NO177603B

NO177603B - Fremgangsmåte for fremstilling av hybride proteiner, DNA sekvens, hybridvektor og eukaryot vertscelle

Info

Publication number: NO177603B
Application number: NO875069A
Authority: NO
Inventors: Bhanu Rajput; Bhabatosh Chaudhuri; Fredericus Alphonsu Asselbergs; Bernd Meyhack; Jutta Heim; Jan Van Oostrum; Sefik Alkan
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1986-12-05
Filing date: 1987-12-04
Publication date: 1995-07-10
Also published as: IL84700A; ATE148167T1; NZ222793A; AU8209187A; NO177603C; JP2641875B2; CY2156B1; DK638187D0; ES2095825T3; JP2645237B2; JPS63160581A; IE81116B1; HK1005037A1; PT86276B; NO875069D0; EP0277313B1; DE3752008D1; PT86276A; AU621281B2; GR3023047T3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en enkel-kjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser til human t-PA vist i figur 1 og human u-PA vist i figur 3, hvor den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411, og tPA(l-86 )-tPA(176-275 )-uPA(159-411), DNA sekvens, hybrid vektor for anvendelse i en gjær- eller pattedyrvertscelle og eukaryot vertscelle transformert med en hybridvektor.

Blodpropper er hovedgrunnen til sykdom og død i utviklings-land. Blodpropper består av fibrin som er dannet fra dets løselige forløper fibrinogen ved hjelp av enzymet trombin. En mengde enzymer og andre substanser ser til at klumper bare normalt dannes når og hvor de er nødvendige for å forhindre blodtap.

Pattedyrplasma inneholder et enzymatisk system, det fibrinolytiske system, som kan oppløse blodklumper. En komponent til det fibrinolytiske system er en gruppe av enzymer som heter plasminogen-aktivatorer, som overfører plasminogen (et inaktivt proenzym-form av plasmin) til det proteolytiske enzymet plasmin. Plasmin degraderer deretter fibrin-nett-verket til klumpene og danner løselige produkter. I de tilfeller hvor den trombolytiske kapasiteten til kroppen ikke er tilstrekkelig for fjerning av intravaskulære tromber, f.eks. i pasienter som lider av blodpropp eller etter-operative komplikasjoner, kan det være uunnværlig å bruke eksogent tilførte trombolittiske agens.

To typer av plasminogen-aktivatorer (nedenfor referert til som "PAs") kan bli isolert fra humane kroppsvæsker eller celler: urokinase eller urokinase-type plasminogen-aktivatorer (nedenfor referert til som "u-PA"), en serin protease som er tilstede f.eks. i human urin og nyreceller, og vevs-type plasminogen-aktivator (nedenfor referert til som "t-PA") som er produsert av endotele celler og som finnes i et stort antall endokrine vev.

Både t-PA og u-PA eksisterer i to molekylære former: en enkel-kjedeform (ofte betegnet som "sc-t-PA" og "sc-u-PA", respektivt) og en to-kjede- (tc) form. Den enkel-kjede eller pro-enzym-formen er overført til en to-kjede-form ved hjelp av proteolytiske enzymer ved vel-definerte posisjoner i polypeptidsekvensen. Den resulterende to kjeden til det prosesserte PA-protein forblir bundet til hverandre via en svovel-svovel bro. Det karboksyterminale fragmentet eller B-kjeden utfører den enzymatiske aktiviteten til PA, mens aminoterminal A-kjede inneholder regulatoriske enheter slik som fibrin-bindings-seter. Den spesifikke bindingen av en inaktiv sc-PA til komponenter i blodproppen, slik som fibrin, etterfulgt av overføringen til den aktive tc-PA ved hjelp av katalytiske mengder av protelytiske enzymer som er tilstede ved det setet resulterer i et effektivt sete-spesifikt (site-specific) medikament.

t-PA og u-PA blir kodet av to forskjellige gener, kan skjelnes immunologisk og enzymatisk og har forskjellig responsprofil til inhibitorer, stimulatorer og aktivatorer. Bare t-PA er sterkt inhibert av proteaseinhibitoren fra Erytrina latissima (DE-3). T-PA aktiviteten blir kraftig stimulert av fibrin og fibrinfragmenter, mens u-PA aktiviteten er ufølsom for stimulering ved fibrin og dets fragmenter. En annen egenskap som skiller de to PA-enzymene fra hverandre er at tc-t-PA har en høy affinitet for fibrin og fibrinfragmenter, mens tc-u-PA har ikke noen merkbar fibrin-affinitet.

På grunn av den utilfredsstillende serumstabiliteten til injisert tPA, den lave affiniteten til tc-u-PA for fibrin og at fibrinaffiniteten til sc-u-PA er ment å være indirekte, d.v.s. at den trenger en blodfaktor til (jfr. D.J. Binnema et al., 8th Int. Congress of Fibrinolysis, Vienna, 1986), er det en kontinuerlig nødvendighet for forbedrede plasminogen-aktivatorer som har en høy affinitet til fibrin, en mere hensiktsmessig respons til stimulatorer, en redusert inaktivering ved inhibitorer og lenger effektiv halveringstid i blodsirkulasjonen.

Det er derfor hensikten med denne oppfinnelsen å frembringe nye hybrid-plasminogen-aktivatorer som inneholder de fordelaktige egenskapene til t-PA og u-PA mens de ikke skal inneholde de uønskede egenskapene til foreldreenzymene.

Det er overraskende at, ved behandling av trombose og andre forhold, hvor det er ønskelig å produsere fibrinolyse gjennom plasminogen-aktivering, har enkel-kjede hybrid PA proteinene mye bedre biologiske egenskaper når man sammenligner med enkel-kjede t-PA og u-PA. Mere spesifikt, sammenlignet med native PA er mindre kvantiteter av de nye PA-molekylene nødvendige i henhold til denne oppfinnelsen for å lysere blodpropper in vivo. Enkel-kjede hybrid PA-molekylene kan bli fremstilt i store mengder gjennom rekombinant DNA-teknologi og vil når de blir injisert i pasienter bare bli overført til deres to-kjede-form ved hjelp av fibrin ved det setet til blodproppen som skal bli lysert. To-kjede hybrid PA-molekyler er blitt beskrevet i litteraturen (Europisk patentsøknad nr. 155,387; K.C. Robbins, 8th International Congress of Fibrinolysis, Vienna, 1986), men de mere ønskede enkel-kjede-formene til hybrid PA-molekylene kan ikke bli produsert på proteinnivået som det fremkommer av nevnte litteratur, men kan bare bli fremstilt i store mengder og på en industriell skala ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi.

Følgelig er det videre hensikten med denne oppfinnelsen å sørge for midler og metoder for produksjonen av nevnte enkel-kjede u-PA/t-PA hybridproteiner. Slike midler består av DNA som koder for nevnte u-PA/t-PA hybridproteiner, hybride vektorer inneholdende nevnte DNA og verter som er transformert med de nevnte hybride vektorene. Det er også sørget for metoder for fremstillingen av nevnte enkel-kjede-u-PA/t-PA hybridproteiner, nevnte DNA, nevnte hybride vektorer og nevnte verter. Denne oppfinnelsen sørger også for en mere kost-effektiv prosess for fremstilling av to-kjede-hybrid-PA-molekyler fordi enkel-kjede produktene til de rekombinante DNA kan bli kuttet in vitro ved hjelp av passende proteolytiske enzymer, slik som plasmin.

I likhet med andre serinproteaser som er involvert i den fibrinolytiske og koagulasjonssystemet til blodet, har u-PA og t-PA store ikke-katalytiske segmenter sammensatt i kjede A knyttet til det katalytiske området (kjede B). Den ikke-katalytiske A-kjede til t-PA kan bli delt inn i diskrete domener: "finger"-domene, "vekstfaktor"-domene og to "kringle"-strukturer mens A-kjeden til u-PA består av en "vekstfaktor "-domene og en "kringle"-struktur [for referanse se L. Patthy, Cell 41, 657,663 (1985)]. Det katalytiske setet til B-kjedene er dannet av His, Asp, Ser residier ved posisjonene 322, 371 og 478 (t-PA) og 204, 255 og 356 (u-PA), respektivt, og er essensiell for fibrinolytisk aktivitet.

Et proteindomene er en strukturell og/eller funksjonell helhet innenfor hele strukturen til det hele proteinet. For eksempel, er fire domener i t-PA A-kjeden (finger-, vekstfaktor- og to kringle-domener) som kommer etter hverandre i serier. Grensene til domenene er best definert ved hjelp av posisjonene til ekson-intron grensene (junctions) i den korresponderende DNA-sekvensen (L. Patthy, ovenfor). Men, av praktiske hensyn er den minimale størrelsen på hvert domene blitt definert ved hjelp av aminosyresekvensen mellom det første og det siste cystein-residiet innenfor hver domene som det er sannsynlig at er involvert i S-S-brodannelse. Aminosyrer før og etter disse cysteinresidiene fra vedsiden-avliggende domener er definert som grensesekvenser (J, junction). Posisjonene til exon-intron grensene (se ovenfor) er innenfor disse J-regionene.

Enkel-kjede t-PA kan derfor bli representert ved hjelp av følgende formel:

T - F - <J>1 - G - J2 - % - J3 - K2 - J4 - TPA

hvori T representerer den N-terminale delen bestående av aminosyrene 1 til 5, F er fingerdomene bestående av aminosyrene 6 til 43, G er vekst faktor-domene bestående av aminosyrene 51 til 84, Ki er kringle 1 struktur bestående av aminosyrene 92 til 173, K2 er kringle 2 strukturen bestående av aminosyrene 180 til 261, TPA er den katalytiske serinpro-teaseregionen bestående av aminosyrene 307 til 527 og J^

(aminosyrene 44 til 50), J2 (aminosyrene 85 til 91), J3 (aminosyrene 174 til 179) og J4 (aminosyrene 262 til 306) er grensesekvenser som sammenføyer de domene segmentene.

Enkel-kjede u-PA kan bli representert ved hjelp av følgende formel:

T'-U-J5-K-J6- UPA

hvor T' representerer den N-terminale del bestående av aminosyrene 1 til 12, U er vekstfaktordomenet bestående av aminosyrene 13 til 42, K er kringlestrukturen bestående av aminosyrene 50 til 131, UPA er den katalytiske serinprote-aseregionen bestående av aminosyrene 189 til 411 og J5 (aminosyrene 43 til 49) og J5 (aminosyrene 132 til 188) er grensesekvenser som sammenføyer de domene segmentene.

Grensesekvensene J4 og J 6 inneholder hver aktiverings (prosessering) sete og, N-terminal dertil, et cysteinresidie som er involvert i en svovel-svovel bro til det katalytiske (B-kjede) området.

Det var overraskende å finne ut at enkel-kjede hybrid PA bestående av den katalytiske serinproteaseområdet til en PA (TPA eller UPA) festet til en aminosyresekvens bestående av alle eller diskrete A-kjede domenene til den andre PA eller diskrete domener til begge PA som har verdifulle farmakologiske egenskaper.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er følgelig kjennetegnet ved å dyrke under hensiktsmessige næringsbetingelser en transformert gjær eller pattedyrvertcelle inneholdene et DNA kodende for nevnte hybride plasminogen-aktivator og isolering av nevnte hybride plasminogen-aktivator.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en DNA sekvens kjennetegnet ved at den består av nukleotidsekvensene kodende for en enkel-kjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser til human t-PA vist i figur 1 og av human u-PA vist i figur 3, idet den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411, og tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

Eybridvektor for anvendelse i en gjær- eller pattedyrvertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter en DNA sekvens, kodende for en enkeltkjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser av human t-PA vist i figur 1 og av human u-PA vist i figur 3, idet den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3 )-tPA(176-275 )-uPA(15 9-411), tPA(1-49 )-tPA(176-275)-uPA(159-411, og tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-41l), idet den hybride vektoren kan uttrykke det gitte genet, er også beskrevet.

Oppfinnelsen omfatter videre en eukaryot vertscelle transformert med en hybrid vektor, kjennetegnet ved at den omfatter en DNA sekvens kodende for en enkeltkjede hybrid plasminogen-aktivator bestående av følgende aminosyresekvenser av human t-PA vist i figur 1 og human u-PA vist i figur 3, idet den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411, og tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411), idet vertcellen kan uttrykke det gitte genet.

Fortrinnsvis, begynner den hybride PA aminosyresekvensen med den N-terminale sekvensen til t-PA (t, aminosyrene 1 til 5) eller u-PA (T', aminosyrene 1 til 12) eller begynner med hvilken som helst grensesekvens som er N-terminalt koblet til den første domenen til den hybride PA eller med et fragment av en slik grensesekvens hvorpå fragmentet fortrinnsvis har minst aminosyreresidier.

I hybride PA er A-kjede domenene festet via naturlige grensesekvenser (f.e<ks.> J^, J2, J3 og J5), sammensatte grensesekvenser eller hybride grensesekvenser eller fragmenter derav. Derfor, er det første domenet til det andre domenet ved grensesekvensen som naturlig er tilstede ved C-terminalen til den første domenen, ved grensesekvensen som naturlig er tilstede ved den N-terminale siden til den andre domenen, ved en sammensatt grensesekvens bestående av nevnte sammenføyningssekvenser eller av fragmenter derav.

A-kjededomenene til hybride PA er koblet til B-kjede serin-protease-regionen (TPA eller UPA) ved hjelp av en grensesekvens selektert fra gruppen bestående av grensesekvensen J4 som fester A-kjeden til B-kjeden i humant t-PA, grensesekvensen J(, som fester A-kjede til B-kjede i human u-PA og en hybrid sekvens som inneholder subsekvensene til nevnte grensesekvenser hvori nevnte grensesekvens inneholder et prosesserings-sete som kan bli kuttet av plasmin og, N-terminalt dertil, et cysteinresidie som kan delta i en svovel-svovel bro til det katalytiske B-kjedeområdet, hvor grensesekvensen fortrinnsvis har minst førti og opp til seksti aminosyreresidier.

Grensen til domenene ved en posisjon som er definert av exon-intron grensene på det korresponderende DNA er å foretrekke. Det er å foretrekke at grensen av A-kjede til B-kjede er ved aktiveringssetet.

I en enkel kjede hybrid-plasminogen-aktivator selektert fra gruppen bestående av en slik hybrid-plasminogen-aktivator som inneholder en A-kjede som essensielt består av u-PA vekstfaktor domenet og t-PA kringle 2 domenet koblet i serie til det katalytiske området (B-kjede) til t-PA, og en hybrid plasminogen-aktivator inneholdende en A-kjede som essensielt består av t-PA kringle 2 domenet eller av t-PA finger og kringle 2 domenene koblet i serie til det katalytiske området (B-kjede) til u-PA, hvori grensen mellom A-kjede domenet(ene) og B-kjede er ved aktiveringssetet, er spesielt å foretrekke.

Nedenfor følger hybrid PA

UPA<A>TPA(BC) = [uPA(l-158)-tPA(276-527)],

UPA<A>TPA(BR) = [uPA(l-131)-tPA(263-527)],

TPA<A>UPA(BC) = [tPA(1-275)-uPA(159-411)],

TPA<A>UPA(BR) = [tPA(1-262)-uPA(132-411)],

UK2TJPAB(BR) = [uPA(l-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411)] , FUPA(BC) = [tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(l59-411)], FUPA(BR) = [tPA(1-49)-uPA(134-411)],

FK2UPA(BC) = [tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)], FK2UPA(BR) = [tPA(l-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)], UK2TPA(BC) = [uPA(l-44)-tPA(176-527)],

K2UPA(BC) = [tPA(l-3)-tPA(176-275 )-uPA(159-411)], FGK2UPA(BC) = [tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411)] og FGK2UPA(BR) = [tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)], hvor UPA<A> er A-kjede til u-PA, TPA<A> er i A-kjede til t-PA, UPA er B-kjede til u-PA, TPA er B-kjede til t-PA, U refererer til vekstfaktordomenet til u-PA, K2 refererer til kringle 2 domenet til t-PA, F refererer til finger domenen til t-PA, G refererer til vekstfaktordomenet til t-PA, (BC) indikerer at grensen mellom A-kjede domenet(er) og B-kjedet er ved aktiveringssetet og (BR) indikerer at A-kjede domenet(er) er koblet til B-kjeden via grensesekvensen som naturlig er koblet til B-kjeden innkludert aktiveringssetet og, N-terminalt dertil, cysteinresidiet som er involvert i en svovel-svovel bro til B-kjeden. Tallene refererer til aminosyresekvensene fra u-PA og t-PA, respektivt. For eksempel, UK2UPA(BR) = [uPA(1-44 )-tPA-(176-261 )-uPA(134-411)] designererer en enkel-kjede hybrid plasminogenaktivator bestående av aminosyrene 1-44 (vekstfaktordomene, U) til u-PA og aminosyrene 176-261 (kringle 2 domene, K2) til t-PA koblet på lineær måte til aminosyrene 134-411 (B-kjede, UPA) til u-PA.

Hybrid-plasminogenaktivatorer TPA<A>UPA(BC), FUPA(BC), FGK2UPAB(BC) og, spesielt, UK2TPA(BC), FK2UPA(BC) og K2UPA(BC), er spesielt å foretrekke.

Det er fra før kjent at en forutsetning for N-koblet glykosylering i pattedyrceller er tilstedeværelsen av den tripeptide sekvensen -Asn-L-Ser(eller Thr)- hvori Asn er akseptoren og L kan være en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede aminosyrene untagen prolin eller asparginsyre som forhindrer glykosylering. Det er tre seter for N-glykosidbinding i t-PA molekylet (tallene refererer til posisjonen til Asn i aminosyresekvensen til t-PA, jfr. Fig. 1 til vedlagte tegninger): - Asn117-Ser-Ser- (tilstede i kringle 1), Asn<184->Gly-Ser- (tilstede i kringle 2), og Asn<448->Arg-Thr (tilstede i t-PA B-kjede). Det unike N-bundet glykosyleringssetet til u-PA er i B-kjeden (Asn<302->Ser-Thr, jfr. Fig. 3). Det er opplagt at hybrid PA inneholdende t-PA kringle 1, t-PA kringle 2, B-kjede til t-PA og/eller B-kjede til u-PA også inkluderer de respektive N-bundede glykosyleringssetene.

