KR100837898B1

KR100837898B1 - 다발성 경화증의 치료에서 사용되는 케모킨 변이체

Info

Publication number: KR100837898B1
Application number: KR1020037004599A
Authority: KR
Inventors: 아만다 프로우드풋트; 티모시엔.씨. 웰스; 마리에 코스코-빌보이스
Original assignee: 라보라토리스 세로노 에스.에이.
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2008-06-13
Also published as: EP1326628B1; ZA200302315B; AU1591902A; SK4062003A3; WO2002028419A2; US7402303B2; CA2423616C; CZ2003947A3; BR0114407A; BG107685A; EP1326628A2; IL155178A; AU2002215919B2; HK1062811A1; JP3908165B2; ATE265222T1; CN1285381C; PL362350A1; NO330278B1; US20040101509A1

Abstract

본 발명은 40' 루프의 양이온성 부위에서 적어도 2개의 돌연변이를 보유하고 야생형 분자와 비교하여 감소된 GAG-결합 활성을 보이는 CC 케모킨의 변이체에 관한다. 특히, 이런 돌연변이된 케모킨은 다발성 경화증 또는 다른 탈수초성 질환의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. RANTES의 삼중 변이체는 최적의 결과를 보이는 화합물이다.

Description

다발성 경화증의 치료에서 사용되는 케모킨 변이체{CHEMOKINE MUTANTS IN THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS}

본 발명은 40' 루프에서 적어도 2개의 돌연변이를 보유하고 야생형 분자와 비교하여 감소된 GAG-결합 활성을 보이는 CC 케모킨의 변이체에 관한다: 이런 돌연변이된 케모킨은 다발성 경화증 및/또는 다른 탈수초성(demyelinating) 질환의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

케모킨은 백혈구 화학주성과 활성화 특성을 갖는 소형 친-염증성 사이토킨의 일족이다. 제일 먼저 보존된 시스테인의 위치에 따라, 케모킨 일족은 C-C, C-X-C, C-X₃-C 케모킨으로 구분할 수 있다(Baggiolini M. et al., Adv Immunol. 1994, 55:97-179; Baggiolini M. et al., Annu Rev Immunol. 1997, 15:675-705; Taub D. et al. Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7(4): 355-76).

인터루킨-8(IL-8)과 같은 많은 C-X-C 케모킨은 단핵구, 림프구, 호산구, 호염기구, NK 세포, 수상돌기 세포에 작용한다.

케모킨의 NH₂-말단 도메인은 수용체 결합에 관여하고, NH₂-말단 가공은 케모킨을 활성화시키거나 또는 완전히 불활성화시킬 수 있다.

합성 C-C 케모킨의 N-말단 변이체는 자연 발생 형태의 저해물질 또는 길항물질로서의 활성을 검사하였다. MCP-1, MCP-2 및 8 내지 9개의 NH₂-말단 아미노산이 결실된 RANTES는 단핵구에 불활성이고 수용체 길항물질로서 유용하다(Gong JH et al., J Exp Med. 1995, 181(2): 631-40; Gong JH et al., J Biol Chem. 1996, 271(18): 1052-7).

1개의 메티오닌으로 RANTES를 신장하면 상기 분자는 거의 완전히 불활성화되고, Met-RANTES는 실제 RANTES에 대한 길항물질로 작용한다(Prudfoot AE et al., J Biol Chem. 1996 Feb 2: 271(5)-2599-603).

WO 99/16877은 자연 발생 RANTES의 아미노산 잔기 1, 1-2, 1-3 또는 1-4에 상응하는 NH₂-말단 아미노산이 결실되고 케모킨 길항 활성을 보유하는 아미노-말단 절두된 RANTES, 이들을 인코드하는 cDNA 서열, 케모킨 효과의 길항 활성이 요구되는 질환의 치료 및/또는 예방에서 이들의 용도에 관한다. RANTES(3-68)이 바람직한 절두된 케모킨 길항물질이다.

일반적으로 RANTES와 CC 케모킨의 화학주성 활성이 특이적인 세포 막 수용체와 관련하여 연구되고 있긴 하지만, RANTES는 일반적으로 프로테오글리칸(PG)으로 총칭되고 일부 단백질에 번역후 부가되는 고도 변이성 분지된 당 작용기인 글리코사미노글리칸(GAG)과도 상호작용한다. 이런 단백질은 세포 막, 세포외 매트릭스, 혈류에 존재하는데, 여기에서는 분리된 GAG도 존재할 수 있다.

GAG와의 상호작용은 많은 세포-신호전달 가용성 분자(인터루킨, 성장 인자) 에 공통적인 특징이다. PG 또는 분리된 GAG는 세포외 환경에서 단백분해를 차단하는 범위내에서 가용성 분자와 복합체를 형성할 수 있다. GAG는 특이적 수용체에 대한 세포 신호전달 분자의 정확한 제시와 이에 따른 표적 세포 활성화의 조절을 촉진할 수 있는 것으로 제시되고 있다.

케모킨의 경우에, 염증 부위에서 고정된 구배로의 농축과 이에 따른 세포 수용체와의 상호작용 및 이들의 활성화 상태는 상이한 형태의 GAG에 의해 조절되는 것으로 보인다(Hoogewerf AJ et al., Biochemistry 1997, 36(44): 13570-8). 따라서, 이런 상호작용은 염증 질환(Schwarz MK and Wells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999, 3(4): 407-17) 및 HIV 감염(Burns JM et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(25): 14499-504)에서 치료요법적 접근법을 대표하는 것으로 제시되고 있다.

GAG-RANTES 상호작용의 구조적 필요와 기능적 효과는 다양한 모델에서 연구되고 있다. RANTES는 MCP-1, IL-8 또는 MIP-1알파와 같은 다른 케모킨보다 높은 친화성과 특이성으로 마이크로몰 농도에서 사람 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)의 GAG에 결합한다. 이런 상호작용은 단순한 정전(electrostatic)이 아닌 GAG의 길이 및 N-과 O-황산포합(Sulfation)과 같은 다른 변수에 의존하는 것으로 보인다(Kuschert GS et al., Biochemistry 1999, 38(39): 12959-68). GAG-결함성 세포주 역시 케모킨에 결합할 수 있지만, 세포 표면 GAG의 존재는 낮은 농도로 수용체에서 이들의 활성을 현저하게 강화시킨다(Ali S et al., J Biol Chem 2000, 275(16): 11721-7). 다른 실험에서 GAG, 특히 헤파린 황산염이 RANTES와 대식세포 세포 표면간 상호작 용 및 이에 따른 HIV 감염의 저해를 촉진하는 것으로 밝혀졌는데, 이런 결과는 헤파린 황산염의 발현이 불량한 이들 세포의 RANTES 항바이러스 효과에 대한 공지된 저항성과 일치한다(Oravecz T, et al., J Immunol. 1997, 159(9): 4587-92).

