DK175483B1 - Enkeltkædehybridplasminogenaktivator, DNA-sekvens, som koder derfor, hybridvektor indeholdende DNA-sekvensen, eukaryotisk værtscelle transformeret med hybridvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af enkeltkædehybridplasminogenaktivatoren,...... - Google Patents

Description

i DK 175483 B1

Den foreliggende -opfindelse angår enkeltkædehybridplasmino-genaktivatorer, DNA-sekvenser, som koder for disse enkeltkæ-dehybridplasminogenaktivatorer, hybridvektorer, som indeholder sådanne DNA-sekvenser, eukaryotiske værtsceller trans-5 formeret med hybridvektorerne, en fremgangsmåde til fremstilling af enkeltkædeplasminogenaktivatorerne, en fremgangsmåde til fremstilling af DNA-sekvensen, som koder for enkeltkæde-hybridplasminogenaktivatoren, en fremgangsmåde til fremstilling af en hybridvektor til anvendelse i en eukaryotisk 10 vært, omfattende DNA-sekvensen, som koder for enkeltkædehy-bridplasminogenaktivatoren en fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret eukaryotisk celle transformeret med hybridvektoren omfattende DNA-sekvensen, som koder for enkeltkædehybridplasminogenaktivatoren samt farmaceutiske 15 præparater, som indeholder disse enkeltkaedehybridplasminogen-aktivatorer, og deres anvendelse.

Blodpropper er den væsentligste årsag til sygelighed og dødelighed hos mennesker i de industrialiserede lande.

20 Blodpropper er sammensat af fibrin, som er dannet ud fra dets opløselige precursorfibrinogen ved indvirkning af enzymet thrombin. En række enzymer og andre stoffer sikrer, at blodpropper normalt kun dannes, når og hvor de er nødvendige for at forhindre blodtab.

25

Humant plasma og pattedyrplasma indeholder et enzymsystem, det fibrinolytiske system, som kan opløse blodpropper. En bestanddel af det fibrinolytiske system er en gruppe enzymer, som kaldes plasminogenaktivatorer, og som omdan-3 0 ner plasminogen, der er en inaktiv proenzymform for plasmin, til det proteolytiske enzymplasmin. Plasmin nedbryder derpå fibrinnetværket i blodpropperne under dannelse af opløselige produkter. I tilfælde hvor organismens thrombolytiske kapacitet er utilstrækkelig 35 til at fjerne intravaskulære blodpropper, f.eks. hos patienter, der lider af thromboembolisme eller

I DK 175483 B1 I

I I

I postkirurgiske komplikationer, kan det være bydende I

I nødvendigt at indgive thrombolytiske midler af fremmed I

I oprindelse. I

I 5 Der kan isoleres to typer plasminogenaktivatorer, som i I

I det følgende betegnes "PA'er", fra humane kropsvæsker I

I eller celler, urokinase eller plasminogenaktivator af I

I urokinasetype (der i det følgende betegnes som "u-PA"), og I

I som er en serinprotease, der eksempelvis forekommer i I

I 10 human urin og humane nyreceller, samt plasminogenaktiva- I

I tor af vævstype, der i det følgende betegnes "t-PA", og I

I som dannes af endothelialceller og findes i en række I

I endocrine væv. I

I 15 Såvel t-PA som u-PA forekommer i to mol ekyl former: en I

I enkeltkædeform, der ofte betegnes som henholdsvis I

I "sc-t-PA" og "sc-u-PA", og en tokædeform (tc-form). I

I Enkeltkædeformen eller proenzymformen omdannes til I

I tokædeformen ved indvirkning af proteolytiske enzymer i I

I 20 veldefinerede positioner i polypeptidsekvensen. De dannede I

I to kæder af det behandlede PA-protein forbliver sammen- I

I knyttet ved hjælp af en svovl-svovl-bro. Carboxyterminal- I

I fragmentet eller B-kæden formidler den enzymatiske I

I aktivitet af PA'en, medens den aminoterminale A-kæde I

I 25 indeholder reguleringsenheder, såsom fibrinbindings- I

I steder. Den specifikke binding af en inaktiv sc-PA til I

I bestanddele af blodproppen, såsom fibrin, efterfulgt af I

I omdannelse til den aktive tc-PA ved hjælp af katalytiske I

I mængder af proteolytiske enzymer, som forekommer på det I

I 30 sted, resulterer i et effektivt steds-specifikt I

I lægemiddel. I

I t-PA og u-PA indkodes af to forskellige gener, kan skelnes I

I fra hinanden immunologisk og enzymatisk og har forskel- I

I 35 lige responsprofiler overfor inhibitorer, stimulatorer og I

I aktivatorer. Således inhiberes kun t-PA kraftigt af I

3 DK 175483 B1 proteaseinhibitoren fra Erytrina latissima (DE-3). t-PA-Aktivitet stimuleres kraftigt af fibrin og fibrinfragmenter, hvorimod u-PA-aktivitet er ufølsom overfor stimulering med fibrin og dets fragmenter. En 5 anden egenskab, som adskiller de to PA-enzymer, er at tc-t-PA har høj affinitet til fibrin og fibrinfragmenter, hvorimod tc-u-PA ikke har nogen kendelig fibrinaffinitet.

På grund af injicerede t-PA'ers utilfredsstillende serum-10 stabilitet, tc-u-PA's lave affinitet til fibrin, og at fibrinaffiniteten til sc-u-PA antages at være indirekte, dvs. at den kræver en yderligere blodfaktor, jf. D.J. Binnema et al., 8. internationale fibrinolysekongres,

Wien, 1986, at der er et behov for bedre plasminogenakti-15 vatorer med høj affinitet til fibrin, et mere fordelagtigt respons på stimulatorer, en nedsat inaktivering som følge af inhibitorer og længere effektive halveringstider i blodkredsløbet.

20 Det er derfor formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hidtil ukendte enkeltkædehybridplasminogenakti-vatorer, som bibeholder de gunstige egenskaber ved t-PA og u-PA, men som ikke har de uønskede egenskaber ved udgangsenzymerne. Enkeltkædehybridplasminogenaktivatorerne kaldes i 25 det følgende også enkeltkædehybrid-PA-proteiner.

Det har overraskende vist sig, at til behandling af thrombose og andre tilstande, hvor det er ønskeligt at fremkalde fibrinolyse ved hjælp af plasminogenaktivering, 30 udviser enkeltkædehybrid-PA-proteiner overlegne biologiske egenskaber sammenlignet med enkeltkædet t-PA og u-PA. Nærmere betegnet kræves der mindre mængder af de hidtil ukendte PA-molekyler ifølge opfindelsen sammenlignet med native PA'er til at lysere blodpropper in vivo.

35 Enkeltkæde-hybrid-PA-molekylerne ifølge opfindelsen kan fremstilles i store mængder ved hjælp af rekombinant-DNA- I DK 175483 B1 I 4 j

I teknologi, og efter injektion i patienter omdannes de kun I

I til den tokædede form under indvirkning af fibrin på I

I stedet med blodproppen, som skal lyseres. Tokæde-hybrid- I

PA-molekyler er beskrevet i litteraturen, jf. beskrivel- I

I 5 sen til europæisk patentansøgning nr. 155.387, K. C. I

I Robbins, 8. internationale fibrinolysekongres, Wien, 1985, I

I men de mere fordelagtige enkeltkædeformer af hybrid-PA- I

I molekyler kan ikke produceres på proteinniveauet som I

I beskrevet i ovennævnte litteratursteder, men kan kun I

I 10 produceres i store mængder og i industriel målestok ved I

I hjælp af rekombinant-DNA-teknologi. I

I Opfindelsen angår især et enkeltkædet-hybrid-PA, som har I

I en aminosyresekvens sammensat af mindst to undersekveh- I

I 15 ser, der med hensyn til aminosyreidentitet og aminosyre- I

I antal svarer til undersekvenser af human-t-PA og af I

I human-u-PA. I

I Lige som andre serinproteaser, der indgår i det I

I 20 fibrinolytiske system og koaguleringssystemet i blodet, I

I har u-PA og t-PA store ikke-katalytiske segmenter samlet I

I i A-kæden knyttet til det katalytiske område (B-kæden). I

I Den ikke-katalytiske A-kæde i t-PA kan opdeles i adskilte I

I områder: "finger"-området, "vækstfaktor"-området og to I

I 25 "kringle”-strukturer, medens A-kæden i u-PA er sammensat I

I af et "vækstfaktor"-område og en "kringle"-struktur, jf. I

L. Patthy, Cell 41, 657-663 (1985). Det katalytiske sted i I

B-kædeme er dannet af His-, Asp-, Ser-rester i positio- I

nerne henholdsvis 322, 371 og 478 (t-PA) og 204, 255 og I

30 356 (u-PA), og er afgørende for fibrinolytisk aktivitet. I

Et proteinområde er en strukturel og/eller funktionel I

helhed i den samlede struktur af hele proteinet. I f.eks. I

t-PA-A-kæden er fire områder (finger-, vækstfaktor- og to I

35 kringle-områder) sammenknyttet i rækkeforbindelse. Græn- I

DK 175483 B1 5 serne for områderne defineres bedst ved hjælp af stillingerne af exon-intron-forbindelsespunkterne i den tilsvarende DNA-sekvens, jf. L. Patthy, citeret ovenfor.

5 Af praktiske årsager er mindstestørrelsen for hvert område imidlertid fastlagt ved hjælp af aminosyresekvensen mellem den første og den sidste cysteinrest i hvert område, som antages at indgå i S-S-brodannelse. Aminosyrer anbragt før og efter disse cysteinrester fra naboområder er defineret 10 som forbindelsessekvenser (J). Positionerne af exon- intron-forbindelsespunkter (se ovenfor) ligger i disse J-områder.

Enkeltkæde-t-PA kan således repræsenteres ved formlen

T - F - Ji - G - J2 - K;l - J3 - K2 - J4 - TPAB

15 hvori T betyder den N-terminale del omfattende aminosyrer 1-5, F er fingerområdet omfattende aminosyrer 6-43, G er vækstfaktorområdet omfattende aminosyrer 51-84, er kringle-l-strukturen omfattende aminosyrer 92-173, K2 er kringle-2-strukturen omfattende aminosyrer 180-261, TPAB 20 er det katalytiske serinproteaseområde omfattende aminosyrer 307-527, og Ji (aminosyrer 44-50), J2 (aminosyrer 85-91), J3 (aminosyrer 174-179) og J4 (aminosyrer 262-306) er forbindelsessekvenser, som forbinder områdesegmenterne .

25 Enkeltkæde-u-PA kan repræsenteres ved formlen Τ' -U-J5-K-J6- UPAB

hvori Τ' betyder den N-terminale del omfattende aminosyrer 1-12, U er vækstfaktorområdet omfattende aminosyrer 13-42, K er kringle-strukturen omfattende aminosyrer 50-131, UPAB 30 er det katalytiske serinproteaseområde omfattende aminosyrer 189-411, og J5 (aminosyrer 43-49) og Jg (aminosyrer 132-188) er forbindelsessekvenser, som forbinder område-

I DK 175483 B1 I

I 6 I

I segmenterne. I

I Forbindelsesekvenseme J4 og Jg indbefatter hver især I

I aktiveringsstedet (processing) og N-terminalt dertil en I

I 5 cysteinrest, som indgår i en svovl-svovl-bro til det I

I katalytiske område (B-kæde). I

I Det har overraskende vist sig, at enkeltkæde-hybrid-PA'er, I

I som indeholder det katalytiske serinproteaseområde fra en I

I PA (TPAB eller UPAB) knyttet til en aminosyresekvens I

I 10 indeholdendé alle eller adskilte A-kædeområder fra den I

I anden PA eller adskilte områder fra begge PA’er, udviser I

I værdifulde farmakologiske egenskaber. I

I l overensstemmelse hermed angår opfindelsen en enkeltkæde- I

I hybrid-PA, som omfatter en aminosyresekvens indeholdende I

I 15 alle eller adskilte A-kædeområder fra human u-PA eller I

I adskilte A-kædeområder fra human u-PA og human t-PA I

I rækkeforbundet til det katalytiske område i human t-PA I

(TPAB), og en enkeltkædehybrid-PA, som omfatter en amino- I

I syresekvens indeholdende alle eller adskilte A-kædeområder I

I 20 i human t-PA eller adskilte A-kædeområder i human t-PA og I

I u-PA bundet i række til det katalytiske område i human I

I u-PA (UPAB). I

I En foretrukken udførelsesform for hybrid-PA'eme ifølge I

I opfindelsen indeholder det katalytiske område fra human I

I 25 u-PA (UPAB). I

I Opfindelsen angår især enkeltkæde-PA*er indeholdende en I

I aminosyresekvens valgt blandt gruppen bestående af en I

I aminosyresekvens indeholdende alle A-kædeområderne fra I

human t-PA, en aminosyresekvens indeholdende adskilte I

30 A-kædeområder fra human t-PA, såsom fingerområdet eller et I

kringle-område, især kringle-2-området, fra human t-PA, og I

en aminosyresekvens indeholdende 2, 3 eller 4 A-kædeområ- I

^ der fra human t-PA og/eller human u-PA, især to eller tre I

7 DK 175483 B1 områder af human t-PA eller to eller tre områder af human u-PA og human t-PA, såsom finger-, vækstfaktor- og kringle-2-områdeme af human t-PA, finger- og kringle-2-5 områderne af human t-PA eller u-PA-vækstfaktor- og t-PA-kringle-2-områderne, hvilken aminosyresekvens er bundet i række til det katalytiske område fra human u-PA, og endvidere en enkeltkæde-PA, der omfatter en aminosyresekvens indeholdende u-PA-vækstfaktor- og t-PA-kringle-2-områ-10 derne, hvilken aminosyresekvens er bundet i række til det katalytiske område fra. human t-PA.

Hybrid-PA-aminosyresekvensen starter fortrinsvis med den N-terminale sekvens fra t-PA (T, aminosyrer 1-5) eller u-PA (Τ', aminosyrer 1-12) eller starter med en vilkårlig 15 forbindelsessekvens, som er naturligt N-terminalt bundet til det første område i hybrid-PA'en, eller med et fragment af en sådan forbindelsessekvens, hvilket fragment fortrinsvis indeholder mindst 5 aminosyrerester.

I hybrid-PA'erne ifølge opfindelsen er A-kædeområderne 20 forbundet via naturlige forbindelsessekvenser (f.eks. J^, J2, J3 og J5), fusionerede forbindelsessekvenser eller hybridforbindelsessekvenser eller fragmenter deraf. Et første område er således bundet til et andet område ved hjælp af forbindelsessekvensen, der naturligt forekommer 25 ved C-terminalen i det første område, ved hjælp af forbindelsessekvensen, der naturligt forekommer ved N-termi-nalen i det andet område, ved hjælp af en fusioneret forbindelsessekvens sammensat af de omtalte forbindelsessekvenser eller ved hjælp af fragmenter deraf. 1 2 3 4 5 6 A-Kædeområderne i hybrid-PA*erne ifølge opfindelsen er 2 bundet til B-kædeserinproteaseområdet (TPAB eller UPAB) 3 ved hjælp af en forbindelsessekvens valgt blandt gruppen 4 bestående af forbindelsessekvensen J4, som binder A-kæden 5 til B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen J5, som 6 forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybrid-

I DK 175483 B1 I

I 8 i

I sekvens sammensat af undersekvenser af ovennævnte forbin- I

I delsessekvenser, hvori forbindelsessekvensen omfatter et I

I processing- eller behandlingssted, som kan spaltes ved I

I 5 hjælp af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, I

som kan indgå i en svovl-svovl-bro til det katalytiske I

I B-kædeområde, idet forbindelsessekvensen fortrinsvis har I

I mindst 40 og op til 60 aminosyrerester. I

I Især foretrækkes det, at områderne forbindes i en I

I 10 position, som er fastlagt ved hjælp af exon-iiitron-sam- I

I lingspunkterne på det tilsvarende DNA. Samlingspunktet for I

I A-kæden til B-kæden er specielt ved aktiveringsstedet. I

I Opfindelsen angår især en enkeltkæde-hybridplasminogen- I

I aktivator valgt blandt gruppen bestående af en hybridplas- I

I 15 minogenaktivator omfattende A-kæden af u-PA eller en I

I A-kæde, der i det væsentlige består af u-PA-vækstfaktor- I

I og t-PA-kringle-2-områdeme forbundet i række til det I

I katalytiske område (B-kæde) af t-PA, og en hybridplas- I

minogenaktivator omfattende A-kæden af t-PA, en A-kæde i I

20 det væsentlige bestående af fingerområdet af t-PA, en I

A-kæde, i det væsentlige bestående af u-PA-vækstfaktor- I

og t-PA-kringle-2-områderne, en A-kæde i det væsentlige I

bestående af t-PA-finger- og kringle-2-områderne eller en I

A-kæde i det væsentlige bestående af t-PA-finger-, vækst- I

25 faktor- og kringle-2-områdeme, hvor A-kæden er bundet i I

række til det katalytiske område (B-kæde) af u-PA, hvor I

A-kæden er bundet til B-kæden gennem en forbindelses- I

sekvens omfattende et aktiveringssted og en cystein- I

rest, som kan danne en svovl-svovl-binding til B-kæden. I

30 Opfindelsen angår især ligeledes en enkeltkædeplasminogen- I

aktivator, som omfatter en A-kæde i det væsentlige bestå- I

ende af t-PA-kringle-2-området bundet til det katalytiske I

område (B-kæde) af u-PA ved aktiveringsstedet. I

Specielt foretrækkes en enkeltkædehybridplasminogenakti- I

DK 175483 B1 9 vator valgt blandt gruppen bestående af en sådan hybridpiasminogenaktivator omfattende en A-kæde i det væsentlige bestående af u-P A-vasks tf aktorområdet og t-PA-5 kringle-2-området bundet i række til det katalytiske område (B-kæde) fra t-PA, og en hybridpiasminogenaktivator omfattende en A-kæde i det væsentlige bestående af t-PA-kringle-2-området eller af t-PA-finger- og kringlen-områderne bundet i række til det katalytiske område 10 (B-kæde) af u-PA, hvor forbindelsesstedet mellem A-kædeområdet eller -områderne og B-kæden er ved aktiveringsstedet.

Foretrukne hybrid-PA’er ifølge opfindelsen er UPAATPAB(BC) = [uPA(1-158)-tPA(276-527) ], 15 UPAATPAB(BR) = [uPA(1-131)-tPA(263-527) ], TPAAUPAB(BC) = [ tPA(l-275)-uPA(159-411) ], TPAAUPAB(BR) = [tPA(1-262)-uPA(132-411) ], UK2UPAB(BR) * [ uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411)], FUPAb(BC) = [tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411) ], 20 FUPAb(BR) = [tPA(1-49)-uPA(134-411) ], FK2UPAb(BC) = [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)], FK2UPAB(BR) = [ tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)J, UK2TPA(BC) = [uPA(1-44)-tPA(176-527)], K2UPAB(BC) = [ tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ], 25 FGK2UPAB(BC) = [tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) og FGK2UPAB(BR) = [ tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411) ], hvori UPAA er A-kæden af u-PA, TPAA er A-kæden af t-PA, UPAb er B-kæden fra u-PA, TPAB er B-kæden fra t-PA, U betyder vækstfaktorområdet fra u-PA, K2 betyder kringle-30 2-området fra t-PA, F betyder fingerområdet fra t-PA, G betyder vækstfaktorområdet fra t-PA, (BC) angiver, at forbindelsespunktet mellem A-kædeområdet eller -områderne og B-kæden er ved aktiveringsstedet, og (BR) angiver, at A-kædeområdet eller -områderne er forbundet med B-kæden 35 over forbindelsessekvensen naturligt bundet til B-kæden

I DK 175483 B1 I

I 10 I

I indbefattende aktiveringsstedet og N-terminalt dertil I

I cysteinresten, som indgår i en svovl-svovl-bro til I

I B-kæden. Tallene angiver aminosyresekvenserne taget fra I

I 5 henholdsvis u-PA og t-PA. Eksempelvis betegner UK2UPAB(BR) I

I = [uPA( 1-44)-tPA( 176-261 )-uPA( 134-411)] en enkeltkædehy- . I

I bridplasminogenaktivator bestående af aminosyrer 1-44 I

I (vækstfaktorområde, U) fra uPA og aminosyrer 176-261 I

I (kringle-2-område, K2) fra t-PA bundet lineært til amino- I

I 10 syrer 134-411 (B-kæde, UPA0) fra u-PA. I

I Især foretrækkes hybridplasminogenaktivatorer TPAAUPAB- I

I (BC), FUPAb(BC), FGK2UPAb(BC) og specielt UK2TPAB(BC), I

I FK2UPAB(BC) og K2UPAb(BC). I

I Opfindelsen angår endvidere mutanter af hybrid-PA'erne I

I 15 ifølge opfindelsen, hvori mindst ét, fortrinsvis alle I

I N-glycosyleringsstederne er modificeret, således at der I

I ikke kan forekomme glycosylering ved dette eller disse I

I steder. I

I Som bekendt er forekomsten af tripeptidsekvensen I

I 20 -Asn-L-Ser(eller Thr)-, hvori Asn er acceptoren, og I» kan I

I være en vilkårlig af de 20 genetisk indkodede aminosyrer I

I bortset fra prolin eller asparaginsyre, som forhindrer I

I glycosylering, en nødvendig forudsætning for N-bundet I

I glycosylering i humane celler og pattedyrceller. Der I

I 25 findes tre steder for N-glycosidisk binding i I

I t-PA-molekylet (tallene angiver positionen af Asn i I

I aminosyresekvensen for t-PA, jf. fig. 1 på tegningen): I

I -Asn^-^-Ser-Ser- (findes i kringle-1), Asn^^-Gly-Ser- I

I (findes i kringle-2) og Asn448_Arg-Thr (findes i t-PA-B- I

I 30 kæden). Det entydige N-bundne glycosyleringssted i u-PA er I

I i B-kæden (Asn302_ser_Thr, jf. fig. 3). Det er klart, at I

I hybrid-PA'er, som indeholder t-PA-kringle-1, t-PA-kringle- I

I 2, B-kæden af t-PA og/eller B-kæden af u-PA også I

I indeholder de pågældende N-bundne glycosyleringssteder. I

DK 175483 B1 11

For at forhindre glycosylering ved enkelte (et eller flere) af N-glycosyleringsstederne er det nødvendigt at ændre tripeptidsekvenserne, der genkendes som signaler for 5 N-glycosylering. Ombytning af Asn- og/eller Ser- (eller Thr)-resterne i de ovenfor omtalte tripeptidsekvenser med en vilkårlig anden aminosyre ville ophæve dannelsen af glycosidiske bindinger på disse steder. For nemheds skyld gennemføres modificering af N-glycosyleringsstederne ikke 10 på proteinniveauet. Det er i stedet for fordelagtigt at modificere genet, som koder for hybrid-PA'en på en sådan måde, at der efter ekspression af det modificerede gen ved hjælp af en vært produceres en mutanthybrid-PA, hvori et eller flere af N-glycosyleringsstederne er ændret på en 15 sådan måde, at der ikke kan foregå glycosylering ved disse steder. Det foretrækkes at modificere alle N-glycosyleringsstederne, som forekommer i hybrid-PA'eme ifølge opfindelsen.

Især ombyttes asparagin med valin, leucin, isoleucin, 20 alanin eller specielt glutamin, og serin eller threonin med valin, mehtionin eller især alanin.

Især foretrækkes de modificerede hybrid-PA'er.

FUPA® (Gln302)(BC) = [tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301,

Gin, 303-411)], 25 FK2(Alal86)UPAB(Gln302)(BC) = [ tPA(1-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA( 159-301), Gin, 303-411)], UK2(Alal86)TPAB(Ala450)(BC) = [UPA(1-44)-tPA(176-185),

Ala, 187-449, Ala, 451-527)], UK2(Alal86)UPAB(gln302)(BC) = [ tPA(1-3)-tPA(176-185), Ala 30 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)], FGK2(Alal86)UPAB(Gln302)(BC) = [ tPA(1-86)-tPA(176-185,

Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)] og endvidere FK2UPAB(Gln302)(BC) = [ tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-301, 35 Gin, 303-411)],

DK 175483 B1 I

12 I

K2UPAB(Gln302)(BC) = [ tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-301, I

Gin, 303-411)], I

UK2TPAB(Ala450)(BC) = [ uPA(l-44)-tPA(176-449, Ala, I

5 451-527)] og I

FGK2UPAB(Gln302)(BC) = [tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA I

(159-301, Gin, 303-411)]. I

Hybrid-PA’eme og mutanter deraf ifølge opfindelsen kan I

fremstilles ved rekombinant-DNA-teknik, der eksempelvis I

10 omfatter dyrkning af en transformeret vært, som udtrykker I

hybrid-PA-proteinet eller en mutant deraf, under I

betingelser, som tillader ekspression deraf og isolering I

af henholdsvis hybrid-PA-proteinet og mutant-hybrid-PA- I

proteinet. Nærmere betegnet fremstilles de ønskede for- I

15 bindeiser ved, at man I

a) fremstiller et DNA, som koder for et hybrid-PA-pro- I

tein eller en mutant deraf, eller kemisk fremstiller et i I

sådant DNA, I

b) inkorporerer DNA1 et i en passende ekspressionsvektor, I

20 c) overfører den dannede hybridvektor til en recipient- I

vært, I

d) selekterer den transformerede vært fra utransformerede I

værter, f.eks. ved dyrkning under betingelser, under I

hvilke kun den transformerede vært overlever, I

25 e) dyrker den transformerede vært under betingelser, som I

tillader ekspression af hybrid-PA-proteinet, og I

f) isolerer hybrid-PA-proteinet eller mutanten deraf. I

De trin, som indgår i fremstillingen af hybrid-PA-prote- I

inerne ved hjælp af rekombinant-DNA-teknik, beskrives mere I

30 detaljeret i det følgende. I

DNA'er, der koder for hybrid-PA-proteiner I

Opfindelsen angår DNA'er, som har en sekvens, der koder I

for et hybrid-PA, som er sammensat af mindst to under- I

sekvenser svarende med hensyn til aminosyreidentitet og I

DK 175483 B1 13 antal til undersekvenser af human u-PA og human t-PA, eller som koder for en mutant deraf. Opfindelsen angår især DNA'er, som har sekvens, der koder for et hvilket som 5 helst af de ovenfor omtalte særligt foretrukne hybrid-PA-proteiner og mutanter deraf.

DNA'erne ifølge opfindelsen har fortrinsvis flankeringssekvenser ved deres ender. Disse flankeringssekvenser indbefatter især egnede restriktionssteder, som tillader 10 integrering af DNA'erne i egnede vektorer.

Endvidere omfatter DNA'erne ifølge opfindelsen signalsekvensen for u-PA eller t-PA knyttet til den første kodon i den modne hybrid-PA-kodningssekvens. Når DNA'erne ifølge opfindelsen udtrykkes i gærceller, kan de eventuelt 15 indeholde en gærsignalsekvens, såsom signalsekvensen, der er naturligt bundet til den anvendte gærpromotor, især PH05- eller invertasesignalsekvensen.

Nucleotidsekvénseme i DNA-undersekvenseme er fortrinsvis identiske med nucleotidsekvenserne i henholdsvis u-PA-cDNA 20 og t-PA-cDNA. Som følge af degenereringen af den genetiske kode kan nucleotidsekvenserne imidlertid afvige, når blot de færdige aminosyresekvenser forbliver uændrede.

I DNA'er, som koder for en mutant hybrid-PA, er mindst én kodon, der koder for en aminosyre, der er essentiel for 25 N-glycosylering af hybrid-PA-proteinet, erstattet med et andet kodon, der koder for en anden aminosyre, som sletter genkendelsesstedet for N-glycosylering.

Nucleotidsekvenserne for u-PA-cDNA og t-PA-cDNA er kendt, jf. W.E. Holmes et al-, Biotechnology 3, 923-929 (1985) og 30 D. Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983). Endvidere er de fuldstændige nucleotidsekvenser for de genomiske u-PA- og t-PA-gener omfattende alle introns og exons fastlagt, jf. A. Riccio et al., Nucl. Acids Res. 13, 2759-2771 (1985) og S. J. Friezner-Degen et al., J. Biol.

35 Chem. 261, 6972-6985 (1986).

Η I

I DK 175483 Bil I il I 14

Ved kendskab til cDNA-sekvenserne og de genomiske DNA-se- I

I kvenser for u-PA og t-PA kan DNA'erne ifølge opfindelsen I

I fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte frem- I

I 5 gangsmåder. Fremgangsmåderne til fremstilling af disse I

I DNA'er indbefatter kemisk syntetisering af DNA'erne eller I

I fremstilling af fragmenter, som koder for polynucleotid- I

I sekvenser af u-PA-cDNA og t-PA-cDNA, og religering af I

I disse i den forudbestemte orden, eventuelt ved inkludering I

I 10 af et eller flere, såsom to eller tre, mutationstrin. I

DNA’erne, som koder for mutanthybrid-PA'er ifølge I

I opfindelsen, kan fremstilles under anvendelse af kendte I

fremgangsmåder. Fremgangsmåderne til fremstilling af disse I

I DNA'er indbefatter udskæring af en del af DNA'et, som I

I 15 omfatter kodonet for den uønskede aminosyrerest, fra I

I moderhybrid-PA-genet og ombytning deraf med et DNA-seg- I

I ment, hvori kodonet er blevet erstattet med en deoxy- I

I ribonucleotidtriplet, som koder for den ønskede aminosyre- I

I rest, eller ved at gennemføre deoxyribonucleotidombytnin- I

20 gen ved hjælp af steddirigeret mutagenese. I

I Den kemiske syntese af DNA er velkendt og gennemføres I

I under brug af konventionel teknik. Egnede teknikker er I

I sammenfattet af S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983). I

I Især kan de fremgangsmåder, som er beskrevet i beskrivel- I

I 25 sen til europæisk patentansøgning nr. 146.785, anvendes, I

I og disse fremgangsmåder skal betragtes som optaget i I

I nærværende beskrivelse. I

I En anden fremgangsmåde til fremstilling af DNA'erne ifølge I

I opfindelsen består i at udskære egnede restriktionsfrag- I

I 30 menter, som koder for polynucleotidsekvenser for u-PA og I

I t-PA, fra u-PA-cDNA og t-PA-cDNA (eller genomisk u—PA-DNA I

I eller t-PA-DNA) og anvende disse fragmenter til fremstil- I

I lingen af hele hybrid-PA-strukturgenet. Dette kan gennem- I

I føres på to måder. Ved begge metoder skal der drages I

I 35 omsorg for, at fusionen af fragmenterne sker på steder I

DK 175483 B1 15 mellem områderne for at holde disse intakte. Ved den første metode anvendes egnede restriktionssteder. Når et egnet restriktionssted er tilgængeligt ved det eller de 5 forudbestemte forbindelsessteder i såvel u-PA- som t-PA-DNA'erne, spaltes DNA'erne med den tilsvarende restriktionsendonuclease, og fragmenterne samles ved kortende- eller forskudtende-ligering (afhængigt af den valgte restriktionsendonuclease). Nyttige restriktions-10 steder kan eventuelt indføres ved f.eks. steddirigeret mutagenese, jf. M.J. Zoller et al., Methods Enzymol 100, 468 (1983)., idet der drages omsorg for, at det muterede DNA ikke resulterer i en ændret aminosyresekvens. Særligt foretrukne naturlige eller kunstigt indførte restrik-15 tionssteder er sådanne, der adskiller DNA'erne, som koder for A- og B-kæderne, eller DNA'er, som koder for de adskilte områder, som er indeholdt i A-kædeme. På denne måde kan der fremstilles hybrid-DNA'er, som koder for hybrid-PA'er med det ønskede samlingspunkt mellem 20 A-kædeområdeme og det katalytiske serinproteaseområde.

Den anden fremgangsmåde er baseret på idéen om at områdegrænser bedst defineres ved positionen af exon-intron-samlingspunkterne i de genomiske DNA'er, jf.

L. Patthy, Cell 4JL, 657-663 (1985), dvs. positionerne i 25 cDNA'erne, hvor introns er blevet splejset. Da disse positioner sjældent falder sammen med restriktionssteder, indføres et system, som kan følges ved en vilkårlig ny konstruktion: i et første trin ligeres hensigtsmæssige restriktionsfragmenter, som koder for det eller de 30 specifikke områder, men som også indeholder yderligere DNA-sekvenser ud over det forudsete fusionspunkt (op til flere hundrede basepar), og subklones i bakteriofag ml3. I et andet trin afsnøres de overskydende DNA-sekvenser ved in vitro-mutagenese, jf. Zoller et al., se ovenfor. Denne 35 metode tillader nøjagtige funktioner i struktur ved en hvilken som helst forudbestemt nucleotid position og foretrækkes derfor.

Til fremstillingen af mutanthybrid-PA'erne kan udskæring

I DK 175483 B1 I

I 16 I

I af en del af det modne hybrid-DNA gennemføres ved anven- I

I delse af restriktionsenzymer. En forudsætning for denne I

I metode er tilgængeligheden af passende restriktionssteder I

I 5 i nærheden af det kodon, som skal ændres. Et lille I

I restriktionsfragment, som, indeholder kodonet for en I

I uønsket aminosyre, fjernes ved spaltning med endonuclease. I

I En tilsvarende dobbeltstrenget DNA-sekvens, fremstilles I

I f.eks. ved kemisk syntese, hvor der anvendes tripletter, I

I 10 som koder for den ønskede aminosyre. DNA-fragmentet I

I ligeres i den rigtige orientering til det tilbageblevne I

I store fragment til dannelse af en dobbeltstrenget DNA- I

I sekvens, som koder for et mutanthybrid. For nemheds skyld I

og for at lette håndteringen af hybridgenet, er sidst- I

15 nævnte fordelagtigt indeholdt i et større DNA-segment I

I forsynet med passende linkere, som tillader indsætning og I

I kloning af segmentet i en kloningsvektor. I

I Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen gennem- I

I føres fremstillingen af DNA'er, som koder for en mutant- I

I 20 hybrid-PA, ved steddirigeret mutagenese. Denne metode er I

I en in vitro-mutagenesemetode, ved hvilken et fastlagt sted I

I i et område af klonet DNA kan ændres, jf. oversigtsartik- I

I lerne af M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, I

I 468 (1983), D. Botstein og D. Shortle, Science 229, 1193 I

I 25 (1985). Mutagenese kan enten gennemføres på hele hybrid- I

I PA-genet eller på funktionelle dele deraf, som indeholder I

I kodonet for den eller de uønskede aminosyrer. Efter I

I mutagenese bindes den muterede funktionelle del til de I

andre dele af hybrid-PA'en til dannelse af mutanthybrid- I

I 30 PA'en. I

I Fremgangsmåden til mutering af hybrid-PA-genet eller en I

I funktionel del deraf er karakteriseret ved, at det enkelt- I

I strengede gen eller et enkeltstrenget DNA, som indeholder I

I PA-genet eller en del deraf, hybridiseres til en oligode- I

I 35 oxyribonucleotidprimer, som er komplementær til området i I

I hybridgenet, som skal muteres, bortset fra en eller flere I

DK 175483 B1 17 mismatch, som styrer mutationen, det hybridiserede oligo-deoxyribonucleotid anvendes som en primer til initiering af syntesen af den komplementære DNA-streng, det dannede 5 (partielle) dobbeltstrengede DNA transformeres til en recipientmikroorganismestamme, mikroorganismestammen dyrkes, og trans formanter, som indeholder DNA med det modificerede (mutant) hybrid-PA-gen, selekteres.

