JP2002053490A - マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１γ - Google Patents
マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１γInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトマクロファージ炎症蛋白質−３、ヒトマ
クロファージ炎症蛋白質−４、ヒトマクロファージ炎症
蛋白質−１γポリペプチドおよびこのポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を提供する。 【解決手段】組換え技術によるこれらポリペプチドの製
法およびこれらのポリペプチドに対する抗体の製法も提
供する。本発明ではこれらポリペプチドの機能を阻止す
るものであるこれらポリペプチドに対する拮抗剤／阻害
剤も提供する。本発明の別の側面では種々の関連疾患の
処置のために治療的有効量のポリペプチドを提供するた
めに本発明のポリペプチドと適当な医薬的担体との組合
せを提供する。
クロファージ炎症蛋白質−４、ヒトマクロファージ炎症
蛋白質−１γポリペプチドおよびこのポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を提供する。 【解決手段】組換え技術によるこれらポリペプチドの製
法およびこれらのポリペプチドに対する抗体の製法も提
供する。本発明ではこれらポリペプチドの機能を阻止す
るものであるこれらポリペプチドに対する拮抗剤／阻害
剤も提供する。本発明の別の側面では種々の関連疾患の
処置のために治療的有効量のポリペプチドを提供するた
めに本発明のポリペプチドと適当な医薬的担体との組合
せを提供する。
Description
【０００１】この発明は新規に確認したポリヌクレオチ
ド、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、
これらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法、
ならびにこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
製法に関する。さらに特定的には、本発明のポリペプチ
ドはヒトのマクロファージ炎症蛋白質−３（ＭＩＰ−
３）、マクロファージ炎症蛋白質−４（ＭＩＰ−４）お
よびマクロファージ炎症蛋白質−１γである。本発明は
このようなポリペプチドの作用の阻止にも関連する。
ド、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、
これらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法、
ならびにこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
製法に関する。さらに特定的には、本発明のポリペプチ
ドはヒトのマクロファージ炎症蛋白質−３（ＭＩＰ−
３）、マクロファージ炎症蛋白質−４（ＭＩＰ−４）お
よびマクロファージ炎症蛋白質−１γである。本発明は
このようなポリペプチドの作用の阻止にも関連する。
【０００２】マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ類）
は、たとえばグラム陰性菌、リポ多糖類およびコンカナ
バリンＡのような、刺激に反応して、例えばマクロファ
ージおよびリンパ球など、ある種の哺乳類細胞によって
生産される蛋白質である。そこで、ＭＩＰ分子は感染
症、癌、炎症、造血機能障害、および自己免疫疾患の検
出および処置のために診断的および治療的有用性を持つ
であろう。ネズミＭＩＰ−１は、リポ多糖類で刺激され
たネズミマクロファージ腫瘍細胞系ＲＡＷ２６４．７か
らの主要な分泌蛋白質である。これは精製され、関連蛋
白質２種、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βから構成さ
れることが発見された。
は、たとえばグラム陰性菌、リポ多糖類およびコンカナ
バリンＡのような、刺激に反応して、例えばマクロファ
ージおよびリンパ球など、ある種の哺乳類細胞によって
生産される蛋白質である。そこで、ＭＩＰ分子は感染
症、癌、炎症、造血機能障害、および自己免疫疾患の検
出および処置のために診断的および治療的有用性を持つ
であろう。ネズミＭＩＰ−１は、リポ多糖類で刺激され
たネズミマクロファージ腫瘍細胞系ＲＡＷ２６４．７か
らの主要な分泌蛋白質である。これは精製され、関連蛋
白質２種、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βから構成さ
れることが発見された。
【０００３】いくつかの研究グループがＭＩＰ−１αお
よびＭＩＰ−１βのヒト同族体であるらしいものをクロ
ーニングしている。これら全ての場合に、ｃＤＮＡは活
性化Ｔ細胞ＲＮＡに対して製造したライブラリーから分
離された。
よびＭＩＰ−１βのヒト同族体であるらしいものをクロ
ーニングしている。これら全ての場合に、ｃＤＮＡは活
性化Ｔ細胞ＲＮＡに対して製造したライブラリーから分
離された。
【０００４】マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ−１α
およびＭＩＰ−１β）はプロ炎症的性質を示すことが証
明されている。ＭＩＰ−１αはヒト好酸球および単球に
遊走および活性化を誘発し、またマクロファージに化学
走化性を誘発できる。これに加え、ネズミＭＩＰ−１α
はヒトの造血幹細胞の増殖に抑制的効果を示すが、ネズ
ミＭＩＰ−１βはＭＩＰ−１αの阻止効果を消去でき
る。最後に、ＭＩＰ−１蛋白質は早期傷害炎症細胞に検
出でき、傷害線維芽細胞からのＩＬ−１とＩＬ−６との
生産を誘導することが証明されている。
およびＭＩＰ−１β）はプロ炎症的性質を示すことが証
明されている。ＭＩＰ−１αはヒト好酸球および単球に
遊走および活性化を誘発し、またマクロファージに化学
走化性を誘発できる。これに加え、ネズミＭＩＰ−１α
はヒトの造血幹細胞の増殖に抑制的効果を示すが、ネズ
ミＭＩＰ−１βはＭＩＰ−１αの阻止効果を消去でき
る。最後に、ＭＩＰ−１蛋白質は早期傷害炎症細胞に検
出でき、傷害線維芽細胞からのＩＬ−１とＩＬ−６との
生産を誘導することが証明されている。
【０００５】ＭＩＰ−１類はケモカイン族の一部であり
炎症または傷害の治癒、免疫抑制に関連する多数の機能
を示し、また多数の疾患状態において活発な役割を演じ
る。さらに、ＭＩＰ−１は造血器官の強化効果を示すこ
とが発見されている。Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．な
ど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻：１５８３〜９４
頁（１９８９年）およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．
など、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：１１１０〜６頁（１９９０
年）。
炎症または傷害の治癒、免疫抑制に関連する多数の機能
を示し、また多数の疾患状態において活発な役割を演じ
る。さらに、ＭＩＰ−１は造血器官の強化効果を示すこ
とが発見されている。Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．な
ど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻：１５８３〜９４
頁（１９８９年）およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．
など、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：１１１０〜６頁（１９９０
年）。
【０００６】ＭＩＰ−１の生物活性の定義は広範に研究
され、天然ＭＩＰ−１および、極く最近には組換えＭＩ
Ｐ−１αおよびＭＩＰ−１βを使用されてきた。精製天
然ＭＩＰ−１（ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ
−１βポリペプチドを含む）はマウスの足蹠に皮下注射
するか、またはウサギの脳脊髄液に脳槽内注射すると
（ＷｏｌｐｅとＣｅｒａｍｉ、１９８９年、ＦＡＳＥＢ
・Ｊ．、３巻：２５６５〜７３頁）、急性の炎症を起こ
す。直接的または間接的でありうるＭＩＰ−１のこれら
プロ炎症的性質に加え、無菌傷害房を採用する実験マウ
スモデルにおける傷害治癒の早期炎症相の間にＭＩＰが
回収されている（Ｆａｈｅｙなど、１９９０年、Ｃｙｔ
ｏｋｉｎｅ、２巻：９２頁）。例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社
が出願したＰＣＴ出願・米国９１／０６４８９は、酵母
における哺乳類マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ類）
のための鋳型として活性なＤＮＡ分子を開示している。
ネズミのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは別物だが、
近縁のサイトカインである。この蛋白質２種の部分的に
精製した混合物は好中球の機能に影響を与え、局所的な
炎症と発熱とを起こす。ＭＩＰ−１αの特殊な性質は造
血幹細胞増殖の阻止に一致するものとして確認されてい
る。ＭＩＰ−１αは酵母細胞中に発現され、均質まで精
製されている。構造的分析ではＭＩＰ−１αは血小板第
４因子およびインターロイキン８に非常に類似した第二
次および第三次構造を示すが、配列の相同性は限定され
たものであることが確認されている。ＭＩＰ−１αは試
験管内で幹細胞を阻止する性質を示すことが発見されて
いる。また、ＭＩＰ−１αは後続する試験管内でのトリ
チオ化チミジンによる殺細胞作用からマウスの幹細胞を
生体内で保護することについて活性なことが証明されて
いる。ＭＩＰ−１αが顆粒球のマクロファージコロニー
刺激因子に反応して前駆顆粒球マクロファージコロニー
形成細胞の増殖を強化することも証明されている。Ｃｌ
ｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｍ．など、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４巻：
７６〜８２頁（１９９２年）。
され、天然ＭＩＰ−１および、極く最近には組換えＭＩ
Ｐ−１αおよびＭＩＰ−１βを使用されてきた。精製天
然ＭＩＰ−１（ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ
−１βポリペプチドを含む）はマウスの足蹠に皮下注射
するか、またはウサギの脳脊髄液に脳槽内注射すると
（ＷｏｌｐｅとＣｅｒａｍｉ、１９８９年、ＦＡＳＥＢ
・Ｊ．、３巻：２５６５〜７３頁）、急性の炎症を起こ
す。直接的または間接的でありうるＭＩＰ−１のこれら
プロ炎症的性質に加え、無菌傷害房を採用する実験マウ
スモデルにおける傷害治癒の早期炎症相の間にＭＩＰが
回収されている（Ｆａｈｅｙなど、１９９０年、Ｃｙｔ
ｏｋｉｎｅ、２巻：９２頁）。例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社
が出願したＰＣＴ出願・米国９１／０６４８９は、酵母
における哺乳類マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ類）
のための鋳型として活性なＤＮＡ分子を開示している。
ネズミのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは別物だが、
近縁のサイトカインである。この蛋白質２種の部分的に
精製した混合物は好中球の機能に影響を与え、局所的な
炎症と発熱とを起こす。ＭＩＰ−１αの特殊な性質は造
血幹細胞増殖の阻止に一致するものとして確認されてい
る。ＭＩＰ−１αは酵母細胞中に発現され、均質まで精
製されている。構造的分析ではＭＩＰ−１αは血小板第
４因子およびインターロイキン８に非常に類似した第二
次および第三次構造を示すが、配列の相同性は限定され
たものであることが確認されている。ＭＩＰ−１αは試
験管内で幹細胞を阻止する性質を示すことが発見されて
いる。また、ＭＩＰ−１αは後続する試験管内でのトリ
チオ化チミジンによる殺細胞作用からマウスの幹細胞を
生体内で保護することについて活性なことが証明されて
いる。ＭＩＰ−１αが顆粒球のマクロファージコロニー
刺激因子に反応して前駆顆粒球マクロファージコロニー
形成細胞の増殖を強化することも証明されている。Ｃｌ
ｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｍ．など、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４巻：
７６〜８２頁（１９９２年）。
【０００７】ＭＩＰ−１αは６〜８ｋｄの、リポ多糖類
誘発性の単球、好中球および好酸球の化学走化性蛋白質
である。ＭＩＰ−１αはヒトの好酸性顆粒球の遊走およ
び活性化も誘発できる。ＭＩＰ−１αは急性的および慢
性的炎症において重要であるかもしれない。肺臓肉芽腫
形成の間に起きる同期化マンソン住血吸虫におけるネズ
ミＭＩＰ−１αの逐次的生産、起源、および生体内の寄
与が測定されている。Ｌｕｋａｃｓ，Ｎ．Ｗ．など、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１５５１〜９頁（１
９９３年）。
誘発性の単球、好中球および好酸球の化学走化性蛋白質
である。ＭＩＰ−１αはヒトの好酸性顆粒球の遊走およ
び活性化も誘発できる。ＭＩＰ−１αは急性的および慢
性的炎症において重要であるかもしれない。肺臓肉芽腫
形成の間に起きる同期化マンソン住血吸虫におけるネズ
ミＭＩＰ−１αの逐次的生産、起源、および生体内の寄
与が測定されている。Ｌｕｋａｃｓ，Ｎ．Ｗ．など、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１５５１〜９頁（１
９９３年）。
【０００８】本発明の一側面に従えば、ＭＩＰ−３、Ｍ
ＩＰ−４、ＭＩＰ−１γ、ならびにそれらの類縁体およ
び誘導体である新規成熟ポリペプチドが提供される。本
発明のＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１γは
ヒト起源である。
ＩＰ−４、ＭＩＰ−１γ、ならびにそれらの類縁体およ
び誘導体である新規成熟ポリペプチドが提供される。本
発明のＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１γは
ヒト起源である。
【０００９】本発明のさらに別の側面に従えば、このよ
うなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）が提供される。
うなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）が提供される。
【００１０】本発明のなお別の側面に従えば、このよう
なポリペプチドを組換え技術によって製造する方法が提
供される。
なポリペプチドを組換え技術によって製造する方法が提
供される。
【００１１】本発明のさらに別の側面に従えば、これら
ポリペプチド、またはこれらポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを、例えば、炎症活性、造血およびリ
ンパ球輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を含む免疫制
御、骨髄幹細胞コロニー形成の阻止、乾癬、固形癌の処
置および耐性慢性感染症に対する宿主防御の強化など、
治療目的のために利用する方法が提供される。
ポリペプチド、またはこれらポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを、例えば、炎症活性、造血およびリ
ンパ球輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を含む免疫制
御、骨髄幹細胞コロニー形成の阻止、乾癬、固形癌の処
置および耐性慢性感染症に対する宿主防御の強化など、
治療目的のために利用する方法が提供される。
【００１２】本発明のさらに別の側面に従えば、これら
のポリペプチドに対する抗体が提供される。
のポリペプチドに対する抗体が提供される。
【００１３】本発明のさらに別の側面に従えば、例えば
動脈硬化症、自己免疫性および慢性炎症および感染性疾
患、ヒスタミン介在アレルギー反応、好酸球増加症候
群、珪肺症、類肉腫症状、肺臓炎症性疾患、ＩＬ１およ
びＴＮＦの阻害、再生不良性貧血、および骨髄形成異常
症候群などにおける処置において、これらポリペプチド
の作用を阻止するために使用しうる、これらポリペプチ
ドに対する拮抗剤／阻害剤が提供される。本発明のこれ
らおよびその他の側面はここに教示するものから当業者
には明瞭となる筈である。
動脈硬化症、自己免疫性および慢性炎症および感染性疾
患、ヒスタミン介在アレルギー反応、好酸球増加症候
群、珪肺症、類肉腫症状、肺臓炎症性疾患、ＩＬ１およ
びＴＮＦの阻害、再生不良性貧血、および骨髄形成異常
症候群などにおける処置において、これらポリペプチド
の作用を阻止するために使用しうる、これらポリペプチ
ドに対する拮抗剤／阻害剤が提供される。本発明のこれ
らおよびその他の側面はここに教示するものから当業者
には明瞭となる筈である。
【００１４】下記の図面は本発明の態様の例示であっ
て、請求項によって包含される本発明範囲の限定を意味
するものではない。図１はＭＩＰ−３をコードするｃＤ
ＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸配列
を図示する。最初のアミノ酸４５個は演繹された推測上
のリーダー配列を示す。図２はＭＩＰ−４をコードする
ｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸
配列を図示する。最初のアミノ酸１９個は演繹された推
測上のリーダー配列を示す。図３はＭＩＰ−１αの部分
に照準を合わせたＭＩＰ−３の演繹されたアミノ酸配列
の一部に対応する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−３アミ
ノ酸配列であり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αであ
る（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆
体）。図４はアミノ酸配列２個を図示し、上段の配列は
ヒトＭＩＰ−４アミノ酸配列であり、下段の配列はヒト
のＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベ
ータ蛋白質前駆体）。図５は大腸菌の細菌発現系内での
発現後に精製したＭＩＰ−４蛋白質に対応する蛋白質バ
ンドを示す。図６はＭＩＰ−４のノーザンブロット分析
であって、この蛋白質が最も共通に存在する細胞を示
す。図７はｐＱＥ−９ベクターの模式図である。図８は
ＭＩＰ−１γをコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対
応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最初のアミ
ノ酸２４個は演繹されたリーダー配列を示す。図９はヒ
トＭＩＰ−１蛋白質の部分アミノ酸配列２個を図示す
る。上段の配列はヒトのＭＩＰ−１γであり、下段の配
列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球Ｌ
Ｄ７８ベータ蛋白質前駆体）。図１０は細菌発現系にお
ける発現および精製後のＭＩＰ−１γ蛋白質に対応する
レーン５における蛋白質バンドを示す。図１１はＭＩＰ
−１γのＣＯＳ発現に対応する蛋白質バンドを示す。図
１２はＭＩＰ−１γのノーザンブロット分析であって、
この蛋白質が最も共通に存在する組織を示す。
て、請求項によって包含される本発明範囲の限定を意味
するものではない。図１はＭＩＰ−３をコードするｃＤ
ＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸配列
を図示する。最初のアミノ酸４５個は演繹された推測上
のリーダー配列を示す。図２はＭＩＰ−４をコードする
ｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸
配列を図示する。最初のアミノ酸１９個は演繹された推
測上のリーダー配列を示す。図３はＭＩＰ−１αの部分
に照準を合わせたＭＩＰ−３の演繹されたアミノ酸配列
の一部に対応する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−３アミ
ノ酸配列であり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αであ
る（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆
体）。図４はアミノ酸配列２個を図示し、上段の配列は
ヒトＭＩＰ−４アミノ酸配列であり、下段の配列はヒト
のＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベ
ータ蛋白質前駆体）。図５は大腸菌の細菌発現系内での
発現後に精製したＭＩＰ−４蛋白質に対応する蛋白質バ
ンドを示す。図６はＭＩＰ−４のノーザンブロット分析
であって、この蛋白質が最も共通に存在する細胞を示
す。図７はｐＱＥ−９ベクターの模式図である。図８は
ＭＩＰ−１γをコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対
応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最初のアミ
ノ酸２４個は演繹されたリーダー配列を示す。図９はヒ
トＭＩＰ−１蛋白質の部分アミノ酸配列２個を図示す
る。上段の配列はヒトのＭＩＰ−１γであり、下段の配
列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球Ｌ
Ｄ７８ベータ蛋白質前駆体）。図１０は細菌発現系にお
ける発現および精製後のＭＩＰ−１γ蛋白質に対応する
レーン５における蛋白質バンドを示す。図１１はＭＩＰ
−１γのＣＯＳ発現に対応する蛋白質バンドを示す。図
１２はＭＩＰ−１γのノーザンブロット分析であって、
この蛋白質が最も共通に存在する組織を示す。
【００１５】本発明の一側面に従えば、図１、２および
８の演繹されたアミノ酸配列を持つ成熟ポリペプチドを
コードするか、または１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄
託番号７５６７６として寄託したクローンのｃＤＮＡが
コードする成熟ＭＩＰ−３ポリペプチド、および１９９
４年２月９日にＡＴＣＣ寄託番号７５６７５として寄託
したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−４ポ
リペプチド、および１９９３年１０月１３日にＡＴＣＣ
寄託番号７５５７２として寄託したクローンのｃＤＮＡ
がコードする成熟ＭＩＰ−１γポリペプチドをコードす
る単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
８の演繹されたアミノ酸配列を持つ成熟ポリペプチドを
コードするか、または１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄
託番号７５６７６として寄託したクローンのｃＤＮＡが
コードする成熟ＭＩＰ−３ポリペプチド、および１９９
４年２月９日にＡＴＣＣ寄託番号７５６７５として寄託
したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−４ポ
リペプチド、および１９９３年１０月１３日にＡＴＣＣ
寄託番号７５５７２として寄託したクローンのｃＤＮＡ
がコードする成熟ＭＩＰ−１γポリペプチドをコードす
る単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【００１６】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは構造的にはサイトカインまたはケモカイン
族内にあるプロ炎症超遺伝子「インタークリン（ｉｎｔ
ｅｒｃｒｉｎｅ）」に関連する。ＭＩＰ−３およびＭＩ
Ｐ−４はともにＭＩＰ−１の同族体であって、ＭＩＰ−
１βよりもＭＩＰ−１αに相同的である。ＭＩＰ−３を
コードするポリヌクレオチドは大動脈内皮のｃＤＮＡラ
イブラリーから誘導されたもので、アミノ酸残基１２１
個のポリペプチドをコードするオープン読み枠を含み、
これはケモカイン多数に明瞭な相同性を示す。最高の一
致はヒトのマクロファージ炎症蛋白質１αへのものであ
って、３６％の同一性と６６％の類似性とを示す（図
３）。
クレオチドは構造的にはサイトカインまたはケモカイン
族内にあるプロ炎症超遺伝子「インタークリン（ｉｎｔ
ｅｒｃｒｉｎｅ）」に関連する。ＭＩＰ−３およびＭＩ
Ｐ−４はともにＭＩＰ−１の同族体であって、ＭＩＰ−
１βよりもＭＩＰ−１αに相同的である。ＭＩＰ−３を
コードするポリヌクレオチドは大動脈内皮のｃＤＮＡラ
イブラリーから誘導されたもので、アミノ酸残基１２１
個のポリペプチドをコードするオープン読み枠を含み、
これはケモカイン多数に明瞭な相同性を示す。最高の一
致はヒトのマクロファージ炎症蛋白質１αへのものであ
って、３６％の同一性と６６％の類似性とを示す（図
３）。
【００１７】ＭＩＰ−４をコードするポリヌクレオチド
は成人肺臓のｃＤＮＡライブラリーから誘導されたもの
で、アミノ酸残基８９個のポリペプチドをコードするオ
ープン読み枠を含み、これはケモカイン多数に明瞭な相
同性を示す。最高の同一性はヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７
８β蛋白質へのものであって、６０％の同一性と８９％
の類似性を示す（図４）。その上、特徴的モチーフとし
て全ケモカインに存在するシステイン残基４個は両クロ
ーンに保存されている。我々の遺伝子では最初のシステ
イン２個が隣接する位置にあるという事実は、これをケ
モカインの「Ｃ−Ｃ」またはβ−サブファミリーに分類
する。「ＣＸＣ」またはαサブファミリーと呼ばれる別
種のサブファミリーでは、最初のシステイン残基２個は
アミノ酸１個だけ隔離されている。
は成人肺臓のｃＤＮＡライブラリーから誘導されたもの
で、アミノ酸残基８９個のポリペプチドをコードするオ
ープン読み枠を含み、これはケモカイン多数に明瞭な相
同性を示す。最高の同一性はヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７
８β蛋白質へのものであって、６０％の同一性と８９％
の類似性を示す（図４）。その上、特徴的モチーフとし
て全ケモカインに存在するシステイン残基４個は両クロ
ーンに保存されている。我々の遺伝子では最初のシステ
イン２個が隣接する位置にあるという事実は、これをケ
モカインの「Ｃ−Ｃ」またはβ−サブファミリーに分類
する。「ＣＸＣ」またはαサブファミリーと呼ばれる別
種のサブファミリーでは、最初のシステイン残基２個は
アミノ酸１個だけ隔離されている。
【００１８】ＭＩＰ−１γをコードするポリヌクレオチ
ドはアミノ酸残基９３個のポリペプチドをコードするオ
ープン読み枠を含み、ヒトのマクロファージおよび霊長
類の蛋白質−αにはアミノ酸８０個の長さにわたって４
８％の同一性と７２％の類似性とを示す明瞭な相同性を
示し、マウスのＭＩＰ−１βにはアミノ酸８２個の領域
にわたって４６％の同一性と６７％の類似性とを示す明
瞭な相同性を示す。さらに、特徴的モチーフを含むシス
テイン残基４個が保存されている。本発明のポリヌクレ
オチドはＲＮＡの形またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、お
よび合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形でありうる。このＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖でありうるし、およびもし一本
鎖ならコード鎖または非コード鎖（アンチセンス）鎖で
もありうる。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は図１および図２に示すコード配列または寄託したクロ
ーンのものと同一でありうるし、またはそのコード配列
が重複性または縮退性の結果として、図１および図２の
ＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチド
をコードする、相異なるコード配列でもありうる。
ドはアミノ酸残基９３個のポリペプチドをコードするオ
ープン読み枠を含み、ヒトのマクロファージおよび霊長
類の蛋白質−αにはアミノ酸８０個の長さにわたって４
８％の同一性と７２％の類似性とを示す明瞭な相同性を
示し、マウスのＭＩＰ−１βにはアミノ酸８２個の領域
にわたって４６％の同一性と６７％の類似性とを示す明
