ES2320743T3 - Mutantes de quimiocina que actuan como antagonistas de quimiocinas. - Google Patents
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Abstract
Un mutante de una quimiocina CC seleccionado de entre CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13 y CCL15 que contiene la siguiente secuencia de consenso: C - C - (X) 18-19 - (X a) 2 - X bX - C en donde, en la secuencia de consenso no mutada: C representa Cisteína; X representa cualquier aminoácido; Xa representa Serina o Treonina; X b representa Glicina o Serina; y en donde dicho mutante: a) contiene en la posición X b una sustitución con Prolina, Lisina, Arginina, Histidina, Ácido aspártico, Ácido glutámico, Glutamina o Aspargina; y b) actúa como un antagonista de la correspondiente quimiocina CC.
Description
Mutantes de quimiocina que actúan como
antagonistas de quimiocinas.
La presente invención se refiere a nuevos
mutantes de CC-quimiocinas que actúan como
antagonistas de CC-quimiocinas.
Las quimiocinas son proteínas
pro-inflamatorias segregadas, de pequeñas
dimensiones (70-130 aminoácidos), implicadas en su
mayoría en la migración y activación direccional de células, en
especial en la extravasación de leucocitos desde la sangre hacia
localizaciones tisulares que necesitan el reclutamiento de estas
células (Baggiolini, M., y otros, 1997; Rossi, D., y Zlotnik, A.,
2000; Fernandez, E.J., y Lolis, E., 2002). Usualmente, las
quimiocinas se producen en el sitio de una lesión, inflamación u
otra alteración tisular, de una manera paracrina o autocrina,
desencadenando migración y activación específicas para tipos de
células.
Dependiendo del número y posición de las
cisteínas conservadas en la secuencia, las quimiocinas se
clasifican en quimiocinas C, CC, CXC y CX_{3}C. Dentro de cada
una de estas familias, las quimiocinas se pueden agrupar además de
acuerdo con la homología de la secuencia completa, o de segmentos
específicos.
Una serie de receptores de membrana acoplados a
proteína G heptahélicos son los partícipes en la fijación que
permiten a las quimiocinas ejercer su actividad biológica en las
células diana, que presentan combinaciones específicas de
receptores de acuerdo con su estado y/o tipo.
Se ha propuesto una nomenclatura unificada para
ligandos y receptores de quimiocinas, que originalmente habían sido
nombrados de una manera muy heterogénea por los científicos que los
habían descubierto, con el fin de asociar cada una de estas
moléculas con un nombre sistémico que incluye un número ascendente:
CCL1 CCL2, etc. para quimiocinas CC; CCR1 CCR2, etc. para
receptores de quimiocinas CC, y así sucesivamente.
Los efectos fisiológicos de las quimiocinas son
el resultado de un sistema complejo e integrado de interacciones
concurrentes. A menudo los receptores tienen una especificidad de
ligando solapada, de modo que un único receptor puede fijar
diferentes quimiocinas, y también una única quimiocina puede fijar
diferentes receptores. En particular, el dominio
N-terminal de quimiocinas está implicado en la
fijación a receptor y la elaboración N-terminal
puede, o bien activar las quimiocinas, o bien hacerlas a las
quimiocinas completamente inactivas.
Aunque existen inconvenientes potenciales en el
uso de quimiocinas como agentes terapéuticos (tendencia a la
agregación, fijación promiscua), estas moléculas ofrecen la
posibilidad de intervención terapéutica en condiciones patológicas
asociadas a estos procesos, en particular inhibiendo/antagonizando
quimiocinas específicas y sus receptores con el objetivo de
prevenir el reclutamiento y activación excesivos de células, en
particular leucocitos, para diversas indicaciones relacionadas con
enfermedades inflamatorias y autoinmunológicas, cánceres, e
infecciones bacterianas o víricas (Carter, P.H., 2002; Schneider,
G.P., y otros, 2001, Baggiolini, M., 2001; Godessart, N., y Kunkel,
S.L., 2001; Proudfoot, A., y otros, 2000).
Ya se han descrito con anterioridad algunos
mutantes/variantes de quimiocinas, por ejemplo un mutante S32A
RANTES (documento US 6,057,123 A), variantes MCP-1
en las cuales los restos expuestos en la superficie han sido
reemplazados por alanina, entre ellos el mutante S34A (Beck Craig,
G., y otros, J. Biol. Chem., 16 de noviembre de 2001;
276(46): 43270-43276); Hemmerich, S., y
otros, Biochemistry 5 de octubre de 1999; 38(40):
13013-13025), una quimiocina CKb-13
que contiene la secuencia de consenso
C-C-(X)_{18-19}-(X_{a})_{2}-X_{b}-X-C,
en donde X_{b} es ácido aspártico (documento WO 98/24908 A), y
una quimiocina Eotaxin-3 que contiene la secuencia
de consenso
C-C-(X)_{18-19}-
(X_{a})_{2}-X_{b}-X-C en donde X_{b} es asparagina (resumen del documento JP 11243960 A).
(X_{a})_{2}-X_{b}-X-C en donde X_{b} es asparagina (resumen del documento JP 11243960 A).
Entre todas las quimiocinas caracterizadas hasta
la fecha, las quimiocinas CC, tales como la CCL5 (también
denominada RANTES; Appay, V., y Rowland-Jones, S.L.,
2001) han sido estudiadas detalladamente con el fin de identificar
moléculas terapéuticamente útiles. Se han probado variantes de
quimiocinas CC que carecen de hasta nueve aminoácidos
N-terminales, en cuanto a su actividad como
inhibidores o antagonistas de las formas existentes en la
naturaleza. Estas moléculas son inactivas sobre monocitos y son
útiles como antagonistas de receptor (Gong, J., y
Clark-Lewis, I., 1995; Gong, J.H., y otros, 1996;
documento WO 99/16877). Como alternativa, la extensión
N-terminal de la quimiocina CC madura con una
metionina da como resultado la inactivación casi completa de la
molécula, que se comporta también como un antagonista para la
molécula auténtica (documento WO
96/17935).
96/17935).
Además, con el fin de llevar cabo análisis de
estructura-función de quimiocinas CC, se han probado
variantes que contienen sustituciones o modificaciones químicas en
diferentes posiciones, así como péptidos derivados de quimiocinas
CC, en busca de interacciones con receptores u otras moléculas,
tales como glicosaminoglicanos (GAGs). Se ha descrito de algunas de
estas variantes que tienen propiedades de fijación
significativamente alteradas, y a veces son activas como
antagonistas de quimiocinas CC, con potenciales aplicaciones
terapéuticas en el tratamiento de la
infección por VIH y de enfermedades inflamatorias o alérgicas (documentos WO 99/33989; US6057123; PCT/EP01/
11428; Nardese, V., y otros, 2001; Martin, L., y otros, 2001; Beck, C., y otros, 2001; Hemmerich, S., y otros, 1999).
infección por VIH y de enfermedades inflamatorias o alérgicas (documentos WO 99/33989; US6057123; PCT/EP01/
11428; Nardese, V., y otros, 2001; Martin, L., y otros, 2001; Beck, C., y otros, 2001; Hemmerich, S., y otros, 1999).
Sin embargo, ninguna de estas investigaciones ha
estudiado exhaustivamente las propiedades de todos los mutantes que
se derivan de las sustituciones no conservadoras en cada posición
individual conservada en quimiocinas CC, o en un subconjunto de las
mismas.
Se ha hallado, sorprendentemente, que mutantes
específicos de una quimiocina CC (CCL5, también denominada RANTES),
que contienen una única sustitución no conservadora en una secuencia
de consenso común a un subconjunto de quimiocinas CC, actúan como
antagonistas de esta quimiocina CC.
Estas pruebas se pueden explotar para generar
mutantes que tengan propiedades similares hacia este subconjunto de
quimiocinas CC que comparten la misma secuencia de consenso. Las
moléculas preparadas de acuerdo con la presente invención se pueden
emplear en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y
autoinmunológicas, cánceres, e infecciones bacterianas o
víricas.
Tras la siguiente descripción detallada serán
evidentes otras características y ventajas de la invención.