For å forhindre glykosylering ved individuelle (en eller flere av de) N-glykosyleringssetene må tripeptidsekvensene som blir gjenkjent som signaler for N-glykosylering bli forandret. "Utskifting av Asn og/eller Ser (eller Thr) residiene i den ovenfor nevnte tripeptide sekvensen med en hvilken som helst annen aminosyre ville hindre dannelsen av glykosidbindinger ved disse setene. Modifisering av N-glykosyleringssetene blir ikke utført på proteinnivå. Det er en fordel i stedet å modifisere genet som koder for det hybride PA på en slik måte at under ekspresjonen av nevnte modifiserte gen av en vert, blir en mutant hybrid PA produsert hvor et eller flere av N-glykosyleringssetene er forandret på en slik måte at glykosylering ikke kan finne sted ved disse setene. Det er mest hensiktsmessig å modifisere alle en N-glykosyleringssetene som er tilstede i de hybride PA i henhold til oppfinnelsen.

Spesielt, asparagin er substituert med valin, leucin, isoleucin, alanin eller, spesielt, glutamin, og serin eller treonin med valin, metionin eller, spesielt, alanin.

Modifiserte hybrid PA er spesielt å foretrekke.

FUPA(Gln302)(BC) = [tPA(1-49 )-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411 )],

FK2(Alal86)UPA(Gln302)(BC) = [tpa(1-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)],

UK2(Alal86)TPA(Ala450)(BC) = [uPA(1-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527)],

K2(Alal86)UPA(Gln302)(BC) = [tPA(1-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)],

FGK2(Alal86)UPA(Gln302)(BC) = [tPA(1-86)-tPA(176-185), Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)],

og videre

FK2UPA(Gln302)(BC) = [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411 )],

K2UPA(Gln302)(BC) = [tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411)] ,

UK2TPA(Ala450)(BC) = [uPA(1-44)-tPA(176-449, Ala, 451-527)], og

FGK2TJPA(Gln302)(BC) = [tPA( 1-86 )-tPA( 176-275 )-uPA( 159-301, Gin, 303-411 )].

Hybride PA og mutanter derav kan bli fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA-teknikk som består, for eksempel, av oppdyrking av en transformert vert som uttrykker det hybride PA-proteinet eller mutant derav ved betingelser som tillater ekspresjon derav og isolering av det hybride PA-proteinet og mutant hybrid PA-protein. Mere spesifikt, blir de ønskede forbindelsene fremstilt ved

a) fremstilling av DNA som koder for et hybrid PA-protein eller en mutant derav eller syntetisere et slik DNA kjemisk, b) inkorporering av DNA inn i en hensiktsmessig ekspresjonsvektor , c) overføring av den oppnådde hybridvektoren inn i en mottagervert, d) selektering av transformerte verter fra utransformerte verter, f.eks. ved oppdyrking av ved betingelser hvor bare

den transformerte verten overlever,

e) oppdyrking av den transformerte verten ved betingelser som tillater ekspresjon av det hybride PA-proteinet, og f) isolering av det hybride PA-proteinet eller mutanter derav.

Stegene som er involvert i fremstilling av de hybride PA-proteinene ved hjelp av rekombinant DNA-teknikk vil bli diskutert mere detaljert nedenfor.

DNA som koder for hybrid PA- proteiner

DNA i henhold til oppfinnelsen har helst flankerende sekvenser ved den terminale enden. Spesielt, inneholder disse flankeringssekvensene passende restriksjonsseter som tillater integrasjon av DNA inn i passende vektorer.

Videre, inneholder DNA i henhold til oppfinnelsen signalsekvensen til u-PA eller t-PA som er festet til det første kodonet til det ferdige hybrid PA kodingssekvens. Når de uttrykkes i gjærceller inneholder DNA i henhold til oppfinnelsen en gjærsignalsekvens, slik som signalsekvensen som naturlig er bundet til gjaerpromotoren som er brukt, spesielt PH05 eller invertasesignalsekvens.

Nukleotidsekvensene til DNA-subsekvensene er helst lik nukleotidsekvensene som finnes i u-PA cDNA og t-PA cDNA, respektivt. Men, på grunn av degenerasjonen til den genetiske koden kan nukleotidsekvensene være forskjellige hvis de resulterende aminosyresubsekvensene forholder seg uforand-rede. I DNA som koder for en mutant hybrid PA kan minst et kodon som koder for en aminosyre som er essensiell for N-glykosylering av det hybride PA-proteinet være byttet ut med en annen kodon som koder for en annen aminosyre som hindrer N-glykosylering av gjenkjenningssetet.

Nukleotidsekvensen til u-PA cDNA og t-PA cDNA er kjent [jfr. W.E. Holmes et al., Biotechnology 3, 923-929 (1985); D. Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1984)]. Videre, er hele nukleotidsekvensene til de genome u-PA og t-PA genene inkludert alle introns og ekstrons kjent [jfr. A. Riccio et al., Nucl. Acids Res. 13, 2759-2771 (1985); S.J. Friezner-Degen et al., J. Biol. Chem. 261, 6972-6985 (1986)].

Siden cDNA og genome DNA-sekvensene til u-PA og t-PA er kjente kan DNA i henhold til oppfinnelsen bli laget ved hjelp av metoder som er kjente innenfor området. Metoder for fremstilling av disse DNA inkluderer kjemisk syntese av DNA eller preparering av fragmenter som koder polynukleotid-subsekvensene til u-PA cDNA og t-PA cDNA og plasserer dem i den mest hensiktsmessige forutbestemte rekkefølge inkludert en eller flere, slik som to eller tre, mutasjonssteg.

DNA som koder for mutant hybrid PA kan bli fremstilt ved hjelp av metoder som er kjent av området. Metodene for fremstilling av disse DNA inkluderer utkutting av en del av det DNA som inneholder kodonet for det uønskede aminosyreresidiet fra foreldre hybrid PA-genet og bytte det med et DNA-segment hvori i nevnte kodon er blitt substituert med en deoksyribonukleotid-triplet som koder for det ønskede aminosyreresidiet, eller utføre deoksyribonukleotid-substitusj onen ved hjelp av sete-spesifikk-mutagenese.

Kjemisk syntese av DNA er velkjent og benytter seg av konvensjonelle teknikker. Hensiktsmessige teknikker er blitt utarbeidet av S.A. Narang [Tetrahedron 39, 3 (1983)]. Spesielt, metodene beskrevet i Europa patensøknad nr. 146,785 kan bli brukt og er inkorporert heri ved bruk av referanse.

En annen fremgangsmåte for syntesen av DNA består av utkutting av passende restriksjonsfragmenter som koder for polynukleotid subsekvensene til u-PA og t-PA fra u-PA cDNA og t-PA cDNA (eller genomt u-PA DNA eller t-PA DNA) og bruk av disse fragmentene for fremstillingen av hele det strukturelle genet til hybrid PA. To strategier kan bli brukt. Ved hver av strategiene må man passe på at fusjonen av fragmentene skjer ved setene mellom domenene for å holde dem intakt. Den første strategien benytter seg av passende restriksjonsseter. Når et hensiktsmessig restriksjonssete er tilstede ved det forutbestemte grensesete(r) i både i u-PA og t-PA DNA, kuttes DNA med den korresponderende restriksjonsendonukleasen og fragmentene er skjøtet ved hjelp av butt-ende eller overhengende-ende ligering (avhengig av hvilken restriksjonsendonuklease) avhengig av hvilken restriksjonsendonuklease som er valgt). Alternativt, kan nyttige restriksjonsseter bli introdusert ved, for eksempel, sete-spesifikk mutagenese

[jfr. M.J. Zoller et al., Methods Enzymol 100, 468 (1983)]

når man passer på at det muterte DNA ikke resulterer i en forskjellige aminosyresekvens. Naturlige eller kunstig introduserte restriksjonsseter som spesielt er å foretrekke

er de som separerer DNA som koder for A- og B-kjedene eller DNA som koder for de diskrete domenene som er i A-kjedene. På denne måten, kan hybride DNA bli produsert som koder for hybride PA med den ønskede grensen mellom A-kjededomenene og det katalytiske serinproteaseområdet. Den andre strategien kommer fra hypotesen om at domengrensene best blir definert ved hjelp av posisjonene til ekson-intron grensene i de genome DNA [jfr. L. Patthy, Cell 41, 657-663 (1985)], d.v.s. posisjoner i cDNA hvor introns er blitt spleiset. Da disse posisjonene sjelden faller sammen med restriksjonssetene, er et system utviklet som kan bli fulgt ved en hvilken som helst ny konstruksjon: i det første steget blir hensiktsmessig restriksjonsfragmenter som koder for det spesifikke domenet-(ene) men også inneholder i tillegg DNA-sekvenser som går lengre enn det forventede fusjonspunktet (opp til flere hundre basepar) er ligert og subklonet i bakteriofag ml3. I det andre steget blir DNA-sekvensene som er i overskudd kuttet ut ved hjelp av in vitro mutagenese (Zoller et al., supra). Denne fremgangsmåten tillater presise fusjoner som er riktig leseramme ved en hvilken som helst forutbestemt nukleotid posisjon og er derfor å foretrekke.

For fremstilling av mutante hybride PA, kan en del av det ferdige hybrid DNA bli kuttet bort ved hjelp av restriksjonsenzymer. En forutsetning for denne metoden er at det finnes hensiktsmessige restriksjonsseter i nærheten av det kodonet som skal forandres. Et lite restriksjonsfragment som inneholder kodonet til den uønskede aminosyren blir fjernet ved hjelp av endonukleasekutting. En korresponderende dobbeltkjedet DNA-sekvens er fremstilt, for eksempel ved hjelp av kjemisk syntese, hvor tripletter som koder for den ønskede aminosyren blir brukt. DNA-fragmentet er ligert med riktig orientering til det gjenværende store fragmentet, som fører til en dobbelkjedet DNA-sekvens som koder for en mutant hybrid. For å få det hensiktsmessig og for å lette håndter-ingen av det hybride genet, blir det satt inn i et større DNA-segment som har hensiktsmessige ende-nukleotider (link-ers) som tillater insesjon og kloning av segmentet i en kloningsvektor.

Fremstillingen av DNA som koder for en mutant hybrid PA utføres ved hjelp av sete-spesifikk mutagenese. Denne metoden er en in vitro mutagenese prosedyre hvor et definert sete innenfor en region av klonet DNA kan bli forandret (jfr. oversiktsartiklene til M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983); D. Botstein og D. Shortle, Science 229, 1193 (1985)]. Mutagenese kan enten bli utført på hele hybrid PA genet eller på funksjonelle deler derav som inneholder kodonet for den uønskede aminosyren(er). Etter mutagenese, blir den muterte funksjonelle delen bundet til de andre delene av det hybride PA for å få den mutante hybride

PA.

Metoden for mutering av det hybride PA-genet eller funksjonelle deler derav er karakterisert ved at enkel-kjede-genet eller en enkel-kjedet-DNA som inneholder PA-genet eller deler derav er hybridisert til en oligodeoksyribonukleotid primer som er komplementær til området i det hybride genet som skal muteres untatt feil-parring(er) mismatch som styrer mutasjonen, det hybridiserte oligodeoksyribonukleotidet blir brukt som en primer for å initiere syntesen av den komple-mentære DNA-kjeden, det resulterende (partielle) dobbel-kjedete DNA er transformert inn i mottager mikroorganisme-stamme, mikroorganismestammen dyrkes opp og transformanter som inneholder DNA med det modifiserte (mutante) hybrid PA-genet blir selektert.

Hybride vektorer som inneholder hybrid PA DNA

Oppfinnelsen vedrører hybride vektorer.

Vektoren er selektert avhengig av hvilke vertsceller som man tenker å bruke for transformasjonen. I prinsipp, er alle vektorer som replikerer og uttrykker det ønskede polypeptid-genet i henhold til oppfinnelsen i den valgte verten passende. Eksempler på passende verter er eukaryoter, som mangler eller har få restriksjonsenzymer eller modifiserings-enzymer, slik som gjær, for eksempel Saccharomyces cerevisiae, for eksempel S. cerevisiae GRF18, og videre pattedyrceller, spesielt kjente humane eller animalske cellelinjer, f.eks. myeloma celler, humane embryonale lunge fibroblaster L-132, COS-celler, LTK-celler, human maligne melanoma Bowes-celler, HeLa-celler, SV-40 virustransformerte nyreceller til afrikansk grønn ape COS-7 eller kinesisk hamster ovarie (CHO) celler og varianter derav. De ovenfor nevnte pattedyrcellene og stammer og Saccharomyces cerevisiae, for eksempel S. cerevisiae GRF18, foretrekkes som vertsmikroorganisme.

a. Vektorer for bruk i gjær

Vektorer som er egnede for replikasjon og ekspresjon i gjær inneholder et gjær-replikasjon-origo og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybride vektorer som inneholder et gjær-replikasjonsorigo, for eksempel kromosomal autonomt repliker-ende segment (ars), blir holdt ekstrakromosomalt inne i gjærcellen etter transformasjonen og er replikert autonomt. Videre, kan hybride vektorer som inneholder sekvenser som er homologer til gjær 2jj plasmid-DNA bli brukt. Slike hybride vektorer vil bli integrert ved rekombinasjon i 2p-plasmidene som allerede eksisterer inne i cellen, eller replikere autonomt. 2jj-sekvensene er spesielt passende for plasmider med en høy transformasjonsfrekvens og og et høyt kopiantall.

Passende markørgener for gjær, er spesielt, som medfører antibiotika resistens til verten eller, når det gjelder auksotrope gjærmutanter, gener som komplementerer verts-lesjoner. Korresponderende gener medfører, for eksempel, resistens mot antibiotika G418 eller fører til prototropi i en auksotrop gjærmutant, for eksempel URA3, LEU2, HIS3 eller TRP1 genet. Hybride gjærvektorer inneholder videre helst et replikasjonsorigo og et markørgen for en bakteriell vert, spesielt E. coli, slik at konstruksjonen og kloning av de hybride vektorene og deres intermediater kan foregå i en bakteriell vert.

Ekspresjon kontrollsekvenser som er passende for ekspresjon i gjær, er for eksempel, de som kommer fra gjærgener som uttrykkes godt. Derfor, promoterene til TRPl-genet, ADHI eller ADHII genet, syrefosfatase (PH03 eller PH05) genene, isocytokromgenet eller en promoter til glykolysegenene, slik som promoteren til enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydroge-nase (GAPDH), 3-fosfoglyserate-kinase (PGK), heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglyserat-mutase, pyruvat kinase, triosefos-fat-isomerase, fosfoglukose-isomerase, invertase og glukokin-ase-genene, kan bli brukt. Vektorer som er å foretrekke ifølge denne oppfinnelsen inneholder promoterer med transkripsjonen kontroll, f.eks. promoterene til PH05 og ADH II genene, som kan bli skrudd på eller av ved variering av vekstbetingelsen. For eksempel, kan PH05 promoteren bli undertrykt, (repressed) eller ikke-undertrykt (derepressed) bare ved å øke eller minke konsentrasjonen til uorganisk fosfat i mediet.

Gjærhybridvektorene består fortrinnsvis også av den 3' flankerende sekvens til et gjærgen som inneholder de riktige signalene for transkripsjonsterminering og polyadenylering. Passende 3' flankerende sekvenser er for eksempel de til genet som naturlig er koblet til promoteren som blir brukt, slik som 3' flankerende sekvensen til gjær PH05 genet.

b. Vektorer for bruk i pattedyrceller

Vektorer for replikering og ekspresjon i pattedyrceller inneholder ofte DNA med viral opprinnelse, f.eks. fra simian virus 40 (SV 40), Rous sarcoma virus (RSV), adenovirus 2, bovin papilloma virus (BVP), papovavirus BK mutant (BKV), eller mus eller human cytomegalovirus (MSMV og HCMV, respektivt ).

Ekspresjon-kontrollsekvenser som er passende for bruk i pattedyrceller inkluderer, blant annet, de tidlige og sene promoterene til SV40, hovedsenpromotor til adenovirus, promotoren til murin metallotionin-genet og forsterker-(enhancer)-promoter region til mus eller human cytomegalovirus hoved umiddelbar-tidlig genet, human immunoglobulin forsterker-promoter region, human a-globin promoter kombinert med SV40-forsterkeren og promotere utledet fra varmesjokk-genene.

Passende markørgener for pattedyrceller er, for eksempel, neo og ble-genene fra transposon Tn5 som medfører resistens til antibiotika G418 og til bleomycin-type antibiotika, respektivt, E. coli genet for hygromycin-B resistens, dihydrofolat reduktase-gen (dhfr) fra pattedyrceller eller E. coli som forandrer fenotypen til DHFR" celler til DHFR<+> celler og/eller fører til resistens til metotreksa, og tymidin-kinase genet til herpes simplex virus som gjør TK" celler fenotypisk til TK<+> celler.

De hybride vektorene til pattedyrcellene inneholder fortrinnsvis den 3' ikke-translerte regionen til et pattedyrgen som inneholder signaler for riktig transkripsjonsterminering og polyadenylering, slik som, for eksempel, de 3'-flankerende områdene til p<->globingenet. Det er fordelaktig at områdene som flankerer polypeptid-kodingsområdet inneholder en eller flere native introns som har hensiktsmessig spleisesignaler ved deres terminale ender. Slike tillegg anses å være nødvendig da cDNA og prokaryote DNA slik som de ovenfor nevnte seleksjonsgenene, generelt mangler slike transkripsjon og proseteringssignaler.

Fortrinnsvis, inneholder slike vektorer et replikasjonsorigo og et antibiotika resistens-gen for propagering i E.coli. Et pattedyr replikasjonsorigo som blir dannet enten ved å inkludere i konstruksjonen av vektoren et eukaryot origo, slik som det som utledes fra SV40 eller fra en annen viral kilde, eller kan bli dannet av vertscellekromosomet ved integrasjon av vektoren i vertscellekromosomet.

De foretrukne hybride vektorer for bruk i pattedyrceller innbefatter hybrid PA eller mutant hybrid PA cDNA som er flankert på oppstrøms side av murin-cytomegalovirus hoved umiddelbar-tidlig gen forsterker-promoter og på nedstrøms side av 3' enden til kanin beta-globin-genet, som inkluderer det andre intronet med dets hensiktsmessig spleisingssignaler og en polyadenyleringssekvens. De inneholder videre sekvensene som koder for neomycin-resistensgenet fra transposon Tn5 eller mere optimalt fra Tn9 eller sekvensene som koder for hygromycin-fosfotransferase som er flankert på dets oppstrøms side sekvensiell ved den tidlige promotor fra SV40-virus som også inkluderer SV40 replikasjonsorigo og den naturlige promotor til Tn5 neogenet, og på dets nedstrøms side av et segment til SV40 tidlig gen som inkluderer de små t-antigen spleising og polyadenyleringssignalene. Hele konstruksjonen blir klonet inn i et fragment til E.coli plasmid pBR322, som inneholder plasmid-replikasjonsorigo, ampicillin-resistens-genet, men mangler såkalte gift-sekvenser som inhiberer SV40-måte DNA-replikasjon i pattedyr celler. For optimalitet, blir et gen som koder for dihydrofolat-reduktase (DHFR) satt inn i vektoren, helst det modulære DHFR genet beskrevet av R.J. Kaufman et al., [Mol. Cell. Biol. 2, 1304-1319 (1982)] blir brukt. Dette modulære DHFR-genet består, sekvensielt, av hovedsenpromoter til adenovirus type 2, et fragment av et immunoglobulingen, den kodende delen av et murin DHFR cDNA og SV40 tidlig polyadenyleringssete.