가용성 GAG는 세포 막 GAG와 경쟁하고, RANTES-유도된 활성화 표면의 특이적인 저해물질(Appay V, et al., Int Immunol 2000, 12(8): 1173-82) 또는 HIV 감염의 억제물질(Burns JM et al.; Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(25): 14499-504)로 기능할 수 있다.

일부 구조-기능 연구에서는 GAG와의 상호작용을 담당하는 RANTES 도메인의 동정을 시도하였는데, 그 이유는 전통적인 공통 서열(BBXB, 여기서 B는 염기성 잔기이고, X는 임의의 잔기이다)이 너무 포괄적이기 때문이다. 에피토프-지도작성(mapping) 연구는 재조합 사람 RANTES에 대하여 발생되고 RANTES에 의해 매개된 항바이러스 효과와 세포내 칼슘의 동원을 모두 차단할 수 있는 단클론 항체를 이용하여 실시하였다(Burns JM et al.; J. Exp. Med. 1998, 188(10): 1917-27). 이 접근법에서는 이런 활성과 GAG 상호작용 모두에 필요한 잔기 55-66을 정의하고, GAG 상호작용이 변형된 응집 특성을 보이는 RANTES 변이체에 대한 연구에서 제시된 바와 같이 정준(canonical) 수용체에 의해 매개되는 상호작용과 상보적인 또는 상이한 기능을 보일 수 있다고 주장한다(Appay V et al., J Biol Chem 1999, 274(39): 27505-12).

C-말단 알파-나선 분절을 나타내는 영역 55-66은 IL-18과 같은 다른 케모킨의 GAG-결합 도메인에 상동하고(Witt DP and lander AD, Curr. Biol. 1994, 4(5): 394-400), 리신과 아르기닌을 포함하는 양이온성 부위(KKWVR)를 보유한다. 이런 결합 영역은 N-말단에 위치하는 세포 수용체에 대한 결합 부위와 상이하고(Pakianathan DR et al., Biochemistry 1997, 36(32): 9642-8) RANTES 단량체의 응집에 관여하는 일부 잔기를 보유하는데, 하지만 이런 탈응집(disaggregating) 돌연변이는 GAG와의 상호작용에 영향을 주지 않는 것으로 보인다(Czaplewski LG et al., J. Biol. Chem. 1999, 274(23): 16077-84; WO 98/13495).

RANTES는 MIP-1α(Koopmann W and Krangel MS, J. Biol. Chem. 1997, 272(15): 10103-9)와 MIP-1β(Koopmann W et al., J Immunol. 1999, 163(4): 2120-7)와 같은 다른 케모킨의 GAG 결합 도메인에 보존된 잔기 44-47에서 상이한 양이온성 부위(RKNR)를 보유한다.

이들 양이온성 부위에서 단일 돌연변이를 보유하는 사람 RANTES 변이체는 HIV 감염 및 염증성이나 알레르기성 질환의 치료에서 잠재적인 치료적 능력을 갖는 RANTES 길항물질로 개시되었다(WO 93/33989).

또한, 위치 44, 45, 46에서 3개의 잔기가 알라닌으로 치환된 RANTES의 삼중 변이체만 GAG-결합 능력을 상실하는 것으로 개시되었다(A. Proudfot et al., Chemokine Gordon Conference, Session I, July 24^th 2000).

소위 "40' 루프"의 양이온성 부위에서 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 CC 케모킨은 다발성 경화증 및/또는 다른 탈수초성 질환의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 부위는 CC 케모킨(예, RANTES, MIP-1알파와 MIP-1베타, MIP-3, MIP-4, HCC1, 1309, MCP-2)에서 보존된 GAG-결합 모티프를 나타낸다. 이들 모든 케모킨 변이체는 상응하는 야생형 분자와 비교하여 감소된 GAG-결합 활성을 보인다.

본 발명에서 적어도 2개의 돌연변이가 존재하는 영역, 소위 40' 루프는 도 1에서 다수의 CC 케모킨에 대하여 표시한다. 특히, 위치 44, 45, 47에서 3개의 염기성 잔기가 알라닌으로 치환된 RANTES 삼중 변이체는 다발성 경화증의 치료를 위한 동물 모델에서 활성인 것으로 밝혀졌다. 이런 RANTES 삼중 변이체는 뮤린 EAE 모델에서 약량-관련된 효과 및 재조합 IFN-베타의 기준 치료에 필적하는 효능을 보였다. 위치 44, 45, 47에서 3개의 잔기가 알라닌으로 치환되고 첫 2개의 N-말단 아미노산이 결실되는 절두된 RANTES 삼중 변이체에서도 유사한 결과가 확인되었다. 이런 절두된 RANTES 변이체(아미노산 서열 SEQ ID NO: 3을 보유)는 신규한 본 발명의 다른 목적이다.

이미 공지되고 본원에서 MIP-1α삼중 변이체 R18A-R46A-R48A(Koopman W and Krangel MS., J Biol Chem. 1997, 272(15): 10103-9)와 MIP-1β삼중 40' 변이체 K45A-R46A-K48A(Laurence JS Biochemistry 2001, 40: 4990-4999)로 동정된 MIP-1알파와 MIP-1베타의 삼중 변이체에서도 유사한 실험 결과가 도출되었다.

"감소된 GAG-결합 활성"은 본 발명의 변이체가 GAG에 대하여 좀더 낮은 결합능력을 보유한다, 다시 말하면 이들 변이체 각각이 상응하는 야생형 분자와 비교하여 좀더 낮은 비율로 GAG(예, 헤파린 황산염)와 결합한다는 것을 의미한다.

사람 RANTES의 변이체가 좀더 바람직한데, 여기서 야생형 분자의 위치 44, 45, 47에서 3개의 염기성 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된다. 이런 잔기는 소형, 지방성, 비-극성 또는 약한 극성 잔기, 예를 들면 Ala, Ser, Thr, Pro, Gly으로 치환될 수 있다. 알라닌(Ala)이 바람직하다.

MS의 치료에 특히 효과적인 것으로 밝혀진 RANTES 변이체는 각각 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:3에 보고된 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 목적은 다발성 경화증 및/또는 다른 탈수초성 질환을 치료하는 제약학적 조성물을 생산하기 위한 전술한 케모킨 변이체의 용도이다.

다발성 경화증(MS)은 뇌와 척수에서 탈수초화(demyelination)의 유포된 패치로 특징지어지는 서서히 진행되는 CNS 질환으로, 완화와 악화를 반복하는 다발성의 다양한 신경학적 증상과 징후를 초래한다(참조: Merck Mannual, sixteenth edition).