Figura 1: ADN y secuencia de proteína (SEQ ID
NO: 8 y 9) de secRANTES G32N. La secuencia madura de RANTES G32N
(SEQ ID NO: 1; subrayado; su secuencia codificadora se indica en SEQ
ID NO:16) se obtienen después de digerir con tripsina el secRANTES
G32N expresado por E. coli, eliminar la secuencia guía
MKKKWPR (secuencia de ADN y secuencia de proteína indicadas en SEQ
ID NO: 14 y 15, respectivamente). La posición específica
(denominada posición X_{b} en la Figura 9 y en la reivindicación
1) que está mutada en RANTES G32N y en los otros mutantes
correspondientes RANTES G32P (SEQ ID NO: 2), RANTES G32D (SEQ ID NO:
3), RANTES G32K (SEQ ID NO: 4), Met-RANTES G32N
(SEQ ID NO: 5), RANTES(3-68) G32N (SEQ ID NO:
6), y RANTES G32N ALL40'S (SEQ ID NO: 7), está en un recuadro. La
numeración se indica con referencia a la secuencia madura de
RANTES.
Figura 2: ensayos de competición de equilibrio
para la fijación a receptor. Desplazamiento de
[^{125}I]MIP-1\alpha por RANTES
(\blacksquare) o RANTES G32A (\medbullet) a partir de (a) CCR1 y
(b) CCR5.
Figura 3: quimiotaxia de monocitos inducida por
RANTES (a) y RANTES G32N (b).
Figura 4: inducción del reclutamiento celular en
el peritoneo por 10 \mug de RANTES (\blacksquare) y 10 \mug de
RANTES G32N (\medbullet) comparado con el nivel basal observado
con la administración de solución salina (\ding{115}).
Figura 5: inhibición por RANTES G32N del
reclutamiento peritoneal inducido por RANTES. Se determinó la
inhibición del reclutamiento celular peritoneal inducido por 10
\mug de RANTES (\blacksquare) mediante la administración de 10
\mug de RANTES G32N (\boxempty), 1 \mug de RANTES G32N
(\Delta) y 0,1 \mug de RANTES G32N (\medcirc) 30 minutos
antes de la administración de RANTES en comparación con el
reclutamiento basal observado con la administración sólo de
solución salina (\ding{115}). Se empleó como testigo positivo de
inhibición (\medbullet) un tratamiento con 1 \mug de
Met-RANTES.
Figura 6: Efecto de RANTES G32N en la prevención
del reclutamiento celular en las vías respiratorias de ratones
sensibilizados con ovalbúmina. Unos ratones no fueron sensibilizados
con ovalbúmina, sino simplemente con solución salina, y constituyen
el testigo negativo (NaCl), mientras que otros fueron sensibilizados
con ovoalbúmina, pero tratados con solución salina, constituyendo
el grupo testigo positivo (OVA). Se empleó como testigo de
inhibición el tratamiento con Met-RANTES.
Figura 7: Inhibición de la hipersensibilidad de
contacto. Los grupos de tratamiento incluían RANTES G32N a 0,5
mg/kg (\medbullet) y proteína de fijación a IL-18
12,5 mg/kg (testigo de referencia; \ding{115}), para comparar con
PBS (testigo negativo; \blacksquare). Se midió la hinchazón de la
oreja en los días 0, 5, 6, 7, 8, 9, 12,14,16. Se utilizó la prueba
T de Student para determinar diferencias significativas de vehículo
frente a RANTES G32N: D6 p=0,0117; D7 p=0,0146; D8 p=0,0083; D9
p=0,0107; D12 p=0,0334.
Figura 8: Estructura de RANTES G32N, que muestra
la densidad electrónica 2fo-fc perfilada a 2\sigma
en torno a los restos
Thr30-Ser31-Gly32-Lys33,
y en particular la mutación de Gly 32 a Asn.
Figura 9: Alineamiento de secuencias de las
secuencias de aminoácido de quimiocinas CC que contienen la
secuencia de consenso definida en la presente invención: quimiocina
CC humana CCL1 (denominada también I-309, número de
accesión SWISSPROT P22362; segmento 33-57, SEQ ID
NO:17), CCL2 (denominada también MCP-1, número de
accesión SWISSPROT P13500; segmento 34-59, SEQ ID
NO:18), CCL3 (denominada también MIP-1 alfa; número
de accesión SWISSPROT P10147; segmento 33-57, SEQ
ID NO:19), CCL4 (denominada también MIP-1 beta;
número de accesión SWISSPROT P13326; segmento
34-58, SEQ ID NO:20), CCL5 (denominada también
RANTES, número de accesión SWISSPROT P13501; segmento
33-57, SEQ ID NO:21), CCL7 (denominada también
MCP-3, número de accesión SWISSPROT P80098;
segmento 34-59, SEQ ID NO:22), CCL11 (denominado
también Eotaxin, número de accesión SWISSPROT P51671; segmento
32-57, SEQ ID NO:23), CCL13 (denominado también
MCP-4, número de accesión SWISSPROT Q99616; segmento
34-58, SEQ ID NO:24), y CCL15 (denominado también
HCC-2, número de accesión SWISSPROT Q16663; segmento
53-77, SEQ ID NO:25). Se han señalado en recuadros
los restos Xa correspondientes y se ha subrayado la posición
correspondiente X_{b} que se ha de sustituir de manera no
conservadora.
En base a estudios cristalográficos, se ha
hallado ahora que mediante la mutación de RANTES (CCL5) en la
posición 32 es posible obtener un antagonista de RANTES, útil en el
tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunológicas,
cánceres, e infecciones bacterianas o víricas. Los análisis de la
estructura de RANTES G32N y la comparación con la estructura y la
secuencia de otras quimiocinas CC conocidas más similares a CCL5 en
esta región (véase la Figura 9) sugiere que este resto desempeña un
papel general en la actividad biológica de un subconjunto de
quimiocinas CC.
Por tanto, los autores de la presente invención
han definido una secuencia de consenso en el segmento comprendido
entre el sitio Cys-Cys que caracteriza a las
quimiocinas CC y los siguientes restos Cys conservados (Figura 9)
que es común a un subconjunto de quimiocinas CC, y que contiene un
residuo conservado que, si está adecuadamente sustituido,
transforma a la quimiocina CC en un antagonista de quimiocina CC. La
técnica anterior no proporciona ninguna indicación acerca de la
importancia y el posible uso de una sustitución no conservadora en
esta posición y en este grupo particular de quimiocinas CC definido
sobre dicha secuencia de consenso (documentos WO 99/33989;
US6057123; PCT/EP01/11428; Nardese, V., y otros, 2001; Mayer, M.R.,
y Stone, M.J., 2001; Martin, L., y otros, 2001; Beck, C., y otros,
2001; Hemmerich, S., y otros, 1999).
Por tanto, el objeto principal de la presente
invención es proporcionar mutantes de una quimiocina CC que
contiene la siguiente secuencia de consenso:
C-C-(X)_{18-19}-(Xa)_{2}-X_{b}-X-C
en donde, en la secuencia de
consenso no
mutada:
C representa Cisteína;
X representa cualquier aminoácido;
X_{a} representa Serina o Treonina;
X_{b} representa Glicina o Serina;
y en donde dicho
mutante:
- a)
- contiene en la posición X_{b} una sustitución con Prolina, Lisina, Arginina, Histidina, Ácido aspártico, Ácido glutámico, Glutamina o Aspargina y
- b)
- actúa como un antagonista de la correspondiente quimiocina CC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las quimiocinas CC humanas que comparten dicha
secuencia de consenso son CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7,
CCL11, CCL13, y CCL15 (véase la Figura 9). En la presente memoria
descriptiva de patente se proporcionan ejemplos de tales mutantes
para RANTES/CCL5 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, y 4).
Además de la mutación en la posición X_{b}, la
presente memoria descriptiva describe mutantes que incluyen otras
modificaciones con respecto a la molécula de tipo natural, tales
como deleciones, sustituciones o adiciones, que generan mutantes
activos de los antagonistas de quimiocina CC antes definidos. Estas
modificaciones adicionales deberían estar destinadas a mantener, o
incluso potenciar las propiedades antagonistas de los mutantes
ilustrados en la presente memoria descriptiva de patente. Esta
categoría de moléculas incluye análogos naturales o artificiales de
dicha secuencia, en donde se han añadido, eliminado, o sustituido
uno o más restos de aminoácido, siempre que presenten la misma
actividad biológica, o mediante cualesquiera otros medios relevantes
conocidos en la técnica, a niveles comparables o superiores.
En los mutantes de quimiocina CC específicos se
han podido añadir, eliminar o sustituir uno o más aminoácidos en la
región N-terminal, que se sabe afectan a la fijación
a receptor. Puede que estas mutaciones adicionales sean ya
conocidas como productoras de antagonistas de quimiocina CC. Por
ejemplo, los mutantes RANTES de la presente invención pueden
contener también un aminoácido adicional en el extremo
N-terminal, tal como se describe en el documento WO
96/17935, o bien pueden carecer de los dos primeros aminoácidos
N-terminales tal como se describe en el documento
WO 99/16877. De acuerdo con esto, se pueden obtener moléculas
basadas en RANTES G32N y con la secuencia aminoacídica de
Met-RANTES G32N (SEQ ID NO: 5) y
RANTES(3-68) G32N (SEQ ID NO: 6), y éstas
están cubiertas también por la presente invención.
