JPH06503710A

JPH06503710A - 酵母細胞におけるマクロファージ誘導タンパク質（ｍｉｐ）の発現

Info

Publication number: JPH06503710A
Application number: JP3515372A
Authority: JP
Inventors: テカンプ−オルソン，パトリシア; ガレゴス，キャロル　アン
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 1994-04-28
Also published as: EP0548214B1; ATE177472T1; WO1992005198A1; DE69130981D1; EP0548214A1; US5814484A; CA2091266A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵母細胞におけるマクロファージ誘導タンパク質（ＭＩＰ）の発現λ豆旦亙１マクロファージ誘導タンパク質（ＭＩＰ）は、ある種の哺乳類細胞（例えば、マクロファージおよびリンパ球）が、グラム陰性菌のリポ多糖およびフンカナバリンＡのような刺激物質に応答して産生ずるタンパク質である。したがって、ＭＩＰ分子には、感染症、癌、骨髄造血機能不全および自己免疫疾患を検出および治療する診断上の用途と治療上の用途とがある。

ネズミノＶＩＰ−１ハ、リボ多糖（ＬＰＳ）　テ刺激すｆＬｆＲＡＷ　２６４゜７細胞（すなわち、ネズミのマクロファージ膿瘍細胞系）から分泌される主要な分泌タンパク質である。このＭＩＰ−１を精製すると、ＭＩＰは２種の近縁タンパク質ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βからなることが見出されている（Ｗｏｌｐｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７巻、５７０頁、１９８７年；　５ｈｅｒｒｙら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５８巻、２２５１頁、１９８８年）ネズミのＭＩＰ−１ａとネズミのＭＩＦ−１βの両方に対するｃＤＮＡはクローン化され、配列が決定されている（Ｄａｖａｔｅｌｉｓら、Ｊ、ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１６７巻、１９３９頁、１９８８年；　５ｈｅｒｒｙら、上記文献）。

また、不ス′ミのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対するｃＤＮＡのクローン化および配列決定もなされている（　Ｂｒｏｗｎら、Ｊ、　１ｍｎ＋ｕｎ、　１４２巻、６７９頁、１９８９年；　ＫｖｏｎおよびＷｅｉｓｓｉａｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　８６巻、１９６３頁、１９８９年、およびＢｒｏｗｎらの上記文献）。両グループともに、フンカナバリンＡで処理することによって活性化させたネズミのヘルパーＴ細胞のＲＮＡから調製されたＣＤＮＡライブラリーから、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭ［Ｐ（βの同族体を単離した。これらの結果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βがＴ細胞の活性化に関与し得ることを示唆している。

いくつかのグループがＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのヒト同族体と思われるものをクローン化している。すべての場合、ｃＤＮＡは、活性化されたＴ細胞ＲＮＡに対して調製されたライブラリーから単離された。例えば、０ｂａｒｕら（Ｊ、　Ｂ　１ｏｃｈｅｔ　９９巻、８８５頁、１９８６年）およびＺｉｐｆｅｌら（Ｊ、　ｌｍｌ１ｕｎ、　１４２巻、１５８２頁、　１９８９年）の両者が、ＭＩＰ−１αに対して高い相同性（７６％）のタンノ＜り質をコードするｃＤＮＡのクローン化を報告している。同様に、Ｂｒｏｗｎら、上記文献；Ｚｉｐｆｅｌら、上記文献；　Ｌｉｐｅｓら（Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ　１、Ａｃａｄ、ＵＳＡ　８５巻、９７０４頁、１９８８年）およびＭｉｌｌｅｒら（Ｊ、　１ｍ５ｕｎ、　１４３巻、２９０７頁、１９８９年）は、ヒトｃＤＮＡのクローン化および配列決定を報告しており、これがＭＩＰ−１βに対して高い相同性（７５％）のタンパク質であることが推定される。上述の相同性の高いタンパク質に加えて、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは、最近報告された、免疫調節活性を宵する近縁タンパク質のファミリーに漠している（再検討のために５ｈｅｒｒｙらの上記文献を参照のこと）。

ＭＩＰ−１の生物活性の決定は、天然のＭＩＰ−１を利用して開始されたが、近年ではＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの組換え体が利用されている。精製された天然のＭＩＰ−１（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのポリペプチドを含有している）を、ネズミの足跡内に皮下注射、またはウサギの槽内を通じて髄液に注射すると急性炎症を起こす（ｆｏｌｐｅおよびＣｅｒａｍｉ、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　３巻、２５６５頁、１９１１９年；　５ａｕｋｋｏｎｅｎら、Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　、　１７１巻、４３９頁、１９９０年）。天然のＭＩＰ（をウサギに静脈内注射すると、単発作性熱が迅速に起こる（　Ｄａｖａｔｅｌ　ｉｓら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、１０６６頁、１９８９年）。

ＭＩＰ−１のこれらの前炎症特性は、直接的または間接的なものであり得るが、この特性に加えて、ＭＩＰ−１は、滅菌創傷チャンバーを用いるネズミの実験モデルにおいて、創傷治癒の炎症の早期段階中で回収されている（Ｆａｈｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、　２巻、９２頁、１９９０年）。

また、ＶＩＰ−１は免疫調節にも関与している。非活動性Ｔ細胞を抗原および窒素で刺激すると、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２およびＩＬ−４を含有するこのサイトカインのスーパーファミリーのいくつかのメンバーの発現が著しく誘導される（　５ｈｅｒｒｙおよびＣｅｒａ＠ｉ、　Ｃｕｒｒ、　０ｐｉｎ、　１ｍｍｕｎ、　、　３巻、５６頁、１９９１年）ｏＭＩＰ−１は、マクロファージの機能に対していくつかの影響を与える。

ＭＩＰ−１で処理されたマクロファージは、ｆＥＩ（ｌｆｆｌ瘍細胞に対して直接、細胞毒性ではないが、腫瘍標的に対して、マクロファージの抗体非依存性の細胞毒性の増大を示した。ＭＩＰ−１で処理すると、成熟組織中のマクロファージの増殖が刺激された。

この作用は、Ｃ５Ｆ−１およびＧＭ−ＣＳＦの両方と共同作用性であった。

チオグリコレートで誘導された腹膜滲出液中のマクロファージを天然のダブレットＭＩＰ−１とインキュベートしたところ、ＴＮＦおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡが発現され、これらの誘導作用は、細胞がＩＦＮ−γによって共に刺激されるときに著しく増大した。

組換え法で誘導されたＶＩＰ−１αのペプチドのみの精製調製物だけが、マクロファージ中にＴＮＦおよびＩＬ−６を誘導したが、ＭＩＰ−１βは誘導しなかった。実際には、２倍程度の過剰量のＭＩＰ−１βで、ＭＩＰ−１αによるＴＮＦ誘導がかなりブロックされた。ＶＩＰ−１のこれらの明らかな「マクロファージ活性化」特性とは対照的に、このサイトカインはマクロファージの酸化的バーストをトリガーできないか、またはマクロファージ表面へのｌａの発現を増大するよう調節できなかった。これらのデータをまとめてみると、ＭＩＰ−１ペプチドは、これら細胞の起源の自己分泌モジュレータ−として作用することを示しており、かつペプチドはｉｎ　ｖｉｖｏで炎症の刺激に対するマクロファージの応答を調節するのに関与し得る可能性があることを示している。

天然ＶＩＰ−１および組換えＭＩＰ−１α、ならびにＭＩＰ−１βについて決定された生物活性の中には、コロニー刺激因子を促進する活性がある（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７０巻、１５８３頁、　１９８９年；　Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、Ｂｌｏｏｄ　７６巻、１１１０頁、１９９０年）。

ネズミの天然ＶＩＰ−１またはネズミの組換えＶＩＰ−１αは、分化エリスロポイエチンＩＬ−３依存性の造血好原細胞であって低分化の細胞の増殖を阻害するが、組換えＭＩＰ−１βは、この細胞の増殖を阻害しないことが見出されている（　Ｇｒａｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４巻、４４２頁、１９９０年、Ｂｒｏｘｌｌｅｙｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、　７６巻、１１１０頁、１９９０年）。生物活性を決定するには精製された因子を大量に必要とし、しかもこれらの因子を天然物から単離することが困難であるために、ＶＩＰタンパク質を組換えＤＮＡ法で産生ずることが望ましい。

ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−１に関連した遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーは、以下に述べる組換えＤＮＡ法で発現されている。

そのうえ、ＭＩＰ−１遺伝子フアミリーのメンバーには関連かうすいメンバーであるＭＩＰ−２遺伝子フアミリーのメンバーについてのバックグランドデータも含まれる。ネズミのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βはＣＱＳ細胞中で、独立して発現されている（　Ｇｒａｈａｍらの上記文献）。ネズミＭＩＰ−１αのヒト同族体と思われるタンパク質をコードするＬＤ７８ｃＤＮＡ　（Ｏｂａｒｕらの上記文献）は、ヒトＩＬ−２へのカルボキシル末端融合体として、ｌ、、ｃｏｌｉ中オよヒＣＯ３細胞中に発現されている（Ｙａｍａｍｕｒａら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、８４巻、１７０７Ｍ、１９．５９年）。ＭＩＰ−１フアミリーのタンパク質に相同のタンパク質をコードするｃＤＮＡであるヒトｌ−３０９が、分泌タンパク質をコードすることを確かめるためにｃｏｓ−を細胞で発現されている（Ｍｉｌｌｅｒらの上記文献）。ＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１βに相同のタンパク質をコードするｃＤＮＡであるＪＥが、Ｃ０５（細胞内で発現されており、ＪＥは約１２　ｋＤａのポリペプチドのコアをコードする（Ｒｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５巻、３７３８頁、１９８８年）。

ＭＩＰ−２と相同のタンパク質をコードするｃＤＮＡであるＫＣが、ＣＯ５−１細胞内で発現され、分泌タンパク質をコードすることが報告されている（　Ｏｇｕｅｎｄｏら、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４巻、４１３３Ｌ１９８９年）。結合組織活性化ペプチド−ｍ　（ＣＴＡＰ、　Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈら、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｔ２６１巻、７１９頁、１９８６年）およびＩＰ−１０（ＬｕｓｔｅｒおよびＲａｖｅｔｃｈ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６６巻、１０８４頁、１９８７年）はともにＭＩＰ−２遺伝子フアミリーのメンバーであるが、それぞれ酵母中およびＥ、ｃｏｌｉ中でα因子融合体として発現されている。

Ｍａｉｏｎｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻、７７頁、１９９０年）は、ヒト血小板因子４　（ＭＡＰ−２７ｙミリ−）を、ｇ、ｃｏｌｉのβ−グルクロニダーゼの３５個のアミノ酸とのタンパク質融合体として、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現させた。不溶性の融合体は、生物活性物質を生成させるために臭化シアンで切断しなければならない。Ｌｉｎｄｌ＋Ｊら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８５巻、９１９９頁、１９８８年）は、ＭＩＰ−２フアミリーのメンバーであるＮＡＦ　（ＩＬ−８）を、ｉ、ｃｏｌｉ中に発現させた。

精製して復元させた後、この組換えタンパク質は、天然分子について同定されたのと同じ生物活性を持っていることが見出された。また、Ｆｕｒｕｔａら（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０６巻、４３６頁、１９８９年）はＩＬ−８（ＭＤＮＣＦ）を旦、ｃｏｌｉ中に発現させた。Ｌｉｐｅｓら（上記文献）は、Ａｃｔ−２ｃＤＮＡのバ牛ユロウイルスでの発現を報告したが、このｃＤＮＡはヒトＭＩＰ −１βをコードしている。

最後になるが、Ｇ　ｆｂｒｏｎｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５巻、１６０１頁、１９８９年）は、内皮ＩＬ−８をヒト２９３細胞中で発現させて、組換え体および天然物質が同じ生物活性をもっていることを示した。しかし、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは、まだ酵母細胞中では発現されていない。

このように、哺乳類の炎症伝達タンパク質の有効量を得る経済的な方法を提供する、該タンパク質のさらなる供給源が当該技術分野で要望されている。

λ豆立！１本発明の目的は、哺乳類マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰｓ）を酵母中で産生ずるための鋳型として活性のＤＮＡ分子を提供することである。

本発明の他の目的は、哺乳類マクロファージ炎症タンパク質を産生ずるための鋳型として活性のＤＮＡ分子を含有する酵母細胞を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｍ［Ｐ−１ポリペプチドの製造方法を提供することである。

本発明のさらに池の目的は、ＭＩＰ−１の組成物を提供することである。

本発明のこれらの目的とその他の目的は、以下に述べる１つ以上の実施態様によって提供されるものである。１つの実施態様において、転写の順に（ａ）酵母中で作動する転写調節領域；　（ｂ）ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βからなる群から選択される哺乳類タンパク質をコードする領域とを含み、酵母中で上記哺乳類タンパク質を産生ずるための鋳型として活性なりＮＡ分子が提供される。

本発明の他の実施態様において、転写の順に（ａ）酵母中で作動する転写調節領域、　（ｂ）ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βからなる群から選択される哺乳類タンパク質をコードする領域とを含み、酵母中で上記哺乳類タンパク質を産生ずるための鋳型とじて活性なりＮＡ分子が提供される。

本発明のさらに他の実施態様では、ＭＩＰポリペプチドを産生ずるための方法が提供される。この方法は、転写の順に（ａ＞酵母中で作動する転写調節領域；　（ｂ）ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βからなる群から選択される哺乳類タンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ分子であって、酵母中で上記哺乳類タンパク質を産生ずるための鋳型として活性なりＩＪＡ分子を含有する酵母細胞を、栄養培地で増殖させてそれによってＶＩＰを発現させることを含有する。

本発明のさらに他の実施態様では、組成物が提供される。

この組成物は、ネズミＶＩＰ−１α、ネズミＭＩＰ−１β、ヒトＭＩＰ−１αおよびヒトＭＩＰ−１βからなる群から選択される哺乳類タンパク質を含有し、ここで該ＭＩＰはＭＩＰでない哺乳類タンパク質を実質的に含まず、そして該ＭＩＰは酵母細胞中で合成される。

本発明は、当該技術分野に、哺乳類ＭＩＰタンパク質を大量に製造する経済的な手段を提供するものである。本発明によってこれらのタンパク質の生物活性の十分な全範囲を測定することができ、かつこれらタンパク質を診断と治療に使用できる。

図面の簡単な説明図１は、ヒトＭＩＰ−１αのｃＤＮＡ配列と推定タンパク質配列を示す。

図２は、ヒトＭＩＰ−１βのｃＤＮＡ配列と推定タンパク質配列を示す。

図３は、ＭＩＰ−１同族体の推定アミノ酸配列の比較を示す。

ｌ豆恋１亙呈鳳皿哺乳類のＶＩＰタンパク質は、酵母細胞中で発現され得、該細胞から分泌させることができるということが本発明で発見されたのである。このようにして発現されたタンパク質は生物活性をもっている。したがって適切なりＮＡ構築物で形質転換された酵母細胞は、治療および研究に用いるＭＩＰの適切な起源になる。

ＶＩＰ−１は、造血幹細胞の増殖の一次の負の調節因子（ｐｒｉｍａｒｙ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒ＋４ｕｌａｔｏｒ）として作用するモノカインである。

例えばＶＩＰ−１は、原始造血細胞（ｐｒｉｍａｔｉｖｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）　（ＣＦＵ−Ａ）中でのＤＮＡ合成を阻害することが知られている（Ｇｒａｈａｍらの前記文献）。さらに、ＭＩＰ−４は、より成熟した造血細胞の増殖を促進する。これらの細胞には、ＧＭ−ＣＳＦで刺激されたＣＦＵ−ＧＭ　（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒらの上記文献）が含まれる。

本発明の発見によって、酵母中でＶＩＰ−１タンパク質を製造するためのＤＮＡ分子および宿主細胞が提供される。このＤＮＡ分子は少なくとも１つの哺乳類ＶＩＰ−１タンパク質をコードする領域を含有している。このＭＩＰ−１は、例えばヒトもしくはネズミのものであり得、αもしくはβサブユニットで構成され得る。