瞭な相同性を示す。さらに、特徴的モチーフを含むシス
テイン残基４個が保存されている。本発明のポリヌクレ
オチドはＲＮＡの形またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、お
よび合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形でありうる。このＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖でありうるし、およびもし一本
鎖ならコード鎖または非コード鎖（アンチセンス）鎖で
もありうる。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は図１および図２に示すコード配列または寄託したクロ
ーンのものと同一でありうるし、またはそのコード配列
が重複性または縮退性の結果として、図１および図２の
ＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチド
をコードする、相異なるコード配列でもありうる。
【００１９】図１、図２および図８の成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドまたは寄託したｃＤＮＡ
がコードする成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドには：成熟ポリペプチドのコード配列のみ、成熟
ポリペプチドのコード配列およびたとえばリーダー配列
または分泌配列またはプロ蛋白質配列のような付加的コ
ード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および、要
すれば付加的コード配列）およびたとえばイントロンま
たは非コード配列のような非コード配列、成熟ポリペプ
チド用コード配列の５’および／または３’を包含しう
る。
をコードするポリヌクレオチドまたは寄託したｃＤＮＡ
がコードする成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドには：成熟ポリペプチドのコード配列のみ、成熟
ポリペプチドのコード配列およびたとえばリーダー配列
または分泌配列またはプロ蛋白質配列のような付加的コ
ード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および、要
すれば付加的コード配列）およびたとえばイントロンま
たは非コード配列のような非コード配列、成熟ポリペプ
チド用コード配列の５’および／または３’を包含しう
る。
【００２０】このようにして、用語「ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド」はそのポリペプチド用コー
ド配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コ
ード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレ
オチドを包含する。本発明はさらに、図１、図２および
図８の演繹されたアミノ酸配列を持つポリペプチドまた
は寄託したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチ
ドの断片、同族体および誘導体をコードする前記ポリヌ
クレオチドの変異体にも関連する。このポリヌクレオチ
ドの変異体はポリヌクレオチドの天然起源対立遺伝子変
異体またはポリヌクレオチドの非天然起源変異体でもあ
りうる。
ードするポリヌクレオチド」はそのポリペプチド用コー
ド配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コ
ード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレ
オチドを包含する。本発明はさらに、図１、図２および
図８の演繹されたアミノ酸配列を持つポリペプチドまた
は寄託したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチ
ドの断片、同族体および誘導体をコードする前記ポリヌ
クレオチドの変異体にも関連する。このポリヌクレオチ
ドの変異体はポリヌクレオチドの天然起源対立遺伝子変
異体またはポリヌクレオチドの非天然起源変異体でもあ
りうる。
【００２１】このように、本発明は図１、２および８に
示すものと同一の成熟ポリペプチドまたは寄託したクロ
ーンのｃＤＮＡがコードする同一の成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドならびに図１、２および８
のポリペプチドの断片、誘導体または同族体または寄託
したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドをコ
ードするこれらポリヌクレオチドの変異体を包含する。
そのようなヌクレオチド変異体は欠失、変異、置換変異
体および付加または挿入変異体を包含する。
示すものと同一の成熟ポリペプチドまたは寄託したクロ
ーンのｃＤＮＡがコードする同一の成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドならびに図１、２および８
のポリペプチドの断片、誘導体または同族体または寄託
したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドをコ
ードするこれらポリヌクレオチドの変異体を包含する。
そのようなヌクレオチド変異体は欠失、変異、置換変異
体および付加または挿入変異体を包含する。
【００２２】ここに示すように、このポリヌクレオチド
は図１、図２および図８に示すコード配列または寄託し
たクローンのコード配列の天然起源対立遺伝子変異体で
あるコード配列を持ちうる。当分野で公知の通り、対立
遺伝子変異体はポリヌクレオチド配列の別型であって、
ヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能を実質的
に変化しない置換、欠失または付加１個またはそれ以上
を持ちうる。
は図１、図２および図８に示すコード配列または寄託し
たクローンのコード配列の天然起源対立遺伝子変異体で
あるコード配列を持ちうる。当分野で公知の通り、対立
遺伝子変異体はポリヌクレオチド配列の別型であって、
ヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能を実質的
に変化しない置換、欠失または付加１個またはそれ以上
を持ちうる。
【００２３】本発明はまた、例えば細胞からのポリペプ
チド輸送を制御するための分泌配列として機能するリー
ダー配列など、宿主細胞でのポリペプチドの発現および
分泌を援助するポリヌクレオチド配列に成熟ポリペプチ
ド用のコード配列が同一読み枠内で融合しているポリヌ
クレオチドを包含する。リーダー配列を持つポリペプチ
ドはプレ蛋白質であって、成熟型ポリペプチドを形成す
るために宿主細胞により切断されるリーダー配列を持ち
うる。このポリヌクレオチドはまた成熟蛋白質プラス付
加的５’アミノ酸残基であるプロ蛋白質をコードしう
る。プロ配列を持つ成熟蛋白質はプロ蛋白質であって、
蛋白質の不活性型である。このプロ配列が切断されると
活性な成熟蛋白質が生成する。
チド輸送を制御するための分泌配列として機能するリー
ダー配列など、宿主細胞でのポリペプチドの発現および
分泌を援助するポリヌクレオチド配列に成熟ポリペプチ
ド用のコード配列が同一読み枠内で融合しているポリヌ
クレオチドを包含する。リーダー配列を持つポリペプチ
ドはプレ蛋白質であって、成熟型ポリペプチドを形成す
るために宿主細胞により切断されるリーダー配列を持ち
うる。このポリヌクレオチドはまた成熟蛋白質プラス付
加的５’アミノ酸残基であるプロ蛋白質をコードしう
る。プロ配列を持つ成熟蛋白質はプロ蛋白質であって、
蛋白質の不活性型である。このプロ配列が切断されると
活性な成熟蛋白質が生成する。
【００２４】このようにして、例えば本発明のポリヌク
レオチドは成熟蛋白質、またはプロ配列を持つ蛋白質、
またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）との両方を
持つ蛋白質をコードしうる。
レオチドは成熟蛋白質、またはプロ配列を持つ蛋白質、
またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）との両方を
持つ蛋白質をコードしうる。
【００２５】本発明のポリヌクレオチドはまた本発明の
ポリペプチドの精製のための標識配列に枠内で融合した
コード配列を持ちうる。標識配列は細菌宿主の場合に標
識に融合した成熟ポリペプチドを精製するためにｐＱＥ
−９ベクターが供給するヘキサヒスチジンタグでありう
るし、または、例えば標識配列はたとえばＣＯＳ−７細
胞など哺乳類宿主を使用する時にはヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）タグでありうる。ＨＡタグは流行性感冒ヘマグルチ
ニン蛋白質から誘導したエピトープに対応する（Ｗｉｌ
ｓｏｎ，Ｉ．など、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁（１９
８４年））。
ポリペプチドの精製のための標識配列に枠内で融合した
コード配列を持ちうる。標識配列は細菌宿主の場合に標
識に融合した成熟ポリペプチドを精製するためにｐＱＥ
−９ベクターが供給するヘキサヒスチジンタグでありう
るし、または、例えば標識配列はたとえばＣＯＳ−７細
胞など哺乳類宿主を使用する時にはヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）タグでありうる。ＨＡタグは流行性感冒ヘマグルチ
ニン蛋白質から誘導したエピトープに対応する（Ｗｉｌ
ｓｏｎ，Ｉ．など、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁（１９
８４年））。
【００２６】本発明はさらにもし前記配列との間に少な
くとも５０％、好ましくは７０％の同一性があれば前記
配列にハイブリド化するポリヌクレオチドに関する。本
発明は殊に前記ポリヌクレオチドに緊密条件下にハイブ
リド化するポリヌクレオチドに関する。ここで使用する
用語「緊密条件」は両配列間に少なくとも９５％、好ま
しくは少なくとも９７％の同一性があればハイブリッド
化を起こすことを意味する。好適な態様での前記ポリヌ
クレオチドにハイブリッド化するポリヌクレオチドは図
１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡがコードする成熟
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
維持するポリペプチドをコードする。ここに参照する寄
託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブタペスト条約の規定に従って維持することになってい
る。これらの寄託物は当業者の便宜のためにのみ提供す
るものであって、米国特許法１１２条の規定が求める寄
託であるとの容認ではない。寄託物内に含まれるポリヌ
クレオチドの配列、ならびにこれらがコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列は参考のために引用するものであ
って、本文記載の配列に何らかの争いが生じた場合に対
照とするものである。寄託した材料を製造、使用または
販売するためには実施許諾が必要になりうるし、ここで
はそのような実施許諾を保証するものではない。本発明
はさらに図１、図２および図８の演繹されたアミノ酸配
列を持つか、または寄託したｃＤＮＡがコードするアミ
ノ酸配列を持つＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−
１γポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの
断片、同族体および誘導体に関する。
くとも５０％、好ましくは７０％の同一性があれば前記
配列にハイブリド化するポリヌクレオチドに関する。本
発明は殊に前記ポリヌクレオチドに緊密条件下にハイブ
リド化するポリヌクレオチドに関する。ここで使用する
用語「緊密条件」は両配列間に少なくとも９５％、好ま
しくは少なくとも９７％の同一性があればハイブリッド
化を起こすことを意味する。好適な態様での前記ポリヌ
クレオチドにハイブリッド化するポリヌクレオチドは図
１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡがコードする成熟
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
維持するポリペプチドをコードする。ここに参照する寄
託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブタペスト条約の規定に従って維持することになってい
る。これらの寄託物は当業者の便宜のためにのみ提供す
るものであって、米国特許法１１２条の規定が求める寄
託であるとの容認ではない。寄託物内に含まれるポリヌ
クレオチドの配列、ならびにこれらがコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列は参考のために引用するものであ
って、本文記載の配列に何らかの争いが生じた場合に対
照とするものである。寄託した材料を製造、使用または
販売するためには実施許諾が必要になりうるし、ここで
はそのような実施許諾を保証するものではない。本発明
はさらに図１、図２および図８の演繹されたアミノ酸配
列を持つか、または寄託したｃＤＮＡがコードするアミ
ノ酸配列を持つＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−
１γポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの
断片、同族体および誘導体に関する。
【００２７】図１、図２および図８または寄託したｃＤ
ＮＡを参照する時、用語「断片」、「誘導体」および
「同族体」はそれらポリペプチドと実質的に同じ生物学
的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。
そこで、同族体はプロ蛋白質部分の切断により活性成熟
ポリペプチドを生産して活性化されることのできるプロ
蛋白質を包含する。
ＮＡを参照する時、用語「断片」、「誘導体」および
「同族体」はそれらポリペプチドと実質的に同じ生物学
的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。
そこで、同族体はプロ蛋白質部分の切断により活性成熟
ポリペプチドを生産して活性化されることのできるプロ
蛋白質を包含する。
【００２８】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり
うるが、好ましくは組換えポリペプチドである。
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり
うるが、好ましくは組換えポリペプチドである。
【００２９】図１、図２および図８のポリペプチドまた
は寄託したｃＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、
誘導体または同族体は（ｉ）アミノ酸残基１個またはそ
れ以上が保存または非保存アミノ酸残基で置換されてお
り（好ましくは保存アミノ酸残基）、そのような置換ア
ミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされていてもい
なくてもよいもの、または（ｉｉ）アミノ酸残基１個ま
たはそれ以上が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成
熟ポリペプチドが、たとえばポリペプチドの半減期を増
加する化合物（例えばポリエチレングリコールなど）の
ような他の化合物と融合しているもの、または（ｉｖ）
成熟ポリペプチドにリーダー配列または分泌配列または
成熟ポリペプチドまたはプロ蛋白質配列の精製に採用す
る配列のような付加的アミノ酸が融合しているもの、で
ありうる。そのような断片、誘導体および同族体はここ
での教示から当該技術範囲内にあると見做される。
は寄託したｃＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、
誘導体または同族体は（ｉ）アミノ酸残基１個またはそ
れ以上が保存または非保存アミノ酸残基で置換されてお
り（好ましくは保存アミノ酸残基）、そのような置換ア
ミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされていてもい
なくてもよいもの、または（ｉｉ）アミノ酸残基１個ま
たはそれ以上が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成
熟ポリペプチドが、たとえばポリペプチドの半減期を増
加する化合物（例えばポリエチレングリコールなど）の
ような他の化合物と融合しているもの、または（ｉｖ）
成熟ポリペプチドにリーダー配列または分泌配列または
成熟ポリペプチドまたはプロ蛋白質配列の精製に採用す
る配列のような付加的アミノ酸が融合しているもの、で
ありうる。そのような断片、誘導体および同族体はここ
での教示から当該技術範囲内にあると見做される。
【００３０】本発明のポリペプチドは好ましくは分離し
た型で提供され、好ましくは均質になるまで精製され
る。用語「分離」はその物質がその起源の環境（たとえ
ば、もし天然起源であれば天然環境）から移動されてい
ることを意味する。例えば、生きている動物に存在する
天然起源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離さ
れていないが、同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまた
はポリペプチドでも天然システム内で共存する物質のい
くつかまたは全てから離されていれば、分離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であ
ることができ、および／またはそのようなポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは組成物の一部であることがで
きるが、そのようなベクターまたは組成物は、その天然
環境の一部ではないという点で、なお分離されているも
のである。
た型で提供され、好ましくは均質になるまで精製され
る。用語「分離」はその物質がその起源の環境（たとえ
ば、もし天然起源であれば天然環境）から移動されてい
ることを意味する。例えば、生きている動物に存在する
天然起源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離さ
れていないが、同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまた
はポリペプチドでも天然システム内で共存する物質のい
くつかまたは全てから離されていれば、分離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であ
ることができ、および／またはそのようなポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは組成物の一部であることがで
きるが、そのようなベクターまたは組成物は、その天然
環境の一部ではないという点で、なお分離されているも
のである。
【００３１】本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを
含有するベクター、本発明のベクターで遺伝子工学的に
処理した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポ
リペプチドの生産法に関する。
含有するベクター、本発明のベクターで遺伝子工学的に
処理した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポ
リペプチドの生産法に関する。
【００３２】宿主細胞は、例えばクローニングベクター
でも発現ベクターでもありうるが、この発明のベクター
で遺伝子工学的に処理（形質導入またはまたは形質転換
または遺伝子移入）される。このベクターは、例えばプ
ラスミド、ウイルス粒子、ファージなどでありうる。遺
伝子工学的に処理した宿主細胞はプロモーターの活性
化、形質転換体の選択またはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、
およびＭＩＰ−１γ遺伝子の増幅に適当なように修正し
た通常の栄養培地中で培養できる。たとえば、温度、ｐ
Ｈ、その他のような培養条件は以前に発現用に選択した
宿主細胞について使用されたものであって、通常の専門
家には明白である。
でも発現ベクターでもありうるが、この発明のベクター
で遺伝子工学的に処理（形質導入またはまたは形質転換
または遺伝子移入）される。このベクターは、例えばプ
ラスミド、ウイルス粒子、ファージなどでありうる。遺
伝子工学的に処理した宿主細胞はプロモーターの活性
化、形質転換体の選択またはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、
およびＭＩＰ−１γ遺伝子の増幅に適当なように修正し
た通常の栄養培地中で培養できる。たとえば、温度、ｐ
Ｈ、その他のような培養条件は以前に発現用に選択した
宿主細胞について使用されたものであって、通常の専門
家には明白である。
【００３３】本発明のポリヌクレオチドは組換え技術に
よるポリペプチド生産用に採用しうる。そこで、例えば
そのポリヌクレオチド配列を発現伝達体多数のどれか一
つ、殊にポリペプチドの発現用ベクターまたはプラスミ
ド、に含有させうる。そのようなベクターには染色体、
非染色体および合成ＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０の誘
導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミ
ド、プラスミドとファージＤＮＡ、たとえば天然痘、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のよう
なウイルスＤＮＡとの結合で誘導されたベクターを包含
する。しかしながら、宿主中で複製でき、利用できる限
り、いかなる他種プラスミドまたはベクターも使用しう
る。
よるポリペプチド生産用に採用しうる。そこで、例えば
そのポリヌクレオチド配列を発現伝達体多数のどれか一
つ、殊にポリペプチドの発現用ベクターまたはプラスミ
ド、に含有させうる。そのようなベクターには染色体、
非染色体および合成ＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０の誘
導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミ
ド、プラスミドとファージＤＮＡ、たとえば天然痘、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のよう
なウイルスＤＮＡとの結合で誘導されたベクターを包含
する。しかしながら、宿主中で複製でき、利用できる限
り、いかなる他種プラスミドまたはベクターも使用しう
る。
【００３４】適当なＤＮＡ配列は種々の操作法の一つに
よってベクター内に挿入されうる。一般に、ＤＮＡ配列
は当該分野で公知の操作法により適当な単数または複数
の制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのよう
な操作法その他は当技術分野の範囲内にあると見做され
る。
よってベクター内に挿入されうる。一般に、ＤＮＡ配列
は当該分野で公知の操作法により適当な単数または複数
の制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのよう
な操作法その他は当技術分野の範囲内にあると見做され
る。
【００３５】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ
合成を指向する適当な発現制御配列（プロモーター）に
作動可能に結合する。そのようなプロモーターの代表例
としては：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌
のｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモータ
ー、および原核生物、真核生物またはそのウイルス中の
遺伝子発現を制御することが公知なその他のプロモータ
ーを指摘しうる。発現ベクターはまた翻訳開始用リボソ
ーム結合部位および転写終結部位も含有する。ベクター
はまた発現増幅用に適当な配列も含有しうる。
合成を指向する適当な発現制御配列（プロモーター）に
作動可能に結合する。そのようなプロモーターの代表例
としては：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌
のｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモータ
ー、および原核生物、真核生物またはそのウイルス中の
遺伝子発現を制御することが公知なその他のプロモータ
ーを指摘しうる。発現ベクターはまた翻訳開始用リボソ
ーム結合部位および転写終結部位も含有する。ベクター
はまた発現増幅用に適当な配列も含有しうる。
【００３６】これに加え、発現ベクターは真核生物には
たとえばジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性
のような、また、大腸菌にはたとえばテトラサイクリン
耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換体宿主細
胞に選択の表現型特性を提供する遺伝子を含むものが好
ましい。
たとえばジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性
のような、また、大腸菌にはたとえばテトラサイクリン
耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換体宿主細
胞に選択の表現型特性を提供する遺伝子を含むものが好
ましい。
【００３７】前記の適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプ
ロモーターまたは制御配列を含むベクターを採用して適
当な宿主を形質転換して宿主に蛋白質を発現させうる。
ロモーターまたは制御配列を含むベクターを採用して適
当な宿主を形質転換して宿主に蛋白質を発現させうる。
【００３８】適当な宿主の代表例としては：たとえば大
腸菌、ストレプトマイセス菌、サルモネラ・ティフィリ
ウム菌のような細菌細胞、たとえば酵母のようなカビ細
胞、キイロショウジョウバエ属およびＳｆ９のような昆
虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫のよう
な動物細胞；植物細胞、その他を指摘しうる。適当な宿
主の選択はここでの教示を基にすれば当技術範囲内にあ
ると見做される。
腸菌、ストレプトマイセス菌、サルモネラ・ティフィリ
ウム菌のような細菌細胞、たとえば酵母のようなカビ細
胞、キイロショウジョウバエ属およびＳｆ９のような昆
虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫のよう
な動物細胞；植物細胞、その他を指摘しうる。適当な宿
主の選択はここでの教示を基にすれば当技術範囲内にあ
ると見做される。
【００３９】さらに具体的には、本発明は広義には前記
したような配列１個またはそれ以上を含む組換え構築物
も含有する。この構築物は正方向または逆方向に本発明
の配列を挿入した、たとえばプラスミドまたはウイルス
ベクターのような、ベクターを含む。この態様の好適な
側面では、この構築物はさらに、例えば該配列に作動可
能に結合するプロモーターなど、制御配列を含む。適当
なベクターおよびプロモーター多数が当業者に公知であ
り、商業的に購入できる。下記ベクターを例示する。細
菌ではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｕｉａ
ｇｅｎ社）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐ
ｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ＳＫ、
ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８
Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐｔｒ
ｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤ
Ｒ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、真核
生物ではｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、
ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶ
Ｋ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）。しかしながら、その他のいかなるプラスミド
またはベクターもそれらが宿主中で複製可能で利用可能
である限り使用しうる。
したような配列１個またはそれ以上を含む組換え構築物
も含有する。この構築物は正方向または逆方向に本発明
の配列を挿入した、たとえばプラスミドまたはウイルス
ベクターのような、ベクターを含む。この態様の好適な
側面では、この構築物はさらに、例えば該配列に作動可
能に結合するプロモーターなど、制御配列を含む。適当
なベクターおよびプロモーター多数が当業者に公知であ
り、商業的に購入できる。下記ベクターを例示する。細
菌ではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｕｉａ
ｇｅｎ社）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐ
ｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ＳＫ、
ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８
Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐｔｒ
ｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤ
Ｒ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、真核
生物ではｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、
ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶ
Ｋ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）。しかしながら、その他のいかなるプラスミド
またはベクターもそれらが宿主中で複製可能で利用可能
である限り使用しうる。
【００４０】プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェ
ニコール転移酵素）ベクターまたはその他の選択マーカ
ーを持つベクターを使用していかなる所望の遺伝子から
も選択できる。適当なベクター２個は、ＰＫＫ２３２−
８およびＰＣＭ７である。殊に有名な細菌性プロモータ
ーにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラム
ダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモ
ーターには、ＣＭＶ即時早期、ＨＳＶチミジンキナー
ゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴ
Ｒ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉを包含する。
適当なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当分
野の通常熟練の水準内にある。
ニコール転移酵素）ベクターまたはその他の選択マーカ
ーを持つベクターを使用していかなる所望の遺伝子から
も選択できる。適当なベクター２個は、ＰＫＫ２３２−
８およびＰＣＭ７である。殊に有名な細菌性プロモータ
ーにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラム
ダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモ
ーターには、ＣＭＶ即時早期、ＨＳＶチミジンキナー
ゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴ
Ｒ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉを包含する。
適当なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当分
野の通常熟練の水準内にある。
【００４１】別の態様では本発明は前記構築物を含む宿
主細胞に関する。宿主細胞は、たとえば哺乳類細胞のよ
うな高等真核生物細胞、または、たとえば酵母細胞のよ
うな低級真核生物細胞であることができ、または、宿主
細胞はたとえば細菌細胞のような原核生物細胞であるこ
とができる。宿主細胞への構築物の導入は燐酸カルシウ
ム遺伝子移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子移入
または電気穿孔法によって達成することもできる。（Ｄ
ａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，
Ｉ．、「分子生物学における基礎的手法（Ｂａｓｉｃ・
Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ」、（１９８６年））。
主細胞に関する。宿主細胞は、たとえば哺乳類細胞のよ
うな高等真核生物細胞、または、たとえば酵母細胞のよ
うな低級真核生物細胞であることができ、または、宿主
細胞はたとえば細菌細胞のような原核生物細胞であるこ
とができる。宿主細胞への構築物の導入は燐酸カルシウ
ム遺伝子移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子移入
または電気穿孔法によって達成することもできる。（Ｄ
ａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，
Ｉ．、「分子生物学における基礎的手法（Ｂａｓｉｃ・
Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ」、（１９８６年））。
【００４２】宿主細胞中の構築物は組換え配列がコード
する遺伝子生成物を生産するための通常の方法で使用で
きる。あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチ
ド合成機によって合成的に生産できる。成熟蛋白質は適
当なプロモーターの制御下に哺乳類細胞、酵母、細菌、
またはその他の細胞中で発現できる。無細胞翻訳システ
ムを採用して本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡ
を使用してそのような蛋白質を生産できる。原核生物お
よび真核生物宿主で使用する適当なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋなど、「分子
クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａ
ｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏ
ｒ社、Ｎ．Ｙ．、（１９８９年）に記載があり、これを
参考のためにここに引用する。
する遺伝子生成物を生産するための通常の方法で使用で
きる。あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチ
ド合成機によって合成的に生産できる。成熟蛋白質は適
当なプロモーターの制御下に哺乳類細胞、酵母、細菌、
またはその他の細胞中で発現できる。無細胞翻訳システ
ムを採用して本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡ
を使用してそのような蛋白質を生産できる。原核生物お
よび真核生物宿主で使用する適当なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋなど、「分子
クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａ
ｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏ
ｒ社、Ｎ．Ｙ．、（１９８９年）に記載があり、これを
参考のためにここに引用する。
【００４３】高等真核生物による本発明のポリペプチド
をコードするＤＮＡの転写はベクターにエンハンサー配
列を挿入することによって増加する。エンハンサーはＤ
ＮＡのシス作用要素であって、通常約１０から３００ｂ
ｐまでで、プロモーターに作用して転写を増加する。こ
の例にはｂｐ１００から２７０の複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーを包含する。
をコードするＤＮＡの転写はベクターにエンハンサー配
列を挿入することによって増加する。エンハンサーはＤ
ＮＡのシス作用要素であって、通常約１０から３００ｂ
ｐまでで、プロモーターに作用して転写を増加する。こ
の例にはｂｐ１００から２７０の複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーを包含する。
【００４４】一般に、組み替え発現ベクターは複製開始
点および、たとえば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子お
よび酵母のＴＲＰ１遺伝子などの宿主細胞の形質転換を
許す選択標識、および下流の構造配列転写を指向する高
度に発現された遺伝子から誘導したプロモーターを包含
するであろう。このようなプロモーターは、殊にたとえ
ば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因
子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質のよ
うな、解糖酵素をコードするオペロンから誘導できる。
異種構造配列を適当なフェーズ中で翻訳の開始および終
結配列および、好ましくは細胞質周辺空隙または細胞外
媒体への翻訳した蛋白質の分泌を指向することのできる
リーダー配列と結合する。要すれば、異種配列は、たと
えば、発現した組換え生成物の安定化または精製単純化
など、所望の性質を与えるＮ−末端認識ペプチドを含む
融合蛋白質をコードできる。
点および、たとえば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子お
よび酵母のＴＲＰ１遺伝子などの宿主細胞の形質転換を
許す選択標識、および下流の構造配列転写を指向する高
度に発現された遺伝子から誘導したプロモーターを包含
するであろう。このようなプロモーターは、殊にたとえ
ば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因
子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質のよ
うな、解糖酵素をコードするオペロンから誘導できる。
異種構造配列を適当なフェーズ中で翻訳の開始および終
結配列および、好ましくは細胞質周辺空隙または細胞外
媒体への翻訳した蛋白質の分泌を指向することのできる
リーダー配列と結合する。要すれば、異種配列は、たと
えば、発現した組換え生成物の安定化または精製単純化
など、所望の性質を与えるＮ−末端認識ペプチドを含む
融合蛋白質をコードできる。
【００４５】細菌での使用に有用な発現ベクターは所期
蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を機能性プロモータ
ーを持つ作動可能な読み枠中の適当な翻訳開始および終
結シグナルとともに挿入することによって構築する。ベ
クターはベクターの維持を確保し、および、もし所望な
ら、宿主内での増幅を提供するために表現型選択標識１
個またはそれ以上および複製開始点を含むであろう。形
質転換のために適当な原核生物宿主には大腸菌、枯草
菌、サルモネラ・ティフィムリウム、およびシュードモ
ナス、ストレプトマイセスおよびアタフィロコッカス属
の様々な菌種を含むが、その他のものも選択の対照とし
うる。
蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を機能性プロモータ
ーを持つ作動可能な読み枠中の適当な翻訳開始および終
結シグナルとともに挿入することによって構築する。ベ
クターはベクターの維持を確保し、および、もし所望な
ら、宿主内での増幅を提供するために表現型選択標識１
個またはそれ以上および複製開始点を含むであろう。形
質転換のために適当な原核生物宿主には大腸菌、枯草
菌、サルモネラ・ティフィムリウム、およびシュードモ
ナス、ストレプトマイセスおよびアタフィロコッカス属
の様々な菌種を含むが、その他のものも選択の対照とし
うる。
【００４６】代表的であるが限定性のない実例として、
細菌で使用する有用な発現ベクターは選択マーカーおよ
びよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（Ａ
ＴＣＣ３７０１７）の遺伝子的要素を含み、商業的に購
入可能なプラスミドから誘導した細菌の複製開始点を含
有できる。この商業的ベクターには、例えばｐＫＫ２２
３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン）およびＧＥＭ
１（Ｐｒｏｍｅｇａ・Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）などを含む。これらｐＢＲ３２２
「バックボーン」部分を適当なプロモーターおよび発現
すべき構造配列と結合する。適当な宿主株の形質転換お
よび適当な細胞密度までの宿主株の生育後、選択したプ
ロモーターを適当な方法により誘導し（たとえば温度変
化または化学的誘導）、細胞を付加的期間培養する。
細菌で使用する有用な発現ベクターは選択マーカーおよ
びよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（Ａ
ＴＣＣ３７０１７）の遺伝子的要素を含み、商業的に購
入可能なプラスミドから誘導した細菌の複製開始点を含
有できる。この商業的ベクターには、例えばｐＫＫ２２
３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン）およびＧＥＭ
１（Ｐｒｏｍｅｇａ・Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）などを含む。これらｐＢＲ３２２
「バックボーン」部分を適当なプロモーターおよび発現
すべき構造配列と結合する。適当な宿主株の形質転換お
よび適当な細胞密度までの宿主株の生育後、選択したプ
ロモーターを適当な方法により誘導し（たとえば温度変
化または化学的誘導）、細胞を付加的期間培養する。
【００４７】典型的には細胞を遠心分離によって収穫
し、物理的または化学的方法によって破砕し、得られる
粗製の抽出物をさらなる精製のために保存する。
し、物理的または化学的方法によって破砕し、得られる
粗製の抽出物をさらなる精製のために保存する。
【００４８】蛋白質の発現に採用する微生物細胞は、い
ずれも当業者によく公知の方法である凍結−解凍の循
環、超音波処理、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用
を含む便利な方法のいずれかにより崩壊する。
ずれも当業者によく公知の方法である凍結−解凍の循
環、超音波処理、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用
を含む便利な方法のいずれかにより崩壊する。
【００４９】様々な哺乳類細胞培養システムを組換え蛋
白質発現のために採用できる。哺乳類発現システムの例
にはＧｌｕｚｍａｎがＣｅｌｌ、２３巻：１７５頁（１
９８１年）に記載したサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７
系および適応性あるベクターを発現することができるそ
の他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈ
ｅＬａおよびＢＨＫ細胞系などを含む。哺乳類発現ベク
ターは複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハン
サー、およびまた必要なリボソーム結合部位、ポリアデ
ニル化部位、スプライスのドナーおよびアクセプター部
位、転写終結配列、および５’−隣接非転写配列のいず
れかをも含むであろう。ＳＶ４０スプライスから誘導さ
れるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は必要な非転
写遺伝子要素を提供するために使用しうる。
白質発現のために採用できる。哺乳類発現システムの例
にはＧｌｕｚｍａｎがＣｅｌｌ、２３巻：１７５頁（１
９８１年）に記載したサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７
系および適応性あるベクターを発現することができるそ
の他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈ
ｅＬａおよびＢＨＫ細胞系などを含む。哺乳類発現ベク
ターは複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハン
サー、およびまた必要なリボソーム結合部位、ポリアデ
ニル化部位、スプライスのドナーおよびアクセプター部
位、転写終結配列、および５’−隣接非転写配列のいず
れかをも含むであろう。ＳＶ４０スプライスから誘導さ
れるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は必要な非転
写遺伝子要素を提供するために使用しうる。
【００５０】ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１
γは硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸性抽
出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、親水性相互作用
クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチン
クロマトグラフィーを含む方法により組換え細胞培養物
から回収し、精製する。精製の間に存在するカルシウム
イオンを低濃度（約０．１５〜５ｍＭ）にすることが好
ましい。（Ｐｒｉｃｅなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２４４巻：９１７頁（１９６９年））。必要に応
じて、成熟蛋白質の立体配置を完成するために蛋白質再
折りたたみ段階を使用できる。最後に、最終的な精製段
階用に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用
できる。
γは硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸性抽
出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、親水性相互作用
クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチン
クロマトグラフィーを含む方法により組換え細胞培養物
から回収し、精製する。精製の間に存在するカルシウム
イオンを低濃度（約０．１５〜５ｍＭ）にすることが好
ましい。（Ｐｒｉｃｅなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２４４巻：９１７頁（１９６９年））。必要に応
じて、成熟蛋白質の立体配置を完成するために蛋白質再
折りたたみ段階を使用できる。最後に、最終的な精製段
階用に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用
できる。
【００５１】本発明のポリペプチドは、天然品精製生産
物または化学合成的操作の生産物、または原核生物また
は真核生物宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植
物、昆虫および哺乳類細胞による）から組換え技術によ
り生産したものでありうる。組換え生産操作に採用する
宿主に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳類または
その他の真核生物炭水化物でグリコシル化、または非グ
リコシル化されうる。本発明のポリペプチドはイニシャ
ルメチオニンアミノ酸残基を含有しうる。
物または化学合成的操作の生産物、または原核生物また
は真核生物宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植
物、昆虫および哺乳類細胞による）から組換え技術によ
り生産したものでありうる。組換え生産操作に採用する
宿主に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳類または
その他の真核生物炭水化物でグリコシル化、または非グ
リコシル化されうる。本発明のポリペプチドはイニシャ
ルメチオニンアミノ酸残基を含有しうる。
【００５２】本発明のポリペプチドは様々な免疫制御お
よび炎症機能、また多数の疾患で使用しうる。ＭＩＰ−
３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１γはケモカイン族に属
し、そのためこれらは白血球（たとえば単球、好中球、
Ｔリンパ球、好酸球、好塩基球、など）の化学誘引剤で
ある。従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−
１γは標的免疫細胞の傷害領域への浸透を制御すること
によって傷害の治癒を促進するために使用できる。同様
な様式で、本発明のポリペプチドは殺微生物白血球の誘
引および活性化を通して、たとえばマイコバクテリアな
どの慢性感染症に対する宿主の防御を強化できる。
よび炎症機能、また多数の疾患で使用しうる。ＭＩＰ−
３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１γはケモカイン族に属
し、そのためこれらは白血球（たとえば単球、好中球、
Ｔリンパ球、好酸球、好塩基球、など）の化学誘引剤で
ある。従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−
１γは標的免疫細胞の傷害領域への浸透を制御すること
によって傷害の治癒を促進するために使用できる。同様
な様式で、本発明のポリペプチドは殺微生物白血球の誘
引および活性化を通して、たとえばマイコバクテリアな
どの慢性感染症に対する宿主の防御を強化できる。
【００５３】さらに、本発明のポリペプチドは、例えば
カポジ肉腫の処置において、腫瘍に注射されたケモカイ
ン発現細胞は腫瘍の縮退を起こす証拠があるので抗腫瘍
療法において有用である。また、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−
４およびＭＩＰ−１γは、たとえば細胞毒性Ｔ細胞およ
びマクロファージなど、宿主防御（殺腫瘍）細胞の侵襲
および活性化を刺激するので、この様にして固形癌の処
置に使用しうる。
カポジ肉腫の処置において、腫瘍に注射されたケモカイ
ン発現細胞は腫瘍の縮退を起こす証拠があるので抗腫瘍
療法において有用である。また、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−
４およびＭＩＰ−１γは、たとえば細胞毒性Ｔ細胞およ
びマクロファージなど、宿主防御（殺腫瘍）細胞の侵襲
および活性化を刺激するので、この様にして固形癌の処
置に使用しうる。
【００５４】このポリペプチドはまた白血病で骨髄幹細
胞のコロニー形成を阻止するため、および腫瘍化学療法
の間に造血幹細胞の付随的保護処置としても使用しう
る。
胞のコロニー形成を阻止するため、および腫瘍化学療法
の間に造血幹細胞の付随的保護処置としても使用しう
る。
【００５５】本発明のポリペプチドのもう一つの使用
は、例えば自己免疫疾患およびリンパ球白血病などで
の、ＩＬ−２生合成の阻止を経るＴ細胞増殖の阻止であ
る。
は、例えば自己免疫疾患およびリンパ球白血病などで
の、ＩＬ−２生合成の阻止を経るＴ細胞増殖の阻止であ
る。
【００５６】ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１
γは皮内ケラチノサイト増殖を阻止するためにも使用し
うるし、皮膚内のランゲルハンス細胞はＭＩＰ−１αを
生産することが発見されているので乾癬（ケラチノサイ
ト増殖過剰症）での有用性がある。
γは皮内ケラチノサイト増殖を阻止するためにも使用し
うるし、皮膚内のランゲルハンス細胞はＭＩＰ−１αを
生産することが発見されているので乾癬（ケラチノサイ
ト増殖過剰症）での有用性がある。
【００５７】ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１
は破砕物の除去と結合組織促進性炎症細胞の補充との双
方を通して、またＴＧＦβ−媒介の過剰線維症制御の可
能性により傷害治癒の間の瘢痕予防に使用しうる。これ
に加え、これらポリペプチドはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４
およびＭＩＰ−１γは血管透過性を増強するので、発
作、血栓血球症、肺塞栓および骨髄増殖性疾患の処置に
有用でありうる。
は破砕物の除去と結合組織促進性炎症細胞の補充との双
方を通して、またＴＧＦβ−媒介の過剰線維症制御の可
能性により傷害治癒の間の瘢痕予防に使用しうる。これ
に加え、これらポリペプチドはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４
およびＭＩＰ−１γは血管透過性を増強するので、発
作、血栓血球症、肺塞栓および骨髄増殖性疾患の処置に
有用でありうる。
【００５８】これらポリペプチドは、しばしば「遺伝子
治療」と呼ばれる、生体内におけるこれらポリペプチド
の本発明に従った生体内における発現に採用できる。
治療」と呼ばれる、生体内におけるこれらポリペプチド
の本発明に従った生体内における発現に採用できる。
【００５９】すなわち、例えば患者からの細胞を生体外
でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）を遺伝子工学的に処理し、次に処理した
細胞をそのポリペプチドで処理すべき患者に戻す。この
ような方法は当業者によく公知である。例えば、細胞を
当業界で公知の操作法により本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して処
理しうる。
でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）を遺伝子工学的に処理し、次に処理した
細胞をそのポリペプチドで処理すべき患者に戻す。この
ような方法は当業者によく公知である。例えば、細胞を
当業界で公知の操作法により本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して処
理しうる。
【００６０】同様にして、例えば当業者公知の操作法に
より、ポリペプチドの生体内発現用に生体内で処理しう
る。当業界で公知のように、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を生産するた
めの生産細胞を患者に投与して、生体内で細胞を処理
し、生体内でそのポリペプチドを発現する。かかる方法
により本発明のポリペプチドを投与するための前記およ
びその他の方法は本発明の教示から当業者には明白であ
る。例えば、細胞を工学的に処理するための発現ビヒク
ルは、例えば適当な送達ビヒクルと結合した後に生体内
で細胞を遺伝子工学的に処理するために使用しうるアデ
ノウイルスなど、レトロウイルス以外でありうる。
より、ポリペプチドの生体内発現用に生体内で処理しう
る。当業界で公知のように、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を生産するた
めの生産細胞を患者に投与して、生体内で細胞を処理
し、生体内でそのポリペプチドを発現する。かかる方法
により本発明のポリペプチドを投与するための前記およ
びその他の方法は本発明の教示から当業者には明白であ
る。例えば、細胞を工学的に処理するための発現ビヒク
ルは、例えば適当な送達ビヒクルと結合した後に生体内
で細胞を遺伝子工学的に処理するために使用しうるアデ
ノウイルスなど、レトロウイルス以外でありうる。
【００６１】本発明のポリペプチドは適当な医薬的担体
と組合せて使用しうる。このような組成物には治療的有
効量の蛋白質、および医薬的に許容しうる担体または添
加剤を包含する。このような担体にはこれに限定するも
のではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、
水、グリセリン、およびこれらの組合せを包含する。剤
型は投与態様に適合さすべきである。
と組合せて使用しうる。このような組成物には治療的有
効量の蛋白質、および医薬的に許容しうる担体または添
加剤を包含する。このような担体にはこれに限定するも
のではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、