De nye foretrukne hybridvektorene for bruk i pattedyrceller står for et fremskritt innenfor dette området. De er overlegne sammenlignet med hertil kjente vektorer idet de inneholder de sterke ekspresjonssignalene for det klonede cDNA som er lokalisert i muse-cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promoter/enhancer og i beta-globin-spleising/poly-adenyleringsekvenser i et miljø som tillater ekspresjon på et høyt nivå i stort antall forskjellige vertebrate celletyper. Mere spesifikt, kan vektorene bli brukt (a) til å uttrykke cDNA kortvarig i normal, d.v.s. ikke SV40-transformert, vevkultur-cellelinjer, men (b) enda bedre høyt kopiantall i primate celler som uttrykker SV40 T-antigen, dermed tillater vektoren å replikere via dets SV40 replikasjonsorigo, men også (c) å uttrykke slike klonede cDNA stabil i normale vevs-kulturcellelinjer, hvor vektoren kan integrere inn i vertscelle-kromosomet og (d) enda bedre, på grunn av det høye kopiantallet, når vektoren blir introdusert inn i SV40 Tr-ant i gen som produserer primate cellelinjer, hvor vektoren kan replikere episomalt.

Forsterker-promoter-regionen til MCMV inneholder for eksempel et DNA som starter ved nukleotidene -835 til -443 og slutter ved nukleotidet +50 (telt fra mENA-start) til 5' regionen til MCMV hoved umiddelbar-tidlig gen. Det forsterker-promoter området som er å foretrekke til MCMV består av nukleotidene-542 til +50.

Det 3'-flankerende området til kanin p<->globingenet består av den andre halvdelen av hare beta-globin genet [P. Dierks et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 1411-1415 (1981); A. van Ooyen et al., Science 206, 337-344 (1979)] og begynner i det andre ekson, fortrinnsvis ved BamHI setet, og inkluderer dermed det andre intron med signalene for spleising ved dets flankerende sekvenser, og terminerer etter polyadenyleringssignalene, fortrinnsvis ved Bglll setet som ligger 1.2 kb bak det ovenfor nevnte BamHI setet.

Replikeringsorigo til SV40 ligger, for eksempel, i Hindlll-Sphl fragmentet til det virale DNA [nukleotider 5171 til 128, origo = posisjon 1; Tooze J. (ed.) DNA Tumor Viruses, del 2, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. 1982]. Mest hensiktsmessig er, Hindlll-Hpall fragmentet (nukleotidene 5171 til 346), som i tillegg til replikeringsorigo også den inneholder den virale tidlig forsterker/promoter som fremmer transkripsjon av det selekterte genet til vektoren.

Neomycingenet er klonet hak en promoter som er aktiv i vevskulturceller, helst SV40 tidlig promoter lokalisert på Hpall-Hindlll fragmentet som er nevnt ovenfor. Kodingssekvensene til neomycingenet ligger, for eksempel, på et Bglll-Smal-fragment fra transposon Tn5 [E. Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982); P. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); F. Colbére-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14 (1981)]. Det er å foretrekke å sette en promoter til på neomycingenet som tillater transkripsjon også i E.coli. For eksempel, kan den naturlige promoter til Tn5 neomycin-genet helst får et Hindi 11-Bgl 11-f ragment bli plassert bak den eukaryote promoter foran neo-kodingssekvenser (Southern et al., supra) eller videre oppstrøms foran den eukaryote promoter (Colbére-Garapin et al., supra). For å uttrykkes i vevskulturceller må det bakterielle neogenet være etterfulgt av et polyadenyleringssignal, helst en del av SV40 t antigen-genet som også inneholder spleisingssignaler. Kodingssekvensen til neomycin-fosfortransferase, spesielt Bglll-Smal delen av Tn5-fragmentet som er nevnt ovenfor, kan også bli erstattet at kodingssekvensen til hygromycin B fosfortransferase helst i form av BamHI-fragmentet til plasmid pLG89 [L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)], som hensiktsmessig kan bli satt inn i pSVd [Luedin et al., EMBO-J. 6, 109-114 (1987)], et derivat av pSV2911neo hvori et Bglll linker er introdusert ved Smal setet i vektoren.

Et annet seleksjonsgen som er å foretrekke bruker kodingssekvensen til enzymet dihydrofolat-reduktase, slik som i pSV2dhfr (ATCC 37145), som tillater ikke bare seleksjon av transformerte cellelinjer med også amplifisering av den plasmid-assosierte DNA-sekvensen, ofte med en proporsjonal øking av produksjonen av plasmid-kodete proteiner i henhold til oppfinnelsen.

Fragmentet som er avledet fra E.coli plasmid pBR322 inneholder pBR322 replikasjonsorigo og ampicillin-resistensgenet. Fragmentet er helst tatt fra et pBR322 derivat, slik som pSVOd [P. Mellon et al., Cell 27, 279-288 (1981)] hvor den såkalte giftsekvensen som ville ha inhibert den SV40 T antigen-drevne replikasjon av vektoren, er fjernet.

I en fremstilling som er å foretrekke, anvendes hybride vektorer som har mulighet for replikasjon og fenotypisk seleksjon i en eukaryot vertstamme bestående av en promoter og et DNA som koder for et hybrid PA eller mutant hybrid PA, hvor nevnte DNA er plassert sammen med transkripsjonsstart og termineringssignaler og translasjonsstart og stoppsignaler i nevnte hybride vektor under kontroll av nevnte promoter slik at det i en transformert vert kommer til uttrykk for produsering av proteinet.

Hybride vektorer i henhold til denne oppfinnelsen er fremstilt ved metoder som er kjent innenfor dette fagområdet, for eksempel ved kobling av DNA-segmentene som inneholder promoteren, den hybride PA eller mutante hybride PA koding-område, den 3'-flankerende sekvens og vektor-DNA.

Forskjellige teknikker kan bli brukt til å koble DNA-segmenter in vitro. Butte ender (helt base-parrede DNA-duplekser) fremstilt ved visse restriksjonsendonukleaser kan bli ligert direkte med T4 DNA-ligase. Det er mere vanlig å koble DNA-segmenter ved hjelp av deres enkel-kjedete kohesive ender og blir kovalent lukket ved hjelp av en DNA-ligase, f.eks. T4 DNA-ligase. Slike enkel-kjedete "kohesive termini" kan bli dannet ved kutting av DNA med en annen klasse av endonukle-aser som danner overhengende-ender (de to kjedene til DNA-duplekset blir kuttet ved forskjellige steder med noen nukleotider imellom). Enkle kjeder kan også bli dannet ved tilsetting av nukleotider til butte ender eller overhengende-ender ved hjelp av terminal transferase ("homopolymeric tailing") eller ved å "spise opp" en kjede i et DNA-segment som har en butt ende ved hjelp av en passende eksonuklease, slik som X-eksonuklease. En annen fremgangsmåte for fremstilling av overhengende ender består i å ligere et kjemisk syntesisert ende-nukleotid DNA som inneholder et gjenkjen-ningssete for en overhengende ende-dannende endonuklease til et DNA-segment som har butte ender og kutte det resulterende DNA med den respektive endonukleasen. Komponentene til de hybride vektorene i henhold til denne oppfinnelsen blir koblet sammen i en forutbestemt rekkefølge for å forsikre en riktig funksjon.

Verter transformert med h<y>bride vektorer som inneholder hvbrid PA DNA

Et annet aspekt av denne oppfinnelsen vedrører eukaryote vertsorganismer som er transformert med hybride vektorer som inneholder et DNA som koder for et hybrid PA som består av minst to subsekvenser som korresponderer i aminosyreidentitet og antall til subsekvenser til human u-PA og human t-PA eller som koder for en mutant derav, og mutanter av nevnte vert, og prosesser for prepareringen derav.

Eksempler på passende eukaryote verter er de som er nevnt ovenfor, spesielt gjærstammer og pattedyrceller. Mutanter til transformerte vertsorganismer innbefatter spesielt mutanter som har dårlige hybrid PA eller mutant hybrid PA degraderende proteaser og gir større utbytte i hybrid PA og mutant hybrid PA, respektivt.

Metoden for fremstilling av de transfomerte eukaryote vertene består av transformering eller transfektering av en eukaryot vert med en ekspresjonsvektor som inneholder et DNA i henhold til denne oppfinnelsen og som er regulert av en ekspresjon-kontrollsekvens.

Transformering av den eukaryote vertscellen utføres ved hjelp av metoder som er kjent innenfor dette fagområdet. For eksempel, transformering av gjær med de hybride vektorene kan bli utført i henhold til metoden beskrevet av Hinnen et al [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1919(1978)]. Denne metoden kan bli inndelt i tre steg:

(1) Fjerning av gjærcelleveggen eller deler derav.

(2) Behandling av de "nakne" gjærcellene (sferoplaster) med det transformerende DNA ved tilstedeværelse av PEG (polyetylenglykol) og Ca<2+> ioner. (3) Regenerering av celleveggen og seleksjon av de transformerte cellene i et fast agar-lag.

Metoder som er å foretrekke:

ad (1): Gjærcelleveggen fjernes enzymatisk ved bruk av forskjellige preparater av glukosidaser, slik som snegle tarmsafter (f.eks. Glusulase® eller Helicase®) eller enzym-blandinger fra mikroorganismer (f.eks. Zymolyase®) i osmotisk stabiliserte løsninger (f.eks. 1 M sorbitol).

ad (2): Gjærsferoplastene aggregerer ved tilstedeværelse av PEG og lokale fusjoner av de cytoplasmatiske membranene blir indusert. Dannelsen av "fusjons-lignende" forhold er helt avgjørende og mange transformerte gjærceller blir diploide eller også triploide i løpet av transformasjonsprosessen. Prosedyrer som tillater seleksjon av fuserte sferoplaster kan bli brukt for å anrike for transformanter, d.v.s. transformerte celler kan lett skilte ut blant preselekterte fusjons-produkter.

ad (3): Da gjærceller uten cellevegg ikke deler seg, må celleveggen bli regenerert. Denne regenereringen gjøres ved å blande sferoplastene inn i agar. For eksempel, smeltet agar (omtrent 50°C) blir blandet med sferoplastene. Ved avkjøling av løsningen til gjærveksttemperaturer (omtrent 30°C), dannes et fast lag. Dette agar-laget brukes for å

forhindre rask diffusjon og tap av essensielle makromolekyler fra sferoplastene og dermed letter regenerering av celleveggen. Cellevegg regenerering kan derimot også bli utført (men med lavere effektivitet) ved ut-plating av sferoplastene på overflaten av ferdiglagde agarlag.

Ågaren for regenerering er fremstilt på en måte som tillater både regenerering og selektering av transformerte celler på samme tid. Siden gjærgener som koder for enzymer til aminosyre-biosyntetiske veier ofte blir brukt som selektive markører (supra), utføres regenereringen helst i gjær minimalt medie agar. Hvis et høyt utbytte av regenereringen er nødvendig, er de følgende to steg fremgangsmåtene fordelaktige (l): regenerering av cellevegg i et rikt kompleks medium, og (2) seleksjon av de transformerte cellene ved kopi-plating cellelaget på selektive agarplater.

Introduksjonen av hybride vektorer inn i pattedyrceller blir gjort ved transfeksjon ved tilstedeværelse av hjelpeforbind-elser, f.eks. dietylaminoetyldekstran, dimetylsulfoksyd, glyserol, polyetylenglykol eller lignende, eller som ko-presipitater av vektor DNA og kalsiumfosfat. Andre passende metoder består i å mikroinjisere vektor DNA rett inn i cellekjernen og elektroporerering, d.v.s. introduksjon av DNA ved en kort elektrisk puls som øker permeabiliteten til cellemembranene. Den etterfulgte seleksjon av transfekterte celler kan bli gjort ved bruk av en seleksjonsmarkør som enten er kovalent integrert inn i ekspresjonsvektoren eller tilsatt i separat form. Markører for seleksjon består av gener som medfører resistens til antibiotika eller gener som komplementerer en genetisk mangel hos vertscellen (supra). Et system for seleksjon som er å foretrekke benytter celler som mangler dihydrofolat-reduktase (DHFR"), f.eks. CHO-celler, som absolutt trenger tymidin, glysin og puriner for vekst hvis ikke et eksogent DHFR-gen blir tilsatt. Når en vektor som inneholder det hybride PA-genet og i tillegg et DHFR-gen inn i passende DHFR" celler blir tilsatt, f.eks. CHO-celler, blir de transformerte cellene selektert ved øking av konsentrasjonen av anti-folat medikament metotreksat til mediet.

En metode for seleksjon som spesielt er å foretrekke er en metode hvor passende pattedyrceller, f.eks. CHO-celler, blir behandlet med co-presipitater av vektor DNA som inneholder det hybride PA-genet og et gen som koder for antibiotika-resistens, f.eks. resistens til G-418, og kalsiumfosfat. De transformerte cellene blir selektert ved oppdyrkning ved tilstedeværelse av de korresponderende antibiotika, f.eks. G-418, og/eller skille ut (screening) hybrid PA-ekspresjon.

Transformerte verts-organismer i henhold til oppfinnelsen kan bli forbedret når det gjelder produksjon av hybride PA eller mutante hybrider PA ved mutasjon og seleksjon ved bruk av metoder som er kjent innenfor fagområdet. Mutasjonen kan dannes, for eksempel, ved U.V. stråling eller ved hjelp av passende kjemikalier. Fremstilling av protease-manglende mutanter er spesielt å foretrekke, spesielt gjærmutanter, for å unngå proteolytisk degradering av det dannede hybrid PA og mutant hybrid PA, respektivt.

Oppdyrking av transformerte vertsceller

Oppfinnelsen inneholder videre en metode for fremstilling av enkelt-kjede hybrid PA som har en aminosyresekvens som består minst to subsekvenser som korresponderer i aminosyreidentitet og antall til subsekvenser til human t-PA og til human u-PA, eller mutanter derav, og oppdyrking ved hensiktsmessig nærende forhold en transformert eukaryot vert som inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte hybrid PA eller mutant hybrid PA og isolering av nevnte hybrid PA eller mutant derav.

De transformerte vertscellene blir dyrket ved hjelp av metoder som er kjente innenfor fagområdet i et væskemedium som inneholder fordøyelige kilder av karbon, nitrogen og uorganiske salter.

Forskjellige karbonkilder kan bli brukt for dyrking av de transformerte gjærcellene i henhold til denne oppfinnelsen. Eksempler på karbonkilder som er å foretrekke er fordøyelige karbohydrater, slik som glykose, maltose, mannitol eller laktose, eller en acetat, som kan bli brukt enten alene eller i passende blandinger. Eksempler på passende nitrogenkilder er aminosyrer, slik som casaminosyrer, peptider og proteiner og deres degraderingsprodukter, slik som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, gjærekstrakter, maltekstrakt og også ammoniumsalter, for eksempel ammoniumklorid, sulfat eller nitrat, som enten kan bli brukt alene eller i passende blandinger. Uorganiske salter som også kan bli brukt, er for eksempel sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium.

Mediet inneholder videre, for eksempel, vekst-fremmende substanser, slik som sporelementer, for eksempel jern, sink, mangan og lignende, og fortrinnsvis substanser som utøver et seleksjonstrykk og forhindrer vekst av celler som har mistet den plasmide ekspresjon. Derfor, for eksempel, hvis en gjærstamme som er auxotrop i, for eksempel, en essensiell aminosyre, er brukt som vertsmikroorganisme, inneholder plasmidet helst et gen som koder for et enzym som komplementerer defekten i verten. Oppdyrking av gjærstammen utføres i et minimalt medium som mangler nevnte aminosyre.

Oppdyrking blir utført ved hjelp av metoder som er kjent innenfor fagområdet. Betingelser for oppdyrking, pH-verdier til mediet og fermenteringstid blir valgt slik at man oppnår høyest mulit titer av PA-proteinene i denne oppfinnelsen. Dermed, blir gjærstammen helst dyrket opp under aerobe forhold med overstrømming av kulturen med skaking eller risting ved en temperatur på omtrent 20 til 40° C, helst omtrent 30°C, og en pH-verdi på 5 til 8, helst ved omtrent pH 7, i omtrent 4 til 30 timer, helst til man får et maksimalt utbytte av proteinene i denne oppfinnelsen.

Pattedyrceller dyrkes under vevskultur-forhold ved hjelp av kommersielle medier som er suplementert med vekstfremmende substanser og/eller pattedyrserum. Cellene vokser enten festet til en fast støtte, f.eks. en mikrobærer eller porøse glassfibre, eller fritt-flytende i hensiktsmessige kultur-beholdere. Kulturemediet er selektert på en slik måte at det utøves et seleksjonstrykk og at bare de celler overlever som enda inneholder det hybride vektor-DNA som inneholder den genetiske markøren. Derfor blir, for eksempel, et antibiotika tilsatt til mediet når den hybride vektoren inneholder det korresponderende antibiotika-resistensgenet.