Hybridvektorer, som indeholder hybrid-PA-DNA

10 Opfindelsen angår hybridvektorer, som indeholder et DNA, der koder for et hybrid-PA, som er sammensat af mindst to undersekvenser, som med hensyn til aminosyreidentitet og antal svarer til undersekvenser af human u-PA og human t-PA, eller som koder for en mutant deraf, og fremgangs-15 måder til fremstilling deraf.

Vektoren vælges under hensyntagen til de værtsceller, som skal anvendes til transformation. Principielt er alle vektorer, som replicerer og udtrykker det ønskede poly-peptidgen ifølge opfindelsen i den valgte vært, egnede.

20 Som eksempler på egnede værter kan nævnes eukaryoter, som ikke eller kun i ringe grad indeholder restriktionsenzy- . mer eller modifikationsenzymer, såsom gær, f,eks.

Saccharomyces cerevisiae, f.eks. Saccharomyces cerevisiae GRF18, og endvidere pattedyrceller, især etablerede humane 25 eller animalske cellelinier, f.eks. myelomaceller, humane embryoniske lungefibroblaster L-132, COS-celler, LTK-cel-ler, human malignantmelanoma Bowes-celler, HeLa-celler, SV-40-virustransformerede nyreceller fra grøn afrikansk abe, C0S-7-celler eller kinesisk hamsterovarieceller (CHO) 30 og varianter deraf. De ovenfor omtalte pattedyrceller og Saccharomyces cerevisiae-stammer, f.eks. Saccharomyces cerevisiae GRF18, foretrækkes som værtsmikroorganismen.

I DK 175483 B1 I

I 18 I

I a. Vektorer til anvendelse i gær I

I Vektorer, som er egnede til replikation og ekspression i I

I gær, indeholder et gærreplikationsorigin og en selektiv I

I 5 genetisk markør for gær. Hybridvektorer, som indeholder et I

I gærreplikationsorigin, f.eks. kromosomalt autonomt repli- I

I cerende segment (ars), tilbageholdes ekstrakromosomalt i I

I gærcellen efter transformationen og replikeres autonomt. I

I Hybridvektorer, som indeholder sekvenser, der er homologe I

I 10 til gær-2-ji-plasmid-DNA, kan også anvendes. Sådanne I

I hybridvektorer vil blive integreret ved rekombination i I

I 2-fi-plasmider, som allerede findes i cellen, eller de vil I

I repliceres autonomt. 2 μ-sekvenser er særligt egnede til I

I plasmider med en høj transformationssekvens og tillader I

I 15 høje kopital. I

I Egnede markørgener for gær er især sådanne, som bibringer I

I værten antibiotikumresistens eller, i tilfælde af I

I auxotrophe gærmutanter, gener, som kompletterer I

I værtslæsioner. Tilsvarende gener bibringer f.eks. I

I 20 resistens mod antibiotiket G418 eller tilvejebringer I

I prototrofi i en auxotroph gærmutant, f.eks. URA3-, LEU2-, I

HIS3- eller TRP1-genet. Gærhybridvektorer indeholder I

I endvidere fortrinsvis et replikationsorigin og et I

I markørgen for en bakterievært, især Escherichia coli, I

25 således at konstruktionen og kloningen af hybridvektorerne I

I og deres intermediater kan finde sted i en bakterievært. I

I Ekspressionskontrolsekvenser, som er egnede til I

I ekspression i gær, er f.eks. ekspressionskontrolsekven- I

I ser fra godt udtrykte gærgener. Der kan derfor anvendes I

I 30 promotorerne for TRPl-genet, ADHI-genet eller ADHII-genet, I

I sur phosphatase (PH03 eller PH05)-generne, isocyto- I

I chromgenet eller en promotor for glycolysegenerne, såsom I

I promotoren for enolase-, glyceraldehyd-3-phosphat- I

I dehydrogenase (GAPDH)-, 3-phosphoglyceratkinase (PGK)-, I

I 35 hexokinase-, pyruvatdecarboxylase-, phosphofructokinase-, I

DK 175483 B1 19 glucose-6-phosphatisomerase-, 3-phosphoglycerat-mutase-, pyruvatkinase-, triosephosphatisomerase-, phosphoglucose-isomerase-, invertase- og glucokinasegenerne. Foretrukne 5 vektorer ifølge opfindelsen indeholder promotorer med transskriptionskontrol, f.eks. promotorerne for PH05- og ADHII-generne, som kan tilkobles eller frakobles ved at variere vækstbetingelserne. Eksempelvis kan PH05-promoto-ren frakobles eller tilkobles alene ved at forøge eller 10 formindske koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet.

Gærhybridvektoreme ifølge opfindelsen indeholder fortrinsvis også 3'-flankeringssekvensen fra et gærgen, som indeholder de rigtige signaler til transskriptions-terminering og polyadenylering. Egnede 3'-flankerings-15 sekvenser er f.eks. sekvenserne fra genet, som er naturligt bundet til den anvendte promotor, såsom 3'-flankeringssekvensen fra gær PH05-genet.

b. Vektorer til anvendelse i pattedyrceller

Vektorer til replikation og ekspression i pattedyrceller 20 er ofte forsynet med DNA af viral oprindelse, f.eks. fra simianvirus 40 (SV 40), Rous sarcoma-virus (RSV), adenovirus 2, bovin papillomavirus (BPV), papovavirus BK-rautant (BKV) eller muse- eller humancytomegalovirus (MCMV og HCMV). 1 2 3 4 5 6

Ekspressionskontrolsekvenser, som er egnede til anvendelse 2 i pattedyrceller, indbefatter bl.a. de såkaldte "early" og 3 "late" promotorer for SV40, den såkaldte "major late" 4 promotor for adenovirus, promotoren for det murine metal- 5 lothioneingen og forstærker-promotor-området for det 6 såkaldte muse- eller humancytomegalovirus major immediate early-gen, det humane immunoglobulin-forstærker-promotor-område, den humane α-globin-promotor eventuelt kombineret med SV40-forstærkeren og promotorer afledt af varmechok-generne.

I DK 175483 B1 I

I 20 I

I Egnede markørgener til pattedyrceller er f.eks. neo- og I

I ble-generne fra transposon Tn5, som tilvejebringer I

I resistens mod henholdsvis antibiotiket G418 og mod I

I 5 antibiotika af bleomycintypen, Escherichia coli-genet for I

hygromycin-B-resistens, dihydrofolatreduktasegenet (dhfr) I

I fra pattedyrceller eller Escherichia coli, som ændrer I

I fænotypen af DHFR"-celler til DHFR+-celler og/eller til- I

I vejebringer resistens mod methotrexat, og thymidinkinase- I

I 10 genet fra herpes simplexvirus, som gør TK"-celler I

I fænotypiske TK+-celler. I

I Hybridvektorerne for pattedyrceller indeholder fortrinsvis I

det 3'-utranslaterede område af et pattedyrgen, som inde- I

I holder signaler for rigtig transskriptionsterminering og I

I 15 polyadenolysering, såsom f.eks. 3'-flankeringsområdet af I

Ø-globingenet. Områderne, som flankerer polypeptidkod- I

I ningsområdet, indeholder fordelagtigt et eller flere I

I native introns med de hensigtsmæssige splejsningssignaler I

I ved deres ender. Sådanne tilføjelser antages at være I

I 20 nødvendige, da cDNA'er og prokaryotiske DMA'er, såsom de I

I ovenfor omtalte selektionsgener, sædvanligvis mangler I

I sådanne transskriptions- og processingsignaler. I

I Sådanne vektorer indeholder fortrinsvis et replikations- I

I origin og et antibiotikumresistensgen til propagering i I

I 25 Escherichia coli. Et pattedyrreplikationsorigin kan til- I

vejebringes enten ved at inkludere i konstruktionen af I

I vektoren et eukaryotisk origin, såsom afledt af SV40 I

I eller af en anden viruskilde, eller kan tilvejebringes ved I

I hjælp af værtscellekromosomet efter integrering af I

30 vektoren i værtscellekromosomet. I

De foretrukne hybridvektorer til anvendelse i pattedyrcel- I

ler indeholder hybrid-PA- eller mutanthybrid-PA-cDNA, som I

er operabelt flankeret på upstream-sidén med den murine I

DK 175483 B1 21 cytomegalovirus major immediate-early-genforstærkerpromo-tor og på downstream-siden med 3'-enden af kanin-0-globingenet , som indeholder det andet intron med dets passende 5 splejsningssignaler og en polyadenyleringssekvens. Endvidere indeholder de sekvenser, som koder for neomycin-resistensgenet fra transposon Tn5 eller eventuelt fra Tn9 eller sekvenserne, som koder for hygromycinphosphotransfe-rase flankeret på upstream-siden sekvensvis med earlypro-10 motoren fra SV40-virus, som også indeholder SV40-replika-tionsoriginet og den naturlige promotor for Tn5-neogenet, og på downstream-siden med et segment af SV40-earlygenet indeholdende det lille t-antigen-splejsningssignal og polyadenyleringssignalet. Hele konstruktionen klones i et 15 fragment af Escherichia coli-plasmid pBR322, som indeholder plasmidreplikationsoriginet og ampicillinresistensge-net, men som mangler såkaldte "gift"-sekvenser, som inhiberer SV40-mode DNA-replikation i pattedyrceller. Eventuelt er et gen, som koder for dihydrofolatreduktase 20 (DHFR) indeholdt i vektoren, og der anvendes fortrinsvis det modulære DHFR-gen beskrevet af R.J. Kaufman et al., [Mol. Cell. Biol. 2, 1304-1319 (1982)]. Dette modulære DHFR-gen består i rækkefølge af major late-promotoren fra adenovirus type 2, et fragment af et immunogl obu lingen, 25 kodningsdelen af et murint DHFR-cDNA og SV40 early poly-adenyleringsstedet.

De nye foretrukne hybridvektorer til anvendelse i pattedyrceller repræsenterer et teknisk fremskridt. De er de hidtil kendte vektorer overlegne, idet de indeholder de 30 stærke ekspressionssignaler for det klonede cDNA placeret i musecytomegalovirus-immediate-early-promotor/forstærke-ren og i Ø-globin-splejsnings/polyadenyleringssekvenserne i et miljø, som tillader ekspression på højt niveau i mange forskellige typer hvirveldyrceller. Nærmere 35 betegnet kan vektorerne anvendes (a) til forbigående at udtrykke cDNA'er i normale, dvs. ikke-SV40-transformerede, vævskulturcellelinier, men (b) endnu bedre ved høje kopi-

I DK 175483 Bl I

I 22 I

I tal i primatceller, som udtrykker SV40-T-antigen, hvilket I

I tillader vektoren at replikere via dens SV40-replikations- I

I origin, men tillige (c) at udtrykke sådant klonet cDNA I

5 stabilt i normale vævskulturcellelinier, hvor vektoren kan I

I integrere i værtscellekromosomet, og (d) endnu bedre, på I

I grund af det høje kopital, når vektoren indføres i SV40- I

I T-antigenproducerende primatcellelinier, hvor vektoren kan I

I replikere episomalt. I

I 10 Forstærker-promotor-området for MCMV omfatter f.eks. et I

I DNA, der starter ved nucleotider -835 til -443 og slutter I

I ved nucleotid +50 (regnet fra mRNA-starten) i 5'-området I

I af MCMV-major-immediate-early-genet. Det foretrukne I

I forstærker-promotor-område fra MCMV omfatter nucleotider I

I 15 -542 til +50. I

3'-Flankeringsområdet af kanin-£-globingenet består af den I

I anden halvdel af kanin-Ø-globingenet, jf. P. Dierks et I

I al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1411-1415 (1981) og A. I

I van Ooyen et al., Science 206, 337-344 (1979), startende I

I 20 fra det andet exon, fortrinsvis ved BamHI-stedet, og ind- I

befatter således det andet intron med dets signaler for I

splejsning ved dets flankeringssekvenser og afslutter bag I

I polyadenyleringssignalerne, fortrinsvis ved Bglll-stedet I

I placeret 1,2 kb efter ovennævnte BamHl-sted. I

I 25 SV40-Replikationsoriginet er eksempelvis indeholdt i I

HindilI-Sphl-fragmentet af det virale DNA [nucleotider I

I 5171 til 128, origin = position 1, J. Tooze (red.) DNA I

I Tumor Viruses, Part. 2, 2. udgave. Cold Spring Harbor I

I Laboratory, Cold Spring Harbor Ν.Υ. 1982 ]. Den foretrukne I

I 30 udførelsesform er imidlertid Hindlll-Hpall-fragmentet I

I (nucleotider 5171 til 346), som foruden replikationsori- I

I ginet også indeholder den virale early-forstærker/promo- I

I tor, der er nyttig til at fremme transskriptionen af I

I vektorens selektionsgen. I

DK 175483 B1 23

Neomycingenet er klonet bag en promotor, som er aktiv i vævskulturceller, fortrinsvis SV40-early-promotoren som placeret på HpalI-Hindi II-fragmentet anført ovenfor.

5 Kodningssekvenserne for neomycingenet er eksempelvis indeholdt på et BgllI-Smal-fragment fra transposon Tn5, jf. E. Beck et al., Gene lj), 327-336 (1982), P. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982) og F.

Colbére-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14 (1981).

10 Det foretrækkes at forsyne neomycingenet med en anden promotor, som også tillader transskription i Escherichia coli. Eksempelvis kan den naturlige promotor for Tn5 neomycingenet indeholdt fortrinsvis på et Hindlll-Bglll-fragment anbringes bag den eukaryotiske promotor foran, 15 neokodningssekvenserne, jf. Southern et al., se ovenfor, eller yderligere upstream foran den eukaryotiske promotor, jf. Colbére-Garapin et al., se ovenfor. Til udtrykkelse i vævskulturceller skal bakterieneogenet efterfølges af et polyadenyleringssignal, fortrinsvis en del af SV40-t-anti-20 gengenet, som også indeholder splejsningssignaler. Kodnings sekvensen for neomycinphosphotransferasen, især Bglll-Smal-delen af Tn5-fragmentet anført ovenfor, kan også erstattes af kodningssekvensen for hygromycin B-phos-photransferase, fortrinsvis i form af BamHI-fragmentet af 25 plasmid pLG89, jf. L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983), som mest hensigtsmæssigt kan indsættes i pSVd, jf.

Luedin et al., EMBO-J. 6, 109-114 (1987), som er et derivat af pSV29lineo, hvori en Bglll-linker er indført ved Smal-stedet i vektoren. 1 2 3 4 5 6

Et andet foretrukket selektionsgen anvender kodningsse 2 kvensen for enzymet dihydrofolatreduktase, såsom i 3 pSV2dhfr (ATCC 37145), som ikke blot tillader selektion af 4 transformerede cellelinier men også forstærkning af den 5 plasmidassocierede DNA-sekvens, ofte med en proportional 6 forøgelse af produktionen af de plasmidkodede proteiner ifølge opfindelsen.

I DK 175483 B1 I

I 24 i

I Fragmentet afledt af Escherichia coli-plasmld pBR322 I

I indeholder pBR322-replikationsoriginet og ampicillin- I

I resistensgenet. Fragmentet tages fortrinsvis fra et I

I 5 pBR322-derivat, såsom pSVOd, jf. P. Mellon et al., Cell I

I 27, 279-288 (1981), hvori den såkaldte "gift"-sekvens, som I

ville inhibere den SV40-T-antigendrevne replikation af I

vektoren, er fjernet. I

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen angår I

10 hybridvektorer, som kan replicere og foretage fænotypisk I

I selektion i en . eukaryotisk værtsstamme, omfattende en I

promotor og et DNA, som koder for en hybrid-PA eller en I

I mutanthybrid-PA, hvilket DNA er placeret sammen med I

I transskriptionsstartsignaler og transskriptionstermine- I 15 ringssignaler samt translationsstartsignaler og transla- I tionsstopsignaler i hybridvektoren under kontrol af pro- motoren, således at det i en transformeret vært udtrykkes til dannelse af proteinet.

I Hybridvektorerne ifølge opfindelsen fremstilles under an- 20 vendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, f.eks. ved I at sammebinde DNA-segmenterne indeholdende promotoren, hybrid-PA- eller mutanthybrid-PA-kodningsområdet,

I 3'-flankeringssekvensen og vektor-DNA'et. I

I Der kan anvendes forskellige teknikker til binding af I 25 DNA-segmenter in vitro. Korte ender (fuldstændigt I baseparrede DNA-dobbeltstrenge) dannet ved hjælp af visse I restriktionsendonucleaser kan ligeres direkte med T4-DNA- I ligase. Oftere sammenbindes DNA-segmenter gennem deres I enkeltstrengede klæbrige ender, og der foretages covalent I 30 lukning ved hjælp af en DNA-ligase, f.eks. T4-DNA-ligase.

I Sådanne enkeltstrengede klæbrige ender kan dannes ved I spaltning af DNA med en anden type endonucleaser, som j I danner forskudte ender (de to strenge i de dobbeltstren- I gede DNA spaltes forskellige steder i en afstand af nogle I 35 få nucleotider). Enkelte strenge kan også dannes ved addi-

DK 175483 B1 I

25 tion af nucleotider til korte ender eller forskudte ender under anvendelse af terminaltransferase (såkaldt

"homopolymer tailing") eller ved simpelthen at skære den 5 ene streng i et kortende-DNA-segment med en egnet I

exonuclease, såsom x-exonuclease. En anden fremgangsmåde I

til fremstilling af forskudte ender består i at foretage I

ligering til et kortendet DNA-segment af kemisk synteti- I

seret linker-DNA, som indeholder et genkendelsessted for I

10 endonuclease, der danner forskudte ender, og derpå spalte I

det dannede DNA med den pågældende endonuclease. Bestand- I

delene i hybridvektorerne ifølge opfindelsen saimnenbindes I

i en forudbestemt rækkefølge eller orden for at sikre I

rigtig funktion. I

I 15 Værter transformeret med hybridvektorer indeholdende

I hybrid-PA-DNA

I Et andet aspekt af opfindelsen omfatter eukaryotiske I værtsorganismer transformeret med hybridvektorer, som I indeholder et DNA, der koder for en hybrid-PA, der er I 20 sammensat af mindst to under sekvenser, som med hensyn til I aminosyreidentitet og antal svarer til undersekvenserne af I human u-PA og human t-PA, eller koder for en mutant deraf, I og mutanter af værten samt fremgangsmåder til fremstilling I deraf.

I 25 Eksempler på egnede eukaryotiske værter er de ovenfor I anførte, især gærstammer og pattedyrceller. Mutanter af I transformerede værtsorganismer indbefatter specielt I mutanter, som har ringe indhold af hybrid-PA- eller I mutanthybrid-PA-nedbrydende proteaser og giver høje I 30 udbytter af henholdsvis hybrid-PA og mutanthybrid-PA.

I Fremgangsmåder til fremstilling af de transformerede I eukaryotiske værter omfatter transformering eller I transficering af en eukaryotisk vært med en ekspressions- I vektor indeholdende et DNA ifølge opfindelsen reguleret

I DK 175483 B1 I

I 26 I

I ved hjælp af en ekspressionskontrolsekvens. I

I Transformationen af de eukaryotiske værtsceller gennem- I

føres under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Eksempel- I

I 5 vis kan transformationen af gær med hybridvektorerne I

I gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet I

I af Hinnen et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 75, 1919 I

I (1978). Denne fremgangsmåde kan opdeles i tre trin: I

I (1) Fjernelse af gærcellevæggen eller dele deraf. I

I 10 (2) Behandling af de "nøgne" gærceller (spheroplaster) I

I med det transformerende DNA i nærværelse af PEG (poly- I

I ethylenglycol) og Ca2+-ioner. I

I (3) Regenerering af cellevæggen og selektion af de trans- I

I formerede celler i et fast agarlag. I

I 15 Foretrukne fremgangsmåder: I

I ad (1): Gærcellevæggen fjernes enzymatisk under anvendel- I

I se af forskellige glucosidasepræparater, såsom snegletarm- I

I safter, f.eks. "Glusulase"® eller "Helicase"®, eller I

I enzymblandinger udvundet fra mikroorganismer, f.eks. I

I 20 "Zymolyase"®, i osmotisk stabiliserede opløsninger, f.eks. I

I 1 M sorbitol. I

I ad (2): Gær-spheroplasterne klumper sammen i nærværelse I

I af PEG, og der fremkaldes lokale fusioner af cytoplasma- I

I membranerne. Dannelsen af "fusionslignende" tilstande er I

25 afgørende, og mange transformerede gærceller bliver I

diploide eller endog triploide under transformationspro- I

cessen. Metoder, som tillader selektion af fusionerede I

spheroplaster kan anvendes til opkoncentrering af I

transformanter, dvs. transformerede celler kan let I

30 screenes fra præselekterede fusionsprodukter. I

ad (3): Da gærceller uden cellevæg ikke deler sig, er det I

nødvendigt at gendanne cellevæggen. Denne gendannelse gen- I

DK 175483 B1 27 nemføres hensigtsmæssigt ved at indlejre spheroplasterne i agar. Eksempelvis blandes smeltet agar (ca. 50°C) med spheroplasterne. Efter afkøling af opløsningen til gær-5 dyrkningsteraperaturer (ca. 30*0), fås et fast lag. Dette agarlag skal forhindre hurtig diffusion og tab af vigtige makromolekyler fra spheroplasterne og derved lette gendannelsen af cellevæggen. Imidlertid kan gendannelsen af cellevæggen også opnås (dog med lavere effektivitet) ved 10 at udplade spheroplasterne på overfladen af præformede agarlag.

Regenereringsagaren fremstilles fortrinsvis på en sådan måde, at det er muligt at opnå regenerering og selektion af transformerede celler på samme tid. Da der sædvanlig-15 vis anvendes gærgener, som koder for enzymer i aminosyre-biosyntesecykluserne, som selektive markører (se ovenfor), gennemføres regenereringen fortrinsvis i minimalmediegær-agar. Hvis der kræves meget høj regenereringseffektivitet er følgende totrinsmetode fordelagtig: (1) regenerering af 20 cellevæggen i et rigt komplekst medium, og (2) selektion af de transformerede celler ved kopiudpladning af cellelaget på selektive agarplader.

Indføringen af hybridvektorer i pattedyrceller gennemføres ved transfektion i nærværelse af hjælpeforbin-25 delser, f.eks. diethylaminoethyldextran, dimethylsul- foxid, glycerol, polyethylenglycol eller lignende, eller som coprecipitater af vektor-DNA og calciumphosphat. Andre egnede metoder indbefatter direkte mikroinjektion af vektor-DNA i cellekernen og elektroporation, dvs. indføring 30 af DNA ved hjælp af en kort elektrisk strøm, som forøger cellemembranernes permeabilitet. Den efterfølgende selektion af transficerede celler kan gennemføres under anvendelse af en selektionsmarkør, som enten er covalent integreret i ekspressionsvektoren eller tilsat som en 35 særskilt enhed. Selektionsmarkørerne indbefatter gener, som tilvejebringer resistens mod antibiotika, eller gener,

I DK 175483 B1 I

I 28 I

der kompletterer en genlæsion hos værtscellen (se I

I ovenfor). I

I Et foretrukket selektionssystem anvender celler, som mang- I

I 5 ler dihydrofolatreduktase (DHFR-), f.eks. CHO-celler, der I

I absolut kræver thymidin, glycin og purin til vækst, med- I

I mindre der tilføres et exogent DHFR-gen. Ved Indføring af I

I en vektor, som indeholder hybrid-PA-genet og tillige et I

I DHFR-gen, i egnede DHFR”-celler, f.eks. CHO-celler, selek- I

I 10 teres transformerede celler ved at forøge koncentrationen I

I af antifolatlægemidlet methotrexat i mediet. I

I Der foretrækkes især en selektionsmetode, ved hvilken I

I egnede pattedyrceller, f.eks. CHO-celler, behandles med I

I coprecipitater af vektor-DNA indeholdende hybrid-PA-genet I

I 15 og et gen, som koder for antibiotikumresis tens, f.eks. I

I resistens mod G-418, og calciumphosphat. De transformerede I

I celler selekteres ved dyrkning i nærværelse af de tilsva- I

I rende antibiotika, f.eks. G-418, og/eller ved screening I

I for hybrid-PA-ekspression. I

I 20 Transformerede værtsorganismer ifølge opfindelsen kan I

I forbedres med hensyn til produktionen af hybrid-PA’er I

I eller mutanthybrid-PA* er ved mutation og selektion under I

I anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. Mutation I

I kan eksempelvis gennemføres ved bestråling med ultraviolet I

I 25 lys eller ved behandling med egnede kemiske midler. Især I

I foretrækkes fremstillingen af proteasedeficiente mutanter, I

I især gærmutanter, for at undgå proteolytisk nedbrydning af I

I henholdsvis den producerede hybrid-PA og mutanthybrid-PA. I

I Dyrking af transformerede værtsceller I

I 30 Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstil- I

I ling af enkeltkædehybrid-PA'er med en aminosyresekvens I

I bestående af mindst to undersekvenser, der med hensyn til I

I aminosyreidentitet og antal svarer til undersekvenser af I

DK 175483 B1 29 human t-PA og human u-PA, eller mutanter deraf, ved hvilken en transformeret eukaryotisk vært, som indeholder en DNA-sekvens, der koder for hybrid-PA'en eller mutant-5 PA'en, dyrkes under passende næringsbetingelser, og hybrid-PA’en eller mutanten Isoleres.

De transformerede værtsceller dyrkes under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder i et flydende medium, som indeholder assimilerbare kilder for kulstof, nitrogen og 10 uorganiske salte.

Til dyrkningen af de transformerede gærceller ifølge opfindelsen kan der anvendes forskellige kilder for I kulstof. Eksempler på foretrukne kilder for kulstof er I assimilerbare kulhydrater, såsom glucose, maltose, I 15 mannitol eller lactose, eller et acetat, der kan anvendes I enten alene eller i passende blandinger. Eksempler på I egnede kilder for nitrogen er aminosyrer, såsom I casaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbryd- I ningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrak- I 20 ter, gærekstrakter, maltekstrakt og tillige ammoniumsalte, I f.eks. ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller I ammoniumnitrat, som kan anvendes enten alene eller i I egnede blandinger. Uorganiske salte, som også kan I anvendes, er f.eks. sulfater, chlorider, phosphater og I 25 carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium.

I Mediet indeholder endvidere f.eks. vækstfremmende stoffer, I såsom sporelementer, f.eks. jern, zink, mangan og lig- I nende, og fortrinsvis stoffer, som udøver et selektions- I tryk og forhindre vækst af celler, som har mistet eks- I 30 pressionsplasmidet. Hvis f.eks. således en gærstamme, som I er auxotroph med hensyn til f.eks. en essentiel I aminosyre, anvendes som værtsmikroorganisme, indeholder I pi asmi det fortrinsvis et gen, der koder for et enzym, som I kompletterer værtdefekten. Dyrkning af gærstammen I 35 gennemføres i et minimalmedium, som mangler aminosyren.

I DK 175483 B1 I

1 30 I

I Dyrkningen gennemføres under anvendelse af i og for sig I

kendte fremgangsmåder. Dyrkningsbetingelserne, såsom I

I temperatur, mediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges I

I 5 således, at man opnår en maksimumkoncentration af PA-pro- I

I teinerne ifølge opfindelsen. Gærstammen dyrkes således I

I fortrinsvis under aerobe betingelser ved submers kultur I

I med rystning eller omrøring ved en temperatur på ca. 20 I

I til ca. 40*0, fortrinsvis ca. 30eC, og ved en pH-værdi på I

I 10 5-8, fortrinsvis ved pH ca. 7, i fra ca. 4 til ca. 30 I

I timer, fortrinsvis indtil der er opnået maksimumudbytter I

I af proteinerne ifølge opfindelsen. I

I Pattedyrceller dyrkes under vævsdyrkningsbetingelser under I

I anvendelse af kommercielt tilgængelige medier, der I

I 15 eventuelt er tilsat vækstfremmende stoffer og/eller I

I pattedyrsera. Cellerne dyrkes enten fastgjort på en fast I

I bærer, f.eks. en mikrobærer eller porøse glasfibre, eller I

I fritflydende i egnede dyrkningsbeholdere. Dyrkningsmediet I

I vælges fortrinsvis på en sådan måde, at der udøves I

I 20 selektionstryk, og at kun de celler overlever, som stadig I

I indeholder hybridvektor-DNA'et inklusive den genetiske I

I markør. Således sættes eksempelvis et antibiotikum til I

I mediet, når hybridvektoren indeholder det tilsvarende I

I antibiotikumresistensgen. I

I 25 Når celletætheden har nået en tilstrækkelig høj værdi, I

I afbrydes dyrkningen, og proteinet isoleres. Når der I

I anvendes pattedyrceller udskilles hybrid-PA- eller I

I mutanthybrid-PA-proteinet sædvanligvis til mediet. Mediet I

I indeholdende produktet adskilles fra cellerne, som kan I

I 30 tilsættes frisk medium og anvendes til fortsat produktion. I

I Når der anvendes gærceller kan proteinet også akkumulere I

I inden i cellerne, især i det periplasmatiske rum. I I

I sidstnævnte tilfælde består det første trin i udvindingen I

I af PA-proteinet i at frigøre proteinet fra cellens indre. I

I 35 Ved de fleste metoder fjernes cellevæggen først ved I

I enzymatisk spaltning af cellevæggen med glucosidaser (se H

DK 175483 B1 31 ovenfor). Eventuelt fjernes cellevæggen ved behandling med kemiske midler, dvs. thiolreagenser eller EDTA, der fremkalder beskadigelser af cellevæggen, hvorved det 5 dannede hybrid-PA eller mutanten kan afgives. Den dannede blanding opkoncentreres med hensyn til hybrid-PA eller mutanten deraf på konventionel måde, f.eks. ved at fjerne størsteparten af det ikke-proteinholdige materiale ved behandling med polyethylenimin, fældning af proteinerne 10 tinder anvendelse af ammoniumsulfat, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, f.eks. ionbytterkromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi, HPLC eller HPLC med omvendt fase, molekylsortering på en egnet "Sephadex"®-søjle eller lignende. Den afsluttende rensning af det 15 forrensede produkt opnås eksempelvis ved affinitetskromatografi, f.eks. antistofaffinitetskromatografi, især monoklonal antistofkromatografi under anvendelse af monoklonale anti-t-PA- eller anti-u-PA-antistoffer fastgjort på en uopløselig matrix under anvendelse af i og 20 for sig kendte fremgangsmåder eller i tilfælde af hybrid-PA'er indeholdende den katalytiske B-kæde fra t-PA, DE-3-affinitetskromatografi (DE-3 er en proteaseinhibitor isoleret fra Erytrina latissima), og lignende.

Hybridomacellelinier, som producerer monoklonale 25 antistoffer rettet mod specifikke områder af t-PA eller u-PA, og de monoklonale antistoffer er ligeledes omfattet af opfindelsen.

Til den hensigtsmæssige fremstilling af enkædeformen af hybrid-PA'en eller mutanthybrid-PA'en, som er praktisk 30 taget fri for tokædeformen, anvendes med fordel en proteaseinhibitor, såsom aprotinin ("Trasylol"®) eller basisk pancreatisk trypsininhibitor under rensningsprocessen for at inhibere spor af proteaser, som kan være til stede i dyrkningsmediet, og som kan forårsage (delvis) 35 omdannelse af enkædeformen til tokædeformen. Den afsluttende rensning opnås da ved kromatografi på en søj-

I DK 175483 B1 I

I 32 I

le, som indeholder et selektivt affinitetsreagens. I

I 5. Farmaceutiske præparater I

I De nye enkeltkædehybrid-PA-proteiner og mutanter deraf, I

I 5 som kan fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse, I

I har værdifulde farmakologiske egenskaber. De kan anvendes I

I på samme måde som kendte plasminogenaktivatorer i menne- I

H

I sker til forebyggelse eller behandling af thrombose eller I

I andre tilstande, hvor det er ønskeligt at frembringe lokal I

I 10 fibrinolytisk eller proteolytisk aktivitet via mekanismen I

I med plasminogenaktivering, f.eks. ar terioscl erose, I

I myocardial og cerebral infarkt, venethrombose, thromboem- I

bolisme, postkirurgisk thrombose, thrombophlebitis og dia- I

I betisk vasculopati. I

I 15 Det har overraskende vist sig, at de nye hybrid-PA-prote- I

I iner og mutanter deraf ifølge opfindelsen kombinerer de I

I gunstige egenskaber ved naturlig t-PA og u-PA. De nye I

I hybrid-PA-proteiner og mutanter deraf har således I

I fibrinolytisk aktivitet. De unike fibrindirigerede egen- I

I 20 skaber, dvs. evnen til at aktivere plasminogen fortrinsvis I

i nærværelse af fibrin, er bibeholdt. Desuden har de nye I

proteiner en længere in vivo-stabilitet end autentisk I

t-PA. I

Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater, som inde- I

25 holder en terapeutisk virksom mængde af den aktive I

bestanddel (hybrid-PA eller mutant deraf) sammen med orga- I

niske eller uorganiske, faste eller flydende farmaceutisk I

acceptable bærestoffer, som er egnede til parenteral, dvs. I

intramuskulær, subkutan eller intraperitoneal, indgift, og I

30 som ikke påvirker de aktive bestanddele i skadelig I

retning. I

De er egnede infusionsopløsninger, fortrinsvis vandige I

opløsninger eller suspensioner, som eventuelt kan frem- I

DK 175483 B1 I

33 I

stilles inden brugen, f.eks. ud fra lyofiliserede præpara- I

ter, som indeholder den aktive bestanddel alene eller I

sammen med et bærestof, såsom mannitol, lactose, glucose, I

5 albumin og lignende. De farmaceutiske præparater er steri- I

liserede og eventuelt blandet med hjælpestoffer, f.eks. I

konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, I

emulgeringsmidler, opløselighedsfremmende stoffer, puffere I

og/eller salte til regulering af det osmotiske tryk. I

10 Sterilisering kan opnås ved sterilfiltrering gennem filtre I

med lille porestørrelse (0,45 pm diameter eller mindre), I

hvorefter præparatet eventuelt kan lyofiliseres. I

Antibiotika kan også tilsættes for at bevare sterilitet. I

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er I

15 dispenseret i enhedsdosisformer f.eks. ampuller, som inde- I

holder 1-2000 mg farmaceutisk acceptabelt bærestof pr. I

enhedsdosis og ca. 1-200 mg, fortrinsvis ca. 5-100 mg, I

aktiv bestanddel pr. enhedsdosis. I

Afhængigt af sygdommens type og patientens alder og I

20 tilstand er den daglige dosis, som skal indgives til I

behandling af en patient med en legemsvægt på ca. 70 kg, I

i området fra 3 til 100 mg, fortrinsvis fra 5 til 50 mg, I

pr. døgn. I tilfælde af myocardial infarkt indgives en I

dosis på fra ca. 30 til 80 mg i løbet af 60 til 120 I

25 minutter, fortrinsvis i tre alikvoter og i løbet af ca. 90 I

minutter. Den samlede mængde hybrid-PA eller I

mutanthybrid-PA kan også indgives som bolusinjektion. I

Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat, og fremgangs-30 måden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at et biologisk aktivt protein ifølge opfindelsen blandes med et farmaceutisk acceptabelt bærestof.

