas osmóticas y similares,
para la administración prolongada del polipéptido a una velocidad
predeter-
minada, preferiblemente en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración única de dosis precisas.
minada, preferiblemente en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración única de dosis precisas.
La administración parenteral puede ser mediante
inyección rápida o mediante perfusión gradual a lo largo del
tiempo. Las preparaciones para administración parenteral incluyen
disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas
estériles, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes
conocidos en la técnica, y que se pueden preparar según métodos
rutinarios. Además, se puede administrar una suspensión de los
compuestos activos en forma de suspensiones aceitosas apropiadas
para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados
incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de sésamo, o ésteres de
ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o
triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección que pueden
contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión
incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o
dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también
estabilizantes. Las composiciones farmacéuticas incluyen
disoluciones adecuadas para administración mediante inyección, y
contienen de alrededor del 0,01 al 99,99 por ciento,
preferiblemente de alrededor del 20 al 75 por ciento de compuesto
activo junto con el excipiente. Las composiciones que se pueden
administrar de forma rectal incluyen supositorios.
Se entiende que la dosis administrada será
dependiente de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de
tratamiento concurrente, si existe, la frecuencia de tratamiento, y
la naturaleza del efecto deseado. La dosis se ajustará al sujeto
individual, como entiende y determina alguien experto en la técnica.
La dosis total necesaria para cada tratamiento se puede administrar
mediante dosis múltiples o en una única dosis. La composición
farmacéutica de la presente invención se puede administrar sola o en
conjunción con otros agentes terapéuticos dirigidos a la
enfermedad, o dirigidos a otros síntomas de la enfermedad.
Normalmente, una dosis diaria de ingrediente activo está
comprendida entre 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso
corporal por día. Normalmente, son eficaces de 1 a 40 miligramos
por kilogramo por día administrados en dosis divididas o en forma de
liberación sostenida para obtener los resultados deseados. Las
segundas o posteriores administraciones se pueden realizar a una
dosis que es la misma, inferior o superior que la dosis inicial o
previa administrada al individuo.
La invención se describirá a continuación por
medio de los siguientes ejemplos. Los ejemplos se referirán a las
figuras especificadas aquí más adelante.
Ejemplo
1
Se generaron mutantes de CXCL11 humano mediante
mutagénesis por PCR in vitro de la secuencia de ADN que
codifica CXCL11 humano (I-TAC; Nº Acc. SWISSPROT
014625), y en particular la forma madura, que corresponde al
segmento 22-94 de la molécula precursora, que
contiene 73 aminoácidos (CXCL11-TN; Fig. 1; ID SEC
Nº: 1).
Los agrupamientos de mutaciones puntuales
asociadas a cada muteína (CXCL11-1B3, ID SEC Nº: 2;
CXCL11-2B3, ID SEC Nº: 3;
CXCL11-3B3, ID SEC Nº: 4;
CXCL11-4B4, ID SEC Nº: 5; Fig. 1A) se introdujeron
en la secuencia codificante de CXCL11-TN mediante
el uso de una o dos etapas de PCR de 25 ciclos (ADN polimerasa Pwo
con corrección de errores; Boehringer-Mannheim). El
molde fue un plásmido basado en el vector comercial
pET-24d (Novagen), en el que la secuencia de CXCL11
humano maduro se expresa como una proteína de fusión que tiene una
señal aminoterminal (MKKKWP) seguida de un sitio de escisión de
caspasa 8 (LETD). Los fragmentos de ADN de 0,3 Kb resultantes
obtenidos mediante PCR se digirieron con BspHI y XhoI, y se
subclonaron en un plásmido pET-24d vacío entre los
sitios XhoI y NcoI. CXCL11-TN y todas las muteínas,
que carecen de la metionina de inicio en la forma madura, se pueden
producir como proteínas que contienen 73 residuos sin ningún otro
residuo adicional, ya que la señal aminoterminal se elimina
mediante el uso de digestión endoproteolítica con caspasa 8.
CXCL11-TN y las muteínas se
expresaron y se ensayaron según los métodos conocidos en la técnica
("Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology, vol.