Når celletettheten har nådd en høy nok verdi blir dyrking avbrutt og proteinet blir isolert. Når man bruker pattedyrceller blir hybrid PA eller mutant hybrid PA-protein vanligvis utskilt i mediet. Mediet som inneholder produktet blir separert fra cellene hvor man igjen kan tilsette friskt medie og bruke for kontinuerlig produksjon. Når gjærceller blir brukt kan proteinet også akkumulere inne i cellene, spesielt i det periplasmatiske området. Når det gjelder det siste tilfellet består det første steget for gjenvinning av PA-protein i å frigi proteinene fra cellene. I de fleste fremgangsmåtene blir celleveggen først fjernet ved enzymatisk kutting av celleveggen med glukosidaser (supra). Alternativt, blir celleveggen fjernet ved behandling med kjemikalier, d.v.s. tiolreagenser eller EDTA, som fører til at celleveggen skades og tillater det produserte hybrid PA eller mutant derav til å bli utskilt. Den resulterende blandingen blir anriket for hybrid PA eller for mutanten derav ved hjelp av konvensjonelle metoder, slik som fjerning av mestenparten av ikke-proteinstoffer ved behandling med polyetylenimin, presipitering av proteinene ved hjelp av ammoniumsulfat, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, for eksempel, ione-bytte-kromatografi, størrelse-eksklusjons-kromatografi, HPLC eller revers fase HPLC, gelfiltrering på en passende Sephadex kolonne, eller lignende. Den endelige rensingen av det pre-rensede produktet blir oppnådd, for eksempel, ved hjelp av affinitetskromatografi, for eksempel antistoff-affinitetskromatografi, spesielt monoklonal antistoff-affinitetskromatografi ved hjelp av monoklonal anti-t-PA eller anti-u-PA antistoffer som er fiksert på en ikke-løselig matrise ved hjelp av metoder som er kjent innenfor dette fagområdet, eller, når det gjelder hybrid PA som inneholder den katalytiske B-kjeden til t-PA, DE-3 affinitetskromatografi (DE-3 er en proteaseinhibitor som er isolert fra Erytrina latissima), og lignende.

Hybridoma-cellelinjer som produserer monoklonale antistoffer rettet mot spesifikke domener av t-PA eller u-PA og nevnte monoklonale antistoffer er også deler av oppfinnelsen.

For den hensiktsmessige fremstilling av en-kjede formen av det hybride PA eller mutant hybride PA som er vesentlig fri for to-kjede-formen, blir en proteaseinhibitor, slik som aprotinin (Trasylol) eller basisk bukspyttkjertel-trypsin-inhibitor, med fordel tilsatt i løpet av prosedyren for rensing for å inhibere spor av proteaser som kan være tilstede i kulturmediet og som kan føre til (partiell) overføring av en-kjedeform til to-kjede form. Den endelige renfremstillingen blir deretter oppnådd ved hjelp av kromatografi og en kolonne som inneholder en selektiv affinitets-reagens.

5. Farmasøytiske preparater

De nye enkel-kjede hybride PA-proteinene og mutanter derav som fremstilles i henhold til denne oppfinnelsen, utviser verdifulle farmakologiske egenskaper. De kan bli brukt i analogi til kjente plasminogenaktivatorer i mennesker for hindring eller behandling av blodpropp eller andre forhold hvor det er ønskelig å produsere en lokal fibrinolytisk eller proteolytisk aktivitet via mekanismen for plasminogenaktiver-ing, slik som arteriosklerose, myokardial og cerebral infarkt, vene-trombose, tromboemboli, etter-operasjon trombose, tromboflebite og diabetisk vaskulopati.

Det var overraskende å finne ut at de nye hybrid PA-proteinene og mutanter derav i henhold til denne oppfinnelsen kombinerer de fordelaktige egenskapene til naturlig t-PA og u-PA. Derfor, er de nye hybrid PA-proteinene og mutantene derav fibrinolytisk aktive. De enestående fibrin-rettede egenskapene, d.v.s. muligheten for aktivering av plasminogen helst ved tilstedeværelse av fibrin, er bevart. Videre, har de nye proteinene en forlenget in vivo stabilitet sammenlignet med autentisk t-PA.

De farmasøytiske preparater innbefatter en terapeutisk effektiv mengde av den aktive bestanddelen (hybrid PA eller mutant derav) sammen med organisk eller uorganisk, fast eller væske farmasøytiske akseptable bærere som passer for parenteral, d.v.s. intramuskulær, subkutant eller intra-peritonealt, administrering og som ikke reagerer på en skadelig måte med de aktive ingrediensene.

Passende løsninger for infusjon, helst vandige løsninger eller suspensjoner, med mulighet for preparering av disse før bruk, for eksempel fra frysetørrede preparater som inneholder den aktive ingrediens alene eller sammen med en bærer, slik som mannitol, laktose, glukose, albumin og lignende. De farmasøytiske preparatene blir steriliserte og, hvis ønskelig, blandet med tilsetningsstoffer, for eksempel konserver-ingsmidler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, oppløse-1ighetsmidler, buffere og/eller salter for regulering av det osmotiske trykket. Sterilisering kan oppnås med steril filtrering gjennom filteret med liten porestørrelse (0.45 pm diameter eller mindre) og deretter kan preparatet bli frysetørret, hvis det er ønskelig. Antibiotika kan også bli tilsatt for å bevare steriliteten.

De farmasøytiske preparatene er fordelt i enhetlige doseformer, for eksempel ampuller, bestående av 1 til 2000 mg av et farmasøytisk akseptabel bærer doseenhet og omtrent 1 til 200 mg, helst omtrent 5 til 100 mg, av den aktive ingrediens per doseenhet.

Avhengig av hvilken sykdomstype og alder og tilstanden til pasienten, er den daglige dosen som blir gitt for behandling av en pasient som veier omtrent 70 kg i området fra 3 til 100 mg, helst fra 5 til 50 mg, per 24 timer. Når det gjelder myokardinal infarkt skal man helst gi en dose på omtrent 30 til 80 mg innenfor 60 til 120 minutter, helst i tre porsjoner og innenfor omtrent 90 minutter. Den totale mengde av hybrid PA eller mutant hybrid PA kan også bli gitt som pille-injeksjon.

Oppfinnelsen innbefatter spesielt hybride vektorer, transformerte vertsstammer og prosedyre for fremstilling derav som det er beskrevet i eksemplene.

Kort beskrivelse av tegningene

I den eksperimentelle delen som følger er forskjellige fremstillinger av denne oppfinnelsen beskrevet med referanse til de vedlagte tegningene hvorpå: Fig. 1 og fig. 3 illustrerer de nukleotidene sekvensene og de utledete aminosyresekvensene til human t-PA cDNA og human u-PA cDNA, respektivt. De første aminosyrene til de endelige proteinene er understreket. Fig. 5 illustrerer skjematisk teknikken som blir brukt til å konstruere plasmid pEcoO.47AScaI. Fig. 6 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid ph'tPAAScaI som inneholder en mutert t-PA cDNA. Fig. 7 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pUNOtc som inneholder et cDNA inskudd bestående av A-kjede domenene til u-PA og B-kjede til t-PA. Fig. 8 beskriver skjematisk konstruksjonen av plasmid ptNC-UC som inneholder et cDNA inskudd bestående av A-kjede domenene til t-PA og B-kjede til u-PA. Fig. 9 beskriver skjematisk konstruksjonen av plasmid pD02. Fig. 10 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pDOlO som inneholder t-PA cDNA som er satt sammen med et beta globin fragment. Fig. 11 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pCGA26 som inneholder t-PAc DNA under kontroll av MCMV IE promoter og et beta globin fragment. Fig. 12 illustrerer skjematisk konstruksjonen av t-PA ekspresjonplasmid pCGA28 og av universal ekspresjonsplasmid pCGA44, begge plasmidene inneholder neomycin resistens-genet. Fig. 13 illustrerer skjematisk konstruksjonen av t-PA ekspresjonsplasmid pCGA42 og universalekspresjonsplasmid pCGA42d, begge plasmider inneholder hygromycin resistens-genet . Fig. 14 illustrerer skjematisk konstruksjonen av t-PA ekspresjonsplasmid pCGA48 som inneholder neomycin-resistens-genet og DHFR-genet. Fig. 15 illustrerer skjematisk konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pBRla som inneholder det muterte t-PA cDNA innskuddet til plasmid ph'tPAAScaI. Fig. 16 illustrerer skjematisk konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pBR2A som inneholder et hybrid PA cDNA inskudd bestående av A-kjede domenene til u-PA og B-kjede til t-PA. Fig. 17 beskriver skjematisk konstruksjonen av u-PA ekspresjonsplasmid pBR3a. Fig. 18 illustrerer skjematisk konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pBR4a som inneholder et hybrid PA cDNA-inskudd bestående av A-kjede domenene til t-PA og B-kjede til u-PA. Fig. 19 viser skjematisk konstruksjonen av gjærekspresjonsvektor pJDB207/ PH05-I-TPA som inneholder PH05 promoter, invertase signalsekvens og t-PA cDNA. Fig. 20 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pCS16. Fig. 21 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pCS16/UPA som inneholder u-PA cDNA. Fig. 22 viser skjematisk konstruksjonen av plasmid PJDB207/ PH05-I-UPA. Figurene 23-26 illustrerer skjematisk teknikkene som ble brukt til å konvertere primære hybrid PA-konstruksjoner inkludert A-kjede domenene og det katalytiske B-kjede området til u-PA eller t-PA til de ferdige konstruksjonene hvor grensene av domenene er ved det aktive setet og/eller ved de naturlige ekson-intron grensesetene: Fig. 23 viser konstruksjonen av et gen som koder for en hybrid PA bestående av A-kjede domenene til t-PA og B-kjede til u-PA. Fig. 24 viser konstruksjonen av et gen somkoder for en hybrid PA bestående av A-kjede domenene til u-PA og B-kjede til t-PA. Fig. 25 viser konstruksjonen av et gen som koder for en hybrid PA bestående av u-PA vekstfaktordomenen, kringle 2 domenen til t-PA og B-kjede til t-PA. Fig. 26 viser konstruksjonen av et gen som koder for en hybrid PA bestående av u-PA vekstfaktordomene, kringle 2 domene til t-PA og B-kjede til u-PA. Fig. 27 er en samling av hybride PA og mutante hybride PA som eksemplifiseres i den eksperimentelle delen.

Symboler som blir brukt i de vedlagte figurene betyr følg-ende : AMP, Amp<R> ampicillin-resistensgen (beta-laktamase) TET, Tet<R> tetracyklin-resistensgen

NEO Tn5 neomycin-fosfortransferase

TN5PR bakteriell promoter til transposon TN5

HPH hygromycin fosfotransferase

pBRori replikasjons-origo til plasmid pBR322

POIS 'gift-sekvens', pBR322 sekvens som inhiberer SV40 replikasjon

SV40ori replikasjons-origo til SV40, som faller

sammen med tidlige og sene promotere. SV40enh, SV40E 72 bp forsterker, del av SV40 tidlig

promoter

HCMVE forsterker av humant cytomegalovirus (HCMV)

hoved umiddelbar tidlig gen

MCMVP promoter/mRNA startsete til muse-cytomegalovirus (MCMV) hoved umiddelbar tidlig gen

RSV Rous sarcoma virus LTR (promoter)

CAP posisjon til 5' m7GP 'cap' til eukaryot

mRNA

polyA polyadenyleringssete til mRNA

SPLD spleis-donorsete, 5' ende til intron

SPLA spleisemottakersete, 3' ende til intron BAP bakteriell alkalin-fosfatase

CIP kalv tarmfosfatase

(BamHl/Bgl2) Sau3a sete som resulterer fra sammenslåing

av et BamHI og et Bglll sete

Seal(del) mutert Seal sete

x < y restriksjonsenzym-sete x lokalisert med

klokken fra y

p promoter

inv.SS invertase signalsekvens

t transkripsjon terminator

L linker DNA

DHFR dihydrofolat-reduktase

mtPA Bowes melanoma t-PA

Eksperimentell del ,

Eksempel 1: Introdusering av et Seal sete ved grensen mellom kringle-strukturene og enzymdomenen i human t-PA cDNA.

En fremgangsmåte som er brukt for å konstruere chimere eller hybride molekyler som inneholder domener fra både t-PA og u-PA består av å lage ønskede restriksjonsfragmenter avledet fra de respektive klonene, sette dem sammen igjen i løsning, deretter kloning av de resulterende konstruksjonene. Etter kloningen blir strukturen av de chimere molekylene verifi-serte ved restriksjonskartlegging og DNA-sekvensanalyser.

For å oppnå de hybride molekylene blir både t-PA og u-PA cDNA kuttet ved grensene mellom de respektive kringle-strukturene og enzymdomenene. Dette oppnår man med u-PA ved utføring av en partiell kutting med restriksjonsendonukleasen Mstl, som separerer den ikke-katalytiske domenen fra enzymdomenen og assosierte sekvenser ved dets 3'ende. Ingen sammenlignbar hensiktsmessig potensiell kuttingssete er tilstede i t-PA, og et blir dermed introdusert slik det står beskrevet nedenfor:

A) Konstruksjon av plasmid pEcoO. 47AScaI ( se fig. 5)

1 denne konstruksjonen, blir det unike Scal-setet (AGTACT) ved nukleotid posisjon 940-945 til t-PA cDNA ødelagt (AGTACT -♦ AGTATT) og et annet Scal-sete introdusert ved de nukleotide posisjonene 963-968 (TCCACC -+ AGTACT) ved 3'enden til kringle 2 (jfr. figurene 1 og 2). Kodingen til ingen av aminosyrene er berørt ved disse forandringene.

Alle restriksjonskuttingene blir utført i henhold til produsentenes (New England Biolabs, Bethesda Research Labs) instruksjoner og de resulterende kuttingene blir analysert ved elektroforese på 3.556 polyakrylamidgel. Gelen blir farget med etidium-bromid (1.0 jig/ml) og visualisert med ultrafiolett lys. Det hensiktsmessige båndet blir kuttet ut og elektroeluert i 0.5 x TBE (1 x TBE = 90 mM Tris-borat, pH 8.3, 2.5 mM EDTA). Det elektroeluerte materialet blir applisert på Elutip-d kolonne (Schleicher og Schuell), det bundne DNA elueres i høy saltkonsentrasjon og presipitert ved tilsetting av etanol. Bunnfallet blir vasket med etanol, tørket og løst i vann.

Plasmid p¥349F (Europa patentsøknad nr. 143,081) som inneholder human t-PA cDNA (syntetisert fra mRNA isolert fra HeLaS3 celler og klonet inn i Pstl setet til plasmid pBR322) blir kuttet med EcoRI og det 470 base-par (bp) fragmentet (jfr. fig. 2) blir isolert. Det 150 bp EcoRI, Seal og det 290 bp EcoRI, Haelll fragmentene oppnås ved kutting av 470 bp EcoRI fragment med Seal og Haelll, respektivt. De to kjedene til 470 bp EcoRI-fragmentet blir separert ved denaturering av DNA i DMSO buffer ( 30% DMSO, 1 mM EDTA, 0.5$ xylen-cyanol, 0.05$ bromfenol blå) og elektroforert på en 5% polyakrylamid-gel i 0.5 x TBE ved 8 volt per centimeter [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 1982]. De separerte kjedene gjenvinnes ved elektroeluering etterfulgt av etanolpresipitering. En 31-mer deoksyoligonukleotid (inkorporerer de 5 ønskede nukleotid-forandringene, jfr. fig. 5) blir syntetisert ved hjelp av fosfotriestermetoden. Femti pmol av 31-mer blir <32>P-merket ved 5'enden i en 20 pl reaksjon som inneholder 1 x kinase-buffer (10 x kinase-buf f er = 0.5 Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM spermidin, 1 mM EDTA), 30 pCi [a<32>P]ATP (Amersham, ~ 3000 Ci/mmol) og 10 enheter T4 polynukleotidkinase (Bethesda Research Labs.). Reaksjonen blir inkubert ved 37°C i 30 minutter etterfulgt av en tilsetting av 1 pl av 10 mM ATP, 10 enheter T4 kinase og videre 30 minutter inkubasjon ved 37°C. Reaksjonen blir avsluttet ved oppvarming ved 68°C i 10 min. Den merkede 31-mer, med sekvens som er slik som den ikke-transkriberte kjeden, blir brukt som probe i en dot blot analyse [utført i henhold til Zoller og Smith, Nucl. Acids Res., 10., 6487-6500

(1982); med unntagelse av at prehybridisasjonen og hybridisa-sjonen blir gjort ved 50°C og vasking ved 60°C] for bestemmelse av hvilken av de to kjedene som hybridiserer til den, d.v.s. representerer den transkriberte kjeden. De fire DNA blir blandet sammen en 20 pl sammensmeltnings-reaksjon som består av 0.3 pmol av den transkriberte kjeden, 2 pmol hver av 150 bp EcoRI, Seal og 290 bp EcoRI, Haelll fragmentene, 25 pmol av fosforylert 31-mer og 1 x sammensmeltingsbuffer (5 x sammensmeltingbuffer = 0.5 M NaCl, 32.5 mM Tris-HCl pH 7.5, 40 mM MgCl2 og 5 mM p<->merkaptoetanol). Blandingen blir inkubert ved 100°C i 3 min., 30°C i 30 min., 4°C i 30 min. og deretter på is i 10 min. etterfulgt av tilsetting av 400 enheter av T4 DNA ligase (New England Biolabs) og reaksjonen inkuberes ved 12.5°C over natten. Det 470 bp sammensmeltede fragmentet blir gjenvunnet fra en 3.55& polyakrylamidgel som beskrevet ovenfor og ligert til EcoRI kuttet og defosforylert pBR322 DNA (New England Biolabs) i 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM spermidin, 0.1 mg/ml bovinserumalbumin ved inkubering over natten ved 12°C. Ligerlngsblandingen blir brukt til å transformere kompetente E.coli stamme HB101 (Maniatis et al., supra). Ampicillin-resistente kolonier blir selektert på L-agar som inneholder 50 jjg/ml ampicillin og kolonier som inneholder det 470 bp fragmentet blir identifisert ved kolonihybridisering ved bruk av 31-mer som probe [D. Woods, Focus 6, 1-3 (1984)]. Plasmid DNA blir isolert i liten skala fra flere positive hybridi-seringskolonier [Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193-197

(1981)] og dannelsen av det nye Seal setet blir verifisert ved kombinert EcoRI, Seal kutting. For å forsikre seg om renheten, blir plasmid DNA fra de positive koloniene for annen gang brukt til transformasjon av E.coli HB101. Stor skala plasmid produksjon blir laget fra en slik annen generasjon positiv koloni [Katz et al., J. Bacteriol. 114, 577-591 (1973); Biochemistry 16, 1677-1683 (1977)] og ødeleggelse av det originale Seal setet og dannelse av det nye Scal-setet blir verifisert ved DNA-sekvensanalyse ved hjelp av metoden til Maxam og Gilbert [Methods Enzym. 65, 499-560 (1980)]. Dette plasmidet designeres pEcoO.47AScaI. B) Rekonstruksjon av human t- PA med mutant Seal sete ( se fig.