원인은 알려져 있지 않고 면역학적 비정상에 기인하는 것으로 추측되고 있긴 하지만, 특정 기전을 시사하는 단서는 현재 없는 상태이다. 추정 원인에는 느림보 또는 잠재성 바이러스에 의한 감염 및 효소에 의한 수초분해가 포함된다. IgG는 CSF에서 통상적으로 상승하고, 상승된 역가는 홍역을 비롯한 다양한 바이러스와 연관한다. 이런 발견 및 HLA 이인자형(allotype)과 변화된 T 세포수 사이의 연관관계의 중요성은 분명하지 않은데, 그 이유는 증거들이 다소 상충되기 때문이다. 증가된 가족 발병률은 유전적 감수성을 시사한다; 여성은 남성보다 걸릴 위험이 조금 더 높다. 환경 인자가 존재하는 것으로 보인다. 일반적으로 발병시의 연령이 20 내지 40세이긴 하지만, MS는 환자가 첫 15년간을 생활하는 지역환경과 연관하였다. 15세 이후의 이주는 이런 위험을 변화시키지 않는다.

희돌기교세포 파괴 및 혈관주위 염증을 보이는 수초의 플라크 또는 세포군은 CNS 전역, 주로 백색질에 유포되고, 외측과 후섬유단(특히, 경부와 척추 영역), 시신경, 뇌실주위가 선호된다. 중뇌, 뇌교, 소뇌에서 신경삭(tract) 역시 영향을 받고, 대뇌와 삭상(cord)에서 회색질이 영향을 받을 수도 있다.

세포체(cell body)와 축삭(axon)은 특히 초기 병변에서는 보존된다. 이후, 축삭은 특히 긴 신경삭에서 파괴될 수 있고, 섬유성 신경교증(gliosis)은 이런 신경삭에 "경화성(sclerotic)" 외형을 제공한다. 초기와 후기 병변이 동시에 발견될 수도 있다. 플라크 주변에서 수초의 지질과 단백질 구성에서 화학적 변화가 나타났다.

상기 질환은 완화와 악화를 지속적으로 반복하는 CNS 기능장애의 다양한 질환과 발견 결과로 특징지어진다.

자기 공명 영상 진단(MRI)은 가장 민감한 영상 진단 기술이다; 이는 많은 플라크를 보여줄 수 있다. 병변은 조영-증강 단층 촬영으로 볼 수도 있다.

다발성 경화증(MS)에서 치료요법적 진보는 이 질환의 병인에 대한 이해 부족으로 인해 지연되고 있다. 경험에 기초한 치료에서 발전에 대한 주요 걸림돌에는 매우 다양한 MS 과정, 가장 중요한 결과 측정(outcome measure)의 장기적 특성, 치료 효과(특히, 단기적)의 객관적 마커 부재가 포함된다.

MS의 병인은 여전히 불확실하지만, 자연사(natural history)가 지속적으로 연구되고 있다. 자기 공명 영상 진단(MRI)에 기초한 객관적 결과 측정이 개발되었고 임상적 실험의 많은 함정이 확인되었는데, 이는 개선된 실험 방법 및 결과의 좀더 효과적인 해석을 결과하였다.

따라서, 본 발명의 다른 목적은 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 본 발명에 따른 케모킨 변이체의 효과량을 투여하여 MS를 치료하는 방법이다.

"효과량"은 이런 질환의 과정과 심각도에 영향을 주고, 이런 병리의 감소 또는 완화를 유도할 만큼 충분한 활성 성분의 함량을 의미한다. 효과량은 투여 경로 및 환자의 상태에 의존한다.

본 발명의 다른 목적은 MS 및/또는 다른 탈수초성 질환을 치료하기 위하여, 하나 또는 복수의 제약학적으로 수용가능한 부형제의 존재하에 본 발명의 케모킨 변이체를 함유하는 제약학적 조성물이다.

"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 간섭하지 않고 투여된 개체에 독성을 유발하지 않는 임의의 담체가 포함되도록 의도한다. 가령, 장관외 투여를 위하여 상기 활성 성분은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청알부민, 링거액과 같은 액체 형태의 주사용 단위 약형으로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체이외에, 소량의 첨가제, 예를 들면, 안정제, 부형제, 완충액, 방부제를 추가로 함유할 수 있다.

이런 활성성분은 정맥, 근육내 또는 피하 루트로 투여할 수 있다. 개별 성분의 혈액 수준을 원하는 수준으로 확립할 수 있는 다른 투여 루트 역시 본 발명에 포함된다.

활성 성분의 최적 용량은 투여 루트, 환자 상태와 특징(연령, 성별, 체중, 건강, 크기), 증상 정도, 재발 치료, 치료 빈도, 원하는 효과에 따라 적절히 선택할 수 있다. 확립된 용량 범위의 조정과 처리는 당업자의 능력 범위에 속한다.

일반적으로, 활성 성분의 일일 용량은 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 100 ㎎이다. 통상적으로, 분할 분량 또는 지속 방출 형태로 제공된 일일 ㎏당 1 내지 40 ㎎이 원하는 결과를 달성하는데 효과적이다. 이차 또는 후속 투여는 개체에 초기에 또는 이전에 투여된 용량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 용량으로 실시할 수 있다.

본 발명은 특정 구체예를 참고로 하여 기술하지만, 본 발명에는 특허청구범위의 기술적 사상과 목적을 벗어나지 않는 범위에서 당업자에 의한 모든 개변이 포함된다.

본 발명은 다음의 실시예로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명을 결코 한정하지 않는다. 실시예는 하기에 명시된 도면을 참고한다.

도 1 은 40' 루프의 수준에서 배열된 일부 전형적인 CC 케모킨의 정렬을 도시한다. GAG-결합 모티프에 상응하는 단백질 분절과 양이온성 부위는 박스로 표시한다.

도 2 는 야생형 RANTES와 실시예에 따른 이의 변이체를 클론하는데 사용되는 플라스미드의 유전자 지도를 도시한다.

도 3 은 헤파린 비드 분석에서 헤파린에 의한 [¹²⁵I]-RANTES와 변이체의 경합 결합 분석의 결과를 도시한다.

도 4 는 RANTES와 삼중 40' RANTES 변이체의 경합 평형 결합 분석을 도시한다.

도 5 는 RANTES 및 삼중 40'와 50' RANTES 변이체에 의한 단핵구와 T 세포 화학주성의 유도를 도시한다.

도 6 은 삼중 40' RANTES 변이체에 의한 복막 세포 동원의 저해를 도시한다.