さらに、ＶＩＰ−１のコーディング領域は”突然変異タンパク質”のような近縁タンパク質をコードし得る。これらのタンパク質は、例えば置換、欠失もしくは挿入によってわずかに変更されて配列の１つ以上のアミノ酸が変化した、密接な関係にある近縁タンパク質である。好ましくは約８より少ないアミノ酸が変更され、通常は４以下で、より一般的には２以下のアミノ酸が変更される。保存的置換すること、すなわち１つのアミノ酸を、電荷のような特性が同様の別のアミノ酸と交換することが好ましい。突然変異タンパク質は、一般に、親タンパク質の活性をすべて保持しているが、自然タンパク質に比べて安定性などの有用な特性が向上している。さらにＭｌｐ−ｔのコーディング領域は一般に先端切断型のＭＩＰ−１をコードしている。先端切断型のタンパク質はＭＩＰ−１の活性もしくはユニークエピトープを保持している。

そのコーディング領域は、酵母内で作動する転写調節領域に連結される。その転写調節領域は、所望の場合に、誘導発現または構成的発現を行い得る。調節領域は、最小限、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始するプロモーターを提供する。

その調節領域は所望の調節特性を有するいずれの酵母遺伝子由来のものでもあり得る。たとえば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキンラーゼ、ホスホフルクロキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３ −ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが使用され得る。これらのプロモーターは当該技術分野ではよく知られている。

転写調節領域はコーディング領域に連結されて調節領域から始まる転写がコーディング領域を通じて続く。本発明のＤＮＡ分子が酵母細胞内に存在すると、ＭＩＰメツセンジャーＲＮＡが形成され翻訳される。本発明による発現は、ＤＮＡ配列が転写され次いで翻訳されてＨＩＰタンパク質を産生ずることを意味する。

酵母のプロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コーディング配列（例えば構造遺伝子）の下流（３）゛転写を始め、ｍＲＮＡにすることができるＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コーディング配列の５′末端に近接して位置している転写開始領域をもっている。この転写開始領域は一般にＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ＴＡＴＡボックス）および転写開始部位を含有している。さらに酵母プロモーターは、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる蔦２のドメインを宵し得る。これは存在している場合は、通常構造遺伝子から遠位にある。このＵＡＳによって調節された（誘導性）発現が可能になる。ＵＡＳがないと構成性発現が起こる。調節された発現は、正と負の場合があり、これによって転写が増大もしくは減少する。

酵母は、活性代謝経路によって発酵する生物である。従ってその代謝経路での酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。その酵素の例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤ）り　（Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰもしくはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）　（Ｅ、Ｐ、Ｏ公開第３２９２０３号）がある。酸性ホスファターゼをフードする酵母団遺伝子もまた有用なプロモーター配列を提供する（　Ｍｉｙａｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　ｃ　ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０巻、１頁、１９８３年）。

さらに、天然には発生しない合成のプロモーターも酵母のプロモーターとして機能する。例えば１つの酵母のプロモーターのＵＡＳ配列を、もう１つの酵母のプロモーターの転写活性化領域と結合させて、合成のハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰの転写活性化領域に結合したＡＤＨの調節配列（米国特許第４．８７６、１９７号、第４．８８０．７３４号）がある。ハイブリッドプロモーターの他の例には、ＧＡＰもしくはＰＹＫのような解糖酵素の遺伝子の転写活性化領域と結合した、Ｕ■ 、１．ｇもしくはＰＨ０５の遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーター類が含まれる（ヨーロッパ特許願公開第１６４５５５号）。さらに、酵母プロモーターとして、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然のプロモーターを含めることができる〔例えば次の文献を参照のこと。

Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７巻、１０７８頁、１９８０年；Ｈｅｎ１ｋｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、２８３巻、８３５頁、１９８１年ＨＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｃｕｒｒ、Ｔｏ　ｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｉｍｕｎｏｌ、、９６巻、１１９頁、１９８１年、；Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅ　ｃｉａｌ　ＩＩＩｏｒロユ鯰（に、Ｎ、Ｔｉｍｍ１ｓおよびＡ、Ｐｕｈｌｅｒｉ！ｊｌ）中のＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇら”Ｔｈｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−；Ｍｅｒｃｅｒｅａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら、Ｇｅｎｅ、１１巻、１６３頁、１９８０年ＨＰａｎｔｈｉｅｒら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅ但■９．２巻、　ＩＱ９Ｊｊ、１０００年コ　。

プロモーター配列はＶＩＰをフードするＤＩＩＩＡ分子と直接連結し得る。この場合、組換えタンパク質のＮ末端における第１アミノ酸は、常にメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによってフードされる。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとともにインビトロでインキュベートすることによってタンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、直接発現とは別の方法である。一般に内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をフードするＤＮＡ配列は異種のコーディング配列の５°末端に融合される。発現するとき、この構築物は２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の遺伝子は、異種遺伝子の５°末端に連結して酵母中で発現させることができる。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ配列は、切断可能な部位をコードしてもしなくてもよい（ＰＩえばＥＰＯ公開第１９６０５６号参照。

）もう１つの例は、ユビキチンの融合タンパク質である。この融合タンパク質は、好ましくは、プロセシング酵素（例えばユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）がユビキチンと異種のタンパク質とを切断するための部位を保持する、ユビキチンの”リーダー″領域もしくは“プロｎ領域で作られる。従って、この方法によって、天然の異種タンパク質を単離することができる（ＰＣＴ公開第ＷＯ３８１０２４０６６号；本願と同一の出願人による、１９８９年８月７日付は出願の米国特許願第３９０．５９９号；これらの出願の開示事項は本願に援用する）。

あるいは、酵母中で分泌を行うためのリーダー配列のフラグメントと異種遺伝子とを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作ることによって、異種タンパク質を細胞から増殖培地に分泌させることもできる。プロセシング部位（生体外または生体内）は、リーダーフラグメントと異種遺伝子の間でコードされるのが好ましい。好ましいインビボの部位としては、１ｙｓ−１ｙｓ、　ａｒｇ−ａｒｇ、　ｌｙｓ−ａｒｇおよびａｒｇ−１ｙｓのような二塩基配列がある。リーダ配列のフラグメントは、一般に、細胞からタンパク質を分泌させる、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（Ｅ、Ｐ、Ｏ公開第１２．８７３号；　Ｊ、Ｐ、Ｏ，公開第６２．０９６．０８６号）のおよびＡ因子の遺伝子（米国特許第４．５８８．６８４号）ような分泌される酵母タパク質の遺伝子から誘導され得る。あるいは、酵母内で分泌を行う、インターフェロンリーダーのごとき非酵母起源のリーダーがある（米国特許第４．７７５．６２２号）。ＶＩＰからシグナルペプチドを同時に切断することが好ましい。これは通常プロセシング部位で行われる。このプロセ／ングは、トランスロケーションの過程で、内因性酵母酵素によってインビボで行うことが好ましい。あるいは、インビトロのプロセシングを、非酵母の酵素または化学的切断法を用いて利用してもよい。

好ましい部類の分泌リーダーは、酵母のα因子遺伝子のフラグメントを利用するリーダーであり、このフラグメントは”プレ”シグナル配列と”プロ”領域の両方を含有している。

利用できる種類のα因子フラグメントとしては、全長のプレープロアルファ因子リーダー（約８３個のアミノ酸の残基）と、先端切断型のα因子リーダー（一般に約２５〜約５０個のアミノ酸の残基）とがある（米国特許第４．５４６．０８２号および同第４，８７０．００１１号、　Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第３２４２７４号）。分泌を行うα因子リーダーフラグメントを利用する別のリーダーとして、第１の酵母のプレ配列と、第２の酵母のα因子由来のプロ領域とで作ったハイブリッドα因子リーダーがある（例えばＰＣＴ第ＷＯ３９１０２４６３号参照）。

本発明のＤＮＡ分子は、一般に、ＭＩＰタンパク質のコーディング領域の３′末端に、転写の終止シグナルをもっている。このシグナルは、プロモーターまたはシグナル配列を供給するのに用いられるようないずれの酵母遺伝子由来のものでもよい。さらに、ＤＮＡ分子は、一般に、複製起点を含有しているので、ＤＮＡ複製の自律性単位として機能できる。しばしば、ＤＮＡ分子は、プラスミドの形態の場合が多いが、コスミド、ウィルスおよびミニクロモソームもまた使用し得る。しばしば、ＤＮＡ分子は二元機能性である。すなわち、２つの異なる属の細胞内で自活することができる。