Anvendelsen af de nye proteiner til profylaktisk og terapeutisk behandling af det menneskelige legeme er ligeledes I DK 175483 B1

I 34 I

I omfattet af opfindelsen. I

I Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under I

I 5 henvisning til tegningen, hvor: I

I Fig. 1 og 3 illustrerer nucleotidsekvenseme og udledte I

I aminosyresekvenser for henholdsvis human-t- I

I PA-cDNA og human-u-PA-cDNA. De første amino- I

I syrer i de modne proteiner er understreget. I

10 Fig. 2 og 4 er restriktionsendonucleasekort for hen- I

I holdsvis human-t-PA-cDNA og human-u-PA-cDNA. I

I Fig. 5 illustrerer skematisk fremstillingen af plas- I

I mid pEco0.47AScaI. I

I Fig. 6 illustrerer skematisk konstruktionen af plasmid I

I 15 ph.tPAAScal indeholdende et muteret t-PA-cDNA. I

I Fig. 7 illustrerer skematisk konstruktionen af plasmid I

I pUNC.tc indeholdende en cDNA-insert omfattende I

I A-ksdeområderne fra u-PA og B-kæden fra t-PA. I

I Fig. 8 skematisk viser konstruktionen af plasmid I

I 20 ptNC-UC indeholdende en cDNA-insert omfattende I

I A-kædeområderne fra t-PA og B-kæden fra u-PA. I

I Fig. 9 viser skematisk konstruktionen af plasmid pD02. I

Fig. 10 illustrerer skematisk konstruktionen af plas- I

mid pDOlO indeholdende t-PA-cDNA kombineret med I

25 et β-globinfragment. I

Fig. 11 illustrerer skematisk konstruktionen af plasmid I

pCGA26 indeholdende t-PA-cDNA'et under kontrol I

af MCMV-IE-promotoren og et β-globinfragment. I

Fig. 12 illustrerer skematisk konstruktionen af t-PA- I

30 ekspressionspiasmid pCGA28 og af universalt I

ekspressionspiasmid pCGA44, som begge indeholder I

neomycinresistensgenet. I

Fig. 13 illustrerer skematisk konstruktionen af t-PA- I

ekspressionsplasmid pCGA42 og af universal I

35 I

DK 175483 B1 35 ekspressionsplasmid pCGA42d, som begge indeholder hygromycinresistensgenet.

Fig. 14 illustrerer skematisk konstruktionen af t-PA-ekspressionsplasmid pCGA48 indeholdende neo-5 mycinresistensgenet og DHFR-genet.

Fig. 15 illustrerer skematisk konstruktionen af ekspressionsplasmid pBRla indeholdende den muterede t-PA-cDNA-insert fra plasmid ph.tPAAScal.

Fig. 16 viser skematisk konstruktionen af ekspressions-10 plasmid pBR2a indeholdende et hybrid-PA-cDNA- insert. indeholdende A-kædeområdeme fra u-PA og B-kæden fra t-PA.

Fig. 17 viser skematisk konstruktionen af u-PA-ekspres-sionsplasmid pBR3a.

15 Fig. 18 illustrerer skematisk konstruktionen af ekspressionsplasmid pBR4a indeholdende en hybrid-PA-cDNA-insert omfattende A-kædeområderne fra t-PA og B-kæden fra u-PA.

Fig. 19 viser skematisk konstruktionen af gærekspres-20 sionsvektor pJDB207/PH05-I-TPA indeholdende PH05-promotoren, invertasesignalsekvensen og t-PA-cDNA.

Fig. 20 illustrerer skematisk konstruktionen af plasmid pCS16.

25 Fig. 21 illustrerer skematisk konstruktionen af plasmid pCS16/UPA indeholdende u-PA-cDNA'et.

Fig. 22 viser skematisk konstruktionen af plasmid pJDB207/PH05-I-UPA.

Fig. 23-26 illustrerer skematisk de teknikker, som 30 anvendes til at omdanne primære hybrid-PA-konstruktioner indeholdende A-kædeområder og det katalytiske B-kæde-område fra u-PA eller t-PA til det færdige produkt, hvori bindingen mellem områderne er ved aktiveringsstedet og/eller ved de naturlige exon-intron-samlingssteder: 35 I DK 175483 B1 1 36

Fig. 23 viser konstruktionen af et gen, som koder for I

I et hybrid-PA, der omfatter A-kædeområdeme fra I

I t-PA og B-kæden fra u-PA: I

I 5 Fig. 24 viser konstruktionen af et gen, som koder for I

I en hybrid-PA, der indeholder A-kædeområdeme fra I

I u—PA og B-kæden fra t-PA. I

I Fig. 25 viser konstruktionen af et gen, som koder for I

I en hybrid-PA, der indeholder u-PA-vækstfaktor- I

I 10 området, kringle-2-området fra t-PA og B-kæden I

I fra t-PA. I

Fig. 25 illustrerer konstruktionen af et gen, som koder I

for en hybrid-PA omfattende u-PA-vækstfaktor- I

I området, kringle-2-området fra t-PA og B-kæden I

I 15 fra u-PA. I

I Fig. 27 er en sammenstilling af hybrid-PA'er og mutant- I

I hybrid-PA'er som eksemplificeret i den eksperi- I

I menteile del. I

I De på tegningen anvendte symboler har følgende I

I 20 betydninger: I

AMP, AmpR ampicillinresistensgen (β-lactamase) I

TET, TetR tetracyclinresistensgen I

I NEO Tn5 neomycinphosphotransferase I

I TN5PR bakteriepromotor for transposon TN5 I

I 25 HPH hygromycinphosphotransferase I

I pBRori replikationsorigin for plasmid pBR322 I

POIS "poison-sequence", pBR322-sekvens, som I

hæmmer SV40-replikation I

I SV40ori replikationsorigin for SV40, falder I

I 30 sammen med early- og late-promotorer I

I SV40enh,SV40E 72 bp forstærker, del af SV40 early- I

I promotor forstærker for human cytomegalo- I

I virus (HCMV) major immediate early-gen I

I MCMVP promotor/mRNA startsted for musecytomegalo- I

I 35 virus (MCMV)major immediate early gen I

I RSV Rous sarcomavirus LTR (promotor) I

DK 175483 B1 37 CAP position af 5’ m7Gp "cap" af eukaryotisk

mRNA

polyA polyadenylationssted for mRNA

5 SPLD splejsningsdonorsted, 5'-ende af intron SPLA splejsningsacceptorsted, 3'-ende af intron BAP bakteriel alkalisk phosphatase CIP kalvetarmphosphatase (BamHl/Bgl2) Sau3a sted dannet ved coligering af et 10 BamHI- og et Bglll-sted

Seal(del) muteret Scal-sted x < y restriktionsenzymsted x placeret med uret fra y p promotor 15 inv.SS invertasesignalsekvens t transskriptionsterminator

L linker-DNA

DHFR dihyrofolatreduktase

mtPA Bowes melanoma t-PA

20 Eksempel 1

Indføring af et Scal-sted ved forbindelsespunktet mellem kringle-strukturerne og enzymområdet i human t-PA-cDNA

En anvendt fremgangsmåde til konstruktion af kimære molekyler eller hybridmolekyler indeholdende områder fra 25 såvel t-PA som u-PA består i at fremstille de ønskede restriktionsfragmenter afledt af de respektive kloner, samle dem igen i opløsning og derpå klone dannede konstruktioner. Efter kloning bekræftes strukturen af de kimære molekyler ved restriktionskortlægning og DNA-se-30 kvensanalyse.

Til dannelse af hybridmolekylerne spaltes såvel t-PA- som u-PA-cDNA'er ved forbindelsespunkterne mellem de respektive kringlestrukturer og enzymområder. Dette opnås med u-PA ved at foretage en partiel spaltning med restrik- I DK 175483 B1 I 38

tionsendonucleasen MstI, som adskiller det ikke-kataly- I

tiske område fra enzymområdet og forbundne sekvenser ved I

I dets 3'-ende. Der findes intet sammenligneligt nyttigt I

I 5 potentielt spaltningssted i t-PA, og et sådant indføres I

derfor som beskrevet i det følgende: I

I A) Konstruktion af plasmid pEco0.47AScal (se fig. 5) I

I Ved denne konstruktion ødelægges det entydige Scal-sted I

I (AGTACT) ved nucleotidposition 940-945 i t-PA-cDNA'et I

10 (AGTACT -» AGTATT), og der indføres et andet Scal-sted ved I

I nucleotidpositionerne 963-968 (TCCACC AGTACT) ved 3'- I

enden af kringle-2 (jf. fig. 1 og 2). Disse ændringer I

påvirker ikke kodningen af aminosyreme. I

I Alle restriktionsspaltningeme gennemføres i overensstem- I

I 15 melse med fabrikantens anvisninger (New England Biolabs, I

I Bethesda Research Labs), og de dannede spaltningsprodukter I

I analyseres ved hjælp af elektroforese på 3,5%'s I

I polyacrylamidgel. Gelen farves med ethidiumbromid (1,0 I

I μg/ml) og gøres synlig med ultraviolet lys. Det egnede I

I 20 bånd udskæres og elektroelueres i 0,5 x TBE (1 x TBE = 90 I

I mM Tris-borat, pH 8,3, 2,5 mM EDTA). Det elektroeluerede I

materiale sættes på en Elutip-d-søjle (Schleicher og I

I Schuell), det bundne DNA elueres i høj saltkoncentration I

I og fældes ved tilsætning af ethanol. Pelletten vaskes med I

I 25 ethanol, tørres og opløses i vand. I

DK 175483 B1 39 EDTA, 0,5% xylencyanol, 0,05% bromphenolblåt) og elektroføres© på en 5% polyacrylamidgel i 0,5 x TBE ved 8 volt pr, cm, jf. Maniatis et al., Molecular Cloning, A 5 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

De adskilte strenge udvindes ved elektroeluering efterfulgt af ethanolfældning. Et 31-mer deoxyoligonucleotid (indeholdende de 5 ønskede nucleotidændringer, jf. fig. 5) fremstilles under anvendelse af phosphotriestermetoden. 50 10 pmol af 31-meren 32p_jnær]Ceg Ved 5'-enden i en 20 μΐ reaktionsblanding indeholdende 1 x kinasepuffer (10 x kinase-puffer = 0,5 M Tris.HCl, pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM spermidin, 1 mM EDTA), 30 /iCi [ q32p ]atp (Amersham, ~3000 Ci/mmol) og 10 enh. T4 polynucleotidkinase 15 (Bethesda Research Labs.). Reaktionsblandingen inkuberes ved 37®C i 30 minutter, hvorpå der tilsættes 1 /il 10 mM ATP, 10 enh. T4-kinase, hvorefter der inkuberes i yderligere 30 minutter ved 37*C. Reaktionen afbrydes ved opvarmning til 68eC i 10 minutter. Den mærkede 31-mer, der 20 har samme sekvens som den ikke-transskriberede streng, anvendes som proben i en prik-blot-analyse [ gennemføres i overensstemmelse med Zoller og Smith, Nucl. Acids. Res.,

10, 6487-6500 (1982), bortset fra at præhybridisering og hybridisering gennemføres ved 50°C og vask ved 60°C ] til 25 bestemmelse af, hvilken af de to strenge hybridiserer til den, dvs. repræsenterer den transskriberede streng. De fire DNA'er sammenblandes i en 20 μΐ annelleringsreaktionsbi ånding, som består af 0,3 pmol af den transskriberede streng, 2 pmol af 150 bp EcoRI, Scal-fragmentet og 2 30 pmol af 290 bp EcoRI, Hael Il-fragmentet, 25 pmol af den phosphorylerede 31-mer og 1 x annelleringspuffer (5 x annelleringspuffer = 0,5 M NaCl, 32,5 mM Tris.HCl, pH

7,5, 40 mM MgCl2 og 5 mM Ø-mercaptoethanol). Blandingen inkuberes ved 100°C i 3 minutter, ved 30°C i 30 minutter, 35 ved 4®C i 30 minutter og derefter på is i 10 minutter, hvorefter der tilsættes 400 enh. T4-DNA-ligase (New England Biolabs), og reaktionsblandingen inkuberes ved 12,5eC natten over. Det annellerede 470 bp-fragment udvin-

I DK 175483 B1 I

I 40 !

I des fra en 3,5% polyacrylamidgel som beskrevet ovenfor og I

I ligeres til EcoRI-spaltet og dephosphoryleret pBR322-DNA I

I (New England Biolabs) i 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM I

I 5 MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM spermidin, 0,1 mg/ml I

bovint serumalbumin inkuberes natten over ved 12°C. I

I Ligeringsblandingen anvendes til at transformere kompetent I

I Escherichia coli-stamme HB101 (Maniatis et al., se I

I ovenfor). Ampicillinresistente kolonier selekteres på I

I 10 L-agar indeholdende 50 /ig/ml ampicillin, og kolonier I

indeholdende 470 bp-fragmentet identificeres ved koloni- I

I hybridisering under anvendelse af 31-meren som proben, jf. I

D. Hoods, Focus 6, 1-3 (1984). Plasmid-DNA isoleres fra I

I flere positive hybridiseringskolonier i lille målestok, I

I 15 jf. Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193-197 (1981),. I

I og dannelsen af det nye Scal-sted bekræftes ved kombineret I

I EcoRI, Scal-spaltning. For at sikre renhed anvendes I

I plasmid-DNA fra de positive kolonier til en anden runde af I

I transformation af Escherichia coli HB101. PIasmidfremstil- I

I 20 ling i stor målestok gennemføres ud fra en sådan anden I

I generation positiv koloni, jf. Katz et al., J. Bacteriol. I

I 114, 577-591 (1973) og Biochemistry 16, 1677-1683 (1977), I

I og ødelæggelsen af det oprindelige Scal-sted og dannelsen I

I af det ny Scal-sted bekræftes ved DNA-sekvensanalyse under I

I 25 anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert, jf. I

I Methods Enzym. 65, 499-560 (1980). Dette plasmid betegnes I

I pEco0.47AScal. I

I B) Rekonstruktion af human t-PA med mutant Scal-sted I

I (se fig. 6) I

I 30 Ved denne konstruktion ombyttes 470 bp EcoRI-fragmentet på I

I vildtype human t-PA'en med 470 bp EcoRI-fragmentet, som I

I indeholder mutant Scal-stedet. Plasmid pW349F, som inde- I

I holder humant t-PA-cDNA (se ovenfor), spaltes med Clal, I

I og de dannede klæbrige ender omdannes til korte ender ved I

I . 35 tilsætning af 50 /tm dCTP, dGTP og 10 enh. DNA-polymerase I

I I, Klenow-fragment (Boehringer, Mannheim). Reaktionsbian- I

DK 175483 B1 41 dingen inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter efterfulgt af phenol- og etherekstraktion og ethanolfældning. Pelletten opløses i vand, spaltes med EcoRI og Seal, og 5 1,5 kb EcoRI,Seal- og 4,3 kb Clal(kortendet), EcoRI-frag menter isoleres. Disse to fragmenter blandes med 470 bp-fragmentet udvundet fra plasmid pEco0.47AScaI efter EcoRI-spaltning og ligeres som beskrevet ovenfor natten over ved 12°C. Kompetente Escherichia coli HBlOl-celler 10 transformeres med ligeringsblandingen, og tetracyclinresi-stente kolonier selekteres på L-agar, som indeholder 12,5 μg/ml tetracyclin. Kolonier, der indeholder 470 bp-mutant-fragmentet, identificeres ved kolonihybridisering under anvendelse af den ovenfor beskrevne 31-mer som proben. DNA 15 fra minilysater af adskillige af de positive hybridise- ringskolonier fremstilles, og den nøjagtige natur af konstruktionen bekræftes ved gennemførelse af hensigtsmæssige restriktionsspaltninger. Et sådant plasmid med de ønskede ændringer betegnes ph.tPAAScal.

20 Eksempel 2

Konstruktion af et u-PA/t-PA-hybridmolekyle, plasmid pUNC.tc (se fig. 7)

Denne konstruktion er en hybrid mellem det ikke-katalyti-ske område af u-PA (indeholdende det 5'-ikkekodende 25 område, signalsekvensen, vækstfaktorsekvensen og kringle-sekvenserne) og det katalytiske område eller enzymområdet fra human t-PA.

Urokinase cDNA fremstilles ud fra mRNA opnået fra humane Hep3-celler, jf. T. Maniatis et al., Molecular Cloning 30 (1982), side 188-246. Et 1,3 kb Smal-BamHI-fragment og et 1 kb-BamHI-EcoRI-fragment af u-PA-cDNA?et klones i Smal, EcoRI-stederne i pUN121, jf. B. Nilsson et al., Nucl.

Acids Res. 11, 8019-8030 (1983), til dannelse af plasmid pcUK176. Restriktionsendonucleasekortet for den humane

I DK 175483 B1 I

I 42 I

u-PA-cDNA-insert er vist i fig. 4. Nucleotidsekvensen og I

I den afledte aminosyresekvens for u-PA-insertet er vist i I

I fig. 3. I

I 5 Plasmid pcUK176 spaltes med Xmal (se fig. 4, Xmal er en I

I isoskisomer af Smal) og MstI, og 521 bp-fragmentet I

I isoleres. Restriktionsenzym MstI genkender DNA-sekvensen I

I I

TGGj.GCA (pile angiver spaltningssted) og danner korte I

I ender ved spaltning. Dette enzym skærer derfor u-PA-cDNA I

I 10 ved nucleotider 520-525, dvs. lige efter den sidste I

I cysteinrest (aminosyre 131) omfattende kringlen, jf. I

I Holmes et al., Biotechnology 3, 923-929 (1985), og I

adskiller således rent de kodende sekvenser for ikke-kata- I

I lytiske og katalytiske områder. I

I 15 Plasmid ph.tPAAScal spaltes med Seal og Hindlll (HindiII I

I er til stede i vektoren), og 1,8 kb-fragmentet udvindes. I

I Restriktionsenzym Seal genkender DNA-sekvensen I

I vir I

I AGT^ACT (pile angiver spaltningssted) og giver ligeledes

I korte ender efter spaltning. Seal vil skære ph.tPAAScal I

I 20 DNA efter serinresten 262 [ 1 aminosyre efter den sidste I

I cystein i kringle 2, Pennica et al., Nature 301, 214-221 I

I (1983) ], og derfor adskille de ikke-katalytiske og kata-

I lytiske områder. I

I De to fragmenter blandes og ligeres til Xmal, Hindlll- I

I 25 spaltet pUC18 vektor-DNA. Efter transformation af Escheri- I

I cia coli HB101 identificeres kolonier med det korrekte I

I insert ved kolonihybridisering under anvendelse af 2,0 kb I

I BglII-fragmentet fra human tPA (se fig. 2) som proben I

I [proben er mærket ved anvendelse af den tilfældige I

I 30 primingsmetode, jf. Feinberg et al., Analyt. Biochem. 132,

I 6-13 (1983)]. DNA-Sekvensen ved forbindelsespunktet for I

DK 175483 B1 43 ligeringen af u-PA- og t-PA-fragmenteme bekræftes ved hjælp af DNA-sekvensanalyse. En korrekt klon betegnes pUNC.tc.

5 Eksempel 3

Konstruktion af et t-PA/u-PA-hybridmolekyle, plasmid ptNC.UC (se fiq. 8)

Denne konstruktion er lige den modsatte af plINC.tc, idet det ikke-katalytiske område af ph.tPAAScal (indeholdende 10 5’-ikke-kodningsområde, leader-, finger-, vasks tf aktor-, kringle 1- og kringle 2-områder) fusioneres til det kata-tytiske område fra human u-PA. Plasmid ph.tPAAScal spaltes med SacI og Seal (se fig. 8), og et fragment på ca. 1,0 kb isoleres. Plasmid pcUK176 spaltes først med BamHI og derpå 15 partielt med MstI, og ca. 800 bp-fragmentet udvindes. Dernæst skæres BamHI-spaltningsproduktet med EcoRi, og ca.

1,0 kb-fragmentet isoleres. Disse tre fragmenter blandes med pUC19-vektor spaltet med SacI, EcoRI og ligeres. Escherichia coli HB101 transformeres med ligeringsblandin-20 gen, og kolonier med det korrekte insert identificeres ved kolonihybridisering under anvendelse af den samme 2,0 kb Bglll-probe som beskrevet ovenfor. DNA-Sekvensen ved forbindelsespunktet for t-PA- og u-PA-DNA bekræftes ved DNA-sekvensanalyse. En korrekt klon betegnes ptNC.UC.

25 Eksempel 4

Konstruktion af en ekspressionsvektor til anvendelse 1 pattedyrceller A) Omdannelse af HgiAI-stedet i t-PA cDNA til et Hindlll-sted 1

Dette gennemføres i 5 trin (fig. 9).

I DK 175483 B1 I 44

I Plasmid pW349F (europæisk patentskrift nr. 143.081) I

I spaltes delvis med restriktionsenzymet HgiAI ved I

I inkubering af 20 ^g/ml DNA i 1 time ved 37eC med 12 enh/ml I

I 5 af enzymet i den af producenten (Bethesda Research Labors- I

I tories) anbefalede puffer, der dog er tilsat 10 pg/ml I ethidiumbromid for at undertrykke sekundær skæring af I plasmidet. Lineariseret plasmid DNA sættes derpå til 0,8% ågarosegel i TBE-puffer (TBE: 89 mM Tris-borat, pH 8,9, 10 indeholdende 1 mM EDTA), hvorpå der elueres elektroforetisk i den samme puffer, ekstraheres to gange med phenol, to gange med chloroform, hvorpå der til sidst I fældes med alkohol ved -20*C efter tilsætning af 0,1 I rumfang 3 M natriumacetat, pH 5,2. DNA-pelleten opløses

I 15 ved 0,2 mg/ml i TE (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, med 0,1 mM

I EDTA).

I 63 μΐ lineariseret DNA inkuberes derpå i 30 minutter ved

I 37°C med 15 enh. T4 DNA-polymerase i llgasepuffer (33 mM

I Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM kaliumacetat, 10 mM

I 20 magnesiumacetat, 0,5 mM dithiothreitol og 0,1 mg/ml okse- I serumalbumin) efterfulgt af opvarmning i 10 minutter ved I 60°C til inaktivering af enzymet. Formålet med denne I inkubering er at udnytte T4-polymerasens exonucleolytiske I aktivitet til at fjerne de fremragende 4 nucleotider, som 25 er blevet tilbage efter spaltning med HgiAI til dannelse af DNA-molekyler med korte ender.

I Til ligering af Hindi 11-linkere (CAAGCTTG) til det I kortendede DNA sættes 6 μΐ (300 ng) kinasebehandlede I linkere til den ovenfor beskrevne opløsning med 4 μΐ 10 mM .

I 30 ATP og 3 μΐ T4 DNA-ligase (New England Biolabs, 400 I enh./μΐ) efterfulgt af inkubering i 16 timer ved 16eC.

I Ligeringen, afbrydes ved opvarmning af blandingen i 10 I minutter ved 68°C, hvorefter DNA spaltes med Hindlll og I Bglll, idet der tilsættes 15 μΐ (135 enh) Hindlll med 1,5 I 35 μΐ 4 M NaCl, 0,2 μΐ 1 M MgCl2 og 11 μΐ 1 mg/ml I okseserumalbumin, inkuberes ved 37*C i 1 time efterfulgt DK 175483 B1 45

af tilsætning af 40 enh. Bglll, hvorpå der inkuberes yderligere 1 time ved 37eC. Det dannede fragment på 177 basepar renses på en 6%'s polyacrylamidgel i TBE, elueres 5 i TNE (TNE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, indeholdende 100 mM NaCl og 1 mM EDTA), absorberes på DEAE-cellulose (Whatman DE52), elueres med 1 M NaCl i TNE, fortyndes med 4 rumfang vand, fældes ved -20eC efter tilsætning af 2,5 rumfang ethanol og opløses til sidst i 17 μΐ TE (TE: 10 mM

10 Tris-HCl, pH 8,0, indeholdende 1 mM EDTA).

Plasmid pRSVneo er et derivat af plasmid pSV2neo [P.J. Southern og P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982)], hvori det SV40-afledte PvuII-HindIII-fragment er blevet ombyttet med et PvuII-HindiII-fragment, som 15 indeholder LTR-promotoren fra Rous sarcomavirus på samme måde som pRSVcat, konstrueres ud fra pSV2cat [C.M. Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982)].

5 μς af dette plasmid skæres i et rumfang på 50 μΐ med 24 enh. Bglll under anvendelse af producentens anvisninger.

20 Efter inkubering i 1 time ved 37eC tilsættes 40 enh.

Hindlll, og inkuberingen fortsættes i 1,5 timer, hvorefter det store 5,4 kb-fragment renses som beskrevet ovenfor. 1 μΐ af det rensede 177 bp-fragment ligeres i 18 timer ved 16eC til 2 μΐ (20 ng) af pRSVneo-fragmentet under 25 anvendelse af 0,25 μΐ (100 enh.) T4-ligase i et samlet rumfang på 22 μΐ ligasepuffer, hvorefter plasmid DNA'et anvendes til transformering af Escherichia col i i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge D. Hanahan [J. Mol.

Biol. 166, 557-580 (1983)]. Blandt de dannede ampicillin-30 resistente stammer vælges en, som indeholder et plasmid, der betegnes ptPAL med 177 bp Hindlll-BgIII-fragmentet, hvilket påvises ved restriktionsanalyse. 0,1 *tg af dette plasmid skæres i 60 μΐ med 16 enh. Bglll under anvendelse af producentens forskrifter i 1,5 timer ved 37eC. Til 35 denne opløsning sættes derpå 20 enh. alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Boehringer, Mannheim), og inkuberingen I DK 175483 B1

I 46 I

I fortsættes i 30 minutter, hvorefter DNA'et ekstraheres to I

gange med phenol, to gange med chloroform og fældes efter I

I tilsætning af 0,1 rumfang 3,0 M natriumacetat, pH 5,2, og I

I 5 0,6 rumfang isopropanol, opløses i TE, renses yderligere I

I ved agarosegelelektroforese som beskrevet ovenfor, I

ekstraheres to gange med phenol, 2 gange med chloroform, I

I fældes ved -20°C efter tilsætning af 2,5 rumfang ethanol I

I og 0,1 rumfang 3 M natriumacetatopløsning, pH 5,2, og I

I 10 opløses til sidst i 30 μΐ TE. 2,1 kb t-PA BglII-fragmentet I

I udskæres derpå af 5 μς pW349F. i en reaktionsblanding på 25 I

I μΐ under anvendelse af 20 enh. Bglll i 2 timer ved 37*C, I

renses på 0,8% agarosegel, elueres elektroforetisk som I

I beskrevet ovenfor, ekstraheres to gange med phenol, to I

I 15 gange med chloroform, fældes ved -20*C efter tilsætning af I

I 2,5 rumfang ethanol og 0,1 rumfang 3 M natriumacetat- I

I opløsning, pH 5,2, og opløses ved en koncentration på 8 I

I ng/μΐ i TE. 1 μ af t-PA-fragmentet ligeres derpå i en I

I reaktionsblanding på 10 μΐ til 7,5 ng Bglll skåret I

I 20 vektor-DNA under anvendelse af 100 enh. T4-ligase I

I (Biolabs) i 17 timer ved 16°C, hvorpå der transformeres i I

I Escherichia coli. En af de dannede kloner, som betegnes I

I pD02, indeholder t-PA Bglll-fragmentet indsat på en sådan I

I måde, at plasmidet indeholder et kontinuert åbent I

I 25 aflæsningssystem for human t-PA. I

I B) Kombination af t-PA cDNA'et med fl-globlnfragroentet I

I Plasmid pD010 (fig. 10) konstrueres ved coligering af 3 I

I DNA-fragmenter: (1) et 2,1 kb-fragment, som starter med I

I et Hindlll-sted og ender med et Bglll-sted, der I

I 30 indeholder hele t-PA-kodningssekvensen, isoleres fra en I

I agarosegel, hvorpå der er sat 10 μg pD02 DNA skåret delvis I

I med Bglll og fuldstændigt med Hindlll. (2) pUB er et I

I plasmid, som indeholder kanin-Ø-globingenet [A. Van Ooyen I

I et al., Science 206. 337 (1979)] subklonet som et Bglll I

I 35 partielt spaltningsprodukt til BamHIstedet i plasmid pUC9 I

I [ J. Vieira og J. Messing, Gene 19, 259-268 (1982), samme I

DK 175483 B1 47 19, 269-276 (1982)]. Fra dette plasmid udskæres et 1,2 kb BamHI-Hindlll-fragment, som indeholder det andet intron og polyadenyleringsstedet, og renses ved agarosegelelektro-5 forese. (3) Vektor pDOl opbygges i omløbsretningen modsat uret fra HindiII-stedet (fig. 10) i Hindlll-Accl-fragmentet af pBR322, soro indeholder replikationsstedet, et 0,3 kb fragment indeholdende forstærkeren for human cytomegalovirus (HCMV), der er afsluttet i et syntetisk 10 Xbal-sted, efterfulgt af en anden kopi af denne forstærker bundet til den homologe promotor, som afslutter ved et syntetisk Hindlll-stéd. Dette vektor-DNA. skæres med Hindlll, og det lineære 6,3 kb plasmid renses ved agarosegelelektroforese.

I 15 C) Indsætning af tPA/globin-komblnationen i pSP62Pst33 I (se fig. 11) I pSP62Pst33 (fig. 11) er et plasmid, som indeholder et 2,1 I kb Pstl-fragment fra musecytomegalovirus (MCMV) DNA, som I indeholder den virale immediate early (IE)-pro- I 20 motor, indsat i Pstl-stedet af plasmid pSP62 (Boehringer I Mannheim) som angivet i figuren. I Hindu I-stedet af I pSP62Pst33 indsættes Hindlll-fragmentet fra pDOlO. Et I plasmid, pCGA26, vælges, hvori t-PA-kodningssekvensen er I indsat således, at den kan transskriberes i "sense"-orien- I 25 tering fra MCMV IE-promotoren.

I D) Indsætning af MCMV/tPA/globinenheden i pFASV29 lineo I (se fig. 12) I Plasmid pSV2911neo [F. Asselbergs et al., J. Mol. Biol.

I 189, 401-411 (1986) ] indeholder neomycin (neo)-phos- I 30 photransferasegenet fra transposon TN5 i en SV40-ekspres- I sionskassette (fig. 12). Det tilvejebringer således resi- I stens mod neomycin og kanamycin, når det indføres i I pattedyrvævskulturceller. pSV2911 neo DNA præpareres til I kloning ved skæring med BamHI, behandling med alkalisk

I DK 175483 B1 I

I 48 I

I phosphatase fra kalvetarm, ekstraheres to gange med I

phenol, to gange med chloroform, fældes med alkohol og I

I opløses til sidst 1 TE. Plasmid pCGA26 skæres med I

I 5 restriktionsenzym Accl, som skærer sekvensen GT/ACAC i I

I position 345 i MCMV-forstærker/promotorområdet [K. I

Doersch-Haessler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, I

I 8325-8329 (1985) ] og sekvensen GT/CGAC (kan også skæres I

med Sall) bag globindelen. De to udhængende baser, som I

10 fremkommer efter skæringen, udfyldes med Escherichia coli I

(stort fragment) DNA-polymerase I, og de nu korte ender I

ligeres til BamHI-linkere (CGGATCCG), og disse skæres med I

BamHI-enzym. 3,8 kb-fragmentet, som bærer MCMV/TPA/ I

I globinenheden nu med BamHI-enderne, renses via en I

I 15 agarosegel og ligeres derpå til pSV2911neo DNA'et behand- I

I let som beskrevet ovenfor til dannelse af ekspressions- I

I plasmid pCGA28. I

I E) Ekspressionsvektorer afledt af pCGA28 I

I pCGA42 er et derivat af pCGA28, hvori neokodningssekvensen I

I 20 (mellem Bglll-stedet og Smal-stedet) er erstattet med I

I kodningssekvensen for et hygromycinresistensgen. Dette I

I opnås (se fig. 13) ved at skære plasmid pSV2911neo ved I

I dets entydige Smal-sted, hvorpå en Bglll-linker I

I (CAGATCTG) ligeres til DNA'et, hvorefter der skæres med I

25 Bglll. Det dannede store DNA-fragment bestående af I

I vektoren minus neo-kodningssekvensen renses på en I

I agarosegel og ligeres til det lille BamHI-fragment fra I

I plasmid pLG89 [L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)], I

I som ligeledes er renset på en agarosegel, hvorved man får I

I 30 plasmider pCGA25c og pCGA25d, der indeholder hygromycin- I

I phosphotransferasegenet i henholdsvis sense- og antisense- I

I orientering. Efter transficering til CHO DUKXBl-celler ved I

I standardbetingelser (se eksempel 16) giver pCGA25C 60 I

I kolonier/^g DNA resistens til 0,2 /ig/ml hygromycin B, som I

I 35 er en koncentration, der dræber CHO-celler indeholdende I

I et plasmid, der ikke koder for hygromycinresistens, f.eks. I

DK 175483 B1 49 pCGA28. I pCGA25c er sekvenserne, som koder for hygromycin B-resistens, placeret således, at de i Escherichia coli transskriberes fra Tn5 promotoren (som i transposon Tn5 5 transskriberer kanamycinresistensgenet). En 2,5 ml kultur af Luria-væske (LB) indeholdende 40 mg/ml hygromycin B inokuleres således med 0,05 ml af en mættet kultur af Eschericia coli DHl-bakterier (har stået natten over dyrket under 50 mg/1 ampicillinselektion) når efter 10 dyrkning i 3 timer under beluftning ved 37°C en mindst 10 gange større bakterietæthed, end når bakterier med plasmider, som ikke indeholder et hygromycingen, funktionelt i Escherichia coli, såsom pCGA25d, pCGA28 eller pAT153 [A. J. Twigg et al., Nature 283, 216-218 15 (1980) ], testes. Funktionaliteten af hygromycin B-resi- stensgenet i såvel dyrevævsceller som i Escherichia coli letter i høj grad anvendelsen af plasmid pCGA25c og dets derivater. Plasmid pCGA42 konstrueres derpå ved at indsætte BamHI-fragmentet fra pCGA28 indeholdende MCMV/t-20 PA/Ø-globinkassetten i pCGA25C. Det overfører t-PA-eks- pressionsgen til celler, som ikke kan transformeres til geneticinresistens, eller som allerede er geneticinresi-stente. Endvidere kan pCGA42 udtrykke hygromycingenet i Escherichia coli, hvilket gør det muligt at dyrke 25 Escherichia coli DH1 indeholdende pCGA28 til tætheder, som er mindst 10 gange større end f.eks. pCGA28-holdig Escherichia coli, når der foretages testning som beskrevet ovenfor.

Plasmid pCGA28 indeholder to Sacl-steder, hvor det ene 30 oprindeligt er en del af en linker netop efter MCMV-promo-toren, og det andet i t-PA-cDNA’et. Sekvensen mellem Sacl-stederne slettes ved først at skære med restriktionsenzymet, rense det store fragment ved hjælp af en agarose-gel og cirkularisere det lineære DNA under anvendelse af 35 T4 DNA-ligase til dannelse af plasmid pCGA44 (se fig.

12).