水、グリセリン、およびこれらの組合せを包含する。剤
型は投与態様に適合さすべきである。
【００６２】本発明は本発明の医薬的組成物の成分１個
またはそれ以上を充填した容器１個またはそれ以上から
なる医薬的パックまたはキットも提供する。このような
容器に伴って、医薬的または生物学的生産物の製造、使
用または販売を規制する政府機関が規定する形式でヒト
投与用製造、使用または販売の機関による承認を反映す
る注意書も添付する。これに加え、本発明のポリペプチ
ドは他の治療用化合物とともに採用しうる。
またはそれ以上を充填した容器１個またはそれ以上から
なる医薬的パックまたはキットも提供する。このような
容器に伴って、医薬的または生物学的生産物の製造、使
用または販売を規制する政府機関が規定する形式でヒト
投与用製造、使用または販売の機関による承認を反映す
る注意書も添付する。これに加え、本発明のポリペプチ
ドは他の治療用化合物とともに採用しうる。
【００６３】この医薬的組成物は、たとえば経口、静脈
内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路のよ
うな常用の様式で投与しうる。被投与者に投与するＭＩ
Ｐ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１γの用量と投与法
とは、たとえば投与様式、処理すべき状態の性質および
処方する医師の判断のような因子多数に依存する。一般
的に言えば、例えば少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの
治療的有効用量で投与し、および殆どの場合に約ｍｇ／
体重ｋｇを超えない日用量、好ましくは投与経路、症
状、その他を考慮して用量は約１０μｇ／体重ｋｇから
の日用量である。
内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路のよ
うな常用の様式で投与しうる。被投与者に投与するＭＩ
Ｐ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１γの用量と投与法
とは、たとえば投与様式、処理すべき状態の性質および
処方する医師の判断のような因子多数に依存する。一般
的に言えば、例えば少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの
治療的有効用量で投与し、および殆どの場合に約ｍｇ／
体重ｋｇを超えない日用量、好ましくは投与経路、症
状、その他を考慮して用量は約１０μｇ／体重ｋｇから
の日用量である。
【００６４】本発明の配列は染色体同定用にも価値があ
る。この配列は殊に個人のヒト染色体の特殊な場所を標
的とするもので、そこにハイブリド化できる。さらに、
最近は染色体特定部位の同定への必要が存在する。染色
体部位標識用に実際的な配列データ（反復多型）に基づ
いて染色体を標識する試薬は現在ではまだ殆ど入手でき
ない。本発明に従う染色体へのＤＮＡ地図作成は疾患に
関する遺伝子の配列を関連付ける重要な第一段階であ
る。
る。この配列は殊に個人のヒト染色体の特殊な場所を標
的とするもので、そこにハイブリド化できる。さらに、
最近は染色体特定部位の同定への必要が存在する。染色
体部位標識用に実際的な配列データ（反復多型）に基づ
いて染色体を標識する試薬は現在ではまだ殆ど入手でき
ない。本発明に従う染色体へのＤＮＡ地図作成は疾患に
関する遺伝子の配列を関連付ける重要な第一段階であ
る。
【００６５】略述すれば、ＰＣＲプライマー（好ましく
は１５〜２５ｂｐ）をｃＤＮＡから製造することにより
配列を染色体に配置できる。ｃＤＮＡのコンピューター
分析を使用して迅速にゲノムＤＮＡ中の増幅過程を複雑
化するエクソン１個以上にわたるプライマーでないプラ
イマーを選択する。これらプライマーを使用して次に各
ヒト染色体を含む体細胞のハイブリッドをＰＣＲスクリ
ーニングする。プライマーに対応するヒトの遺伝子を含
むハイブリッドのみが増幅した断片を得る。
は１５〜２５ｂｐ）をｃＤＮＡから製造することにより
配列を染色体に配置できる。ｃＤＮＡのコンピューター
分析を使用して迅速にゲノムＤＮＡ中の増幅過程を複雑
化するエクソン１個以上にわたるプライマーでないプラ
イマーを選択する。これらプライマーを使用して次に各
ヒト染色体を含む体細胞のハイブリッドをＰＣＲスクリ
ーニングする。プライマーに対応するヒトの遺伝子を含
むハイブリッドのみが増幅した断片を得る。
【００６６】体細胞ハイブリッドのＰＣＲ地図作成は特
定染色体に特定のＤＮＡを割り当てる迅速な手段であ
る。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用い
れば、同様にして特定の染色体または大きなゲノムクロ
ーンのプールからの断片集団についてサブローカリゼー
ションを達成できる。同様に染色体地図作成に使用でき
る他の地図作成方策は原位置ハイブリド化、標識したフ
ロー選択染色体での前スクリーニングおよび染色体特異
的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリッド
化による前選択を包含する。
定染色体に特定のＤＮＡを割り当てる迅速な手段であ
る。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用い
れば、同様にして特定の染色体または大きなゲノムクロ
ーンのプールからの断片集団についてサブローカリゼー
ションを達成できる。同様に染色体地図作成に使用でき
る他の地図作成方策は原位置ハイブリド化、標識したフ
ロー選択染色体での前スクリーニングおよび染色体特異
的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリッド
化による前選択を包含する。
【００６７】分裂中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡク
ローンの螢光ｉｎ・ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）は染色体上の厳密な配置を一段階で提供で
きる。この技術は５００または６００塩基までの短さの
ｃＤＮＡで使用できるが、しかしながら、２０００ｂｐ
以上のクローンは単一の検出について十分なシグナル強
度で独特な染色体位置への結合をする見込みが高い。Ｆ
ＩＳＨではＥＳＴが誘導されたクローンの使用を必要と
し、長い方がよい。例えば、２０００ｂｐは良いが、４
０００ｂｐはさらに良く、時間の合理的百分率で良い結
果を得るためには４０００以上は必要ではない。この技
術の綜説についてはＶｅｒｍａなど、「ヒト染色体：基
礎技術便覧（Ｈｕｍａｎ・Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ
・Ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・Ｂａｓｉｃ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ）」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ・
Ｙｏｒｋ（１９８８年）を参照のこと。
ローンの螢光ｉｎ・ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）は染色体上の厳密な配置を一段階で提供で
きる。この技術は５００または６００塩基までの短さの
ｃＤＮＡで使用できるが、しかしながら、２０００ｂｐ
以上のクローンは単一の検出について十分なシグナル強
度で独特な染色体位置への結合をする見込みが高い。Ｆ
ＩＳＨではＥＳＴが誘導されたクローンの使用を必要と
し、長い方がよい。例えば、２０００ｂｐは良いが、４
０００ｂｐはさらに良く、時間の合理的百分率で良い結
果を得るためには４０００以上は必要ではない。この技
術の綜説についてはＶｅｒｍａなど、「ヒト染色体：基
礎技術便覧（Ｈｕｍａｎ・Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ
・Ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・Ｂａｓｉｃ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ）」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ・
Ｙｏｒｋ（１９８８年）を参照のこと。
【００６８】ある配列が染色体上の精密な位置に配置さ
れると、その配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地
図データと関連付けできる。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、「ヒトでのメンデル的遺伝
（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ・Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ・ｉｎ
・Ｍａｎ）」（Ｊｏｈｎｓ・Ｈｏｐｋｉｎｓ・Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ・Ｗｅｌｃｈ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｌｉｂｒ
ａｒｙから購入可能）に見出される。同じ染色体領域に
配置された遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖分析（物
理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって確認される。
れると、その配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地
図データと関連付けできる。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、「ヒトでのメンデル的遺伝
（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ・Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ・ｉｎ
・Ｍａｎ）」（Ｊｏｈｎｓ・Ｈｏｐｋｉｎｓ・Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ・Ｗｅｌｃｈ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｌｉｂｒ
ａｒｙから購入可能）に見出される。同じ染色体領域に
配置された遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖分析（物
理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって確認される。
【００６９】次に、患者と非患者との間のｃＤＮＡまた
はゲノム配列の相違を決定する必要がある。もし患者の
一部か全部に突然変異が観察されるが、いずれの非患者
でも観察されなければ、その突然変異はその疾患の原因
であると見込まれる。
はゲノム配列の相違を決定する必要がある。もし患者の
一部か全部に突然変異が観察されるが、いずれの非患者
でも観察されなければ、その突然変異はその疾患の原因
であると見込まれる。
【００７０】物理的地図作成および遺伝子的地図作成技
術の最近の解決法によれば、疾患に関連ある染色体領域
に精密に配置されたｃＤＮＡは可能性ある原因遺伝子５
０個と５００個との間の中の一つである。（これは１メ
ガ塩基の地図作成分析および１遺伝子２０ｋｂと仮定し
ている）。
術の最近の解決法によれば、疾患に関連ある染色体領域
に精密に配置されたｃＤＮＡは可能性ある原因遺伝子５
０個と５００個との間の中の一つである。（これは１メ
ガ塩基の地図作成分析および１遺伝子２０ｋｂと仮定し
ている）。
【００７１】患者と非患者との比較は一般に、まず、た
とえば染色体スプレッドに見られるかまたはｃＤＮＡ配
列に基づくＰＣＲを使用して検出される欠失または転座
のような、染色体中の構造変化を探す。究極的には突然
変異の存在を確認し、および突然変異を多形性から識別
するためには、数人からの遺伝子を完全に配列決定する
ことが必要である。
とえば染色体スプレッドに見られるかまたはｃＤＮＡ配
列に基づくＰＣＲを使用して検出される欠失または転座
のような、染色体中の構造変化を探す。究極的には突然
変異の存在を確認し、および突然変異を多形性から識別
するためには、数人からの遺伝子を完全に配列決定する
ことが必要である。
【００７２】本発明はさらにアンチセンス技術の使用に
よって、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１γ
を生体内で阻害することを指向している。アンチセンス
技術はポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合
に基づいて、三重ラセン形成か、アンチセンスＤＮＡま
たはＲＮＡか、の方法を通して遺伝子発現を制御するた
めに使用できる。例えば、本発明のポリペプチドをコー
ドするそのポリヌクレオチド配列の５’−コード部分を
使用して、長さ約１０から４０塩基対のアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドは転写に関与する遺伝子領域に相補的なように
設計（三重ラセンについては、Ｌｅｅなど、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、６巻：３０７３頁（１９７９
年）；Ｃｏｏｎｅｙなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：
４５６頁（１９８８年）；およびＤｅｒｖａｎなど、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３６０頁（１９９１年）を
参照のこと）し、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩ
Ｐ−１γの転写および生産を予防する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡにハイブリ
ッド化して、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−
１γへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する（アンチセンス
については、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．、５６巻：５６０頁（１９９１年）；「遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオ
チド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ・
ａｓ・Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ・ｏ
ｆ・Ｇｅｎｅ・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＣＲＣ・Ｐ
ｒｅｓｓ社、Ｂｏｃａ・Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８
年）参照）。
よって、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１γ
を生体内で阻害することを指向している。アンチセンス
技術はポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合
に基づいて、三重ラセン形成か、アンチセンスＤＮＡま
たはＲＮＡか、の方法を通して遺伝子発現を制御するた
めに使用できる。例えば、本発明のポリペプチドをコー
ドするそのポリヌクレオチド配列の５’−コード部分を
使用して、長さ約１０から４０塩基対のアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドは転写に関与する遺伝子領域に相補的なように
設計（三重ラセンについては、Ｌｅｅなど、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、６巻：３０７３頁（１９７９
年）；Ｃｏｏｎｅｙなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：
４５６頁（１９８８年）；およびＤｅｒｖａｎなど、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３６０頁（１９９１年）を
参照のこと）し、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩ
Ｐ−１γの転写および生産を予防する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡにハイブリ
ッド化して、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−
１γへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する（アンチセンス
については、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．、５６巻：５６０頁（１９９１年）；「遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオ
チド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ・
ａｓ・Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ・ｏ
ｆ・Ｇｅｎｅ・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＣＲＣ・Ｐ
ｒｅｓｓ社、Ｂｏｃａ・Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８
年）参照）。
【００７３】その他に前記オリゴヌクレオチドは、前記
の様式でＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１γ
の産生を阻止するため、生体内でアンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡが発現されうるような当分野の操作法によっ
て細胞まで送達できる。
の様式でＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１γ
の産生を阻止するため、生体内でアンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡが発現されうるような当分野の操作法によっ
て細胞まで送達できる。
【００７４】従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭ
ＩＰ−１γへのアンチセンス構築物をＭＩＰが誘発する
か強化するかいずれかの疾患、例えば動脈硬化症、たと
えば多発性硬化症およびインシュリン依存性糖尿病など
のような自己免疫疾患、および慢性炎症および感染性疾
患、ヒスタミン媒介性アレルギー反応、リュウマチ性関
節炎、珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症、その他の肺
臓の慢性炎症疾患、特発性好酸球過剰症候群、内毒素性
ショック、ヒスタミン媒介アレルギー性反応、プロスタ
グランジン−非依存性発熱、および再生不良性貧血、そ
の他の骨髄不全性疾患など、を処置するために使用でき
る。
ＩＰ−１γへのアンチセンス構築物をＭＩＰが誘発する
か強化するかいずれかの疾患、例えば動脈硬化症、たと
えば多発性硬化症およびインシュリン依存性糖尿病など
のような自己免疫疾患、および慢性炎症および感染性疾
患、ヒスタミン媒介性アレルギー反応、リュウマチ性関
節炎、珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症、その他の肺
臓の慢性炎症疾患、特発性好酸球過剰症候群、内毒素性
ショック、ヒスタミン媒介アレルギー性反応、プロスタ
グランジン−非依存性発熱、および再生不良性貧血、そ
の他の骨髄不全性疾患など、を処置するために使用でき
る。
【００７５】これらポリペプチド、その断片またはその
他の誘導体、または同族体、またはこれらを発現する細
胞はそれらに対する抗体を生産するための免疫原として
使用できる。これら抗体は、例えばポリクローナルまた
はモノクローナル抗体であることができる。本発明はま
たキメラ、単一鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断
片またはＦａｂ発現ライブラリー生産物を包含する。そ
のような抗体と断片との生産のためには当業界で公知の
様々な操作法を使用しうる。
他の誘導体、または同族体、またはこれらを発現する細
胞はそれらに対する抗体を生産するための免疫原として
使用できる。これら抗体は、例えばポリクローナルまた
はモノクローナル抗体であることができる。本発明はま
たキメラ、単一鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断
片またはＦａｂ発現ライブラリー生産物を包含する。そ
のような抗体と断片との生産のためには当業界で公知の
様々な操作法を使用しうる。
【００７６】本発明の配列に対応するポリペプチドまた
はその生体内受容体に対する抗体はそのポリペプチドを
直接に動物に注射するかまたは動物、好ましくはヒト以
外、に投与することによって生産できる。こうして得た
抗体はポリペプチドに結合する。この様式で、そのポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえ全天然ポリペ
プチドを結合する抗体を発生させるために使用できる。
そのような抗体を次にそのポリペプチドを発現する組織
から、そのポリペプチドを分離するために使用できる。
はその生体内受容体に対する抗体はそのポリペプチドを
直接に動物に注射するかまたは動物、好ましくはヒト以
外、に投与することによって生産できる。こうして得た
抗体はポリペプチドに結合する。この様式で、そのポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえ全天然ポリペ
プチドを結合する抗体を発生させるために使用できる。
そのような抗体を次にそのポリペプチドを発現する組織
から、そのポリペプチドを分離するために使用できる。
【００７７】モノクローナル抗体を製造するには、連続
的細胞系培養によって抗体を与えるいかなる技術も使用
できる。例にはハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６
巻：４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒなど、１９８３年、
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、
およびヒトのモノクローナル抗体を生産するためのＥＢ
Ｖハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅなど、１９８５年、
「モノクローナル抗体および癌治療法（Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ・ａｎｄ・Ｃａｎｃｅｒ
・Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ・Ｒ．Ｌｉｓｓ社、
中、７７〜９６頁）を包含する。
的細胞系培養によって抗体を与えるいかなる技術も使用
できる。例にはハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６
巻：４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒなど、１９８３年、
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、
およびヒトのモノクローナル抗体を生産するためのＥＢ
Ｖハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅなど、１９８５年、
「モノクローナル抗体および癌治療法（Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ・ａｎｄ・Ｃａｎｃｅｒ
・Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ・Ｒ．Ｌｉｓｓ社、
中、７７〜９６頁）を包含する。
【００７８】単鎖抗体の生産法について記載された技術
（米国特許４９４６７７８号）は単鎖抗体を生産するよ
うにこの発明の免疫原性ポリペプチド生産物に適応でき
る。
（米国特許４９４６７７８号）は単鎖抗体を生産するよ
うにこの発明の免疫原性ポリペプチド生産物に適応でき
る。
【００７９】本発明はまたポリペプチドの機能を阻止ま
たは除去する本発明のポリペプチドの拮抗剤／阻害剤を
も指向する。
たは除去する本発明のポリペプチドの拮抗剤／阻害剤を
も指向する。
【００８０】そこで、例えば、拮抗剤は本発明のポリペ
プチドに結合して、その機能を阻止または除去する。こ
の拮抗剤は、例えばこのポリペプチドまたは、場合によ
ってはオリゴヌクレオチドに結合するポリペプチドに対
する抗体であることができよう。阻害剤の例は、ポリペ
プチドの触媒部位に結合し、占有して基質が触媒部位に
接近できなくして正常な生物学的活性を阻止するような
低分子である。低分子の例は、これに限定するものでは
ないが、低分子のペプチドまたはペプチド様分子であ
る。
プチドに結合して、その機能を阻止または除去する。こ
の拮抗剤は、例えばこのポリペプチドまたは、場合によ
ってはオリゴヌクレオチドに結合するポリペプチドに対
する抗体であることができよう。阻害剤の例は、ポリペ
プチドの触媒部位に結合し、占有して基質が触媒部位に
接近できなくして正常な生物学的活性を阻止するような
低分子である。低分子の例は、これに限定するものでは
ないが、低分子のペプチドまたはペプチド様分子であ
る。
【００８１】その他に、本発明のポリペプチドに対する
拮抗剤には正常には本発明のポリペプチドが結合する受
容体に結合するものを採用しうる。この拮抗剤は、天然
蛋白質の受容体部位を認識し、結合するが、しかしなが
ら、それらはポリペプチドの不活性型であって受容体部
位を占有するので、そこでＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、お
よびＭＩＰ−１γの活性を阻止するような、極めて近縁
な蛋白質でありうる。これらの方法において、これら拮
抗剤／阻害剤は白血球の誘引および活性化を予防するこ
とによって抗炎症薬剤として使用しうる。それらはまた
自己免疫性および慢性炎症性および感染性疾患におい
て、マクロファージおよびその前駆体および好中球、好
塩基球、Ｂリンパ球およびある種のＴ細胞サブセットの
化学走化性および活性化を阻止するために；ＭＩＰ誘発
性幹細胞および好塩基球の脱顆粒化を阻止し、そこでヒ
スタミン媒介アレルギー反応を低下させるために；ＭＩ
Ｐが生合成を刺激するＩＬ−１およびＴＮＦが一次的に
起こす有害な過程を阻止するために；リュウマチ性関節
炎；およびＭＩＰが駆動する主に好中球性炎症からマク
ロファージが主役の病理へ移行して急性の消散する炎症
的防御から慢性の究極的には破壊的な、たとえば自己免
疫疾患などの、機構への移行を阻止するために；有用で
ありうる。
拮抗剤には正常には本発明のポリペプチドが結合する受
容体に結合するものを採用しうる。この拮抗剤は、天然
蛋白質の受容体部位を認識し、結合するが、しかしなが
ら、それらはポリペプチドの不活性型であって受容体部
位を占有するので、そこでＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、お
よびＭＩＰ−１γの活性を阻止するような、極めて近縁
な蛋白質でありうる。これらの方法において、これら拮
抗剤／阻害剤は白血球の誘引および活性化を予防するこ
とによって抗炎症薬剤として使用しうる。それらはまた
自己免疫性および慢性炎症性および感染性疾患におい
て、マクロファージおよびその前駆体および好中球、好
塩基球、Ｂリンパ球およびある種のＴ細胞サブセットの
化学走化性および活性化を阻止するために；ＭＩＰ誘発
性幹細胞および好塩基球の脱顆粒化を阻止し、そこでヒ
スタミン媒介アレルギー反応を低下させるために；ＭＩ
Ｐが生合成を刺激するＩＬ−１およびＴＮＦが一次的に
起こす有害な過程を阻止するために；リュウマチ性関節
炎；およびＭＩＰが駆動する主に好中球性炎症からマク
ロファージが主役の病理へ移行して急性の消散する炎症
的防御から慢性の究極的には破壊的な、たとえば自己免
疫疾患などの、機構への移行を阻止するために；有用で
ありうる。
【００８２】これら拮抗剤／阻害剤はまた珪肺症、類肉
腫症、特発性肺線維症およびその他の肺慢性炎症性疾患
の処置；ＭＩＰ生産の上昇は好酸球生産および移動を悪
化させるので特発性好酸球過剰性症候群の処置；内毒素
に反応するＭＩＰ水準上昇に起因する内毒素性ショック