酵母−細菌シャトルベクターの例としては、ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｌｎら、江皿、８巻、１７〜２４頁、１９７９年）　、ｐｃｉ／１（Ｂｒａｋｅら、ｂζ 」１見り１二ａｄ、　Ｓ＋日−罫湧１８１巻、４６４２〜４６４６頁、１９８４年）、およびＹＲｐ１７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５８巻、１５７頁、１９８２年）がある。さらにレプリコンは高コピー数または低コピー数いずれのプラスミドでもよい。高コピー数のプラストは、コピー数が一般に約５〜約２００の範囲内にあり、代表的なものは約１０〜約１５０である。高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、コピー数が好ましくは少なくとも約１０であり、より好ましくは少なくとも約２０である。高コピー数もしくは低コピー数のベクターは、ベクターと異種タンノ４り質の宿主に対する作用によって、選択することができる（例えばＢｒａｋｅらの上記文献参照）。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターによって酵母ゲノムに組込まれ得る。

組込みベクターは、一般にベクターを組込むことができる、酵母染色体に相同の配列を少なくとも１つ含有し、しかも好ましくは発現構築物にフランキングする２つの相同の配列をもっている。組み込みは、ベクターと酵母染色体中の相同ＤＩＪＡ間の組換えによってなされるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０１巻、２２８〜２４５頁、１９８３年）。組み込みベクターは、ベクターに含有させる適切な相同配列を選択することによって、酵母中の特定の座に導入することができる（　０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、の前記文献参照）ｏ　ｔつ以上の発現構築体を組込んでもよ（、この場合産生させる組換えタンパク質のレベルに影響することがある。（Ｒｉｎｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、８０巻、６７５０頁、１９８３年）。ベクター中に含有されている染色体配列は、ベクター中に単一セグメントとして存在させるか（この場合全ベクターが組込まれる）、または、染色体中の隣接セグメントと相同で、ベクター中の発現構築物にフランキングする２つのセグメントとして存在させてもよい。　（この場合、発現構築物だけが安定して組込まれる）。

一般に、染色体外の組込み発現構築物は、形質転換された酵母菌株を選択できるように、選択可能なマーカーを含有し得る。選択可能なマーカーとしては、紐■ 、旺旦４旦■、１および■旦のような生合成遺伝子が含まれる。選択可能なマーカーには、ＡＬＧ７耐性遺伝子またはＧ４１８耐性遺伝子のような薬剤耐性遺伝子も含まれる。これらの耐性遺伝子はそれぞれ、酵母細胞にツニマカイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択可能なマーカーは、ある種の金属のような毒性物質の存在下で増殖する性能を酵母に与えることもできる。例えば、ＣＵＰＩなどが存在すると、酵母は銅イオンの存在下で増殖することができる（Ｂｕｔｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　５１巻、３５１頁、１９８７年）。

発現ベクターは、染色体外レプリコンあるいは組み込みベクターのいずれも、多くの酵母を形質転換させるものが開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ以下の酵母に用いるものが開発されている。すなわち、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　旺肛旦皿）　（Ｋｕｒｔｚら、　Ｍｏ１．ＣｅユＬ」土［Ｆ］１″６巻ゝ１４２頁、１９８６年）、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ）（にｕｎｚｅら、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２５巻、１４１頁、１９８５年）、ハンセヌラ・ポリモルフｙ　（ｈＪ１１ｎ阻江肚■ｎ）　（Ｇ　ｌ　ａ　ｅｓｏｎら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１３２巻、３４５９頁、１９８６年ＨＲｏｇｇｅｎｋａｍｐら、…江」ｉユゴｉユりよ、２０２巻、３０２頁、１９８６年）、クルイベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ　ａｃｅｓ　ｆｒａ　１ｌｉｓ）（Ｄａｓら、Ｊ、　Ｂａｃｔ６区ハ、１５８巻、１１６５頁、１９８４年）、タルイベロマイセス・ラクテイス（Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ　ら、Ｊ、Ｂａｃｔ虹上杜、　１５４巻７３７頁、１９８３年ＨＶａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ　ら、１四ｔシ匹上ル１１化ヒ、１１！’、１３５頁、１９９０年）、ピキア・ギレリモンディ（■’ａ　ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ　（Ｋｕｎｚｅら、　Ｊ、Ｂａ５ｉｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２５巻、　１４１頁、１９８５年）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　匹ニジＬシ）　（Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、５巻３３７６頁、１９８５年；米国特許第４，８３７．１４８号、第４．８７９．２３１号および第４．９２９．５５５号）、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃ　ａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、７５巻、１９２９頁、１９７８年；Ｉｔｏら、ムＢａｃｔｅｒｉｏ１．　、１５３巻、１６３頁、１９８３年）、シゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ　ａｒｏｍ　ｃｅｓ　匹ｉ回）（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３００巻、７０６頁、１９８１年）、およびヤロウイア・リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　■正江■工岨）　（Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１０巻、３９〜４ｇ頁、１９８５年；　Ｇａ１ｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０巻、４９頁、１９８５年）に用いる発現ベクターである。

一般に、哺乳類のＶＩＰをコードするＤＮＡは、ヒト、ネズミおよび他の起源から、哺乳類の組織から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築し、次に相同の配列を有するクローンをｃＤＮＡライブラリー中に検出するため、ヒトもしくはネズミの連鎖の一部をコードする標識付のＤＮＡプローブでスクリーニングすることによって得ることができる。あるいは、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）、（ｍＲＮＡからの）　ｃＤＮＡの増幅、およびサブクローニングおよび標識付ＤＮＡプローブによるスクリーニングを用い得る。クローンは、制限酵素分析法及び核酸配列決定法で分析して、全長のクローンを同定することができる。全長のクローンがライブラリー中に存在していない場合は、フラグメントを各種のクローンから回収し、クローンに共通の制限部位で連結して、全長分子をコードするクローンを組立てることができる。ｃＤＮＡの５′末端から抜けている配列は、ｍＲＮＡを鋳型として用いて、ＭＩＰ配列に相捕的な合成オリゴヌクレオチドを３′伸長することによって得ることができる。（プライマー伸長法）。あるいは、相同配列を、本願に開示されたヒトもしくはマウスの配列由来の公知のｃＤＮＡから供給してもよい。

本発明を実施する際は、特にことわりがない限り、通常の分子生物学的方法、微生物学的方法および組換ＤＮＡ法が使用されるがこれらはすべて当業者の技術に含まれている。このような技術は文献に記載されている（例えばＭａｒ＋１ａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（１９８２年）　ニーＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ″Ｉ巻および■巻（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ　ｉｆ集、１９８５年）　；−０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ　！１ｉｉｌ集、１９８４年）；−Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−（Ｂ、　Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、　Ｈ１ｇｇ１ｎｓ編集、１９８５年）−Ｔｒａｎｓｃｒ　１ｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−（Ｂ、Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｉｉｉ集１９８４年）；− Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ−（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ　’ｔＡ集、１９８６年）＋１ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ−（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）：Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、＋Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−（１９８４年）参％、）。

本願で用いる場合、「酵母」という用語には、有子嚢胞子酵母〔エンドミセタレス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｌｔａｌｅｓ）］　、担子胞子酵母、および不完全菌に属する酵母〔プラス１−ミセテス（Ｂ　ｌａｓ　ｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））が含まれる。有子嚢胞子酵母は２つのファミリー、すなわちスプルモフトラシエ（Ｓｐｅｒｓ＋ｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）とサツカロミセタシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に分類される。後者は、４つのサブファミリー、すなわち、シゾサノカロマイコイダエ（ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏＬＩｙｃｏｉｄａｅａ　（たとえばレゾサッカ０ミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、ナドソニオイデエ（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポマイコイデエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）、およびサノ力ロマイフイデエ（ＳａｃｃｈａｒｏＢｃｏｉｄｅａｅ）　（例えばピキア漠；クロイベロマイセス属およびサツカロミセス属）を含む。担子胞子酵母には、ロイコスボリジウム属（Ｌａｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ＋＋＋）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボルスＫ　（Ｓｐｏｒｉｄｉ。