도 7 은 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 생산된 절두된 삼중 40' RANTES(3-68) 변이체에 의한 RANTES 유도된 복막 세포 동원의 저해를 도시한다.

도 8 은 MIP-1β삼중 40' 변이체(K45AR46AK48A)에 의한 MIP-1β유도된 복막 세포 동원의 저해를 도시한다.

도 9 는 삼중 MIP-1α변이체(R18A-R46A-R48A)에 의한 MIP-1α유도된 복막 세포 동원의 저해를 도시한다.

도 10 은 삼중 40' RANTES 변이체에 의한 티오글리콜레이트(thioglycollate) 유도된 세포 동원의 저해를 도시한다.

도 11 은 본 발명에 따른 모든-40' RANTES 삼중 변이체에 의한 실험적 자가면역 뇌척수염 발병의 저해를 도시한다.

1. 재료와 방법

a) 비-헤파린 결합 RANTES 변이체의 생산

RANTES의 돌연변이유발은 역전사연쇄반응 기술로 달성한다. 점 돌연변이는 반대 방향으로 사람 RANTES 코딩 서열(GenBank acc. No. NM_002985)과 혼성화하는데 사용되는 2가지 프라이머중 한가지에 도입한다. 프라이머 어닐링의 효율을 높이기 위하여(특히, 다중 돌연변이가 프라이머에 도입되는 경우), DNA는 알칼리-변성시킨다. 변성된 DNA는 대략 10 pg/반응의 농도로 희석시켜, 돌연변이되지 않은 DNA가 형질전환 반응에 참여하지 않도록 한다.

실시예와 상세한 설명에 제시된 아미노산 번호는 서열 리스트에 따라, 위치 24에서 Ser으로 시작되는 성숙 단백질을 고찰한다. 따라서, 서열 리스트와 실시예에서 아미노산 번호를 완전히 일치시키기 위해서는 실시예 또는 상세한 설명에 기재된 번호에 23을 더한다.

사용된 돌연변이유발성(mutagenic) 프라이머 서열은 다음과 같고, 돌연변이된 염기는 밑줄로 표시한다:

R44A(센스)

5'-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3'. P1

R44A(안티-센스)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3'. P2

K45A(센스)

5'-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3'. P3

K45A(안티-센스)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3'. P4

R47A(센스)

5'-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3'. P5

R47A(안티-센스)

5'-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG-3'. P6

R44A-K45A-R47A(삼중 40' 변이체, 센스)

5'-TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC-3'. P7

R44A-K45A-R47A(삼중 40' 변이체, 안티-센스)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3. P8

K55A(센스)

5'-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG-3'. P9

K55A(안티-센스)

5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3'. P10

K56A(센스)

5'-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3. P11

K56A(안티-센스)

5'-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3'. P12

R59A(센스)

5'-AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3'. P13

R59A(안티-센스)

5'-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG-3'. P14

K55A-K56A-R59A(삼중 50' 변이체, 센스)

5'-GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3' P15

K55A-K56A-R59A(삼중 50' 변이체, 안티-센스)

5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3'. P16

증폭은 pfuturbo^®DNA 중합효소(Strategene)를 이용하여 DNA 유전자 증폭기(Perkin-Elmer-Cetus 480)에서 35회 실시한다. DNA는 결찰시키고 Top 10F' 콤피던트 대장균(E. coli) 세포(Invitrogen)에 형질전환시킨다. 상기 변이체의 서열은 DNA 서열분석으로 검증한다.

b) 대장균( E. coli )에서 야생형(WT) RANTES와 RANTES 변이체의 발현과 정제

전술한 바와 같이 PCR로 수득된 DNA 단편은 플라스미드 pET24d(도 2)에 클론시켜 일련을 벡터를 생성한다. WT 또는 돌연변이된 RANTES 코딩 서열은 pT7 프로모터에서 Xbal과 Nhel/Xhol 부위 사이에 클론시킨다. 상기 플라스미드는 2개의 마커 유전자(Km과 lacl) 및 1개의 활성 복제 기점(Ori fl)을 보유한다.

생성된 벡터는 BL21(DE3) 대장균(E. coli) 균주를 재형질전환하는데 사용되는데, 이들은 pT7/Lacl 시스템을 이용하여 강한 단백질 발현을 가능하게 한다. 단백질 발현은 배양액에 1 mM 아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 유도한다. 세포는 수거하고 세포용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl₂, 5 mM 벤즈아미딘/HCl, 1 mM DTT, 0.1 mM 페닐메틸설포닐 불화물(PMSF), DNase 20 ㎎/ℓ)에 재부유시킨다. 세포는 French Press Cell 유닛에 3회 통과시켜 깨뜨린다. 이후, 현탁액은 4℃에서 30분동안 10,000 x g로 원심분리한다. WT RANTES 또는 RANTES 변이체중 한가지를 보유하는 봉입체(inclusion body) 펠렛은 6M 구아니딘/HCl을 함유하는 0.1M Tris/HCl, pH 8.0과 1 mM DTT에 용해시키고 60℃에서 30분동안 교반한다. 용액은 3회 교환된 1% 아세트산에 대하여 투석한다. 불용성 물질은 30분동안 10,000 x g로 원심분리하여 제거한다. WT RANTES 또는 RANTES 변이체중 한가지를 보유하는 상층액은 동결건조시킨다.

동결건조된 분말은 6M 구아니딘/HCl을 함유하는 0.1M Tris/HCl, pH 8.0과 1 mM DTT에 용해시켜 대략 1 ㎎/㎖의 농도를 달성한다. 단백질은 0.01 mM 산화된 글루타티온과 0.1 mM 환원된 글루타티온을 함유하는 20 mM Tris/HCl, pH 8.0의 구아니딘 용액의 10x 부피로 방울방울 희석(dropwise dilution)하여 재생시킨다. 용액은 4℃에서 하룻밤동안 교반한다. 불용성 물질은 30분동안 10,000 x g로 원심분리하여 제거한다. pH는 아세트산으로 4.5로 조정하고, 전도(conductivity)는 물로 희석하여 20 mS로 조정한다. 용액은 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.5에서 사전 평형화된 Hiload S 26/10 칼럼에 통과시키고, 단백질은 동일 완충액에서 선형 0-2M NaCl 농도구배로 용출한다. WT RANTES 또는 RANTES 변이체 단백질중 한가지를 보유하는 분취물은 모으고 3회 교환된 1% 아세트산에 투석하며 동결건조시킨다.