138, Humana Press, 2000). Todas las construcciones se obtuvieron y
se controlaron mediante técnicas estándar de biología molecular
(mutagénesis y amplificación mediante PCR, secuenciación de ADN,
digestión de restricción), y después se mantuvieron en la cepa TG1
de E. coli durante el proceso de clonación. Las secuencias
codificantes se eligieron para tener un uso óptimo de los códones
para la expresión en E. coli (Kano JF et al.,
1995).
Los plásmidos basados en pET-24d
que codifican CXCL11-TN o uno de sus mutantes se
transfirieron a células de E. coli competentes BL21 (DE3)
pLysS, en las que la expresión de proteínas se indujo mediante la
adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 1 mM al cultivo. Las células se recogieron 3,5 horas después
de la inducción y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris/HCl 50
mM pH 8, MgCl_{2} 10 mM, Benzamidina/HCl 5 mM, DTT 1 mM, fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, 20 mg/L de ADNasa). Las
células se rompieron mediante tres pasos por una prensa de French.
La suspensión se centrifugó después a 10.000x g durante 60 minutos
a 4ºC. El sedimento de cuerpos de inclusión que contiene
CXCL11-TN o una de las muteínas se solubilizó (a
una concentración inferior a 1 mg/ml) en Tris/HCl 0,1 M, pH 8,0, que
contenía guanidina/HCl 6M y DTT 1 mM, y se agitó durante 30 minutos
a 60ºC. Las proteínas se renaturalizaron mediante dilución gota a
gota en un volumen de 10 veces el de la disolución de guanidina de
Tris/HCl 0,1 M, pH 8,0, que contenía glutatión oxidado 0,01 mM y
glutatión reducido 0,1 mM. La disolución se agitó durante la noche a
4ºC. Después se ajustó el pH a 4,5 con ácido acético, y se
disminuyó la conductividad a 20 miliSiemens mediante dilución con
agua. La disolución se aplicó a una columna de intercambio
catiónico (SP-Sepharose) previamente equilibrada con
acetato sódico 50 mM (pH 4,5), y la proteína se eluyó con un
gradiente lineal de NaCl de 0 a 2 M en el mismo tampón. Las
fracciones que contienen la proteína de interés se mezclaron y se
dializaron con 3 cambios de ácido acético al 1%. El material
insoluble se eliminó mediante centrifugación a 10.000x g durante 30
minutos, y el sobrenadante se liofilizó.
La secuencia líder aminoterminal común a
CXCL11-TN y a todas las muteínas (MKKKWPLETD) se
escindió con caspasa 8 mediante el uso del siguiente procedimiento.
Las proteínas liofilizadas se disolvieron en 15-20
ml de H_{2}O y se aplicaron a columnas PD-10
previamente equilibradas con tampón de escisión con caspasa 8 (15%
de glicerol, NaCl 150 mM, Tris 25 mM de pH 7,5, EDTA 2 mM). Después
de la incubación de las proteínas con enzima proteolítica (1:100,
enzima: sustrato, p/p) durante 4-5 horas a
temperatura ambiente, se ajustó el pH de la disolución de escisión
a 4,5, y se disminuyó la conductividad a 1-2
miliSiemens mediante dilución con urea 6 M (la reacción se repitió
dos o tres veces si fue necesario). Las proteínas escindidas se
separaron de la proteína sin escindir mediante cromatografía de
intercambio catiónico en una columna de SP-Sepharose
previamente equilibrada con acetato sódico 50 mM (pH 4,5) que
contenía urea 6 M, y las proteínas se eluyeron con un gradiente de
NaCl de 0 a 2 molar en el mismo tampón. Las fracciones escindidas
se mezclaron y se dializaron con tres cambios de ácido acético al
1%, se liofilizaron, se solubilizaron en ácido trifluoroacético al
0,1%, y finalmente se liofilizaron de nuevo para el almacenamiento
a largo plazo.
La identidad de todas las proteínas así
expresadas se verificó mediante espectrometría de masas, y se
determinó la pureza mediante cromatografía líquida de alta presión
(HPLC).