ｂｏｌｕｓ）、フィロバンジウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｎ＋）およびフイａｔ＜シディエラ属（Ｆ　１ｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）の酵母が含まれている。不完全菌に属する酵母は２つのファミリー、すなわちスブロボロミセタンエ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）　Ｃ例えばスプロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ブレラ＠　（Ｂｕｌｌｅｒａ））およびり１ノプトコノカシエ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）　（例え１ｆカンジダ属）（こ分類される。本発明にとって特に重要なのは、ピキア属、クルレイベロマイセス属、サツカロミセス属、シゾサ・ンカロミセス属およびカンジダ属の範囲内にある種である。中でも特に重要なのは、す、カロミセス属の種のニスセレビシェ、エスカールスベルゲンシス（Ｋ、　組ｒｌｓｂ虹■旦ｉｓ）、ニス・ディアスタティクス（Ｓ、　ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、ニス・ドーグラシ−（Ｓ、包刀上眩旦）、ニス・クルイベリ（Ｓ、■扛猛ユ）　、　ニス・ノルベンシス（１二ｂｅｎｓｉｓ）およびニス・オビフオルミス（Σ、　虹亘甜１ｎ）である。

クロイベロマイセス属の中で特に重要なのはケイ・ラクテイスである。酵母の分類は将来変化し得るので、本発明を実施するに当り、酵母は、旺吐ＱＪＩ−且り遣℃ｊ尤ユＬ江ユ旦旦（Ｆ、　Ａ、　５ｋｉｎｎｅｒ、　Ｓ、　Ｍ、　ＰａｓｓｍｏｒｅおよびＲ，Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ編集、１９８０年）（Ｓｏｃ、　Ａｐｐ、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、　Ｓｙ＋ａｐ、　５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、　９）に記載されて（λるように定義するものとする。上記の事項に加えて、当該技術分野の当業者は、おそらく、酵母の生理現象、酵母の遺伝子の操作について知っているであろう［例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　（Ｍ、Ｂａｃｉｌａ、Ｂ、Ｌ、ＨｏｒｅｃｋｅｒおよびＡ、　Ｏ，Ｍ、Ｓｔｏｐｐａｎｉｍ集、１９７８年）；　Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ（Ａ、Ｈ，ＲｏｓｅおよびＪ、　Ｓ、　Ｈａｒｒｉｓｏｎｌ集、第２版、１９８７年）　；　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　。

ｒ　ｔｈｅ　Ｙｅ　ｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｍ　ｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編集、１９８１年）参照〕。上記文献の開示事項は本願に援用するものとする。

酵母細胞は、ＤＮＡを導入する公知の方法にしたがって本発明のＤＮＡ分子によって形質転換される（例えば旧ｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ、７５巻、１９１９〜１９３３頁、１９７８年および５ｔｉｎｃｈｃｏｎ＋ｂらＥＰ第４５、５２３号参照）。酵母宿主に外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該技術分野で公知であり、一般に、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理された無傷の酵母細胞を形質転換する方法である。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する（例えば、カンジダ属の酵母については、Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　６巻、１４２頁、１９８６年、Ｋｕｎｚｅら、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２５巻、１４１頁、１９８５年；ハンゼヌラ属の酵母については、Ｇ　１ｅｅｓｏｎら、Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、　１３２巻、３４５９頁、１９８６年、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２０２Ｌ　３０２ＪＮ、１９８６年；クルイベロマイセス属の酵母については、Ｄａｓら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１５８巻、１１６５頁、１９８４年、Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃ。

ｕｒｔら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１５４巻、１１６５頁、１９８３年、Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら肛Ｍｎ皿匹旦…、８巻、１３５頁、１９９０年；　ピキア属の酵母については、Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、５巻、３３７６頁、１９８５年、Ｋｕｎｚｅら、Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２５巻、１４１頁、１９８５年、米国特許第４．８３７．１４８号および同第４．９２９．５５５号；サツカロミセス属の酵母について、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、７５巻、１９２９頁、１９７８年、Ｉｔｏら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１５３巻、１６３頁、１９８３年；ヤロウィア属の酵母については、ＤＢｖｉｄｏｖら、Ｃｕｒｒ、　ＧｅｎｅＬ、１０巻、３９頁、１９８５年、Ｇａ１ｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１０巻、４９頁、１９８５年をそれぞれ参照のこと）。

酵母細胞は、公知の方法にしたがって、栄養培地中で培養することによって増殖させる（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ参Ｎ）。本発明によれば、所定のＤＮＡ分子を「有する」酵母細胞は、その分子を安定に含有している。すなわち、そのＤＮＡは酵母細胞中で正確に複製される。

単一の酵母細胞は、本発明によって、ＶＩＰ−１のサブユニットのαとβのいずれかまたは両方のＤＮＡで形質転換され得る。したがってモノマー、ホモマーおよびヘテロマーを、酵母または培養培地に形成することができた。

本発明の教示事項を実施することによって、哺乳類のＭＩＦ’−１タンパク質を含有する組成物を得ることができる。これらの組成物は、酵母細胞内で産生されるので、ＭＩＰでない哺乳動物タンパク質を実質的に含有していない。「実質的に含有していない」という用語は、全組成物のタンパク質含量に対して、ＭＩＰが約７５重量％より多いことを意味する。Ｍ［Ｐは、組成物のタンパク質の約９０重量％より多いのが好ましく、約９９重量％より多いのが最も好ましい。実際に、唯一の哺乳類タンパク質がＭＩＰ−１である組成物が、本発明によって提供される。

以下に述べる実施例は例示を目的とするのであり、本発明の適用範囲を限定するものではない。

（以下余白）実１Ｌ舛災、ｌＬ上この実施例により、ネズミのＭ［Ｐ−１αおよびネズミのＭＩＰ−１βのコーディング配列のクローン化を説明する。

Ｅ、ｃｏｌｉのリボ多糖で刺激したＲＡＷ　２６４．７　（ネズミのマクロファージ腫瘍細胞系）細胞から単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ネズミのＭＩＰ−１αおよびネズミのＭＩＦ−１βに対するｃＤＮＡのクローン化については、Ｄａｖａｔｅｌｉｓら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６７巻、１９３９−１９４４頁、１９８８年、および５ｈｅｒｒｙら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６８巻、２２５１〜２２５９頁、１９８８年に記載されている。

コレらの文献は本願に援用されている。

爽施丘ユこの実施例により、ヒトのＭＩＰ−１αおよびヒトのＭＩＰ−１βのコーディング配列のクローン化を説明する。

１ライブラリーのヒトの単球様細胞系Ｕ９３７を集密増殖させ、次いで、ホルボール１２−ミリステート　１３−アセテート（ＰＭＡ）を最終濃度５×１１０−１ｌ１まで添加することによって刺激して分化させた。ＰＭＡの存在下で２４時間経過後、リボ多糖を最終濃度１μｇ／ｍ　ｌまで添加し、細胞をさらに３７℃で３時間インキュベートした。全ＲＮＡを、Ｃａｔｈａｌａら（ＤＮＡ２巻、３２９頁、１９８３年）に記載されているのと事実上同様にして調製した。ポリＡ＋ＲＮＡは、Ｏｋａｙａｍａら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻、３頁、１９８７年）およびＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２年）に記載されているのと事実上同様にしてオリゴ−ｄＴセルロースにて単一継代により調製した。二本鎖ＣＤＮＡを標準方法で調製し、クローン化し、次いでλｇｔｌｏに挿入した。プレートされたライブラリーの二重のニトロセルロースフィルターのリフト　（５，６−７ｘ　１０５プラーク）を、５０％ホルムアミド、５　ｘ　ＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ［、ｓ、０．２％ＳＤＳ、　２Ｘデンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）および０．２５　ｍｇ／ｉｔの音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で５２ °Ｃにてプレハイブリダイズ０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５，０，１％ＳＤＳ、ＩＸＸノンート溶液、１０％硫酸デ牛ストラン、０．Ｉ　ｎａｇ／ｍｌの音波処理されたサケ精子Ｄ）ＪＡ、　および約５００．０００　ｃｐ＋ａ／ｍｌの、適切な”’Ｐ−ＡＴＰでニック翻訳されたネズミのｃＤＮＡプローブ中で、４２°Ｃにて一晩ハイブリネズミのＭＩＰ−１αおよびネズミのＭＩＰ−１βに対するヒト同族体をスクリーニングするため、下記の２個のフラグメントを単離した。ＭＩＰ−１ａについては、２３６ｂｐのＫｐｎｌ−ＳａｌｌフラグメントをｐＭＩＰ２００から単離した（ｐＭ［Ｐ２Ｏ０の構築は以下に述べる）。