동결건조된 단백질은 50 mM Tris/HCl, pH 8.0에 용해시킨다. 클로닝 과정으로부터 유도된 MKKKWPR 리더 서열은 37℃에서 엔도프로테이나제 Arg-C(1:600 효소:기질, w/w)와 하룻밤동안 배양하여 WT RANTES 또는 RANTES 변이체 단백질중 한가지 로부터 절단한다. 절단된 단백질은 6M 요소를 함유하는 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.5에서 사전 평형화된 Hiload S 26/10 칼럼에서 양이온 교환 크로마토그래피로 절단되지 않은 단백질로부터 분리하고, 단백질은 동일 완충액에서 선형 0-2M NaCl 농도구배로 용출시킨다. 절단된 분취물은 모으고 2회 교환된 1% 아세트산과 최종적으로 0.1% 트라이플루오르아세트산에 투석하며 동결건조시킨다(Edgerton MD et al., pg. 33-40; Proudfoot AE et al., pg. 75-87, in "Chemokine Protocols", Methods in Molecular Biology 2000, vol. 138, uman Press).

WT와 RANTES 변이체 단백질의 진정성은 질량 분광법으로 검증한다. 유사한 과정으로, NH₂-말단 신장으로 Met를 보유하는 다른 변이체 및 단일이나 삼중 40' RANTES 변이체와 단일이나 삼중 50' 변이체를 만들었다.

c) 피치아 패스토리스( Pichia pastoris )에서 야생형(WT) RANTES와 RANTES 변이체의 발현과 정제

성숙한 삼중 40' RANTES 변이체(R44A-K45A-R47A)는 메가프라이머 기초한 PCR 돌연변이유발로 생성한다(Datta AK, Nucleic Acid Research 1995, 23(21): 4530-31). 이는 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae) Mat 알파 프리-프로(pre-pro) 신호 펩티드 골격의 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 발현 벡터, pPIC9K에 클론시킨다.

서열 확인후, 상기 플라스미드는 에렉트로포레이션(electroporation)으로 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 숙주 균주 GS115(his4)에 형질전환시킨다. His⁺ 클론은 RANTES 변이체의 발현을 스크리닝한다. 소규모 발현 연구는 Invitrogen(Life Technologies)의 Pichia Expression Kit에서 밝힌 표준 과정으로 실시한다. 간단히 말하면, 배양액은 글리세롤을 탄소원으로 이용한 강화 배지에서 확대시키고, 이후 펠렛하고 메탄올을 함유한 배지에서 재부유시켜 RANTES 변이체 단백질의 발현을 유도한다. 배지에서 RANTES 변이체의 분비는 쿠마씨 블루 염색된 SDS-PAGE에서 검출한다.

높은 수준의 RANTES 변이체(대략 500-750 ㎎/ℓ)를 분비하는 클론은 큰 쉐이크 플라스크(shake flask)에서 스케일 업(scale up)에 사용한다. 발효된 액체배지는 5,000 rpm으로 원심분리하고 상층액은 정제에 사용한다.

단백질은 0.1M Tris-HCl에서 평형화된 헤파린 세파로즈 칼럼에서 단일 크로마토그래피 단계로 상층액으로부터 정제하고, 20 칼럼 부피를 이용하여 동일 완충액에서 0-2M Nacl의 선형 농도구배로 용출한다. 단백질의 진정성은 질량 분광법으로 검증하는데, 상기 시스템에서 이렇게 만들어진 RANTES 변이체(R44A-K45A-R47A) 역시 야생형 분자와 비교하여 N-말단에서 첫 2개의 아미노산이 결핍되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이렇게 얻은 변이체는 삼중 40' RANTES(3-68)로 동정되었고, 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 서열이다.

d) 헤파린 결합 분석

헤파린 세파로즈 크로마토그래피는 50 ㎍ WT 또는 돌연변이된 RANTES 단백질을 이용하여 실시하고, 상기 단백질은 25 mM Tris/HCl, pH 8.0에서 평형화된 헤파린 세파로즈 칼럼에 적하하고, 25 mM Tris/HCl, pH 8.0에서 0-2M NaCl의 선형 농도 구배로 용출한다.

헤파린 세파로즈 크로마토그래피는 50 ㎍ WT 또는 돌연변이된 RANTES 단백질을 이용하여 실시하고, 상기 단백질은 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.5에서 평형화된 MonoS 양이온 교환 칼럼에 적하한다. 단백질은 0-2M Nacl 농도구배로 용출한다.

경합 결합 분석은 2200 mCi/mole의 특이적 활성도로 Amersham에 의해 ¹²⁵I로 방사성표지된 WT RANTES, 삼중 50' RANTES 변이체, 삼중 40' RANTES 변이체(SEQ ID NO: 2 - "R44A-K45A-R47ARANTES")를 이용하여 실시한다. 96 웰을 보유한 필터 평판은 결합 완충액(1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.15 M NaCl, 0.5% BSA를 함유한 50 mM HEPES, pH 7.2)에 담근다. 결합 완충액에서 헤파린의 연속 희석은 20 ㎎/㎖ 내지 1 ㎍/㎖의 농도 범위로 실시한다. 분석은 각 웰에 25 ㎕ 헤파린 희석액, 25 ㎕ 0.4 nM[¹²⁵I]-케모킨, 25 ㎕ 헤파린 비드(물에서 0.2 ㎍/㎖), 25 ㎕ 결합 완충액을 첨가하여 총 100 ㎕ 부피로 실시한다. 이런 분석은 3회 반복한다. 평판은 진탕하면서 실온에서 4시간동안 배양한다. 필터 평판은 진공 펌프를 이용하여 200 ㎕ 세척 완충액으로 3회 세척하여 결합되지 않은 표지된 케모킨을 제거한다. 이후, 50 ㎕ 신틸란트(scintillant)를 각 웰에 첨가하고, 방사성을 측정한다(1 min/웰). 데이터는 GraFit 소프트웨어로 분석한다.

e) 평형 경합 수용체 결합 분석

이런 분석은 [¹²⁵I]-MIP-1α를 탐침으로 하여 섬광근접검색법(SPA)으로 CCR1 이나 CCR5를 발현하는 CHO 형질감염체(transfectant)로부터 얻은 막에서 실시한다. 경합물질은 표지되지 않은 케모킨을 결합 완충액에서 10^-6-10^-12 M 범위로 희석하여 준비한다. 사용된 결합 완충액은 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0.15 M NaCl, 0.5% BSA를 함유하는 50 mM HEPES, pH 7.2이다. Wheatgerm SPA 비드(Amersham)는 PBS에서 50 ㎎/㎖로 용해시키고 결합 완충액에서 10 ㎎/㎖로 희석하며, 이런 분석에서 최종 농도는 0.25 ㎎/웰이다. CCR1이나 CCR5를 발현하는 CHO 세포로부터 준비된 막은 -80℃로 저장하고 결합 완충액에서 80 ㎍/㎖로 희석한다. 각 용량의 막과 비드 원액은 분석을 실시하기에 앞서 혼합하여 백그라운드를 감소시킨다. 최종 막 농도는 2 ㎍/㎖이고, [¹²⁵I]-MIP-1α의 최종 농도는 0.1 nM이다. 평판은 진탕하면서 실온에서 4시간동안 배양한다. 방사성을 측정하고, 데이터는 헤파린-결합 분석에서 밝힌 바와 같이 분석한다.