Se clonó CXCR3 humano a partir del ARN total
extraído de leucocitos aislados de membrana sinovial de artritis
reumatoide mediante transcripción inversa-reacción
en cadena de la polimerasa (RT-PCR) mediante el uso
de cebadores basados en la secuencia de ARNm de CXCR3 humano que
cubre toda la secuencia codificante (Genbank Nº X95876; nucleótidos
del 69 al 1175). Todos los reactivos para las reacciones de
RT-PCR están disponibles comercialmente
(Trizol^{TM} y Superscript^{TM} de Life Technologies;
oligodT_{15} de Promega) y se usaron según las instrucciones del
fabricante. El producto de PCR resultante de 1,1 kb se subclonó en
el vector de expresión de células mamíferas pCDNA3.1zeo
(Invitrogen) para crear pZeo-CXCR3.
Se transfectaron células HEK293/EBNA y L1.2
humanas con ADN plasmídico purificado de pZeo-CXCR3
mediante precipitación con fosfato cálcico mediante el uso de un
equipo de transfección con fosfato cálcico (Life Technologies), y
los clones positivos se seleccionaron mediante el uso de Zeocin
(Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La expresión de
CXCR3 se confirmó mediante análisis de FACS (separación de células
activada por fluorescencia) de los clones individuales mediante el
uso de un anticuerpo monoclonal comercial contra CXCR3 humano
marcado con un fluoróforo de FITC (R&D Systems; nº de cat.
MAB160), y mediante un ensayo de unión en equilibrio de
radioligando (véase más adelante).
CXCL11-TN, o cada uno de sus
mutantes, se cargó en una columna de
heparina-Sepharose (usando 50 microgramos de
proteína) o en una columna de intercambio catiónico
SP-Sepharose (usando 50 microgramos de proteína). En
ambos casos la columna se equilibró en Tris/HCl 50 mM, pH 7,5 y
NaCl 50 mM, y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl
0 - 2 M en el mismo tampón.
Se incubaron diluciones en serie de
CXCL11-TN o de sus mutantes en solución salina
tamponada con fosfato (PBS), que cubrían el intervalo de
0,02-30 \muM, con 2,5 \mug/ml de
[^{3}H]-heparina durante 1 hora a 37ºC. Se
transfirieron triplicados de 20 \mul de cada muestra a una placa
Unifilter P81 de 96 pocillos (Whatman Inc.) equipada con un filtro
de fosfato de celulosa. La placa se lavó tres veces con 200 \mul
de PBS mediante el uso de una bomba de vacío para eliminar la
heparina marcada sin unir. Se añadió líquido de centelleo (50
\mul) a cada pocillo y se contó la radiactividad (1
minuto/pocillo) en un contador \beta. Los datos se analizaron
mediante el uso del programa informático Prism® (GraphPad).
Los ensayos se llevaron a cabo en membranas de
células HEK que expresaban de forma estable CXCR3 mediante el uso
de un ensayo de proximidad de centelleo (SPA) con
[^{125}I]-CXCL11 como marcador. Se generó CXCL11
radiomarcado (I-TAC humano recombinante; Peprotech)
y se ensayó según las instrucciones del proveedor de [^{125}I]
(Amersham; actividad especifica de 2200 mCi/moles), también para
comprobar los clones de HEK y L1.2 que expresan CXCR3 teñidos de
forma positiva durante el análisis de FACS.
Los competidores se prepararon mediante
diluciones en serie (intervalo de 10^{-6} a 10^{-12} M) de
CXCL11 sin marcar, o de uno de sus mutantes, en el tampón de unión
(HEPES 50 mM, pH 7,2, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 M
y 0,5% de albúmina de suero bovino). Se solubilizaron esferas de SPA
de germen de trigo (Amersham) en PBS hasta 50 mg/ml, y se diluyeron
en el tampón de unión hasta 10 mg/ml, y la concentración final en
el ensayo fue de 0,25 mg/pocillo. Las membranas celulares que
expresan CXCR3 se almacenaron a -80°C y se diluyeron en el tampón de
unión hasta 20 \mug/ml. Se mezclaron volúmenes iguales de reservas
de membrana y de esferas antes de realizar el ensayo para reducir
el fondo. La concentración final de membrana fue de 5
\mug/pocillo, y la de [^{125}I]-CXCL11 fue 0,05
nM. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación
durante 4 horas. Se contó la radiactividad (1 minuto/pocillo) en un
contador \beta. Los datos de las muestras triplicadas se
analizaron mediante el uso del programa informático Prism®
(GraphPad).
