PL204231B1 - Zastosowanie mutanta chemokiny CC, kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego, skrócona i zmutowana ludzka RANTES i sposób jej wytwarzania, cząsteczka DNA i zawierający ją wektor ekspresyjny oraz komórka gospodarza - Google Patents

Zastosowanie mutanta chemokiny CC, kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego, skrócona i zmutowana ludzka RANTES i sposób jej wytwarzania, cząsteczka DNA i zawierający ją wektor ekspresyjny oraz komórka gospodarza

Info

Publication number
PL204231B1
PL204231B1 PL362350A PL36235001A PL204231B1 PL 204231 B1 PL204231 B1 PL 204231B1 PL 362350 A PL362350 A PL 362350A PL 36235001 A PL36235001 A PL 36235001A PL 204231 B1 PL204231 B1 PL 204231B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
cheese
rantes
mutant
pro
Prior art date
Application number
PL362350A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362350A1 (pl
Inventor
Amanda Proudfoot
Timothy N.C. Wells
Marie Kosko-Vilbois
Original Assignee
Serono Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Serono Lab filed Critical Serono Lab
Publication of PL362350A1 publication Critical patent/PL362350A1/pl
Publication of PL204231B1 publication Critical patent/PL204231B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutanta chemokiny CC, kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego, skrócona i zmutowana ludzka RANTES i sposób jej wytwarzania, cząsteczka DNA i zawierający ją wektor ekspresyjny oraz komórka gospodarza. Niniejszy wynalazek dotyczy w ogólności mutantów chemokin CC, które zawierają przynajmniej dwie mutacje w pętli 40-tych (ang. 40's loop) i które w odniesieniu do cząsteczki typu dzikiego mają obniżoną aktywność wiązania GAG. Stwierdzono, że takie zmutowane chemokiny są skuteczne w leczeniu stwardnienia rozsianego (MS) oraz innych chorób demielinizacyjnych.
Chemokiny tworzą rodzinę małych cytokin pro-zapalnych o właściwościach chemotaktycznych i aktywuj ą cych wobec leukocytów. W zależ noś ci od poł o ż enia pierwszych konserwatywnych cystein, rodzina chemokin może być podzielona na chemokiny C-C, C-X-C i C-X3-C (Baggiolini M. i wsp., Adv. Immunol. 1994, 55: 97-179; Baggiolini M. i wsp., Annu. Rev. Immunol. 1997, 15: 675-705; Taub D. i wsp., Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7 (4) : 355-76).
Wiele cytokin C-X-C, takich jak interleukina 8 (IL-8), wykazuje właściwości chemotaktyczne wobec neutrofili, natomiast chemokiny C-C są aktywne wobec różnych leukocytów, w tym również monocytów, limfocytów, eozynofili, bazofili, i komórek NK i komórek dendrytycznych.
NH2-końcowa domena chemokin jest zaangażowana w wiązanie receptora i obróbka końca NH2 możne albo aktywować chemokiny albo doprowadzić do całkowitej utraty ich aktywności.
N-końcowe warianty syntetycznych chemokin C-C zostały zbadane pod względem ich aktywności jako inhibitorów lub antagonistów naturalnie występujących form. MCP-1, MCP-3 i RANTES nie zawierające 8 do 9 aminokwasów na końcu NH2 są nieaktywne wobec monocytów i są użyteczne jako antagoniści receptora (Gong J.H. i wsp., J. Exp. Med. 1995, 181 (2): 631-40 oraz Gong J.H. i wsp., J. Biol . Chem. 1996, 271 (18): 10521-7).
Wydłużenie RANTES o jedną metioninę powoduje prawie całkowitą dezaktywację cząsteczki i Met-RANTES zachowuje się jak antagonista wł a ś ciwej czą steczki (Proudfoot A.E. i wsp., J. Biol. Chem. 2 luty 1996; 271 (5): 2599-603).
WO 99/16877 odnosi się do RANTES skróconych od końca aminowego, gdzie brakuje N-końcowych aminokwasów odpowiadających pozycjom aminokwasowym 1, 1-2, 1-3 lub 1-4 naturalnie występującej RANTES i posiadających aktywność antagonisty chemokin, jak również sekwencji cDNA je kodujących, ich zastosowania terapeutycznego i/lub diagnostyki chorób, w których potrzebna jest aktywność antagonistyczna wobec działania chemokin. RANTES (3-68) jest szczególnie korzystnym skróconym antagonistą chemokin.
Nawet jeśli chemotaktyczna aktywność RANTES i ogólnie chemokin CC była badana głównie w odniesieniu do specyficznych receptorów błony komórkowej, RANTES moż e oddziaływać również z glikozaminoglikanami (GAG), silnie zróż nicowanymi, rozgałęzionymi resztami cukrowymi dodawanymi po translacji do szeregu białek, ogólnie zwanych proteoglikanami (PG). Takie białka są obecne na błonie komórkowej, w macierzy zewnątrzkomórkowej i w krwiobiegu, gdzie mogą występować również wyizolowane GAG.
Oddziaływanie z GAG jest wspólną cechą wielu rozpuszczalnych cząsteczek przekaźnikowych (interleukin, czynników wzrostowych). PG lub wolne GAG mogą tworzyć kompleksy z rozpuszczalnymi cząsteczkami, prawdopodobnie w celu ochrony tej cząsteczki przed proteolizą w środowisku zewnątrzkomórkowym. Zaproponowano również, że GAG mogą wspomagać właściwą prezentację cząsteczek sygnalizacji komórkowej ich specyficznym receptorom i w rezultacie także modulację aktywacji komórki docelowej.
W przypadku chemokin koncentracja w stałe gradienty w miejscu zapalenia, a w konsekwencji oddziaływanie z receptorami komórkowymi oraz ich stan aktywacji wydaje się być modulowany przez różne formy GAG (Hoogewerf A.J. i wsp., Biochemistry 1997,36 (44): 13570-8). Zatem zaproponowano, że modulacja takich oddziaływań może stwarzać możliwości terapeutyczne w chorobach zapalnych (Schwarz M.K. i Wells T.N., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3 (4): 407-17) i w zakażeniu HIV (Burns J.M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96 (25): 14499-504).
Wymagania strukturalne i efekty funkcjonalne oddziaływań GAG - RANTES były badane w różnych modelach. RANTES wiąże GAG na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, ang. human umbilical vein endothelial cell) w stężeniach mikromolarnych z powinowactwem i specyficznością większą niż inne chemokiny, takie jak MCP-1, IL-8 lub MIP-1 alfa. Wydaje się, że takie oddziaływanie nie jest po prostu elektrostatycznym, ale jest zależne od innych czynników, jak długość
PL 204 231 B1 i N- i O-siarkowanie cząsteczek GAG (Kuschert G.S. i wsp., Biochemistry 1999, 38 (39): 12959-68). Linie komórkowe nieposiadające GAG nadal mogą wiązać chemokiny, ale obecność powierzchniowych GAG znacznie zwiększa ich aktywność wobec receptorów, gdy są one w niskich stężeniach (Ali S. i wsp., J. Biol. Chem. 2000, 275 (16): 11721-7). Inne doświadczenia wykazały, że GAG, a zwłaszcza siarczan heparyny, ułatwiają oddziaływanie RANTES z powierzchnią komórkową makrofagów i w następstwie hamowanie zakażenia HIV, wynik zgodny z powszechnie znaną opornością tych komórek, słabo wyrażających siarczan heparyny, na przeciwwirusowe działanie RANTES (Oravecz T. i wsp., J. Immunol. 1997, 159 (9): 4587-4592).
Rozpuszczalne GAG współzawodniczą z GAG błony komórkowej i mogą one działać jako specyficzne inhibitory aktywacji powierzchniowej indukowanej przez RANTES (Appay V., i wsp., Int. Immunol. 2000, 12 (8): 1173-82), lub jako supresor zakażenia HIV (Burns J.M., i wsp.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96 (25): 14499-14504).
Pewne badania struktura-funkcja próbowały określić domenę RANTES odpowiedzialną za oddziaływanie z GAG, ze względu na to, że tradycyjna sekwencja konsensusowa (BBXB, w której B oznacza resztę zasadową, a X może być dowolną resztą) jest zbyt ogólna. Mapowanie epitopów zostało przeprowadzone z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego, wytworzonego przeciwko zrekombinowanej ludzkiej RANTES, zdolnego do hamowania zarówno efektów antywirusowych, jak i uwalniania wapnia wewną trzkomórkowego pod wpł ywem RANTES (Burns J.M. i wsp., J. Exp. Med. 1998, 188 (10): 1917-27). To podejście pozwoliło określić pozycje 55-66 jako niezbędne dla obu tych aktywności, jak i oddziaływania z GAG, przemawiając za tym, że oddziaływanie z GAG może mieć dodatkową lub różną funkcję niż ta, w której biorą udział klasyczne receptory, podobnie jak to sugerowano w badaniu wariantów RANTES posiadających zmienione własności agregacyjne (Appay V. i wsp., J. Biol. Chem. 1999, 274 (39): 27505-12).