Como alternativa, RANTES G32N puede contener
también mutaciones puntuales en otros sitios, tal como se describe
en el documento WO 99/33989, o bien puede contener otras mutaciones
en el dominio de fijación GAG tal como se describe en el documento
PCT/EP01/11428. En este último caso, la molécula tiene la secuencia
de aminoácidos de RANTES G32N ALL40'S (SEQ ID NO: 7).
Estos polipéptidos se pueden preparar mediante
síntesis química, mediante técnicas de mutagénesis dirigida, o
mediante cualquier otra técnica conocida adecuada para ello, que
proporcione un conjunto finito de péptidos o polipéptidos mutados o
acortados sustancialmente correspondientes que se puedan obtener y
ensayar de manera rutinaria por un especialista de pericia
ordinaria en la técnica haciendo uso de las enseñanzas presentadas
en la técnica anterior y en los Ejemplos de la presente memoria
descriptiva de patente. También se pueden originar compuestos
similares mediante una técnica de mutagénesis convencional del ADN
codificador, mediante tecnologías combinatorias a nivel de la
secuencia de ADN codificador (por ejemplo barajamiento de ADN,
expresión/selección en fago), o mediante estudios
de diseño asistido por ordenador para diseñar señuelos para interacciones de quimiocinas (Rajarathnam, K., 2002).
de diseño asistido por ordenador para diseñar señuelos para interacciones de quimiocinas (Rajarathnam, K., 2002).
Otros cambios preferidos en los mutantes
activos, adicionales, que se describen a continuación, se denominan
habitualmente sustituciones "conservadoras" o "seguras",
es decir son sustituciones con aminoácidos que tienen propiedades
químicas lo suficientemente similares como para mantener la
estructura y la función biológica de la molécula como antagonista
de quimiocina CC. Está claro que pueden hacerse inserciones y
deleciones de aminoácidos en las secuencias definidas anteriormente
sin alterar la función, en particular si las inserciones o
deleciones sólo implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos
de diez y preferiblemente menos de tres, y no retiran ni desplazan
aminoácidos que son críticos para la conformación funcional de una
proteína o un péptido.
La bibliografía proporciona muchos modelos en
los que puede realizarse la selección de sustituciones de
aminoácidos conservadores basándose en estudios estadísticos y
fisicoquímicos sobre la secuencia y/o la estructura de proteínas
naturales (Rogov, S.I. y Nekrasov, A.N., 2001). Los experimentos de
diseño de proteínas han demostrado que el uso de subseries
específicas de aminoácidos puede producir proteínas plegables y
activas, ayudando a la clasificación de sustituciones
"sinónimas" de aminoácidos que pueden acomodarse más fácilmente
en la estructura de las proteínas, y que pueden usarse para
detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales (Murphy,
L.R., y otros, 2000). Los grupos aminoácidos sinónimos y los grupos
sinónimos más preferidos son los definidos en la Tabla 1.
En la técnica anterior (Nardese, V., y otros,
2001) se han descrito péptidos correspondientes a subsecuencias
pertenecientes a quimiocinas CC. También se han descrito péptidos
similares, comprendidos en cualquiera de los subconjuntos de
quimiocinas CC antes identificados y que contienen una sustitución
no conservadora del resto situado en la posición correspondiente a
la posición X_{b} antes indicada en la secuencia de consenso.
Estos péptidos deben corresponder a subsecuencias que pertenecen a
las quimiocinas CC antes indicadas, y deben estar constituidos por
al menos 5 aminoácidos, preferiblemente 10 o más aminoácidos.
Además, se pueden generar antagonistas
alternativos basados en dichos péptidos en forma de miméticos de
péptido (también llamados peptidomiméticos), en los cuales se ha
modificado químicamente la naturaleza del péptido o polipéptido al
nivel de las cadenas de aminoácidos, de la quiralidad de los
aminoácidos, y/o del esqueleto peptídico. Se pretende que estas
alteraciones proporcionen antagonistas con características de
preparación, potencia y/o farmacocinética mejoradas.
Por ejemplo, cuando suponga un problema el hecho
de que el péptido sea susceptible de escisión por peptidasas
después de la inyección en el sujeto, el reemplazo de un enlace
peptídico particularmente sensible por un peptidomimético no
escindible puede proporcionar un péptido más estable y de esta
manera más útil como agente terapéutico. De manera similar, el
reemplazo de un resto L-aminoacídico es una manera
convencional de hacer que el péptido sea menos sensible a la
proteólisis y finalmente más similar a compuestos orgánicos
distintos de péptidos. También son útiles grupos bloqueantes
amino-terminales tales como
t-butiloxicarbonilo, acetilo, etilo, succinilo,
metoxisuccinilo, suberilo, adipilo, azelaílo, dansilo,
benciloxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, metoxiazelaílo,
metoxiadipilo, metoxisuberilo y 2,4-dinitrofenilo.
En la bibliografía se han descrito muchas otras modificaciones que
proporcionan una mayor potencia, actividad prolongada, facilidad de
purificación y/o mayor vida media (documento WO 02/10195; Villain,
M., y otros, 2001).
Los definidos en la Tabla II son grupos
"sinónimos" alternativos preferidos para los derivados de
aminoácidos incluidos en peptidomiméticos. Una lista no exhaustiva
de derivados de aminoácidos incluyen también el ácido
amino-isobutírico (Aib),
hidroxi-prolina (Hyp),
1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolina-3-COOH,
ácido indolina-2-carboxílico,
4-difluoro-prolina, ácido
L-tiazolidina-4-carboxílico,
L-homoprolina,
3,4-dehidro-prolina,
3,4-dihidroxi-fenilalanina,
ciclohexil-glicina, y
fenil-glicina.
Se entiende por "derivado de aminoácido" un
aminoácido o una entidad química similar a aminoácido distinta de
uno de los 20 aminoácidos presentes en la naturaleza codificados
genéticamente. En particular, los derivados de aminoácidos pueden
contener restos de alquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituidos
o sin sustituir, y pueden incluir uno o más heteroátomos. Los
derivados de aminoácido se pueden preparar por síntesis o bien se
pueden obtener de fuentes comerciales
(Calbiochem-Novablochem AG, Suiza; Bachem,
EE.UU.A.).
En la bibliografía también se describen diversas
metodologías para incorporar derivados de aminoácidos no naturales
en proteínas, usando sistemas de traducción tanto in vitro
como in vivo, para sondear y/o mejorar la estructura y la
función de las proteínas (Dougherty D.A., 2000). También son bien
conocidas en la técnica técnicas para la síntesis y desarrollo de
peptidomiméticos y de no peptidomiméticos (Sawyer, T.K., 1997;
Hruby, V.J. y Balse, P.M., 2000; Goleblowski, A., y otros,
2001).
La expresión "antagonista de quimiocina CC"
significa cualquier molécula que actúa como antagonista contra la
correspondiente quimiocina CC madura y/o de longitud completa,
presente en la naturaleza (de tipo natural).
El término "activo" significa que tales
compuestos alternativos deben mantener las propiedades antagonistas
de los mutantes de quimiocinas CC descritos en la presente
invención, y también deben ser farmacéuticamente aceptables y
útiles.
La presente memoria descriptiva de patente
describe también polipéptidos que comprenden antagonistas de
quimiocinas CC tal como se han definido más arriba, y una secuencia
aminoacídica que pertenece a una secuencia de proteína distinta de
la de la quimiocina CC correspondiente. Esta secuencia heteróloga
debe proporcionar propiedades adicionales sin afectar
considerablemente a la actividad antagonista. Son ejemplos de estas
propiedades adicionales un procedimiento de purificación más fácil,
una mayor duración de la vida media en fluidos corporales, un resto
de unión adicional, la maduración por medio de una digestión
endoproteolítica o la localización extracelular. Esta última
característica tiene una importancia particular para definir un
grupo específico de proteínas de fusión o quiméricas incluidas en
la anterior definición, ya que permite a las moléculas definidas
como antagonistas de quimiocina CC en esta memoria descriptiva de
patente estar localizadas en el espacio donde no sólo se facilita
el aislamiento y purificación de estos polipéptidos, sino también
donde las quimiocinas CC interaccionan naturalmente con receptores
y otras moléculas. En la bibliografía se describen ampliamente el
diseño de los restos, ligandos y enlazadores, así como métodos y
estrategias para la construcción, purificación, detección y uso de
proteínas de fusión (Nilsson, J., y otros, 1997; "Applications of
chimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol. vol.