Se expresó CXCL11 humano en cuatro formas
mutadas para identificar la secuencia y las propiedades de las
variantes que no se unen a heparina. El objetivo de las mutaciones
fueron cuatro agrupaciones de residuos básicos, y se
incluyó al menos un residuo básico conservado en todas las quimiocinas de unión a CXCR3 en cada muteína (Fig. 1).
incluyó al menos un residuo básico conservado en todas las quimiocinas de unión a CXCR3 en cada muteína (Fig. 1).
La forma madura de CXCL11 humano
(CXCL11-TN) y las cuatro muteínas correspondientes
se expresaron en E. coli, (Fig. 1A). Una primera muteína,
CXCL11-1B3, contiene tres sustituciones por alanina
que eliminan una agrupación básica en el extremo aminoterminal de
CXCL11-TN (lisina 5, arginina 6 y lisina 8). Una
segunda muteína (CXCL11-2B3) contiene tres
sustituciones por alanina que eliminan una agrupación básica que
rodea al residuo 50 de CXCL11-TN (lisina 46, lisina
49 y arginina 52). Una tercera muteína (CXCL11-3B3)
contiene tres sustituciones por alanina que eliminan una agrupación
básica que rodea al residuo 60 de CXCL11-TN (lisina
57, lisina 59 y arginina 62). Finalmente, una cuarta muteína
(CXCL11-4B4) contiene cuatro sustituciones por
alanina que eliminan una agrupación básica que rodea al residuo 70
de CXCL11-TN (lisina 66, lisina 67, arginina 70 y
lisina 71).
Los efectos de las sustituciones sobre las
propiedades de las muteínas de CXCL11-TN se
ensayaron primero mediante cromatografía con heparina e intercambio
catiónico. La comparación de los perfiles de elución de tales medios
cromatográficos proporciona una indicación cualitativa sobre la
contribución de las interacciones electrostáticas inespecíficas
debidas a los aminoácidos básicos con respecto a las propiedades de
unión a heparina (Proudfoot A et al., 2001). Como se muestra
en la Tabla III, la diferencia en la concentración de NaCl de
elución entre CXCL11-TN y cada muteína se calcula
en una columna de intercambio catiónico (Mono S) y en una columna de
heparina. Los valores obtenidos en la columna Mono S se restan
después de los obtenidos en la columna de heparina. Si el valor
resultante es positivo, esto indica que los residuos mutados
contribuyen a la interacción con heparina. A partir de este
análisis, parece que los residuos mutados en
CXCL11-1B3 no contribuyen a la unión a heparina,
mientras los mutados en CXCL11-2B3,
CXCL11-3B3 y CXCL11-4B4 están
implicados en el reconocimiento específico de GAGs.
Después se realizó una medida directa de la
unión a heparina mediante el uso de heparina tritiada y una dilución
en serie de los mutantes de CXCL11-TN recombinantes
(Fig. 2). Los complejos radiomarcados resultantes se separaron de
la [^{3}H]-heparina sin unir poniendo en contacto
la mezcla de reacción con filtros de fosfato de celulosa, que son
capaces de retener eficazmente las proteínas, por lo que permiten
una evaluación directa de la cantidad de heparina unida. Este
ensayo demostró que CXCL11-1B3 tiene propiedades de
unión a heparina similares a las de CXCL11-TN,
mientras todos los demás mutantes mostraron propiedades de unión a
heparina reducidas (hasta un 50% menos de heparina unida), lo que
confirma los resultados obtenidos mediante el uso de ensayos
cromatográficos (Tabla III). Estos datos son de interés particular,
ya que la agrupación básica mutada en CXCL11-1B3
está dispuesta en forma de un motivo (BBXB) muy parecido a otro
motivo de unión a heparina conocido, como el de RANTES (Proudfoot A
et al., 2001), lo que confirma la observación sobre la
notable diversidad estructural y la escasa previsibilidad de los
sitios de unión a GAG en las quimiocinas
(Lortat-Jacob H et al., 2002).
Finalmente, se realizó un ensayo de unión
competitiva al receptor en equilibrio para comparar las propiedades
de las muteínas sobre la unión al receptor específico CXCR3 (Fig.