f) 화학주성 분석

단핵구 화학주성은 마이크로-Boyden 챔버 분석으로 실시한다. 단핵구는 다음의 분리 과정을 활용하여 백혈구층(buffy coat)으로부터 정제한다: 100 ㎖ 백혈구층 용액은 100 ㎖ PBS로 희석하고 피콜에 층으로 만들며 실온에서 20분동안 600 x g로 원심분리한다. 경계면을 형성하는 세포는 수거하고 PBS로 2회 세척하며 5% 불활성화된 우태아 혈청(FCS), 2 mM 글루타민, 25 mM HEPES, pH 7.2를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 40-100 x 10⁶/㎖로 재부유시킨다. 이들은 10⁶ 양 적혈구 세포/ ㎖를 첨가하여 림프구 분취물로부터 추가로 정제하고 4℃에서 하룻밤동안 재정주시키며 실온에서 20분동안 900 x g로 이차 피콜 농도구배 원심분리하여 분리한다. 단핵구는 피콜과 완충액 사이의 경계면에서 발견되고, T 세포는 펠렛에 존재한다. 단핵구는 PBS에 세척하고 RPMI 1640 배지에서 2.5 x 10⁶/㎖로 재부유시킨다. 순도는 FACS 분석에 의해 전방과 측방 산란으로 측정하는데, 공여자에 40-80%에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 케모킨은 30 ㎕의 최종 부피로 희석하고, RPMI 배지에서 10^-6-10^-12 M의 농도 범위가 아래쪽 웰에 위치하도록 한다. 단핵구의 경우 5 ㎛ 구멍 크기, T 세포의 경우 8 ㎛ 구멍 크기를 갖는 필터(Neuroprobe)는 아래쪽 웰에 위치시켜 공기 버블이 존재하지 않고 시스템이 밀봉되도록 담보한다. RPMI 배지에 용해된 50 ㎖ 세포 현탁액(2.5 x 10⁶ 세포/㎖)은 위쪽 웰에 위치시킨다. 챔버는 O₂하에 37℃에서 단핵구의 경우 30분동안, T 세포의 경우 1.5시간동안 배양한다. 이후, 세포는 버리고, 막의 상층 표면은 문질러 세포를 제거하고, 막은 PBS로 세척한다. 막은 1분동안 MeOH에서 이멀젼(immersion)으로 고정시키고 공기 건조시키며 Field A와 B 용액으로 염색한다. 이동된 세포는 IBAS 이미지 분석 소프트웨어가 설치된 표준 현미경에서 20x 배율로 각 웰에 대하여 무작위 필드를 선택하여 계수한다. 데이터는 GraFit 소프트웨어로 합치시킨다.

g) 복막 세포 동원 분석

첫 번째 분석에서, 세포 동원은 0.2-㎖ 멸균 식염수(LPS-free Nacl)에 희석 된 10 ㎍ 케모킨을 8 내지 12주된 암컷 BALB/c 생쥐의 복막내 주사하여 유도한다. 케모킨 변이체(0.2 ㎖ 멸균 식염수에 희석된 10 ㎍ 케모킨)는 작용물질 투여 30분전에 투여한다. 16시간후, 생쥐는 에어로졸화된 CO₂로 희생시킨다. 복강 세척은 5 ㎖ PBS로 3회 실시하고, 세척액은 모은다. 세포는 10분동안 600 x g로 원심분리하고 1 ㎖ 최종 부피로 재부유시키며, 총 백혈구는 혈구계산기로 계수한다.

두 번째 분석에서, 세포 동원은 멸균수에 용해된 200 ㎕의 3% 티오글리콜레이트 용액을 8 내지 12주된 암컷 BALB/c 생쥐의 복막내 주사하여 유도한다(1일). 케모킨 변이체(0.2 ㎖ 멸균 식염수에 희석된 10 ㎍ 케모킨)는 티오글리콜레이트 투여 30분전에 투여한다. 케모킨 변이체는 3일(2일, 3일, 4일)동안 매일 투여한다. 생쥐는 5일째 에어로졸화된 CO₂로 희생시킨다. 복강 세척은 5 ㎖ PBS로 3회 실시하고, 세척액은 모은다. 세포는 10분동안 600 x g로 원심분리하고 1 ㎖ 최종 부피로 재부유시키며, 총 백혈구는 혈구계산기로 계수한다.

h) 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)

면역화 과정

18-22 g의 8주된 C57 BL/6NCrlBR 암컷 생쥐는 0.25 ㎎ 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 보유하는 완전 프레운드 어쥬번트[미코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 포함하는 CFA, Difco, Detriot, U.S.A]에 용해된 200 ㎍ MOG₃₅-₅₅ 펩티드(Neosystem, Strasbourg, France)를 함유하는 0.1 ㎖ 에멀젼을 목 뒷부분에 s.c. 주사하여 면역한다. s.c 주사에 앞서, 이들은 PBS에 용 해된 300 ng 백일해독소(pertussis toxin)를 꼬리 정맥에 200 ㎕ i.v. 주사한다. 2일째, 이들 동물은 300 ng 백일해독소를 2차 i.p. 주사한다.

이런 과정은 대략 8-10일째부터 시작하여 꼬리로부터 점진적으로 앞다리까지 진행성 마비를 유발한다.

연구 설계

본 연구에서 각 군은 10마리의 동물로 구성된다. 모든 군은 면역화 프로토콜에 따라, CFA에 용해된 MOG₃₅-₅₅ 펩티드 및 백일해독소로 면역한다.

1 군: i.p. 루트로 운반체 단독(PBS) 투여된 파지티브 대조군

2 군: s.c. 루트로 운반체 단독(PBS) 투여된 파지티브 대조군

3 군: 10 ㎍/생쥐 삼중 40' RANTES 변이체의 i.p. 투여

4 군: 1 ㎍/생쥐 삼중 40' RANTES 변이체의 i.p. 투여

5 군: 10 ㎍/생쥐 삼중 40' Met-RANTES 변이체의 i.p. 투여

6 군: 1 ㎍/생쥐 삼중 40' Met-RANTES 변이체의 i.p. 투여

7 군: 10,000 U/생쥐의 생쥐 재조합 인터페론 베타(m-IFN-β)의 s.c. 투여

8 군: 20,000 U/생쥐 m-IFN-β의 s.c. 투여

운반체

PBS는 RANTES 40' 삼중 변이체, Met-RANTES 40' 삼중 변이체, mIFN-β를 적합한 농도로 희석하는데 사용된다.