このフラグメントは、ネズミのＶＩＰ−１αの成熟コーディング配列のすべてを含有している。ネズミのＶＩＰ−１βに対する同族体をスクリーニングするために、２１３ｂｐのＮｃｏｌ−Ｓａｌ　ＩフラグメントをｐＭＩＰ３００から単離した（１）ＭＩＰ３００の構築については以下に述べる）。このフラグメントは、ネズミのＭＩＰ−１β成熟コーディング配列の最初の２個のアミノ酸を除くすべてをコードしている。

１４己のＤＮＡフラグメントをニックトランスレージコンして、各ニックトランスレーンヨンブローブの５００，０００　ｃｐｓ／＋１と、Ｕ９３７ｃＤＮＡライブラリーとをハイブリダイズさせた。両方のプローブを、スクリーニングの第１段階で用いる。フィルターを、２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、室温にて３０分間ずつ３回、低緊縮性洗浄にかけた。

多くの陽性のクローンを同定した。プラーク精製の第２段階を行うために１９個を選択した。これらのプレートからの二重フィルターのリフトを別個に、下記のようにして、ネズミのＭＩＰ−１αまたはネズミのＭＩＰ−１βのｃＤＮＡプローブのいずれかとハイブリダイズさせた。−次スクリーニングと同様に洗浄を行った。このスクリーニングによって、これらの洗浄条件下では、ネズミのＭＩＰ −１αおよびネズミのＭＩＰ−１βに相同のクローンを区別することは不可能であることが分かった。

３、ヒトＭＩＰ１の。

挿入ＤＮＡをＭ１３ファージベクター中にサブクローニングした後に、９個の独立のファージクローン由来のヌクレオチド配列を、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシチェーンターミネーション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　Ｌ４Ｊ！、５４６３頁、１９７７年）によって決定した。２ｆ！のｃＤＮＡ同族体を決定した。ネズミの２個のＭＩＦ−１ペプチドに対するヌクレオチドの配列相同性に基づいて、クローンＭＩＰ−１２ｂ、　３ａ、４ａ、　４ｂおよび５ｂで、不ス゛ミーＭＩＰ−１αのヒト同族体であるｃＤＮＡＤＮＡヒトＩＰ−１αを決定した（Ａ１）。そして、クローンＭＩＰＩ−８ａのｌｌｂ、　１３ａで不ズミー１βに対するヒト同族体であるｃＤＮＡヒト−ＶＩＰ−１β を決定した（１）。ネズミのＶＩＰ−１αもしくはネズミのＭＩＰ−１βのヒト同族体としてのｃＤＮＡの表示は、ヌクレオチドとアミノ酸の両方の相間性を比較することに基づいて行った。ヒト−ＭＩＰ−１αは、ネズミ−Ｍ［Ｐ−１αニ対シて６８．５％の相同性を有しく７４ｏのヌクレオチドがオーバーラツプ）、ネズミ−ＭＩＰ−１βに対しては５７．８％のヌクレオチド相同性を有している（５Ｓ５のｎｔがオーバーラツプ）。ヒト−ＭＩＰ−１βの、ネズミ−Ｍ［Ｐ− ＬαおよびネズミーＭＩＰ（βに対するヌクレオチド同一性の百分率はそれぞれ、５９．０％（５５９のｎｔがオーバーラツプ）および７２．７％（６００のｎｔがオーバーラツプ）である。ヒトＭ［Ｐ−１αの推定タンパク質配列の、ネズミ−ＶＩＰ−１αおよびネズミ−ＭＩＰ−１βの推定タンパク質配列に対する同一性百分率はそれぞれ、７５．３％（９３のａａがオーバーラツプ）および５８．２％（９１のａａがオーバーラツプ）である。同様に、ヒト−ＭＩＰ−１βの、ネズミ−ＭＩＰ−１αおよびネズミ−ＭＩＰ−１βに対するアミノ酸配列に対する同一性百分率はそれぞれ、５９．３％（９１のａａがオーバーラツプ）および７４．７％（９１のａａがオーバーラツプ）である。これらのＭＩＰ−１同族体の推定アミノ酸配列の配列をＬに示す。

ヒト−ＭＩＰ−１αのｃＤＮＡは、以前に０ｂａｒｕら（上記文献）およびＺｉｐｆｅｌら（上記文献）がそれぞれ単離したｃＤＮＡ　ＬＤ７８およびＡＴ４６４と同一である。ヒト−ＶＩＰ−１βｃＤＮＡは、Ｂｒｏｗｎら（上記文献）、Ｚｉｐｆｅｌら（上記文献）、Ｌｉｐｅｓら（上記文献）およびＭｉｌｌｓｒら（上記文献）が単離したｅＤＮＡと事実上同一である。これらのタンパク質はすべて、最近報告された、宿主が侵入に対して応答する際に機能すると思われる近縁タンノｆり質のファミリーのメンバーである（　５ｈｅｒｒｙら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　ｊ１皿、２２５１頁、１９８８年を再検討のために参照のこと）。

支血五ユこの実施例によってＶＩＰ発現プラスミドの構築を説明する。

ａ、ＹＭＩＰ−２００不ス゛ミのＶＩＰ−１ａこのプラスミドは、成熟ネズミＭＩＰ−１αをコードする配列に連結するα因子リーダーをコードする。ＭＩＰ− １α成熟コーディング配列は、対応するＭＩＰ−１αのｃＤＮＡから誘導される（　Ｄａｖａｔｅｌｉｓら、Ｊ、’Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７巻、１９３９− １９４３頁、１９８８年）。ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α因子リーダー配列およびα因子転写ターミネータ−は、プラスミドｐＧＡ　Ｉ　１から誘導されるが、それらの構築法は、標題が「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ａｌｐｈａ−ｆａｃｔｏｒ　１ｅａｄｅｒ　５ｅｑｕａｎｃｅｓＪであるヨーロノ／寸特許出願第０３２４２７４号に記載されている。参考として、その開示事項を特に本願に援用する。

ｐＹＭＩＰ−２００の構築を次のようにして行った。ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位にクローン化されたＶＩＰ−１αをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＢＲ３２２／ＮＡＰ８ＳＯを、ＮｄｅｌおよびＢｓｍ１で消化し、成熟ＭＩＰ（αの配列のＮ末端の最初の２個のアミノ酸以外のすべてをコードする１９６　ｂｐのフラグメントを以下のアダプターに連結した。

３　’　ＧＧＡＣＴＡＴＣＧＣＡαス匡Ｔ５゜得られたフラグメントをアクリルアミドゲルで精製した。次に、このフラグメントを、Ｋｐｎｌおよび５ａｉｌで消化したｐＧＡｌｌに連結し、アガロースゲルで精製した。細菌の形質転換およびスクリーニングを行って、プラストｐＭＩＰ２００を得た。ＤＮＡの配列決定を行った際に、Ｃ末端のアラニンをコードするヌクレオチド配列にサイレント突然変異（ＧＣＣ−ＯＣＴ）が起こっていることが見出された。このプラスミドからのＢａｍｌｌｌｌ発現力セクトをシャトルベクターｐＡＢ２４（ヨーロッパ特許出願東０３２４２７４　Ａ１号参照）のＢａｏ＋旧部位にクローン化させて、ｐＹＭＩＰ２００を生成させた。ｐＡＢ２４は完全な２μの配列を含有している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの１巻、４５５頁、１９８１年のＢｒｏａｃｈの報告）Ｏｂ、ＹＭＩＰ−３００ネズミのＶＩＰ−１このプラスミドは、成熟ネズミのＭＩＰ２００−１βをコードする配列に連結されたα因子リーダーをコードする。ＭＩＰ−１βをコ−ドする配列は、ＭＩＰ−１βｃＤＮＡ　（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１６８巻、２２５１−２２５９頁、１９８８年）から誘導される。ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α因子リーダー配列およびα因子転写ターミネータ−は、上述のプラスミドｐＧＡ１１から誘導される。ＭＩＰ２００−１βをコードするｃＤＮＡを、江り工銭で突然変異誘発処理して、ＭＩＰ（ βのコーディング領域を発現ベクターにクローン化し易（する制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。使用される突然変異プライマーは、次のとおりである。