I DK 175483 B1 I

I 50 I

I Alt cDNA klonet i den rigtige orientering i det nu entydi- I

ge Sacl-sted i pCGA44 erstatter effektivt t-PA-kodnings- I

I sekvensen i pCGA28 og udtrykkes effektivt. I

I 5 pCGA42d er afledt af pCGA42 ved sletning af 1,4 kb-SacI- I

I fragmentet (se fig. 13). I det nu entydige Sacl-sted kan I

I der indsættes cDNA'er, som er forskellige fra t-PA-cDNA, I

I og udtrykkes i høje koncentrationer i vævskulturceller. I

I Eksempel 5 I

I 10 Indsætning af u-PA-, t-PA- og hybrid-PA-cDNA1er i I

I ekspressionsvektor pCGA28 I

I A) Indsætning af t-PA-cDNA (se fig. 15) I

I Med denne konstruktion indsættes t-PA-cDNA-fragmentet fra I

I plasmid ph.tPAAScal i pCGA28. Denne konstruktion menes at I

I 15 være nødvendig for at virke som en kontrol på eventuelle I

I ændringer, som utilsigtet kunne opstå under restrukture- I

I ringen af Scal-stedet. 1,4 kb SacI-fragmentet udvindes fra I

I plasmid ph.tPAAScal efter spaltning med SacI. Ekspres- I

I sionsvektoren pCGA28 skæres også med SacI, og 8,2 kb I

I 20 vektorfragmentet isoleres og dephosphoryleres i en 100 μΐ I

I reaktionsblanding indeholdende 0,1 mM Tris, pH 8,0, 0,1% I

I SDS og 0,02 enh. bakteriel alkalisk phosphatase. Efter I

I inkubering ved 60*0 i 30 minutter ekstraheres reaktions- I

I blandingen to gange med phenol og ether, hvorpå der fældes I

25 med ethanol. Pelletten opløses i vand, og en alikvot af I

opløsningen anvendes til ligering til 1,4 kb Sacl-fragmen- I

tet fra ph.tPAAScal. Ligeringsblandingen anvendes til at I

transformere Escherichia coli HB101, og minilysat-DNA I

fremstillet fra ampicillinresistente kolonier spaltes med I

30 passende restriktionsenzymer for at bekræfte, om SacI- I

insertet har den ønskede orientering. Plasmidet med den I

ønskede orientering betegnes pBRIA. Plasmidet med SacI- I

fragmentet med den modsatte orientering betegnes pBRIB. I

51 I

DK 175483 B1 I

B) Indsætning af hybrld-UPAATPAB-cDNA (se fig. 16) I

Ved denne konstruktion indsættes hybrid UPAATPAB-cDNA- I

fragmentet fra plasmid pUNC.tc i ekspressionsvektoren I

5 pCGA28. pUNC.tc-DNA spaltes med Smal (se fig. 7), 1,24 kb- I

fragmentet isoleres og ligeres til Sacl-spaltet, I

dephosphoryleret 8,2 kb pCGA28-vektor-DNA. Escherichia I

coli HBlOl-celler transformeres med ligeringsblandingen, I

og kolonier indeholdende Sacl-insertet i den ønskede I

10 orientering identificeres ved hjælp af restriktions- I

spaltninger på minilysat-DNA. PIasmidet med pUNC.tc-DNA- I

insertet i den ønskede orientering betegnes pBR2A, og I

plasmidet med den modsatte orientering pBR2B. I

C) Indsætning af u—PA-cDNA (se fig. 17) I

I 15 Ved denne konstruktion indsættes human-u-PA-cDNA i eks- I

I pressionsvektoren pCGA28, og sammen med pBRl tjener dette I

I plasmid som moderplasmidkontrol og bekræfter nyttigheden I

I af vektorerne af pCGA28-typen. Plasmid pcUK176 spaltes med I

I Smal, Ahalil (se fig. 4), 2,25 kb-fragmentet isoleres og I

I 20 ligeres til phosphoryleret Sad-linker som beskrevet oven- I

I for. Efter spaltning med SacI udvindes 2,25 kb-fragmentet, I

I som ligeres til Sacl-spaltet, dephosphoryleret 8,2 kb I

I pCGA28-DNA-fragment. Escherichia coli HB101 transformeres, I

I og kolonier indeholdende det ønskede plasmid identificeres I

I 25 ved spaltning af minilysat-DNA med restriktionsenzymer. I

I Plasmidet med det humane u-PA-DNA i den rigtige oriente- I ring betegnes pBR23A, og plasmidet med den modsatte orien- I tering pBR3B.

I D) Indsætning af hybrid-TPAAUPAB-cDNA (fig. 18) I 30 Hybrid-TPAAUPAB-cDNA'et fra plasmid ptNC.UC indsættes i I ekspressionsvektoren pCGA28. 2,75 kb Smal (findes i I vektoren), Ahalll-fragmentet isoleres fra ptNC.UC-DNA'et, I ligeres til phosphoryleret Sacl-linker, det I linkerligerede I DK 175483 B1

I 52 I

I 2,75 kb-fragment udvindes og ligeres til Sacl-spaltet, I

I dephosphoryleret vektor-DNA, og de ønskede kolonier iden- I

I ficeres som beskrevet ovenfor. Plasmidet med ptNC.UC-DNA- I

I 5 insertet i den korrekte orientering betegnes pBR4A. I

I Eksempel 6 I

I Konstruktion af en gærekspressionsvektor, som indeholder I

I PH05-promotoren, invertaseslgnalsekvensen og t-PA-kod- I

I ningsområdet I

I 10 A) Syntese af oliqodec^yribonucleotider til invertase- I

I signalsekvens I

I Fire oligodeoxyribonucleotider,1-1, 1-2, 1-3 og 1-4, syn- I

I tetiseres ved hjælp af et DNA-syntetiseringsapparatur I

I (model 380B Applied Biosystems). Efter afblokering renses I

I 15 de syntetiske fragmenter på en 12% polyacrylamidgel I

I indeholdende 8 M urinstof. Saltfrie, rene oligodeoxyribo- I

I nucleotider fås ved anvendelse af Sep. Pak (Waters I

I Associates). Disse fragmenter udgør en duplex, som koder I

I for invertasesignalsekvensen med de ofte anvendte gær- I

I 20 kodoner. I

I Hlndlll I

I EcoRI MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu I

I 1-1 5'AATTCATGCXTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3' I

I 1-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5’ I

I AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla I

I 1-3 5‘GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3' I

I 1-4 3'CAAAACGTCGGTTTIATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5' I

I Hgal_ I Xhol DK 175483 B1 53 B) Underkloning af invertaseslqnalsekvensen 1 plasmid p31 a) Fremstil liner af vektor 1,5 μg p31R/SS-TPAA2 (europæisk patentansøgning nr.

5 143.081) spaltes med 10 enh. EcoRI (Boehringer) i 50 μΐ 10

mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM

mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter tilsætning af 1 μΐ 2,5 M NaCl tilsættes 10 enh. Xhol (Boehringer), og der inkuberes ved 37eC i 1 time. 4,2 kb vektoren isoleres på 10 en 0,8% præparativ agarosegel. Gelskiven overføres til et Micro Colloidor-rør (Sartorius GmbH), dækkes med 200 μΐ TE og elektroelueres (elektroforesebehandles ved 90 mA i 50 minutter). TE-0pløsningen opsamles, og der fældes i 2,5 rumfang absolut ethanol efter tilsætning af 0,1 rumfang 15 10 x TNE. DNA-Pelletten vaskes med koldt 80%'s ethanol og tørres i vakuum. DNA'et resuspenderes i 6 μΐ TE (40 pmol/fil).

b) Annellering af oligodeoxyribonucleotider (1-1, 1-2, 1-3 og 1-4), kinasebehandling og ligering med vektor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

En opløsning indeholdende 10 pmol i hver af de fire 2 deoxyribonucleotider i 10' pi 0,5 M Tris.HCl pH 8 3 inkuberes ved 95°C i 5 minutter på et vandbad. Vandbadet 4 afkøles til 30eC over et tidsrum på 5 timer. Til denne 5

annellerede blanding sættes 2 μΐ af henholdsvis 0,1 M

6

MgCl2, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP og 8 enh. (1 μΐ) 7 polynucleotidkinase (Boehringer). Kinasebehandlingen 8 gennemføres ved 37"C i 1 time. De annellerede, 9 kinasebehandl ede oligodeoxyribonucleotider og 60 pmol 10 p31R/SS-TPAA2-skåret vektor (1,5 μΐ) ligeres med 400 enh.

11 (1 fil) T4-DNA-ligase (Biolabs) ved 14eC i 17 timer.

Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter.

10 fil af denne ligeringsblanding anvendes til transformation af Escherichia coli HB101 Ca++-celler, jf. M. Dagert i og S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979). 20 ampR-Kolonier

I DK 175483 B1 I

I 54 j

I udtages. DNA fremstilles ved anvendelse af hurtigisole- I

I ringsmetoden, jf. D.S. Holmes og M. Quigley, Anal. I

I Biochem. 114, 193-197 (1981). DNA spaltes med EcoRI og I

I 5 Xhol, mærkes radioaktivt ved EcoRI-enden og analyseres på I

I en 6%' s polyacrylamidgel indeholdende 8 M urinstof under I

I anvendelse af radioaktivt mærket pBR322 Haelll-skåret DNA I

I som markør. Bånd med den korrekte størrelse iagttages for I

I DNA opnået for alle de 20 kloner. En klon dyrkes i 100 ml I

I 10 LB-medium indeholdende 100 μg/τ&l ampicillin. Plasmid DNA I

I isoleres og betegnes som p31RIT-12. I

I C) Konstruktion af pJBD207/PH05-I-TPA (se fig. 19) I

I a) Fremstilling af vektor I

I 3 /tg pJDB207/PH05-TPA18 (europæisk patentansøgning nr. I

I 15 143.081) inkuberes ved 37°C i 1 time med 10 enh. BamHI i I

I 50 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM I

I mercaptoethanol. En alikvot kontrolleres på en 1%’ s I

I agarosegel i TBE-puffer til bekræftelse af fuldstændig I

I spaltning. Spaltningsblandingen inkuberes ved 65®C i 10 I

I 20 minutter. Derpå tilsættes 0,5 μΐ 5 M NaCl efterfulgt af 15 I

enh. Xhol (Boehringer). Denne blanding inkuberes ved 37'C I

i 1 time. 6,8 kb-vektoren isoleres på en 0,8%'s I

præparativ agarosegel. DNA’et ekstraheres ved I

elektroeluering, og efter fældning opløses det i TE. I

25 b) Xhol-spaltning af p31/PH05-TPA18 I

30 μg p31/PH05-TPA18 (europæisk patentansøgning nr. I

143.081) inkuberes ved 37”C i 1 time med 60 enh. Xhol (15 I

enh./μΐ) i 200 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM I

NaCl,6 mM mercaptoethanol, ekstraheres med et lige så I

30 stort rumfang phenol-chloroform, hvorpå der fældes i I

ethanol. I

DK 175483 B1 55 c) Partiel PstI-spaltning af Xhol-skåret p31/PH05-TPA18

Det fældede Xhol-skåme p31/PH05-TPA18-DNA resuspenderes i 250 /il 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM 5 mercaptoethanol, 2,5 mg ethidiumbromid, blandingen inkuberes ved 37*C i 35 minutter med 22,5 enh. PstI og ekstraheres med et lige så stort rumfang phenol og derpå med et lige så stort rumfang chloroform-isoamylalkohol (50:1). 1,6 kb-fragmentet isoleres på en 1% præparativ 10 agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering og fældning (insert 1).

d) Sall-Xhol-Spaltning af p31RIT-12 30 μg p31RIT-12 inkuberes ved 37“C i 1 time med 60 enh.

Sall (Boehringer 12 enh.//il) og 60 enh. XhoX (15 enh.//il) 15 i 200 /il 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol, ekstraheres med et lige så stort rumfang phenol-chloroform, hvorpå der fældes i ethanol.

869 bp fragmentet isoleres på en 1,2% præparativ agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering, 20 afsaltes over DE-52 og fældes i ethanol.

e) Hgal-Spaltning af Sall-Xhol-skåret p3lRIT-12

Sall-Xhol-skåret p31RIT-12 resuspenderes i 100 /il 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM dithio-threitol, 10 mg bovint serumalbumin, og blandingen 25 inkuberes ved 37eC i 1 time med 6 enh. Hgal (Biolabs, 0,5 enh.//il). 600 bp-fragmentet isoleres på en 1,2% agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering og fældes i ethanol.

f) Annellering af linker-oligonucleotider 30 90 pmol af to oligodeoxyribonucleotider med sekvenserne

I DK 175483 B1 I

I 56 I

I Hgal PstI I

5' CIGCATCTTACCAAGTGATCTGCA 3' I

I 3'AGAATGGTTCACTAG 5' I

I suspenderes i 10 /il 0,5 mM Tris.HCl pH 8 i et silikone- I

behandlet Eppendorf-rør. Opløsningen inkuberes ved 95eC i I

I 55 minutter, hvorpå den langsomt afkøles til stuetemperatur I

I natten over. I

g) Kinasebehandling af linker I

I Til den ovenfor fremstillede opløsning sættes 2μ1 0,1 Μ I

I KC1, 2 (ti 0,1 M MgCl2/ 3 μΐ 30 mM DTT, 1 μΐ 200 mM ATP, 8 I

I 10 enh. polynucleotid (8 enh./μΐ). Blandingen inkuberes ved I

I 37°C i 1 time. I

h) Ligering af Hgal-fragmentet fra p31RIT-12 med den I

kinasebehandlede linker I

I Den kinasebehandlede linkeropløsning overføres til et rør, I

I 15 som indeholder det tørre Hgal-fragment, hvorpå der I

I tilsættes 400 enh. T4 DNA-ligase. Opløsningen inkuberes I

I ved stuetemperatur (21-22*0). i 90 minutter, fortyndes til I

I 100 μΐ med TB og ekstraheres med et lige så stort rumfang I

I phenol-chloroform. Fragmentet fældes ved at sætte 0,6 I

I 20 rumfang isopropanol og 0,1 rumfang 3 M natriumacetat til I

den vandige opløsning ved stuetemperatur. I

i) BamHI-Pstl-Spaltning af det ovenfor fremstillede DNA I

Det ovenfor fremstillede tørre DNA spaltes med 10 enh. I

BamHI og 10 enh. PstI i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 100 I

25 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37°C. Efter I

fortynding til 100 /il ekstraheres opløsningen med et lige I

så stort rumfang phenol-chloroform, og det vandige lag I

fældes med isopropanol (insert 2). I

DK 175483 B1 57 j) Ligering af de tre fragmenter

100 fmol pJDB207/PHO5-TPA18 BamHI-Xhol-skåret vektorfragment og 200 fmol af hvert af de andre to insert fragment er 5 (1 og 2) ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM

MgCl2/ 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 enh.

T4 DNA-ligase i 16 timer ved 15°C. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter. 5 μΐ af denne ligeringsblanding anvendes til transformation af 10 Escherichia coli HB101 Ca++-celler. 10 amp^-kolonier udtages, og DNA fremstilles ved.anvendelse af hurtigisoleringsmetoden. Ved analyse med EcoRI, PstI og BamHI-HindiII iagttages fragmenter med den korrekte størrelse. En klon dyrkes i 100 ml LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicil-15 lin. Plasmid DNA isoleres og betegnes pJDB207/PH05-I-TPA.

Eksempel 7

Konstruktion af plasmid pCS16/UPA indeholdende u-PA-kodningsområdet A) Konstruktion af plasmid pCS16 (se fig. 20) 20 Et 1,5 kb Pstl-BamHI-f ragment plasmid pUNl21, jf. B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983) indeholdende cl-genet fra fag-X og en del af tetracyclin-resistensgenet klones i pUC18, jf. J. Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983), skæres med Pstl og BamHI. Den 25 dannede klon spaltes med Pstl. De udragende 3'-ender fjernes ved reaktion med T4 DNA-polymerase, og Xhol-linkere ligeres til de korte ender. Efter spaltning med Xhol recirkulariseres molekylet ved ligering. En alikvot af ligeringsblandingen anvendes til at transformere Ca++-30 behandlede Escherichia coli HBlOl-celler. DNA'et fra enkelte ampicillinresistente, transformerede kolonier analyseres. En af flere korrekte kloner vælges og betegnes PCS16.

I DK 175483 B1 I

I 58 i

I B) Konstruktion af plasmid pCS16/UPA (se fig. 21) I

I Urokinase-cDNA'et som er indeholdt i plasmid pcUK176 (se I

I eksempel 2) underklones i plasmid pCS16. Det underklonede I

I 5 cDNA rækker fra Smal-stedet i det 51-ikketranslaterede I

I område (fig. 4) til PvuII-stedet ved nucleotidpositionerne I

I 1439-1444 i det 3'-ikketranslaterede område (nummerering I

I ifølge fig. 3). I

I 15 μg plasmid pcUK176 spaltes med PvuII. 379 bp PvuII- I

I 10 fragmentet isoleres fra . andre fragmenter på en 1,5%'s I

I agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. DNA'et elek- I

I troelueres, renses ved hjælp af DE 52 (Whatman)-ionbytter- I

I kromatografi og fældes med ethanol. 1,2 μg enkeltstrengede I

I Xhol-linkere (5'-CCTCGAGG-3*) phosphoryleres ved 5'-en- I

I 15 derne, opvarmes i 10 minutter til 75DC, selvannelleres ved I

I afkøling til stuetemperatur og opbevares ved -20eC. 0,9 /tg I

I af de kinasebehandlede, dobbeltstrengede Xhol-linkere I

I ligeres ved et 80-dobbelt molært overskud til de korte I

I ender af 379 bp PvuII-fragmentet af pcUK176 (se ovenfor) i I

I 20 20 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM I

I ATP og 400 enh. T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 16 I

I timer. Blandingen opvarmes i 10 minutter til 85eC. I

I Overskud af linkermolekyler fjernes ved fældning med 0,54 I

I rumfang isopropanol i nærværelse af 10 mM EDTA og 300 mM I

I 25 natriumacetat pH 6,0 i 30 minutter ved stuetemperatur. I

I DNA'et spaltes med Xhol og BamHI. Et 121 bp BamHI-Xhol- I

I fragment isoleres på en 1,5%'s agarosegel i Tris-borat- I

I EDTA-puffer pH 8,3. 6 μg plasmid pcUK176 spaltes med Smal I

I og BamHI. Et 1,3 kb Smal-BamHI-fragment indeholdende stør- I

I 30 steparten af u-PA-kodningssekvensen isoleres. 6 μg plasmid I

I pCS16 spaltes med Smal og Xhol. 2,7 kb vektorfragmentet I

I isoleres. DNA-fragmenterne elektroelueres fra gelen og I

I fældes med ethanol. 0,2 pmol af 1,3 kb Smal-BamHI-frag- I

I mentet, 0,2 pmol af 121 bp BamHI-Xhol - fragmentet (de to I

I 35 fragmenter tilsammen omfatter den fuldstændige u-PA-kod- I

I ningssekvens) og 0,1 pmol af 2,7 kb vektorfragmentet lige- I

59 I

DK 175483 B1

res i 10 μΐ 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, I

3,5 mM ATP og 400 enh. T4 DNA-ligase ved 15°C. 1 og 3 μΐ I

alikvoter af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ Ca++- I

5 behandlede Escherichia coli HBlOl-celler. Transformeringen I

gennemføres som beskrevet af A. Hinnen et al., Proc. Natl. I

Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978). 12 ampicillinresistente I

kolonier dyrkes i LB-medium indeholdende 100 mg/1 ampicil- I

lin. DNA isoleres i overensstemmelse med fremgangsmåden I

10 ifølge Holmens et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981) og I

I analyseres ved restriktionsspaltninger med EcoRI, PvuII og I

I Xhol. En klon med de forventede restriktionsfragmenter I

I betegnes som pCS16/UPA. I

I Eksempel 8 I

I 15 Konstruktion af plasmid pJDB207/PHO5-I-UPA (fig. 22) I

I pJDB207/PH05-I-UPA indeholder PH05-promotoren, invertase- I

I signalsekvensen, kodningssekvensen for rooden urokinase og I

I PH05-transskriptionsterminatoren i et tandemarrangement I

I klonet i pJDB207-gærekspréssionsvektoren. I

I 20 20 μg plasmid pCS16/UPA spaltes fuldstændigt med 40 enh. I

I EcoRI. Efter phenolekstraktion og fældning med ethanol I

I skæres det EcoRI-spaltede DNA yderligere med Tagl ved I

I 65°C. De dannede fragmenter adskilles på en præparativ I 1,2%'s agarosegel. 462 bp Taql-EcoRI-fragmentet isoleres I 25 ved elektroeluering fra gelen og fældes med ethanol.

I En oligodeoxyribonucleotidlinker med formlen I (I) 5'-CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3' I (II) 3'- TCGTIACTTGAAGTAGrTCAAGGTAGC-51 ligeres til Taql-stedet i DNA-fragmentet. Linkeren gendan- I 30 ner 5’-enderne i kodningssekvensen i modent u-PA (nucleo- I DK 175483 B1 60 i

I tider 130-154, se fig. 3) og tilvejebringer strukturfunk- I

I tionen til invertasesignalsekvensen. 5'-CTGCA-Sekvensen af I

I linkeren udfylder de tilsvarende skrå 3'-ender i inverta- I

5 sesignalsekvehsen dannet ved spaltning af Hgal. I

I 300 pmol af hver af oligodeoxynucleotiderne I og II phos- I

I phoryleres og annelleres. 5,25 μς (600 pmol) phosphoryle- I

I ret, dobbeltstrenget linker-DNA ligeres til 1,7 μς (5,6 I

I pmol) af 462 bp Taql-EcoRI-fragmentet (se ovenfor) i 175 I

I 10 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT I

I og 800 enh. T4 DNA-ligase ved 15eC i 16 timer. T4-DNA- I

I ligase inaktiveres ved opvarmning i 10 minutter til 85°C. I

I Overskud af linkere fjernes ved fældning i nærværelse af I

I 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang I

I 15 isopropanol. DNA'et spaltes med Pstl. Et entydigt 312 bp I

I fragment isoleres indeholdende linkeren knyttet til DNA- I

I sekvenserne, som koder for u-PA op til nucleotid 436 I

I (Pstl-sted, se fig. 3). DNA-fragmentet renses ved elektro- I

I eluering og fældning med ethanol. I

I 20 Plasmid pCS16/UPA spaltes med Xhol og Pstl. Et 1007 bp I

I Pstl-Xhol-fragment isoleres og renses. Dette fragment I

indeholder størsteparten af kodningssekvensen for I

urokinase. I

Plasmid p31RIT-12 (se eksempel 6B) spaltes med Sall og I

25 Xhol. Et 882 bp Sal I-Xhol-fragment isoleres fra gelen ved I

élektroeluering og ethanpifældning. Fragmentet spaltes I

yderligere med BamHI og Hgal. Der isoleres et 591 bp I

BamHI-Hgal-fragment, som indeholder PH05-promotorområdet I

og invertasesignalsekvensen. I 1

Plasmid pJDB207/PH05-TPA18 (se europæisk patentansøgning I

tir. 143.081) spaltes med BamHI og Xhol. 6,8 kb vektor- I

fragmentet isoleres på en præparativ 0,6%'s agarosegel i I

Tris-acetatpuffer pH 8,2. DNA'et elektroelueres og fældes I

med ethanol. I

DK 175483 B1 61

Alle DNA-fragmenter resuspenderes i vand ved en koncentration på 0,1 pmol/ftl. 0,2 pinol af 591 bp BaraHI-Hgal-frag-mentet, 0,2 pmol af 312 bp Hgal-Pstl-fragmentet, 0,2 pmol 5 af 1007 bp Pstl-Xhol-fragmentet og 0,1 pmol af 6,8 kb

BamHI-Xhol-vektorfragmentet ligeres i 15 timer ved 15*C i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enh. T4 DNA-ligase. 1 μΐ af ligeringsblandingen anvendes til transformering af Escherichia coli HB101 10 Ca++-celler. 12 ampR-kolonier udtages og dyrkes i LB- medium indeholdende 100 mg/1 ampicillin. DNA fremstilles ved hurtigisoleringsmetoden, jf. D.S. Holmes et al.. Anal. Biochem. 114, 193 (1981). Ved restriktionsspaltninger af plasmid DNA'et med Hindlll og EcoRI konstateres de for-I 15 ventede restriktionsfragmenter. Plasmid DNA fra en enkelt I klon udvælges og betegnes pJDB207/PH05-I-UPA.

I Eksempel 9 I En t-PA/u-PA-hybridplasrainogenaktivator med t-PA-A-kæde- I områderne og u-PA-B-kæde (primær DNA-konstruktion) I 20 En anden metode til konstruktionen af en struktur fusion af I DNA-sekvenser, som koder for A-kæden i t-PA og B-kæden i I u-PA, i en forudbestemt position består af to trin: Først I ligeres hensigtsmæssige restriktionsfragmenter med kod- I ningssekvenserne. DNA fremstilles i Escherichia coli og I 25 underklones i M13 til dannelse af enkeltstrengede templa- I ter. I et andet trin fjernes overskud af nucleotidsekven- I ser ved in vitro mutagenese. Det nøjagtige strukturforbin- I delsessted mellem t-PA-A-kæden og u-PA-B-kæden er ved I aktiveringsstedet. Mutant-DNA1et underklones i en egnet I 30 ekspressionsvektor for gær og pattedyrcellelinier.

I a) Isolering af et DNA-fragment, som koder for t-PA-A- I kæden 10 ftg plasmid pJDB207/PH05-I-TPA (se eksempel 6) spaltes I DK 175483 B1 I 62

I med BamHI og PvuII. 1,7 kb BamHI-PvuII-fragmentet isoleres I

på en 0,8%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. I

I DNA-fragmentet indeholder PH05-promotoren, invertasesig- I

I 5 nalsekvensen og kodningssekvensen for modent t-PA op til I

I PvuII-restriktionsstedet (se fig. 1, nucleotidpositioner I

I 1305-1310). DNA'et elektroelueres, fældes med ethanol og I

I resuspenderes i vand i en koncentration på 0,1 pmol//tl. I

I b) Isolering af et DNA-fragment, som koder for u-PA-B- I

I 10 kæden I

I Plasmid pCS16/UPA (se eksempel 7B) spaltes med Ball (se I

I fig. 3 og 4, nucleotidpositioner 573-578) og Xhol. 868 bp I

I BalI-Xhol-fragmentet isoleres som beskrevet ovenfor og I

I resuspenderes i vand ved en koncentration på 0,1 pmol//ti. I

I 15 c) Ligering af fragmenter til vektorfragment I

I Plasmid pJDB207/PH05-TPA18 (europæisk patentansøgning nr. I

I 143.081) spaltes med BamHI og Xhol. 6,7 kb vektorfragmen- I

tet isoleres på en 0,8%'s agarosegel i Tris-acetat-puffer I

I pH 8,2. DNA'et elektroelueres, fældes med ethanol og I

I 20 resuspenderes i vand ved en koncentration på 0,1 pmol//tl. I

I 0,2 pmol af 1,7 kb BamHI-PvuII-fragmentet, 0,2 pmol af 868 I

I bp Ball-XhoI-fragmentet og 0,1 pmol af 6,7 kb BamHI-Xhol- I

I vektorfragmentet ligeres i 10 /ti 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 I

mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 400 enh. T4 DNA-ligase I

I 25 (Biolabs) ved 15°C i 16 timer. Alikvoter på 1 /ti og 3 /ti I

I af ligeringsblandingen sættes til 100 /ti Ca++-behandlede I

Escherichia coli HBlOl-celler. Transformationen gennemfø- I

I res på sædvanlig måde. I 1

6 transformerede, ampicillinresistente kolonier dyrkes i I

I 30 LB-medium indeholdende 100 mg/1 ampicillin. Plasmid DNA I

I fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge I

I Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193 (1981) og analy- I

DK 175483 B1 63 seres ved restriktionsspaltninger med BamHl og Pstl. En klon med de forventede restriktionsfragmenter betegnes pJDB207/PH05-I-TPAAUPAB.

5 Eksempel 10

En u-PA/t-PA-hybridplasminoqenaktivator med u-PA-A-kæde-områdeme og t-PA-B-kæden (primær DNA-konstruktion)

Den primære hybrid-DNA-konstruktion omfatter u-PA-nucleo-tidsekvenserne fra Smal-stedet til EcoRI-stedet (se fig.

10 4) knyttet til t-PA-nucleotidsekvenserne fra Scal-stedet (positioner 940-945) til Xhol-stedet indført ved position 1800 via en Xhol-linker. Den dannede hybrid-DNA-sekvens indeholder overskud af nucleotider, som fjernes ved in vitro-mutagenese. Det nøjagtige strukturforbindelsespunkt 15 mellem u-PA-A-kæden og t-PA-B-kæden er ved aktiveringsstedet.

a) Isolering af et DNA-fragment, som koder for u-PA-A-kæden 7 μg plasmid pCS16/UPA spaltes med EcoRI. De klæbrige 20 ender af de dannede tre fragmenter omdannes til korte ender ved en udfyldningsreaktion med 7,5 enh, Klenow-DNA-polymerase (BRL) i nærværelse af 60 mM Tris.HCi pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM dATP og 0,1 mM dTTP i 30 minutter ved 25*C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 25 EDTA til en s lutkoncentration på 12,5 mM. DNA' et spaltes yderligere med KpnI. Et 619 bp KpnI-kortendet [ EcoRI ]-fragment isoleres på en 1,5%’s agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3, elektroelueres og fældes med ethanol.

b) Isolering af et DNA-fraqment, som koder for t-PA-B-30 kæden 6 μς plasmid pJDB207/PH05-TPAl8 spaltes med Seal og Xhol.

Et 860 bp fragment isoleres på en 1,2%’s agarosegel i

I DK 175483 B1 I

I 64 I

Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3, elektroelueres og fældes I

I med ethanol. I

I c) Llgerlng af DNA-fragmenterne til en pUC18-afledt I

I 5 vektor I

I 5 /ig plasmid pCS16/UPA (se eksempel 7) spaltes med Kpnl og I

I Xhol. Det dannede 2,7 kb fragment isoleres på en 0,8%'s I

I agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. DNA*et elek- I

I troelueres og fældes med ethanol. Alle DNA-fragmenterne I

I 10 resuspenderes i vand ved en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. I

I 0,2 pmOl af det 619 bp Kpn-kortendede u-PA-fragment, 0,2 I

I pmol af 860 bp Scal-Xhol-t-PA-fragmentet og 0,1 pmol af I

I 2,7 kb Kpnl-Xhol-vektorfragmentet ligeres som beskrevet I

I ovenfor (eksempel 9). Ca++-behandlede Escherichia coli I

I 15 HBlOl-celler transformeres. 12 transformerede, ampicillin- I

I resistente kolonier dyrkes i LB-medium tilsat ampicillin I

I (100 mg/1). DNA fremstilles under anvendelse af den I

I ovenfor beskrevne fremgangsmåde ifølge Holmes et al. og I

I analyseres ved restriktionsspaltninger med EcoRI og Pstl. I

I 20 En enkelt klon med de forventede restriktionsfragmenter I

I betegnes pCS16/UPAATPAB. I

Eksempel 11 I

En u-PA/t-PA-hybridplasminogenaktivator med den anden I

kringle og den katalytiske B-kade fra t-PA (primær kon- I

25 struktion) I

Et hybridplasminogenaktivatorgen indeholdende DNA-sekven- I

serne for det urokinase "growth factor like" (U)-område, I

det andet kringleområde (K2) fra t-PA og den katalytiske I

B-kæde fra t-PA konstrueres på følgende måde: To I

30 DNA-restriktionsfragmenter, som koder for henholdsvis I

u-PA-vækstfaktorområdet og t-PA-K2~kringleområdet og I

B-kæden ligeres og indsættes i plasmid pCS16. Den dannede I

DK 175483 B1 €5 klon betegnes PCSI6/UK2TPA®. Et fragment indeholdende u-PA- og t-PA-kodningssekvenserne subklones i M13. Der gennemføres in vitro-mutagenese på enkeltstrenget DNA til 5 fjernelse af overskud af DNA-sekvenser ved forbindelsespunktet mellem u-PA- og t-PA-sekvenser.

5 μg plasmid pCS16/UPA spaltes med Ncol (nucleotidpositioner 326-331, se fig. 4). De klæbrige ender på restrik- . tionsfragmenteme udfyldes ved en reaktion med 5 enh.

10 Klenow-DKA-polymerase I (BRL) i nærværelse af 0,1 mM af

henholdsvis dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 60 mM Tris-HCl pH

7,5, 10 mM MgCl2 i 50 μΐ i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til en.slut-koncentration på 12,5 mM. DNA'et fældes med ethanol og 15 spaltes yderligere med Xhol. Det 3 kb Xhol-kortendede (Ncol)-fragment isoleres på en 0,8%'s agarosegel i

Tris-borat-EDTA pH 8,3, elektroelueres og fældes med ethanol. Dette fragment indeholder pCS16-vektoren og kodningssekvensen for u-PA-vækstf aktorområdet. 10 μg 20 plasmid pJDB207/PH05-TPA18 (europæisk patentansøgning nr. 143.081) spaltes med BstXI (nucleotidpositioner 577-588).

Det lineære DNA-fragment med udhængende 3'-ender inkuberes med 10 enh. T4 DNA-polymerase (BRL) i 100 /il 33 mM Tris-acetat pH 7,9, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magneslum-25 acetat, 0,5 mM DTT og 0,1 rog/ml bovint serumalbumin i 2,5 minutter ved 37eC. Derefter fortsættes inkuberingen i 35 minutter ved 37*C i nærværelse af 0,1 mM af henholdsvis dATP, dCTP, dTTP og dGTP i et samlet rumfang på 200 /il.

DNA*et fældes med éthanol og spaltes yderligere med Xhol.

30 Det 1,2 kb kortendede [ BstXI ]-XhoI-fragment isoleres på en 0,8%'s agarosegel, elektroelueres og fældes med ethanol.

Dette fragment indeholder kodningssekvensen for K2 og B-kæden fra t-PA: 0,2 pmol af 1,2 kb t-PA-fragmentet og 0,1 pmol af 3 kb 35 u-PA/vektorfragmentet (se ovenfor) ligeres som beskrevet. Alikvoter af ligeringsblandingen anvendes til at transfor-

I DK 175483 B1 I

I 66 I

I mere kompetente Escherichia coli HBlOl-celler. Ampicillin- I

I resistente kolonier selekteres på LB-agarplader indehol- I

dende 100 mg/1 ampicillin. DNA fremstilles fra individu- I

I 5 elle transformanter og analyseres ved hjælp af Seal- og I

I Smal-restriktionsspaltninger. En klon indeholdende 0,5 kb I

I Seal- og 1,55 kb Smal-forbindelsesfragmenteme selekteres I

I og betegnes PCSI6/UK2TPA®. I

Eksempel 12 I

I 10 En t-PA/u-PA-hybridplasmlnogenaktivator med den anden I

I kringle af t-PA og den katalytiske B-kæde af u-PA (primær I

I konstruktion) I

I Et hybridpiasminogenaktivatorgen indeholdende DNA-sekven- I

I serne for det urokinase "growth factor like" (U)-område, I

I 15 den anden kringle (K2) af t-PA og den katalytiske B-kæde I

I fra u-PA konstrueres under anvendelse af samme fremgangs- I

I måde som beskrevet i eksempel 11. I

I Konstruktion af plasmid pCS 16/UK?UPA** I

I 5 /tg plasmid pCS16/UPA spaltes med Bglll og Ncol (nueleo- I

I 20 tidpositioner henholdsvis 391-396 og 326-331, se fig. 4). I

I De klæbrige ender på restriktionsfragmenterne udfyldes ved I

en reaktion med Klenow DNA-polymerase 1 (BRL) som I

I beskrevet ovenfor. 4,2 kb DNA-fragmentet med korte ender I

I isoleres på en 0,8%'s agarosegel i Tris-acetat-puffer pH I

I 25 8,2. DNA'et elektroelueres og fældes med ethanol. Dette I

I fragment indeholder u-PA-G-området og u-PA-B-kæden forbun- I

I det til vektormolekylet. I

I 10 /tg plasmid p31/PH05-TPA18 (europæisk patentansøgning I

I nr. 143.081) spaltes med Alul. Et 447 bp Alul-fragment I

I 30 indeholdende hele K2-området af t-PA isoleres på en 1,5%' s I

I agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. DNA-fragmentet I

I elektroelueres og fældes med ethanol. I

DK 175483 B1 67 j 0,2 pmol af 447 bp-fragmentet og 0,1 pmol af 4,2 kb-frag-mentet ligeres. Alikvoter af ligeringsblandingen anvendes til transformering af kompetente Escherichia coli HB101-5 celler. Transformerede celler selekteres på LB-agarpiader med 100 mg/1 ampicillin. DNA fremstilles ud fra ampicil-linresistente celler og analyseres ved hjælp af EcoRI- og Scal-spaltninger. En enkelt klon med et 551 bp EcoRI-frag-ment og et 403 bp Scal-fragment har Alul-fragmentet indsat 10 i den korrekte orientering. Denne klon betegnes pCS16/UK2UPAB.