투여 루트

삼중 40' RANTES 변이체, 삼중 40' Met-RANTES 변이체, m-IFN-β는 200 ㎕/생쥐의 투여 용량으로 매일 i.p. 투여한다. 1,2 군은 200 ㎕/생쥐 PBS를 i.p. 투여한다.

치료 기간

치료는 실험 4일째(발병으로부터 대략 3-5일 이전)에 시작하고 14일동안 지속한다(실험 18일째 동물의 희생).

임상적 관찰

5일째부터 시작하여 모든 동물은 다음과 같은 임상적 스코어로 마비의 존재를 개별적으로 검사한다:

0 = 병의 징후 없음

0.5 = 부분적인 꼬리 마비

1 = 꼬리 마비

1.5 = 꼬리 마비 + 부분적인 일측의 뒷다리 마비

2 = 꼬리 마비 + 뒷다리의 약화 또는 부분적인 마비

2.5 = 꼬리 마비 + 부분적인 뒷다리 마비(처진 골반)

3 = 꼬리 마비 + 완전한 뒷다리 마비

3.5 = 꼬리 마비 + 완전한 뒷다리 마비 + 요실금

4 = 꼬리 마비 + 뒷다리 마비 + 앞다리의 약화 또는 부분적인 마비

5 = 사망

2. 결과

a) 헤파린 결합 분석

한 위치 또는 세 위치에서 돌연변이된 정제된 RANTES 단백질은 헤파린 크로마토그래피로 분석하고, 이들을 용출하는데 필요한 NaCl의 농도는 WT RANTES의 용출 프로필과 비교한다. 헤파린과의 상호작용은 정전(electrostatic)이기 때문에, 이들 변이체 역시 MonoS 칼럼에서 양이온 교환 크로마토그래피로 처리한다. 이는 이들을 용출하는데 필요한 NaCl 농도의 감소를 결과하는데, 그 이유는 이런 돌연변이유발이 염기성 잔기를 제거하기 때문이다. 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 NaCl 농도에서의 차이는 헤파린 크로마토그래피에서 얻은 농도에서의 차이로부터 감한다. 이 값이 파지티브이면, 헤파린과의 특이적인 상호작용이 존재한다(표 1).

경합 결합 분석동안 삼중 40'와 50' RANTES 변이체에서 헤파린에 대한 결합을 직접 측정한다. WT RANTES와 상기 변이체는 Amersham으로 요오드화시키는데, 이들 모두 2,200 mCi/mole의 동일한 특이적 방사성을 보유하였다. 하지만, 삼중 40' 변이체중에서 20% 정도만 헤파린 비드에 결합하고, 최대 cpm 값은 WT RANTES와 50' 변이체의 20,000 cpm과 비교하여 4,000 cpm이었다. 이는 돌연변이된 40' 루프에서 이들 잔기가 RANTES의 헤파린 결합 능력에 상당히 기여한다는 것을 입증한다. 다른 한편, 이는 50' 루프에서 추정 GAG-결합 모티프가 "진실한" GAG-결합 부위가 아니라는 것을 입증한다.

b) 평형 경합 수용체 결합 분석

CHO 안정적 형질감염체로부터 준비한 막에서 재조합 CCR1과 CCR5와의 결합에 대하여 [¹²⁵I] MIP-1α와 경합하는 삼중 40'와 삼중 50' RANTES 변이체의 능력을 분석한다. 양 수용체에서 단일 돌연변이간에 현저한 차이는 없었다. 삼중 변이체는 WT RANTES 단백질과 비교하여 CCR5와의 결합에서 차이를 전혀 보이지 않았다. 하지만, CCR1에서 삼중 40' 변이체는 친화성의 100-배 감소를 보이고, 반면 삼중 50' 변이체는 적은(3-배) 친화성 감소를 보였다(도 4).

c) 화학주성 분석

삼중 40'와 50' 변이체는 1 μM에서만 현저한 화학주성을 유도할 수 있는 삼중 40' 변이체를 제외하고 WT RANTES에 필적하는 활성으로 단핵구 화학주성을 유도할 수 있었다. 하지만, 삼중 40'와 50' 변이체는 T 세포 화학주성을 유도하는 능력에서는 동등하였다(도 5).

단핵구 화학주성 분석에서 얻은 결과는 수용체 결합 분석에서 얻은 결과와 일치한다. 단핵구 화학주성에 대한 삼중 40' RANTES 변이체의 활성 상실은 CCR1에 대한 친화성 상실과 일치한다.

d) 복막 세포 동원 분석

삼중 40' RANTES 변이체는 RANTES가 실질적인 동원을 유발하는 용량(10 ㎍/생쥐)에서 복막으로의 세포 동원을 유도할 수 없었다.

이에 더하여, RANTES 투여 30분전에 10 ㎍ 변이체가 투여되는 경우에, RANTES에 의해 유도되는 세포 동원이 저해되었다. 따라서, GAG-결합의 파괴는 생체내에서 케모킨-유도된 세포 동원의 저해물질을 결과하였다.

절두된 RANTES(3-68) 삼중 40' 변이체[피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 생산], MIP-1β삼중 40' 변이체(K45A-R46A-K48A), MIP-1α삼중 40' 변이체(R18A-R46A-K48A)에서 얻은 유사한 결과는 각각 도 7,8,9에 도시한다. 도 10에 도시한 바와 같이, 삼중 40' RANTES 변이체에 의해 티오글리콜레이트에 의해 촉진된 세포 동원 역시 저해되었다.

e) 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)

삼중 40' RANTES 변이체는 뮤린 EAE 모델에서 약량-관련된 효과를 보였다. 상기 단백질은 MOG로 1차 면역후 10일째부터 매일 1 ㎍과 10 ㎍/생쥐 i.p. 투여하는데, 참고 치료물질, 재조합 m-IFN-β에 필적하는 효능을 보였다(도 11). 병의 발병이 현저하게 지연되었고 질환 심각도(곡선 아래 영역으로 평가) 역시 현저하게 감소하였다. 게다가, 실험동안 도달된 최대 임상적 스코어의 평균이 감소하였다. 다른 변이체(삼중 40' Met-RANTES 변이체)는 동일 실험에서 유익한 효과를 보이지 않았다.