61

I denne konstruksjonen blir 470 bp EcoRI fragmentet som er tilstede på vill-type human t-PA erstattes med det 470 bp EcoRI fragmentet som inneholder det mutante Seal setet. Plasmid pW349F som inneholder human t-PA cDNA (se ovenfor) blir kuttet med Clal og de resulterende klebrige endene blir gjort butte ved tilsetting av 50 pm som er av dCTP, dGTP og 10 enheter av DNA-polymerase I, Klenow fragment (Boehringer, Mannheim). Reaksjonen blir inkubert ved romtemperatur i 30 min. etterfulgt av fenol og eter-ekstraksj on og etanol-presipitasjon. Bunnfallet blir løst i vann, kuttet med EcoRI og Seal, og 1.5 kg EcoRI, Seal og 4.3 kb Clal (butt ende), EcoRI fragmentene blir isolerte. Disse to fragmentene blir blandet med 470 bp fragmentet fra plasmid pEcoO.47AScaI etter EcoRI kutting og ligert som beskrevet ovenfor ved 12° C over natten. Kompetente E.coli HB101 celler blir transformert med ligeringsblanding og tetracyklinresistente kolonier selektert på L-agar som inneholder 12.5 pg/ml tetracyklin. Koloniene som inneholder 470 bp mutant fragmentet blir identifisert ved kolonihybridisering ved hjelp av den nevnte 31-mer som probe. DNA fra minilysatene til flere av de positive hybridiserings-koloniene blir fremstilt og den eksakte beskaffenheten av konstruksjonen blir verifisert ved utføring av hensiktsmessig restriksjonskuttinger. Et slikt plasmid med de ønskede forandringene er kalt ph-PAAScal.

Eksempel 2: Konstruksjon av et u-PA/t-PA hybridmolekyl; plasmid pUNC*tc (se fig. 7)

Denne konstruksjonen er en hybrid mellom det ikke-katalytiske området til u-PA (som inneholder 5' ikke-kodete regionen, signal, vekstfaktor og kringlesekvensene) og det katalytiske eller enzymdomenet til human t-PA.

Urokinase cDNA er fremstilt fra mRNA fra human Eep3 celler [jfr. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), s. 188-246]. Et 1.3 kb Smal-BamHI-fragment og et 1 kb BamHI-EcoRI-fragment til u-PA cDNA blir klonet inn i Smal, EcoRI setene til pTJN121 [B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030

(1983)] fører til plasmid pcUK176. Restriksjon endonuklease kartet til human u-PA cDNA inskuddet er vist i fig. 4. Nukleotidsekvensen og utledet aminosyresekvens til u-PA inskuddet er gitt i fig. 3.

Plasmid pcUK176 blir kuttet med Xmal (jfr. fig. 4; Xmal er en isoschizomer av Smal) og Mstl og 521 bp fragmentet blir isolert. Restriksjonsenzym Mstl oppdager DNA-sekvensen TGC^GCA (piler indikerer sete for kuttingen) og danner butte ender etter kuttingen; dette enzymet kutter derfor ut u-PA cDNA ved nukleotidene 520-525, d.v.s. rett etter det siste cysteinresidiet (aminosyre 131) som inneholder kringlen [Holmes et al., Biotechnology 3, 923-929 (1985)], og separerer dermed sekvensen som koder for ikke-katalytiske og katalytiske områder.

Plasmid ph-tPAAScal blir kuttet med Seal og Hindlll (Hind III er tilstede i vektoren) og 1.8 kb fragmentet blir gjenvunnet. Restriksjonsenzym Seal gjenkjenner DNA-sekvensen TGC^GCA (piler indikerer sete for kuttingen) og gir også butte ender etter kuttingen. Seal kutter pbvtPAAScal DNA etter serin-residiet 262 [1 aminosyre etter den siste cystein i kringle 2; Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983)], og dermed separerer de ikke-katalytiske og katalytiske domenene.

De to fragmentene blir blandet og ligert til Xmal, Hindlll kuttet pUC18 vektor DNA. Etter transformering av E.coli HB101, blir koloniene som har det riktige innskuddet identifisert ved kolonihybridisering ved bruk av 2.0 kb Bglll fragment til human tPA (jfr. fig. 2) som probe [proben er merket ved hjelp av "tilfeldig-begynner-metoden": Feinberg et al., Analyt. Biochem. 132, 6-13 (1983)]. DNA-sekvensen ved grensen av liger ingen av u-PA og t-PA fragmentene blir verifisert ved DNA-sekvensanalyse. En korrekt klon er designert pUNC'tc.

Eksempel 3: Konstruksjon av et t- PA/ u- PA hvbridmolekvl: plasmid ptNC- UC ( jfr, fig. 8)

Denne konstruksjonen er bare det motsatte pUNC*tc hvor det ikke-katalytiske området til ph'tPAAScaI (inneholdende 5' ikke-kodet område, leder, finger, vekstfaktor, kringle 1 og kringle 2 domenene) blir fusert til den katalytiske domenen til human u-PA. Plasmid ph*tPAAScaI blir kuttet med SacI og Seal (jfr. fig. 8) og et omtrent 1.0 kb fragment blir isolert. Plasmid pcUK176 blir først kuttet med BamHI og deretter delvis kuttet med Mstl og det omtrent 800 bp fragmentet isolert. Etterpå, blir BamHI kuttede sekvensen kuttet med EcoRI og den omtrent 1.0 kb fragmentet isolert. Disse tre fragmentene blir blandet med pUC19 vektor kuttet med SacI, EcoRI og ligert. E.coli HB101 blir transformert med ligeringsblandingen og kolonier som har det riktige innskuddet blir identifisert ved kolonihybridisering ved hjelp av det samme 2.0 kb Bglll probe som er beskrevet ovenfor. DNA-sekvensen ved grensen mellom t-PA og u-PA DNA er verifisert ved DNA-sekvensanalyse. En riktig klon er kalt ptNC-UC.

Eksempel 4: Konstruksjon av en ekspres. lonvektor for bruk i pattedyrceller.

A. Omdannelse av HgiAI sete i t- PA cDNA til et Hindlll sete Dette gjøres i fem steg (fig. 9).

Plasmid p¥349F (Europa patentsøknad nr. 143,081) er delvis kuttet med restriksjonsenzymet HgiAI ved inkubering av 20 jjg/ml DNA i 1 time ved 37"C med 12 U/ml enzym i bufferen som er anbefalt av produsenten (Bethesda Research Laboratories) med unntagelse av at det er supplementer t med 10 pg/ml etidiumbromid for å undertrykke sekundær kutting av plasmidet. Lineærisert plasmid DNA blir deretter applisert på en 0. 8% agarosegel i TBE-buffer (TBE: 89 mM Tris-borat pH 8.9 som inneholder 1 mM EDTA), éluert elektroforetisk i den samme buffer, ' ekstrahert to ganger med fenol, to ganger med kloroform og til slutt presipitert med alkohol ved -20°C etter tilsetting av 0.1 vol. av 3 M natriumacetat pH 5.2. DNA i bunnfallet blir løst med 0.2 mg/ml i TE (TE: 10 mM Tris-HCl pH 7.2 med 0.1 mM EDTA).

63 pl av lineærisert DNA er deretter inkubert i 30 min. ved 37° C med 15 U T4 DNA polymerase i ligasebuffer [33 mM Tris-acetat (pH 7.9), 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 0.5 mM ditiotreitol og 0.1 mg/ml bovinserumalbumin] etterfulgt av oppvarming i 10 min. ved 60° C for inaktivering av enzymet. Hensikten med denne inkubasjonen er å bruke den eksonukleolytiske aktiviteten til T4 polymerase for fjerning av de fire nukleotidene som stikker ut etter kutting med HgiAI for å oppnå butt-endede DNA-molekyler.

For å ligere Hindlll linkerene (CAAGCTTG) til butt-ende DNA 6 pl (300 ng) kinasebehandlede linkere blir tilsatt til den ovenfornevnte løsningen med 4 pl 10 mM ATP og 3 pl t4 DNA ligase (New England Biolabs, 400 u/pl) etterfulgt av 16 t inkubasjon ved 16"C. Ligeringen avsluttes ved oppvarming av blandingen 10 min. ved 68° C, deretter blir DNA kuttet med Hindlll og Bglll, d.v.s. 15 pl (135 U) Hindlll blir tilsatt med 1.5 pl 4M NaCl, 0.2 pl IM MgCl2 og 11 pl 1 mg/ml bovinserumalbumin, inkubert ved 37°C ilt etterfulgt av tilsetting av 40 U Bglll etterfulgt av 1 t inkubering ved 37° C. Det resulterende 177 baseparfragmentet blir renset på en b% polyakrylamidgel kjørt i TBE, eluert i TNE (TNE: 10 mM Tris-Hcl pH 8.8 som inneholder 100 mM NaCl og 1 mM EDTA), absor-bert til DEAE cellulose (Whatman DE52), eluert med 1 M NaCl i TNE, fortynnet med 4 volumer vann, presipitert ved -20°C etter tilsetting av 2.5 volumer av etanol og deretter løst i 17 pl TE (TE: 10 mM Tris-HCl pH 8.0 som inneholder 1 mM

EDTA).

Plasmid pRSVneo er avledet fra plasmid pSV2neo [P.J. Southern og P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982)] hvor SV40-avledete PvuII-Hindlll fragmentet er blitt erstattet med et PvuII-Hindlll fragment som inneholder LTR-promoter fra Rous sarcoma virus på samme måte som pRSVcat ble konstruert fra pSV2cat [CM. Gorman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 6777-6781 (1982)]. 5 pg av dette plasmidet blir kuttet i et 50 pl volum med 24 U Bglll i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 1 t inkubasjon ved 37° C blir 40 U Hindlll tilsatt og inkubasjonen fortsettes i 1.5 time hvorpå et 5.4 kb stort fragment blir renset som beskrevet ovenfor.

17 pl av det rensede 177 bp fragmentet blir ligert i 18 timer ved 16°C til 2pl (20 ng) av pRSVneo fragment med 0.25 pl (100

U) T4 ligase i et totalt volum på 22 pl ligasebuffer, hvorpå plasmid DNA blir brukt til å transformere E.coli i henhold til D. Hanahan [J. Mol. Biol. 166, 557-589 (1983)]. Fra det resulterende ampicillinresistente stammene blir en selektert som inneholder plasmid designert ptPAL med 177 bp Hindlll-Bglll fragmentet, bevist ved restriksjonsanalyse. 0.1 pg av dette plasmidet blir kuttet i 60 pl med 16 U Bglll som det ble anbefalt av produsenten i 1.5 t ved 37° C. Til denne løsningen blir det så tilsatt 20 U kalv-tarm alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim) og inkuberingen fortsetter i 30 min. hvorpå DNA ekstraheres to ganger med fenol, to ganger med kloroform og presipitert etter tilsetting av 0.1 volum 3.0 M natriumacetat pH 5.2 og 0.6 volum av isopropanol, løst i TE, videre renset ved agarosegelelektroforese som beskrevet ovenfor, ekstrahert to ganger med fenol, to ganger med kloroform, presipitert ved -20°C etter tilsetting av 2.5 volumer etanol og 0.1 vol. 3 M natriumacetat pH 5.2 og deretter løst i 30 pl TE. Det 2.1 kb tPA Bglll fragmentet blir deretter kuttet ut av 5 pg pW349F i en 25 pl reaksjonsblanding ved hjelp av 20 U BG1II i 2 t ved 37°C, renset på en 0.8$ agarosegel, elektroforetisk eluert som beskrevet ovenfor, ekstrahert to ganger med fenol, to ganger med kloroform, presipitert ved -20°C etter tilsetting av 2.5 volumer etanol og 0.1 vol. 3 M natriumacetat pH 5.2 og løst ved en konsentrasjon på 8 ng/pl i TE. 1 pl av t-PA fragmentet blir deretter ligert in en 10 pl reaksjon til 7.5 ng Bglll kuttet vektor DNA med 100 U T4 ligase (Biolabs) i 17 t ved 16°C og deretter transformert i E.coli. En av de resulterende klonene, designert pD02, inneholder t-PA Bglll fragmentet satt inn på en slik måte at plasmidet inneholder en kontinuerlig åpen leseramme for human t-PA. B) Kombinering av t- PA cDNA med beta- globin- fragmentet

Plasmid pDOlO (fig. 10) blir konstruert ved sammensetting av tre DNA-fragmenter: (i) et 2.1 kb fragment som starter med et Hindlll sete og terminerer med et Bglll sete som inneholder hele t-PA kodingsekvensen blir isolert fra en agarosegel som er påsatt 10 pg av pD02 DNA kuttet delvis med Bglll og helt med Hindlll. (ii) pUB er et plasmid som inneholder kanin beta-globin-gen [A. Van Ooyen et al., Science 206, 337

(1979)] subklonet som et Bglll delvis kuttet fragment inn i BamHI setet til plasmid pUC9 [J. Vieira og J. Messing, Gene 19, 259-268 (1982); ibid. 19, 269-276 (1982)]. Fra dette plasmidet blir et 1.2 kb BamHI-HindlII fragment som inneholder det andre introne og polyadenyleringssetet kuttet ut og renset ved agarosegelelektroforese. (iii) Vektor pDOl er bygget opp, i mot klokke retning rekkefølge fra Hindlll setet (fig. 10) til Hindlll-AccI fragmentet til pBR322 som inneholder replikasjonsorigo, et 0.3 kb fragment som inneholder forsterkeren til human cytomegalovirus (HCMV) som terminerer i et syntetisk Xbal sete etterfulgt av et kopi til av denne forsterkeren festet til den homologe promoter som terminerer ved et syntetisk Hindlll sete. Denne vektor DNA blir kuttet med Hindlll og det 6.3 kb lineære plasmidet blir renset ved agarosegelelektroforese.

C) Innsetting av tPA/ globin kombinasjonen inn i pSP62Pst33

( se figur 11)

pSP62Pst33 (fig. 11) er et plasmid som inneholder et 2.1 kb Pstl fragment til musecytomegalovirus (MCMV) DNA, som inneholder det virale umiddelbar tidlig (IE) promoter, satt inn i Pstl setet til plasmid pSP62 (Boehringer Mannheim) som indikert i figuren. Inn i Hindlll setet til pSP62Pst33 blir Hindlll fragmentet satt inn fra pDOlO. Et plasmid, pCGA26, er selektert hvor t-PA kodingssekvensen er satt inn slik at den kan bli transkribert i riktig orientering fra MCMV IE promoteren.

Dl Innsetting av MCMV/ tPA/ globin- enheten inn i pFASV2911neo

( se figur 12)

Plasmid pSV2911neo [F. Asselbergs et al., J. Mol. Biol. 189, 401-411 (1986)] som inneholder neomycin (neo) fosfortrans-ferasegenet fra transposon TN5 i en SV40 ekspresjonskasett (fig. 12). Det utøver dermed resistens til neomycin og kanamycin når den blir introdusert i pattedyrvevskultur-celler. pSV2911neo DNA blir forberedt for kloning ved kutting med BamHI, behandlet med kalv-tarm alkalisk-fosfatase, to ekstraheringer med fenol, to med kloroform, presipitering med alkohol og til slutt løst i TE. Plasmid pCGA26 blir kuttet med restriksjonsenzym AccI, som kutter sekvensen GT/ACAC ved posisjon 345 i MCVM forsterker/promoter regionen [K. Doersch-Haessler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 8325-8329 (1985)] og sekvensen GT/CGAC (kan også bli kuttet med Sali) etter globindelen. De to base-overheng som resulterer etter kutting blir fylt i med E.coli (store fragment) DNA polymerase I, de nå butte endene blir ligert til BamHI linkere (CGGATCCG) og disse blir kuttet med BamHI enzymet. Det 3.8 kb fragmentet som bærer MCMV/tPA/globin enheten nå med BamHI ender blir renset via en agarose gel og deretter ligert til pSV2911neo DNA fremstilt som det var beskrevet ovenfor fører til ekspresjonsplasmid pCGA28.

E) Ekspresjonsvektorer avledet fra pCGA28

pCGA42 er et derivat av pCGA28 hvor neo-kodingssekvensen (mellom Bglll setet og Smal setet) er erstattet av kodingssekvensen til hygromycinresistens-genet. Dette er oppnådd (se fig. 13) ved kutting av plasmid pSV2911neo ved dets unike Smal sete, og ligering av et Bglll linker (CAGATCTG) til DNA etterfulgt av kutting med Bglll. Det resulterende store DNA-fragmentet som består av vektoren minus neokodings-sekvensen blir renset på en agarosegel og ligert til det lille BamHI fragmentet fra plasmid pLG89 [L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)] også renset på en agarosegel, som

fører til plasmidene pCGA25c og pCGA25d, som inneholder hygromycinfosfotransferase-genet i riktig og ikke-riktig orientering, respektivt. Når den blir transfektert inn i CHO DUKXB1 celler ved standard betingelser (se eksempel 16), gir pCGA25C 60 kolonier/jjg DNA resistent til 0.2 jjg/ml hygromycin B, en konsentrasjon som dreper CEO-cellene som inneholder et plasmid som ikke koder for hygromycin-resistens, for eksempel pCGA28. I pCGA25c er sekvensene som koder for hygromycin-B reistens lokalisert slik at i E.coli blir transkribert fra Tn5-promoteren (som i transposon Tn5 transkriberer kanamycin-resistens-genet). En 2.5 ml kultur av "Luria broth" (LB) som inneholder 40 mg/l hygromycin-B inokulert med 0.05 ml av en over natt, d.v.s mettet kultur av E.coli DH1 bakterie (vokst under 50 mg/l ampicillin-seleksjon) når etter 3 t aerert kultur ved 37°C en minst 10 ganger høyere bakterielle tetthet, enn når bakterien med plasmider som ikke inneholder et hygromycin-gen som er funksjonelt i E.coli, slik som pCGA25d, pCGA28 eller pAT153 [A.J. Twigg et al., Nature 283, 216-218 (1980)3, blir testet. Funksjonaliteten av hygromycin-B resistensgenet både i dyrevevskulturceller og i E.coli letter sterkt bruken av plasmid pCGA25c og dets derivater. Plasmid pCGA42 er deretter konstruert ved innsetting av BamHI fragmentet fra pCGA28 som inneholder MCMV/t-PA/beta-globin kassetten inn i pCGA25C. Denne overfører genet som uttrykker t-PA inn i celler som ikke kan bli transformert til geneticin-resistens eller som er allerede er geneticin-resistente. pGA42 kan også uttrykke hygromycin-genet i E.coli, dette fører til at pCGA42 som inneholder E.coli DH1 kan vokse til tettheter som er minst 10 ganger høyere enn, for eksempel, pCGA28 som inneholder E.coli, når de blir testet som det er beskrevet ovenfor.