Eksempel 13

Kloning af primære hybrld-DNA-konstruktioner i M13mpl8 A) Kloning af et pJDB207/PH05-I-TPAAUPAB-BamHI-frag-15 ment i M13mpl8 1,5 μg pJDB207/PH05-I-TPA^UPAB (se eksempel 9) fremstillet fra en hurtig DNA-præparation spaltes med 9 enh. BamHI (Boehringer) i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol ved 37*C i 1 time. Efter 20 tilsætning af 1 μΐ RNase (Serva, 1 mg/ml), inkubering i 15 minutter ved 37eC og behandling med phenol isoleres 2,5 kb insertet på en 0,8%'S præparativ agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering, hvorpå det fældes.

1 jtg M13mpl8 (RF) skæres med BamHI, behandles med alkalisk 25 phosphatase fra kalvetarm, og 7,3 kb vektorfragmentet isoleres på en 0,7%'s præparativ agarosegel. DNA*et elektro-elueres og fældes. 1 pmol M13mpl8 BamHI-skåret vektor og 200 pmol af BamHI-TPAAUPAB-insertet ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 30 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 enh. T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15eC. Efter inkubering ved 65"C i 10 minutter anvendes 5 μΐ af denne

I DK 175483 B1 I

I 68 I

I ligeringsblanding til transformering af Escherichia coli I

I JM101 kompetente celler i overensstemmelse med håndbogen I

"M13 Cloning and sequencing handbook" udgivet af Amersham. I

I 5 Der udtages 36 farveløse plaque, og der fremstilles I

I enkeltstrenget DNA og DNA på replikativ form (RF). Ved I

I analyse af RF-DNA viser alle kloner inserter med den I

I korrekte størrelse efter spaltning med BamHI. Fragmenter I

I med korrekt størrelse efter spaltning med EcoRI og PstI I

10 indicerer, at DNA-inser terne i alle kloner er i den I

I forkerte orientering (enkeltstrenget tempiat-DNA er den I

ikke-kodende streng). En af disse kloner betegnes I

I mpl8/BamHI/TPAAUPAB og anvendes til sletningsmutagenese. I

I B. Kloning af et pCS16/UPAATPÅB-Kpnl-Hindlll-fragment i I

I 15 M13mpl8 I

I 1,5 μg pCS16/UPAATPAB (se eksempel 10) fremstillet ud fra I

I en hurtig DNA-præparation spaltes med 12 enh. Kpnl i 20 μΐ I

I 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol I

I ved 37eC i 1 time. Efter tilsætning af 1 μΐ 1 M NaCl, I

I 20 spaltes DNA med 12 enh. Hindi!! ved 37CC i 1 time. Der I

I isoleres et 1,5 kb fragment på en 0,8%'s præparativ I

I agaro- I

I segel. DNA*et ekstraheres ved elektroeluering, hvorpå det I

I fældes. I

I 25 0,5 μg M13mpl8 (RF) spaltes med KpnX og HindXIX. 7,3 kb I

I vektorfragmentet isoleres på en 0,7%s præparativ agarose- I

I gel. DNA1 et elektroelueres og fældes. I

100 fmol M13mpl8 KpnI-Hindlll-skåret vektor og 200 fmol I

I KpnI-Hindlll-insert ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, I

I 30 10 mM MgCl2^ 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 /tg gelatine med 400 I

I enh. T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15°C. Reaktionen afbrydes I

I ved inkubering ved 65®C i 10 minutter. 5 μΐ af denne I

I ligeringsblanding anvendes til transformation af I

I Escherichia coli JMlOl-kompetente celler. 10 farveløse I

I 35 plaque udtages, og der fremstilles enkeltstrenget DNA og I

DK 175483 B1 69 DNA på replikativ form (RF). Ved analyse af RF-DNA viser alle kloner inserter med korrekt størrelse og fragmenter med korrekt størrelse. En af disse kloner betegnes 5 mpl8/KpnI-HindIII/UPAATPAB og anvendes til sletningsmuta-genese.

C. Kloning af et pCS16/UK9TPAB-KpnI-HindllI-fragment i Ml3mpl8 1,5 /tg pCS16/UK2TPAB (se eksempel 11) fremstillet ved en 10 hurtig DNA-præparation spaltes med 12 enh. Kpnl (Boehringer) i 20 /il, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol ved 37®C i 1 time. Efter tilsætning af 1 /il 1 M NaCl spaltes DNA med 12 enh. Hindlll ved 37®C i 1 time. Et 1,5 kb-fragment isoleres på en 0,8%'s 15 præparativ agarosegel. DNA* et ekstraheres ved elektroeluering, hvorpå det fældes.

0,5 μg M13mpl8 (RF) spaltes med Kpnl og Hindlll. 7,3 kb vektorfragmentet isoleres på en 0,7%'s præparativ agarosegel. DNA*et élektroelueres, hvorpå det fældes. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 100 f mol Ml3mpl8 Kpnl-Hindi 11-skåret vektor og 200 f mol 2

Kpnl-HindiII-insert ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 3 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 /tg gelatine med 400 4 enh. T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15eC. Reaktionen afbrydes 5 ved inkubering ved 65®C i 10 minutter. 5 /il af denne 6 ligeringsblanding anvendes til transformering af 7

Escherichia coli JM10Inkompetente celler. 7 farveløse 8 plague udtages, og der fremstilles enkeltstrenget DNA og 9 DNA på replikativ form (RF). Ved analyse af RF-DNA viser 10 alle kloner inserter med korrekt størrelse og fragmen- 11 ter med korrekt størrelse. En af disse kloner betegnes mpl8/KpnI-HindIII/UK2TPAB og anvendes til sletningsmuta-genese.

I DK 175483 B1 I

I 70 I

I D. Kloning af et pCS16/UK9UPAB-KpnI-HindIII-fragment I

I i M13mpl8 I

I 1,5 μg pCSI6/UK2UPA® (se eksempel 12) fremstillet ved en I

I 5 hurtig DNA-præparation spaltes med 12 enh. Kpnl i 20 μ 1 10 I

I mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM merceptoethanol ved I

37eC i 1 time. Efter tilsætning af 1 μΐ 1 M NaCl spaltes I

I DNA'et med 12 enh. Hindlll ved 37SC i 1 time. Der isoleres I

I et 1,7 kb fragment på en 0,8%'s præparativ agarosegel. I

I 10 DNA'et ekstraheres ved elektroeluering, hvorpå det fældes. I

I 0,5 /ig M13mpl8 (RF) spaltes med Kpnl og Hindlll. 7,3 kb- I

I vektorfragmentet isoleres på en 0,7%'s præparativ agarose- I

I gel. DNA'et elektroelueres, hvorpå det fældes. I

I 100 fmol M13mpl8 Kpnl-Hindi 11-skåret vektor og 200 fmol I

I 15 Kpnl-Hindil I-insert ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH I

I 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med I

400 enh. T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15°C. Reaktionen I

I afbrydes ved inkubering ved 65‘C i 10 minutter. 5 μΐ af I

I denne ligeringsblanding anvendes til transformation af I

I 20 Escherichia coli JM101-kompetente celler. Der udtages 10 I

I farveløse plague, og der fremstilles enkeltstrenget DNA og I

I DNA på replikativ form (RF). Ved analyse af RF-DNA viser I

I alle kloner inserter med korrekt størrelse og fragmenter I

I med korrekt størrelse. En af disse kloner betegnes I

I 25 mpl8/KpnI- Hindlll/UK2UPAB og anvendes til I

I sletningsmutagenese. I

I Eksempel 14 I

I Sletningsmutagenese af primære hybrid-DNA-konstruktioner I

I A) Almen fremgangsmåde til sletningsmutagenese I

I 30 a) Phosphorylering af mutagenprimer I

I Til mut agenese phosphoryleres 200 pmol af mutagenprimeren I

DK 175483 B1 71 i 20 μΐ 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM spermidin, 0,1 mM EDTA Indeholdende 1 ni 10 dm ATP under anvendelse af 8 enh. T4 polynucleotidklnase 5 (Boehringer, 8 enh.//il). Efter inkubering ved 37°C i 1 time afbrydes reaktionen ved opvarmning til 65®C i 10 minutter.

Til hybridiseringsscreening phosphoryleres 20 pmol af mutagenprimeren som beskrevet ovenfor under anvendelse af 10 30 /iCi γ32ρ_Ατρ (3000 Ci/mmol, Amersham International) som den eneste kilde for ATP. Primeren fortyndes med 3,5 ml 6 x SSC og anvendes direkte som en probe.

b) Annellering af mutagenprimer og universel sekvenseringsprimer til enkeltstrenget tempiat 15 0,2 pmol enkel tstrenget templat inkuberes med 20 pmol phosphoryleret mutagenoligodexyribonucleotidprimer (10 pmol//il) og 10 pmol universal M13-sekvenseringsprimer i 10 μΐ 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT ved 95®C i 5 minutter. Opløsningen henstår til langsom 20 afkøling til stuetemperatur over et tidsrum på 30 minutter.

c) Forlængelses-ligeringsreaktion

Til den ovenfor annellerede blanding sættes 10 μΐ enzym-dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) opløsning indeholdende 1 /il 25 puffer [0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 0,1 M DTT], 4 μΐ 2,5 mM dNTP-bl ånding, 1 μΐ 10 mM ATP, 0,5 /il T4 DNA-ligase (Biolabs, 400 enh.//il), 0,67 /il Klenow DNA-polymerase (BRL, 2,99 enh.//il). Blandingen inkuberes ved 15eC i 1 time, hvorpå den inkuberes ved 8-9eC i 16 30 timer. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter.

I DK 175483 B1

I 72 I

I d) Transformation af ligeringsblanding I

I Ligeringsblandingen fortyndes i forholdet 1:20 og 1:200 I

I med TE, 1 /il og 5 /il af hver af disse fortyndede opløs- I

I 5 ninger anvendes til transformering af 0,2 ml af en såkaldt I

I "repair-minus"-stamme af Escherichia coli BMH 71-18mutS I

I [ BMH71-18(A(lac-proAB), thi, supE, F^laciQ, ΖΔΜ15, I

I proA+B+1 kompentente celler. Konstruktion af Escherichia I

I coli BMH71-18mutS (BMH71-18, mut S215::Tnio) er beskrevet I

I 10 af Kramer et al., Cell 38, 879-887 (1984). Efter I

I transfektion tilvejebringes såkaldte "lawn"-celler ved I

I hjælp af "repair-plus"-stamme af Escherichia coli JM101 I

I for at formindske udsættelsen af fagen for mutator I

I fænotypen af "repair-minus"-stammerne, jf. P. Carter, Η. I

I 15 Bedouelle og G. Winter, Nucl. Acids Res. 13, 4431-4443 I

I (1985). I

I e) Screening af fager I

I 100 plague fra den transficerede DNA overføres med en I

I tandstikker til YT-plader og opdyrkes som kolonier af I

I 20 inficerede bakterier i 15-18 timer. Koloniblotting I

I anvendes ifølge Grunstein og Hogness, Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 72, 3961-3965 (1985). Et nitrocellulosefilter I

I (Millipore S.A. kat. nr. HAWP 090, porestørrelse 0,45 μΐη) I

I anbringes på kolonipladen i 10 minutter ved stuetempera- I

25 tur. Filtrene denatureres med 0,5 N NaOH-opløsning, I

neutraliseres med 1 M Tris.HCl pH 7,5 og behandles derpå I

med en saltopløsning med høj koncentration (0,5 M Tris.HCl I

pH 7,5 + 1,5 M NaCl). Filtrene ovntørres i vakuum i 30 I

minutter ved 80eC, præhybridiseres i 100 ml 10 x I

30 Denhardt's opløsning (D.T. Denhardt, Biochem. Biophys. I

Res. Commun. 23, 641-646), 6 x SSC og 0,2% SDS i forsegle- I

lige plastposer i 15 minutter. I

Til hybridiseringsscreening vaskes præhybridiserede fil- I

tre i 50 ml 6 x SSC i 1 minut, hvorpå de hybridiseres i I

DK 175483 B1 73 3,5 ml probeholdig 32p_mæricet mutagenprimer 1 30 minutter. Hybridiserede filtre vaskes tre gange i 100 ml 6 x SSC ved stuetemperatur i i alt 2 minutter, hvorpå de autoradiogra-5 feres- Der opnås god forskel mellem vildtype- og mutantfager ved hjælp af en kortvarig vask (5 minutter) ved 60®C i 100 ml 0,1 x SSC + 0,1% SDS.

f) Bekræftelse på sletningsmutation i positive kloner opnået ved hybridisering 10 Fagerne fra de positive kloner overføres méd en tandstikker til 1 ml 2 x YT, opvarmes ved 70°C i 20 minutter for at dræbe bakterierne, hvorpå 100 μΐ af denne fagsuspension inokuleres i 1,5 ml frisk voksende Escherichia coli JMlOl-kultur (ODgQø ~ 0,45). Kulturerne rystes kraftigt 15 (300 o/m) ved 37eC i 4 timer. Fagstock og DNA på replikativ form fra de positive kloner fremstilles, jf. J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21-78 (1983). DNA fra mutanterne (efter sletningsmutagenese) analyseres med egnede restriktionsenzymer og sammenlignes med restrik-20 tionsfragmenterne fra vildtype DNA (før sletningsmutagenese). Efter bekræftelse ved restriktionsanalyse plaque-renses DNA fra en korrekt mutant. Mutationer verificeres yderligere ved restriktionsanalyse og sekvensering under anvendelse af kædeterminatormetoden, jf. F. Sanger, S.

25 Niclen og A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

B) Sletningsmutagenese på mp!8/BamHI/TPAAUPAB (se fig. 23)

Sletningsmutagenese gennemføres som beskrevet i

30 forbindelse med den almene fremgangsmåde. Positive kloner opnået ved hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse. 333 bp fjernes ved sletningsmutagenese fra BamHI-fragmentet. Restriktionsanalyse med BamHI bekræfter 2150 bp fragmentet. Yderligere restriktionsanalyse med EcoRX

I DK 175483 B1 I 74

I giver 660, 416, 287, 230 bp fragmenter på mutanterne i I

I stedet for 660, 472, 416 og 287 bp fragmenter, som findes I

i vildtypen. Analyse med PstI viser to fragmenter på 611 I

I 5 og 414 bp for mutanterne. Vildtype-DNA viser tre I

I fragmenter på 622, 611 og 414 bp. En mutant med den I

I korrekte struktur betegnes mpl8/BamHI/M0TPAAUPAB.

DNA-sekvensen ved forbindelsespunktet mellem t-PA-A-kæden I og u-PA-B-kæden bekræftes ved kædetermineringssekvense- I 10 ringsmetoden med en sekvenseringsprimer med sekvensen I 5'CAGAGCCCCCCCGGTGC3'.

I Denne primer er komplementær til den kodende streng af I u-PA (682-666).

I C) Sletningsmutagenese på mpl8/KpnI-HindIII/UPAATPAB

I 45 (se fig. 24)

Sletningsmutagenese gennemføres som beskrevet under den I almene fremgangsmåde. Positive kloner opnået ved I hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse med PstI.

I mutanterne konstateres et 467 bp bånd sammenlignet med H 20 vildtypen, som angiver et 544 bp fragment. En mutantklon I med den korrekte struktur betegnes mpl8/KpnI-HindIII/ I M0UPAATPAB. Sletningen bekræftes ved hjælp af kædetermi- natorsekvenseringsmetoden under anvendelse af en sekven- I seringsprimer med sekvensen 25 5' CAAAGATGGCAGCCTGC 3'.

Denne primer er komplementær til den kodende streng i t-PA (1062-1046).

D. Sletningsmutagenese på mpl8/KpnI-HindIII/UKoTPÅB (se flg. 25) 1

Der gennemføres sletningsmutagenese som beskrevet under DK 175483 B1 75 den almene fremgangsmåde. Positive kloner opnået ved hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse med KpnI-Hindlll, EcoRI og Pstl. De opnåede fragmenter er 5 KpnI-Hindlll EcoRI Pstl vildtypemutant vildtypemutant vildtypemutant 1475 bp 1284 bp 542 bp 351 bp 622 bp intet 622 472 bp 472 bp bp bånd

Inserter og fragmenter med korrekt størrelse konstateres 10 for mutanter. En mutantklon med den korrekte struktur betegnes mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2TPAB. Sletningen bekræftes ved hjælp af kæde-terminatorsekvenseringsmetoden under anvendelse af en sekvenseringsprimer med sekvensen 5' CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG 3' .

15 Denne primer er komplementær til den kodende streng i t-PA (853-821).

E) Sletningsmutagenesé på mpl8/KpnI-HindIII/UK?UPAB (se fig. 26)

To adskilte sletningsmutationer indgår i konstruktionen af 20 UK2UPAb: Først foretages sletningsmutagenese som beskrevet under den almene fremgangsmåde. Positive kloner opnået ved hybridisering bekræftes ved hjælp af restriktionsanalyse med EcoRI. I mutanterne konstateres 549 bp, 416 bp og 351 25 bp bånd sammenlignet med vildtypen, som giver 549 bp, 452 bp og 416 bp fragmenter. En mutantklon med den korrekte struktur betegnes mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2UPAB-l. Sletningen bekræftes ved hjælp af kæde-terminatorsekvenseringsmetoden under anvendelse af en sekvenseringsprimer med 30 sekvensen 5' CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

I DK 175483 B1 I

I 76 I

I Primeren er komplementær til den kodende streng i t-PA I

I (853-821). I

I 1 det andet trin i sletningsmutagenesen foretages en slet- I

5 ning samtidig med indføringen af en punktmutation. Slet- I

I ningsmutagenesen gennemføres som beskrevet ved den I

I almindelige fremgangsmåde. Positive kloner opnået ved I

hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse med EcoRI. I

I 1 mutanterne iagttages 416 bp, 351 bp og 259 bp bånd I

I ~ 10 sammenlignet med vildtypen, som giver 549 bp, 416 bp og I

I 351 bp fragmenter. En mutantklon med den korrekte struktur I

I betegnes mp18/KpnI-HindiII/MOUK2UPA0. Sletningen bekræftes I

I ved hjælp af kæde-terminatorsekvenseringsmetodeh under I

I anvendelse af en sekvenseringsprimer med sekvensen I

I 15 5' CAGAGCCCCCCCGGTGC 3'.

I Primeren er komplementær til den kodende streng i u-PA I

I (682-666).

I Eksempel 15 I

I Kloning af hybrid-t-PA/u-PA-cDNA-konstruktioner i gær- I

I 20 ekspressionsvektor pJDB207 I

I A) Kloning af TPAAUPAB-hybridgen i pJDB207 I

I RF-DNA fremstilles for mpl8/BamHI/M0TPAAUPAB ved hjælp af I

I den hurtige DNA-isoleringsmetode, jf. D.S. Holmes og Μ. I

I Quingley, Anal. Biochem. 114, 192-197 (1981). I

H

I 25 RF-DNA (~ 1,5 /tg) spaltes med 9 enh. BamHI i 20 /il 10 nM

I Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM mercapto- I ethanol i 1 time ved 37°C. Efter tilsætning af 1 μΐ RNase I (1 mg/ml) og inkubering i 10 minutter ved 37eC isoleres I 2,1 kb insertet på en 0,7%'s præparativ agarosegel. DNA- I 30 Insertet ekstraheres ved elektroeluering og fældes i I ethanol.

DK 175483 B1 77

If5 #ig pJDB207/PH05-I-TPAAUPAB skæres med BamHI, behandles med alkalisk phosphatase fra kalvetarm, og 6,7 kb vektoren isoleres. Efter elektroeluering fældes vektor-DNA'et.

5 100 fmol pJDB207/PH05-I-TPAAUPAB-BamHI-skåret vektor, 200

fmol TPAAUPAB-insert ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH

7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 enh. T4 DNA-ligase i 8 timer ved 15"C. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65°C i 10 minutter. 5 μΐ af 10 denne ligeringsblanding anvendes til transformation af Escherichia coli HB101 Ca2+-celler, jf. M. Dagert og S.D.

Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1979). 12 ampR-kolonier udtages, og der fremstilles DNA ved anvendelse af hurtigisoleringsmetoden. Ved analyse af DNA viser 5 kloner såvel inserter 15 med korrekt størrelse som korrekt orientering. En klon dyrkes i 100 ml LB-medium indeholdende 100 mg/ml ampicillin. Plasmid DNA isoleres og betegnes pJDB207/PH05-I-MOTPAaUPAb.

B) Kloning af M0UPAATPAB-, M0UK?TPAB- og MOUK?UPAB-qen-20 inserterne i piamid pCS16 RF-DNA fremstilles for mpl8/KpnI-HindIII/M0UPAATPAB, mpl8/Kpnl-HindiII/M0UK2TPAB og mpl8/KpnI-HindiII/ M0UK2UPAB ved den hurtige DNA-isoleringsmetode.

De tre RF-DNA'er (- 1,5 μg) spaltes hver for sig med 12 25 enh. Kpnl og 12 enh. Hindlll i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH

7.5, 6 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37°C.

Der tilsættes 1 μΐ 1 M NaCl, og DNA'eme spaltes yderligere med 12 enh. Hindlll. Efter tilsætning af 1 /il RNase (1 mg/ml) og inkubering i 10 minutter ved 37°C, 30 isoleres 1,4 kb inserterne hver for sig på en 0,8%'s præparativ agarosegel. DNA-inserterne ekstraheres ved elektroeluering og fældes i ethanol.

3 μg pCS16/UPA spaltes med Kpnl og Hindlll, og 2,7 kb _ ___

I DK 175483 B1 I

I 78 I

I vektorfragmentet isoleres. Efter elektroeluering fældes I

I vektor-DNA'et i ethanol. I

I 100 fmol pCS16 KpnI-Hindlll-skåret vektor, 200 fmol ΚρηΙ- I

I 5 Hindlll-skåret insert fragment er ligeres i 10 μΐ 50 mM I

I Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 /tg I

I gelatine med 400 enh. T4 DNA-ligase i 8 timer ved 15*C. I

I Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65®C i 10 minutter, I

I og 5 μΐ af denne ligeringsblanding anvendes til transfor- I

I 10 mation af Escherichia coli HB101 Ca2+-celler. I

I 6 ampR-kolonier udtages fra hver af de tre ligeringer. DNA I

I fremstilles ved hurtigisoleringsmetoden. Ved analyse af I

I DNA med Kpnl-HindiII iagttages insertbånd med korrekt I

I størrelse. En klon fra hver af de tre ligeringer dyrkes i I

I 15 100 ml LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Pias- I

I mid-DNA '„er afledt fra mpl 8/Kpnl -Hindi 11 /MOUPAATPAB, mpl8/ I

I KpnI-Hindl II /M0UK2TPAb og mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2UPAB I

I isoleres og betegnes henholdsvis pCS16/MOUPAATPAB, I

I pCS16/M0UK2TPAB og pCS16/M0UK2UPAB. I

I 20 C) Kloning af M0UPAATPAB-, MOUKpTPA5- og MOUK?UPAB-qen- I

I inserteme i PJDB207 I

I 5 #*9 PJDB207/PH05-I-UPA spaltes med 15 enh. Seal og 15 I

I enh. Xhol (Boehringer) i 50 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM I

I MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM mercaptoethanol i 1 time ved I

I 25 37°C. Efter tilsætning af 1 μΐ RNase (1 mg/ml) isoleres I

I 6,7 kb vektorfragmentet. Efter elektroeluering fældes I

I vektor-DNA’et. I

I 15 μg af henholdsvis pCS16/M0UPAATPAB, pCS16/M0UK2TPAB og I

I pCS16/M0UK2UPAB inkuberes ved 37eC i 1 time med 30 enh. I

I 30 Xhol i 200 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM I

I NaCl, 6 mM mercaptoethanol, der ekstraheres med et til- I

I svarende rumfang phenol-chloroform og fældes med ethanol. I

I De fældede Xhol-skårne pCS16/M0UPAATPAB-, I

I pCS16/MOUK2TPAB- og pCS16/MOUK2UPAB-DNA’er resuspenderes I

DK 175483 B1 79 hver for sig i 150 /ti 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol, 1,5 Mg ethidiumbromid, blandingerne inkuberes ved 37eC i 40 minutter med 12 enh.

5 Seal (partiel spaltning), og der ekstraheres med et lige så stort rumfang phenol og derpå med et lige så stort rumfang chloroform-isoamylalkohol (50:1). 1,2 kb fragmenterne isoleres hver for sig på en 1%'s præparativ agarosegel. DNA'erne ekstraheres ved elektroeluering og 10 fældes.

100 fmol pJDB207/PH05-I-UPA-ScaI-XhoI-skåret vektor og 200 fmol af henholdsvis Xhol-Scal-skåret pCS16/MOUPAATPAB-, pCS16/MOUK2TPAB- og pCS16/M0UK2UPAB-l,2 kb-inserter ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 15 DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 enh. T4 DNA-ligase i 15 timer ved 15eC. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65BC i 10 minutter. 5 μΐ af denne ligeringsblanding anvendes til transformation af Escherichia coli HB101 Ca2+-celler.

20 6 ampB-kolonier udtages fra hver af de tre ligeringer. DNA

fremstilles ved hurtigisoleringsmetoden. Restriktionsanalyse af DNA'er viser insertbånd med korrekt størrelse. En klon fra hver af de tre ligeringer dyrkes i 100 ml LB-mediuro indeholdende 100 /tg/ml ampicillin. P lasmi d-25 DNA'er afledt af pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/M0UK2TPAB, pCS16/M0UK2UPAB betegnes henholdsvis pJDB207/PH05-I- M0UPAATPAB, pJDB207/PH05-I-M0UK2TPAB og pJDB207/PH05-I-M0UK2UPAB.

Eksempel 16 30 Transformation af Saccharomyces cerevisiae GRF18 og fremstilling af gærcelleekstrakter

Plasmideme pJDB207/PH05-I-MOTPAAUPAB, pJDB207/PH05-I- M0UPAATPAB, pJDB207/PH05-I-MOUK2TPAB og pJDB207/PH05-I-M0UK2UPAB indføres hver for sig i Saccharomyces cerevi-

I DK 175483 B1 I

I 80 I

I siae-stamme GRF18 under anvendelse af transformationsme- I

I toden beskrevet af Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. I

I USA 75, 1929 (1978). 5 pg af hver enkelt plasmid-DNA I

I 5 sættes til 100 μΐ af en spherop last suspens ion, og blandin- I

gen behandles med polyethylenglycol. Spheroplasterne I

I blandes med 10 ml regenereringsagar og udplades på gær- I

minimalmediumplader uden leucin. Efter inkubering i 3 dage I

I ved 30eC opnås ca. 200 transformerede celler. I

I 10 En koloni fra hver af gærtransformationeme udtages. De I

forskellige kolonier betegnes som følger I

I Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PHO5-I-MOTPAAUPAB I

I Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2Q7/PH05-I-M0UPAATPAB I

I Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2Q7/PH05-I-M0UK->TPAB I

I 15 Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PH05-I-MQUK?UPAB I

I Gærceller dyrkes ved 30°C i 20 ml HE-17-medium (8,4 g I

I Yeast Nitrogen Base (Difco), 10 g L-asparagin (Sigma), 1 g I

I L-histidin (Sigma), 40 ml 50% glucose pr. 1 opløsning) i I

I en 50 ml Erlenmeyer-kolbe med rystning i 24 timer, indtil I

I 20 der er opnået en tæthed på 8-10 x 10? celler/ml. Cellerne I

I centrifugeres, resuspenderes i 10 ml 0,9%'s NaCl. 2 ml af I

de resuspenderede celler anvendes til inokulering af 50 ml I

lav-Pi-minimalmedium (som beskrevet i beskrivelsen til I

europæisk patentansøgning nr. 143.081), hvortil der er I

25 sat 10 g/1 L-asparagin (Sigma) og 10 g/1 L-histidin I

(Sigma), i 250 ml Erlenmeyer-kolber. Inkuberingen I

gennemføres ved 30°C og 250 o/m. I

Celler fra 10 ml lav-Pi-minimalmedium samles efter 48 I

timer ved centrifugering ved 3000 o/m i 10 minutter i I

30 Falcon 2070-rør. Cellerne vaskes en gang med 10 ml lav- I

Pi-medium og centrifugeres. Cellepelletten suspenderes i I

lyseringspuffer (66 mM kaliumphosphat pH 7,4, 4 mM I

"Zwittergent" (Calbiochem.)). Til cellesuspensionen sættes I

8 g glasperler med en diameter på 0,5-0,75 mm, og en I

DK 175483 B1 81 lille glasstav, og suspensionen rystes på en Vortex Mixer (Scientific Instruments Inc., USA) ved fuld hastighed i 4 x 2 minutter med mellemrum på 2 minutter på is. Mere end 5 90% af cellerne oplukkes ved denne behandling. Cellerester og glasperler aflejres ved centrifugering i 5 minutter ved 3000 o/m ved 4°C. Supernatanten anvendes til bestemmelse af PA-aktivitet og til rensning og isolering af PA.

Eksempel 17 10 Indsætning af hybrid-PA-kodningssekvenser i pattedyrcelle-ekspressionsvektor A) Indsætning af en UPAATPAB "perfekt" hybridkodningssekvens RF-DNA af mpl8/KpnI-HindiII/M0UPAATPAB skæres ved Smal-15 stedet anbragt lige modstrøms for begyndelsen af kodningssekvensen og ligeret til en Sacl-linker (CGAGCTCG). Derefter skæres plasmidet med Sacl, der spalter ved positionen for de ligerede linkeie og ved det naturlige Sacl-sted i den t-PA-afledte del af hybrid-PA-kodnings-20 sekvensen. Det mindste af de to dannede fragmenter renses ved hjælp af en agarosegel og ligeres til Sacl-skåret pCGA44 (se eksempel 4), transformeres til Escherichia coli HB101, og DNA fra kandidatkloner testes med EcoRI. En klon med det forventede restriktionsmønster betegnes 25 pCGCl/UPAATPAB.

B) Indsætning af UK?TPAB-hybridkodningssekvens RF-DNA af mpl8/Kpnl-HindiII/M0UK2TPAB skæres ved Smalstedet anbragt lige modstrøms for begyndelsen af kodnings-sekvensen og ligeret til Sacl som beskrevet ovenfor. Efter 30 skæring med Sacl klones det dannede lille fragment i Sacl-skåret pCGA44 som beskrevet ovenfor, og en klon med . det forventede restriktionsmønster betegnes pCGC2/UK2TPAB.

I DK 175483 B1

I 82 I

I C) Indsætning af en UK?UPAB-hybrldkodninqssekvens I

I RF-DNA af mpl 8 /Kpnl -Hindi 11 /MOUK2UPAB skæres ved Smal- I

stedet modstrøms for u-PA-kodningssekvensen og ved Xhol- I

I 5 stedet medstrøms for kodningssekvensen (i vektor-DNA'et). I

I Den klæbrige ende af DNA-fragmentet udfyldes under anven- I

I delse af Escherichia coli DNA-polymerase I (se eksempel 5 I

I D). Sacl-linkere ligeres til de korte ender, DNA’et skæres I

I med SacI, det mindste af de to dannede fragmenter renses I

I 10 ved hjælp af en agarosegel og klones i Sacl-skåret pC6A44. I

I En klon med det forventede EcoRl-restriktionsmønster I

I betegnes pCGC3/UK2UPAB. I

I D) Indsætning af en TPAAUPAB "perfekt" kodningssekvens I

I Trin 1: RF-DNA af mpl8/BamHI/M0TPAAUPAB skæres med BamHI, I

I 15 og det lille (~ 2,1 kb) fragment klones i BamHI-skåret I

pJDB207/PH05-I-TPAAUPAB (se eksempel 9) vektor. Korrekt I

I orientering vælges ved spaltning med Hindlll, og et I

I korrekt plasmid betegnes pJDB207/PH05-l-MQTPAAUPAB. I

Trin 2: Et ~ 600 bp SacI-Narl-fragment fra ptNC.UC (se I

I 20 eksempel 3) og et ~ 1350 bp Nar I-Xhol-fragment fra I

I pJDB207/PH05-I-TPAAUPAB isoleres og klones i I

SacI-XhoI-skåret pCS16 (se eksempel 7) vektor. ~ 1,9 kb- I

I insertet bekræftes ved spaltning med Sacl-Xhol og EcoRI. I

I Et korrekt plasmid betegnes pCS16/M0TPAAUPAB. I

I 25 Trin 3: Plasmid pCS16/M0TPAAUPAB skæres ved Xhol-stedet I

I placeret modstrøms for u-PA-kodningssekvensen, og de I

I klæbrige ender udfyldes under anvendelse af Escherichia I

I coli DNA-polymerase I. Sacl-linkere ligeres til de korte I

I ender, og DNA*et skæres med SacI. Det mindste af de to I

I 30 fragmenter renses ved hjælp af en agarosegel og klones i I

I Sacl-skåret pBR4a (se eksempel 5) vektorfragment. Korrekt I

I orientering og korrekt størrelse af inserter bekræftes ved I

I spaltning med henholdsvis BamHI og SacI. Et korrekt plas- I

DK 175483 B1 83 raid betegnes pCGC4a/TPAAUPAB.

Eksempel 18

Konstruktion af andre hybrld-PA-kodningssekvenser og 5 indsætning deraf i pattedyrcelleekspressionsvektor A) Kloning af et pCGC4a/TPAAUPAB-fragment i M13mpl8 3 μς pCGC4a/TPAAUFAB (se eksempel 17) spaltes med 12 enh.

SacI (Boehringer) i 20 μΐ 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM

MgCl2, 6 mM mercaptoethanol ved 37eC i 1 time. Et ~ 1,9 10 kb-£ragment isoleres på en 0,7%'s præparativ agarosegel.

DNA’et ekstraheres ved elektroeluering og fældning.

0,5 μg M13mpl8 (RF) spaltes med SacI. 3,7 kb vektorfragmentet isoleres på 0,7% præparativ agarosegel. DNA'et elektroelueres og fældes. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 100 fmol M13rapl8 Sacl-skåret vektor og 200 fmol 2

Sacl-insert ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM

3

MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 enh.

4 T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15°C. Reaktionen afbrydes ved 5 inkubering ved 65eC i 10 minutter. 5 μΐ af denne lige- 6 ringsblanding anvendes til transformation af Escherichia 7 coli JM101 kompetente celler. Seks farveløse plague udta 8 ges, og der fremstilles enkeltstrenget DNA og DNA på 9 replikativ form (RF). Ved analyse af RF-DNA viser fire 10 kloner inserter med korrekt størrelse og korrekt orien- 11 tering. En af disse kloner betegnes mpie/SacI/TPA^PA® 12 (BC).

13 B) Kloning af et pBR4a-SacI-fragment i M13mpl8 14

Et pBR4a (se eksempel 5) Sacl-fragment klones i M13mpl8.

15

En af klonerne, som har et insert med korrekt størrelse og 16 korrekt orientering, betegnes mpl8/SacI/TPAAUPAB(BR).