３　’　ＧＴＣＣＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＣＧＧＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＣＧＡ　ＧＡＣ −５’（＊は、ｃＤＮＡ配列のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを示す）このプライマーは、成熟ＭＩＦ−１βタンパク質をコードするヌクレオチド配列のスタート部位にＮｃｏ１部位を導入した。改変ＭＩＰ−１βｃＤＮＡ配列（Ｎｃｏ１部位を含有している）を含有するＥｅｏＲＩフラグメントをＭ１３ファージＲＦから単離して、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位にクローン化し、プラスミドｐＢＲ−３−１ｂ／６を得た。このプラスミドをＢｇｌＩＩで切断し、ＭＩＰ −１βのカルボキシル末端の２０個のアミノ酸をコードする下記のＢｇｌ　［［ −５ａｔ　Ｉアダプターおよび停止コドンに連結した。

Ｌ　ＢＣ：、２．　５０　ＸＢＡ工　７３　５ＡＬＸ。

Ｎｃｏｌで消化した後、ＭＩＰ−１βおよび停止コドンをコードする２１３ｂｐのフラグメントをアクリルアミドゲル電気泳動法で精製した。

ベクターｐＧＡ　Ｉ　１をＫｐｎ　Ｉで切断し、α因子リーダーのカルボキシル末端の３個のアミノ酸、ＬｙｓＡｒｇプロセシング部位および５ｊ熟ＭＩＰ−１ βの最初の２つのアミノ酸をコードする下記のＫｐｎｌ−Ｎｃｏｌアダプターに連結した。

５’　−ＣＣＴｒＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＣ−３゜３”−ＣＡＴＧＧＧＡＡＣＣＴＡπｆｆ１ｃＴｃ父α刀ＴＡＣ−５’上記のベクターをＳａｌ　Ｉで切断し、得られたベクターのフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で精製した。得られたＮｃｏｌ−Ｓａｉｌベクターフラグメントを、Ｎｃｏｌ−Ｓａｌｔ　ＭＩＰ（βをコードするフラグメントと連結した。連結生成物でＥ、ｃｏｌｉを形質転換してクローンｐＭＩＰ３００／２０を得たが、このクローンは予想したヌクレオチド配列を有することが見出された。このプラスミドをＢａ１１旧で消化して、ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α図子す−ダーーＭＩＰ−１β融合タンパク質をコードする配列およびα因子転写ターミネータ−を含有する１１５５　ｂｐのフラグメントを生成させ、このフラグメントをｐＡＢ２４のＢａｍ）ＩＩ部位にクローン化して、発現プラスミドｐＹＭＩＰ３００を得た。

Ｃ，ＹＭｌ　２２０　ヒトＭＩＰ−１αこのプラスミドは、成熟ヒト−ＭＩＰ− １αをコードする配列に連結されたα因子リーダーをコードしている。ヒトーＭＩＰ−１α配列は、λｇｔｌｏｃＤＮＡクローンヒトＭＩＰＩ−１３ａから誘導される。

ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α因子リーダー配列およびα因子転写ターミネータ−はプラスミドｐＧＡ　＋　１から誘導されるが、その構築法はヨーロッパ特許出願第０３２４−２７４号に記載されている。

下記のプライマーを用いて、ヒトＭＩＰ−１のλｇｔｌｏクローン由来のＥｃｏＲ１挿入ＤＮＡフラグメントを、３０サイクルのポリメラーゼチェーンリアクシロン（ＰＣＲ）にかけた。

ｐｎＺＣＣＧＡＣＣＧＣ−３’ 増幅させたＤＮＡをＫｐｎｌおよび５ａｉｌで消化し、α因子リーダーのカルボキシル末端の４個のアミノ酸、二塩基プロセシング部位、および成熟ヒト−ＶＩＰ−１αの全体の７０個のアミノ酸をコードする２３５　ｂｐのフラグメントを、アクリルアミドゲル電気泳動法で単離した。次に、このフラグメントを、Ｋｐｎｌおよび５ａｌｌで予め消化したｐＧＡ＋１に連結し、アガロースゲルで精製した。細菌の形質転換とスクリーニングを行って、プラスミドｐＭＩＰ２２０を得た。ＤＮＡの配列を決定したところ、このプラスミドは、予想されたヌクレオチド配列をもっていることが見出された。このプラスミドをＢａｍ旧で消化して、ＧＡＰＤＩ（プロモーター配列、α因子リーダー／ヒト−ＭＩＰ−１α融合タンノくり質をコードする配列、およびα因子転写ターミネータ−を含有する１１５４　ｂｐのフラグメントを生成させ、これをｐＡＢ２４のＢａｍ旧部位にクローン化して、発現プラスミドｐＹＭＩＰ２２０を得た。

ｄ、吐ＭＩＰ３皿このプラスミドは、成熟ヒト−ＭＩＰ−１βをコードするヌクレオチド配列に連結されたα因子リーダーをコードする。成熟ヒト−ＭＩＰ−１βのコーディング配列は、ヒトＭＩＰ−１βのλｇｔｌ。

ｃＤＮＡクローンから誘導される。ＧＡＰＤＩ（プロモーター配列、α因子リーダー配列およびα因子転写ターミネータ−は、プラスミドｐＧＡ１１から誘導されるが、その構築法は３−口・ツノ＜特許出願第０３２４２７４号に記載されている。下記のプライマーを用いて、ヒト−ＭＩＰ−１βｃＤＮＡを含有するλｇｔｌＯクローン由来のＥｃｏＲＩ挿入ＤＮＡフラグメントを、３０サイクルのポリメラーゼチェーンリアクシロン（ＰＣＲ）にかけた。

ＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣ−３’ 増幅されたＤＮＡをＫｐｎｌおよび５ａｉｌで消化し、α因子リーダーのカルボキシル末端の４個のアミノ酸、二塩基プロセシング部位、成熟ヒｌ−ＭＩＰ−１ βの全体の６９のアミノ酸をコードする２３２　ｂｐのフラグメントをアクリルアミドゲル電気泳動法で単離した。次に、このフラグメントを、ＫｐｎｌおよびＳａｌ［で予め消化したｐＧＡ　ｌ　ｌに連結し、アガロースゲルで精製した。

細菌の形質転換およびスクリーニングを行って、プラスミドｐＭＩＰ３２０を得たが、ＤＮＡ配列決定を行ったところ、このプラスミドは予想されるヌクレオチド配列をもっていることが見出された。

このプラスミドをＢａａ＋ＨＩで消化して、ＧＡＰＤＦ［プロモータ配列、α因子リーダー／ヒト−ＭＩＰ−１β融合タンパク質をコードする配列、およびα因子転写ターミネータ−を含有する１１４３　ｂｐのフラグメントを生成させ、これを、ｐＡＢ２４のＢａｍ旧部位にクローン化して発現プラスミドｐＹＭＩＰ３２０を得た。

支立五工この実施例によって、ネズミのＶＩＰ−１αおよびネズミのＭＩＰ−１β、ならびにヒトのＭＩＰ−ＬαおよびヒトのＭＩＰ〜１−βの発現を示す。

Ｌｋ上り二良里Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＭＢ２−１　（１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、出３△、と４△、違、ａｉｒｏ）を、標準の方法を用いてプラスミドのｐＹＭＩＰ２００またはｐＹＭ［Ｐ２２０で形質転換し、形質転換細胞をウラシル・プロトトロフィについて選択した。