Plasmid pCGA28 inneholder to SacI seter, det ene opprinnelig del av en linker like bak MCMV-promoteren, den andre i t-PA cDNA. Sekvensen mellom SacI setene er fjernet ved kutting først med restriksjonsenzymet, rensing av det større fragmentet via en agarosegel og sirkularinsering av dette lineære DNA ved hjelp av T4 DNA ligase, som danner plasmid pCGA44 (se fig. 12). En hvilken som helst cDNA som er klonet i den riktige orienteringen inn i det nå unike Sacl-setet til pCGA44 erstatter effektivt t-Pa kodingssekvensen til pCGA28 og blir effektivt uttrykt.

pCGA42d er avledet fra pCGA42 ved fjerning av 1.4 kb SacI fragmentet (se fig. 13). Inn i den nå unike SacI setet kan cDNA som er forskjellige fra t-PA cDNA bli satt inn og uttrykkes på et høyt nivå i vevskulturceller.

Eksempel 5: Innsetting av u- PA. t- PA og hybride PA cDNA inn i ekspres. ionvektor pCGA28

A) Innsetting av t- PA cDNA ( se figur 15)

I denne konstruksjonen, blir t-PA cDNA-fragmentet fra plasmid ph-tPAAScal satt inn i pCGA28. Denne konstruksjonen er ansett å være nødvendig for å virke som en kontroll for forandringer som kan ha skjedd i løpet av restruktureringen av Seal setet. 1.4 kb SacI fragmentet blir isolert fra plasmid ph-tPAAScal etter SacI kutting. Ekspresjonvektor pCGA28 blir også kuttet med SacI og 8.2 kb vektorfragmentet blir isolert og defosforylert i 100 pl reaksjonsblanding som inneholder 0.1 mM Tris pH 8.0, 0.1$ SDS og 0.02 enheter bakterielle alkalisk fosfatase. Etter inkubering ved 60°C i 30 min., blir reaksjonen ekstrahert to ganger med fenol og eter og deretter presipitert med etanol. Bunnfallet blir løst i vann og en del av det blir brukt til legering til 1.4 kb SacI fragmentet fra ph-tPAAScal. Ligeringsblandingen blir brukt til å transformere E.coli EB101 og minilysat DNA som er fremstilt fra ampicillin-resistente kolonier blir kuttet med hensiktsmessige restriksjonsenzymer for å verifisere om SacI innsatte fragmentet har den ønskede orienteringen. Plasmidet som har den ønskede orienteringen kalles pBRlA. Plasmidet med SacI fragmentet i motsatt orientering kalles pBRlB.

B) Innsetting av hybrid UPA^ tpaS cDNA ( se figur 16).

I denne konstruksjonen, blir hybrid UPA<A>TPA cDNA fragmentet fra plasmid pUNC.tc satt inn i ekspresjonvektor pCGA28. pUNC.tc DNA blir kuttet med Smal (jfr. figur 7), og 1.24 kb fragmentet blir isolert og ligert til SacI kuttet, defosforylert 8.2 kb pCGA28 vektor DNA. E.coli HB101 cellene blir transformert med ligeringsblandingen og kolonier som inneholder SacI inskuddet i den ønskede orienteringen idenfisert ved utføring av restriksjonskuttinger på minilysat DNA. Plasmid med pUNC.tc DNA inskuddet i den ønskede orienteringen er designert pBR2A og den med motsatt orientering pBR2B.

C) Innsetting av u- PA cDNA ( se figur 17)

I denne konstruksjonen, blir human u-PA DNA satt inn i ekspresjonsvektor pCGA28 og sammen med pBRl tjener dette plasmidet som foreldreplasmidkontroll og bekrefter nyttig-heten av pCGA28-type vektorer. Plasmid pcUK176 blir kuttet med Smal, Ahalll (jfr. Fig. 4), 2.25 kb fragmentet isoleres, og ligeres til fosforylert SacI linkeren som beskrevet ovenfor. Etter SacI kuttingen, isoleres 2.25 kb fragmentet og ligeres til SacI kuttet, defosforylert 8.2 kb pCGA28 DNA fragmentet. E.coli HB101 blir transformert og kolonier som inneholder ønskede plasmid identifisert ved kutting av minilysat DNA med restriksjonsenzymer. Plasmidet med human u-PA DNA i riktig orientering blir kalt pBR23A og det i motsatt orientering pBR3B.

D) Innsetting av hybrid TPA^ UPA^ cDNA ( Fig. 18)

Her blir hybrid TPA<A>UPA cDNa fra plasmid ptNC.UC satt inn i ekspresjonsvektor pCGA28. 2.75 kb Smal (tilstede i vektoren), Ahalll fragment blir isolert fra ptNC.UC DNA, ligert til fosforylert SacI linker, linkeren 2.75 kb fragmentet blir isolert og ligert til SacI kuttet, defosforylert vektor DNA og de ønskede koloniene identifisert som det er beskrevet ovenfor. Plasmidet med ptNC.UC DNA innskuddet i den riktige orienteringen blir kalt pBR4A.

Eksempel 6: Konstruksjon av en g. iærekspres. ionsvektor som inneholder PH05 promoter. invertasesignalsekvens og t- PA kode- område

A) Syntese av oligodeoksyribonukleotider for invertase-signal- sekvenser

Fire oligodeoksyribonukleotider: I-l, 1-2, 1-3, 1-4 blir syntesisert ved hjelp av DNA-syntesemaskin (modell 380B Applied Biosystems). Etter deblokkering blir de syntetiske fragmentene renset på en 12% polyakrylamidgel som inneholder 8 M urea. Salt-frie rene oligodeoksyribonukleotider oppnås ved bruk av Sep. Pak (Waters Associates). Disse fragmentene består av duplekser som koder for invertase-signalsekvensen med gjærkodoner som ofte blir brukt.

B) Subkloning av invertase signalsekvensen i plasmid p31

a) Fremstilling av vektor:

1.5 pg av p31R/SS-TPAA2 (Europa patentsøknad nr. 143,081)

blir kuttet med 10 U EcoRI (Boehringer) i 50 pl av 10 mM Tris.HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol i en time ved 37"C. Etter tilsetting av 1 pl av 2.5 M NaCl, 10 U Xhol (Boehringer) blir tilsatt og inkubert ved 37"C i en

time. 4.2 kb vektoren blir isolert på en 0. 8% preparativ agarosegel. Gel-biten blir overført til en Micro Colloidor tube (Sartorius GbmE), dekket med 200 pl TE og elektroeluert (elektroforese ved 90 mA i 50 min.). TE-løsningen blir samlet og presipitert i 2.5 volum absolutt etanol etter tilsetting av 0.1 volum 10 x TNE. DNA-bunnfallet blir vasket med kald 80% etanol og tørket i vakuum. DNA blir resuspendert i 6 pl TE (40 pmol/pl). b) Sammensmelting av oligodeoksyribonukleotider ( I- l. 1- 2. I-3. 1- 4). behandling med kinase og ligering med vektor.

En løsning som inneholder 10 pmol av hver av de fire deoksy-ribonukleotidene i 10 pl av 0.5 M Tris.HCl pE 8 blir inkubert ved 95°C i 5 minutter på et vannbad. Vannbadet avkjøles sakte til 30° C over en periode på 5 timer. Til denne sammensmeltningsblandingen blir det tilsatt 2 pl hver av 0.1 M MgCl2, 0.1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP og 8 TJ (1 pl) polynukleotid-kinase (Boehringer). Kinasebehandlingen utføres ved 37°C i en time. De sammensmeltede, kinasebehandlede oligodeoksyribonukleotidene og 60 pmol av p31R/SS-TPAA2 kuttede vektor (1.5 pl) blir ligert med 400 U (1 pl) T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 14° C i 17 timer. Reaksjonen blir stoppet ved inkubering ved 65°C i 10 min. 10 pl av denne ligeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli HB101 Ca<++> celler [M. Dagert og S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28

(1979)]. 20 amp<R> kolonier blir plukket. DNA blir fremstilt ved hjelp av den raske isoleringsprosedyren (D.S. Eolmes og M. Quigley. Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)]. DNA blir kuttet med EcoRI og Xhol, merket radioaktivt med EcoRI ende og analysert på b% polyakrylamidgel som inneholder 8 M urea ved hjelp av radioaktivt merket pBR322 Eaelll kuttet DNA som markør. Bånd med riktig størrelse blir observert fra DNA som er oppnådd fra alle 20 klonene. En klon ble dyrket i 100 ml LB medium som inneholder 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA er isolert og er referert til som p31RIT-12.

C) Konstruksjon av PJDB207/ PH05- I- TPA ( se fig. 19)

a) Fremstilling av vektor:

Tre pg pJDB207/PH05-TPA18 (Europa patentsøknad nr. 143,081)

blir inkubert ved 37°C i en time med 10 U BamHI i 50 pl 10 mM Tris.HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol. En del er sjekket på en 1$ agarosegel i TBE-buffer for å fastslå fullstendig kutting. Kutting-blandingen blir inkubert ved 65°C i 10 min. Deretter blir 0.5 pl 5 M NaCl tilsatt etterfulgt av 15 U Xhol (Boehringer). Dette blir inkubert ved 37° C i en time. 6.8 kb vektor blir isolert på en 0.8$ preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og etter presipitering løst i TE.

b) Xhol kutting av P31/ PH05- TPA18:

Tretti pg p31/PH05-TPA18 (Europa patentsøknad nr. 143,081)

ble inkubert ved 37° C i en time med 60 U Xhol ( 15 U/pl) i 200 pl 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol, ekstrahert med et likt volum fenol-kloroform, og presipitert i etanol.

c) Partiell Pstl kutting av Xhol kuttet p31/ PH05- TPA18

Det presipiterte Xhol kuttet p31/PH05-TPA18 DNA blir resuspendert i 250 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol, 2.5 mg etidium-bromid, inkubert ved 37°C i 35 minutter med 22.5 U Pstl, og ekstrahert med et likt volum fenol, etterfult av et likt volum kloroform-isoamylalkohol (50:1). 1.6 kb fragmentet blir isolert på en 1% preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert [innskudd 1].

d) Sall- Xhol kutting av P31RIT- 12:

Tretti pg p31RIT-12 blir inkubert ved 37°C i en time med 60 U

Sali (Boehringer 12 U/pl) og 60 U Xhol (15 U/pl) i 200 pl 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol, ekstrahert med likt volum fenol-kloroform og presipitert i etanol. 869 bp fragmentet blir isolert på en 1.2$ preparativ agarosegel. DNA ble ekstrahert ved elektroeluering, avsaltet over DE-52, og presipitert i etanol.

e) Hgal kutting av Sall- Xhol kuttet P31RIT- 12

Sall-Xhol kuttet p31RIT-12 blir resuspendert i 100 pl 6 mM

Tris.HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol, 10 mg bovinserumalbumin og blir inkubert ved 37°C i en time med 6 U Hgal (Biolabs, 0.5 U/pl). 600 bp-fragmentet blir isolert på en 1. 2% agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert i etanol.

f) Baseparring av linker- oligonukleotider

90 pmol av to oligodeoksyribonukleotider med følgende

sekvenser

Hgal Pstl

5' CTGCATCTTACCAAGTGATCTGCA 3'

3'AGAATGGTTCACTAG 5'

blir suspendert i 10 pl 0.5 mM Tris.HCl pH 8 i et silikoni-sert Eppendorf-rør. Løsningen blir inkubert ved 95°C i 5 min. og deretter sakte avkjølt til romtemperatur over natten.

g) Kinasebehandling av linker

Til løsningen ovenfor blir det tilsatt 2 pl 0.1 M KC1, 2 pl

0.1 M MgCl2, 3pl 30 mM DTT, 1 pl 200 mM ATP, 8 U polynukleotid (8U/pl). Dette blir inkubert ved 37°C i en time. h) Ligering av Hgal- fragmentet fra p31RIT- 12 med kinasebehandlet linkerene.

Kinasebehandlet linker-løsningen blir overført til et rør som inneholder det tørre Hgal-fragmentet, og 400 U T4 DNA ligase blir deretter tilsatt. Løsningen blir inkubert ved romtemperatur (21-22°C) i 90 minutter, fortynnet til 100 pl med TE og ekstrahert med et likt volum fenol-kloroform. Fragmentet blir presipitert ved tilsetting av 0.6 volum isopropanol og 0.1 volum 3 M natriumacetat ved romtemperatur til den vandige løsningen.

i) BamHI- PstI kutting av løsningen ovenfor.

Det ovenfor tørre DNA blir kuttet med 10 U BamHI og 10 U Pstl i 20 pl 10 mM Tris.HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanol i en time ved 37°C. Etter fortynning til 100 pl blir løsningen ekstrahert med et likt volum fenol-kloroform, og det vandige laget blir presipitert i isopropanol [inskudd 2].

j) Ligering av de tre fragmentene

100 fmol pJDB207/PH05-TPA18 BamHI-XhoI kuttet vektorfragment, 200 fmol av hver av de andre to inskuddfragmentene [1 og 2] blir ligert i 10 pl 50 mM Tris.HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 U T4 DNA ligase i 16 timer ved 15°C. Reaksjonen stoppes ved inkubering ved 65°C i 10 min. 5 pl av denne legeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli HB101 Ca<++> celler. 10 amp<R> kolonier ble plukket og DNA fremstilt ved hjelp av den raske isoleringsprosedyren. Etter analyse med EcoRI, Pstl og BamHI-Hindlll ble fragmenter med korrekt størrelse observert. En klon ble dyrket i 100 ml LB-medium som inneholder 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA blir isolert og blir referert til som pJDB 207/PH05-I-TPA.

Eksempel 7: Konstruksjon av plasmid pCS16/ UPA som inneholder det området som koder for u- PA.

A) Konstruksjon av plasmid pCS16 ( se figur 201.

Et 1.5 kb Pstl-BamHI-fragment av plasmid pUN121 [B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)] som inneholder cl genet til fag-lambda og deler av tetracyklin-resistens-genet er klonet inn i pUC18 [J. Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)], og kuttet med Pstl og BamHI. Den resulterende klonen blir kuttet med Pstl. De 3' overhengende ender blir fjernet i en reaksjon med T4 DNA-polymerase og Xhol-linkerne blir ligert til de butte endene. Etter kutting med Xhol blir molekylet resirkulert ved hjelp av ligering. En prøve av legeringsblandingen blir brukt til å transformere Ca<++> behandlede E.coli HB101 celler. DNA til individuelle ampicillin resistente, transformerte kolonier ble analysert. En av flere korrekte kloner blir valgt og referert til som pCS16.

B) Konstruksjon av plasmid pCS16/ UPA ( se figur 21)

Urokinase cDNA slik den består i plasmid pcUK176 (se eksempel 2) blir subklonet i plasmid pCS16. Subklonet cDNA strekker seg fra Smal-setet i 5' ikke-translaterte området (fig. 4) til PvuII-setet ved nukleotidposisjonene 1439-1444 i det 3' ikke-translaterte området (med nummerering i henhold til fig. 3) . 15 pg plasmid pcUK176 blir kuttet med PvuII. Det 379 bp PvulI-fragmentet blir isolert fra andre fragmenter på en 1.5$ agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8.3. DNA blir elektroeluert, renset på DE52 (Whatman) ion-bytte-kromatografi og presipitert med etanol. 1.2 pg av enkel kjedet Xhol linkere (5'-CCTCGAGG-3') blir fosforylert ved 5' endene, varmet i 10 min. ved 75° C, sammensmeltet ved avkjøling til romtemperatur og oppbevart ved -20°C. 0.9 pg av kinasebehandlet, dobbelkjedet Xhol-linkere blir ligert ved en 80-eks molart overskudd til de butte endene til 379 bp PvuII-fragmentet til pcUK176 (se ovenfor) i 20 pl 60 mM Tris.HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2. 5 mM DTT, 3.5 mM ATP og 400 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15° C i 16 timer. Blandingen blir varmet i 10 min. ved 85°C. Overflødige linker-molekyler blir fjernet ved presipitasjon med 0.54 volumer isopropanol med tilstedeværelse av 10 mM EDTA og 300 mM natriumacetat pH 6.0 i 30 min. ved romtemperatur. DNA blir kuttet med Xhol og BamHI. Et 121 bp BamHI-XhoI-fragment blir isolert på en 1. 5% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8.3. 6 pg plasmid pcUK176 ble kuttet med Smal og BamHI. Et 1.3 kb Smal-BamHI-fragment som inneholder mesteparten av u-PA kodingssekvens blir isolert. 6 pg av plasmid pCS16 ble kuttet med Smal og Xhol. 2.7 kb vektorfragmentet ble isolert. DNA-fragmentene blir elektroeluert fra gelen og etanolpresipitert. 0.2 pmol av 1.3 kb Smal-BamHI fragmentet, 0.2 pmol av 121 bp BamHI-Xhol fragmentet (begge fragmenter består sammen av hele u-PA kodingssekvensen) og 0.1 pmol av 2.7 kb vektorfragmentet blir ligert i 10 pl 60 mM Tris.HCl pH 7.5, 10 mM MgClg, 5 mM DTT, 3.5 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase ved 15°C. En og 3 pl prøver av 1 igeringsblandingen blir satt til 100 pl av Ca<++ >behandlet E.coli HB101 celler. Transformasjonen utføres slik det er beskrevet [A. Hinnen et. al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. 12 ampicillin-resistente kolonier dyrkes opp i LB-medium som inneholder 100 mg/l ampicillin. DNA blir isolert i henhold til Holmes et al., [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analysert ved EcoRI, PvuII og Xhol restriksjonskutting. En klon med de ventede restriksjonsfragmentene blir referert til som pCS16/UPA.

Eksempel 8: Konstruksjon av plasmid pJDB207/PHO5-I-UPA

( fig. 22)

pJDB2 0 7/ PHO 5-1-UPA inneholder PH05 promoter, invertase signalsekvensen, kodingssekvensen til ferdig urokinase og

PH05 transkripsjonsterminator i en tandem oppstilling, klonet inn i pJDB207 gjær-ekspresjonsvektor. 20 pg plasmid pCS16/UPA blir kuttet helt med 40 enheter EcoRI. Etter fenol-ekstraksjon og etanol presipitasjon blir det EcoRI kuttede DNA videre kuttet med Taql ved 65°C. De resulterende fragmentene blir separert på en preparativ 1. 2% agarosegel. Det 462 bp Taql-EcoRI fragmentet blir isolert ved elektroeluering fra gel og etanol-presipitasjon.