Region 55-66, który reprezentuje alfa-helikalny, C-końcowy segment, jest homologiczny do domeny wiążącej GAG innych chemokin, takich jak IL-8 (Witt D.P. i Lander A.D., Curr. Biol. 1994,4 (5): 394-400), i zawiera miejsce kationowe zawierające lizynę i argininę (KKWVR). Taki region wiążący jest różny od miejsca wiążącego dla receptora komórkowego, który znajduje się na N-końcu (Pakianathan D.R. i wsp., Biochemistry 1997,36 (32): 96428), i zawiera pewne reszty zaangażowane w agregację monomerów RANTES, nawet jeśli takie mutacje osłabiające agregację wydają się nie mieć wpływu na oddziaływanie z GAG (Czapiewski L.G. i wsp., J. Biol. Chem. 1999, 274 (23): 16077-84; WO 98/13495).
RANTES zawiera jeszcze jedno miejsce kationowe (RKNR) w pozycjach 44-47, które jest konserwowane w domenach wiążących GAG innych chemokin, takich jak MlP-Ια (Koopmann W. i Krangel M.S., J. Biol. Chem. 1997, 272 (15): 10103-9) i MIP-1e (Koopmann W. i wsp., J. Immunol.1999, 163 (4): 2120-7).
Warianty ludzkiej RANTES zawierające pojedyncze mutacje w tych miejscach kationowych zostały opisane jako antagoniści i RANTES posiadający potencjalne zastosowania terapeutyczne w leczeniu zakażenia HIV i zapaleń lub chorób alergicznych (WO 99/33989).
Zostało również ujawnione, że wyłącznie potrójny mutant RANTES, w którym trzy reszty w pozycjach 44, 45 i 47 zostały zastąpione alaniną, stracił zdolność wiązania GAG (A. Proudfoot i wsp., Chemokine Gordon Conference, sesja I, 24 lipca 2000, przekaz ustny).
Obecnie stwierdzono, że chemokiny CC, zawierające przynajmniej dwie mutacje w miejscu kationowym tak zwanej „pętli 40-tych są skuteczne w leczeniu stwardnienia rozsianego i/lub chorób demielizacyjnych. To miejsce reprezentuje konserwatywny motyw wiążący GAG w chemokinach CC (takich jak RANTES, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, MIP-3, MIP-4, HCC1, 1309, MCP-2). Wszystkie te mutanty chemokin mają obniżoną aktywność wiązania GAG w porównaniu z odpowiadającymi im cząsteczkami typu dzikiego.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutanta chemokiny CC, wybranego z grupy składającej się z mutanta RANTES o SEK NR ID: 3, mutanta RANTES o SEK NR ID: 2, mutanta MIP-1-alfa o SEK NR ID: 4 oraz mutanta MIP-1-beta o SEK NR ID: 5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia stwardnienia rozsianego.
Wynalazek dostarcza również kompozycji farmaceutycznej do leczenia stwardnienia rozsianego zawierającej składnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, która jako składnik aktywny zawiera mutanta chemokiny CC wybranego z grupy składającej się z mutanta RANTES o SEK NR ID: 3, mutanta RANTES o SEK NR ID:2, mutanta MIP-1-alfa o SEK NR ID: 4 oraz mutanta MIP-1-beta o SEK NR ID: 5.
PL 204 231 B1
Przedmiotem wynalazku jest także skrócona i zmutowana ludzka RANTES o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 2 oraz cząsteczka DNA zawierająca sekwencję DNA kodującą tą skróconą i zmutowaną chemokinę .
Wynalazek dotyczy również wektora ekspresyjnego zawierającego cząsteczkę DNA według wynalazku oraz komórki gospodarza zawierającej taki wektor ekspresyjny.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest rekombinacyjny sposób wytwarzania polipeptydu według wynalazku obejmujący hodowanie w odpowiedniej pożywce komórek gospodarza według wynalazku.
Obszar, tak zwana pętla 40-tych, w którym, zgodnie z rozwiązaniami według wynalazku, powinny być obecne przynajmniej dwie mutacje jest wskazany dla szeregu chemokin CC na fig. 1. W szczególności, potrójny mutant RANTES, w którym trzy zasadowe reszty w pozycjach 44, 45 i 47 zostały zastąpione alaniną, okazał się aktywny w modelach zwierzęcych w leczeniu stwardnienia rozsianego. Ten potrójny mutant RANTES wykazał zależny od dawki efekt w mysim modelu EAE i porównywalną skuteczność jak leczenie odniesienia zrekombinowanym IFN-beta. Analogiczne wyniki zostały otrzymane ze skróconym potrójnym mutantem RANTES, w którym trzy reszty w pozycjach 44, 45 i 47 zostały zastąpione alaniną, i który nie zawiera pierwszych dwóch aminokwasów na N-końcu. Ten skrócony mutant RANTES jest przedstawiony jako SEK Nr ID: 3.
Podobne dowody doświadczalne zastały również uzyskane w odniesieniu do potrójnych mutantów MlP-1 α i MIP-1 β, które są już znane i które są niniejszym określone jako potrójny mutant MIP-1a R18A-R46A-R48A (Koopmann W. i Krangel M.S., J. Biol. Chem. 1997, 272 (15): 10103-9) i potrójny mutant 40-tych MIP-Ιβ K45A-R46A-K48A (Laurence J.S., Biochemistry 2001,40: 4990-4999).
Określenie „obniżona aktywność wiązania GAG oznacza, że mutanty znajdujące zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku mają mniejszą zdolność wiązania GAG, tzn. niższy procent każdego z tych mutantów wiąże GAG (takich jak siarczan heparyny) w porównaniu z odpowiadającą cząsteczką typu dzikiego.
Pożądane właściwości wykazują mutanty ludzkiej RANTES, w których trzy zasadowe aminokwasy w pozycjach 44, 45 i 47 cząsteczki typu dzikiego zostały podstawione innymi aminokwasami. Takie reszty mogą być podstawione małymi, alifatycznymi, niepolarnymi lub słabo polarnymi resztami, takimi jak na przykład Ala, Ser, Thr, Pro i Gly, z których alanina jest najkorzystniejszą.
Mutanty RANTES, które okazały się szczególnie skuteczne w leczeniu MS, to te, które mają sekwencje aminokwasowe odpowiednio przedstawione w SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 3.
Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie mutantów chemokin, jak określono powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia stwardnienia rozsianego i/lub innych chorób związanych z zanikiem mieliny.
Stwardnienie rozsiane (multiple sclerosis, MS) jest powoli postępującą chorobą ośrodkowego układu nerwowego (CNS) odznaczającą się rozproszonymi obszarami zaniku mieliny w mózgu i rdzeniu kręgowym, wywołującą liczne i różnorodne objawy i oznaki neurologiczne, zazwyczaj z remisjami i zaostrzeniami (zob. The Merck Manual, wyd. szesnaste).
Przyczyna jest nieznana, ale podejrzewa się zaburzenie immunologiczne, z pewnymi danymi obecnie wskazującymi na specyficzny mechanizm. Proponowane przyczyny zawierają zakażenie powolnym lub utajonym wirusem i rozkład mieliny przez enzymy. Poziom IgG jest zazwyczaj zwiększony w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), a podniesiony poziom jest związany z różnymi wirusami, łącznie z wirusem odry. Znaczenie tych spostrzeżeń i opisanych związków z allotypami HLA i zmienioną liczbą komórek T jest niejasne zwłaszcza, że dane są w pewnym stopniu sprzeczne. Zwiększone występowanie w pewnych rodzinach sugeruje podatność genetyczną; kobiety są w pewnym stopniu częściej dotknięte niż mężczyźni. Czynniki środowiskowe wydają się być istotne. Chociaż wiek wystąpienia objawów ogólnie wynosi od 20 do 40 lat, MS zostało powiązane z obszarem geograficznym, gdzie zostało spędzonych 15 pierwszych lat życia pacjenta. Przesiedlenie po osiągnięciu 15 lat nie zmienia ryzyka.
Obszary lub wyspy demielinizacji z uszkodzeniem komórek glejowych skąpowypustkowych oraz zapaleniem otaczających naczyń są rozproszone w CNS, przede wszystkim w substancji białej, zwłaszcza w kolumnach bocznych i tylnych (zwłaszcza w obszarze szyjnym i grzbietowym), w nerwach wzrokowych i w obszarach okołokomorowych. Wiązki w śródmózgowiu, moście i móżdżku są również dotknięte, i substancja szara zarówno w mózgu jak i w rdzeniu może być dotknięta.
Ciała komórek i aksony są zazwyczaj zachowane, szczególnie w przypadku wczesnych uszkodzeń. Później mogą być niszczone aksony, zwłaszcza w długich wiązkach, a włóknista glejoza nadaje wiązkom ich „stwardniały wygląd. Zarówno wczesne jak i późne ubytki mogą być wykrywane równoPL 204 231 B1 cześnie. Chemiczne zmiany w lipidowych i białkowych składnikach mieliny zostały wykazane w, jak i wokół obszarów jej zaniku.