個々の形質転換細胞の単一コロニーを、ロイシン選択培地に接種し、３０°Ｃで約４８時間、または培養物が飽和するまで増殖させることによって、発現を分析した。次に培養物を遠心分離し、ウラシルがない培地に細胞を再懸濁させ、ウラシル選択培地で２０倍希釈を行った。培養物を約７２時間増殖させ、次に回収し、細胞を含有しない上澄み液を調製した。

処方ロイシン　立５０ｍ１　ＩＯＸ基本塩基２５ｍ１　２０Ｘロイシン補充物２ｍｌ　５％トレオニン８０ａ＋１　５０％０％グルツースｌ　パントテン酸およびイノシトールを０．３％ずつ滅菌ｄｄＨ２０を添加して５００■ｌとし、次いでオートクレーブもしくは滅菌フィルターで処理する。

■工皿充璽滅１１ｄｄＨ２０１００ｍ１当り０．５ｇの粉末ロイシン補充物。オートクレーブ。

ロイシン０．４ｇ　Ｌ−ｈリブヒフアン０．４ｇ　ｌ、−ヒスチジン０、６ｇ　Ｌ−チロシン０、６ｇ　Ｌ−リシン０．９６ｇ　Ｌ−フェニルアラニン全成分をコーヒーグラインダーに入れて、粉末が均一になるまで粉砕する。

ウラシル　立５００ａ＋１　２％グルコース培地５０ｍ１　ＩＯＸ基本塩基２０ｎ＋１　５０％グルコース１２．５ｍｌ　２０％カザミ／酸２、５ｍｌ　１％アデニン２、５ｍｌ　１％ドリフトファン５ｍｌ　パントテン酸およびイノシトールを０．３％ずつ馴化培地を、５ＤＳ− ＰＡＧＥ、次いでクー７シ一染色法によってＭＩＰ−１αの存在について分析し、ネズミの因子の場合は免疫ブロッティング法で分析した。未変性ＭＩＰ−１の標準品（ロックフェラー大学のＢ、　５ｈｅｒｒｙが提供した）とともに移行するネズミのＶＩＰ−１αのバンドが５ＤＳ−ＰＡＧＥで認められ、不ス゛ミのＭＩＰ−１に対して生じたポリクローナル抗血清（Ｂ、　５ｈｅｒｒｙが提供した抗血清ンに対して免疫反応性を示した。ヒトＭ［Ｐ−１αが発現したときに、同じ大きさの染色バンドが認められた。これらのタンパク質は、１〜５％の分泌されたタンパク質として発現された。

社たＵ二１里Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｍＩ株ＭＢ２−１を、標準法を用いてプラスミド、ＹＭＩＰ３００またはｐＹＭＩＰ３２０で形質転換し、形質転換細胞をウラシル・プロトトロフィーについて選択した。ＭＩＰ−１αに対する発現試験を上述したように実施した。発現レベルについて、同様の結果が得られた。

ここで、ネズミの組換えＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは未変性ＭＩＰ−１の生物活性、すなわちＣＦＵ−ＧＭに対するＣＳＦ依存性の骨髄造血促進活性をもっていることが分かった。

した　二の五称ｔｆＬａ　ＡＴＣＣＮｏ。

ＭＢ２−１　（ｐＹＭＩＰ−２００＞　１９９０年６月２０日　７４００８ＭＢ２−１　（ｐＹＭＩＰ−２２０）　１９９０年６月２０日　７４００７ＭＢ２− １　（ｐＹＭＩＰ−３００）　１９９０年６月２０日　７４００６ＭＢ２−１　（ｐＹＭＩＰ−３２０）　１９９０年６月２０２Ｉ　７４００５上記の物質は、米国、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークローンドライブ１２３（１１に所在のｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣＬＩＩｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに上記寄託番号で寄託した。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて保管される。

これらの寄託物は、単に便宜上当業者に提供されるだけであり、寄託物が米国特許法第１１２条に基づいて必要であるということをめているわけではない。寄託された物質に含有されているポリヌクレオチドの配列、および、これによってコードされているポリペプチドのアミノ酸配列は、本願に参考として援用されており、本願における配列の記載と矛盾する場合には対照になる。寄託物質を調製、使用または販売するには認可が必要とされ得、本発明ではこのような認可は与えられていない。

（べＴ−係Ｕ）Ｆｉｇｕｒｅ　１巳ト　ＨＩ？−１αｅＤＮ入ＣＴＣフＴロフフλ＾Ｃ？フ入入入τ〒フＴ入入τフＴ入ＴＴＴ入τλＣτλｍ λＧ？Ｔフ２τ入λ丁−−′λ７Ｔフ↑ＣＣ入ＣＡＣＡＣＣＧＣ［ＧＡＣＡＸＣＣＷに；ＣＴＧＴＣＡＴＣｋＧＣＣ？ＧＴ’ＧＴＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＪ：二臼二１ λＴＡＡＣＴＧＴＣＣ１’？ＡＴＧＧＧＧＡＴＧＧ？Ｃ０ｋＣＴＧＴＣＡＣＴＧ −−ａＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴ’ＧＣＡ入ＡＴｋＣ入↑ＧＧλ１、ｎｕ−Ｍ！Ｐ− １αフコ＜＾ＤｐｓＣ＊ＩＩｖＱｋ丁ｖｍｏしｔＬ−＾コ、ｍｕ−ｎｚｐ−Ｊ　）３　１ＣＡｎＰ＄ｔｐｂｌＶｔｌＣｙａｊＤｕｕｌ補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims

【特許請求の範囲】

１．転写の順に、（ａ）酵母中で作動する転写調節領域；（ｂ）ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β からなる群から選択される哺乳類タンパク質をコードする領域；を含有するＤＮＡ分子。
２．領域（ａ）が誘導可能な転写調節を提供する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
３．領域（ａ）が構成的転写調節を提供する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
４．さらに、哺乳類のタンパク質の分泌を促進するリーダーフラグメントを含有し、該フラグメントが領域（ｂ）に共有結合で連結している、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
５．前記リーダーフラグメントが、酵母のα因子リーダーをコードする、請求項４に記載のＤＮＡ分子。
６．前記リーダーフラグメントが、先端切断型の酵母α因子リーダーをコードする、請求項４に記載のＤＮＡ分子。
７．さらに、（ｃ）酵母内で作動するターミネーター領域を含有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
８．領域（ｃ）が、酵母α因子転写ターミネーターに由来する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
９．領域（ｂ）が、制限酵素認識部位を導入するように、突然変異誘発を受ける、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
１０．さらに、（ｄ）酵母中で作動する複製系を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
１１．請求項１に記載のＤＮＡ分子を含有する酵母細胞。
１２．請求項１０に記載のＤＮＡ分子を含有する酵母細胞。
１３．請求項４に記載のＤＮＡ分子を含有する酵母細胞。
１４．請求項１１に記載の酵母細胞を栄養培地内で増殖させて、これにより、領域（ｂ）が発現されＭＩＰが産生されることを包含する、ＭＩＰポリペプチドの製造方法。
１５．請求項１２に記載の酵母細胞を栄養培地内で増殖させて、これにより、領域（ｂ）が発現されＭＩＰが産生されることを包含する、ＭＩＰポリペプチドの製造方法。
１６．請求項１３に記載の酵母細胞を栄養培地内で増殖させて、これにより、領域（ｂ）が発現されＭＩＰが分泌産生されることを包含する、ＭＩＰポリペプチドの製造方法。
１７．前記リーダーフラグメントが、酵母α因子リーダーおよびプロセシングシグナルを含有している、請求項１６に記載の方法。
１８．前記リーダーフラグメントが先端切断型の酵母α因子のリーダーを含有している、請求項１６に記載の方法。
１９．ネズミＭＩＰ−１α、ネズミＭＩＰ−１β、ヒトＭＩＰ−１αおよびヒトＭＩＰ−１βからなる群から選択される哺乳類のＭＩＰタンパク質を含む組成物であって、該ＭＩＰが、ＭＩＰでない哺乳類タンパク質を実質的に含有していない、組成物。
２０．前記ＭＩＰがヒトＭＩＰ−１αであり、そしてさらにヒト　ＭＩＰ−１β を含有する、請求項１９に記載の組成物。
２１．ネズミＭＩＰ−１αとおよびネズミＭＩＰ−１βを含有する、請求項１９に記載の組成物。