3). Se mezclaron muestras que contenían una cantidad constante de
CXCL11 comercial radiomarcado con diluciones en serie de
CXCL11-TN, o de una de las muteínas, y después se
incubaron con membranas preparadas a partir de células HEK que
expresan CXCR3. Aunque la muteína que se une a heparina
CXCL11-1B3 muestra una reducción de más de dos
órdenes de magnitud (variación de sub-nanomolar a
sub-micromolar) en la afinidad por CXCR3, las otras
muteínas muestran solamente una caída limitada de afinidad por
CXCR3, y permanecen en el intervalo nanomolar (reducción de un orden
de magnitud, o menos). Por lo tanto, la afinidad por el receptor se
mantiene sustancialmente en los mutantes del extremo
carboxiterminal de CXCL11-TN deficientes de unión a
heparina, mientras las mutaciones en el extremo aminoterminal
afectan de forma específica a la unión al receptor, una
característica que parece claramente distinta.
Ejemplo
2
El ensayo se llevó a cabo mediante el uso de la
línea de células pre-B de linfoma (células L1.2)
transfectadas con un plásmido que permite la expresión de CXCR3 en
estas células, y microplacas de 96 pocillos (sistema ChemoTX,
Neuroprobe).
Las células L1.2 que expresan CXCR3 (véase la
descripción anterior) se cultivaron en medio
RPMI-1640 que contenía un 5% de suero bovino fetal
(FCS) inactivado, L-glutamina, HEPES 25 mM,
\beta-mercaptoetanol 0,05 mM y 0,8 mg/ml de
geneticina G-418. El día antes del ensayo se añadió
ácido n-butírico 5 mM al medio de cultivo. Las
células se recogieron mediante centrifugación a 600x g a temperatura
ambiente y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10^{6}/ml
en medio RPMI 1640 que contenía un 5% de FCS inactivado sin rojo
fenol. La expresión del receptor se comprobó mediante análisis de
FACS mediante el uso de un anticuerpo anti-CXCR3
marcado con un fluoróforo de FITC, como se describió
anteriormente.
Las muteínas de CXCL11 recombinantes se
diluyeron en serie (intervalo de 10^{-6} a 10^{-12} M) en 30
\mul de medio RPMI sin rojo fenol y se pusieron en los pocillos
inferiores, y se colocó un filtro (8 \mum de tamaño de poro)
sobre ellos, asegurándose de que no había burbujas de aire
retenidas, antes de sellar el sistema. Las células L1.2 que
expresan CXCR3 (25 \mul de una suspensión de células a 2,5 x
10^{4} células/ml en el mismo medio) se colocaron en los pocillos
superiores. La cámara se incubó durante 4 horas a 37ºC en una
atmósfera con un 5% de CO_{2}. La suspensión celular se desechó
después de los pocillos superiores y se extrajo el filtro. Las
células de los pocillos inferiores se transfirieron a una placa
negra de 96 pocillos y se congelaron durante al menos 1 h a -80ºC.
La placa se descongeló y se añadieron 200 \mul/pocillo de una
mezcla de tinción CyQUANT/tampón de lisis celular (Molecular
Probes) para determinar el número de células que migraron. La
fluorescencia se contó con un lector de placas Victor^{2} Wallac.
Los datos se analizaron mediante el uso del programa informático
Prism® (GraphPad).
\newpage
Las propiedades de las muteínas de
CXCL11-TN se ensayaron mediante el uso de un ensayo
basado en células. Los resultados obtenidos en el ensayo de
quimiotaxis en células L1.2 modificadas para expresar CXCR3 se
corresponden con los obtenidos en el ensayo de unión a receptor
descrito anteriormente. De acuerdo con su baja afinidad por CXCR3,
el mutante CXCL11-1B3 fue incapaz de reclutar
células L1.2 que expresan CXCR3 (Fig. 4). Los otros tres mutantes
fueron menos activos que CXCL11-TN, pero todavía
fueron capaces de provocar una respuesta medible en este ensayo de
quimiotaxis.