Choroba odznacza się różnymi zgłaszanymi objawami i wykryciem zaburzenia funkcjonowania CNS, z remisjami i stale nawracającymi zaostrzeniami.
Obrazowanie rezonansem magnetycznym (ang. magnetic resonance imaging, MRI) jest najbardziej czułą techniką obrazowania diagnostycznego; może ona wykazać wiele obszarów zaniku mieliny. Ubytki mogą być również widoczne w skanowaniu CT ze wzmocnieniem kontrastu.
Postępy w leczeniu stwardnienia rozsianego (MS) następowały powoli, częściowo ze względu na niepełne rozumienie patogenezy schorzenia. W terapii empirycznej główne trudności obejmują bardzo zmienny przebieg MS, długotrwały charakter najistotniejszych wskaźników skuteczności oraz brak obiektywnych wyznaczników skutków leczenia, szczególnie w krótkim czasie.
Chociaż patogeneza MS pozostaje niejasna, choroba ta jest nadal badana w odniesieniu do jej przebiegu i pochodzenia. Obiektywne wskaźniki skuteczności oparte na obrazowaniu rezonansem magnetycznym (MRI) zostały opracowane i znajomość wielu prób klinicznych zakończonych niepowodzeniem doprowadziły do ulepszonych metod badań i lepszej interpretacji wyników.
Rozwiązania wynalazku jest umożliwiają leczenie MS przez podawanie skutecznej ilości mutantów chemokin razem z farmaceutycznie dopuszczonym nośnikiem.
„Skuteczna ilość odnosi się do ilości aktywnych składników, która jest wystarczająca, aby wpłynąć na przebieg i ciężkość choroby, prowadząc do zmniejszenia lub remisji takiej patologii. Skuteczna ilość będzie zależała od drogi podawania i stanu pacjenta.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są farmaceutyczne kompozycje zawierające mutanty chemokin, w obecności jednego lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników do leczenia MS i/lub innych chorób związanych z zanikiem mieliny.
„Farmaceutycznie dopuszczalny ma obejmować jakikolwiek nośnik, który nie wpływa na skuteczność biologicznej aktywności aktywnego składnika i nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Na przykład, przy podawaniu pozajelitowym, powyższe aktywne składniki mogą być formułowane w postaci dawki jednostkowej do zastrzyków w nośnikach takich jak sól fizjologiczna, roztwór dekstrozy, albuminy osocza i roztwór Ringera.
Poza farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, kompozycje według wynalazku mogą zawierać również niewielkie ilości dodatków, takich jak stabilizatory, zaróbki, bufory i składniki konserwujące.
Podawanie takiego aktywnego składnika może odbywać się dożylnie, domięśniowo lub podskórne. Możliwe są również inne drogi podania, które mogą wytwarzać pożądany poziom odpowiednich składników we krwi.
Optymalna dawka aktywnego składnika może być odpowiednio dobrana w zależności od drogi podawania, stanu pacjenta i jego charakterystyki (płeć, wiek, waga ciała, zdrowie, wielkość), rozległości objawów, równoczesnego leczenia, częstości leczenia i pożądanego efektu. Ustalenie i modyfikowanie określonych zakresów dawkowania znajdują się w zakresie możliwości osób biegłych w dziedzinie.
Zazwyczaj dzienne dawkowanie aktywnego składnika może wynosić około 0,01 do 100 miligramów na kilogram masy ciała. Powszechnie 1 do 40 miligramów na kilogram dziennie w dawkach podzielonych lub w postaci do powolnego uwalniania jest skuteczne, aby otrzymać pożądane rezultaty. Drugie lub kolejne podawania mogą być prowadzone w dawkach, które są takie same, mniejsze lub większe niż pierwotne lub poprzednie dawki podawane pacjentowi.
Niniejszy wynalazek został opisany w odniesieniu do specyficznych postaci wykonania, ale zawartość opisu zawiera wszystkie modyfikacje i podstawienia, które mogą być wprowadzone przez specjalistę w dziedzinie bez wykraczania poza znaczenie i cel zastrzeżeń.
Wynalazek będzie teraz opisany w odniesieniu do następujących Przykładów, które nie powinny być rozumiane w żaden sposób jako ograniczające niniejszy wynalazek. Przykłady będą się odnosić do rysunków określonych poniżej.
Opis rysunków
Figura 1: przedstawia zestawienie pewnych przykładowych chemokin CC, zestawionych na poziomie pętli 40-tych. Ten segment białka i miejsce kationowe, które odpowiadają motywowi wiążącemu GAG, są zaznaczone ramką.
Figura 2: przedstawia mapę plazmidu użytego do klonowania RANTES typu dzikiego i jego mutantów zgodnie z przykładami.
PL 204 231 B1
Figura 3: przedstawia wyniki testu wiązania współzawodniczącego [125I] -RANTES i mutantów w te ś cie heparynowym i teś cie zł o ż a heparynowego.
Figura 4: przedstawia test równowagowego wiązania współzawodniczącego RANTES i potrójnego mutanta 40-tych RANTES.
Figura 5: przedstawia indukcję monocytów i chemotaksję komórek T pod wpływem RANTES i potrójnych mutantów 40-tych i 50-tych RANTES.
Figura 6: przedstawia hamowanie nacieku dootrzewnowego komórek pod wpływem potrójnego mutanta 40-tych RANTES.
Figura 7: przedstawia hamowanie nacieku dootrzewnowego komórek indukowanego przez RANTES pod wpływem skróconego potrójnego mutanta 40-tych RANTES (3-68) wytwarzanego w Pichia pastoris.
Figura 8: przedstawia hamowanie nacieku dootrzewnowego komórek indukowanego przez
MIP-1 β pod wpływem potrójnego mutanta 40-tych MIP-Ιβ (K45AR46AK48A).
Figura 9: przedstawia hamowanie nacieku dootrzewnowego komórek indukowanego przez MlP-1 α pod wpływem potrójnego mutanta 40-tych MIP-1a(R18A-R46A-R48A).
Figura 10: przedstawia hamowanie nacieku dootrzewnowego komórek indukowanego przez tioglikolan pod wpływem potrójnego mutanta 40-tych RANTES.
Figura 11: przedstawia hamowanie wystąpienia doświadczalnego autoimmunizacyjnego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego pod wpływem wszystkich potrójnych mutantów 40-tych RANTES wynalazku.
Przykłady
Materiały i metody
a) Wytwarzanie mutantów RANTES niewiążących heparyny
Mutageneza RANTES została uzyskana techniką odwrotnej reakcji łańcuchowej polimerazy. Mutacje punktowe zostały wprowadzone do jednego z dwóch starterów zastosowanych do hybrydyzacji z kodującą sekwencją ludzkiej RANTES (GenBank No. NM_002985) w odwrotnej orientacji. W celu poprawy wydajności przyłączania starterów (zwłaszcza, gdy do starterów zostało wprowadzonych wiele mutacji), DNA zostało alkalicznie zdenaturowane. Zdenaturowane DNA zostało rozcieńczone do stężenia około 10 pg/reakcja, aby uniknąć włączania niezmutowanego DNA do reakcji transformacji.
Numerowanie aminokwasów podane w przykładach i w opisie dotyczy dojrzałego białka, tzn. rozpoczynającego się od Ser, która jest aminokwasem w pozycji 24 zgodnie z listą sekwencji. Zatem, aby otrzymać idealne odwzorowanie numeracji aminokwasów w zapisie sekwencji i w przykładach, należy dodać 23 do numerów pojawiających się w przykładach lub w opisie.
Poniżej przedstawione zostały sekwencje starterów stosowanych do mutagenezy, w których podkreślono zmutowane zasady:
R44A (sensowny)
5' -TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3' : P1
R44A (anty-sensowny)
5' -GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3' : P2
K45A (sensowny)
5'-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3': P3
K45A (anty-sensowny)
5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3': P4
R47A (sensowny)
5' -CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3' : P5
R47A (anty-sensowny)
5'-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG-3' : P6
R44A-K45A-R47A (potrójny mutant 40-tych, sensowny)
5' -TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC-3' : P7
R44A-K45A-R47A (potrójny mutant 40-tych, anty-sensowny)
5' -GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3' : P8
K55A (sensowny)
5'-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG-3': P9
K55A (anty-sensowny)
5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3': P10
K56A (sensowny)
PL 204 231 B1
5'-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3': P11
K56A (anty-sensowny)
5'-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3': P12
R59A (sensowny)
5'-AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3': P13
R59A (anty-sensowny)
5'-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG- 3' : P14
K55A-K56A-R59A (potrójny mutant 50-tych, sensowny)
5'-GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3': P15
K55A-K56A-R59A (potrójny mutant 50-tych, anty-sensowny)
5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3': P16
Amplifikacja była prowadzona w termocyklerze DNA (Perkin-Elmer-Cetus 480) przez 35 cykli z zastosowaniem polimerazy DNA pfutrbo® (Stratagene). DNA ligowano i transformowano do wydolnych komórek E. coli Top 10 F' (Invitrogen). Sekwencję mutantów sprawdzano przez o sekwencjonowanie DNA.
b) Ekspresja i oczyszczanie RANTES typu dzikiego (WT) i mutantów RANTES w E. coli
Fragmenty DNA otrzymane w PCR jak wyjaśniono powyżej zostały sklonowane w plazmidzie pET24d (fig. 2) tworząc serię wektorów. WT lub zmutowana sekwencja kodująca RANTES jest sklonowana 3' do promotora T7, pomiędzy miejscami Xbal i NheI/XhoI. Plazmid zawiera dwa geny znacznikowe (Km i lad)i aktywne miejsce inicjacji replikacji (Ori f1).