I DK 175483 B1

I 84 I

I C) Sletnlngsmutagenese på TPA-UPA-hybridkonstruktloner I

I 1) Konstruktion af K2UPAB (BC) [dvs. tPA(l-3)-tPA(176- I

I 275)-uPA(159-411) ] I

I 5 Sletningsmutagenese gennemføres som beskrevet ved den I

I almene fremgangsmåde (se eksempel 14) på I

I mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Positive kloner dannet ved I

I hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse med Sad. I

I 1 mutanterne konstateres et ~ 1380 bp bånd sammenlignet I

I 10 med vildtypen, som giver et ~ 1900 bp fragment. Mutanter I

I bekræftes endvidere ved EcoRl-spaltning. En mutantklon med I

I den korrekte struktur betegnes mpl8/Sad/K2UPAB(BC). I

I Sletningen bekræftes ved kædeterminatorsekvenseringsmeto- I

I den under anvendelse af en sekvenseringsprimer med sekven- I

I 15 sen I

I 5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTICTGTGCIGTG 3' I

I Denne primer er komplementær til den kodende streng i I

I t-PA(853-821) med en mismatch i position 838 (t-PA). I

I 2) Konstruktion af FUPAB(BC) [dvs. tPA(1-49)-tPA(262- I

I 20 275)-uPA(159-411) ] I

I Sletningsmutagenese gennemføres som beskrevet i forbin- I

I delse med den almene fremgangsmåde (se eksempel 14) på I

I mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Positive kloner opnået ved I

I hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse med Sad. I

I 25 1 mutanterne iagttages et ~ 1200 bp bånd sammenlignet med I

I vildtypen, der giver et ~ 1900 bp fragment. Mutanter I

I bekræftes endvidere ved hjælp af EcoRI-spaltning. En I

I mutantklon med den korrekte struktur betegnes I

I mpl8/SacI/FUPAB(BC). Sletningen verificeres ved hjælp af I

I 30 kædeterminatorsekvenseringsmetoden under anvendelse af en I

sekvenseringsprimer med sekvensen DK 175483 B1 85 S’ CAGAGCCCCCCCGGTGC 3’.

Denne primer er komplementær til den kodende streng i u-PA(656-682).

5 3) Konstruktion af FK2UPAB(BC) [dvs. tPA(1-49)-tPA(176- 275)-uPA(159-411)]

Sletningsmutagenese gennemføres som beskrevet i forbindelse med den almene fremgangsmåde (se eksempel 14) på mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Positive kloner opnået ved hybri-10 disering bekræftes ved restriktionsanalyse med Sad. I mutanterne konstateres et ~ 1470 bp bånd sammenlignet med vildtypen, som giver et ~ 1900 bp fragment. Mutanter bekræftes endvidere ved spaltning med EcoRX. En mutantklon med den korrekte struktur betegnes mpl8/SacI/KF2UPAB(BC).

15 Sletningen bekræftes ved hjælp af kædeterminatorsekvense-ringsmetoden under anvendelse af en sekvenseringprimer roed sekvensen 5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3* .

Denne primer er komplementær til den kodende streng i 20 t-PA(853-821) med en mismatch i position 838 (t-PA).

4) Konstruktion af FGK2UPAB(BC) [dvs. tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ]

Sletningsmutagenese gennemføres som beskrevet i forbindelse med den almene fremgangsmåde (se eksempel 14) på 25 mpl8/SacI/TPAAUPAB(BC). Positive kloner opnået ved hybridisering bekræftes ved restriktionsanalyse med Sacl.

I mutanterne konstateres et ~ 1580 bp bånd sammenlignet med vildtypen, som giver et ~ 1900 bp fragment. Mutanter

I DK 175483 B1 I

I 86 I

bekræftes endvidere ved spaltning med EcoRX. En mutant- I

klon med den korrekte struktur betegnes mpl8/SacI/ I

I FGK2UPAB(BC). Sletningen bekræftes af kædeterminatorse- I

I 5 kvenseringsmetoden under anvendelse af en sekvenserings- I

I primer med sekvensen I

I 5’ CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3' . I

I Denne primer er komplementær til den kodende streng i I

t-PA(853-821) med en mismatch i position 838 (t-PA). I

I 10 5) Der gennemføres tilsvarende sletningsmutagenese til I

I dannelse af I

I K2UPAB(BR) [tPA(l-3)-tPA(176-262)-uPA(132-411)] I

I FUPAB(BR) [tPA(l-49)-uPA(134-411)] I

I FK2UPAB(BR) [tPA(l-49)-tPA(l76-262)-uPA(132-411)) 99. I

I FGK2UPAB(BR) [tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(132-4ll)}. I

I D) Indsætning af hybrid-PA-kodningssekvenser i pattedyr- I

I celleekspressionsvektor I

I 15 1. Indsætning af FUPAB(BC), K2UPAB(BC), FK2UPAB(BC) og I

I FGK2UPAb(BC). I

I RF-DNA fra mpl8/SacI/K2UPAB(BC), mpl8/SacI/FUPAB(BC), I

I mpl8/Sacl/FK2UPAB(BC) og mpl8/SacI/FGK2UPAB(BC) skæres I

I hver for sig med Sacl. Det mindste af de to dannede I

I 20 fragmenter isoleres og ligeres til Sacl-skåret pBR4a (se I

I eksempel 5) vektorfragment, overføres til Escherichia coli I

I ΗΒ101, og inserter med korrekt orientering og korrekt I

Η I

I størrelse bekræftes ved spaltning med henholdsvis BamHI og I

I Sacl. De dannede plasmider betegnes henholdsvis I

I 25 pCGC5/K2UPAb, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPAB og I

I pCGC8/FGK2UPAB. I

DK 175483 B1 87 2. På tilsvarende måde indsættes K2UPAB(BR)-, fupab(BR)-, FK2UPAb(BR)- og FGK2UPAB(BR)-DNA’er (se ovenfor) hver for sig i pBR4a. De opnåede plasmider betegnes henholdsvis 5 pBR5, pBR6, pBR7 og pBR8.

Eksempel 19

Pattedyrekspressionsvektorer, som indeholder DHFR-genet

Plasmid pSV2dhfr (ATCC 37145) er et plasmid, der tillader selektering af transformanter af DHFR-holdige celler ved 10 selektion under anvendelse af antifolatlægemidlet methotrexat eller selektion af DHFR+-transformanter af DHFR"-CHO-celler [ DUKXBl-celler, G. Urlaub, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)]. I det eneste BamHI-sted i dette plasmid kan klones BamHI-fragmentet af pCGA28 15 indeholdende det modulære t-PA-gen. Plasmider indeholdende den ene af de to mulige orienteringer betegnes pCGA700a/tPA og pCGA700b/tPA. Begge kan anvendes til at udtrykke t-PA i vævskulturceller, men man foretrækker pCGA700a/tPA'en, i hvilken transskriptionen af t-PA-genet 20 er i samme retning som retningen for DHFR-genet, da denne orientering ofte fører til lidt højere ekspressionsniveauer end med plasmider, som er transskriberet konvergent.

På analog måde kan de modulære gener, som koder for 25 hybridplasminogenaktivatorer (nedenfor) fra plasmider pBRla/tPA, pBR2a/UPAATPAB, pCGCl/UPAATPAB og pCGC2/UK2TPAB, kombineres som BamHI-fragmenter med DHFR-genet af pCGA700a/tPA til dannelse af henholdsvis plasmider pCGA701a/tPA, pCGA702a/UPAATPAB, pCGA705a/ 30 UPAaTPAb og pCGA707a/UK2TPAB, hvori det modulære plasminogenaktivatorgen er transskriberet i den samme retning som DHFR-genet, og pCGA701b/tPA, pCGA702b/ UPAaTPAb, pCGA705b/UPAATPAB, pCGA707b/UK2TPAB, hvori begge gener er transskriberet i modsatte retninger. Som følge

I DK 175483 B1 I

I 88 I

I af tilstedeværelsen af en BamHl-sekvens i den del, som I

koder for u-PA-B-kæden, kan det modulære plasminogenakti- I

I vatorgen kun isoleres ved en partiel spaltning (2 af de 3 I

I 5 BamHI-steder) af neoR-plasmidet efterfulgt af isolering af I

I det hensigtsmæssige fragment (se figurerne) ved hjælp af I

I agarosegelelektroforese. Ud fra pBR3a/uPA, pBR4a/TPAAUPAB, I

I pBR5/K2UPAB, pBR6/FUPAB, pBR7/FK2UPAB, pBR8/FGK2UPAB, I

I pCGC3/UK2UPAB, pCGC4a/TPAAUPAB, pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, I

I 10 pCGC7/FK2UPAB og pCGC8/FGK2UPAB kan således konstrueres I

I henholdsvis pCGA703a/uPA, pCGA704a/TPAAUPAB, I

I pCGA705a/K2UPAB, pCGA708a/FUPAB, pCGA706a/FK2UPAB, I

I pCGA707a/FGK2UPAB, pCGA709a/UK2UPAB, pCGA7Ua/TPAAUPAB, I

I pCGA712a/K2UPAB, pCGA713a/FUPAB, pCGA714a/FK2UPAB og I

I 15 pCGA715a/FGK2UPAB, hvori plasmigenogenaktivatorgenerne I

I alle er transskriberet i den samme retning som DHFR-genet, I

I og endvidere pCGA703b/uPA, pCGA704b/TPAAUPAB, I

I pCGA708b/FUPAB, pCGA705b/K2UPAB, pCGA706b/FK2UPAB, I

I pCGA707b/FGK2UPAB, pCGA709b/UK2UPAB, pCGA711b/TPAAUPAB, I

I 20 pCGA712b/K2UPAB, pCGA713b/FUPAB, pCGA714b/FK2UPAB og I

I pCGA715b/FGK2UPAB, hvori de to gener er transskriberet I

I inkonvergent. I

I Eksempel 20 I

I Fremstilling af hybridpiasminogenaktivatorer ved hjælp I

I 25 af transformerede pattedyrceller I

I A) Opretholdelse og DNA-transfektion af vævskulturceller, I

I almen fremgangsmåde I

I DNA-konstruktioner udtrykkes i DUKXB1, som er en mutant af I

I kinesisk hamsterovarieceller (CHO), der mangler enzymet I

I 30 dihydrofolatreduktase, jf. G. Urlaub et al., Proc. Natl. I

I Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980). DUKXB1-celler dyrkes I

I i a-MEM-medium Indeholdende nucleosider (Gibco) tilsat 5% I

I føtalt kalveserum. I

DK 175483 B1 89

Cellerne udplades i en tæthed på 10.000 pr. cm^ i 6-hullers multiplader (diameter 3,4 cm) og transformeres med 4 μς DNA: DNA opløses 1 en mængde på 50 /tg/ml i 10 mM 5 Tris/HCl pH 7,0 indeholdende 0,1 nM EDTA, afkøles på is i 5 minutter, der tilsættes 0,25 rumfang 1 M CaCl2 og inkuberes på is i 10 minutter, derpå blandes blandingen med et tilsvarende rumfang 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 0,75 mM Na2HP04, 0,75 mM NaH2P04, pH 7,12) 10 efterfulgt af inkubation i yderligere 10 minutter på is.

Til sidst sættes dette DNA-Ca-phosphat-coprecipitat til dyrkningsmediet, og cellerne inkuberes med DNA'et i 16-18 timer, hvorpå de udsættes for glycerolchok, dvs. cellerne skylles med TBS (80 g/1 NaCl, 3,8 g/1 KC1, 1 g/1 15 Na2HP04.2H20, 0,114 g/1 CaCl2.2H20, 0,11 g/1 MgCl2.6H20, 25 mM Tris/HCl pH 7,5, inkuberes i 1 minut med 20% (r/r) glycerol i TBS, skylles igen med TBS og dyrkes i 24 timer i vævskulturmedium. Derpå underkastes cellerne trypsinbe-handling, hvorpå de overføres til petriskåle med en dia-20 meter på 8 cm. Den næste dag erstattes begyndelsesdyrkningsmediet uden selekteringsmiddel med medium med 1 mg/ml geneticin. Mediet erstattes hver 3. eller 4. dag. Kolonier kan iagttages omkring den 14. dag. Celler fra de enkelte kolonier isoleres ved afskrabning med spidsen af en 25 pipette, medens de samtidig opsuges i spidsen fyldt med trypsinopløsning og overføres enkeltvis til et hul på en 24-hullers multiplade tilsat geneticin. Når disse kulturer er sammenflydende, opdeles de i hullerne på en 6-hullers multiplade og derefter i petriskåle med en diameter på 8 30 cm.

B. Agarosepladeanalyser for plasminogenaktivatorer

Disse følsomme analyser for plasminogenaktivatorer anvender agarosegeler, hvortil der er sat plasminogen (stam-opløsning fremstillet ved opløsning af plasminogen Sigma 35 A-6877 i en mængde på 1 mg/ml i 50 mM Tris/HCl pH 8,0 og dialysering to gange mod 100 rumfang 50 mM Tris/HCl

I DK 175483 B1 I

I 90 I

I pH 8,0) og enten casein (tilsat som fedtfrit mælketørstof) I

I eller fibrin (tilsat som fibrinogen plus thrombin). I

Prøven, der indeholder plasminogenaktivator, anbringes i I

I 5 huller udstukket i et 4 mm tykt agaroselag, og gelen I

I inkuberes derefter ved 37°C. Derefter påvises den I

I enzymatiske aktivitet ved, at plasminogenaktivator diffun- I

I derer radialt bort fra prøvehullet, omdanner plasminogenet I

I i gelen til plasmin, som igen spalter caseinet eller I

I 10 fibrinet og derved danner en klar ring i den uigennemsig- I

I tige gel omkring prøvehullet. Ringens radius, der måles I

I fra kanten af prøvehullet, er et udtryk for den mængde I

I plasminogen, som er blevet aktiveret. Analysen viser ikke I

I et lineært respons på den tilsatte mængde plasminogen- I

I 15 aktivator. Til analyse af små mængder plasminogenaktivator I

kan inkuberingen forlænges i op til flere dage. Fremgangs- I

I måden og kalibreringen af caseinanalysen er som beskrevet I

I af Tang et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 434, 536-540 (1984), I

I idet der dog i stedet for 2% (vægt/rumfang) fedtfrit I

I 20 mælkepulver fra firmaet Carnation anvendes 12,5% I

I (rumfang/rumfang) steriliseret (UHT) fedtfri mælk fra I

I firmaet Migros Corp. (Schweiz). Når der anvendes fibrin, I

I jf. Granelli-Piperno og Reich, J. Exp. Med. 148, 223-234 I

I (1978), som substrat, opløses 0,2 g agarose i 15 ml 0,9% I

I 25 NaCl, og opløsningen afkøles til 42BC. På dette trin I

I tilsættes 5 ml 0,9% natriumchloridopløsning indeholdende I

I 80 mg oksefibrinogen (Sigma F-8630), 0,1 ml plasminogen- I

I opløsning (se ovenfor) og 0,1 ml 100 mg/ml natriumazid ved I

I 42°C. Til sidst tilsættes 0,2 ml oksethrombin (Sigma I

I 30 T-6634, opløst i en mængde på 16,6 NIH enh./ml i 0,9% I

NaCl), og blandingen hældes hurtigt i en petriskål med en I

I diameter på 8 cm og henstilles til afkøling til stuetem- I

I peratur i 1 time. Den dannede gel har en tykkelse på ca. 4 I

I mm og kan opbevares ved 4BC i flere dage eller anvendes I

35 straks på samme måde som den ovenfor omtalte caseinhol- I

I dige gel. I

DK 175483 B1 91 C. Fremstilling af hybrid-PA-proteiner 1 hamsterceller CHO-DUKXBl-celler transformeres med DNA fra plasmider henholdsvis pBRIA, pBRIB, pBR2A, pBR2B, pBR3A, pBR3B, 5 pBR4A, pBR5, pBR7, pBR8, pCGCl, pCGC2, pCGC3, pCGC4a, pCGC5, pCGC6, pCGC7 og pCGC8 som beskrevet ovenfor (eksempel 20A). Kolonier fremkommer omkring den 10. dag, kolonier udtages omkring den 15. dag som beskrevet ovenfor, og 2 uger senere er antallet af celler steget 10 tilstrækkeligt til at måle PA som beskrevet ovenfor. Ikke-transformerede celler og cellelinier transformeret med pBRIB, pBR2B og pBR3B, som indeholder det indsatte SacI-fragment i antisense-orienteringen, producerer ikke påviselige mængder PA.

15 D. Enzymaktivitet 1 medier konditioneret med transformerede CHO-celler

Konditioneret medium fra plasmidtransformerede CHO-celler og kontrol-CHO-celler fremstilles ved dyrkning af 200.000-500.000 celler/ml i 24 timer i a-MEM med 20 nucleosider og 5% føtalt kalveserum og 0,03 ml inkuberes på agaroseplader indeholdende casein eller fibrin i det nedenfor anførte tidsrum. På fibrinpladen påvises en minimal baggrundsaktivitet, formentlig som følge af endogent hamster-t-PA, i det DUKXBl-konditionererde 25 medium. Der fremkommer ingen ring på caseinplader, når prøver af hybridprotein blandes med 3 μΐ kanin-anti-tPA-antistoffer (dannet mod renset Bowes melanoma-t-PA) eller anti-urokinaseantistoffer (dannet mod Serono urokinase).

Anti-tPA-antistof hæmmer ikke u-PA-enzym, og anti-urokina-30 seantistof hæmmer heller ikke t-PA i udtalt grad. Resultaterne er anført i nedenstående tabel 1.

I DK 175483 B1 I

I 92 |

I Tabel 1: Forskellige plasminoqenaktivitatorers aktivtet I

I Transformeringsplasmld Ringdiameter I

I 18 t 36 .t 90 min* 300 min. I

I 1· pBRla(t-PA) _ 2nan 5 mm 1 mm 2 mm I

2. pBR2a (UPAiPA ) 0 mm 0 mm 0,5 mm 1,5 mm I

I 3. pBR3a(u-PA) _ 5 mm 10 n 0,5 m 2,5 an I

I *· pBR4a(TPA^jPA ) 6mm 11 mm 2 mm 3 mm I

I 3. PBR6/K2UPA _ 3 mm 8 mm ikke bestemt I

I 3· pBR7/FK2UPA _ 4 mm 9 mm 1 mm 2 mm I

7. pBR8 /FGKzUPA _ 3,5 mm 7mm0,8mm 2 mm I

I 8* pCGCl/UPA ΤΡΔ Omm 6 mra 0,2 mm 2 mm I

I 9. pCGC2/UK2UPA_ 5mm 10 mm 1 mm 2,5 mg I

I pCGC3/UK2TPA _ 3,5 mm 5 mm 1,5 mm 2,5 mm I

I 11· pCGC4a/TPAftyPA 2,5 mm 5 mm 0,5 mm 1,5 mm I

I 12· pCGCS/føUPA 6,5 mm 12 mm 6 mm >10 mm I

13. pCGC6/FUPA° 2 mm 8 mm 0 om 1 om I

I 1*· pCGC7/FK2UPA 2,5 mm 5 mm 1 mm 2 mm I

I 13· PCGC8/FGK2UPA 2,5 mm 6mmlmm 2 mm I

16. mtPA 1 pg/ml 3 mm 7 mm 1,5 mm 3 mm I

I 17. DUKXBl kontrol Omm 0 mm 0 mm 0,5 nm I

I 5 Eksempel 21 I

Fremstilling af hybridomaceller og isolering af monoklo- I

nåle antistoffer I

I a) Kilde for immunogen: En prøve af halvrenset naturlig I

I humann(melanoma-t-PA) har en anslået renhed på >90%. I

I 10 b) Immuniseringsmetode: Tre grupper BALB/c mus (dyrefarm I

Sisseln, CH), som er 10-14 uger gamle, immuniseres ved I

subkutan injektion i trædepuderne på de to bagpoter med I

100 μg melanoma-t-PA emulgeret i komplet Freund's adju- I

vans (Difco). Derefter administreres 10 pg t-PA i inkom- I

15 plet adjuvans til første gruppe (nr. 405) en gang om ugen I

i 6 uger, medens den anden gruppe (406) indgives den samme I

mængde hver anden uge. Den tredje gruppe (407) gives to DK 175483 B1 93 gange 50 μg t-PA med 3 ugers mellemrum. Der udtages blod fra alle dyrene på den 4. og 8. uge. Til den sidste injektion gives 100 μς t-PA i PBS intraperitonealt, og 4 5 dage senere fusioneres miltceller med SP2/o myelomalinie under anvendelse af standardfremgangsmåder. Til fusionen anvendes kun de mus, som har høj anti-t-PA-antistoftiter.

c) Cellefusion: Alle fusionsforsøgene gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge G. kchler og C.

10 Milstein, Nature 256, 495 (1975) samt under anvendelse af den ikke-sekreterende Sp 2/0-Agl4 myelomalinie, M.

Shulman, C.D. Wilde og G. Kchler, Nature 276, 269 (1978).

ΙΟ** miltceller blandes med 10? myelomaceller i nærværelse af 1 ml 50% polye thyl engly col (PEG 1500, Serva). Efter 15 vaskning resuspenderes cellerne i 48 ml Dulbecco's standard minimumessentielmedium (Gibco nr. 0422501). 3x10^ normal museperitonealexsudatceller pr. fusion tilsættes som fødeceller. Cellerne fordeles i 48 x 1 ml costar-huller og fødes tre gange pr. uge med standard HAT-selek-20 tionsmedium i 3 til 6 uger. Når hybridomaceliernes vækst bliver synlige, screenes supernatanterne ved hjælp af såvel direkte antigenbindingsanalyse (ELISA) og neutraliseringsanalyse (casein) (se nedenfor). Ved fire fusionsforsøg opnås følgende resultater: Fra 192 podede huller 25 opnås 192 hybridomaer. Blandt disse producerer 24 anti-t-PA-antistof. Blandt 24 positive hybridomaer klones 14, og ud af 574 opnåede kloner producerer 31 anti-t-PA-mAb stabilt. Tre af disse kloner (klon 405B.33.3, 406A.23.7 og 407A.15.27) injiceres i mus, og 30 ascitesvæske udtages til videre undersøgelser.

d) Isolering og rensning af monoklonalt antistof: 8-10 uger gamle BALB/c mus (dyrefarm Sisseln, CH) forbehandles intraperitonealt med 0,3 ml pristan (Aldrich).

2-3 uger senere foretages intraperitoneal inokulering med 35 2-5x10^ klonede hybridomaceller 405B.33.3, 406A.23.7 og 407A.15.27 og 0,2 ml pristan. Efter 8-10 dage opsamles

I DK 175483 B1 I

I 94 I

I ascitesvæske, som centrifugeres ved 800 x 6 og I

I opbevares ved -20‘C. I

I Optøet ascitesvæske centrifugeres ved 50.000 x G i 60 I

I 5 minutter. Et fedt lag, som flyder på overfladen, fjernes I

I forsigtigt, og proteinkoncentrationen indstilles på 10-12 I

I mg/ml. Råt immunoglobulin fældes ved dråbevis tilsætning I

I af 0,9 rumfangsækvivalenter mættet ammoniumsulfat ved 0°C, I

I hvorpå det opløses i 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) og I

I 10 dialyseres mod den samme puffer. En immunoglobulinfraktion I

I fås ved kromatografi på DEAE-D52-cellulose (Whatman) under I

I anvendelse af et puffergradientsystem med 20 mM I

I Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Immunoglobulinet fældes I

I igen med ammoniumsulfat og opløses i PBS ved en koncen- I

I 15 tration på 10 mg/ml. I

I Ved gelelektroforese på natriumdodecylsulfatpolyacrylamid I

I (SDS-PAGE) påvises en renhedsgrad på mere end 95% for de I

I monoklonale antistoffer. I

I e) Påvisning af klasse og underklasse for monoklonale I

I 20 antistoffer: Klassen og underklassen for monoklonale I

I antistoffer produceret af klonede hybridomaceller bestem- I

I mes ved hjælp af den kendte Ouchterlony-immunodiffusions- I

I teknik (agar-gelimmunodiffusionsmetode) under anvendelse I

I af klasse- og underklassespecifikke kaninantistoffer I

I 25 (Bionetics). I

I Underklasser for mAbs er som følger: I

I 405B.33.3 : I

I 406Ά.23.7 : γ2^κ I

I 407A.15.27 : J2aK I

I 30 f) Enzymimmunoanalyse (ELISA): Mikrotiterplader over- I

I trækkes med 0,5 μg pr. hul af en t-PA-præparation (renhed I

I >95%) i 100 μΐ PBS. Pladens fri bindingskapacitet mættes I

DK 175483 B1 95 med en puffer af 0,2% gelatine i PBS indeholdende 0,2%

NaN3 (v/r), pH 7,4. 100 μΐ prøver indeholdende monoklonale antistoffer henholdsvis 405B.33.3, 406A.23.7 og 407A.15.27 5 inkuberes i hullerne ved 37eC i 2 timer. Pladerne vaskes med PBS indeholdende 0,05% "Tween 20"®, hvorpå der inkuberes ved 37eC i 2 timer med en phosphatasekonjugeret kanin-anti-muse-immunoglobulinpræparation. Det fikserede enzym fremkaldes ved inkubering ved 37®C i 30-60 minutter 10 med en opløsning af enzymsubstratet p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i diethanolaminpuffer 10% indeholdende 0,5 mM MgCl2 og 0,02% (v/r) NaN3, pH 9,8), og den optiske tæthed måles ved 405 nm.

Den samme ELISA gennemføres også under anvendelse af 15 urokinase. Intet mAb binder til urokinase. Alle mAb'er er t-PA-specifikke.

g) Caseinlyserinqsanalyse (neutraliseringstest):

Til bestemmelse af den hæmmende virkning af mAb'er blandes t-PA først med mAb'er henholdsvis 405B.33.3, 406B.23.7 og 20 407A.15.27, og der inkuberes i 30-60 minutter ved 4®C, hvorpå man gennemfører den sædvanlige casein/plasmi-nogenagaranalyse; (se eksempel 20B). Ingen af mAb'erne inhiberer t-PA-aktiviteten, bortset fra at mAb 405B.33.3 bevirker en forsinkelse (mere end 6 timer) af caseinly-25 seringen.

Eksempel 22

Rensning af hybridpiasminoqenaktivator, almen fremgangsmåde

Ekstrakter fra transformerede gærceller fremstilles som 30 beskrevet i eksempel 16. Ekstrakter fra plasmid-transformerede pattedyrceller, såsom CHO-celler, fremstilles på følgende måde: I DK 175483 B1

I 96 I

I Cellerne dyrkes først til en sammenflydningsgrad på I

I 70-80%. Derefter skylles cellemonolaget med medium som I

I beskrevet ovenfor dog uden indhold af serumet, hvorpå I

I 5 cellerne dyrkes i et tidsrum på 5-7 dage. Mediet høstes I

hver 24. time, , og samtidig tilføres cellerne frisk medium. I

Det således opnåede konditionerede medium centrifugeres I

derpå ved 5000 x G i 30 minutter og filtreres gennem et I

I 0,45 μπι filter til fjernelse af uønskede cellerester inden I

I 10 affinitetskromatografi. Som affinitetsmatrix anvendes I

I enten den immobiliserede proteaselnhibitor DE-3 fra I

H Erythrina latissima eller immobiliserede antistoffer mod I

u-PA eller t-PA. I

I Hybrid-PA'er indeholdende den katalytiske B-kæde fra t-PA I

I 15 renses fra det konditionerede medium fremstillet som I

I beskrevet ovenfor eller fra gærcelleekstrakter under I

I anvendelse af den fremgangsmåde, der oprindeligt er I

I udviklet til rensning af t-PA fra melanoma-cellekondi- I

I tioneret medium, jf. C. Heussen et al., J. Biol. Chem. I

I 20 259, 11635-11538 (1984). I

I Alle hybrid-PA'er renses under anvendelse af polyklonale I

I antistoffer dannet i kaniner eller geder mod stam-u-PA- og I

I -t-PA-enzymerne eller under anvendelse af monoklonale I

antistoffer (af museoprindelse) dannet mod stamenzymeme, I

I 25 forudsat at disse genkender en epitop i det pågældende I

I hybrid-PA (se eksempel 21). Det valgte antistof immobili- I

I seres på en uopløselig matrix, såsom "Affigel" eller I

"Sepharose"®-4B. Det konditionerede medium fremstillet som I

I beskrevet ovenfor eller gærcelleekstrakten sættes derpå I

30 til en søjle med affinitetsmatrix, uønskede proteiner I

vaskes bort under anvendelse af en passende puffer, f.eks. I

I Dulbecco's PBS [0,1 g/1 CaCl2, 0,2 g/1 KC1, 0,2 g/1 I

I KH2P04, 0,047 g/1 MgCl2, 8,0 g/1 NaCl, 1,15 g/1 Na2HP04,

I J. Exp. Med. 9£, 167 (1954)], hvorefter PA'en elueres fra I

I 35 søjlen under anvendelse af det chaotropiske middel kalium- I

I thiocyanat, jf. M. Einarsson et al., Biochim. Biophys. I

DK 175483 B1 97

Acta 830, 1-10 (1985), eller en puffer med lav pH-værdi, såsom 0,1-0,2 M glycin-HCl (pH 2,1).

Efter rensning under anvendelse af monoklonale antistoffer 5 har hybrid-PA' eme en renhed på mere end 90%.

Eksempel 23

Rensning af UK«>tpab(BC) a. Fremstilling af en DE-3 "Sepharose"®-søjle

For hver ml bromcyanidaktiveret "Sepharose 4B"® 10 (Pharmacia) kobles 5 mg renset inhibitor fra Erythrina latissima, jf. F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531 (1981), under anvendelse af producentens forskrifter. Matrixen ækvilibreres med 0,2 M ammoniumacetatpuffer pH 7,0 indeholdende 0,2 M 15 NaCl, 0,1% "Synperonic"® og 0,02% natriumazid.

b. Kromatografirensning af UK?TPAB(BC) på DE-3 "Sepharose 4B"®

Konditioneret medium (se eksempel 22) indstilles på 0,1% med hensyn til "Synperonic"®, hvorpå det sættes til DE-3 20 "Sepharose 4B"®. Efter forsigtig omrøring i 1 time ved 4eC hældes DE-3 "Sepharose 4B"® i en søjle, og der vaskes med 0,2 M NaCl, 0,1% "Synperonic"®, indtil UV-absorptionen ved 280 nm når grundlinieniveauerne, som angiver fravær af proteiner i eluatet. Vaskningen fortsættes derpå med 0,2 M 25 ammoniumacetatpuffer pH 7,0 indeholdende 0,2 M ammonium-thiocyanat og 0,1% "Synperonic"®. Når UV-absorptionen ved 280 nm angiver fravær af protein i eluatet, elueres søjlen med 0,2 M ammoniumacetatpuffer pH 7,0 indeholdende 1,6 M ammoniumthiocyanat og 0,1% "Synperonic"®. Fraktioner 30 indeholdende de højeste amidolytiske aktiviteter, målt under anvendelse af fluorometrianalysen med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat, jf. M. Zimmermanm et al., Proc.

I DK 175483 B1

98 I

I Natl., Acad. Sci USA 75, 750 (1978), hældes sammen. Mindst I

I 80% af aktiviteten sat til DE-3 "Sepharose 4B"®-materialet I

I udvindes i en enkelt top. I

I 5 De sammenbiåndede aktive fraktioner dialyseres mod 0,2 Μ I

I ammoniumacetatpuffer pH 7,0 indeholdende 0,1% I

I "Synperonic"® og sættes til en søjle indeholdende mono- I

I klonalt antistof 407A.15.27, som er rettet mod det første I

I kringleområde i t-PA, koblet til "Sepharose 4B"®, ækvili- I

I 10 breret i 0,2 M ammoniumacetatpuffer pH 7,0 indeholdende I

I 0,1% "Synperonic"® til fjernelse af endogent t-PA. Af- I

gangsvæsken, som indeholder UK2TPAB(BC), opsamles. I

I HPLC med omvendt fase af det rensede UK2TPAB(BC) på en I

I "Nucleosil"® 300-5-Cl8-søjle med dimensionerne 4 x 110 mm I

I 15 viser en enkelt top ved eluering med en lineær gradient I

I over 30 minutter startende med 70% opløsning A bestående I

af vand indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre og 30% op- I

I løsning B bestående af acetonitril indeholdende 0,08% I

I trifluoreddikesyre, og sluttende med 40% A og 60% B. Det I

I 20 rensede protein viser ved N-terminalsekvensanalyse, at de I

I første ti aminosyrerester fra sekvensen SNELHQVPSN, som I

I er identisk med sekvensen, som forventes ud fra I

I DNA-sekvensen, der koder for molekylet. I

I Eksempel 24 I

I 25 Rensning af FK?UPAB(BC) og K?UPAB(BC) I

I a. Fremstilling af antistofaffinitetssøjler I

I Kanin-anti-u-PA-antistoffer renset fra kanin-anti-u-PA- I

I serum, monoklonale antistoffer 405B.33.3 og 406A.23.7, I

I kobles til bromcyanidaktiveret "Sepharose 4B"® under I

I 30 anvendelse af producentens forskrifter og under anven- I

I delse af 6 mg antistof pr. ml aktiveret "Sepharose". I

I Gelmatrixen ækvilibreres med PBS indeholdende 0,1% I

DK 175483 B1 99 "Synperonic"® og 0,1% natriumazid.

b. Kromatografirensning af FK?UPAB(BC) og K?UPAB(BC) på antistof "Sepharose 4B"® 5 Konditioneret medium (se eksempel 22) indstilles på 0,1% med hensyn til "Synperonic"® og sattes til anti-uPA-"Sepharose 4B"® eller 405B.33.3 "Sepharose 4B"® eller 406A.23.7 "Sepharose 4B"®. De to sidstnævnte antistoffer er rettet mod det andet kringleområde i t-PA. Efter 10 forsigtig omrøring i 2 timer ved 4eC hældes antistof-Sepharosen i en søjle, og der vaskes med PBS indeholdende 1 M NaCl og 0,1% "Synperonic"®, indtil UV-absorptionen ved 280 nm indicerer fravær af protein i eluatet. Søjlen elueres derpå med 0,2 M glycin-HC-puffer 15 pH 2,5. Fraktioner opsamles i rør indeholdende en neutraliserende mængde 1 M Tris. Fraktioner indeholdende de højeste amidolytiske aktiviteter, målt under anvendelse af fluorometeranalysen med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat, jf. M. Zimmerroann et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

20 USA 75, 750 (1978), hældes sammen.

Ved HPLC med omvendt, fase af det rensede FK2UPAB(BC) og K2UPAB(BC) på en "Nucleosil"® 300-5-C18-søjle med dimensionerne 4 x 110 mm viser en enkelt top hver ved eluering med en lineær gradient over 30 minutter startende med 70% 25 opløsning A bestående af vand indeholdende 0,1% trifluor-eddikesyre og 30% opløsning B bestående af acetonitril indeholdende 0,08% trifluoreddikesyre og sluttende med 40% A og 60% B. N-Terminalsekvenseringsanalyse af de første fem rester i de rensede proteiner resulterer i sekvensen 30 SYQGN for K2UPAB(BC) og SYQVI for FK2UPAB(BC), som er identisk med de sekvenser, der forventes ud fra DNA-se-kvenserne, som koder for de enkelte molekyler.