326-328, Academic Press, 2000; documento WO
01/77137).
Las secuencias proteicas adicionales que se
pueden emplear para generar los antagonistas de la presente se
pueden elegir entre los dominios extracelulares de proteína unida a
membrana, regiones constantes de inmunoglobulina, dominios de
multimerización, proteínas extracelulares, proteínas que contienen
péptidos señalizadores, proteínas que contienen señales de
exportación. La elección de una o más de estas secuencias a fusionar
con los mutantes de quimiocina CC de la invención es funcional para
el uso específico y/o el método de preparación.
Los polipéptidos y los péptidos descritos en la
presente memoria descriptiva pueden proporcionados en otras formas
alternativas que pueden preferirse de acuerdo con el método deseado
de uso y/o producción, por ejemplo como fracciones activas,
precursores, sales, derivados, conjugados o complejos.
Los "precursores" son compuestos que pueden
ser convertidos en los compuestos descritos en la presente invención
mediante elaboración metabólica y enzimática antes o después de la
administración a las células o al organismo.
El término "sales" en la presente memoria
se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales por
adición de ácidos de grupos amino de los péptidos, polipéptidos o
análogos de los mismos, de la presente invención. Pueden formarse
sales de un grupo carboxilo por medios conocidos en la técnica, y
dichas sales incluyen sales inorgánicas, por ejemplo sales de
sodio, de calcio, de amonio, férricas o de cinc y similares, y sales
con bases orgánicas tales como las formadas, por ejemplo, con
aminas tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina,
procaína y similares. Las sales de adición de ácidos incluyen, por
ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido
clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales
como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto,
cualquiera de estas sales debe tener una actividad sustancialmente
similar a la de los péptidos y polipéptidos de la invención, o sus
análogos.
El término "derivados", tal como se usa en
la presente memoria, se refiere a derivados que se pueden preparar
a partir de los grupos funcionales presentes en las cadenas
laterales de los restos aminoacídicos o en los grupos N- ó
C-terminales de acuerdo con métodos conocidos. Estos
derivados incluyen, por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los
grupos carboxilo y N-acil derivados de grupos amino
libres u O-acil derivados de grupos hidroxilo
libres, y se forman con grupos acilo tales como, por ejemplo, grupos
alcanoílo o aroílo. Como alternativa, los derivados pueden contener
azúcares o grupos fosfato unidos a los grupos funcionales presentes
en las cadenas laterales de los restos de aminoácido. Estas
moléculas pueden ser el resultado de procesos in vivo o
in vitro que normalmente no alteran la secuencia primaria,
por ejemplo la derivatización química de péptidos (acetilación o
carboxilación), fosforilación (introducción de restos fosfotirosina,
fosfoserina o fosfotreonina) o glicosilación (por exposición del
péptido a enzimas que afectan a la glicosilación, por ejemplo
enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamífero).
Se pueden generar conjugados o complejos útiles
de los antagonistas de la presente invención empleando moléculas y
métodos conocidos en la técnica para mejorar la detección de la
interacción con otras proteínas (marcadores radiactivos o
fluorescentes, biotina), la eficacia terapéutica (agentes
citotóxicos, isótopos) o la eficacia en la administración del
fármaco, tales como polietilenglicol y otros polímeros naturales o
sintéticos (Pillai, O., y Panchagnula, R., 2001). En este último
caso, se pueden producir los antagonistas después de una
modificación dirigida de un resto apropiado, presente en la
secuencia natural o introducido por mutación de la secuencia
natural, en una posición interna o terminal. Ya se han descrito
modificaciones similares para quimiocinas (documentos WO 02/04499;
WO 02/04015; Vita, C., y otros, 2002).
Para la unión puede usarse cualquier resto,
siempre que tenga una cadena lateral susceptible de unión a un
polímero (es decir, la cadena lateral de un aminoácido que lleve un
grupo funcional, por ejemplo, lisina, ácido aspártico, ácido
glutámico, cisteína, histidina, etc.). Como alternativa, un resto en
estos sitios puede reemplazarse por un aminoácido diferente con una
cadena lateral susceptible de unión con un polímero. Además, las
cadenas laterales de los aminoácidos codificados genéticamente
pueden modificarse químicamente para la unión al polímero, o bien
se pueden emplear aminoácidos no naturales con grupos funcionales de
cadena lateral apropiados. La unión de un polímero puede ser no
sólo a la cadena lateral del aminoácido natural en una posición
específica del antagonista o a la cadena lateral de un aminoácido
natural o no natural que reemplaza al aminoácido natural en una
posición específica del antagonista, sino también a un carbohidrato
u otro resto que esté unido a la cadena lateral del aminoácido en
la posición diana.
Los polímeros adecuados para estos fines son
biocompatibles, en particular son no tóxicos para los sistemas
biológicos, y se conocen muchos de estos polímeros. Estos polímeros
pueden ser de naturaleza hidrófoba o hidrófila, biodegradables, no
biodegradables o una combinación de los mismos. Estos polímeros
incluyen polímeros naturales (tales como colágeno, gelatina,
celulosa, ácido hialurónico), así como polímeros sintéticos (por
ejemplo poliésteres, poliortoésteres y polianhídridos). Los
ejemplos de polímeros hidrófobos no degradables incluyen
polidimetilsiloxanos, poliuretanos, politetrafluoroetilenos,
polietilenos, poli(cloruros de vinilo) y
poli(metacrilatos de metilo). Los ejemplos de polímeros
hidrófilos no degradables incluyen poli(metacrilato de
2-hidroxietilo), poli(alcohol vinílico),
poli(N-vinilpirrolidona), polialquilenos,
poliacrilamida, y copolímeros de los mismos. Los polímeros
preferidos comprenden como unidad de repetición secuencial el óxido
de etileno, como ocurre por ejemplo en el polietilenglicol
(PEG).
El método preferido de unión emplea una
combinación de síntesis de péptidos y unión química. Ventajosamente,
la unión de un polímero soluble en agua se realizará a través de un
enlazador biodegradable, especialmente en la región
amino-terminal de una proteína. Esta modificación
actúa proporcionando la proteína en una forma de precursor (o
"profármaco") que, tras la degradación del enlazador, libera la
proteína sin modificación con polímero.
Los antagonistas de la invención se pueden
preparar por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica,
entre ellos tecnologías relacionadas con el ADN recombinante y
tecnologías de síntesis química.
Son otro objeto de la invención las moléculas de
ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los mutantes
de quimiocina CC de la invención.
La invención incluye también vectores de
expresión que comprenden los ADNs anteriores, células hospedantes
transformadas con dichos vectores, y un procedimiento de preparación
de tales mutantes de quimiocina CC de la invención, que comprende
cultivar dichas células transformadas en un medio de cultivo
apropiado, y cosechar las proteínas expresadas. Cuando el vector
expresa los antagonistas como una proteína de fusión con proteínas
extracelulares, que contienen señal de exportación, o que contienen
péptido señalizador, los antagonistas de quimiocina CC pueden ser
segregados al espacio extracelular, y pueden ser cosechados más
fácilmente extrayéndolos de las células cultivadas y purificados
también con mayor facilidad con vistas a la elaboración
ulterior.
La expresión de cualquiera de las proteínas
recombinantes de la invención que se mencionan en este documento
puede realizarse en células eucariotas (por ejemplo, levaduras,
células de insecto o de mamífero) o células procariotas, usando los
vectores de expresión apropiados. Puede emplearse cualquier método
conocido en la técnica.
En particular, se prefieren células de mamífero
tales como células humanas, de mono, de ratón y en particular de
ovario de hámster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones
postraduccionales a moléculas de proteína, entre ellas el
plegamiento correcto o la glicosilación en sitios correctos. También
las células de levadura pueden realizar modificaciones de péptidos
después de la traducción, incluyendo la glicosilación. Existen
varias estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias
promotoras fuertes y altos números de copias de plásmidos que
pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en
levaduras. La levadura reconoce secuencias guía en productos
génicos de mamífero clonados y segrega péptidos que llevan
secuencias guía (es decir, pre-péptidos). Como
alternativa, se puede emplear cualquiera de los protocolos
específicos para la expresión de quimiocinas en células bacterianas
descritos en la bibliografía (Edgerton, M.D., y otros, 2000).