Otrzymane wektory zostały użyte do transformacji szczepu o BL21(DE3) E. coli, który umożliwia silną ekspresję białka z zastosowaniem systemu pT7/LacI. Ekspresja białka była indukowana przez dodanie 1 mM izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do hodowli. Komórki były zbierane i zawieszane w buforze lizującym (50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCI2, 5 mM 5 Benzamidyna/HCI, 1 mM DTT, 0,1 mM fluorek fenylometylosulfonylowy (PMSF), 20 mg/L DNaza). Komórki rozbijano poddając trzykrotnemu działaniu prasy francuskiej. Zawiesina była następnie wirowana przy 10000 x g przez 30 min. w 4°C. Osad ciał inkluzyjnych zawierający WT RANTES lub jeden z mutantów RANTES był rozpuszczany w 0,1 M Tris/HCI, pH 8,0, zawierającym 6M chlorowodorek guanidyny i 1 mM DTT i mieszany przez 30 min. w 60°C. Roztwór dializowano trzykrotnie wobec 1% kwasu octowego. Nierozpuszczalny materiał był usuwany przez wirowanie przy 10000 x g przez 30 min. Nadsącz zawierający WT RANTES lub jeden z mutantów RANTES był liofilizowany.
Liofilizowany proszek był rozpuszczany w 0,1 M Tris/HCI, pH 8,0, zawierającym 6M chlorowodorek guanidyny i 1 mM DTT do końcowego stężenia około 1 mg/ml. Białka były renaturowane przez rozcieńczanie po kropli do 10-krotnej objętości roztworu guanidyny 20 mM Tris/HCI pH 8,0 zawierającym 0,01 mM utlenionego glutationu i 0,1 mM zredukowanego glutationu. Roztwór był mieszany przez noc w 4°C. Nierozpuszczalny materiał był usuwany przez wirowanie przy 10000 x g przez 30 min. pH doprowadzano do 4,5 kwasem octowym i przewodnictwo doprowadzano do 20 mS przez rozcieńczanie wodą. Roztwór nanoszono na kolumnę HiLoad S 26/10 uprzednio zrównoważoną 20 mM octanem sodowym, pH 4,5 i białko było wymywane liniowym gradientem 0-2 M NaCl w tym samym buforze. Frakcje zawierające WT RANTES lub jeden z mutantów RANTES były łączone, dializowane trzykrotnie wobec kwasu octowego i liofilizowane.
Liofilizowane białka były rozpuszczane w 50 mM buforze Tris/HCI, pH 8,0. Sekwencja liderowa MKKKWPR pochodząca z procedury klonowania była odcinana z WT RANTES lub jednego ze zmutowanych białek RANTES przez inkubację z endoproteinazą Arg-C (1:600 enzym : substrat, wag/wag) przez noc w 37°C. Cięte białka były oddzielane od niestrawionych białek przez chromatografię kationowymienną na kolumnie HiLoad S 26/10 uprzednio zrównoważonej 20 mM octanem sodu, pH 4,5 zawierającym 6M mocznik, a białka były wymywane liniowym gradientem 0-2 M NaCl w tym samym buforze. Odcięte frakcje były łączone i dializowane dwukrotnie wobec 1% kwasu octowego i na koniec wobec 0,1% kwasu trifluorooctowego, a następnie liofilizowane (Edgerton M.D. i wsp., str. str. 33-40, i Proudfoot A.E. i wsp., str. 75-87, w Chemokine Protocols, Methods in Molecular Biology 2000, t. 138, Humana Press).
Autentyczność WT i zmutowanych białek RANTES była sprawdzana przez spektrometrię mas. W analogicznej procedurze został wytworzony kolejny mutant, który zawierał Met jako dodatek na końcu NH2 jak również pojedyncze lub potrójne mutanty 40-tych RANTES i pojedyncze lub potrójne mutanty 50-tych.
PL 204 231 B1
c) Ekspresja i oczyszczanie RANTES typu dzikiego (WT) i mutantów RANTES w Pichia pastoris
Dojrzały potrójny mutant 40-tych RANTES (R44A-K45A-R4 7A) został wytworzony z zastosowaniem mutagenezy megastarterowej opartej na PCR (Datta A.K., Nucleic Acid Research 1995, 23 (21): 4530-4531). Został sklonowany do wektora ekspresyjnego Pichia pastoris pPIC9K w tej samej ramce, co peptyd sygnałowy Mat alfa pre-pro S. cerevisiae.
Po potwierdzeniu sekwencji, plazmid został przeniesiony do szczepu GS115(his4) Pichia pastoris przez elektroporację. Klony His+ zostały przebadane pod względem ekspresji mutanta RANTES. Badania ekspresji w małej skali zostały przeprowadzone z zastosowaniem standartowych procedur jak opisano w Pichia Expression Kit firmy Invitrogen (Life Technologies). W skrócie, hodowla zastała przeniesiona do wzbogaconej pożywki zawierającej glicerol jako źródło węgla, po czym została odwirowana i zawieszona w pożywce zawierającej metanol jako źródło węgla, aby indukować ekspresję zmutowanego białka RANTES. Wydzielanie mutanta RANTES do pożywki wykrywano w SDS-PAGE barwionych Coomassie Blue.
Klon wydzielający duże ilości mutanta RANTES (ok. 500-750 mg/l) został użyty do produkcji na większą skalę w dużych kolbach hodowlanych. Sfermentowana pożywka została odwirowana przy 5000 rpm i nadsącz został użyty do oczyszczania.
Białko zostało oczyszczone z nadsączu w pojedynczym etapie chromatograficznym na kolumnie Heparyna-Sepharose, zrównoważonej 0,1 M Tris-HCl i wypłukane liniowym gradientem 0-2 M NaCl w tym samym buforze używając 20 objętości kolumny. Autentyczność białka była sprawdzana przy użyciu spektrometrii mas i stwierdzono, że w takich systemach mutant RANTES (R44A-K45AR47A) tak wytwarzany jest również skrócony na N-końcu w porównaniu z cząsteczką typu dzikiego tzn. brak mu pierwszych 2 aminokwasów. Tak otrzymany mutant został w związku z tym opisany jako potrójny mutant RANTES (3-68) 40-tych (R44A, K45A, R47A) i jego sekwencją aminokwasową jest ta z SEK NR ID: 3.
d) Oznaczanie wiązania heparyny
Chromatografia na złożu heparyna-Sepharose była prowadzona z zastosowaniem 50 μg białek RANTES typu dzikiego lub zmutowanych, które były nakładane na kolumnę heparyna-Sepharose zrównoważoną 25 mM Tris/HCI, pH 8,0 i 50 mM NaCl i wymywane liniowym gradientem 0-2 M NaCl w 25 mM Tris/HCI, pH 8,0.
Chromatografia na złożu heparyna-Sepharose była prowadzona z zastosowaniem 50 μg białek RANTES typu dzikiego lub zmutowanych, które były nakładane na kolumnę jonowymienną MonoS zrównoważoną 50 mM octanem sodu, pH 4.5. Białko było wymywane liniowym gradientem 0-2 M NaCl.
Test wiązania współzawodniczącego był prowadzony z zastosowaniem RANTES typu dzikiego, potrójnego mutanta 50-tych RANTES i potrójnego mutanta 40-tych RANTES (SEK NR ID: 2 - również opisany niniejszym jako „R44A-K45A-R4 7A RANTES), które zostały wyznakowane radioaktywnie 125I Amersham do aktywności specyficznej 2200 mCi/mol. Płytki titracyjne zawierające 96 studzienek zostały zwilżone buforem wiążącym (50 mM HEPES, pH 7,2 zawierający 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl i 0,5% BSA). Seryjne rozcieńczenia heparyny w buforze wiążącym zostały sporządzone w zakresie obejmującym stężenia od 20 mg/ml do 1 μg/ml. Oznaczenie przeprowadzono w całkowitej objętości 100 μl przez dodanie 25 μl rozcieńczeń heparyny, 25 μl 0,4 nM [125I]-chemokiny, 25 μl złoża heparyny (0,2 μg/ml w wodzie) i 25 μl buforu wiążącego do każdej studzienki. Oznaczenie prowadzono w trzech powtórzeniach. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej ze wstrząsaniem przez 4 godziny. Płytki titracyjne płukano 3 razy 200 μl buforu płuczącego z zastosowaniem pompy próżniowej, aby usunąć niezwiązaną wyznakowaną chemokinę. Następnie dodawano 50 μl scyntylatora do każdej studzienki i liczono radioaktywność (1 min./studzienka). Wyniki analizowano z zastosowaniem oprogramowania GraFit.