I DK 175483 B1

I 100 I

I Eksempel 25 I

I Aktivitetsanalyse af hybrldplasmlnogenaktlvatorer 1 nær- I

værelse eller fravær af fibrinogenfragmenter I

I 5 Her anvendes dobbeltrateanalysen beskrevet af Verheyen et I

I al., Thromb. Haemost. 48, 266 (1982), baseret på omdannel- I

I sen af plasminogen til plasmin ved hjælp af plasminogen- I

I aktivatoren, efterfulgt af reaktionen af plasmin med det I

I kromogene plasminsubstrat H-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-p- I

I 10 nitroanilid-dihydrochlorid. Analysen gennemføres i en I

I mikrotiterplade med 96 huller og med en "Titertek"® I

mikrotiterpladelæser. Hullerne indeholder 120-X μΐ 0,1 I

I mol/1 Tris/HCl-puffer ved pH 7,5 indeholdende 0,1% I

I "Tween"® 80, 20 μΐ Glu-plasminogen i en mængde på 1,3 I

I 15 μΐηοΐ/ΐ i ovennævnte Tris-puffer, 100 μΐ plasminsubstrat i I

en mængde på 0,7 mmol/1 i Tris-puffer, X μΐ prøve ved I

I kendt koncentration (X svarer til henholdsvis 10, 20, 40 I

I og 60 μΐ), eller urokinasestandard med defineret aktivitet I

I udtrykt i internationale enheder samt 10 μΐ stimulator I

20 (fibrinogenfragmenter) i en mængde på 3 mg/ml i destille- I

I ret vand eller 10 μΐ destilleret vand, hvis forsøgene skal I

gennemføres uden stimulator. Den forøgede lysabsorption I

I divideret med kvadratet på inkuberingstiden er I

I proportional med plasminogenaktivatoraktiviteten med en I

I 25 kendt aktivatorkoncentration og anføres i internationale I

I enheder. Urokinase med høj molekylvægt med en difineret I

I aktivitet udtrykt i internationale enheder (American I

I Diagnostics) er anvendt som standard. Hver plasminogen- I

I aktivator er blevet analyseret under Identiske betingelser I

I 30 i henholdsvis fravær og tilstedeværelse af fibrinogenfrag- I

I menter. Under disse betingelser er de opnåede forskelle I

med hensyn til aktiviteter et mål for stimuleringen af I

I plasminogenaktivatorerne ved hjælp af fibrinogenfragmen- I

I terne. Tabel 2 indeholder resultaterne af analysen, som I

I 35 viser mangel på stimulering for urokinasestandarden i I

I modsætning til den stimulering, som udøves af fibrinogen- I

DK 175483 B1 101 fragmenter på de nye plasroinogenaktivatormolekyler, som indeholder det katalytiske område fra urokinase. Selv om der mangler et eller flere af de ikke-katalytiske områder 5 F, G, Kl og K2 fra vævspiasminogenaktivator konstateres en stimulering med fibrinogenfragmenter for alle de testede hybridmolekyler.

Tabel 2

Plasmlnogenaktivator I. enh. stimuleret/ 10 I. enh. ikke-stimuleret u-PA-standard 1,0 FGK2UPAb(BC) 5,0 FK2UPAb(BC) 10,0 F2UPAb 6,0 15 FUPAB 3,6

Eksempel 26

MutantpiasminogenaktIvatorers blodkoagellyseringsaktivitet

Blodkoagellyseringsaktiviteter bestemmes under anvendelse 20 af analysen beskrevet af R.D. Philo og P.J. Gaffney, Thromb. Haemost. 45/ 107-109 (1981). En logaritmisk afbildning af lyseringstiden mod plasminogenaktivator-koncentrationen resulterer i en ret linie. Den specifikke aktivitet på en plasminogenaktivator bestemmes ved sammen-25 ligning med kurverne opnået med et standardpræparat af vævspiasminogenaktivator eller urokinase.

Kurverne for alle de målte aktivatorer har omtrentlig den samme hældning, hvilket indicerer en direkte sammenhæng mellem den tid, som kræves til blodkoagellysering og den 30 specifikke aktivitet. Da de forskellige plasminogenakti-vatorer ikke har den samme molekylmasse, må de specifikke aktiviteter udtrykkes i en molær koncentration i stedet for den sædvanlige vægtkoncentration for at der kan opnås

I DK 175483 B1 I

I 102 [

et brugbart kriterium for de forskellige molekylers I

I effektivitet. UK2TPAB(BC) viser sig at være i det mindste I

lige så aktivt som standard t-PA*en, hvorimod I

I 5 FGK2UPAB(BC) og FK2UPAb(BC) viser aktiviteter, som næsten I

I svarer til t-PA, men som er væsentligt større end I

I u-PA-standarden. K2UPAB(BC) viser sig at have en aktivitet, som er næsten identisk med u-PA-standarden. De ved analysen opnåede aktiviteter er anført i tabel 3.

10 Tabel 3 PIasminogenaktivator Blodkoagellyserlngsenh./pmol* t-PA-standard 23,6 UK2TPA(BC) 28,6 I u-PA-standard 13,2 15 FGK2UPAb(BC) 24,3 I FK2UPAB(BC) 20,7 I K2UPAB(BC) 10,4 FUPAb(BC) 2,7

I * Blodkoagellyseringsenheder er udtrykt i picomol t-PA

I 20. under anvendelse af molekylmassen af t-PA baseret på dens aminosyresekvens, og en specifik aktivitet på 400.000 I blodkoagellyseringsenh./mg.

I Eksempel 27 I Clearance for plasminogenaktivatormutantmolekyler fra I 25 kaniners kredsløb I 1. Mærkning I Alle mutantmolekyler mærkes radioaktivt med !25j ved I anvendelse af iodogenmetoden, jf. P. J. Fraker et al., I Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978).

DK 175483 B1 103

Til fjernelse af overskud af frit *25j affinitetsrenses mutantmolekylerne enten under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i eksempel 23 (PA'er med t-PA-B-kæden) 5 eller metoden beskrevet i eksempel 24 (PA'er med u-PA-B-kæden).

Der opnås sædvanligvis specifikke radioaktiviteter på 2-20 μΟί/μς protein. Homogenitet for de mærkede molekyler bedømmes ved hjælp af SDS-elektroforese efterfulgt af 10 røntgenstråleautoradiografi. I alle tilfælde migrerer mutantmolekylerne under ikke-reducerende betingelser som enkelte bånd og med Mr'er identiske med de ikke-mærkede proteiner.

2. Clearanceundersøgelser 15 Forsøgene gennemføres på New Zealand hvide kaniner med en vægt på 1,8-2,4 kg. Dyrene anæstetiseres subkutant med 1750 mg/kg "Urethan"® (Merck, Darmstadt, DE). Der gennemføres tracheotomi, og et plastrør indsættes i den externale halsåre og halspulsåren. 0,5 ml phosphatpufret 20 saltopløsning indeholdende ca. 300-500 ng mutant-PA injiceres i halsåren, og der udtages en række blodprøver å 2 ml over et interval på 60 minutter via halspulsåren.

Blodprøverne opsamles på citrat, centrifugeres straks ved 3000 o/m i 15 minutter, og plasmaet dekanteres. Alikvoter 25 fældes i 10% trichloreddikesyre, og de opnåede pellets tælles i en 7-tæller.

Sammenlignet med t-PA isoleret fra Bowes melanoma-celle-linien udviser mutantmolekylerne følgende halveringstider i kredsløbet.

I DK 175483 B1 I 104

Tabel 4 I

I Hybrid-PA Halveringstid (min) for cirkulerende I plasminogenaktivator I 5 t-PA 2 I UK2TPAb(BC) 20 FGK2UPAb(BC) 10 I FK2UPAb(BC) 10 I K2UPAb(BC) 30-40 10 Clearance-mønstret for t-ΡΑ er typisk bi-eksponentielt med I en meget hurtig a-faseeliminering efterfulgt af en lang- I sommere Ø-faseeliminering. Eliminering af UK2TPAb(BC) og I K2UPAb(BC) er næsten monofasisk, hvilket indicerer, at

fordeling til et andet område er undertrykt. I

I 15 3. Organfordeling

I Kaniner behandles som beskrevet ovenfor. 20 minutter efter I

I injektion af de iodmærkede mutantmolekyler aflives kani- I

I nerne, de store organer udtages, vejes, og efter homogeni- I

I sering tælles en alikvot i γ-tælleren. I

I 20 Tabel 5

I Udvundet radioaktivitet I

I t-ΡΑ UK2TPAb(BC) K2UPAb(BC) ' I

I lever 40 10 7 I

I hjerte <1 <1 <1 I

I 25 lunge <1 <1 < 1 I

I milt <1 <1 <1 I

I nyre 1,6 2 4 I

Mutant-PA'eme viser en større brøkdel af de radioaktive I

molekyler, der stadig forbliver i kredsløb (se ovenfor), I

DK 175483 B1 105 hvilket falder sammen med en meget nedsat lever-clear-• ance. Formindsket optagelse i leveren er derfor forklaringen på den forlængede halveringstid og det 5 monofasiske elimineringsmønster for mutantmolekylerne, især UK2TPAB(BC) og K2UPAB(BC).

I eksempel 28-34 anvendes plasmiderne pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPAB og pCGC8/FGK2UPAB (se eksempel 18) til at konstruere gærekspressionspiasmider. Gærinver-10 tasesignalsekvensen fusioneres i struktur til de forskellige kodningssekvenser. De udtrykkes under kontrol af den inducerbare PH05-promotor. I nogle konstruktioner er glycosyleringsstederne muteret.

Eksempel 28 15 Kloning af fag Fl-replikationsområdet til ekspressions-vektor PJDB207

Plasmider af pEMBL-familien, jf. Dente et al., Nucl.

Acids. Res. 11, 1645-1655 (1983), indeholder et område af fag Fl-genomet, som tilvejebringer alle cis-virkende 20 elementer til. DNA-replikation og morphogenese. Kun ved superinfektion med fag F1 (hjælper) udskilles store mængder enkeltstrenget plasmid-DNA til mediet.

Plasmid pEMBL19(+) spaltes med Seal og EcoRI. Der isoleres et 2,2 kb fragment, som indeholder en del af ampicillinre-25 sistensgenet fra pBR322 (Scal-sted), Fl-intérgenområdet og en del af Ø-galactosidasegenet op til polylinkerområdet (EcoRI-sted).

Plasmid pJDB207 lineariseres ved skæring med Hpal. 10 μg lineariseret plasmid spaltes delvis med 7,5 enh. EcoRI i 30 nærværelse af 0,1 mg/ml ethidiumbromid i 40 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 10 mM EDTA.

1,8 kb EcoRI-Hpal-fragmentet isoleres på en præparativ I DK 175483 B1

106 I

I O,8%'s agarosegel. I

I 3 μς Hpal-skåret pJDB207 spaltes yderligere med Seal. Det I

4,8 kb store Hpal-Scal-fragment isoleres. DNA-fragmenter 5 elektroelueres fra agarosegelblokkene, renses ved hjælp af I DE52-kromatografi og ethanolfældning.

I 0,2 pmol af henholdsvis 2,2 kb Scal-EcoRI-fragmentet og 1,8 kb EcoRl-Hpal-fragmentet og 0,1 pmol af Hpal-Scal- I vektorfragmentet ligeres. Ligeringsblandingen anvendes til I 10 transformering af kompetente Escherichia coli HB101 Ca^+- I celler.

Plasmid-DNA fra 12 ampicillinresistente kolonier analyse- I res ved EcoRI/PstI-dobbeltspaltning. DNA'et fra en enkelt I klon med de korrekte restriktionsfragmenter udtages og I 15 betegnes pJDB207FlLac.

I Eksempel 29

I Konstruktion af plasmid pJDB207/PHQ5-I-FK9UPAB

Kodningssekvensen for FK2UPAB som forekommer i plasmid I pCGC7/FK2UPAB tilpasses . til ekspression i gær ved I 20 fusionering af gærinvértasesignalsekvensen og ekspression af genet under kontrol af PH05-promotoren.

I Plasmid pCGC7/FK2UPAB (se eksempel 18D) spaltes med PstI

I og BamHI. 1147 bp PstI-BamHI-fragmentet indeholder I FK2UPAB-kodningssekvensen fra Pstl-stedet ved nucleotid- I 25 position 199 i t-PA (fig. 1) til BamHI-stedet ved position I 1322 i u-PA (fig. 3).

I Plasmid pJDB207/PH05-I-TPA (se eksempel 6C) skæres med I Sall og PstI. 891 bp fragmentet isoleres. Det indeholder I PH05-promotoren, invertasesignalsekvensen og 19 baser fra I 30 t-PA (Pstl-sted).

DK 175483 B1 107

Plasmid pJDB207/PH05-I-UPA (se eksempel 8) spaltes med Sall og BamHI. 6,6 kb vektorfragmentet indeholder 3'-delen af u-PA-genet fra BamHI-stedet ved nucleotidposition 1323 5 (fig. 3) til position 1441 (PvuII-stedet med tilsat Xhol-linker) og PH05-transskriptionstermineringssiqnalerne.

0,2 pmol af henholdsvis 891 bp Sall-Pstl-fragmentet og 1147 bp Pstl-BamHI-fragmentet og 0,1 pmol af 6,6 kb Sall-BamHI-vektorfragmentet ligeres og anvendes til 10 transformering af Escherichia eoli HB101 Ca^+-celler.

8 ampicillinresistente kolonier dyrkes i LB-medium indeholdende ampicillin (100 mg/1). Plasmid-DNA isoleres og analyseres ved EcoRI- og Hindlll-restriktionsspalt-ninger. Et plasmid med de forventede restriktionsfragmen-15 ter vælges og betegnes pJDB207/PH05-I-FK?UPAB.

Plasmider pCGC6/FUPAB og pCGC8/FGK2UPAB kan anvendes på samme måde som pCGC7/FK2UPAB. De dannede gærekspressions-plasmider betegnes henholdsvis pJDB207/PH05-I-FUPAB og pJDB207/PH05-I-FGK2UPAB.

20 Eksempel 30

Mutation af glycosyleringsstedet ved Γ Asn 302 1 i urokinase-B-kæden a) Kloning af et Pstl-BamHI-fragment fra u-PA til M13mpl8: 1 2 3 4 5 6

Plasmidet pJDB207/PH05-I-UPA (se eksempel 8) indeholder 2 det komplette kodningsområde for urokinase. DNA'et skæres 3 med PstI og BamHI. 886 bp Pstl-BamHI-fragmentet fra uroki- 4 nasegenet indeholder glycosyleringsstedet (Asn 302) ved 5 nucleotidpositioner 1033-1041. Et andet fragment med 6 lignende størrelse skæres yderligere med BstEII. 886 bp Pstl-BamHI-fragmentet isoleres på en præparativ 0,8%'s

I DK 175483 B1 I

I 108 I

I agarosegel. I

I M13mpl8 RF-DNA skæres med PstI og BamHI. 7,3 kb fragmentet I

I isoleres på en præparativ 0,8%’s agarosegel. DNA-fragmen- I

I 5 terne elektroelueres fra agarosegelen og renses ved kroma- I

I tografi på DE52 og fældning med ethanol. I

I 0,1 pmol af den 7,3 kb PstI-BamHI-skårne vektor og 0,2 I

I pmol af 886 bp Pstl-BamHI-u-PA-fragmentet ligeres. 1 μΐ og I

I 3 /il af ligeringsblandingen anvendes til transformation af I

I 10 Escherichia coli JM109 Ca^^-celler i henhold til håndbogen I

I "M13 cloning and sequencing handbook" udgivet af Amersham. I

I Der udtages 12 farveløse plaque, og der fremstilles I

I enkeltstrenget DNA, jf. J. Messing, Methods in Enzymology. I

I 101, 21-78 (1983). Det enkeltstrengede DNA anvendes til I

I 15 fremstilling af partielt dobbeltstrenget DNA ved annelle- I

I ring og forlængelse af M13-universalprimeren med Klenow- I

I polymerase. Reaktionsproduktet ekstraheres med phenol/ I

I chloroform, og DNA*et fældes med ethanol. DNA'et skæres I

I med PstI og BamHI. Et 886 bp fragment Indicerer, at u-PA- I

I 20 fragmentet er blevet klonet i M13mpl8-vektoren. En klon I

I analyseres yderligere, og den korrekte insert bekræftes I

I ved sekvensering. Klonen betegnes M13mpl8/UPA. I

I b) Mutation af glycosyleringsstedet ved Asn 302: I

I 302 I

I M13mpl8-insert: (AanjSer Thr I

I 25 ( "antisense"-streng) 3'----AAA CCT TTT CTC TTA AGA TGG CTG ATA.. .5' I

I mutageniserings- 5'-GGA AAA GAG CAA TCI ACC GAC-3' I

I primer W: I

muteret 5'... .TTT GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC TAT... 3' I

"sense"-streng: [UlD I

DK 175483 B1 109

sekvenseringsprimer: CTGCCCTCGATGTATAACG

967 985

Mutageniserings- og sekvenseringsprimeme fremstilles under anvendelse af phosphor amidi tmetoden, jf. M.H.

5 Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, red. H.G. Gassen og A. Lang, Ver lag Chemie, Weinheim, DE, på et synteseapparatur model 380B fra Applied Biosystem.

In vitro-mutagenese på enkeltstrenget templat-DNA 10 gennemføres som beskrevet af T.A. Kunkel, Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 82, 488-492 (1985). Uracilholdig enkeltstrenget templat-DNA fremstilles ved en vækstcyklus på Escherichia coli-stamme RZ1032 (dut”, ung”).

100 pmol af den mutagene oligonucleotidprimer W phospho-15 ryleres i 20 μΐ 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 20 enh. T4 polynucleotidkinase (Boehringer). Efter 30 minutter ved 37°C afbrydes reaktionen ved opvarmning til 70eC i 10 minutter.

0,3 pmol uracilholdig M13mpl8/UPA-templat-DNA inkuberes 20 med 10 pmol phosphoryleret mutagenisk oligodeoxyribonu-cleotidprimer W og 10 pmol M13 universal sekvenserings-primer i 30 μΐ 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2. Prøven opvarmes til 80eC og henstår til afkøling til stuetemperatur i et lille vandbad.

25 c) Forlængelses-ligeringsreaktion:

Til den ovenfor fremstillede annellerede prøve sættes 10 /il af en enzym-dNTP-blanding indeholdende 1 mM dNTP'er, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 400 enh. T4 DNA-ligase (Biolabs, 400 enh.//il) og 6 enh.

30 Klenow DNA-polymerase (Boehringer, 6 enh./μΐ). Inkubationen gen- I DK 175483 B1 I 110

nemføres ved 15"C natten over. I

d) Transformation af Escherichia coli BMH71-celler: I

I Ligeringsblandingen fortyndes til 200 /il med TE. 0,1 /ti, 1 I

5 /ti og 10 /il af extensions-ligeringsblandingen sættes til I

I kompetente Escherichia coli BMH71 Ca2+-celler (Kunkel, se I

I ovenfor). Efter 30 minutter på is udsættes cellerne for I

I varmechok i 3 minutter ved 42eC, hvorefter de holdes på I

is. Cellerne udplades med topagar og Escherichia coli I

I 10 JMlOl-indikatorceller. I

I 6 plague udtages og anvendes til inficering af Escherichia I

coli JM109. Fager isoleres fra supernatanten ved fældning I

I med PEG. Enkeltstrenget DNA fremstilles ved ekstraktion I

I med phenol og fældning med ethanol. Tempiat-DNA'er I

I 15 resuspenderes i TE. I

I Mutation af AAT-kodonet (Asn302) til CAA-kodonet (Gln302) I

I bekræftes for en klon ved DNA-sekvensbestemmelse med den I

I ovenfor anførte sekvenseringsprimer under anvendelse af I

I kædetermineringsmetoden, jf. F. Sanger et al., Proc. Nat. I

I 20 Acad. Sci. USA 74, 5453-5467 (1977). Mutationen bevirker I

I en Asn -» Gin-ændring i aminosyreposition 302 i u-PA, og I

I derved elimineres det eneste glycosyleringssted i uro- I

I kinase. W betegner mutationen af glycosyleringsstedet i I

I u-PA-B-kæden (Asn302-*Gln302). Den positive klon betegnes I

I 25 M13mpl8/UPA-W. I

I Eksempel 31 I

I Overføring af mutationen Γ gln302 ) i urokinase-B-kæden I

I til FK?UPAb-hybriden I

I Plasmid pJDB207/PH05-I-FK?UPAB spaltes med Sall og Xhol. I

I 30 2,2 kb SalI-Xhol-fragmentet isoleres, elektroelueres fra I

I agarosegelen, renses ved DE52-kromatografi og fældes i I

DK 175483 B1 111 ethanol. Dette DNA-fragment Indeholder to Mstl-steder i PH05-promotoren og u-PA-sekvensen. 3 /tg af 2,2 kb Sall-XhoI-fragmentet spaltes partielt med 3 enheder MstI i 5 10 minutter ved 37°C. Reaktionsprodukteme adskilles på en præparativ 0,8%'s agarosegel, og 1651 bp Sall-Mstl-frag-mentet isoleres og elektroelueres fra gelen. DNA-fragmen-tet indeholder Sall-BamHI-sekvensen fra pBR322, PH05-pro-motoren, invertasesignalsekvensen og FK2UPAB-kodnings-10 sekvensen op til Mstl-stedet i u-PA-delen ved nucleotid-position 935.

RF-DNA fremstilles for Ml3mpl8/UPA-W (se eksempel 30) ved hjælp af den hurtige DNA-isoleringsmetode, jf. D.S. Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193-197 (1981). 5 /tg DNA 15 spaltes med BamHI og MstI. Efter tilsætning af 2 μg RNase (Serva) og inkubering i 5 miunutter ved 37eC isoleres 387 bp Mstl-BamHI-fragmentet på en præparativ 0,8%'s agarosegel. DNA-fragmentet elektroelueres og fældes i ethanol. Fragmentet indeholder mutationen AAT -* CAA ved 20 nucleotidpositioner 1033-1035 (Asn302 -» Gin) i urokinase-B-kæden.

Plasmid pJDB207/PHO5-I-UPA skæres med Sall og BamHI. 6,6 kb-vektorfragmentet (se eksempel 29) isoleres. 0,2 pmol af 1651 bp Sall-Mstl-fragmentet, 0,2 pmol af 387 bp MstI-25 BamHI-fragmentet og 0,1 pmol af 6,6 kp S al I-BamHI-vektorfragmentet ligeres. Kompetente Escherichia coli HB101 Ca2+-celler transformeres. 1 ampicillinresistente transformanter dyrkes. Plasmid-DNA Isoleres og analyseres ved restriktionsspaltninger 30 med EcoRI og Hindlll. Mutationen (W) ved glycosyle-ringsstedet ødelægger EcoRI-stedet ved nucleotidpostioner 1032-1037. Tilstedeværelsen af mutationen bekræftes ved DNA-sekvensering. Et plasmid-DNA med mutationen i u—PA-B-kæden betegnes pJDB207/PH05-I-FK?UPAB-W. Dette plasmid 35 har et intakt glycosyleringssted i kringle K2 men mutant-

I DK 175483 B1 I

I 112 I

stedet W (Asn302 Gin) 1 u-PA-B-kæden. I

I PIasmider pJDB207/PH05-I-FUPAB-W og I

I pJDB207/PHQ5-I-FGK?UPAB-W I

I 5 konstrueres på samme måde ud fra de tilsvarende I

I ikke-muterede plasmider (se eksempel 29). I

I 4,8 kb Sall-Hpal-vektordelen af pJDB207/PH05-I-FK2UPAB-W I

erstattes med 6,2 kb Sall-Hpal-vektorfragmentet af I

I pJDB207FlLac (se eksempel 28). 6,2 kb fragmentet har et I

I 10 1,4 kb FILac-insert fra pEMBL19 klonet i 4,8 kb fragmen- I

I tet fra pJDB207. Efter ligering, transformering og analyse I

af den nye konstruktion betegnes et korrekt plasmid med I

FILac-insertet pJDB207FlLac/PH05-I-FK?UPAB-W. I

I Plasmid pJDB207FlLac/PH05-I-FGK2-UPAB-W fremstilles på I

I 15 samme måde. I

I På samme måde ombyttes 4, 8 kb sall-Hpal vektordelen af I

I pJDB207/PH05-I-MQU-K?,TPAB (se eksempel 15C) med 6,2 kb I Sall-Hpal vktorfragmentet af pJDB207FlLac. Det dannede I plasmid betegnes pJDB207FlLac/PH05-I-UK^TPAB. Plasmider

I 20 pJDB207FlLac/PH05-I-UK2UPAB, pJDB207FlLac/PH05-I-TPAA-UPAB

og pJDB207FlLac/PH05-I-UPAATPAB fås på samme måde ud fra I plasmider uden FILac-vektorfragmentet.

Eksempel 32 I Mutation af glycosyleringsstedet [ Asnl84GlySer ] i kringle

I 25 K? af FK?UPAb-W

I a) Fremstilling af enkeltstrenget templat: I Plasmid pJDB207FlLac/PH05-I-FK2UPAB-W anvendes til at I transformere kompetente Escherichia coli RZ1032 Ca2+-cel- I ler jf. T.A. Kunkel, se ovenfor. En ampicillinresistent I 30 koloni, dyrkes i LB-medium tilsat 100 ftg/ml ampicillin, DK 175483 B1 113 20 jig/ml thymidin og 20 Mg/ml desoxyadenosin. Ved en celletæthed på 1 x 108/ml samles cellerne, vaskes 1 LB-medlum og resuspenderes i LB-medium Indeholdende 100 5 /tg/ml ampiclllln og 0,25 /ig/ml uridin. Ved en 0D600“værdi på 0,3 tilsættes hjælperfag R408 (Pharmacia-PL Biochemicals, Inc.) ved et m.o.i. på 20. Kulturen rystes kraftigt i 5 timer ved 37®C. Det uracilholdige enkeltstrengede DNA i mediet isoleres som beskrevet af T.A.

10 Kunkel (se ovenfor). Ud fra pEMBL19( + ) (se eksempel 28) klones Fl-området i pJDB207 iorienteringen mod uret. Det isolerede enkeltstrengede DNA er "sense"-strengen af FK2UPAB-insertet i ekspressionspiasmidet.

b) Mutation af glycosyleringsstedet ved Asnl84 i 15 kringle K2 i t-PA:

Mutationen angår den tredje position af konsensusamino-syregenkendelsessekvensen for glycosylering. Serl86 ombyttes med Ala.

181) 1 B 6 SS DNA: Asn Oly I Ser| 20 ( "sense"-streng) 5*-...GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT...-3’ mutageniseringsprimer Y: 3'- CC TTA CCC CGT cgg ATG -5' muteret "sense"-streng: 5’-.. .GGG AAT GGG GCA GCC TAC CGT.. .-3'

Asn GlyIAla| 5’-CCACGGGAGGCAGGAGG-3 sekvenseringsprimer: ® 7*5

Mutationen gennemføres som beskrevet i eksempel 30. I 25 stedet for M13 universalsekvenseringsprimeren anvendes en PH05-oligonucleotidprimer med formlen 5'-AGTCGAGGTTAGTATGGC-3 *, som hybridiserer til nucleo-

I DK 175483 B1 I

I 114 I

I tider -60 til -77 fra ATG'en i PH05-promotoren. Efter I

I forlængelsen og ligeringsreaktionen transformeres I

I kompetente Escherichia coli BMH71 CA2+-celler, jf. I

I 5 Kunkel, se ovenfor. Ampicillinresistente kolonier udtages I

I og dyrkes i LB-medium indeholdende 100 mg/1 ampicillin. I

I Plasmid-DNA fremstilles og analyseres for tilstedeværelse I

af mutationen ved DNA-sekvensering. Mutation af TCA-kodo- I

I net til GCA resulterer i en Ser -» Ala-ændring i aminosyre- I

I 10 position 186 i t-PA. Mutationen i den tredje position af I

konsensussekvensen eliminerer glycosyleringsstedet. En I

I klon med det muterede DNA betegnes pJDB207FlLac/PH05-I- I

I FK2UPAB-WY. I

I Y betegner mutationen af glycosyleringsstedet ved Asnl84 i I

I 15 K2 i t-PA, og W betegner mutationen ved Asn302 i u-PA-B- I

I kæden. Det dannede ikke-glycosylerede FK2UPAB-hybrid- I

I protein har to aminosyreændringer: Serl86 -» Ala i t-PA- I

I kringle K2 og Asn302 -> Gin i u-PA-B-kæden. I

I Den analoge mutation af plasmid pJDB207FlLac/PH05-I- I

I 20 FGK2UPAB-W (se eksempel 31) fører til plasmid I

I pJDB207FlLac/PH05-I-FK2-UPAB-WY, som koder for et ikke- I

I glycosyleret FGK2UPAB-hybridprotein. I

I Eksempel 33 I

I Konstruktion af plasmid pJDB207/PH05-I-K2UPAB-WY I

I 25 Nucleotidsekvensen, som koder for hybrid K2UPAB-proteinet I

I som defineret ved aminosyresekvensen tPA(Serl-Gln3)- I

I (Glyl76-Arg275)-uPA(Ilel59-Leu411) er indeholdt i plasmid I

I pCGC5/K2UPAB. Til ekspression i gær anvendes den I

I inducerbare PH05-promotor, og invertasesignalsekvensen I

I 30 fusioneres i struktur til K2UPAB-kodningsområdet. Plasmid I

I pCGC5/K2UPAB skæres med Bglll og AccI. 487 bp Bglll-Accl- I

I fragmentet isoleres. Det indeholder kodningssekvensen fra I

I Bglll-stedet i t-PA (nucleotidposition 178) til Accl-ste- I

DK 175483 B1 115 det i u-PA (nucleotidposition 779). Fragmentet skæres ved Hphl, hvorved der dannes fire fragmenter.

To oligodesoxyribonucleotider med formlen

Asn I Ala I

(I) 5' -CTGCATCTTACCAAGGAAACACTGACTGCTACTTTGGGAATGGGGCAGCCTACCGTGGCACG-3* (II) 3'- AGAATGGTTCCTTTGTCACTGACGATGAAACCCTTACCCCGTCGGATGGCACCGTG -5'

syntetiseres under anvendelse af phosphoramiditmetoden på et synteseapparatur fra Applied Biosystem, model 380B. Oligonucleotideme I og II danner en dobbeltstrenget DNA-10 linker. De 5 nucleotider ved den skrå 5'-ende er delt af gærinvertasesignalsekvensen, efterfulgt af t-PA-kodnings-sekvensen (Serl-Gln3)(Glyl76-Thrl91) til det første Hphl-skæringssted ved nucleotidposition 752 (se fig. 1). Glycosyleringsstedet ved position 729-737 (AsnGlySer) er 15 muteret i den syntetiske sekvens fra TCA (Ser) til GCA

(Ala), hvorved glycosyleringsgenkendelsessekvensen er elimineret. Mutationen af glycosyleringsstedet ved amino-syrepositioner 184-186 i t-PA (f.eks. det andet glyco-syleringssted i ægte t-PA) betegnes Y.

20 Oligonucleotider I og II phosphoryleres ved 5'-enderne, opvarmes i 10 minutter ved 85eC og annelleres under afkøling til stuetemperatur. 10,5 #ig (270 pmol) kinase-behandlede, dobbeltstrenget linker-DNA ligeres ved et 30-dobbelt molært overskud til HphI-skårne DNA-fragmenter (se 25 ovenfor) som beskrevet i eksempel 8B. Overskud af linker-molekyler fjernes ved fældning med isopropanol. DNA'et spaltes endvidere med Seal. 252 bp-fragmentet isoleres på en præparativ 1,5%'s agarosegel, elektroelueres og fældes i ethanol. 1

Plasmid p31RIT-12 (se eksempel 6B) spaltes med Sall og Xhol. Det isolerede fragment spaltes endvidere med Hgal (se eksempel 6C) og BamHI. Det dannede 591 bp BamHI-Hgal-

I DK 175483 B1 I

I 116 I

I fragment isoleres. Det indeholder PH05-promotoren og I

I invertasesignalsekvensen. I

I Plasmid pJDB207/PH05-I-FK2UPAB-W spaltes med BamHI. 5 μg I

I 5 af det lineære DNA spaltes partielt med 10 enh. Seal i 10 I

minutter. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 10 mM I

I EDTA. 7,7 kb BamHI-Scal-vektorfragmentet isoleres, I

elektroelueres og fældes i ethanol. Det indeholder I

I 3'-delen af kodningssekvensen fra Seal-stedet i t-PA I

I 10 (position 953) til enden af u-PA-B-kæden (PvuII-sted ved I

I position 1441 med adderet Xhol-linker), PH05-terminator- I

I og pJDB207-vektorsekvenserne. 0,2 pmol af henholdsvis 591 I

I bp BamHI-Hgal-fragmentet og det 252 bp (linker)-Seal- I

I fragment med klæbrige ender og 0,1 pmol af 7,7 kb I

I 15 vektorfragmentet ligeres. Efter transformation af I

I Escherichia coli HB101 Ca^-celler dyrkes 12 ampicillin- I

I resistente kolonier. Plasmid-DNA isoleres og analyseres I

I ved spaltning med EcoRI og Hindlll. Tilstedeværelsen af I mutationerne bekræftes ved DNA-sekvensering. En korrekt I 20 klon vælges og betegnes pJDB207/PH05-I-K9-UPAB-WY. Glyco- I syleringsstederne i kringle K2 i t-PA og i u-PA-B-kæden er I begge muteret (henholdsvis Y og W).

Det dannede ikke-glycosylerede K2UPAB-hybridprotein har to I aminosyreændringer: Ser 186 -* Ala i t-PA-K2-området og I 25 Asn302 -» Gin i u-PA-B-Kæden.

I Eksempel 34 I Mutation af glycosyleringsstederne |Ά5η184Θ1γ56Γ 1 og I Γ Asn448ArqThr 1 i UK7TPAB-hybriden

Uracilholdig enkeltstrenget tempiat, jf. T.A. Kunkel, se I 30 ovenfor, af plasmid pJDB207FlLac/-PHO5-I-UK2TPAB (se I eksempel 31) fremstilles som beskrevet i eksempel 30.

I Mutationsskemaet for glycosyleringsstedet ved Asnl84 er I som beskrevet i eksempel 32. Mutationen af glycosylerings- DK 175483 B1 117 stedet ved Asn448 resulterer i en Thr450 -» Ala-aminosyre-ændring.

h s e JlL% enkelt strenget DNA: Asn ArelThr | 5 ( "sense"-streng) 5'-...CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC A. ..-3' mutageniseringsprimer 2: 3'-...GAA TTG TCT CGI CAG TGG CTG T...-5* muteret "sense"-streng: 5'-...ctt aac AGA GCA GTC ACC GAC A...-3'

Asn ArgjAla) , . . 5’-TGGCAGGCGTCGTGCAA-3' sekvenseringsprimer: · · 1603 1587

Mutationsmetoden er beskrevet i eksempel 30. De phosphor-10 ylerede mutagen!seringsprimere Y og Z annelieres begge til det uracilholdige, enkeltstrengede templat af pJDB2Q7FlLac/PH05-I-UK?TPAB. Yderligere anvendelse af PH05-oligonucleotidprimeren (se eksempel 32) er valgfri.

Efter forlængelses- og ligeringsreaktionen transformeres 15 kompetente Escherichia coli BMH71 Ca2+-celler. Plasmid-DNA fra ampicillinresistente transformanter fremstilles og analyseres for tilstedeværelse af de to mutationer ved DNA-sekvensering med de angivne sekvenseringsprimere.