En oligodeoksyribonukleotid-linker med følgende formel

(I) 5'-CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3 *

(II) 3'- TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5'

blir ligert til Taql setet på DNA-fragmentet. Linkeren gjenoppretter 5' terminale enden til kodingssekvensen til ferdig u-PA (nukleotidene 130-154, fig. 3) og etablerer riktig leseramme ved fusjonen til invertase-signalsekvensen. 5'-CTGCA sekvensen til linkeren fyller den korresponderende 3' avbrutte enden til invertase-signalsekvensen som ble dannet ved Hgal-kutting.

300 pmol av hver av ol igodeoksynukleot idene I og II blir fosforylert og sammenføyd. 5.25 pg (600 pmol) av fosforylert, dobbeltkjedet linker DNA blir ligert til 1.7 pg (5.6 pmol) av 462 bp Taql-EcoRI fragment (se ovenfor) i 175 pl 60 mM Tris.HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT og 800 enheter T4 DNA ligase ved 15 °C i 16 timer. T4 DNA ligase blir inaktivert i 10 min. ved 85° C. Linkere som er i overskudd blir fjernet ved presipitasjon ved tilstedeværelse av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6.0 og 0.54 volum isopropanol. DNA blir kuttet med Pstl. Et unikt 312 bp fragment som inneholder linkeren knyttet til DNA-sekvensene som koder for u-PA opp til nukleotid 436 (Pstl sete, se fig. 3) blir isolert. DNA-fragmentet blir renset ved elektroeluering og presipitasjon med etanol.

Plasmid pCS16/UPA blir kuttet med Xhol og Pstl. Et 1007 bp Pstl-Xhol fragment blir isolert og renset. Dette fragmentet inneholder mesteparten av kodingssekvensen for urokinase.

Plasmid p31RIT-12 (se eksempel 6B) blir kuttet med Sali og Xhol. Et 882 bp Sall-Xhol fragment blir isolert fra gelen ved elektroeluering og etanol-presipitasjon. Fragmentet blir videre kuttet med BamHI og Hgal. Et 591 BamHI-Hgal fragment som inneholder PH05 promoter region og invertase-signalsekvensen blir isolert.

Plasmid pJDB207/PH05-TPA18 (se Europa patentsøknad nr. 143,081) bli kuttet med BamHI og Xhol. 6.8 kb vektorfragmentet blir isolert på en preparativ 0.6$ agarosegel i Tris-acetatbuffer pH 8.2. DNA blir elektroeluert og presipitert med etanol.

Alle DNA-fragmentene blir resuspendert i H20 ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl. 0.2 pmol av 591 bp BamHI-Hgal fragment, 0.2 pmol 312 bp Hgal-Pstl fragment, 0.2 pmol 1007 bp Pstl-Xhol fragment og 0.1 pmol 6.8 kb BamHI-XhoI vektorfragment ble ligert i 15 t ved 15°C ved 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheter T4 DNA ligase. En pl av liger ingsblandingen blir brukt til å transformere E.coli HB101 Ca<++> celler. 12 amp<R> kolonier blir plukket og dyrket i LB medium som inneholder 100 mg/l ampicillin. DNA blir fremstilt ved hjelp av den raske isolasjonsprosedyren [D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. Ved restriksjonskutting av plasmid DNA med Hindlll og EcoRI ble de ventede restriksjonsfragmentene observert. Plasmid DNA fra en enkel klon ble selektert og referert til som pJDB207/ PH05-1-UPA.

Eksempel 9: Et t- PA/ u- PA hybrid- plasminogen- aktivator med t-PA A- k. iede domenene og u- PA B- k. iede ( primær DNA- konstruksjon)

En annen fremgangsmåte for konstruksjonen av en i riktig leseramme fusjon av DNA-sekvenser som koder for A-kjede til t-PA og B-kjede til u-PA ved en forutbestemt posisjon består av to steg: Først, blir hensiktsmessige restriksjonsfragmenter med kodingssekvensene ligert. DNA blir fremstilt i E.coli og subklonet i M13 for å oppnå enkel-kjedete templater. I neste steget blir nukleotidsekvenser som er i overskudd fjernet ved in vitro mutagenese. Den nøyaktige i riktig leseramme grensen mellom t-PA A-kjeden og u-PA B-kjeden er ved aktiveringssetet. Mutant DNA blir subklonet i en passende ekspresjonsvektor for gjær og pattedyrcelle-linjer. a) Isolering av DNA- f ragmentet som koder for t- PA A- k. ieden: 10 pg plasmid pJDB207/ PH05-I-TPA (se eksempel 6) blir kuttet med BamHI og PvuII. Den 1.7. kb BamHI-PvuII fragmentet blir separert på en 0. 8% agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8.3. DNA-fragmentet inneholder PH05 promoteren, invertase-signalsekvensen og kodingssekvensen for ferdig t-PA opp til PvuII restriksjonssete [jfr. fig. 1; nukleotidposisjoner 1305-1310]. DNA blir elektroeluert, presipitert med etanol og resuspendert i HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl. b) Isolering av et DNA- fragment som koder for u- PA B- kjeden: Plasmid pCS16/UPA (se eksempel 7B) blir kuttet med Ball (jfr.

figurene 3 og 4, nukleotide posisjoner 573-578) og Xhol. Det 868 bp Ball-Xhol fragmentet blir isolert som ovenfor og resuspendert i HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl.

c) Ligering av fragmenter til vektorfragmentet:

Plasmid pJDB207/PH05-TPA18 (Europa patentsøknad nr. 143,081)

blir kuttet med BamHI og Xhol. 6.7 kb vektorfragmentet blir isolert på en 0.85é agarosegel i Tris-acetat-buffer pH 8.2. DNA ble elektroeluert, etanolpresipitert og resuspendert i HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl.

0.2 pmol 1.7 kb BamHI-PvuII fragment, 0.2 pmol 868 bp Ball-Xhol fragment og 0.1 pmol 6.7 kb BamHI-XhoI vektorfragment blir ligert i 10 pl 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 400 enheter T4 DNA ligase (Biolabs) ved 15°C i 16 timer. En og 3 pl prøver av ligeringsblandingen blir satt til 100 pl Ca<++> behandlet E.coli HB101 celler. Transformasjonen utføres som vanlig.

Seks transformerte, ampicillin-resistente kolonier dyrkes i LB-medium som inneholder 100 mg/l ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt i henhold til metoden til Holmes et al.

[Analyt. Biochem. 114, 193 (1981)] og analysert ved restrik-sj onskutting med BamHI og Pstl. En klon med de ventede restriksjonsfragmentene blir referert til som pJDB207/PH05-I-TPA<Å>UPA.

Eksempel 10: En u- PA/ t- PA hvbridplasminogen- aktivator med u-PA A- k. iede domenene og t- PA B- k. ieden ( primær DNA- konstruk-s. i on)

Den primære hybrid DNA-konstruksjonen består av u-PA nukleotidsekvensene fra Smal-setet til EcoRI-setet (se fig. 4) festet til t-PA nukleotidsekvensene fra Scal-setet (posisjonene 940-945) til Xhol-setet som er introdusert ved posisjon 1800 via en Xhol-linker. Den resulterende hybrid DNA-sekvensen inneholder nukleotitder i overskudd som blir fjernet ved in vitro mutagenese. Den nøyaktige, i riktig leseramme grense mellom u-PA A-kjeden og t-PA B-kjeden er ved aktiveringssetet.

a) Isolering av et DNA- f ragment som koder for u- PA A- k. 1eden: 7 pg av plasmid pCS16/UPA ble kuttet med EcoRI. De klebrige endene til de resulterende 3 fragmentene blir overført til butte ender ved hjelp av en inn-fyllingsreaksjon med 7.5 enheter Klenow DNA-polymerase (BRL) med tilstedeværelse av 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 0.1 mM dATP og 0.1 mM dTTP i 30 min. ved 25°C. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetting av EDTA til en final konsentrasjon på 12.5 mM. DNA blir videre kuttet med Kpnl. Et 619 bp Kpnl-butt [EcoRI] endefragment blir isolert på en 1.556 agarosegel i Tris-borat-EDTA-buf f er pH 8.3, elektroeluert og etanolpresipitert. b) Isolering av et DNA- fragment som koder for t- PA B- kjeden: 6 pg av plasmid pJDB207/PH05-TPA18 blir kuttet med Seal og

Xhol. Et 860 bp fragment blir isolert på en 1.256 agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8.3, elektroeluert og etanolpresipitert .

c) Ligering av DNA- fragmentene til en pUC18 avledet vektor:

5 pg av plasmid pCS16/UPA (se eksempel 7) blir kuttet med

Kpnl og Xhol. Det resulterende 2.7 kb fragmentet blir isolert på en 0.856 agarosegel i Tris-borat-EDTA-buf f er pH 8.3. DNA ble elektroeluert og etanolpresipitert. Alle DNA-fragmentene ble resuspendert i HgO med en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl.

0.2 pmol av 619 bp Kpn-butt ende u-PA fragment, 0.2 pmol 860 bp Scal-Xhol vektorfragment ble ligert som beskrevet ovenfor (eksempel 9). Ca<++> behandlet E.coli HB101 celler ble transformerte. 12 transformerte, ampicillin-resistente kolonier dyrkes i LB-medium supplementert med ampicillin (100 mg/l). DNA blir fremstilt i henhold til Holmes et al.

(supra) og analysert ved restriksjonskutting med EcoRI og

Pstl. En enkel klon med de ventede restriksjonsfragmentene blir referert til som pCS16/UPA<A>TPA.

Eksempel 11: En u- PA/ t- PA hybrid- plasminogen- aktivator med den andre kringlen og den katalytiske B- kjeden til t- PA

( primær konstruksjon)

Et hybrid plasminogen-aktivator-gen som består av DNA-sekvensene til urokinase "vekstfaktor-lignende" (U)-domene, den andre kringle-domenen (K2) til t-PA og den katalytiske B-kjeden til t-PA blir konstruert på følgende måte: To DNA-restriksjonsfragmenter som koder for u-PA vekstfaktordomenen og t-PA K2 kringle og B-kjeden, respektivt, blir ligert og satt inn i plasmid pCS16. Den resulterende klonen blir kalt pCS16/UK2TPA. Et fragment som inneholder u-PA og t-PA kodingssekvensene blir subklonet inn i M13. In vitro mutagenese blir utført på enkel-kjede til DNA for å fjerne DNA-sekvenser som er i overskudd ved grensen mellom u-PA og t-PA-sekvensen.

5 pg av plasmid pCS16/UPA blir kuttet med Ncol (nukleotid posisjonene 326-331, se fig. 4). De klebrige endene til restriksjonsfragmentene blir fylt i en reaksjon med 5 enheter av Klenow DNA-polymerase I (BRL) ved tilstedeværelse av 0.1 mM hver av dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2 i 50 pl i 30 min. ved romtemperatur. Reaksjonen stoppes ved tilsetting av EDTA til en final konsentrasjon på 12.5 mM. DNA blir etanolpresipitert og videre kuttet med Xhol. Det 3 kb Xhol-butte ende [Ncol] fragmentet blir isolert på en 0. 8% agarosegel i Tris-borat-EDTA pH 8.3, elektroeluert og etanolpresipitert. Dette fragmentet inneholder pCS16 vektoren og sekvensen som koder for u-PA vekstfaktordomenen. 10 pg av plasmid pJDB207/ PH05-TPA18 (Europa patentsøknad nr. 143,081) blir kuttet med BstXI [nukleotide posisjoner 577-588]. Det lineære DNA-fragmentet med 3' overhengende ender blir inkubert med 10 enheter T4 DNA-polymerase (BRL) i 100 pl 33 mM Tris-acetat pH 7.9, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 0.5 mM DTT og 0.1 mg/ml bovinserumalbumin i 2.5 min. ved 37°C. Deretter fortsettes inkubasjonen i 35 min. ved 37°C med tilstedeværelse av 0.1 mM hver av dATP, dCTP, dTTP, DGTP i et totalt volum på 200 pl. DNA blir etanolpresipitert og kuttet videre med Xhol. Det 1.2 kb butte ende [BstXI]-Xhol-fragmentet blir separert på en 0.8 % agarosegel, elektroeluert og etanolpresipitert. Dette fragmentet inneholder sekvensen som koder for K2 og B-kjeden til t-PA.

0.2 pmol av 1.2 kb t-PA fragmentet og 0.1 pmol av 3 kb u-PA/vektorfragmentet (se ovenfor) blir ligert som beskrevet. Aliquoter av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere kompetente E.coli HB101 celler. Ampicillin-resistente kolonier blir selektert på LB agarskåler som inneholder 100 mg/l ampicillin. DNA blir fremstilt fra individuelle transformanter og analysert ved Seal og Smal restriksjonskuttinger. En klon som inneholder 0.5 kb Seal og 1.55 kb Smal grense-fragmentene blir selektert og referert til som pCS16/UK2TPA<B.>

Eksempel 12: En t- PA/ u- PA hybrid plasminogenaktivator med den andre kringle til t- PA og den katalytiske B- kjeden til u- PA ( primær konstruksjon).

Et hybrid plasminogenaktivatorgen som består av DNA-sekvensen til urokinase "vekstfaktorlignende" (U) domenen, den andre kringle (K2) til t-PA og den katalytiske B-kjeden til u-PA blir konstruert på en måte som er analog til det som var beskrevet i eksempel 11.

Konstruksjon av plasmid PCS16/ UKQ UPAB-:

5 pg plasmid pCS16/UPA blir kuttet med Bglll og Ncol (nukleotide posisjoner 391-396 og 326-331, respektivt, se figur 4). De klebrige endene til restriksjonsfragmentene blir fylt i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase I (BRL) som beskrevet ovenfor. Det 4.2 kb DNA-fragmentet med butte ender blir isolert på en 0. 8% agarosegel i Tris-acetat-buffer pH 8.2. DNA blir elektroeluert og etanolpresipitert. Dette fragmentet inneholder u-PA G-domene og u-PA B-kjeden festet til vektormolekylet. 10 pg plasmid 31/PH05-TPA18 (Europa patentsøknad nr. 143,081) blir kuttet med Alul. Et 447 bp Alul fragment som inneholder hele K2 domenet til t-PA blir isolert på en 1.5 % agarosegel i Tris-borat-EDTA pH 8.3. DNA-fragmentet blir elektroeluert og etanolpresipitert.

0.2 pmol av 477 bp fragmentet og 0.1 pmol av 4.2 kb fragmentet blir ligert. Aliquoter av 1igeringsblandingen blir brukt til å transformere kompetente E.coli HB101 celler. Transformerte celler blir selektert på LB-agarskåler med 100 mg/l ampicillin. DNA blir fremstilt fra ampicillin-resistente celler og analysert ved EcoRI og Seal kuttinger. En enkelt klon som viser 551 bp EcoRI fragmentet og et 403 bp Seal fragment inneholder Alul fragment i riktig orientering. Denne klonen refereres til som pCSlb/UKgOT-k13.

Eksempel 13: Kloning av primære hybrid DNA- konstruksjoner i M13mpl8.

A) Kloning av pJDB207/ PH05- I- TPA^ UPA£ BamHI fra<g>mentet i M13mpl8

1.5 pg pJDB207/ PH05-I-TPAAUPAB (jfr. eksempel 9) er oppnådd fra en rask DNA-f remstilling blir kuttet med 9 U BamHI (Boehringer) i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgClg, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol ved 37 °C i en time. Etter tilsetting av 1 pl RNase (Serva, 1 mg/ml), inkubering i 15 min. ved 37°C og fenolisering, blir 2.5 kb inskuddet isolert på en 0.856 preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert.

1 pg M13mpl8 (RF) blir kuttet med BamHI, behandlet med kalv-tarm alkalisk fosfatase og 7.3 kb vektorfragmentet blir isolert på en 0.7 56 preparativ agarosegel. DNA bli elektroeluert og presipitert. 100 pmol av M13mpl8 BamHI kuttet vektor og 200 pmol av BamHI TPA<A>UPA inskuddet blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 U T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15"C. Etter inkubering ved 65°C i 10 min. , blir 5 pl av denne ligeringsblandingen bruk til transformasjon av E.coli JM101 kompetente celler i henhold til manuale "M13 kloning og sekvenseringshåndbok" utgitt av Amersham. 36 fargeløse plaques ble plukket, og enkel-kjedet og replikativ form (RF) DNA blir fremstilt. Analyse av RF-DNA viser at alle klonene inneholder innskudd ved riktig størrelse etter kutting med BamHI. Fragmenter med riktig størrelse etter kutting med EcoRI og Pstl indikerer at DNA-innskuddet i alle klonene har feil orientering (enkel-kjedet templat DNA er den ikke-kodete kjeden). En av disse klonene blir referert til som mpl8/BamHI/TPA<A>UPA og blir brukt ved delesjonsmutagenese.

B. Kloning av et pCS16/ UPA^ TPÅB- Kpnl- Hindi 11 fragment i M13mpl8

1.5 pg pCSl6/UPA<A>TPA (jfr. eksempel 10) fra en rask DNA-fremstilling blir kuttet med 12 U Kpnl i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanol ved 37" C i en time. Etter tilsetting av 1 pl 1 M NaCl, DNA blir kuttet med 12 U Hindlll ved 37°C i en time. Et 1.5 kb fragment blir isolert på en 0.856 preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert.

0.5 pg M13mpl8 (RF) blir kuttet med Kpnl og Hindlll. Det 7.3 kb vektorf ragmentet blir isolert på en 0.756 preparativ agarosegel. DNA blir elektroeluert og presipitert.

100 pmol av M13mpl8 Kpnl-HindiII kuttet vektor og 200 pmol av Kpnl-Hindlll innskudd blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 TJ T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15° C. Reaksjonen blir stoppet ved inkubering ved 65"C i 10 min. 5 pl av denne ligeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli JM101 kompetente celler. Ti fargeløse plaques blir plukket, og enkel-kjedet og replikativ form (RF) DNA blir fremstilt. Analyse av RF-DNA, viser at alle kloner inneholder innskudd med riktig størrelse og fragmenter med riktig størrelse. En av disse klonene blir referert til som mpl8/KpnI-HindIII/- UPA<A>TPA og blir brukt i delesjonmutågenese.

C. Kloning av et PCSI6/ UK0 TPAS Kpnl- Hindlll fragment i Ml3mpl8

1.5 pg pCS16/UK2TPA (jfr. eksempel 11) fra en rask DNA-fremstilling blir kuttet med 12 U Kpnl (Boehringer) i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanol ved 37°C i en time. Etter tilsetting av 1 pl 1 M NaCl, blir DNA kuttet med 12 U Hindlll ved 37°C i en time. Et 1.5 kb fragment blir isolert på en 0.856 preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert.

0.5 pg M13mpl8 (RF) blir kuttet med Kpnl og Hindlll. 7.3 kb vektorf ragment blir isolert på en 0.756 preparativ agarosegel. DNA blir elektroeluert og presipitert.