e) Test równowagowego kompetycyjnego wiązania receptora
Testy prowadzono na błonach z transfekowanych CHO wyrażających CCR1 lub CCR5 z zastosowaniem testu bliskości scyntylacji (ang. scintillation proximity assay (SPA)) używając [125I]-MlP-1a jako znacznika. Związki współzawodniczące przygotowano przez seryjne rozcieńczenia nieznanowanych chemokin w buforze wiążącym, aby zawierały się w zakresie 10-6-10-12 M. Używany bufor wiążący zawierał 50 mM HEPES, pH 7,2 zawierający 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl i 0,5% BSA. Złoża SPA z kiełków pszenicy (Amersham) zawieszano w PBS do stężenia 50 mg/ml i rozcieńczano w buforze wiążącym do 10 mg/ml, a końcowe stężenie w oznaczeniu wynosiło 0,25 mg/studzienkę. Błony uzyskiwane z komórek CHO produkujących CCR1 lub CCR5 przechowywano
PL 204 231 B1 w -80°C i rozcieńczano w buforze wiążącym do 80 μg/ml. Przed oznaczeniem mieszano równe objętości podstawowych roztworów błon i złoża w celu obniżenia tła. Końcowe stężenie błon wynosiło 2 μg/ml, a [125I]-MlP-1a 0,1 nM. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej ze wstrząsaniem przez 4 godziny. Radioaktywność mierzono i analizowano wyniki, tak jak opisano dla oznaczenia wiązania heparyny.
f) Oznaczanie chemotaksji
Chemotaksja monocytów była prowadzona z zastosowaniem oznaczenia w mikrokomorze Boydena. Monocyty oczyszczano z kożuszka z wykorzystaniem następującej procedury izolacji: 100 ml roztworu kożuszka rozcieńczano 100 ml PBS, nawarstwiano na Ficoll i wirowano przy 600 x g przez 20 min. w temperaturze pokojowej. Komórki tworzące granicę faz zbierano, płukano dwukrotnie PBS i zawieszano w stężeniu 40 100 x 106/ml w podłożu RPMI 1640 zawierającym 5% inaktywowaną surowicę płodową cielęcą (FCS), 2 mM glutaminę i 25 mM HEPES, pH 7,2. Były one dalej oczyszczane od frakcji limfocytów przez dodanie 106 erytrocytów owcy/ml, rozetkowanych przez noc w 4° C i rozdzielane przez drugie wirowanie w gradiencie Ficollu przy 900 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej. Monocyty znajdowały się na granicy faz pomiędzy Ficollem i buforem, a komórki T znajdowały się w osadzie. Monocyty płukano PBS i zawieszano do 2,5 x 106/ml w podłożu RPMI 1640. Czystość mierzono w rozproszeniu czołowym i bocznym świtała w analizie FACS i wynosiła ona 40-80% w zależności od dawcy. Chemokiny rozcieńczano do objętości końcowej 30 , w zakresie stężeń 10-6 - 10-12 M w podłożu RPMI i umieszczano w niższych studzienkach. Filtr o średnicy porów 5 μm (Neuroprobe) dla monocytów i 8 μm dla komórek T umieszczano ponad niższymi studzienkami zwracając uwagę, aby nie powstały pęcherze powietrza i system uszczelniano. Pięćdziesiąt mikrolitrów zawiesiny komórkowej (2,5 x 106 komórek/ml) w podłożu RPMI umieszczano w górnych studzienkach. Komorę inkubowano przez 30 min. dla monocytów i 1,5 godz. dla komórek T w 37°C w O2. Następnie komórki odrzucano, oczyszczano górną powierzchnię membrany z komórek i płukano membranę w PBS. Membranę utrwalano przez zanurzenie w MeOH przez minutę, suszono w powietrzu i barwiono roztworami Fields A i B. Migrujące komórki liczono przez wybranie losowych pól dla każdej studzienki w obiektywie 20x w standardowym mikroskopie współpracującym z oprogramowaniem analizy obrazu IBAS. Dane analizowano używając oprogramowania GraFit.
g) Oznaczanie dootrzewnowego nacieku komórkowego
W pierwszym oznaczeniu, naciek komórkowy był indukowany przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 10 μg chemokiny rozcieńczonej w 0,2 ml jałowej soli fizjologicznej (NaCl wolnej od LPS) samicom myszy BALB/c w wieku 8 do 12 tygodni. Mutanty chemokin (10 μg chemokiny rozcieńczonej w 0,2 ml jałowej soli fizjologicznej) podawano 30 min. przed podaniem agonisty. Szesnaście godzin później, myszy zabijano przez rozpylenie CO2. Płukanie otrzewnowe prowadzono przez 3 płukania 5 ml PBS i łączono popłuczyny. Komórki odwirowywano przy 600 x g przez 10 min, zawieszano w końcowej objętości 1 ml i zliczano wszystkie wywołane leukocyty w hemacytometrze.
W drugim oznaczeniu, naciek komórkowy był indukowany przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 200 μl 3% roztworu tioglikolanu w wodzie destylowanej samicom myszy BALB/c w wieku 8 do 12 tygodni (Dzień 1). Mutant chemokiny (10 μg chemokiny rozcieńczonej w 0,2 ml jałowej soli fizjologicznej) podawano 30 min przed podaniem tioglikolanu. Mutant chemokiny był następnie podawany codziennie przez 3 dni (Dzień 2, 3 i 4). Myszy zabijano Dnia 5 przez rozpylenie CO2. Płukanie otrzewnowe prowadzono przez 3 płukania 5 ml PBS i łączono popłuczyny. Komórki odwirowywano przy 600 x g przez 10 min., zawieszano w końcowej objętości 1 ml i zliczano wszystkie wywołane leukocyty w hemacytometrze.
h) Doświadczalne autoimmunizacyjne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego(EAE)
Procedura immunizacji
8-tygodniowe samice myszy C57 BL/6NCrlBR ważące 18-22 gramy były immunizowane (dzień=0) przez podskórne wstrzyknięcie w kark 0,1 ml emulsji zawierającej 200 μg peptydu MOG35-55 (Neosystem, Strasbourg, Francja) w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA z Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, Stany Zjednoczone) zawierającym 0,25 mg Mycobacterium tuberculosis. Przed wstrzyknięciem podskórnym zwierzęta otrzymywały 200 μl dożylny zastrzyk 300 ng toksyny krztuścowej (List Biological Lab., Campbell, CA, Stany Zjednoczone) rozpuszczonej w PBS w żyłę ogonową. Dnia 2 zwierzęta otrzymywały drugi dootrzewnowy zastrzyk 300 ng toksyny krztuścowej.
Skutki procedury rozpoczynały się w przybliżeniu 8-10 dnia jako pojawianie się postępującego paraliżu, początkowo ogona i stopniowo rozszerzającego się do kończyn przednich.
PL 204 231 B1
Schemat prowadzenia badania
Badanie obejmowało grupy po 10 zwierząt każda. Wszystkie grupy były immunizowane peptydem MOG35-55 w CFA i toksyną krztuścową według protokołu immunizacji.
Grupa 1: Grupa kontroli dodatniej, której podawano dootrzewnowo sam nośnik (PBS).
Grupa 2: Grupa kontroli dodatniej, której podawano podskórnie sam nośnik (PBS).
Grupa 3: podawano dootrzewnowo 10 μg/mysz potrójnego mutanta 40-tych RANTES.
Grupa 4: podawano dootrzewnowo 1 μg/mysz potrójnego mutanta 40-tych RANTES.
Grupa 5: podawano dootrzewnowo 10 μg/mysz potrójnego mutanta 40-tych Met-RANTES.
Grupa 6: podawano dootrzewnowo 1 μg/mysz potrójnego mutanta 40-tych Met-RANTES
Grupa 7: podawano podskórnie 10000 U/mysz mysiego rekombinowanego interferonu beta (m-IFN-β)
Grupa 8: podawano podskórnie 20000 U/mysz m-IFN-β.
No ś nik
Do rozcieńczania wszystkich potrójnych mutantów 40-tych RANTES, wszystkich potrójnych mutantów 40-tych Met-RANTES i m-IFN-β do odpowiedniego stężenia używano PBS.
Droga podania
Potrójny mutant 40-tych RANTES, potrójny mutant 40-tych Met-RANTES i m-IFN-β były podawane codziennie dootrzewnowo w objętości podania wynoszącej 200 μl/mysz. Grupom 1,2 podawano 200 μl/mysz PBS.
Czas leczenia
Leczenie rozpoczynano dla każdego zwierzęcia w 4 dniu eksperymentu (w przybliżeniu 3-5 dni przez zwykłym wystąpieniem choroby) i kontynuowano przez 14 kolejnych dni (zwierzęta zabijano w 18 dniu eksperymentu).