Los factores de importancia en la selección de
un vector plasmídico o vírico particular incluyen: la facilidad con
la que pueden reconocerse y seleccionarse células receptoras que
contienen el vector frente a las células receptoras que no
contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en
un hospedante particular; y si es deseable poder hacer que el
vector "vaya y venga" entre células hospedantes de diferentes
especies.
Los vectores deben permitir la expresión de la
proteína aislada o de fusión, y también del antagonista de la
invención en la célula procariota o eucariota bajo el control de
secuencias reguladoras del inicio/terminación de la transcripción,
que se eligen de manera que sean constitutivamente activas o
inducibles en dicha célula. Después de la introducción del vector o
vectores, las células hospedantes crecen en un medio de selección
que selecciona el crecimiento de células que contienen el vector. La
expresión de la secuencia o secuencias génicas clonadas da como
resultado la producción de las proteínas deseadas. Después puede
aislarse una línea celular sustancialmente enriquecida en dichas
células para proporcionar una línea celular estable.
En el caso de hospedantes eucariotas (por
ejemplo, levaduras, células de insecto o células de mamífero),
pueden emplearse diferentes secuencias reguladoras de la
transcripción y de la traducción, dependiendo de la naturaleza del
hospedante. Pueden obtenerse a partir de fuentes víricas tales como
adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio o similares,
donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular
que tiene un alto nivel de expresión. Son ejemplos el promotor de
TK del virus del herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor
del gen gal4 de levadura, etc. Pueden seleccionarse señales
reguladoras del inicio de la transcripción que permitan la
represión y activación, de manera que pueda modularse la expresión
de los genes. Las células que se han transformado de manera estable
por el ADN introducido pueden seleccionarse introduciendo también
uno o más marcadores que permiten la selección de células
hospedantes que contienen el vector de expresión. El marcador
también puede proporcionar fototrofia a un hospedante auxótrofo,
resistencia a biocidas, por ejemplo antibióticos, a metales pesados
tales como cobre o similares. El gen marcador seleccionable puede
unirse directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o
bien puede introducirse en la misma célula por cotransfección.
Estos objetos de la invención se pueden
conseguir combinando la descripción proporcionada en la presente
memoria descriptiva de patente sobre antagonistas de quimiocinas
CC, con el conocimiento de técnicas comunes de biología molecular.
Muchos libros y revisiones proporcionan enseñanzas sobre cómo clonar
y producir proteínas recombinantes usando vectores y células
hospedantes procariotas y eucariotas, tales como algunos títulos de
la serie "A Practical Approach" publicada por Oxford
University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995;
"DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein
Expression", 1999; "Protein Purificación Techniques",
2001).
Los mutantes de quimiocinas CC descritos en la
invención se pueden preparar por cualquier otro procedimiento bien
conocido en la técnica, en particular por los procedimientos de
síntesis química bien establecidos, que se pueden aplicar de manera
eficaz sobre esa molécula dada su corta longitud. En la bibliografía
se describen quimiocinas CC completamente sintéticas, que también
contienen grupos químicos adicionales (Brown, A., y otros, 1996;
Vita, C., y otros, 2002).
Son ejemplos de tecnologías de síntesis química
la síntesis en fase sólida y la síntesis en fase líquida. Como
síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente
al extremo carboxi del péptido a sintetizar se une a un soporte que
es insoluble en disolventes orgánicos, y por repetición alterna de
reacciones, una en el cual se condensan de uno en uno aminoácidos
con sus grupos amino y grupos funcionales de cadena lateral
protegidos con grupos protectores apropiados, en orden desde el
extremo carboxi hacia el extremo amino, y otra en la cual se
liberan los aminoácidos unidos a la resina o el grupo protector de
los grupos amino de los péptidos, extendiéndose así de esta manera
la cadena peptídica. Los métodos de síntesis en fase sólida se
clasifican principalmente en los que emplean el método tBoc y en los
que emplean el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector
usado. Los grupos protectores usados típicamente incluyen tBoc
(t-butoxicarbonilo), Cl-Z
(2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z
(2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc
(9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh
(4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr
(4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo),
Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y
CI2-Bzl (2,6-diclorobencilo) para
los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc
(2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo)
para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para
los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado,
se somete a una reacción de desprotección y se corta del soporte
sólido. Esta reacción de corte de péptidos puede realizarse con
fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el
método Boc, y con TFA para el método Fmoc. Por último, los péptidos
de longitud completa intactos se purifican y se pliegan
químicamente o enzimáticamente (incluyendo la formación de puentes
disulfuro entre cisteínas) para dar los correspondientes mutantes
de quimiocina CC de la invención.
La purificación de las proteínas naturales,
sintéticas o recombinantes se realiza por cualquiera de los métodos
conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento
convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía,
electroforesis o similar. Otro procedimiento de purificación
adicional que puede usarse con preferencia para purificar la
proteína de la invención es la cromatografía de afinidad con empleo
de anticuerpos monoclonales, heparina o cualquier otro ligando
adecuado que pueda unirse a la proteína diana con alta eficacia y
que pueda ser inmovilizado sobre una matriz de gel contenida dentro
de una columna. Las preparaciones impuras que contienen las
proteínas se pasan a través de la columna. La proteína se unirá a la
columna por medio de este ligando mientras que las impurezas
pasarán a través de la misma. Después del lavado, la proteína se
eluye del gel por un cambio en el pH o en la fuerza iónica. Como
alternativa, se puede emplear también HPLC (cromatografía líquida
de alta resolución).
La presente invención incluye también
preparaciones purificadas de los mutantes de quimiocina CC antes
descritos. La expresión "preparaciones purificadas", tal como
se emplea en este documento, se refiere a las preparaciones que
contienen al menos 1% sobre el peso seco, preferiblemente al menos
5%, de los mutantes de quimiocina CC de la invención.
Otro objeto de la presente invención es el
empleo de los mutantes de quimiocina CC tal como se han descrito
más arriba, como medicamentos, en particular como ingredientes
activos en composiciones farmacéuticas (y formulados en combinación
con vehículos, excipientes, estabilizantes, adyuvantes, o diluyentes
farmacéuticamente aceptables). Es aún otro objeto el empleo de los
mutantes de quimiocina CC de la invención para producir una
composición farmacéutica destinada a tratar o prevenir trastornos
en los cuales las propiedades antagonistas de dichas moléculas
puedan proporcionar efectos benéficos, tales como, según la
bibliografía sobre quimiocinas, enfermedades autoinmunitarias e
inflamatorias, cánceres, e infecciones bacterianas y víricas. Una
lista no limitante de trastornos específicos incluye la artritis,
artritis reumatoide (siglas inglesas RA), artritis psoriásica,
osteoartritis, lupus sistémico eritematoso (SLE), esclerosis
sistémica, escleroderma, polimiositis, glomerulonefritis, melanoma,
carcinoma, leucemia, linfoblastoma, fibrosis hepática, fibrosis
cutánea, fibrosis pulmonar, afecciones alérgicas o de
hipersensibilidad, dermatitis, hipersensibilidad de tipo IV,
denominada también hipersensibilidad de tipo retardado o DTH, asma,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (siglas inglesas COPD),
enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), enfermedad de Crohn,
colitis ulcerante, esclerosis múltiple, choque séptico, infección
por HIV, transplante, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD),
aterosclerosis.
Por tanto, es otro objeto de la presente memoria
descriptiva, el método para tratar o prevenir cualquiera de las
enfermedades antes mencionadas administrando una cantidad eficaz de
los mutantes de quimiocina de la invención junto con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Una "cantidad eficaz" hace referencia a una
cantidad de ingrediente activo que es suficiente para alterar el
curso y la gravedad de la enfermedad, conduciendo a la reducción o
remisión de dichas patologías. La cantidad eficaz dependerá de la
vía de administración y el estado del paciente.
Son otro objeto de la presente invención las
composiciones farmacéuticas que contienen los mutantes de quimiocina
de la invención, en presencia de uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables, para tratar o prevenir cualquiera de
las enfermedades antes mencionadas. Las composiciones farmacéuticas
pueden formularse de una manera aceptable para satisfacer las
necesidades del modo de administración. Por ejemplo, en la
bibliografía se describe el uso de biomateriales y otros polímeros
para la administración de fármacos, así como las diferentes
técnicas y modelos para validar un modo de administración específico
(Luo, B. y Prestwich, G.D., 2001; Cleland J.L., y otros,
2001).
2001).