の処置；ＭＩＰ誘発性の幹細胞および好塩基球脱顆粒化
阻止によるヒスタミン媒介アレルギー反応の処置；ＭＩ
Ｐ−１αが誘発するプロスタグランジン非依存性発熱の
阻止；および形成不全性貧血およびその他の骨髄不全症
例における過剰なＭＩＰ−１αによる抑制効果の予防；
にも有用でありうる。
腫症、特発性肺線維症およびその他の肺慢性炎症性疾患
の処置；ＭＩＰ生産の上昇は好酸球生産および移動を悪
化させるので特発性好酸球過剰性症候群の処置；内毒素
に反応するＭＩＰ水準上昇に起因する内毒素性ショック
の処置；ＭＩＰ誘発性の幹細胞および好塩基球脱顆粒化
阻止によるヒスタミン媒介アレルギー反応の処置；ＭＩ
Ｐ−１αが誘発するプロスタグランジン非依存性発熱の
阻止；および形成不全性貧血およびその他の骨髄不全症
例における過剰なＭＩＰ−１αによる抑制効果の予防；
にも有用でありうる。
【００８３】これら抗体はまた病状進行および治療的介
入の効果を把握するための予後適用および臨床スクリー
ニングにも有用であると思われる。常在性マクロファー
ジはＭＩＰｍＲＮＡを全くまたは殆ど生産しないので、
これを検出できる診断用抗体は自己免疫疾患および慢性
炎症性および感染性病状の有用な指標であると思われ
る。
入の効果を把握するための予後適用および臨床スクリー
ニングにも有用であると思われる。常在性マクロファー
ジはＭＩＰｍＲＮＡを全くまたは殆ど生産しないので、
これを検出できる診断用抗体は自己免疫疾患および慢性
炎症性および感染性病状の有用な指標であると思われ
る。
【００８４】この拮抗剤／阻害剤は、たとえば前記のよ
うな医薬的担体との組成物中に採用しうる。
うな医薬的担体との組成物中に採用しうる。
【００８５】本発明をさらに下記実施例に照らして記載
する。しかしながら、本発明はこれら実施例に限定され
ないことを理解すべきである。別段の指摘がない限り、
比率または量は重量による。下記実施例の理解を促進す
るために頻繁に出現する方法および／または用語をいく
つか記載しよう。
する。しかしながら、本発明はこれら実施例に限定され
ないことを理解すべきである。別段の指摘がない限り、
比率または量は重量による。下記実施例の理解を促進す
るために頻繁に出現する方法および／または用語をいく
つか記載しよう。
【００８６】「プラスミド」は小文字のｐと、その前に
および／またはそれに続く、大文字および／または数字
とで示す。ここで出発プラスミドは商業的に購入可能で
あるか、公衆が制限なしに入手しうるか、または出版さ
れた操作法に従って入手可能なプラスミドから構築する
ことができる。これに加え、前記のものと均等なプラス
ミドは当業者に公知であり、通常の熟練者には明白とな
ろう。
および／またはそれに続く、大文字および／または数字
とで示す。ここで出発プラスミドは商業的に購入可能で
あるか、公衆が制限なしに入手しうるか、または出版さ
れた操作法に従って入手可能なプラスミドから構築する
ことができる。これに加え、前記のものと均等なプラス
ミドは当業者に公知であり、通常の熟練者には明白とな
ろう。
【００８７】ＤＮＡの「消化」はＤＮＡ中でのある配列
でのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的切断を示
す。ここで使用する様々な制限酵素は商業的に購入可能
で、それらの反応条件、補助因子およびその他の必要条
件は通常の当業者に公知なようにして使用されよう。分
析目的のためには、典型的にはプラスミドまたはＤＮＡ
断片１μｇを酵素約２単位とともに緩衝液約２０μＬ中
で使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を分離
する目的のためには、典型的には５から５０μｇのＤＮ
Ａを２０から２５０単位の酵素でさらに大きい容積中で
消化する。特定の制限酵素用に適当な緩衝液および基質
量は製造社が指定する。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常使用されるが、供給社の指示に従っ
て変動しうる。消化後、反応物を直接にポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動して所期の断片を分離する。
でのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的切断を示
す。ここで使用する様々な制限酵素は商業的に購入可能
で、それらの反応条件、補助因子およびその他の必要条
件は通常の当業者に公知なようにして使用されよう。分
析目的のためには、典型的にはプラスミドまたはＤＮＡ
断片１μｇを酵素約２単位とともに緩衝液約２０μＬ中
で使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を分離
する目的のためには、典型的には５から５０μｇのＤＮ
Ａを２０から２５０単位の酵素でさらに大きい容積中で
消化する。特定の制限酵素用に適当な緩衝液および基質
量は製造社が指定する。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常使用されるが、供給社の指示に従っ
て変動しうる。消化後、反応物を直接にポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動して所期の断片を分離する。
【００８８】切断した断片のサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ，Ｄ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅ
ｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）に記載の８％ポ
リアクリルアミドゲルを使用して実行する。
ｅｌ，Ｄ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅ
ｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）に記載の８％ポ
リアクリルアミドゲルを使用して実行する。
【００８９】「オリゴヌクレオチド」は化学合成された
ものでもよい一本鎖ポリデオキシヌクレオチド１個か、
相補二本鎖ポリデオキシヌクレオチドかのいずれかを示
す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’−ホスフ
ェートを持たないので、キナーゼの存在下でもＡＴＰで
ホスフェートを付加しなければ、他のオリゴヌクレオチ
ドには結合しない。合成オリゴヌクレオチドは脱燐酸化
していない断片に結合する。
ものでもよい一本鎖ポリデオキシヌクレオチド１個か、
相補二本鎖ポリデオキシヌクレオチドかのいずれかを示
す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’−ホスフ
ェートを持たないので、キナーゼの存在下でもＡＴＰで
ホスフェートを付加しなければ、他のオリゴヌクレオチ
ドには結合しない。合成オリゴヌクレオチドは脱燐酸化
していない断片に結合する。
【００９０】「結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」は二本鎖核
酸断片２個の間のホスホジエステル結合形成の過程を示
す（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．など、前出、１４６頁）。
別段の指摘がない限り、結合は約等モル量の結合すべき
両ＤＮＡ断片０．５μｇについてＴ４ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）１０単位とともに既知の緩衝液および
条件を使用して達成しうる。
酸断片２個の間のホスホジエステル結合形成の過程を示
す（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．など、前出、１４６頁）。
別段の指摘がない限り、結合は約等モル量の結合すべき
両ＤＮＡ断片０．５μｇについてＴ４ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）１０単位とともに既知の緩衝液および
条件を使用して達成しうる。
【００９１】別段の指摘がない限り、形質転換はＧｒａ
ｈａｍ，Ｆ．とＶａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ，Ａ．、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７３年）の
方法に記載されているようにして実行した。
ｈａｍ，Ｆ．とＶａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ，Ａ．、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７３年）の
方法に記載されているようにして実行した。
【００９２】
【実施例】実施例１ ＭＩＰ−３の細菌での発現および
精製 ＭＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６
７６、は最初に５’およびプロセッシングされたＭＩＰ
−３蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）の配列お
よびＭＩＰ−３遺伝子の３’へのベクターの配列に対応
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増
幅する。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加的な
ヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。
５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列５’−ＴＣ
ＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ−
３’を持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロ
セッシングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸
から始まるＭＩＰ−３のコード配列１８ヌクレオチドを
包含する。３’−配列である３’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−５’はＸｂａＩ
部位とＭＩＰ−３ＤＮＡ挿入物の３’に位置するｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター配列とへの相補配列を包
含する。これら両制限酵素部位は細菌発現ベクターＰＱ
Ｅ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ
社、９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗ
ｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質
耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰ
ＴＧ制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リ
ボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制
限酵素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩ
およびＸｂａＩで消化する。増幅した配列をＰＱＥ−９
に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配
列を持つフレーム中に挿入する。図６はこの取合せの図
式的表現を示す。次に結合混合物を使用して商標Ｍ１５
／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸
菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ
４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４
の多重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）
も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力
により認定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロ
ニーを選択する。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析
により確認する。所期の構築物を含むクローンを一夜
（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ
（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体
培地中で生育させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１０
０から１：２５０の比率で大きな培地に植菌する。細胞
を光学的密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から
０．６までの間になるまで生育させる。次にＩＰＴＧ
（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド」）を最終濃度１ｍＭになるまで添加する。ＩＰＴＧ
はｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導
くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３か
ら４時間生育させる。次に細胞を遠心分離により収穫す
る。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジ
ン中に溶解する。稠明化後、溶解したＭＩＰ−３をこの
溶液からニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを
包含する蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロ
マトグラフィーして精製する。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．な
ど、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１
７７〜１８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−３（純度９５
％）はこのカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０
で溶離し、再生のため３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍ
Ｍ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元
型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整す
る。この溶液中で１２時間インキュベーション後、この
蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析する。
誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−
３の発現を証明する。
精製 ＭＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６
７６、は最初に５’およびプロセッシングされたＭＩＰ
−３蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）の配列お
よびＭＩＰ−３遺伝子の３’へのベクターの配列に対応
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増
幅する。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加的な
ヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。
５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列５’−ＴＣ
ＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ−
３’を持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロ
セッシングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸
から始まるＭＩＰ−３のコード配列１８ヌクレオチドを
包含する。３’−配列である３’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−５’はＸｂａＩ
部位とＭＩＰ−３ＤＮＡ挿入物の３’に位置するｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター配列とへの相補配列を包
含する。これら両制限酵素部位は細菌発現ベクターＰＱ
Ｅ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ
社、９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗ
ｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質
耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰ
ＴＧ制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リ
ボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制
限酵素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩ
およびＸｂａＩで消化する。増幅した配列をＰＱＥ−９
に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配
列を持つフレーム中に挿入する。図６はこの取合せの図
式的表現を示す。次に結合混合物を使用して商標Ｍ１５
／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸
菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ
４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４
の多重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）
も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力
により認定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロ
ニーを選択する。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析
により確認する。所期の構築物を含むクローンを一夜
（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ
（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体
培地中で生育させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１０
０から１：２５０の比率で大きな培地に植菌する。細胞
を光学的密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から
０．６までの間になるまで生育させる。次にＩＰＴＧ
（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド」）を最終濃度１ｍＭになるまで添加する。ＩＰＴＧ
はｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導
くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３か
ら４時間生育させる。次に細胞を遠心分離により収穫す
る。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジ
ン中に溶解する。稠明化後、溶解したＭＩＰ−３をこの
溶液からニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを
包含する蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロ
マトグラフィーして精製する。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．な
ど、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１
７７〜１８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−３（純度９５
％）はこのカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０
で溶離し、再生のため３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍ
Ｍ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元
型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整す
る。この溶液中で１２時間インキュベーション後、この
蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析する。
誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−
３の発現を証明する。
【００９３】実施例２ ＭＩＰ−４の細菌での発現およ
び精製 ＭＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６
７５、はまずプロセッシングされたＭＩＰ−４蛋白質の
５’−配列（マイナスシグナルペプチド配列）およびＭ
ＩＰ−４遺伝子の３’へのｐＢＳＫベクター中の配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用し
て増幅した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加
的なヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加し
た。５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列ＴＣＡ
ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣを
持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシ
ングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始
まるＭＩＰ−４のコード配列１８ヌクレオチドを包含す
る；３’−配列ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣＡＧＴはＸｂａＩ部位およびＭＩＰ−４ＤＮ
Ａ挿入物の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
ベクター配列への相補配列を包含する。これら両制限酵
素部位は細菌の発現ベクターｐＱＥ−９上の制限酵素部
位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ
・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３
１１）。ｐＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌
複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーター
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードす
る。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化
した。増幅した配列をｐＱＥ−９に結合し、ヒスチジン
タグおよびＲＢＳをコードする配列を持つフレーム中に
挿入した。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に
結合混合物を使用して商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱ
ｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株
を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑制因子
を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有
し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）も与える。形質転換
体はＬＢプレート上で生育する能力により認定し、アン
ピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プ
ラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認した。所
期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１
００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双
方を添加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させた。Ｏ
／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０の比率
で大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００
（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から０．６までの間になる
まで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭにな
るまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化
して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリングを誘
発する。細胞をさらに３から４時間生育させた。次に細
胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペレットをカオト
ロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解した。稠明化
後、溶解したＭＩＰ−４をこの溶液からニッケルキレー
トカラム上で６−Ｈｉｓタグを包含する蛋白質による強
固な結合をさせる条件下にクロマトグラフィーして精製
した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８
４年）。ＭＩＰ−４（純度９５％）はこのカラムから６
Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生の目的で
３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、
１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グル
タチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で１２時間
インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナ
トリウムに対して透析した。誘導後、１４ｋｄに対応す
る新蛋白質の存在がＭＩＰ−４の発現を証明した。（図
５）。
び精製 ＭＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６
７５、はまずプロセッシングされたＭＩＰ−４蛋白質の
５’−配列（マイナスシグナルペプチド配列）およびＭ