Ejemplo
3
Se sensibilizaron ratones Balb/C hembra de 8 a
12 semanas de edad en el día 0. Todos los ratones recibieron 5
inyecciones subcutáneas (4 x 50 \mul en cada extremidad y 1 x 100
\mul en la nuca) de CpG-ODN 10 nM (Microsynth)
mezclado con 100 \mug de ovoalbúmina (Sigma, grado V) en PBS
estéril. Después de una semana, se indujo el reclutamiento celular
en los ratones Balb/C mediante inyección intraperitoneal de 10
\mug (0,5 mg/kg) de proteína CXCL11 recombinante diluida en 0,2
ml de solución salina estéril exenta de lipopolisacáridos (0,9%). Al
ensayar las propiedades de los mutantes de CXCL11, las cantidades
indicadas de la proteína, diluida de 0,2 ml de la misma disolución
estéril, se administraron 30 minutos antes de la administración del
agonista. Los ratones se sacrificaron mediante CO_{2} en aerosol
4 horas más tarde, y se realizó el lavado peritoneal con 5 ml de PBS
tres veces. Los lavados se mezclaron y se centrifugaron a 1500x g
durante 5 minutos, y las células sedimentadas se resuspendieron en
un volumen final de 1 mililitro. Se contó el número total de
leucocitos obtenidos para cada muestra con un hemocitómetro.
Se realizó el ensayo de inflamación de la oreja
de ratón para medir la hipersensibilidad por contacto como se
describió (Garrigue JL et al., 1994). Brevemente, los ratones
se pre-sensibilizaron de forma tópica aplicando 25
\mul de disolución del 0,5% de
2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB; Sigma Chemical Co.)
en acetona/aceite de oliva (4:1) en el abdomen afeitado. Cinco días
después, se aplicaron 20 \mul de DNFB al 0,2% en el mismo vehículo
en la oreja derecha, y solamente vehículo en la oreja izquierda.
Los ratones se trataron diariamente desde el día 5 al 9 con una
administración intraperitoneal de 0,5 mg/kg de
CXCL11-3B3 o vehículo solamente en el grupo de
control. El primer tratamiento se administró 1 hora antes de la
exposición a DNFB. Se midió el grosor de la oreja con un calibre de
espesor con escala circular (Mitutoyo Corp.), y se estimó la
inflamación de la oreja restando el valor
pre-exposición del valor
post-exposición, y sustrayendo además cualquier
inflamación detectada en la oreja contralateral expuesta al
vehículo.
Se obtuvieron datos adicionales de las
propiedades in vivo de las muteínas de
CXCL11-TN haciendo uso de dos modelos animales.
Un primer ensayo fue un ensayo de reclutamiento
celular peritoneal (Fig. 5). Ya que CXCR3 se expresa en células Th1
activadas, se sensibilizó a los ratones antes del ensayo con
CpG-ODN para inducir una respuesta Th1. De acuerdo
con su escasa actividad como proteína de unión a CXCR3 y su
incapacidad para reclutar células in vitro, el mutante
CXCL11-1B3 fue incapaz de reclutar células in
vivo cuando se administró en el peritoneo. Tanto
CXCL11-2B3 como CXCL11-4B4 mostraron
una actividad débil, pero CXCL11-3B3 no fue capaz de
provocar reclutamiento (Fig. 5).
Después se ensayó la capacidad de este último
mutante para inhibir CXCL11-TN in vivo (Fig.
6). CXCL11-3B3 no muestra propiedades de
reclutamiento por sí solo, sino actividad antagonista considerable
sobre CXCL11-TN, con respecto a la inducción del
reclutamiento celular en el peritoneo, cuando se administra antes a
la misma dosis (10 \mug/ratón). Por lo tanto, la abrogación de la
unión a heparina en CXCL11 produce un antagonista capaz de inhibir
in vivo el reclutamiento celular inducido por CXCL11.
Finalmente, las propiedades de
CXCL11-3B3 se ensayaron en un modelo de inflamación
cutánea, el ensayo de hipersensibilidad retardada por contacto.
Esta inflamación cutánea específica de haptenos está mediada por las
células T, y genera una inflamación medible después de exponer a
los ratones al sensibilizador por contacto
2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) como hapteno. La
inflamación inducida fue significativamente inferior en los ratones
tratados con una administración intraperitoneal de
CXCL11-3B3, cuando se compara con el efecto
observado en los ratones tratados con vehículo solamente, a lo
largo del periodo de tratamiento (Fig. 7).