Obserwacje kliniczne
Od dnia 5 zwierzęta były indywidualnie badane pod względem obecności paraliżu z wykorzystaniem następującej oceny klinicznej:
= brak objawów choroby
0,5 = częściowy paraliż ogona = paraliż ogona
1.5 = paraliż ogona + częściowy jednostronny paraliż kończyny tylnej = paraliż ogona + osłabienie kończyn tylnych lub częściowy paraliż kończyn tylnych
2.5 = paraliż ogona + częściowy paraliż kończyn tylnych (obniżona miednica) = paraliż ogona + całkowity paraliż kończyn tylnych
3.5 = paraliż ogona + całkowity paraliż kończyn tylnych + nietrzymanie odchodów = paraliż ogona + paraliż kończyn tylnych + osłabienie lub częściowy paraliż kończyn przednich = umierające lub martwe.
Wyniki
a) Oznaczanie wiązania heparyny
Oczyszczone białka RANTES zmutowane w jednej lub trzech pozycjach były analizowane przez chromatografię heparynową i stężenia NaCl konieczne do ich wymycia były porównywane z profilem elucyjnym RANTES WT. Ponieważ oddziaływanie z heparyną jest elektrostatyczne, mutanty poddano również chromatografii kationowymiennej na kolumnie MonoS. Powoduje to spadek stężenia NaCl koniecznego do ich wymycia, ponieważ mutageneza doprowadziła do usunięcia reszt zasadowych. Różnica w stężeniu NaCl otrzymana w chromatografii kationowymiennej zostaje odjęta od tej otrzymanej w chromatografii heparynowej. Jeżeli wartość ta jest dodatnia, zostaje zidentyfikowane specyficzne oddziaływanie z heparyną (Tabela 1).
Bezpośredni pomiar wiązania z heparyną został przeprowadzony z potrójnymi mutantami RANTES 40- i 50-tych w oznaczeniu wiązania współzawodniczącego. RANTES WT i mutanty były jodowane (Amersham) i wszystkie miały tę samą radioaktywność specyficzną 2200 mCi/mol. Jednakże, w przybliżeniu tylko 20% potrójnego mutanta 40-tych wiązało się ze złożem koralików heparynowych, z najwyższym cmp wynoszącym 4000 w porównaniu z 22000 cpm w przypadku RANTES WT i mutanta 50-tych (fig. 3). Pokazuje to, że te reszty w pętli 40-tych, które zostały zmutowane, przyczyniają się do większości zdolności wiązania heparyny przez RANTES. Z drugiej strony, to również pokazuje, że przypuszczalny motyw wiążący GAG w pętli 50-tych nie jest „prawdziwym miejscem wiążącym GAG.
b) Test równowagowego kompetycyjnego wiązania receptora
PL 204 231 B1
Zdolność potrójnych mutantów RANTES 40- i 50-tych do współzawodniczenia z [125I] MIP-1a w wiązaniu do rekombinowanego CCR1 i CCR5 na błonach otrzymanych ze stabilnych transfektantów CHO. Nie stwierdzono znaczącej różnicy w żadnym z pojedynczych mutantów dla obu receptorów (wyniki nieprzedstawione). Żaden z potrójnych mutantów nie wykazywał różnicy w wiązaniu do CCR5 w porównaniu do białka RANTES WT. Jednakże, dla CCR1 potrójny mutant 40-tych miał 100-krotnie obniżone powinowactwo, podczas gdy potrójny mutant 50-tych wykazywał tylko mały (3-krotny) spadek powinowactwa (fig. 4).
c) Oznaczanie chemotaksji
Wszystkie potrójne mutanty 40- i 50-tych były zdolne do indukowania chemotaksji monocytów z aktywnością porównywalną z RANTES WT, z wyjątkiem potrójnego mutanta 40-tych RANTES, który był zdolny do indukowania chemotaksji przy 1 μM. Jednakże, potrójne mutanty 40- i 50-tych były równie skuteczne w indukcji chemotaksji komórek T (fig. 5). Wyniki otrzymane w oznaczeniach chemotaksji monocytów dobrze odpowiadają tym otrzymanym w oznaczeniach wiązania receptora.
Wyniki otrzymane w oznaczeniach chemotaksji monocytów dobrze odpowiadają tym otrzymanym w oznaczeniach wiązania receptora. Utrata aktywności potrójnego mutanta 40-tych RANTES w chemotaksji monocytów odpowiada utracie powinowactwa wobec CCR1.
d) Oznaczanie dootrzewnowego nacieku komórkowego
Potrójny mutant 40-tych RANTES nie był zdolny do indukcji dootrzewnowego nacieku komórkowego w dawce (10 μg/mysz), przy której RANTES powodował znaczny naciek (fig. 6).
Ponadto, jeżeli podawano 10 μg mutanta 30 min przed podaniem RANTES, naciek komórkowy indukowany przez RANTES był zahamowany. Tak więc zahamowanie wiązania GAG wytworzyło inhibitor indukowanego przez chemokiny nacieku komórkowego in vivo.
Analogiczne wyniki są przedstawione na fig. 7 dla skróconego (3-68) potrójnego mutanta 40-tych RANTES (wytwarzanym w Pichia pastoris), na fig. 8 dla potrójnego mutanta 40-tych MIP-1e (K45AR46A-K48A) i na fig. 9 dla potrójnego mutanta 40-tych MlP-1a (R18A-R46A-R48A). Naciek komórkowy stymulowany przez tioglikolan został zahamowany również przez potrójnego mutanta 40-tych RANTES, jak pokazano na fig. 10.
e) Doświadczalne autoimmunizacyjne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego(EAE)
Potrójny mutant 40-tych RANTES wykazał efekt zależny od dawki w mysim modelu EAE. Białko w dawce zarówno 1 μg i 10 μg/mysz podawane codziennie dootrzewnowo od dnia 10 po pierwotnej immunizacji MOG, wykazało podobną skuteczność jak leczenie odniesienia rekombinowanym m-IFN-β (fig. 11). Wystąpienie choroby było znacząco opóźnione i ciężkość choroby (oceniona jako obszar pod krzywą) była również znacznie zmniejszona. Co więcej, średnia maksymalnej punktacji klinicznej osiąganej w czasie eksperymentów była również znacząco zredukowana. Inny mutant (potrójny mutant 40-tych Met-RANTES) nie wykazał żadnego pozytywnego wpływu w tym samym doświadczeniu.
Nasze wyniki pokazują widoczne korzystne działanie w leczeniu potrójnym mutantem 40-tych RANTES, który zmniejsza kliniczne objawy chronicznego EAE u myszy po immunizacji MOG. Zatem potrójny mutant RANTES wykazał korzystny efekt terapeutyczny i może być stosowany do leczenia chronicznych chorób związanych z zanikiem mieliny, takich jak MS.