La definición de "farmacéuticamente
aceptable" significa que incluye cualquier vehículo que no
interfiera con la eficacia de la actividad biológica del
ingrediente activo y que no sea tóxico para el hospedante al cual
se administra. Los vehículos se pueden seleccionar también de entre
almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina,
malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato magnésico,
estearato sódico, monoestearato de glicerol, cloruro sódico, leche
desnatada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y
diversos aceites, entre ellos aceites procedentes del petróleo, de
origen animal, vegetal o sintético (aceite de cacahuete, aceite de
soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí). Por ejemplo, para la
administración por vía parenteral, los anteriores ingredientes
activos se pueden formular en formas de dosificación unitaria para
la inyección, en el seno de vehículos tales como solución salina,
solución de dextrosa, seroalbúmina y solución de Ringer.
Además del vehículo farmacéuticamente aceptable,
las composiciones de la invención pueden comprender también
cantidades menores de aditivos, tales como estabilizantes,
excipientes, tampones y conservantes, que pueden facilitar la
elaboración de los compuestos activos para proporcionar
preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente.
La administración de dichos ingredientes activos
se puede realizar por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.
La presente invención contempla otras vías de administración que
pueden establecer los niveles sanguíneos deseados de los
ingredientes respectivos. Por ejemplo, la administración puede
realizarse por diversas vías parenterales tales como la vía
subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular,
intraperitoneal, intranasal, transdérmica, oral o bucal. Las
composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden
administrar también en formas de dosificación de liberación
sostenida o controlada, entre ellas inyecciones de depósito, bombas
osmóticas, y preparaciones similares, para administrar de manera
prolongada el polipéptido a un ritmo predeterminado,
preferiblemente en formas de dosificación unitarias adecuadas para
la administración única de dosis exactas.
La administración parenteral se puede realizar
por inyección en embolada o por una perfusión gradual a lo largo
del tiempo. Las preparaciones para administración parenteral
incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no
acuosas, estériles, que pueden contener agentes auxiliares o
excipientes conocidos en la técnica, y se pueden preparar de
acuerdo con métodos rutinarios. Además, se pueden administrar
suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones
para inyección oleosas apropiadas. Los vehículos o disolventes
lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de
ajonjolí, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo,
oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para
inyección que pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad
de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica,
sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede
contener estabilizantes. Las composiciones farmacéuticas incluyen
soluciones adecuadas para la administración por inyección y
contienen de aproximadamente 0,01 a 99,99 por ciento, con
preferencia de aproximadamente 20 a 75 por ciento de compuesto
activo junto con el excipiente.
La dosis óptima de ingrediente activo se puede
seleccionar adecuadamente con arreglo a la vía de administración,
las condiciones del paciente y sus características (sexo, edad, peso
corporal, salud, corpulencia), gravedad de los síntomas,
tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento y el efecto
deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de
dosificación establecidos se encuentran entre las capacidades de los
especialistas en la técnica.
Normalmente, una dosificación diaria de
ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,01 a 100
miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente, de 1 a 40
miligramos por kilogramo al día en dosis divididas o en forma de
liberación sostenida son eficaces para obtener los resultados
deseados. Las segundas administraciones o las administraciones
posteriores pueden realizarse con una dosificación que sea igual,
menor o mayor que la dosis inicial o anterior administrada al
individuo.
A continuación se describirá la invención por
medio de los siguientes Ejemplos, que no deben interpretarse como
limitantes en modo alguno de la presente invención. Los Ejemplos
harán referencia a las Figuras especificadas a continuación.
Se expresó RANTES humano en E. coli en
cuatro formas mutadas en la posición 32, o bien con Gly o bien con
Ser en un subconjunto de quimiocinas CC que tienen, o bien Ser o
bien Thr, en las dos posiciones inmediatamente precedentes (véanse
las Figuras 1 y 10).
Los mutantes RANTES se expresaron como variantes
de RANTES maduros que contenían una secuencia guía heteróloga que
comenzaba con Met (MKKKWPR), que se elimina después de este
precursor (proteína secRANTES G32N; SEC ID Nº: 9; Figura 1) por
medio de una enzima proteolítica para obtener la proteína madura
(RANTES G32N; SEC ID Nº: 1). La posición mutada se indica como 32
ya que se refiere a la proteína madura.
El ADN que codifica el mutante (ADN de secRANTES
G32N; SEC ID Nº: 8; Figura 1) se generó por mutagénesis PCR de
RANTES humano realizando una mutagénesis basada en PCR de dos
etapas, empleando dos pares de oligonucleótidos que hibridan una
secuencia de RANTES humano fusionada a la misma secuencia guía y
clonada en el vector de expresión pET24d (Novagen).
La porción 5'-terminal de ADN de
secRANTES G32N se generó utilizando, como cebador hacia adelante, un
cebador que incluía la secuencia guía y la secuencia 5' del RANTES
humano maduro (cebador P1; SEC ID Nº: 10) y, como cebador inverso,
un cebador mutágeno para sustituir un codón Gly con un codón Asn al
cambiar dos nucleótidos (cebador P2; SEC ID Nº: 11). La porción
3'-terminal del ADN de secRANTES G32N se generó
utilizando, como cebador hacia adelante, un cebador mutágeno para
sustituir un codón Gly con un codón Asn al cambiar dos nucleótidos
(cebador P3; SEC ID Nº: 12) y, como cebador inverso, un cebador que
contenía el extremo 3' de RANTES humano y una secuencia utilizada
posteriormente en el paso de clonación (cebador P4; SEC ID Nº:
13).
Se purificaron los productos resultantes de 138
y 139 pares de bases, que se hibridan al nivel de la región mutada
común de RANTES, y se mezclaron en proporción 1:1. Se diluyó 100
veces la disolución antes de realizar una segunda reacción PCR
utilizando los cebadores terminales originales (cebadores P1 y P4).
Se purificó el producto PCR de 244 pares de bases predicho, y se
digirió con endonucleasas de restricción BspHI y XhoI, se clonó en
pET24d entre sitios NcoI y XhoI, y se transformó en células de E.
coli TG1-competentes. El análisis de la
secuencia de ADN del vector resultante reveló el sitio de mutación
esperado (Figura 1).
Se utilizó la misma estrategia para generar
vectores para expresión de los mutantes alternativos en la misma
posición RANTES G32P (SEQ ID NO: 2), RANTES G32D (SEQ ID NO: 3), y
RANTES G32K (SEQ ID NO: 4).
Los plásmidos basados en pET24d que codifican
RANTES y los mutantes en posición 32 fueron transferidos a células
E. coli competentes BL21 (DE3) pLysS, en donde se indujo la
expresión de proteína por la adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 1 mM al cultivo. Se cosecharon las células 3,5 horas después
de la inducción y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris/HCl 50
mM pH 8, MgCl_{2} 10 mM, benzamidina/HCl 5 mM, DTT 1 mM, fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, DNasa 20 mg/L). Se
desintegraron las células mediante tres pasadas a través de una
unidad French Pressure Cell. Después se centrifugó la suspensión a
10,000x g durante 30 minutos a 4ºC. El pellet de cuerpos de
inclusión que contenía RANTES o la muteína se solubilizó en Tris/HCl
0,1 M, pH 8,0, que contenía guanidina/HCl 6M y DTT 1 mM, y se agitó
durante 30 minutos a 60ºC. Se dializó la disolución frente a 3
cambios de ácido acético al 1%. El material insoluble se eliminó
por centrifugación a 10,000x g durante 30 minutos. Se liofilizó el
sobrenadante que contenía la proteína recombinante.
Se disolvió el polvo liofilizado en Tris/HCl 0,1
M, pH 8,0, que contenía guanidina/HCl 6M y DTT 1 mM, para obtener
una concentración de aproximadamente 1 mg/ml. Las proteínas se
renaturalizaron por dilución gota a gota con Tris/HCl 20 mM, pH
8,0, que contenía glutatión oxidado 0,01 mM y glutatión reducido 0,1
mM, hasta un volumen 10 veces el de la disolución de guanidina. Se
agitó la disolución durante una noche a 4ºC. El material insoluble
se eliminó por centrifugación a 10,000x g durante 30 minutos. Se
ajustó el pH a 4,5 con ácido acético, y se ajustó la conductividad
a 20 mS por dilución con H_{2}O. Se aplicó la disolución a una
columna HiLoad S 26/10 previamente equilibrada en acetato sódico 20
mM, pH 4,5, y se eluyó la proteína con un gradiente lineal
0-2M de NaCl en el mismo tampón. Se combinaron las
fracciones que contenían las proteínas recombinantes, se dializaron
frente a 3 cambios de ácido acético, y se liofilizaron.