ＩＰ−４遺伝子の３’へのｐＢＳＫベクター中の配列に
対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用し
て増幅した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加
的なヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加し
た。５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列ＴＣＡ
ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣを
持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシ
ングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始
まるＭＩＰ−４のコード配列１８ヌクレオチドを包含す
る；３’−配列ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣＡＧＴはＸｂａＩ部位およびＭＩＰ−４ＤＮ
Ａ挿入物の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
ベクター配列への相補配列を包含する。これら両制限酵
素部位は細菌の発現ベクターｐＱＥ−９上の制限酵素部
位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ
・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３
１１）。ｐＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌
複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーター
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードす
る。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化
した。増幅した配列をｐＱＥ−９に結合し、ヒスチジン
タグおよびＲＢＳをコードする配列を持つフレーム中に
挿入した。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に
結合混合物を使用して商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱ
ｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株
を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑制因子
を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有
し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）も与える。形質転換
体はＬＢプレート上で生育する能力により認定し、アン
ピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プ
ラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認した。所
期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１
００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双
方を添加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させた。Ｏ
／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０の比率
で大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００
（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から０．６までの間になる
まで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭにな
るまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化
して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリングを誘
発する。細胞をさらに３から４時間生育させた。次に細
胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペレットをカオト
ロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解した。稠明化
後、溶解したＭＩＰ−４をこの溶液からニッケルキレー
トカラム上で６−Ｈｉｓタグを包含する蛋白質による強
固な結合をさせる条件下にクロマトグラフィーして精製
した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８
４年）。ＭＩＰ−４（純度９５％）はこのカラムから６
Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生の目的で
３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、
１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グル
タチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で１２時間
インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナ
トリウムに対して透析した。誘導後、１４ｋｄに対応す
る新蛋白質の存在がＭＩＰ−４の発現を証明した。（図
５）。
【００９４】実施例３ 組換えＭＩＰ−３のＣＯＳ細胞
中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−３ＨＡの発現は１）ＳＶ４
０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸
菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポ
リリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニ
ル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−４前
駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに
融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にク
ローニングするため、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロ
モーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマ
グルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして
（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈ
ｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、
３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。
ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したことで、Ｈ
Ａエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検
出が容易になる。
中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−３ＨＡの発現は１）ＳＶ４
０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸
菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポ
リリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニ
ル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−４前
駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに
融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にク
ローニングするため、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロ
モーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマ
グルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして
（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈ
ｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、
３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。
ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したことで、Ｈ
Ａエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検
出が容易になる。
【００９５】プラスミド構築の方策を次に記述する：Ｍ
ＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７
６はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳ
ＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライマー（５’
ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＧ
ＣＴ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コ
ドンから出発するＭＩＰ−３のコード配列１８ヌクレオ
チドとを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴ
ＧＧＧＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣ
−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン、
ＨＡタグおよびＭＩＰ−３のコード配列の最後の２０ヌ
クレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。それ
故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−３の
コード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、
ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ
部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片およびベ
クターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ
ｂａＩ制限酵素で消化し、結合する。結合混合物で大腸
菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ
・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒ
ｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、Ｃ
Ａ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質転
換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐
性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体
から分離し、制限分析によって正しい断片の存在を調査
する。組換えＭＩＰ−３の発現用に、ＤＥＡＥデキスト
ラン法によってこの発現ベクターをＣＯＳ細胞に遺伝子
移入する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験
室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓ
ｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、
（１９８９年））。ＭＩＰ−３−ＨＡ蛋白質の発現は放
射能標識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａ
ｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕ
ａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８
年））。遺伝子移入２日後に細胞を３５Ｓ−システイン
で８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性剤
（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−
４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯ
Ｃ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４年））で
溶解する。細胞溶解物および培地の双方をＨＡ特異的モ
ノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質を１５
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する。
ＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７
６はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳ
ＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライマー（５’
ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＧ
ＣＴ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コ
ドンから出発するＭＩＰ−３のコード配列１８ヌクレオ
チドとを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴ
ＧＧＧＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣ
−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン、
ＨＡタグおよびＭＩＰ−３のコード配列の最後の２０ヌ
クレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。それ
故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−３の
コード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、
ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ
部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片およびベ
クターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ
ｂａＩ制限酵素で消化し、結合する。結合混合物で大腸
菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ
・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒ
ｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、Ｃ
Ａ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質転
換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐
性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体
から分離し、制限分析によって正しい断片の存在を調査
する。組換えＭＩＰ−３の発現用に、ＤＥＡＥデキスト
ラン法によってこの発現ベクターをＣＯＳ細胞に遺伝子
移入する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験
室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓ
ｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、
（１９８９年））。ＭＩＰ−３−ＨＡ蛋白質の発現は放
射能標識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａ
ｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕ
ａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８
年））。遺伝子移入２日後に細胞を３５Ｓ−システイン
で８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性剤
（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−
４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯ
Ｃ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４年））で
溶解する。細胞溶解物および培地の双方をＨＡ特異的モ
ノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質を１５
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する。
【００９６】実施例４ 組換えＭＩＰ−４のＣＯＳ細胞
中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−４ＨＡの発現は１）ＳＶ４
０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸
菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポ
リリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニ
ル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−４前
駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに
融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にク
ローニングするため、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロ
モーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマ
グルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして
（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈ
ｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、
３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。
ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したことで、Ｈ
Ａエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検
出が容易になる。
中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−４ＨＡの発現は１）ＳＶ４
０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸
菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポ
リリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニ
ル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−４前
駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに
融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にク
ローニングするため、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロ
モーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマ
グルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして
（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈ
ｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、
３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。
ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したことで、Ｈ
Ａエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検
出が容易になる。
【００９７】プラスミド構築の方策を次に記述する：Ｍ
ＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７
５はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳ
ＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライマー（５’
ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧ
ＣＴＧＣＣ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く
開始コドンから出発するＭＩＰ−４のコード配列２０ヌ
クレオチドを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡ
ＧＡＴＣＡＡＢＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴ
ＡＴＧＧＧ-ＴＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴ
Ｃ−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コド
ン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−４のコード配列の最後の１
９ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。
それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−
４のコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタ
グ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂ
ａＩ部位を包含する。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片および
ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合する。結合混合物で大
腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏ
ｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質
転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、
耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換
体から分離し、制限分析によって正しい断片の存在を調
査する。組換えＭＩＰ−４の発現用に、この発現ベクタ
ーをＤＥＡＥデキストラン法によってＣＯＳ細胞に遺伝
子移入する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験
室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓ
ｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、
（１９８９年））。ＭＩＰ−４−ＨＡ蛋白質の発現は放
射能標識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａ
ｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕ
ａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８
年））。遺伝子移入２日後に、細胞を３５Ｓ−システイ
ンで８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性
剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ
−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％Ｄ
ＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。（Ｗｉｌｓｏ
ｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４
年））で溶解する。細胞溶解物と培地との双方をＨＡ特
異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質
を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する。
ＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７
５はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳ
ＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライマー（５’
ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧ
ＣＴＧＣＣ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く
開始コドンから出発するＭＩＰ−４のコード配列２０ヌ
クレオチドを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡ
ＧＡＴＣＡＡＢＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴ
ＡＴＧＧＧ-ＴＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴ
Ｃ−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コド
ン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−４のコード配列の最後の１
９ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。
それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−
４のコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタ
グ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂ
ａＩ部位を包含する。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片および
ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合する。結合混合物で大
腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏ
ｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質
転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、
耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換
体から分離し、制限分析によって正しい断片の存在を調
査する。組換えＭＩＰ−４の発現用に、この発現ベクタ
ーをＤＥＡＥデキストラン法によってＣＯＳ細胞に遺伝
子移入する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験
室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓ
ｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、
（１９８９年））。ＭＩＰ−４−ＨＡ蛋白質の発現は放
射能標識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａ
ｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕ
ａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８
年））。遺伝子移入２日後に、細胞を３５Ｓ−システイ
ンで８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性
剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ
−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％Ｄ
ＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。（Ｗｉｌｓｏ
ｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４
年））で溶解する。細胞溶解物と培地との双方をＨＡ特
異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質
を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する。
【００９８】実施例５ ヒト組織中でのＭＩＰ−３の発
現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ
−３の発現水準を調査した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮ
Ａｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏ
ｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で
分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１
０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィ
ルター上で染色する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌ
ｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮ
Ａ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒ
ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行う。標識したＤＮＡはＳ
ｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製する（５・Ｐｒｉｍ
ｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ・
Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィ
ルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４および
７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射能
標識した全長ＭＩＰ−３遺伝子と一夜６５℃でハイブリ
ド化する。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０℃
で強化スクリーンに一夜露出する。
現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ
−３の発現水準を調査した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮ
Ａｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏ
ｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で
分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１
０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィ
ルター上で染色する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌ
ｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮ
Ａ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒ
ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行う。標識したＤＮＡはＳ
ｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製する（５・Ｐｒｉｍ
ｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ・
Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィ
ルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４および
７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射能
標識した全長ＭＩＰ−３遺伝子と一夜６５℃でハイブリ
ド化する。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０℃
で強化スクリーンに一夜露出する。
【００９９】実施例６ ヒト組織中でのＭＩＰ−４の発
現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト細胞中でのＭＩＰ
−４の発現水準を調査した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮ
Ａｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏ
ｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で
分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１
０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィ
ルター上で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌ
ｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮ
Ａ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒ
ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡは
Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した。（５・Ｐｒ
ｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏ
ｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。
フィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４お
よび７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放
射能標識した全長ＭＩＰ−４遺伝子と一夜６５℃でハイ
ブリド化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０
℃で強化スクリーンに一夜露出した。図６参照。
現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト細胞中でのＭＩＰ
−４の発現水準を調査した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮ
Ａｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏ
ｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で
分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１
０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィ
ルター上で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌ
ｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮ
Ａ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒ
ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡは
Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した。（５・Ｐｒ
ｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏ
ｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。
フィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４お
よび７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放
射能標識した全長ＭＩＰ−４遺伝子と一夜６５℃でハイ
ブリド化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０
℃で強化スクリーンに一夜露出した。図６参照。
【０１００】実施例７ ＭＩＰ−１γの細菌での発現お
よび精製 ＭＩＰ−１γをコードするＤＮＡ配列ＰＢＬＳＫＭＩＰ
（ＡＴＣＣ＃７５５７２）はまずプロセッシングされた
ＭＩＰ−１γ蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）
の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して増幅し、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｂａＩに対応する付加的ヌクレオチドを５’および３’
配列に各々付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマ
ーは配列ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧ
ＧＧＡＣＣＴＴＡＣを持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位と
それに続くプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上
の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−１γコード配列１５
ヌクレオチドを包含する。３’−配列ＧＣＣＴＧＣＴＣ
ＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧは
ＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドンおよびＭＩＰ
−１γコード配列の最後の２０ヌクレオチドを包含す
る。これら両制限酵素部位は細菌の発現ベクターＰＱＥ
−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、
９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質耐性
（Ａｍｐｒ）、細菌複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制
御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソー
ム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素
部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩとＸｂ
ａＩとで消化した。増幅した配列をＰＱＥ−９に結合
し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を持
つフレーム中に挿入した。図６はこの取合せの図式的表
現を示す。次に結合混合物を使用して、商標Ｍ１５／ｒ
ｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ
１５／ｒｅｐ４株を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は
ｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多
重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）も与
える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力によ
り認定されるが、アンピシリン／カナマイシン耐性のコ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離して、制限
分析により確認した。所期の構築物を含むクローンを一
夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ
（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体
培地中で生育させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１０
０から１：２５０比の大きな培地に植菌する。細胞を光
学的密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から０．６
までの間になるまで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終
濃度１ｍＭになるまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑
制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのク
リアリングを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育
させた。次に細胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペ
レットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解
した。稠明化後、溶解したＭＩＰ−１γをこの溶液から
ニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを含有する
蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグラ
フィーして精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１
８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−１γ（純度９５％）は
このカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離
し、再生の目的で３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−
燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）お
よび２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整した。この
溶液中で１２時間インキュベーション後、この蛋白質を
１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析した。誘導後、
１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−１γの発
現を証明した。（図３）。
よび精製 ＭＩＰ−１γをコードするＤＮＡ配列ＰＢＬＳＫＭＩＰ
（ＡＴＣＣ＃７５５７２）はまずプロセッシングされた
ＭＩＰ−１γ蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）
の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して増幅し、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｂａＩに対応する付加的ヌクレオチドを５’および３’
配列に各々付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマ
ーは配列ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧ
ＧＧＡＣＣＴＴＡＣを持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位と
それに続くプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上
の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−１γコード配列１５
ヌクレオチドを包含する。３’−配列ＧＣＣＴＧＣＴＣ
ＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧは
ＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドンおよびＭＩＰ
−１γコード配列の最後の２０ヌクレオチドを包含す
る。これら両制限酵素部位は細菌の発現ベクターＰＱＥ
−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、
９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質耐性
（Ａｍｐｒ）、細菌複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制
御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソー
ム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素
部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩとＸｂ
ａＩとで消化した。増幅した配列をＰＱＥ−９に結合
し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を持
つフレーム中に挿入した。図６はこの取合せの図式的表
現を示す。次に結合混合物を使用して、商標Ｍ１５／ｒ
ｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ
１５／ｒｅｐ４株を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は
ｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多
重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）も与
える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力によ
り認定されるが、アンピシリン／カナマイシン耐性のコ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離して、制限
分析により確認した。所期の構築物を含むクローンを一
夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ
（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体
培地中で生育させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１０
０から１：２５０比の大きな培地に植菌する。細胞を光
学的密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から０．６
までの間になるまで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終
濃度１ｍＭになるまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑
制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのク
リアリングを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育
させた。次に細胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペ
レットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解
した。稠明化後、溶解したＭＩＰ−１γをこの溶液から
ニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを含有する
蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグラ
フィーして精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１
８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−１γ（純度９５％）は
このカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離
し、再生の目的で３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−
燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）お
よび２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整した。この
溶液中で１２時間インキュベーション後、この蛋白質を
１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析した。誘導後、
１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−１γの発
現を証明した。（図３）。
【０１０１】実施例８ 組換えＭＩＰ−１γのＣＯＳ細
胞中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−１γＨＡの発現は１）ＳＶ
４０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大
腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続く
ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデ
ニル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−
１γ前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレ
ームに融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領
域にクローニングしたので、組換え蛋白質の発現はＣＭ
Ｖプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエン
ザヘマグルチニン蛋白質から以前に報告されたようにし
て（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇ
ｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌ
ｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌ
ｌ、３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応す
る。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したのでＨ
Ａエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検
出が容易になる。
胞中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−１γＨＡの発現は１）ＳＶ
４０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大
腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続く
ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデ
ニル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−
１γ前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレ
ームに融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領
域にクローニングしたので、組換え蛋白質の発現はＣＭ
Ｖプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエン
ザヘマグルチニン蛋白質から以前に報告されたようにし
て（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇ
ｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌ
ｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌ
ｌ、３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応す