Dados los resultados obtenidos en los ejemplos
de la presente invención, los antagonistas nuevos de las quimiocinas
CXC de unión a CXCR3 se pueden diseñar de acuerdo con los hallazgos
de esta solicitud de patente, en particular los mutantes
deficientes de unión a heparina de CXCL11 humano, CXCL10 humano y
CXCL9 humano que contienen sustituciones simples o múltiples de los
aminoácidos básicos conservados en el extremo carboxiterminal, y,
finalmente, de otros residuos básicos conservados en una o más
quimiocinas CXC de unión a CXCR3 específicas y/o uno o más residuos
básicos que los rodean.
Las propiedades de las moléculas alternativas
descritas en la presente solicitud se pueden ensayar mediante
cualquiera de los métodos descritos anteriormente, o haciendo uso de
otras aproximaciones de validación conocidas en la técnica, como se
analiza exhaustivamente en la bibliografía ("Chemokine
Protocols", Methods in Molecular Biology, vol. 138, Humana
Press, 2000; "Chemokine Receptors", Methods in Enzymology, vol.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTAGONISTAS NUEVOS DE QUIMIOCINAS
CXC DE UNIÓN A CXCR3
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<130> WO513
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<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
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<210> 1
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<211> 73
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<211> 73
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<212> PRT
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<213> construcción sintética
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<400> 2
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Antagonistas de quimiocinas CXC de unión a
CXCR3 que consisten en mutantes de CXCL11, CXCL10 ó CXCL9 en los
que al menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de
acuerdo con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano
maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está
sustituido por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina, ácido
glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 46, 62, 66 y
70.
2. Los antagonistas de la reivindicación 1, en
los que la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es CXCL11 humano, y al
menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo
con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro,
como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1), está sustituido
adicionalmente por alanina, glicocola, serina, treonina, prolina,
ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 49, 52,
57, 59, 67 ó 71.
3. Los antagonistas de la reivindicación 2, en
los que una de las siguientes combinaciones de residuos básicos,
numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con
CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº:
1), están sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina:
- a)
- 46, junto con 49 y/o 52;
- b)
- 62, junto con 57 y/o 59;
- c)
- 66 y 70, junto con 67 y/o 71; o
- d)
- 62 y 66, junto con uno o más de los siguientes: 57, 59, 67, 70 ó 71.
4. Los antagonistas de la reivindicación 2 ó 3,
en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos,
numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con
CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº:
1) está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina,
treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina: 5, 6, 8, 17, 20, 26 ó 38.
5. Los antagonistas de la reivindicación 1, en
los que la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es CXCL10 humano, y al
menos uno de los siguientes residuos básicos, numerados de acuerdo
con las posiciones en el alineamiento con CXCL11 humano maduro,
como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº: 1) está sustituido
adicionalmente por alanina, gli-
cocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 47, 48, 51, 52, 59, 74 ó 75.
cocola, serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o asparagina: 47, 48, 51, 52, 59, 74 ó 75.
6. Los antagonistas de la reivindicación 5, en
los que una de las siguientes combinaciones de residuos básicos,
numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con
CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº:
1), están sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina:
- a)
- 46 y 52, junto con 47, 48 ó 51;
- b)
- 59 y 62;
- c)
- 66 y 70, junto con 74 y/o 75; o
- d)
- 62 y 66, junto con 59 y/o 70.
7. Los antagonistas de la reivindicación 5 ó 6,
en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos,
numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con
CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº:
1) está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina,
treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina: 5, 8, 22, 26 ó 38.
8. Los antagonistas de la reivindicación 1, en
los que la quimiocina CXC de unión a CXCR3 es CXCL9, y el residuo
básico 67, numerado de acuerdo con las posiciones en el alineamiento
con CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC
Nº: 1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola,
serina, treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido
aspártico o asparagina.