Se disolvieron las proteínas liofilizadas en
tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,0. La secuencia guía MKKKWPR se escindió
de RANTES o del mutante de RANTES por incubación con tripsina
(1:10,000, enzima: sustrato, w/w) durante 3 horas a 37ºC. Las
proteínas escindidas fueron separadas de la proteína sin escindir
mediante cromatografía de intercambio catiónico en una columna
HiLoad SP 26/10 previamente equilibrada en acetato sódico 20 mM, pH
4,5, que contenía urea 6 M, y se eluyeron las proteínas con un
gradiente lineal 0-2M de NaCl en el mismo tampón.
Se combinaron las fracciones escindidas y se dializaron frente a dos
cambios de ácido acético al 1%, y después frente a ácido
trifluoroacético al 0,1%, y por último se liofilizaron antes del uso
posterior.
La identidad de todas las proteínas así
expresadas se verificó mediante espectrometría de masas, y la pureza
mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Las
proteínas recombinantes purificadas se analizaron mediante
espectrometría de masas para elucidar la estructura correcta. RANTES
tenía una masa de 7846,69 Da, frente a la masa esperada de 7947,04
Da para la proteína oxidada. RANTES G32N tenía una masa de 7904,08
Da, frente a la masa esperada de 7903,54 Da para la proteína
oxidada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos se llevaron a cabo sobre membranas
procedentes de transfectantes CHO que expresaban CCR1 y CCR5,
empleando un ensayo de centelleo por proximidad (siglas inglesas
SPA) que utilizaba
[^{125}I]-MIP-1\alpha como
trazador. Se prepararon competidores mediante diluciones en serie de
las quimiocinas sin marcar en tampón de fijación, para cubrir el
intervalo de 10^{-6} a 10^{-12} M. El tampón de fijación
utilizado fue HEPES 50 mM, pH 7,2, que contenía CaCl_{2} 1 mM,
MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 M y seroalbúmina de bovino al 0,5%. Se
solubilizaron perlas de germen de trigo SPA (Amersham) en PBS a una
concentración 50 mg/ml, y se diluyeron en el tampón de fijación a
una concentración 10 mg/ml, siendo la concentración final en el
ensayo 0,25 mg/pocillo. Las membranas que expresaban CCR1 o CCR5 se
conservaron a -80ºC y se diluyeron en el tampón de fijación hasta
una concentración de 80 \mug/ml. Para reducir el nivel de fondo se
mezclaron volúmenes iguales de disoluciones madre de membranas y de
perlas antes de llevar a cabo la determinación. La concentración
final de membranas era 2 \mug/ml y la de [^{125}I]-
MIP-1\alpha era 0,1 nM. Se incubaron las placas a
temperatura ambiente, con agitación, durante 4 horas. Se contó la
radiactividad (1 minuto por pocillo) en un contador beta. Los datos
de muestras triplicadas fueron analizados mediante el programa
informático Prism® (GraphPad).
Todos los mutantes de RANTES en la posición 32
conservaron una alta afinidad hacia los dos receptores de RANTES,
CCR1 y CCR5. Eran capaces de competir con
[^{125}I]-MIP-1\alpha por la
fijación a CCR1 (Figura 2a) y CCR5 (Figura 2b) aún en el rango
nanomolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron monocitos de la capa leucocitaria
empleando el siguiente procedimiento de aislamiento. Se diluyó una
disolución de capa leucocitaria (100 ml) con 100 ml de PBS, se
extendió en una capa sobre Ficoll y se centrifugó a 600x g durante
20 minutos a temperatura ambiente. Se cosecharon las células que
formaban la interfase, y se lavaron dos veces con PBS. Se
enriquecieron los monocitos mediante selección negativa por
depleción de células T, células NK, células B, células dendríticas
y basófilos, utilizando el conjunto en "kit" para aislamiento
de células MACS (Miltenyi Biotech).
Se resuspendieron los monocitos a una
concentración de 1,5 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640, sin Rojo
fenol. La pureza se midió mediante dispersión frontal y lateral
mediante análisis FACS. Se dispusieron diluciones de quimiocina (30
\mul), que cubrían el intervalo de
10^{-6}-10^{-12} M en medio RPMI (sin Rojo
fenol), en los pocillos inferiores de una cámara de quimiotaxis de
96 pocillos (Neuroprobe). Se colocó la unidad filtrante (tamaño de
poro 3 \mum) sobre los pocillos inferiores asegurándose de no
dejar burbujas de aire. Se dispuso la suspensión de células (20
\mul a razón de 1,5 x 10^{6} células/ml en medio RPMI) en los
pocillos superiores. Se incubó la cámara durante 2 horas a 37ºC
bajo O_{2}. Se lavó la superficie superior del filtro con 10 ml
de PBS, y después se retiró el filtro. Se transfirieron las células
migradas de las cámaras inferiores a una segunda placa de 96
pocillos, de color negro, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante, y se congeló a -80ºC. Después se dejó que la placa
alcanzase la temperatura ambiente, y se contó el número de células
empleando el "kit" de ensayo de proliferación celular CyQUANT
(Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante. Se midió
la fluorescencia por excitación a 480 nm, y emisión a 520 nm, y los
datos fueron analizados mediante el programa informático Prism®
(GraphPad).
Los resultados obtenidos en los ensayos de
quimiotaxia de monocitos concuerdan con el hecho de que el mutante
conserva elevada afinidad de fijación a receptor. RANTES G32N fue
capaz de inducir quimiotaxia de monocitos con actividades
comparables a RANTES (Figura 3). En un ensayo de fijación a heparina
se hanb obtenido también otras pruebas de la similitud de las
propiedades in vitro de lo mutantes de RANTES.
\newpage
Se sensibilizaron el día 0 ratones Balb/C
hembras de 8 a 12 semanas de edad. Todos los ratones recibieron 5
inyecciones subcutáneas (4 x 50 \mul en cada pata y 1 x 100
\mul en la nuca) de CpG-ODN (Microsynth) 10 nM
mezclada con 100 \mug de ovoalbúmina (Sigma, Grado V) en pBS
estéril.
Al cabo de una semana se indujo el reclutamiento
celular en los ratones Balb/C mediante la inyección intraperitoneal
de 10 \mug (0,5 mg/Kg) de RANTES o mutante RANTES G32N diluidos en
0,2 ml de disolución salina (al 0,9%) exenta de lipopolisacáridos y
estéril. Cuando se ensayaron las propiedades agonistas del mutante
RANTES G32N, se administraron las cantidades indicadas de la
proteína, diluidas en 0,2 ml de la misma disolución estéril, 30
minutos antes de la administración del agonista (RANTES).
16 horas después se sacrificaron los ratones
mediante un aerosol de CO_{2}, y se llevó a cabo un lavado
peritoneal con 5 ml de PBS tres veces. Se combinaron los lavados y
se centrifugaron a 1500x g durante 5 minutos, y se resuspendieron
las células peletizadas en un volumen final de 1 mililitro. Con un
hematocitómetro se contó el número total de leucocitos detectados
en cada muestra.
El mutante RANTES G32N no fue capaz de inducir
el reclutamiento celular en el peritoneo a la dosis (10
\mug/ratón) a la cual RANTES produce un reclutamiento sustancial
(Figura 4). por otra parte, cuando se administra el mutante 30
minutos antes de la administración de RANTES, el reclutamiento
celular de inducido por RANTES es inhibido de manera dependiente de
la dosis por RANTES G32N, con una eficacia estadísticamente
significativa similar a la del antagonista de RANTES conocido
Met-RANTES (Figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones sensibilizados con ovoalbúmina,
cuando son tratados intra-nasalmente con
ovoalbúmina, desarrollan síntomas que se parecen a los del asma
humano. La respuesta inflamatoria está asociada con una gran
infiltración de leucocitos en los pulmones, y ésta se puede medir
mediante lavados broncoalveolares.
Se inyectó intraperitonealmente (i.p.) a ratones
Balb/c hembras con una edad entre 8 y 12 semanas (n=6 por grupo),
10 \mug de ovoalbúmina (Sigma A-5503) más 2% de
AlOH_{3} en 200 \mul de NaCl. El grupo testigo recibió una
inyección de sólo disolución salina.
En los días 15 a 19, ambos inclusive, se inyectó
por vía i.p. a los ratones 10 \mug de RANTES G32N o bien 1 \mug
de Met-RANTES en 200 \mul de disolución salina
estéril como testigo positivo, o bien 200 \mul de disolución
salina (NaCl) como testigo negativo, 30 minutos antes de la
administración intranasal de 15 \mug de ovoalbúmina en 50 \mul
de disolución salina, bajo anestesia por inhalación. Se sacrificaron
los ratones el día 22 mediante una sobredosis de uretano por vía
i.p., y se lavaron los pulmones con 4 x 0,4 ml
PBS-EDTA enfriado con hielo. Las células totales
recuperadas de cada animal se contaron manualmente con un
hemocitómetro.