이런 결과는 40' RANTES 삼중 변이체를 이용한 치료의 유익한 효과를 입증하는데, 상기 변이체는 MOG 면역후 생쥐에서 만성적 EAE의 임상적 징후를 감소시킨다. 따라서, 삼중 40' RANTES 변이체는 유익한 치료 효과를 보이고 MS와 같은 만성 탈수초성 질환에서 치료 약물로 사용될 수 있다.

표 1. 헤파린과 Mono-S(양이온 교환) 칼럼으로부터 용출을 위한 NaCl 몰농도

RANTES 돌연변이	헤파린	MonoS	△NaCl^Hep-S	△NaCl^Monoe-S	△△NaCl
No(WT)	0.80	0.91	------	------	------
R44A	0.61	0.82	0.19	0.09	0.10
K45A	0.65	0.97	0.15	0.04	0.11
R47A	0.65	0.84	0.15	0.07	0.08
R44A-K45A-R47A	0.47	0.70	0.33	0.21	0.11
K55A	0.70	0.86	0.10	0.05	-0.05
K56A	0.90	0.94	-0.10	0.07	-0.17
R59A	0.79	0.85	0.01	0.06	-0.05
K55A-K56A-R59A	0.70	0.75	0.10	0.16	-0.06

다음의 표 2는 서열 리스트와 전체 명세서에서 보고된 서열의 본질을 명확하게 설명한다

SEQ ID NO:	서열 설명
1	야생형(WT) RANTES
2	삼중 40' RANTES 변이체
3	삼중 40' RANTES(3-68) 변이체
4	삼중 MIP-1-알파 변이체(R18A-R46A-R48A)
5	삼중 MIP-1-베타 변이체(K45A-R46A-K48A)
6	삼중 50' RANTES 변이체
7	삼중 40' Met-RANTES 변이체
8	R44A-RANTES 변이체
9	K45A-RANTES 변이체
10	K47A-RANTES 변이체
11	K55A-RANTES 변이체
12	K56A-RANTES 변이체
13	K59A-RANTES 변이체
14	프라이머 P1
15	프라이머 P2
16	프라이머 P3
17	프라이머 P4
18	프라이머 P5
19	프라이머 P6
20	프라이머 P7
21	프라이머 P8
22	프라이머 P9
23	프라이머 P10
24	프라이머 P11
25	프라이머 P12
26	프라이머 P13
27	프라이머 P14
28	프라이머 P15
29	프라이머 P16
30	WT-1309
31	WT-MIP-1-알파
32	WT-MIP-1-베타
33	WT-MIP-4
34	WT-MIP-5
35	WT-HCC1
36	WT-I36512
37	WT-MCP-2

<110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. <120> CHEMOKINES MUTANTS IN THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS <130> WO465 <160> 37 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 1 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 2 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 2 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Ala Ala Asn Ala Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 3 <211> 66 <212> PRT <213> Pichia Pastoris <400> 3 Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro 1 5 10 15 Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys 20 25 30 Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gln Val Cys 35 40 45 Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu 50 55 60 Met Ser 65 <210> 4 <211> 70 <212> PRT <213> Escherichia Coli <400> 4 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Ala Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Ala Ser Ala 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 5 <211> 69 <212> PRT <213> Escherichia Coli <400> 5 Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Ala Ala Ser Ala 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Asn 65 <210> 6 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 6 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Ala Ala Trp 65 70 75 80 Val Ala Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 7 <211> 92 <212> PRT <213> Escherichia Coli <400> 7 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Met Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr 20 25 30 Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile 35 40 45 Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val 50 55 60 Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys 65 70 75 80 Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 8 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 8 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Ala Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 9 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Ala Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 10 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 10 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Ala Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 11 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 11 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Ala Lys Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 12 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 12 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Ala Trp 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 13 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 13 Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Val Ala Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 tttgtcaccg caaagaaccg ccaag 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 gacgactgct gggttggagc acttg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 tttgtcaccc gagcgaaccg ccaag 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 gacgactgct gggttggagc acttg 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 18 cgaaagaacg cccaagtgtg tgcca 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 19 ggtgacaaag acgactgctg ggttg 25 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 tttgtcaccg cagcgaacgc ccaagtgtgt gccaac 36 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 21 gacgactgct gggttggagc acttgcc 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 22 gccaacccag aggcgaaatg ggttcgg 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 23 acacacttgg cggttctttc gggtgac 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 24 aacccagaga aggcatgggt tcgggag 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 25 ggcacacact tggcggttct ttcgggt 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 26 aagaaatggg ttgcggagta catcaac 27 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 27 ctctgggttg gcacacactt ggcg 24 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 28 gccaacccag aggcggcatg ggttgcggag tacatc 36 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 29 acacacttgg cggttctttc gggtgacaaa gac 33 <210> 30 <211> 74 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 30 Ser Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala 1 5 10 15 Glu Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser 20 25 30 Ser Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys 35 40 45 Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys 50 55 60 Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys 65 70 <210> 31 <211> 70 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 31 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 32 <211> 68 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 32 Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys 20 25 30 Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys 35 40 45 Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys 50 55 60 Pro Tyr Ser Ile 65 <210> 33 <211> 68 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 33 Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp 1 5 10 15 Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln 20 25 30 Cys Pro Lys Leu Gly Val Ile Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp Leu 50 55 60 Lys Leu Asn Ala 65 <210> 34 <211> 76 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 34 Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser 20 25 30 Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg 35 40 45 Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met 50 55 60 Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 75 <210> 35 <211> 74 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 35 Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys 1 5 10 15 Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp 20 25 30 Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile 35 40 45 Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val 50 55 60 Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn 65 70 <210> 36 <211> 96 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 36 Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu Lys 1 5 10 15 Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg Lys 20 25 30 Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg Asn 35 40 45 Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr Ile 50 55 60 Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val 65 70 75 80 Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser Gln 85 90 95 <210> 37 <211> 76 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 37 Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr 20 25 30 Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly 35 40 45 Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro 65 70 75

Claims

SEQ ID NO:2의 24 내지 91번 잔기를 가지거나 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 사람 RANTES(Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and Secreted) 돌연변이체.
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RANTES(Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and Secreted) 돌연변이체를 활성 성분으로 포함하며 다발성 경화증 치료용 약학 조성물에 있어서, 돌연변이체는 SEQ ID NO:2의 24 내지 91번 잔기를 가지거나 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지며, 와일드 타입에 비해 GAG(Glycosaminoglycans)-결합 활성이 감소된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 9 항에 있어서, 약학적으로 수용가능한 부형제를 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 10 항에 따른 돌연변이된 RANTES를 코딩하는 DNA 서열로 구성되는 DNA 분자.
제 11 항의 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 12 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항의 RANTES 돌연변이체를 제조하기 위한 재조합 방법에 있어서, 적합한 배양 배지에서 제 13항의 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.