T a b e l a 1
Molarność NaCl do wymywania z kolumn heparynowych i Mono-S (wymiana kationowa)
Mutacja RANTES Heparyna MonoS ΔNaCl Hep's ΔNaClMono s ΔΔNaCl
brak (WT) 0,80 0,91
R44A 0,61 0,82 0,19 0,09 0,10
K45A 0,65 0,97 0,15 0,04 0,11
R47A 0,65 0,84 0,15 0,07 0,08
R44A-K45A-R47A 0,47 0,70 0,33 0,21 0,11
K55A 0,70 0,86 0,10 0,05 -0,05
K56A 0,90 0,94 -0,10 0,07 -0,17
R59A 0,79 0,85 0,01 0,06 -0,05
K55A-K56A-R59A 0,70 0,75 0,10 0,16 -0,06
PL 204 231 B1
W zamieszczonej poniżej Tabeli 2 wyjaśniono znaczenia sekwencji przedstawionych w liście sekwencji i w tekście
T a b e l a 2
SEK NR ID: Opis sekwencji
1 RANTES TYPU DZIKIEGO (WT)
2 POTRÓJNY MUTANT RANTES W 40-tych
3 POTRÓJNY MUTANT RANTES (3-68) W 40-tych
4 POTRÓJNY MUTANT MIP-1-alfa (R18A-R46A-R48A)
5 POTRÓJNY MUTANT MIP-1-beta (K45A-R46A-K48A)
6 POTRÓJNY MUTANT W 50-tych RANTES
7 POTRÓJNY MUTANT W 40-tych Met-RANTES
8 MUTANT RANTES R44A
9 MUTANT RANTES K45A
10 MUTANT RANTES R47A
11 MUTANT RANTES K55A
12 MUTANT RANTES K56A
13 MUTANT RANTES R59A
14 Starter P1
15 Starter P2
16 Starter P3
17 Starter P4
18 Starter P5
19 Starter P6
20 Starter P7
21 Starter P8
22 Starter P9
23 Starter P10
24 Starter P11
25 Starter P12
26 Starter P13
27 Starter P14
28 Starter P15
29 Starter P16
30 WT-1309
31 WT-MIP-1-alfa
32 WT-MIP-1-beta
33 WT-MIP-4
34 WT-MIP-5
35 WT-HCC1
36 WT-136512
37 WT-MCP-2
PL 204 231 B1
Lista sekwencji <110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
<120> MUTANTY CHEMOKIN W LECZENIU STWARDNIENIA ROZSIANEGO <130> WO465 <160> 37 <170> Patentln wersja 3.0 <210> 1 <211> 91 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli <220>
<221> sygnał <222> (1)...(23) <400> 1
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys
35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
50 55 60
Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
85 90
<210> 2 <211> 66 <212> BIAŁKO <213> Pichia pastoris <400> 2
Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro
1 5 10 15
Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys
20 25 30
Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gin Val Cys
35 40 45
Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu
65 70 75 80
Met Ser 65
PL 204 231 B1 <210> 3
--1> 91 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli <220>
<221> sygnał <222> (1)...(23) <400> 3
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu
1 5
Leu Cys Ala Pro 20 Ala Ser Ala Ser
Cys Cys Phe 35 Ala Tyr Ile Ala Arg 40
Glu Tyr 50 Phe Tyr Thr Ser Gly 55 Lys
Val 65 Thr Ala Ala Asn Ala 70 Gin Val
Val Arg Glu Tyr Ile 85 Asn Ser Leu
Ala Val 10 Ile Leu Ile Ala Thr 15 Ala
Pro 25 Tyr Ser Ser Asp Thr 30 Thr Pro
Pro Leu Pro Arg Ala 45 His Ile Lys
Cys Ser Asn Pro 60 Ala Val Val Phe
Cys Glu Ala Met 90 Asn 75 Ser Pro Glu Lys Lys Trp 80
<210> 4 <211> 70 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli <400> 4
Ala Ser Leu Ala Ala ASp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr
1 5 10 15
Ser Ala Gin Ile Pro Gin Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser
20 25 30
Ser Gin cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Ala Ser Ala
35 40 45
Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser Ala
70 <210> 5 <211> 69 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli <400> 5
Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr
1 5 10 15
Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser
20 25 30
Ser Leu cys Ser Gin Pro Ala Val Val Phe Gin Thr Ala Ala Ser Ala
PL 204 231 B1
35 40 45
Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gin Glu Tyr Val Tyr
50 55 60
Asp Leu Glu Leu 65 Asn
<210> 6 <211> 91 <212> BIAŁKO
<213> Escherichia coli
<220>
<221> sygnał <222> (1)...(23)
<400> 6 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys
35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
50 55 60
Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Ala Ala Trp
65 70 75 80
Val Ala Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
90 <210> 7 <211> 92 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli
<400> 7
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Met Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr
20 25 30
Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile
35 40 45
Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val
50 55 60
Phe Val· Thr Ala Ala Asn Ala Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys
65 70 75 80
Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
90 <210> 8 <211> 91
PL 204 231 B1 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli <220>
<221> sygnał <222> (1)...(23) <400> 8
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys
35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
50 55 60
Val Thr Ala Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
90 <210> 9 <2ll> 91 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli
<220> <221> sygnał <222> (1)...(23)
<400> 9 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys
35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
50 55 60
Val Thr Arg Ala Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
85 90
<210> 10 <211> 91 <212> BIAŁKO
<213> Escherichia coli
<400> 10 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
PL 204 231 B1
5
Leu Cys Ala Pro 20 Ala Ser Ala Ser
Cys Cys Phe 35 Ala Tyr Ile Ala Arg 40
Glu Tyr 50 Phe Tyr Thr Ser Gly 55 Lys
Val 65 Thr Arg Lys Asn Ala 70 Gin Val
Val Arg Glu Tyr Ile 85 Asn Ser Leu
Pro 10 Tyr Ser Ser Asp Thr 15 Thr Pro
25 Pro Leu Pro Arg Ala 30 His Ile Lys
Cys Ser Asn Pro 45 Ala Val Val Phe
Cys Ala Asn 60 Pro Glu Lys Lys Trp
Glu Met 90 75 Ser 80
<210> 11
<211> 91
<212> BIAŁKO
<213> Escherichia coli
<220>
<221> sygnał
<222> (1)...(23)
<400> 11
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu
1 5
Leu Cys Ala Pro 20 Ala Ser Ala Ser
Cys Cys Phe 35 Ala Tyr Ile Ala Arg 40
Glu Tyr 50 Phe Tyr Thr Ser Gly 55 Lys
Val 65 Thr Arg Lys Asn Arg 70 Gin Val
Val Arg Glu Tyr Ile 85 Asn Ser Leu
Ala Val 10 Ile Leu Ile Ala Thr 15 Ala
Pro 25 Tyr Ser Ser Asp Thr 30 Thr Pro
Pro Leu Pro Arg Ala 45 His Ile Lys
Cys Ser Asn Pro 60 Ala Val Val Phe
Cys Glu Ala Met 90 Asn 75 Ser Pro Glu Ala Lys Trp 80
<210> 12 <211> 91 <212> BIAŁKO <213> Escherichia coli <220>
<221> sygnał <222> (1)...(23) <400> 12
Met 1 Lys Val Ser Ala 5 Ala Ala Leu
Leu Cys Ala Pro 20 Ala Ser Ala Ser
Cys Cys Phe 35 Ala Tyr Ile Ala Arg 40
Ala Val 10 Ile Leu Ile Ala Thr 15 Ala
Pro 25 Tyr Ser Ser Asp Thr 30 Thr Pro
Pro Leu Pro Arg Ala 45 His Ile Lys
PL 204 231 B1
Glu Tyr 50 Phe Tyr Thr Ser Gly 55 Lys Cys Ser Asn Pro Ala 60 Val Val Phe
Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Ala Trp
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
90
<210> 13
<211> 91
<212> BIAŁKO
<213> Escherichia coli
<220>
<221> sygnał
<222> (1)...(23)
<400> 13
Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro
20 25 30
Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys
35 40 45
Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe
50 55 60
Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp
65 70 75 80
Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser
85 90
<210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 tttgtcaccg caaagaaccg ccaag <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 gacgactgct gggttggagc acttg <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli
PL 204 231 B1
<400> 22 gccaacccag aggcgaaatg ggttcgg
PL 204 231 B1
<210> 29 <211> 33 <212> DNA
PL 204 231 B1 <213> Escherichia coli <400> 29 acacacttgg cggttctttc gggtgacaaa gac <210> 30 <211> 74 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 30
Ser Lys Ser Met Gin Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala
1 5 10 15
Glu Gin Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser
20 25 30
Ser Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys
35 40 45
Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gin Arg His Arg Lys
50 55 60
Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys
65 70
<210> 31 <211> 70 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 31
Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr
1 5 10 15
Ser Arg Gin Ile Pro Gin Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser
20 25 30
Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg
35 40 45
Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser Ala
65 70
<210> 32 <211> 68 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 32
Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gin Ser
1 5 10 15
Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys
20 25 30
Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gin Val Cys
35 40 45
PL 204 231 B1
Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val 50 55
Pro Tyr Ser Ile <210> 33 <211> 68 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 33
Gin Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys 60
Gin Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu
1 5
Gin Ile Pro Gin Lys Phe Ile Val
20
Cys Pro Lys Leu Gly Val Ile Leu
35 40
Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp
50 55
Lys Leu Asn Ala
Cys Cys 10 Leu Val Tyr Thr Ser 15 Trp
Asp 25 Tyr Ser Glu Thr Ser 30 Pro Gin
Leu Thr Lys Arg Gly 45 Arg Gin Ile
Val Gin Lys Tyr 60 Ile Ser Asp Leu
<210> 34 <211> 76 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 34
Asp 1 Arg Phe His Ala 5 Thr Ser Ala
Arg Ser Ile Pro 20 Cys Ser Leu Leu
Glu Cys Ser 35 Lys Pro Gly Val Ile 40
Phe Cys 50 Ala Asn Pro Ser Asp 55 Lys
Leu 65 Lys Leu Asp Thr Arg 70 Ile Lys
Asp Cys 10 Cys Ile Ser Tyr Thr 15 Pro
Glu 25 Ser Tyr Phe Glu Thr 30 Asn Ser
Phe Leu Thr Lys Lys 45 Gly Arg Arg
Gin Thr Val Arg Gin Lys 75 Val 60 Asn Cys Met Arg Met
<210> 35 <211> 74 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 35
Thr 1 Lys Thr Glu Ser 5 Ser Ser Arg
Cys Phe Thr Tyr 20 Thr Thr Tyr Lys
Tyr Tyr Glu 35 Thr Asn Ser Gin Cys 40
Gly Pro Tyr 10 His Pro Ser Glu 15 Cys
Ile Pro Arg Gin Arg Ile Met Asp
25 30
Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile
45
PL 204 231 B1
Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val
50 55 60
Gin Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn
65 70
<210> 36
<211> 96
<212> białko
<213> Escherichia coli
<400> 36
Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu Lys
1 5 10 15
Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg Asn
35 40 45
Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gin Glu Tyr Ile
50 55 60
Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val
65 70 75 80
Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gin Pro Gin Leu Leu Asn Ser Gin
85 90
<210> 37 <211> 76 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 37
Gin Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile
5 10 15
Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gin Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr
25 30
Asn Ile Gin Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly
40 45
Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met
55 60
Lys His Leu Asp Gin Ile Phe Gin Asn Leu Lys Pro 65 70 75

Claims (7)

1. Zastosowanie mutanta chemokiny CC, wybranego z grupy składającej się z mutanta RANTES o SEK NR ID: 3, mutanta RANTES o SEK NR ID: 2, mutanta MIP-1-alfa o SEK NR ID: 4 oraz mutanta MIP-1-beta o SEK NR ID: 5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia stwardnienia rozsianego.
2. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego zawierająca składnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera mutanta chemokiny CC wybranego z grupy z grupy składającej się z mutanta RANTES o SEK NR ID: 3, mutanta RANTES o SEK NR ID:2, mutanta MIP-1-alfa o SEK NR ID: 4 oraz mutanta MIP-1-beta o SEK NR ID: 5.
3. Skrócona i zmutowana ludzka RANTES o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 2.
4. Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję DNA kodującą skróconą i zmutowaną RANTES określoną w zastrz. 3.
5. Wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 4.
6. Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 5.
7. Rekombinacyjny sposób wytwarzania polipeptydu określonego w zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje hodowanie w odpowiedniej pożywce komórek określonych w zastrz. 6.
PL362350A 2000-10-04 2001-10-03 Zastosowanie mutanta chemokiny CC, kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego, skrócona i zmutowana ludzka RANTES i sposób jej wytwarzania, cząsteczka DNA i zawierający ją wektor ekspresyjny oraz komórka gospodarza PL204231B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00121665 2000-10-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362350A1 PL362350A1 (pl) 2004-10-18
PL204231B1 true PL204231B1 (pl) 2009-12-31

Family

ID=8170011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362350A PL204231B1 (pl) 2000-10-04 2001-10-03 Zastosowanie mutanta chemokiny CC, kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego, skrócona i zmutowana ludzka RANTES i sposób jej wytwarzania, cząsteczka DNA i zawierający ją wektor ekspresyjny oraz komórka gospodarza

Country Status (31)

Country Link
US (1) US7402303B2 (pl)
EP (1) EP1326628B1 (pl)
JP (1) JP3908165B2 (pl)
KR (1) KR100837898B1 (pl)
CN (1) CN1285381C (pl)
AR (1) AR030854A1 (pl)
AT (1) ATE265222T1 (pl)
AU (2) AU1591902A (pl)
BG (1) BG66137B1 (pl)
BR (1) BR0114407A (pl)
CA (1) CA2423616C (pl)
CZ (1) CZ303409B6 (pl)
DE (1) DE60103078T2 (pl)
DK (1) DK1326628T3 (pl)
EA (1) EA006137B1 (pl)
EE (1) EE05174B1 (pl)
ES (1) ES2217199T3 (pl)
HK (1) HK1062811A1 (pl)
HR (1) HRP20030215B1 (pl)
HU (1) HUP0302194A3 (pl)
IL (2) IL155178A0 (pl)
MX (1) MXPA03003008A (pl)
NO (1) NO330278B1 (pl)
PL (1) PL204231B1 (pl)
PT (1) PT1326628E (pl)
RS (1) RS50738B (pl)
SI (1) SI1326628T1 (pl)
SK (1) SK287523B6 (pl)
UA (1) UA77950C2 (pl)
WO (1) WO2002028419A2 (pl)
ZA (1) ZA200302315B (pl)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE421974T1 (de) 2001-12-17 2009-02-15 Serono Lab Chemokine mutanten, die als chemokine antagonisten wirken
JP2005529099A (ja) 2002-04-04 2005-09-29 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ 改善された経口生物学的利用能を有するケモカイン変異体
EP1575608B1 (en) * 2002-12-23 2008-05-07 Laboratoires Serono SA Use of cc-chemokine ccl5/rantes mutants against liver diseases
CA2534828A1 (en) * 2003-10-22 2005-05-06 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Novel cxcl8 antagonists
AT412785B (de) * 2003-12-04 2005-07-25 Kungl Andreas J Dr Gag-bindungsproteine
DE60304435T2 (de) * 2004-01-19 2006-08-24 Ares Trading S.A. Verfahren zur Reinigung von in Bakterien exprimierten Proteinen
GB0412400D0 (en) * 2004-06-03 2004-07-07 Univ Newcastle Treatment of inflammatory conditions
EP1760110B1 (en) * 2005-09-03 2011-11-02 Samsung SDI Co., Ltd. Polybenzoxazine-based compound, electrolyte membrane including the same, and fuel cell employing the electrolyte membrane
GB0614755D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Univ Geneve Cytokine derivatives
AU2008317495B2 (en) 2007-08-02 2013-08-01 Novimmune S.A. Anti-RANTES antibodies and methods of use thereof
CN102781952B (zh) * 2010-02-08 2015-09-02 宾夕法尼亚大学托管会 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法
WO2019229615A1 (en) 2018-05-28 2019-12-05 Université De Genève Methods of inhibiting cerebral inflammation
WO2022093857A1 (en) * 2020-10-26 2022-05-05 City Of Hope Oncolytic virus compositions and methods for the treatment of cancer

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5739103A (en) 1993-11-12 1998-04-14 Dana-Farber Cancer Institute Chemokine N-terminal deletion mutations
WO1998006751A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 Research Corporation Technologies, Inc. Mcp-3, rantes and mip-1alpha receptor antagonists
EP0906954A1 (en) * 1997-09-29 1999-04-07 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist
DK1040191T3 (da) * 1997-12-23 2005-12-19 San Raffaele Centro Fond RANTES-mutanter og terapeutiske anvendelser heraf
JP2002535376A (ja) * 1999-01-29 2002-10-22 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃｃｒ１アンタゴニストを用いた脱髄性炎症性疾患の治療方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2423616C (en) 2010-03-16
KR100837898B1 (ko) 2008-06-13
KR20030034238A (ko) 2003-05-01
CN1477969A (zh) 2004-02-25
HRP20030215B1 (en) 2011-09-30
MXPA03003008A (es) 2003-07-14
EP1326628B1 (en) 2004-04-28
DE60103078D1 (de) 2004-06-03
JP3908165B2 (ja) 2007-04-25
AU1591902A (en) 2002-04-15
CZ303409B6 (cs) 2012-09-05
ATE265222T1 (de) 2004-05-15
HK1062811A1 (en) 2004-11-26
CN1285381C (zh) 2006-11-22
DE60103078T2 (de) 2005-04-07
UA77950C2 (en) 2007-02-15
ES2217199T3 (es) 2004-11-01
JP2004510426A (ja) 2004-04-08
DK1326628T3 (da) 2004-08-09
EP1326628A2 (en) 2003-07-16
YU25703A (sh) 2006-05-25
SI1326628T1 (en) 2004-10-31
NO20031525L (no) 2003-04-03
AR030854A1 (es) 2003-09-03
HRP20030215A2 (en) 2005-02-28
PT1326628E (pt) 2004-09-30
EA200300439A1 (ru) 2003-08-28
RS50738B (sr) 2010-08-31
NO330278B1 (no) 2011-03-21
BG66137B1 (bg) 2011-07-29
SK287523B6 (sk) 2011-01-04
EE200300139A (et) 2003-06-16
EA006137B1 (ru) 2005-10-27
EE05174B1 (et) 2009-06-15
CA2423616A1 (en) 2002-04-11
SK4062003A3 (en) 2003-08-05
BR0114407A (pt) 2003-07-29
CZ2003947A3 (cs) 2003-11-12
BG107685A (bg) 2003-11-28
PL362350A1 (pl) 2004-10-18
US7402303B2 (en) 2008-07-22
ZA200302315B (en) 2004-03-25
IL155178A0 (en) 2003-11-23
HUP0302194A3 (en) 2005-12-28
US20040101509A1 (en) 2004-05-27
IL155178A (en) 2009-07-20
WO2002028419A2 (en) 2002-04-11
WO2002028419A3 (en) 2002-06-13
HUP0302194A2 (hu) 2003-10-28
AU2002215919B2 (en) 2005-11-24
NO20031525D0 (no) 2003-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU708558B2 (en) Human chemokine beta-9
PL204231B1 (pl) Zastosowanie mutanta chemokiny CC, kompozycja farmaceutyczna do leczenia stwardnienia rozsianego, skrócona i zmutowana ludzka RANTES i sposób jej wytwarzania, cząsteczka DNA i zawierający ją wektor ekspresyjny oraz komórka gospodarza
MXPA97001330A (en) Chemistry beta-9 hum
EP1673103A1 (en) Therapeutic uses of chemokine variants
WO2003084993A1 (en) Novel antagonists of mcp proteins
AU2003255505B2 (en) Antagonists of CXR3-binding CXC chemokines
AU2002215919A1 (en) Chemokine mutants in the treatment of multiple sclerosis
EP1458756A1 (en) Chemokine mutants acting as chemokine antagonists
AU711573B2 (en) Short forms of chemokine beta-8
US20030138400A1 (en) Short forms of chemokine beta-8
CA2233367A1 (en) Short forms of chemokine .beta.-8
MXPA98002380A (en) Short shapes of bet chemiscino

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20131003