RANTES G32N (10 \mug/ratón) fue capaz de
inhibir el reclutamiento celular en 48%, frente al 52% observado
con 1 \mug/ratón de Met-RANTES, el control
positivo para el tratamiento (Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Las respuestas de hipersensibilidad por contacto
(siglas inglesas CHS) son inflamaciones cutáneas específicas
respecto al hapteno, en las que intervienen las células T. La
mayoría de los haptenos da lugar a una respuesta de células T
oligoclonales que consisten principalmente en células T de efector
CD8^{+}, mientras que las células T CD4^{+} tienen un papel
desregulador en la respuesta CHS.
El ensayo de hinchazón de la oreja en ratones
para medir la hipersensibilidad por contacto se llevó a cabo de la
manera descrita (Garrigue, J.L., y otros, 1994). En pocas palabras,
se pre-sensibilizaron tópicamente los ratones
aplicando 25 \mul de disolución de
2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB; Sigma Chemical Co.)
al 0,5% en acetona/aceite de oliva (4:1) al abdomen rasurado. Cinco
días después se aplicaron 20 \mul de DNFB al 0,2% en el mismo
vehículo a la oreja derecha, y sólo vehículo en la oreja izquierda,
a fin de inducir una quimiotaxia de células que indujese a su vez
el hinchamiento de la oreja.
Los tratamientos se iniciaron en la fecha de la
exposición, y se administraron cada día en forma de una inyección
intraperitoneal. El incremento de la hinchazón de la oreja se
calculó como el cambio en el tamaño de la oreja izquierda en
comparación con la oreja derecha del mismo ratón en los días 5 a 12
después de la sensibilización. Se trató a los ratones diariamente
desde el día 5 al 9 con la administración intraperitoneal de RANTES
G32N 0,5 mg/kg, o bien 12,5 mg/kg de proteína de fijación
IL-18. El primer tratamiento se administró una hora
antes de la exposición a DNFB. Se midió el grosor de la oreja con
un calibre de espesores con disco de lectura (Mitutoyo Corp.), y se
estimó la hinchazón de la oreja restando el valor anterior a la
exposición del valor posterior a la exposición, y restando además
cualquier valor de hinchazón detectado en la oreja del lado
contrario, expuesta sólo a vehículo.
La exposición a DNFB en el día 5 indujo una
hinchazón auricular significativa en los dos grupos de tratamiento,
en comparación con el grupo testigo (Figura 7), que volvió a un
estado casi normal en el día 9. En este modelo murino de
hipersensibilidad por contacto/dermatitis de contacto, ya
acreditado, un tratamiento de tres días con un mutante de
quimiocina CC de la invención tuvo un efecto significativo sobre el
grado de hinchazón o inflamación desencadenado por el tratamiento
con un hapteno.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la estructura cristalográfica de
RANTES G32N, se disolvió la proteína recombinante a una
concentración de 10 mg/ml en agua, y se ajustó el pH a 3,5 mediante
la adición tampón de acetato 50 mM, pH 3,5. Se hicieron crecer los
cristales por el método de difusión de vapor de gota colgante en el
cual se mezclaron 5 \mul de la disolución de proteína con 5
\mul de la solución de reserva, y se equilibraron frente a 1 ml de
disolución de reserva. Esta disolución estaba compuesta por
15-20% (v/v) de polietilenglicol (PEG) 400, tampón
de acetato 100 mM, pH 4,5, y glicerol al 10% (v/v). Se sumergieron
los cristales en una disolución crioprotectora compuesta por PEG
400 al 25% (v/v), tampón de acetato 100 mM, pH 4,5, y glicerol al
10% (v/v), y se congelaron directamente en una corriente de
nitrógeno a -190ºC. Los datos cristalográficos se obtuvieron a
-190ºC en un detector de rayos X MAR345 combinado con un generador
de ánodo giratorio Siemens XG-12, y se procesaron
dichos datos con los programas informáticos DENZO y SCALEPACK.
La proteína cristalizó en el mismo grupo
espacial que RANTES de tipo natural, y con dimensiones de celda
unitaria similares. El examen del mapa de densidad electrónica
fo-fc reveló la presencia de densidad electrónica
nueva en la Gly32, confirmando la mutación a Asn (Figura 8).
El análisis de la estructura de RANTES G32N y la
comparación con la secuencia y la estructura de otras quimiocinas
CC conocidas (Figuras 1 y 9) sugieren que el resto sustituido puede
desempeñar un papel general en la actividad biológica de
quimiocinas CC. Esta posición específica 32, junto con Thr30 y Ser31
y los restos Cys vecinos conservados, definen una secuencia de
consenso común a un subconjunto de quimiocinas CC para las cuales se
puede inferir que una sustitución no conservadora similar puede
conducir a un mutante con propiedades antagonistas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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17-12-2001
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<170> PatentIn versión 3.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 69
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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<220>
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<221> mat_péptido
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<222> (24) .. ( )
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<400> 5
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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<220>
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<221> mat_péptido
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<222> (24) .. ( )
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<210> 7
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 225
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<210> 9
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<211> 75
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<212> PRT
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<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> constructo sintético
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipatcgtcatga aaaaaaaatg gccgcgttcc ccatattcct cggacacc
\hfill48
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<210> 11
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> constructo sintético
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskiptgggttggag cacttgttac tggtgtagaa ata
\hfill33
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<210> 12
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> constructo sintético
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\hskip-.1em\dddseqskiptatttctaca ccagtaacaa gtgctccaac cca
\hfill33
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<210> 13
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Claims (16)
1. Un mutante de una quimiocina CC seleccionado
de entre CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13 y CCL15
que contiene la siguiente secuencia de consenso:
C-C-(X)_{18-19}-(X_{a})_{2}-X_{b}X-C
en donde, en la secuencia de
consenso no
mutada:
C representa Cisteína;
X representa cualquier aminoácido;
X_{a} representa Serina o Treonina;
X_{b} representa Glicina o Serina;
y en donde dicho
mutante:
- a)
- contiene en la posición X_{b} una sustitución con Prolina, Lisina, Arginina, Histidina, Ácido aspártico, Ácido glutámico, Glutamina o Aspargina; y
- b)
- actúa como un antagonista de la correspondiente quimiocina CC.
2. El mutante según la reivindicación 1, que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3 ó
4.
3. Un mutante activo de un antagonista según
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2, que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6, ó 7.
4. Un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 y una
secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia de proteína
distinta de la quimiocina CC correspondiente.
5. El polipéptido según la reivindicación 4, en
donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos que
pertenece a una o más de estas secuencias de proteína: dominio
extracelular de proteína fijada a membrana, regiones constantes de
inmunoglobulina, dominios de multimerización, proteínas
extracelulares, proteínas que contienen péptidos señalizadores,
proteínas que contienen señal de exportación.
6. Sales, conjugados o complejos de mutantes de
quimiocina CC según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a
5.
7. Los mutantes según la reivindicación 6, en
donde dicho antagonista se encuentra en forma de conjugado o
complejo activo con una molécula seleccionada de entre marcas
radiactivas, biotina, marcas fluorescentes, agentes citotóxicos, o
agentes para el suministro de fármacos.
8. Molécula de ADN que comprende la secuencia de
ADN que codifica los mutantes de quimiocina CC según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5.
9. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ADN según la reivindicación 8.
10. Una célula hospedante que comprende una
molécula de ADN según la reivindicación 8 o el vector de expresión
según la reivindicación 9.
11. Un procedimiento recombinante para preparar
los mutantes según las reivindicaciones 1 a 5, que comprende
cultivar las células según la reivindicación 10 en un medio de
cultivo apropiado, y cosechar las proteínas expresadas.
12. Preparaciones purificadas de los mutantes de
quimiocina CC según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 que
contienen al menos 1% de dichos mutantes sobre el peso seco.
13. Un mutante de quimiocina CC según cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 7 para uso como un medicamento.
14. Uso de los mutantes de quimiocina CC según
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 en la preparación de
una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades
autoinmunológicas e inflamatorias, cáncer, o infecciones
bacterianas y víricas.
15. Composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades autoinmunológicas e inflamatorias, cáncer, o
infecciones bacterianas y víricas, que comprende como ingrediente
activo el mutante de quimiocina CC tal como se ha definido en
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 junto con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
16. Procedimiento para preparar composiciones
farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas
e inflamatorias, cáncer, o infecciones bacterianas y víricas, que
comprende combinar un antagonista de una quimiocina CC según
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
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