Plasmid-DNA fra en klon med begge mutationer betegnes 20 pJDB207FlLac/PH05-I-UK2TPAB-YZ. Y betegner mutationen af glycosyleringsstedet ved Asnl84, og Z betegner mutationen ved Asn448. Det ikke-glycosylerede UK2TPAB-hybridprotein • har to aminosyreændringer: Serl86 -* Ala i K2-kringle i t-PA og Thr450 -» Ala i t-PA-B-kæden. 1

Mutationsmetoden er også anvendelig for templater af pJDB207FlLac/PH05-I-UK2UPAB, pJDB207FlLac/PH05-I-TPAAUPAB og pJDB207FlLac/PH05-I-UPAATPAB (se eksempel 31)

I DK 175483 B1 I

I 118 I

I med mutagenlserlngsprlmer W til mutering af glycosyle- I

I ringsstedet i u-PA-B-kæden og/eller mutageniseringsprimere I

I Y og Z og andre publiceret i europæisk patentansøgning nr. I

I 5 225.286 til muteringen af glycosyleringsstederne i t-PA. I

I Eksempel 35 I

I Transformation af Saccharomyces cerevisiae GRF18 og I

I fremstilling af garcelleekstrakter I

I Plasmideme pJDB207/PH05-J-FK2UPAB, I

I pJDB207FILac/PH05-I-FK 2 UPAB-W. I

I PJDB207FlLac/PH05-I-FK2UPAB-WYt I

I pJDB207FlLac/PH05-I-UK2TPAB, I

I PJDB207FlLac/PH05-I-UK2TPAB-YZ. I

I PJDB207/PH05-I-K2UPAB-WY. I

I pJDB207/PH05-I-FUPAB. I

I pJDB207/PH05-I-FUPAB-W. I

I pJDB207/PH05-I-FGK2UPAB. I

I p JDB207 / PH05-I-FGK?. UPAB-W. I

I pJDB207FlLac/PH05-I-FGK2UPAB-W og I I

I PJDB207FlLac/PH05-I-FGK2UPAB-WY I

I 10 transformeres til Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 I

I (DSM 3665). Transformationen, celledyrkningen og frem- I

I stillingen af celleekstrakter er beskrevet i eksempel 16. I

I De dannede hybridpiasminogenaktivatorer kan renses på I

I samme måde som beskrevet 1 eksempel 22 til 24. I

I I

I 15 Eksempel 36 I

I Fremstilling af lyoflliserede hybrldplasminogenaktiva- I

I torer I

I Opløsningen fremstillet i et af eksemplerne 22-24 renses I

I og lyofiliseres yderligere på følgende måde: I

DK 175483 B1 119

Opløsningen fortyndes med 10 rumfang 0,1 M ammoniumacetat pH 5,0 (samlet rumfang 80 ml) og sættes på en søjle indeholdende 5 ml CM-"Sepharose"® Fast Flow (Pharmacia) med en 5 strømningshastighed på 25 ml/t ved stuetemperatur. (Søjlen er blevet præækvilibreret med 0,1 M ammoniumacetat). Det produktfri percolat kasseres. Søjlen vaskes med 15 ml 0,1 M ammoniumacetat pH 5,0 og med 10 ml 0,1 M ammoniumacetat pH 7,0. Eluering af det absorberede hybrid-PA gennemføres 10 derefter med en 1 M ammoniumacetat pH 8,6 ved stuetemperatur (strømningshastighed 5 ml/t). For at forhindre gasdannelse på søjlen gennemføres elueringen ved et overtryk på 1-1,5 bar. Hybrid-PA-indholdet i eluatet måles ved hjælp af en UV-monitor (280 nm). En fraktion indeholdende 15 ca. 90% af det eluerede hybrid-PA samles og underkastes lyofilisering. Renheden af det faste hybrid-PA-lyofilisat er ca. 95% eller derover bedømt ved hjælp af HPLC. Produktet indeholder ikke detergenter.

Eksempel 37 20 Første farmaceutiske præparat til parenteral Indgift

En opløsning indeholdende ren uPA(1-44)-tPA(176-527) fremstillet som beskrevet ovenfor dialyseres mod 0,3 molær natriumchlorid indeholdende 0,01% "Tween 80”® og opbevares ved -80'C. Inden administrationen indstilles koncentratio-25 nen på 75 #tg/ml total PA og 0,3 M NaCl. Opløsningen steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 μτα membranfilter .

I stedet for det ovenfor anførte PA er det også muligt at anvende den samme mængde af en anden PA beskrevet i de fo-30 regående eksempler, såsom f.eks. uPA(1-158)-tPA(276-527), uPA( 1-131)-tPA(263-527), tPA(l-275)-uPA(159-411), tPA(l-262)-uPA(132-411), uPA(l-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411), tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-uPA(134-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411),

120 I

DK 175483 B1 I

tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411), I

tPA(l-3)-tPA(l76-275)-uPA(159-411), I

tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) eller I

tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(l32-411), I

eller en mutanthybrid-PA, såsom f.eks. I

tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), I

tPA(l-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), I

uPA(1-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527), I

tPA(1-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411) eller I

tPA(l-86)-tPA(l76-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411). I

Eksempel 38 I

Andet farmaceutisk præparat til parenteral indgift I

5 (dispersion til injektion) I

169,3 mg sojabønnelecithin (sojabønnephosphatid NC 95, I

producent: Nattermann, Køln, DE, renhed 90-96%, fedt- I

syresammensætning: linolsyre 61-71%, linolensyre 4-7%, I

oliesyre 6-13%, palmitinsyre 10-15%, stearinsyre 1,5-3,5%) I

10 og 92,7 mg rent natriumglycocholat opløses i 752,5 ml I

sterilt vand. Opløsningen indstilles på pH 7,4 med IN I

natriumhydroxidopløsning. Der tilsættes 10 mg lyofiliseret I

uPA(1-44)-tPA(176-527). Blandingen omrøres til dannelse I

af en klar opløsning. Opløsningen steriliseres ved filtre- I

15 ring gennem et 0,22 μτα membranfilter og fyldes i ampuller. I

I stedet for den ovenfor omtalte PA er det også muligt at I

anvende den samme mængde af en anden PA beskrevet i de fo-

regående eksempler, såsom f.eks. uPA(1-158)-tPA(276-527), I

uPA(1-131)-tPA(263-527), tPA(l-275)-uPA(159-411) , I

tPA(l-262)-uPA(132-411), uPA(l-44)-tPA(l76-261)-uPA(134-411), I

tPA(l-49)-t?A(262-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-uPA(l34-411), I

tPA(l-49)-tPA(l76-275)-uPA(159-411), I

tPA(l-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411) , I

tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411),

tPA(1-86)-tPA(176-27 5)-uPA(159-411) eller I

tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411), I

DK 175483 Bl 121 eller en mutanthybrid-PA, såsom f.eks.

tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), tPA(1-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411), uPA(l-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527), tPA(l-3)-tPA( 176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411) eller tPA(l-86)-tPA(l76-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411).

Eksempel 39

Tredje farmaceutiske præparat til parenteral indgift 5 (Inklusive bolusinjektion) 100 mg af hybridpiasminogenaktivatoren eller mutanthybrid-plasminogenaktivatoren, såsom en af de i eksempel 37 og 38 anførte, opløses i 1000 ml 50 mM glutaminsyre/natriumglu-tamat indeholdende 0,7% NaCl, pH 4,5. Opløsningen fyldes i 10 ampuller og kan anvendes til intravenøs (bolus) infusion.

Deponering af mikroorganismer

Nedenstående stammer er deponeret den 23. oktober 1987 i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" (DSM), Griesebach-strasse 8, 3000 Gottingen, DE: 15 Deponeringsnummer E. coli HB101/pW349F DSM 4291 E. coli HBl01/pCS16 DSM 4294 E. coli HBl01/pcUK176 DSM 4290 E. coli HB101/PCGA26 DSM 4296 20 E. coli HBl01/pSV2911neo DSM 4292

Nedenstående hybridomacellelinier er deponeret den 20. november 1987 ved "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, FR, (CNCM) med de anførte deponeringsbetegnelser: I DK 175483 B1

I 122 I

I hybridoma Deponeringsnummer I

I 405B.33.3 1-715 I

I 406A.23.7 1-716 I

I 5 407A.15.27 1-717 I

Claims (25)

1. Enkeltkædehydridplasminogenaktivator bestående af 5 a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående af for-10 bindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbin-delsessekvens bestående af subsekvenser af forbindelses sekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og hy-15 bridforbindelsessekvenserne omfatter et processe- ringssted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser 20 valgt fra gruppe bestående af {i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flankerer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et fragment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller 25 fragmentet deraf er positioneret i hybridplasmi- nogenaktivatoren N-terminalt til det humane t-PA-kringle-2-domæne, og . (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt 30 fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, b) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA-35 kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra I DK 175483 B1 I 124 I I gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som for- I I binder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindel- I sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I I human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående I I 5 af subsekvenser af forbindelsessekvenserne, hvor for- I I bindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenseme I I omfatter et processeringssted, som kan spaltes af I I . plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som I I kan danne en svovl-svovl-bro til det humane kataly- I I 10 tiske u-PA-domæne, I I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I I 15 rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse- I I kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2- I domænet i human t-PA, eller en fusioneret forbin- I I delsessekvens bestående af begge forbindelsesse- I I kvenser eller af fragmenter deraf, hvor forbindel- I I 20 sessekvensen eller den fusionerede forbindelsesse- I I kvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet og I I t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti- I I vatoren, og I 25 {ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I plasminogenaktivatoren, I 1 2 3 4 5 6 c) det humane t-PA- finger domæne, det humane t-PA- I 2 vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, I 3 det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindel- I 4 sessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2- I 5 domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor I 6 forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående I af den forbindelsessekvens, som forbinder A-kæden med I B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som for- I binder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy- I DK 175483 B1 125 bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af forbindelsessekvenseme, hvor forbindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenseme omfatter et proces-seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi-5 nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppen bestående af 10 (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke rer fingerdomænet i human· t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- 15 bindelsessekvens bestående af de to forbindelses sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindelsessekvenserne eller de fusionerede forbindelsessekvenser er positioneret mellem finger- og vækstfaktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, 20 (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flankerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-domænet i human t-

25 Pa, eller et fragment deraf, eller en fusioneret forbindelsessekvens bestående af de to forbindelsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindelsessekvenserne eller de fusionerede forbindelsessekvenser er positioneret mellem vækstfak- 30 tor- og kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti vatoren, og (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller frag- 35 mentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybridplasminogenaktivatoren. I DK 175483 B1 I I 126 I

2. Enkeltkædehybridplasminogenaktivator ifølge krav 1 I I valgt fra gruppen bestående af tPA{1-3)-tPA(176-275)- I I uPA(159-411) , tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) og I I tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411). I I 5 I

3. Enkeltkædehybridplasminogenaktivator ifølge krav 1 som I I er tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA{159-411). I

4. DNA-sekvens som koder for en enkeltkædehybridplasmino- I I 10 genaktivator betående af I I a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane kata- I I lytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der I I forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det I I 15 humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelses- I I sekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbin- I I delsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I I human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A- I I kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbin- I I 20 delsessekvens bestående af subsekvenser af forbindel- I I sessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og hy- I I bridforbindelsessekvenserne omfatter et processe- I I ringssted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt I I dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl- I I 25 bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, I I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppe bestående af I I (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flanke- I I 30 rer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et frag- I I ment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller frag- I I mentet deraf er positioneret i hybridplasminogen- I I aktivatoren N-terminalt til det humane t-PA-kring- I I le-2-domæne, og I I 35 I I (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I DK 175483 B1 127 deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, b) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA-. 5 kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som for-10 binder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindel sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af forbindelsessekvenserne, hvor for-bindelsessekvenseme og hybridforbindelsessekvenserne 15 omfatter et processeringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser 20 valgt fra gruppen bestående af (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flankerer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsessekvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-25 domænet i human t-PA, eller en fusioneret forbin delsessekvens bestående af begge forbindelsessekvenser eller af fragmenter deraf, hvor forbindelsessekvensen eller den fusionerede forbindelsessekvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomæ-30 net og t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogen- aktivatoren, og {ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet 35 deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- plasminogenaktivatoren, I DK 175483 B1 I I 128 I H c) det humane t-PA- finger domæne, det humane t-PA- I I vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, I det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindel- I sessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2- I I 5 domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor I I forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående I I af den forbindelsessekvens, som forbinder A-kæden med I I B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som I I . forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy- I I 10 bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af I I forbindelsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne I I og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et proces- I I seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi- I I nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- I I 15 svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, I I over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I I 20 rer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment I I deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt I I flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, I I eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I I bindelsessekvens bestående af de to forbin- I I 25 delsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor for- I I bindelsessekvenserne eller de fusionerede forbin- I I delsessekvenser er positioneret mellem finger- og I I vækstfaktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, I 1 2 3 4 5 6 (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flan- I 2 kerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et I 3 fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-ter- I 4 minalt flankerer kringle-2-domænet i human t-Pa, I 5 eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I 6 bindelsessekvens bestående af de to forbindel- I sessekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbin- I delsessekvenserne eller de fusionerede forbin- I delsessekvenser er positioneret mellem vækstfak- I DK 175483 B1 129 tor- og kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti-vatoren, og (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-termi-5 nalt fragment deraf, hvor T-regionen eller frag mentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybridplasminogenaktivatoren.

5. DNA-sekvens ifølge krav 4, som koder for en enkeltkæde-10 hybridplasminogenaktivator valgt fra gruppen bestående af tPA{1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176- 275)-uPA(159-411) og tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

6. DNA-sekvens ifølge krav 4, som koder for en enkeltkaede-15 hybridplasminogenaktivator som er tPA{l-3)-tPA(176-275) - uPA(159-411) .

7. Hybridvektor til anvendelse i en eukaryotisk vært, omfattende en DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehy- 20 bridplasminogenaktivator bestående af a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det 25 humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsesse kvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæ-den med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindel-30 sessekvens bestående af subsekvenser af forbindelses- sekvenserne, hvor forbindelsessekvenseme og hybrid-forbindelsessekvenseme omfatter et processerings-sted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro 35 til det humane katalytiske u-PA-domæne, og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppe bestående af I DK 175483 B1 I I 130 I I (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flan- I I kerer kringle-2-domsenet i human t-PA, eller et I I fragment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller I I fragmentet deraf er positioneret i hybridplasmi- I I 5 nogenaktivatoren N-terminalt til det humane t-PA- I I kringle-2-domæne, og I I (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I I 10 deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I I plasminogenaktivatoren, I I b) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA- I I kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne I I 15 og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane I I t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u- I I PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra I I gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som for- I I binder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindel- I I 20 sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I I human u-PÅ, og en hybridforbindelsessekvens bestående I I af subsekvenser af forbindelsessekvenserne, hvor for- I I bindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenserne I I omfatter et processeringssted, som kan spaltes af I I 25 plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som I I kan danne en svovl-svovl-bro til det humane kataly- I I tiske u-PA-domæne, I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I valgt fra gruppen bestående af I

30 I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse- I kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-do- I mænet i human t-PA, eller en fusioneret forbin- I 35 delsessekvens bestående af begge forbindelsesse- I kvenser eller af fragmenter deraf, hvor forbindel- I sessekvensen eller den fusionerede forbindelsesse- I kvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet og I DK 175483 B1 131 t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktiva-toren, og (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt 5 fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- plasminogenaktivatoren, c) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA-10 vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbin delsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle- 2-domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående 15 af den forbindelses sekvens, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy-I bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af I forbindelsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne I 20 og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et proces- I seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi- I nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- I svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, I over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I 25 valgt fra gruppen bestående af I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I rer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment I deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt I 30 flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, I eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I bindelsessekvens bestående af de to forbindel- I sessekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbin- I delsessekvenserne eller de fusionerede forbindel- I 35 sessekvenser er positioneret mellem finger- og I vækst faktordomænet i hybridplasminogenaktiva toren, I DK 175483 B1 I 132 I (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flan- I kerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et I I fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N- I H terminalt flankerer kringle-2-domænet i human t- I I 5 Pa, eller et fragment deraf, eller en fusioneret I forbindelsessekvens bestående af de to forbin- I H delsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor for- I bindelsessekvenserne eller de fusionerede forbin- I I delsessekvenser er positioneret mellem vækstfak- I I 10 tor- og kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti- I vatoren, og I (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-ter- I I minalt fragment deraf, hvor T-regionen eller frag- I I 15 mentet deraf er positioneret ved N-terminalen i I I hybridplasminogenaktivatoren. I

8. Hybridvektor ifølge krav 7 til anvendelse i en eukaryo- I I tisk vært, omfattende, en DNA-sekvens, som koder for en en- I I 20 keltkædehybridplasminogenaktivator valgt fra gruppen I I bestående af tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA{159-411), tPA(l- I I 49)-tPA(176-275)-uPA{159-411) og tPA(l-86)-tPA(176-275)- I I uPA(159-411). I I 25 9. Hybridvektor ifølge krav 7 til anvendelse i en eukaryo- - I I tisk vært, omfattende en DNA-sekvens, som koder for en en- I I keltkædehybridplasminogenaktivator som er tPA(l-3)- I tPA(176-275)-uPA(159-411). I

10. Eukaryotisk værtscelle transformeret med en hybrid- I vektor indeholdende en DNA-sekvens, som koder for en en- I keltkædehybridplasminogenaktivator bestående af I a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane kata- I 35 lytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der I forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det I humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsesse- I kvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindel- I DK 175483 B1 133 sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kaeden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af forbindel-5 sessekvenseme, hvor forbindelsessekvenserne og hy bridforbindelsessekvenserne omfatter et processe-ringssted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, 10 og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppe bestående af (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flankerer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et frag-15 ment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller frag mentet deraf er positioneret i hybridplasminogen-aktivatoren N-terminalt til det humane t-PA-kring-le-2-domæne, og 20 (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, 25 b) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA- kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra 30 gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som for binder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af forbindelsessekvenseme, hvor for-35 bindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenseme omfatter et processeringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som _;___ I DK 175483 B1 I 134 I I kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalyti- I I ske u-PA-domæne, I I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I I 5 I I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I I rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse- I I kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-do- I I mænet i human t-PA, eller en fusioneret forbin- I I 10 delsessekvens bestående af begge forbindelsesse- I I kvenser eller af fragmenter deraf, hvor forbindel- I I sessekvehsen eller den fusionerede forbindelses- I I sekvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet I I og t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti- I I 15 vatoren, og I I (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I I deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I I 20 plasminogenaktivatoren, I I c) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA- I I vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, I I det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindel- I I 25 sessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2- I I domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor I I forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående I I af den forbindelsessekvens, som forbinder A-kæden med I I B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som for- I I 30 binder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy- I I bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af I I forbindelsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne I I og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et proces- I I seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi- I I 35 nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- I svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, I I over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I DK 175483 B1 135 (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flankerer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt 5 flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, eller en fusioneret forbindelsessekvens bestående af de to forbindelsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindelsessekvenserne eller de fusionerede forbin-10 deIsessekvenser er positioneret mellem finger- og vækstfaktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, {ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flankerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et 15 fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-ter minalt flankerer kringle-2-domænet i human t-Pa, eller et fragment deraf, eller en fusioneret, forbindelsessekvens bestående af de to forbindelsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor for-20 bindelsessekvenseme eller de fusionerede forbin delsessekvenser er positioneret mellem vækstfaktor- og kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktivatoren, og 25 (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-ter minalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybridplasminogenaktivatoren.

11. Eukaryotisk værtscelle ifølge krav 10 transformeret med en hybridvektor omfattende en DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehybridplasminogenaktivator valgt fra gruppen 'bestående af tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) , tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) og tPA(l-86)-tPA(176-35 275)-uPA(159-411). 1 Eukaryotisk værtscelle ifølge krav 10 transformeret med en hybridvektor omfattende en DNA-sekvens, som koder I DK 175483 B1 I I 136 I I for en enkeltkædehybridplasminogenaktivator som er tPA(l- I I 3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) . I

13. Fremgangsmåde til fremstilling af en enkeltkædehybrid- I I 5 plasminogenaktivator bestående af I I a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane kata- I I lytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der I I forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det I I 10 humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelses- I I sekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbin- I I delsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I I human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A- I I kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbin- I I 15 delsessekvens bestående af subsekvenser af forbin- I I delsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og I I hybridforbindelsessekvenserne omfatter et processe- I I ringssted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt I I dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl- I I 20 bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, I I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppe bestående af I I (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flanke- I I 25 rer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et frag- I I ment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller frag- I I mentet deraf er positioneret i hybridplasminogen- I I aktivatoren N-terminalt til det humane t-PA-kring- I I le-2-domæne, og I I 30 I I {ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I I deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I I plasminogenaktivatoren, I I 35 I I b) det humane t-PA-finger domæne, det humane t-PA- I I kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne I I og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane DK 175483 B1 137 t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindel-5 sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i hu man u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af forbindelsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et processeringssted, som kan spaltes af 10 plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppen bestående af 15 (i) forbindelsessekvénsen, som C-terminalt flanke-I rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse- I kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-domæ- I net i human t-PA, eller en fusioneret forbindel- I 20 sessekvens bestående af begge forbindelsessekven- I ser eller af fragmenter deraf, hvor forbindelses- I sekvensen eller den fusionerede forbindelses- I sekvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet I og t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti- I 25 vatoren, og I (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I 30 plasminogenaktivatoren, I c) det humane t-PA-f ingerdomæne, det humane t-PA- I vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, I det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindel- I 35 sessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2- I domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor I forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående j I af den forbindelses sekvens, som forbinder A-kæden med I DK 175483 B1 I 138 B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som for- I I binder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy- I I bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af I I forbindelsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne I I 5 og hybridforbindelséssekvenseme omfatter et proces- I I seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi- I I nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- I I svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, I over eventuelt yderligere en eller, flere sekvenser I I 10 valgt fra gruppen bestående af I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I I rer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment I I deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt I I 15 flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, I I eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I I bindelsessekvens bestående af de to forbin- I I delsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor for- I I bindelsessekvenseme eller de fusionerede forbin- I I 20 delsessekvenser er positioneret mellem finger- og I I vækstfaktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, I I (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flan- I I _ kerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et I I 25 fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-ter- I I minalt flankerer kringle-2-domænet i human t-Pa, I I eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I I bindelsessekvens bestående af de to forbindelses- I I sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindel-*. I I 30 sessekvenserne eller de fusionerede forbindelses- I I sekvenser er positioneret mellem vækstfaktor- og I I kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktivatoren, I I og I I 35 (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-ter- I I minalt fragment deraf, hvor T-regionen eller frag- I I mentet deraf er positioneret ved N-terminalen i I I hybridplasminogenaktivatoren. I DK 175483 B1 139 ved hvilken man under egnede dyrkningsbetingelser dyrker en transformeret eukaryotisk vært, som indeholder en DNA-sekvens, der koder for hybridplasminogenaktivatoren, og isolerer hybridplasminogenaktivatoren. 5

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13 til fremstilling af en enkeltkædehybridplasminogenaktivator valgt fra gruppen bestående af tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l- j 49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) og tPA(l-86)-tPA{176-275)-10 uPA(159-411).

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13 til fremstilling af en enkeltkædehybridplasminogenaktivator som er tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA{159-411). I 15

16. Fremgangsmåde til fremstilling af en DNA-sekvens, som I koder for en enkeltkædehybridplasminogenaktivator beståen- I de af I 20 a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane kata- I lytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der I forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det I humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelses- I sekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbin- I 25 delsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A- I kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbin- I delsessekvens bestående af subsekvenser af forbin- I delsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og I 30 hybridforbindelsessekvenserne omfatter et processe- I ringssted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt I dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl- I bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I 35 valgt fra gruppe bestående af I (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flanke- I rer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et frag- I DK 175483 B1 I I' 140 I I ment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller frag- I I mentet deraf er positioneret i hybridplasminogen- I aktivatoren N-terminalt til det humane t-PA-kring- I I le-2-domæne, og I I 5 i I (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I I deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I I plasminogenaktivatoren, I I 10 I I b) det humane t-PA-finger domæne, det .humane t-PA- I I kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne I I og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane I I t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u- I I 15 PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra I I gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som for- I I binder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindel- I I sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I I human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående I I 20 af subsekvenser af forbindelsessekvenseme, hvor for- I I bindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenserne I I omfatter et processeringssted, som kan spaltes af I I plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som I I kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalyti- I I 25 ske u-PA-domæne, I I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I I 30 rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse- I kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-do- I I mænet i human t-PA, eller en fusioneret forbindel- I I sessekvens bestående af begge forbindelsessekven- I ser eller af fragmenter deraf, hvor forbindelses- I 35 sekvensen eller den fusionerede forbindelsesse- I kvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet og I t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktiva- I toren, og I DK 175483 B1 141 (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, 5 c) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA-vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2-10 domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående af den forbindelses sekvens, som forbinder A-kæderi med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy-15 bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af forbindelsessekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenseme omfatter et proces-seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-20 svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppen bestående af (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke-25 rer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, eller en fusioneret forbindelsessekvens bestående af de to forbindelses-30 sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbin delsessekvenserne eller de fusionerede forbindelsessekvenser er positioneret mellem finger- og vækstfaktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, 1 (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flan kerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-domænet i human t-Pa, I DK 175483 B1 I 142 I eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I I bindelsessekvens bestående af de to forbindelses- I I sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbin- I delsessekvenserne eller de fusionerede forbindel- I I 5 sessekvenser er . positioneret mellem vækstfaktor- I I og kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktivato- I I ren, og I (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-termi- I I 10 nalt fragment deraf, hvor T-regionen eller I I fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen I I i hybridplasminogenaktivatoren. I I ved hvilken man kemisk syntetiserer DNA'et eller fremstil- I I 15 ler fragmenter, som koder for polynucleotid-subsekvenser I I af u-PA- og t-PA- cDNA, og religerer dem i forudbestemt I I rækkefølge, eventuelt under anvendelse af et eller flere I trin. I

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16 til fremstilling af en I DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehybridplasminogen- I I aktivator valgt fra gruppen bestående af tPA(l-3)-tPA(176- I 275)-uPA{159-411), tPA(l-49)-tPA{176-275)-uPA(159-411) og I I tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA{159-411). I

25 I

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16 til fremstilling af en I I DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehybridplasminogen- I I aktivator som er tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411). I I 30 19. Fremgangsmåde til fremstilling af en hybridvektor til I anvendelse i en eukaryotisk vært, omfattende en DNA-se- I I kvens, som koder for en enkeltkædehybridplasminogenaktiva- I I tor bestående af I I 35 a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane kata- I I lytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der I I forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det I I humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsesse- I DK 175483 B1 143 kvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæ-den med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindel-5 sessekvens bestående af subsekvenser af forbindelses sekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et processerings-sted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro 10 til det humane katalytiske u-PA-domæne, og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppe bestående af (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flanke- 15 rer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et fragment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller fragmentet deraf er positioneret i hybridplasmino-genaktiva toren N-terminalt til det humane t-PA-kringle-2-domæne, og 20 (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, 25 b) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-30 PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående 35 af subsekvenser af f orbindelsessekvenseme, hvor forbindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenseme omfatter et processeringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som I DK 175483 B1 I 144 I I kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalyti- I I ske u-PA-domæne, I og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I I 5 I (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse- I I kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-domæ- I net i human t-PA, eller en fusioneret forbinde!- I 10 sessekvens bestående af begge forbindelsessekven- I I ser eller af fragmenter deraf, hvor forbindelses- I I sekvensen eller den fusionerede forbindelsesse- I I kvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet og I I t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktiva- I I 15 toren, og I I <ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt I fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet I deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid- I I 20 plasminogenaktivatoren, I c) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA- I I vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, I I det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindel- I I 25 sessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2- I I domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor I I forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående I af den forbindelsessekvens, som forbinder A-kæden med I I B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som for- I I 30 binder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy- I I bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af I I forbindelsessekvenseme, hvor forbindelsessekvenserne I I og hybridforbindeIsessekvenserne omfatter et proces- I seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi- I 35 nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- I I svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, I over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I DK 175483 B1 145 (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flankerer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, 5 eller et fragment deraf, eller en fusioneret for bindelsessekvens bestående af de to forbindelses- · sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindelsessekvenserne eller de fusionerede forbindelsessekvenser er positioneret mellem finger- og vækst-10 faktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flankerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-ter- 15 minalt flankerer kringle-2-domænet i human t-Pa, eller et fragment deraf, eller en fusioneret forbindelsessekvens bestående af de to forbindelsessekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindelsessekvenserne eller de fusionerede forbindel-20 sessekvenser er positioneret mellem vækstfaktor- og kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktivatoren, og {i ii) T-regionen fra human t-PA eller et N-ter-25 minalt fragment deraf, hvor T-regionen eller frag mentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybridplasminogenaktivatoren. ved hvilken man forbinder DNA-segmenterne, som indeholder 30 den eukaryotiske promotor, kodningsregionen for hybridplasminogenaktivatoren, 3 '-flankeringssekvensen fra et eukaryotisk gen og vektor-DNA'et. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 19 til fremstilling af en 35 hybridvektor til anvendelse i en eukaryotisk vært, omfattende en DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehy-bridplasminogenaktivator valgt fra gruppen bestående af I DK 175483 B1 I I 146 I I tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176- I I 275)-uPA(159-411) og tPA(l-86)-tPA(175-275)-uPA{159-411). I

21. Fremgangsmåde ifølge krav 19 til fremstilling af en I I 5 hybridvektor til anvendelse i en eukaryotisk vært, om- I I fattende en DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehy- I I bridplasminogenaktivator som er tPA(l-3)-tPA(176-275)- I I . UPA(159-411). I I 10 22. Fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret eu- I I karyotisk celle transformeret med en hybridvektor om- I I fattende en DNA-sekvens, som koder for en enkeltkædehy- I bridplasminogenaktivator bestående af I I 15 a) det humane t-PA-kringle-2-domæne, det humane kata- I I ly tiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, der I I forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det I I humane katalytiske u-PA-domæne, hvor forbindelsesse- I I kvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindel- I I 20 sessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i I I ' human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A- I I kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbin- I I delsessekvens bestående' af subsekvenser af forbindel- I I ses sekvenserne, hvor forbindelsessekvenserne og hy- I I 25 bridforbindelsessekvenserne omfatter et processe- I I ringssted, der kan spaltes af plasmin, og N-terminalt I I dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl- I I bro til det humane katalytiske u-PA-domæne, I I og eventuelt yderligere en. eller flere sekvenser I I 30 valgt fra gruppe bestående af I I (i) forbindelsessekvensen som N-terminalt flanke- I I rer kringle-2-domænet i human t-PA, eller et frag- I I ment deraf, hvor forbindelsessekvensen eller frag- I I 35 mentet deraf er positioneret i hybridplasminogen- I I aktivatoren N-terminalt til det humane t-PA-kring- I I le-2-domæne, og I DK 175483 B1 147 (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, 5 b) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA-kringle-2-domæne, dét humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindelsessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2-domæne med det humane katalytiske u-10 PA-domæne, hvor forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående af forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human t-PA, forbindelsessekvensen, som forbinder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hybridforbindelsessekvens bestående 15 af subsekvenser af forbindelsessekvenserne, hvor for bindelsessekvenserne og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et processeringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-terminalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl-svovl-bro til det humane katalyti-20 ske u-PA-domæne, og eventuelt yderligere en eller flere sekvenser valgt fra gruppen bestående af (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke-25 rer fingerdomænet i human t-PA, forbindelsesse kvensen, som N-terminalt flankerer kringle-2-domænet i human t-PA, eller en fusioneret forbindelsessekvens bestående af begge forbindelsessekvenser eller af fragmenter deraf, hvor forbindelses-30 sekvensen eller den fusionerede forbindelsesse kvens er positioneret mellem t-PA-fingerdomænet og t-PA-kringle-2-domænet i hybridplasminogenakti-vatoren, og 1 (ii) T-regionen af human t-PA eller et N-terminalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybrid-plasminogenaktivatoren, I DK 175483 B1 I I 148 I c) det humane t-PA-fingerdomæne, det humane t-PA- I I vækstfaktordomæne, det humane t-PA-kringlé-2-domæne, I I det humane katalytiske u-PA-domæne og en forbindel- I I 5 sessekvens, som forbinder det humane t-PA-kringle-2- I I domæne med det humane katalytiske u-PA-domæne, hvor I I forbindelsessekvensen er valgt fra gruppen bestående I I af den forbindelsessekvens, som forbinder A-kæden med I I B-kæden i human t-PA, forbindeIsessekvensen, som for- I I 10 binder A-kæden med B-kæden i human u-PA, og en hy- I I bridforbindelsessekvens bestående af subsekvenser af I I forbindelsessekvenserné, hvor forbindelsessekvenseme I I og hybridforbindelsessekvenserne omfatter et proces- I I seringssted, som kan spaltes af plasmin, og N-termi- I I 15 nalt dertil en cysteinrest, som kan danne en svovl- I I svovl-bro til det humane katalytiske u-Pa-domæne, I I over eventuelt yderligere en eller flere sekvenser I I valgt fra gruppen bestående af I I 20 (i) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flanke- I I rer fingerdomænet i human t-PA, eller et fragment I I deraf, forbindelsessekvensen, der N-terminalt I I flankerer t-PA-vækstfaktordomænet i human t-PA, I I eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I I 25 bindelsessekvens bestående af de to forbindelses- I sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbin- I I delsessekvenserne eller de fusionerede forbindel- I I sessekvenser er positioneret mellem finger- og I I vækstfaktordomænet i hybridplasminogenaktivatoren, I I 30 I I (ii) forbindelsessekvensen, som C-terminalt flan- I I kerer vækstfaktordomænet i human t-PA, eller et I I fragment deraf, forbindelsessekvensen, som N-ter- I I minalt flankerer kringle-2-domænet i human t-Pa, I I 35 eller et fragment deraf, eller en fusioneret for- I I bindelsessekvens bestående af de to forbindelses- I sekvenser eller fragmenter deraf, hvor forbindel- I sessekvenserne eller de fusionerede forbindel- I DK 175483 B1 149 sessekvenser er positioneret mellem vækstfaktor-og kringle-2-domænet i hybridplasminogenaktivato-ren, og 5 (iii) T-regionen fra human t-PA eller et N-ter minalt fragment deraf, hvor T-regionen eller fragmentet deraf er positioneret ved N-terminalen i hybridplasminogenaktivatoren. 10 ved hvilken man transformerer eukaryotiske værtsceller med hybridvektoren.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22 til fremstilling af en I transformeret eukaryotisk celle transformeret med en hy- I 15 bridvektor omfattende en DNA-sekvens, som koder for en en- I keltkædehybridplasminogenaktivator valgt fra gruppen be- I stående af tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)- I tPA(176-275)-uPA(159-411) og tPA(l-86)-tPA{176-275)- I uPA(159-411). I 20

24. Fremgangsmåde ifølge krav 22 til fremstilling af en I transformeret eukaryotisk celle transformeret med en hy- I bridvektor omfattende en hybridvektor til anvendelse i en I eukaryotisk vært omfattende en DNA-sekvens, som koder for I 25 en enkeltkædehybridplasminogenaktivator som er tPA(l-3)- I tPA(176-275)-uPA{159-411).

25. Farmaceutisk præparat omfattende en enkeltkædehybrid- I plasminogenaktivator ifølge kray' 1 til 3 sammen med et I 30 farmaceutisk acceptabelt bærestof.

26. Enkeltkædehybridplasminogenaktivator ifølge krav 1 til I 3 til anvendelse i en fremgangsmåde til terapeutisk pro- I fylaktisk behandling af det menneskelige legeme. | I 35

27. Anvendelse af en enkeltkædehybridplasminogenaktivator I ifølge krav 1 til 3 til fremstilling af et farmaceutisk I præparat.