る。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したのでＨ
Ａエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検
出が容易になる。
【０１０２】プラスミド構築の方策を次に記述する：Ｍ
ＩＰ−１γをコードするＤＮＡ配列ｐＢＬＳＫＭＩＰ
（ＡＴＣＣ＃７５５７２）はプライマー２個を使用して
クローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築した。
５’−プライマー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣ-３’）はＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位とそれに続く開始コドンから始まるＭＩＰ−１γ
コード配列２０ヌクレオチドを包含し；３’配列（５’
ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧ
ＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡ
ＴＧＴＣＣＴＴＧ-５’）はＸｂａＩ部位の相補配列、
翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−１γコード配
列の最後の１９ヌクレオチド（停止コドンを含まない）
を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部
位、ＭＩＰ−１γコード配列とそれに続くフレームに融
合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コド
ンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤ
ＮＡ断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合した。
結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎ
ｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ
・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質
転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレ
ートに播種し、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを形質転換体から分離し、制限分析により正しい断
片の存在を調査した。組換えＭＩＰ−１γの発現用に、
この発現ベクターをＣＯＳ細胞にＤＥＡＥデキストラン
法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験室便覧
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ
ｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８
９年））によって遺伝子移入した。ＭＩＰ−１γ−ＨＡ
蛋白質の発現は放射能標識と免疫沈降法とにより検出し
た。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験
室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈ
ａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、
（１９８８年））。遺伝子移入２日後に細胞を３５Ｓ−
システインで８時間標識した。次に培地を集め、細胞を
界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、
１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、
０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。
（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁
（１９８４年））で溶解した。細胞溶解物および培地の
双方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させた。沈
降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
ＩＰ−１γをコードするＤＮＡ配列ｐＢＬＳＫＭＩＰ
（ＡＴＣＣ＃７５５７２）はプライマー２個を使用して
クローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築した。
５’−プライマー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣ-３’）はＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位とそれに続く開始コドンから始まるＭＩＰ−１γ
コード配列２０ヌクレオチドを包含し；３’配列（５’
ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧ
ＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡ
ＴＧＴＣＣＴＴＧ-５’）はＸｂａＩ部位の相補配列、
翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−１γコード配
列の最後の１９ヌクレオチド（停止コドンを含まない）
を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部
位、ＭＩＰ−１γコード配列とそれに続くフレームに融
合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コド
ンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤ
ＮＡ断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合した。
結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎ
ｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ
・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質
転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレ
ートに播種し、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを形質転換体から分離し、制限分析により正しい断
片の存在を調査した。組換えＭＩＰ−１γの発現用に、
この発現ベクターをＣＯＳ細胞にＤＥＡＥデキストラン
法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験室便覧
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ
ｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８
９年））によって遺伝子移入した。ＭＩＰ−１γ−ＨＡ
蛋白質の発現は放射能標識と免疫沈降法とにより検出し
た。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験
室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈ
ａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、
（１９８８年））。遺伝子移入２日後に細胞を３５Ｓ−
システインで８時間標識した。次に培地を集め、細胞を
界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、
１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、
０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。
（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁
（１９８４年））で溶解した。細胞溶解物および培地の
双方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させた。沈
降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【０１０３】実施例９ ヒト組織中でのＭＩＰ−１γの
発現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ
−１γの発現水準を調査した。細胞全ＲＮＡ標本はＲＮ
Ａｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏ
ｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で
分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１
０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィ
ルター上で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌ
ｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮ
Ａ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒ
ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡは
Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した（５・Ｐｒｉ
ｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ
・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フ
ィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４およ
び７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射
能標識した全長ＭＩＰ−１γ遺伝子と一夜６５℃でハイ
ブリド化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０
℃で強化スクリーンに一夜露出した。ＭＩＰ−１γ用の
メッセージＲＮＡは脾臓、肺臓、肝臓に豊富であり、ま
た、その他の組織ではそれらより少なかった。（図
５）。前記の教示に照らせば本発明の修正および変化は
無数に可能であり、それ故、添付請求項の範囲内にあ
り、本発明は特定的に記載したものとは異なるようにも
実行しうるものである。
発現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ
−１γの発現水準を調査した。細胞全ＲＮＡ標本はＲＮ
Ａｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏ
ｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で
分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１
０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィ
ルター上で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌ
ｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮ
Ａ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒ
ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡは
Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した（５・Ｐｒｉ
ｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ
・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フ
ィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４およ
び７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射
能標識した全長ＭＩＰ−１γ遺伝子と一夜６５℃でハイ
ブリド化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０
℃で強化スクリーンに一夜露出した。ＭＩＰ−１γ用の
メッセージＲＮＡは脾臓、肺臓、肝臓に豊富であり、ま
た、その他の組織ではそれらより少なかった。（図
５）。前記の教示に照らせば本発明の修正および変化は
無数に可能であり、それ故、添付請求項の範囲内にあ
り、本発明は特定的に記載したものとは異なるようにも
実行しうるものである。
【０１０４】
(１) 一般的情報： (ｉ) 出願人：リ等 (ii) 発明の名称： マクロファージ炎症蛋白質−３、
−４および−１γ (iii) 配列の数： ６ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレラ、バーン、ベイン、ギルフィラン、
セッチ、スチュアート・アンド・オルステイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュー・ジャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (Ｖ) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３．５インチディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２ (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト５．１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号：０８／１７３，２０９ (Ｂ) 出願日：１９９３年１２月２２日 (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号：０８／２０８，３３９ (Ｂ) 出願日：１９９４年３月８日 (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラーロ，グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６，１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−１６３ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０１−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０１−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４７４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１：
−４および−１γ (iii) 配列の数： ６ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレラ、バーン、ベイン、ギルフィラン、
セッチ、スチュアート・アンド・オルステイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュー・ジャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (Ｖ) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３．５インチディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２ (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト５．１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号：０８／１７３，２０９ (Ｂ) 出願日：１９９３年１２月２２日 (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号：０８／２０８，３３９ (Ｂ) 出願日：１９９４年３月８日 (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラーロ，グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６，１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−１６３ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０１−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０１−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４７４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１：
【数１】 (２) 配列番号２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：９３アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：配列番号２：
【数２】 (２) 配列番号３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３６６塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号３：
【数３】 (２) 配列番号４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１２１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：配列番号４：
【数４】 (２) 配列番号５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２７０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号５：
【数５】 (２) 配列番号６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：８９アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列：配列番号６：
【数６】
【図１】 ＭＩＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列および
それに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最
初のアミノ酸４５個は演繹された推測上のリーダー配列
を示す。
それに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最
初のアミノ酸４５個は演繹された推測上のリーダー配列
を示す。
【図２】 ＭＩＰ−４をコードするｃＤＮＡ配列および
それに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最
初のアミノ酸１９個は演繹された推測上のリーダー配列
を示す。
それに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最
初のアミノ酸１９個は演繹された推測上のリーダー配列
を示す。
【図３】 ＭＩＰ−１αの部分に照準を合わせたＭＩＰ
−３の演繹されたアミノ酸配列の一部に対応する。上段
の配列はヒトのＭＩＰ−３アミノ酸配列であり、下段の
配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球
ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
−３の演繹されたアミノ酸配列の一部に対応する。上段
の配列はヒトのＭＩＰ−３アミノ酸配列であり、下段の
配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球
ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
【図４】 アミノ酸配列２個を図示し、上段の配列はヒ
トＭＩＰ−４アミノ酸配列であり、下段の配列はヒトの
ＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベー
タ蛋白質前駆体）。
トＭＩＰ−４アミノ酸配列であり、下段の配列はヒトの
ＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベー
タ蛋白質前駆体）。
【図５】 大腸菌の細菌発現系内での発現後に精製した
ＭＩＰ−４蛋白質に対応する蛋白質バンドを示す。
ＭＩＰ−４蛋白質に対応する蛋白質バンドを示す。
【図６】 ＭＩＰ−４のノーザンブロット分析であっ
て、この蛋白質が最も共通に存在する細胞を示す。
て、この蛋白質が最も共通に存在する細胞を示す。
【図７】 ｐＱＥ−９ベクターの模式図である。
【図８】 ＭＩＰ−１γをコードするｃＤＮＡ配列およ
びそれに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。
最初のアミノ酸２４個は演繹されたリーダー配列を示
す。
びそれに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。
最初のアミノ酸２４個は演繹されたリーダー配列を示
す。
【図９】 ヒトＭＩＰ−１蛋白質の部分アミノ酸配列２
個を図示する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−１γであ
り、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁
桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
個を図示する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−１γであ
り、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁
桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
【図１０】 細菌発現系における発現および精製後のＭ
ＩＰ−１γ蛋白質に対応するレーン５における蛋白質バ
ンドを示す。
ＩＰ−１γ蛋白質に対応するレーン５における蛋白質バ
ンドを示す。
【図１１】 ＭＩＰ−１γのＣＯＳ発現に対応する蛋白
質バンドを示す。
質バンドを示す。
【図１２】 ＭＩＰ−１γのノーザンブロット分析であ
って、この蛋白質が最も共通に存在する組織を示す。
って、この蛋白質が最も共通に存在する組織を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 35/02 35/02 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 // Ｃ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ハオドン・リ アメリカ合衆国20878メリーランド、ゲイ ザーズバーグ、ラトリッジ・ドライブ 11033番 (72)発明者 クレイグ・エイ・ローゼン アメリカ合衆国20882メリーランド、レイ トンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 (72)発明者 スティーブン・エム・ルーベン アメリカ合衆国20832メリーランド、オル ネイ、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者 マーク・ディー・アダムズ アメリカ合衆国20878メリーランド、ノー ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA07 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 HA03 4C084 AA02 BA08 BA20 BA21 CA18 CA26 DA01 MA52 MA56 MA59 MA66 ZA512 ZA592 ZA892 ZB012 ZB212 ZB262 ZB272 ZB312 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 EA20 FA72 FA74 GA26
Claims (1)
- 【請求項１】 慢性感染症、癌、白血病、リンパ球性白
血病、免疫病、乾癬、卒中、血小板増加症、肺塞栓、及
び骨髄増殖性障害よりなる群から選択される疾病の処置
方法であって、その方法は、以下の群： （ａ）配列番号４のポリペプチドの成熟形； （ｂ）配列番号４の完全長のポリペプチド； （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの成熟形； （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３
ｃＤＮＡによりコードされる完全長のポリペプチ
ド；； （ｅ）（ａ）〜（ｂ）のいずれかのポリペプチドの断片
であって、該断片は白血球の誘引物質であり、又は骨髄
幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血
幹細胞を保護し、該断片は配列番号４の位置１０及び５
０においてＣｙｓ残基を含む断片； （ｆ）（ｃ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドの断片
であって、該断片は白血球の誘引物質であり、骨髄幹細
胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細
胞を保護し、該断片はＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号
中のＭＩＰ−３ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドの位置１０及び５０においてＣｙｓ残基を含む断片； （ｇ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドであっ
て、該ポリペプチドにおいては、（i）１以上のアミノ
酸残渣が置換され、そして１０、１１、３４、及び５０
位のＣｙｓ残基は保存され；（ii）アミノ酸残基の１つ
は置換基を含み、又は（iii）そのポリペプチドは他の
化合物と融合しており；該ポリペプチドは白血球の誘引
物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又
は癌化学療法の間造血幹細胞を保護するポリペプチド； （ｈ）65℃で0.5M NaPO4、ｐH 7.4、及び７％SDS中
で、配列番号３のコード領域の核酸の相補物に、又はＡ
ＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３ ｃＤＮ
Ａにハイブリダイズさせた後、0.5XSSC、0.1％SDSによ
り室温で２度及び60℃で２度の洗浄する核酸によりコー
ドされるポリペプチドであって；該ポリペプチドは白血
球の誘引物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻
害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護し、１０、
１１、３４、及び５０位のＣｙｓ残基は保存されている
ポリペプチド； （ｉ）配列番号４の１〜７６のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチド； より選択されるポリペプチドの有効量をその必要のある
患者に投与することを含む方法。
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