9. Los antagonistas de la reivindicación 8, en
los que una de las siguientes combinaciones de residuos básicos,
numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con
CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº:
1), están sustituidos por alanina, glicocola, serina, treonina,
prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina:
- a)
- 62, junto con 66 y/o 67;
- b)
- 66 y 67; o
- c)
- 66 y 70, junto con uno o más de los siguientes: 67, 74 ó 75.
10. Los antagonistas de la reivindicación 8 ó 9,
en los que al menos uno de los siguientes residuos básicos,
numerados de acuerdo con las posiciones en el alineamiento con
CXCL11 humano maduro, como se muestra en la Figura 1B (ID SEC Nº:
1), está sustituido adicionalmente por alanina, glicocola, serina,
treonina, prolina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico o
asparagina: 5, 6, 8, 25, 28 ó 38.
11. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a
10, en los que los residuos básicos están sustituidos por alanina o
glicocola.
12. Los antagonistas de la reivindicación 11 que
consisten en las secuencias de CXCL11-2B3 (ID SEC
Nº: 3), CXCL11-3B3 (ID SEC Nº: 4) o
CXCL11-4B4 (ID SEC Nº: 5).
13. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a
11, en los que uno o más aminoácidos que se han añadido, eliminado
o sustituido pertenecen a los primeros nueve aminoácidos del dominio
aminoterminal de la quimiocina CXC de unión a CXCR3 humana
madura.
14. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a
13, en los que se han mutado uno o más aminoácidos para disminuir
las propiedades de agregación de dicho antagonista.
15. Los antagonistas de quimiocinas CXC de unión
a CXCR3 que comprenden los antagonistas de las reivindicaciones 1 a
14, y una secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia
proteica distinta de la que corresponde a quimiocina CXC de unión a
CXCR3.
16. Los antagonistas de la reivindicación 15,
que comprenden una secuencia de aminoácidos que pertenece a una o
más de estas secuencias proteicas: dominios extracelulares de
proteína unida a membrana, región constante de inmunoglobulinas,
dominios de multimerización, proteínas extracelulares, proteínas que
contienen péptidos señal, proteínas que contienen señales de
exportación.
17. Los antagonistas de las reivindicaciones 1 a
16, en los que dicho antagonista está en forma de conjugado o
complejo activo con una molécula elegida entre moléculas
radiactivas, biotina, moléculas fluorescentes, agentes citotóxicos
o agentes de administración de fármacos.
18. Las moléculas de ADN que comprenden las
secuencias de ADN que codifican los antagonistas de las
reivindicaciones 1 a 16.
19. Los vectores de expresión que comprenden las
moléculas de ADN de la reivindicación 18.
20. Una célula hospedadora transformada con un
vector de la reivindicación 19, en la que la célula hospedadora no
es una célula embrionaria humana.
21. El uso de cualquiera de los antagonistas de
las reivindicaciones 1 a 17, del ADN de las reivindicaciones 18 ó
19, o de la célula de la reivindicación 20, para la fabricación de
una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de
enfermedades relacionadas con la migración y activación excesiva de
leucocitos.
22. El uso de la reivindicación 21, en el que la
enfermedad es una enfermedad inflamatoria, una enfermedad
autoinmune o una infección.
23. El uso de la reivindicación 22, en el que la
enfermedad es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, infección
por VIH-1, diabetes tipo I o rechazo de
injertos.
24. El uso de cualquiera de los antagonistas de
las reivindicaciones 1 a 17, del ADN de las reivindicaciones 18 ó
19, o de la célula de la reivindicación 20, para la fabricación de
una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de
enfermedades que necesitan un incremento de la vascularización.
25. El uso de la reivindicación 24, en el que la
enfermedad es una cardiopatía isquémica.
26. El uso de cualquiera de los antagonistas de
las reivindicaciones 1 a 17, del ADN de las reivindicaciones 18 ó
19, o de la célula de la reivindicación 20, para la fabricación de
una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención
del cáncer.
27. Un proceso de preparación de los
antagonistas de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende cultivar
las células transformadas de la reivindicación 20 y recoger las
proteínas expresadas.
28. Una composición farmacéutica que contiene un
antagonista de quimiocinas CXC de unión a CXCR3 de las
reivindicaciones 1 a 17, el ADN de las reivindicaciones 18 ó 19, o
la célula de la reivindicación 20, como ingrediente activo.
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