100 fmol av M13mpl8 Kpnl-HindiII kuttet vektor og 200 fmol av Kpnl-Hindlll innskudd blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 U T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15°C. Reaksjonen stoppet ved inkubering ved 65°C i 10 min. 5 pl av ligeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli JM101 kompetente celler. Syv fargeløse plaques blir plukket, og enkel-kjedet og replikativ form (RF) DNA er fremstilt. Analyse av RF-DNA, viser at alle kloner inneholder innskudd med riktig størrelse

og fragmenter med riktig størrelse. En av disse klonene blir referert til som mpl8/KpnI-HindIII/UK2TPA og blir brukt ved delesjon-mutagenese.

D. Kloning av et pCSlé/ TJKg TJPA^ Kpnl- Hindlll fragment i M13mpl8

1.5 pg pCS16/UK2UPA (jfr. eksempel 12) fra en rask DNA-fremstilling blir kuttet med 12 U Kpnl i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanol ved 37°C i en time. Etter tilsetting av 1 pl 1 M NaCl, blir DNA kuttet med 12 TJ Hindlll ved 37°C i en time. Et 1.7 kb fragment blir isolert på en 0.856 preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert.

100 fmol av M13mpl8 Kpnl-Hindlll kuttet vektor og 200 fmol av Kpnl-Hindlll innskudd blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 TJ T4 DNA-ligase i 7 timer ved 15°C. Reaksjonen blir stoppet ved inkubering ved 65°C i 10 min. 5 pl av ligeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli JM101 kompetente celler. Ti fargeløse plaques blir plukket, og enkel-kjedet og replikativ form (RF) DNA er fremstilt. Analyse av RF-DNA, viser at alle kloner inneholder innskudd med riktig størrelse og fragmenter med riktig størrelse. En av disse klonene blir referert til som mpl8/KpnI-HindIII/UK2U-PA og blir brukt ved delesjon-mutagenese.

Eksempel 14: Delesjonmutagense av primære hybride DNA-konstruks. i oner

A) Generell protokoll for deles. ionmutagense.

a) Fosforylering av mutagenisk primer:

For mutagenese blir 200 pmol av den mutageniske primer

fosforylert i 20 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.1 mM spermidin, 0.1 mM EDTA som inneholder 1 pl 10 mM ATP ved bruk av 8 TJ T4 polynukleotid-kinase (Boehringer, 8 TJ/pl). Etter inkubering ved 37°C i en time, blir reaksjonen stoppet ved oppvarming ved 65°C i 10 min.

For hybridiseringssøking (screening), blir 20 pmol av den mutagene primer fosforylert som ovenfor med 30 pCi 'y<32>P-ATP (3000 Ci/mmol; Amersham International) som eneste ATP-kilde. Primeren blir fortynnet med 3.5 ml 6 x SSC og brukt med en gang som probe. b) Baseparring av mutagene primer og universal sekvenserings primer til enkel- kjedet templat.

0.2 pmol av enkel-kjedet templat blir inkubert med 20 pmol fosforylert mutagen oligodeoksyribonukleotid primer (10 pmol/pl) og 10 pmol universal M13 sekvenseringsprimer i 10 pl 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT ved 95°C i 5 min. Løsningen får avkjøle sakte til romtemperatur over en tidsperiode på 30 min.

c) Ekstensjons- 1igerings- reaksjon

Til den ovenfor baseparrede blandingen blir det tilsatt 10 pl

enzym-dNTP (dATP, dGTP, dTTP, DCTP) løsning som inneholder 1 pl buffer [0.2 M Tris-HCl pH 7.5, 0.1 MgCl2, 0.1 M DTT], 4 pl 2.5 mM dNTP blanding, 1 pl 10 mM ATP, 0.5 pl T4 DNA-ligase (Biolabs, 400 TJ/pl), 0.67 pl Klenow DNA-polymerase (BRL, 2.99

U/jj1 ). Blandingen blir inkubert ved 15°C i en time og deretter inkubert ved 8°C i 16 timer. Reaksjonen stoppes ved inkubering ved 65 "C i 10 min.

d) Transformasjon av ligeringsblanding

Ligeringsblandingen blir fortynnet 1:20 og 1:200 med TE, 1 pl

og 5 pl av hver av disse fortynnede løsningene blir brukt til å transformere 0.2 ml av en ikke-reparerende stamme av E.coli BMH 71-18mutS [BMH71-18(A(lac-proAB), thi, supE. FllaciQ, ZAM15, roA<+>B<+>l kompetente celler. Konstruksjonen av E.coli BMH71-18mutS (BMH71-18, mut S215::Tnio) er beskrevet av Kramer et al. [Cell 38, 879-887 (1984)]. Etter transfeksjo-nen, blir grunncellene tatt fra reparasjon + stamme fra E.coli JM101 for å minimalisere utsetting av fagen til den mutante fenotype av reparasjon-minus stamme [P. Carter, H. Bedouelle og G. Winter, Nucl. Acids Res. 13, 4431-4443 (1985 )] .

e) Screening av fagene

100 plaques som resulterte fra det transfekterte DNA blir

plukket og applisert på YT-plater og vokser opp som kolonier av infekterte bakterier i 15-18 timer. Koloniblotting ble adaptert fra Grunstein og Hogness [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72, 3961-3965 (1985)]. Et nitrocellulosefilter (Millipore S.A., Cat. No. HAWP 090, porestørrelse 0.45 pm) legges på koloniplaten i 10 min. ved romtemperatur. Filterene blir denaturert med 0.5 N NaOE, nøytralisert med 1 M Tris-HCl pH 7.5, og deretter behandlet med en høy-salt løsning (0.5 M Tris-HCl pH 7.5 + 1.5 M NaCl). Filterene ble bakt i vakuum i 30 minutter ved 80"C, prehybridisert i 100 ml 10 x Denhardfs løsning (D.T. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646), 6 x SSC og 0.2 % SDS i en forseglingsbar plastikk-pose i 15 minutter.

For hybridiseringsscreeningen, ble prehybridiserte filterene vasket i 50 ml 6 x SSC i 1 minutt og deretter hybridisert i 3.5 ml probe som inneholder <32>P-merket mutagen primer i 30 minutter. Eybridiserte filtere blir vasket tre ganger i 100 ml 6 x SSC ved romtemperatur i totalt 2 minutter og deretter satt til autoradiografi. God diskriminering mellom vill-type og mutante fag oppnås ved en rask vask (5 min) ved 60"C i 100 ml 0.1 x SSC + 0.1 % SDS.

f) Bekreftelse på deles. ionmutas. ion i positive kloner etter h<y>bridiserin<g>en

Fagene fra de positive klonene blir plukket med tannpirkere på 1 ml 2 x YT, varmet ved 70° C i 20 minutter for å drepe bakterien, og deretter ble 100 pl av denne fag-suspensjonen inokulert i 1.5 ml av en nydyrket E.coli JM101 kultur (OD600 ~ 0.45). Kulturene blir ristet kraftig (300 rpm) ved 37°C i 4 timer. Fag-stokk og DNA i replikativ form fra de positive klonene blir fremstilt [J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21-78 (1983)]. DNA fra mutantene (etter delesjonsmutagenese) blir analyserte med passende restriksjonsenzymer og sammenlignet med restriksjonsfragmentene til vill-type (før delesjonmutagenese) DNA. Etter bekreftelsen ved restriksjonsanalyse, blir DNA fra en riktig mutant plaque-renset. Mutasjoner blir videre bekreftet ved restriksjons-analyser og sekvensering ved hjelp av kjede-terminatormetoden [F. Sanger, S. Niclen og A.R. Coulson, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467 (1977)]. B) Deles. ionmutagenese på mp! 8/ BamHI/ TPA^ UPA5- ( se figure 23).

Delesjonsmutagenese utføres som det er beskrevet i den generelle protokollen. Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse. 333 bp blir fjernet ved delesjonmutagenese fra BamHI-fragmentet. Restriksjonsanalyse med BamHI bekrefter 2150 bp-fragmentet. Videre restriksjonsanalyse med EcoRI gir 660, 416, 287, 230 bp fragmenter på mutantene istedenfor 660, 472, 416 og 287 fragmenter som finnnes i vill-typen. Analyse med Pstl viser to fragmenter, 611 og 414 bp i størrelsen når det gjelder mutantene. Vill-type DNA viser tre fragmenter på 622, 611 og 414 bp. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/BamHI/M0TPA<A>UPA.

DNA-sekvensen på grensen mellom t-PA A-kjeden og u-PA B-kjeden er bekreftet med kjedeterminatorsekvenseringsmetoden til å ha en sekvenseringsprimer med sekvens

5'CAGAGCCCCCCCGGTGC 3'.

Denne primeren er komplimentær til kodingskjeden til u-PA (682-666).

C) Deles. jonmutagenese på mpl8/ KpnI- HindIII/ UPAATPA^ ( se figur 24 )

Delesjonmutagenese blir utført som det er beskrevet i den generelle protokollen. Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med Pstl. I mutantene blir et 467 bp bånd observert sammenlignet til vill-typen som har et 544 bp fragment. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/KpnI-HindIII/M0UPA<A->TPA. Delesjonen bekreftes ved kjede-terminatorsekvens-eringsmetoden ved bruk av en sekvenseringsprimer med sekvensen

5' CAAAGATGGCAGCCTGC 3'

Denne primeren er komplementær til kodingskjeden til t-PA (1062-1046).

D. Deles jonmutagenese på mpl8/ KpnI- HindIII/ IH^ TPA5- ( se figur 25 )

Delesjonmutagenese utføres som det er beskrevet i den generelle protokollen. Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med Kpnl-Hindlll, Eco RI og Pstl. Fragmentene som fremkommer er

Riktig størrelse på innskudd og riktig størrelse på fragmentene blir observert i mutantene. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/KpnI-HindIII/- MOUKgTPA15. Delesjonen bekreftes ved kjede-terminator-sekvenseringsmetoden ved bruk av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens

5 ' CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

Denne primeren er komplementer til den kodete kjeden til t-PA (853-821).

E. Deles. ionmutagenese på mpl8/ KpnI- HindIII/ UKg UPA5- ( se figur 261

To separate delesjonmutasjoner er involvert ved konstruksjonen av UK2UPA: Første delesjonmutagenese utføres som beskrevet i den generelle protokollen. Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med EcoRI. I mutantene observeres 549, 416, 351 bp bånd i motsetning til vill-typen som har følgende fragmenter: 549, 452 og 416 bp. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/KpnI-EindIII/M0UK2UPA<B->l. Delesjonen blir bekreftet ved kjede-terminator-sekvenseringsmetoden ved hjelp av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens:

5' CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

Primeren er komplementær til den kodete kjeden til t-PA (853-821).

I andre steget av delesjonmutågenesen, blir en delesjon laget samtidig med introduksjonen av en punktmutasjon. Delesjon-mutagenesen blir utført som beskrevet i den generelle protokollen. Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med EcoRI. I mutantene observeres 416, 351, 259 bp bånd i motsetning til vill-type som har 549, 416 og 351 bp fragmenter. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2UPA<B.> Delesjonene blir bekreftet ved kjedeterminatorsekvenseringsmetoden ved hjelp av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens

5' CAGAGCCCCCCCGGTGC 3'.

Primeren er komplementær til den kodete kjeden til u-PA (682-666).

Eksempel 15: Kloning av hybrid t- PA/ u- PA cDNA konstruksjonene inn i gjærekspresjonsvektor pJDB207

A) Kloning av TPaAuPA^ hybridgenet inn i pJDB207

RF-DNA er fremstilt for mpl8/BamHI/M0TPA<A>UPA ved hjelp av den raske DNA-isoleringsprosedyre [D.S. Holmes og M. Quing-ley, Anal. Biochem. 114, 192-197 (1981)].

RF-DNA (~ 1.5 pg) blir kuttet med 9 U BamHI i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol i en time ved 37°C. Etter tilsetting av 1 pl RNase (1 mg/ml) og inkubert i 10 minutter ved 37°C, blir 2.1 kb innskuddet isolert på en 0. 7% preparativ agarosegel. DNA-innskuddet blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitering i etanol.

1.5 pg pJDB207/ PH05-I-TPAAUPAB blir kuttet med BamHI, behandlet med kalv-tarm alkalisk fosfatase og vektoren på 6.7 kb blir isolert. Etter elektroeluering blir vektor-DNA presipitert.

100 fmol av pJDB207/ PHO5-1-TPAAUPAB BamHI kuttet vektor, 200 fmol TPAUPA innskudd blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400

TJ T4 DNA ligase i 8 timer ved 15° C. Reaksjonen stoppes ved inkubering ved 65°C i 10 minutter. 5 pl av denne ligeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli HB101 Ca<2+ >celler [M. Dagert og S.D. Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1979)]. 12 amp<E> kolonier blir plukket og DNA blir fremstilt ved den raske isoleringsprosedyren. Etter analyse av DNA viser 5 kloner både riktig størrelse på innskuddet og riktig orientering. En klon dyrkes i 100 ml LB medium som inneholder 100 mg/ml ampicillin. Plasmid DNA blir isolert og blir referert til som pJDB207/PH05-I-MOTPA<A>UPA.

B) Kloning av MOUPaAtaI. aiOTJK2 TPAB- og MOUKo UPAB gen- innskuddene inn i plasmid pCS16

RF-DNA blir fremstilt for mpl8/KpnI-HindIII/M0UPA<A>TPA» mpl8/KpnI -Hindi 11 /M0UK2TPAB , mpl8/KpnI -Hindi 11 /M0TJK2UPAB ved hjelp av den raske DNA isoleringsprosedyren.

De tre RF-DNA (~ 1.5 pg) har hver kuttet med 12 U Kpnl og 12 U Hindlll i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanol i en time ved 37° C. 1 pl 1 M NaCl blir tilsatt og DNA blir videre kuttet med 12 TJ Hindlll. Etter tilsetting av 1 pl RNase (1 mg/ml) og inkubering i 10 min. ved 37°C, blir 1.4 kb innskuddet isolert på en 0. 8% preparativ agarosegel. DNA-innskuddet blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert i etanol.

Tre pg pCS16/UPA blir kuttet med Kpnl og Hindlll og 2.7 vektorfragmentet isoleres. Etter elektroeluering, blir vektor DNA presipitert i etanol.

100 fmol av pCS16 Kpnl-Hindlll kuttet vektor, 200 fmol av Kpnl-Hindlll kuttet innskuddfragmenter blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 TJ T4 DNA-ligase i 8 timer ved 15° C. Reaksjonen blir stoppet ved inkubering ved 65°C i 10 minutter, 5

pl av denne ligeringsblandingen blir brukt til transformasjon av E.coli HB101 Ca<2+> celler.

Seks amp<R> kolonier blir plukket for hver av de tre ligeringene. DNA blir fremstilt ved den raske isoleringsprosedyren. Etter analyse av DNA med Kpnl-Hindlll ble innskuddbånd med riktig størrelse observert. En klon av hver av de tre ligeringene ble dyrket i 100 ml LB-medium som inneholder 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA avledet fra mpl8/KpnI-HindIII/M0UPA<A>TPA, mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2TPA og mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2UPA blir isolert og blir referert til som pCS16/M0TJPAATPAB, pCS16/M0UK2TPA og pCS16/M0UK2UPA, respektivt. C) Kloning av M0UPAATPA, M0TJK2TPAB og M0TJK2UPAB gen-innskuddene inn i pJDB207.

Fem pg PJDB207/ PH05-I-UPA blir kuttet med 15 U Seal og 15 TJ Xhol (Boehringer) i 50 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol i en time ved 37° C. Etter tilsetting av 1 pl RNase (1 mg/ml), blir 6.7 kb vektorf ragment isolert. Etter elektroeluering, blir vektor DNA presipitert.

Femten pg av hver av pCS16/M0TJPAATPAB, pCS16/M0UK2TPA, pCS16/M0TJK2UPAB blir inkubert ved 37° C i en time med 30 TJ Xhol i 200 10 mM Tris-HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol, ekstrahert med et likt volum av fenol-kloroform og presipitert i etanol. De presipiterte Xhol kuttede pCS16/M0TJPA<A>TPA, pCS16/M0TJK2TPAB og pCS16/M0UK2UPADNA er hver resuspendert i 150 pl 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol, 1.5 pg etidium-bromid, inkubert ved 37 °C i 40 minutter med 12 TJ Seal (partiell kutting), og ekstrahert med et likt volum av fenol, etterfulgt av et likt volum kloroform-isoamyl-alkohol (50:1). 1.2 kb fragmentene er hver isolert på en 156 preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert.

100 fmol av pJDB207/ PHO5-1-UPA Scal-Xhol kuttet vektor og 200 fmol av Xho-Scal kuttet pCS16/M0UPA<A>TPA, pCS16/M0UK2TPAeller pCS16/M0UK2UPA 1.2 kb innskuddene, respektivt, blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 TJ T4 DNA-ligase i 16 timer ved 15° C. Reaksjonen stoppes ved inkubering ved 65°C i 10 minutter. 5 pl av denne ligeringsblandingen blir brukt for transformasjon av E.coli HB101 Ca<2+> celler.

Seks amp<R> kolonier blir plukket fra hver av de tre ligeringene. DNA blir fremstilt ved hjelp av den raske isoleringsprosedyren. Restriksjonsanalyse av DNA viser bånd med riktig størrelse av innskuddet. En klon fra hver av de tre ligeringene dyrkes i 100 ml LB-medium som inneholder 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA avledes fra pCS16/M0UPA<A>TPA, pCS16/M0TJK2TPAB, pCS16/M0TJK2UPA blir referert til som pJDB207/PH05-I-M0UPA<A>TPA, pJDB207/PH05-I-M0UK2TPA og pJDB207/PH05-I-M0TJK2UPA, respektivt.

Eksempel 16: Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae GRF18 og fremstilling av gjærecelleekstrakter

Plasmidene pJDB207/PH05-I-MOTPAAUPAB , pJDB207/ PHO5-1 -M0TJPAA-TPA, pJDB207/PH05-I-MOTJK2TPA og pJDB207/PH05-I-MOTJK2UPA er hver introdusert inn i Saccharomyces cerevisiae stammen GRF18 ved hjelp av transformasjonprotokollen som beskrevet ved Hinnen et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Fem pg hver av plasmid DNA blir satt til 100 pl av en sferoplast-suspensjon og blandingen blir behandlet med polyetylenglykol. Sferoplastene blir blandet med 10 ml regenererings-agar og platet ut på gjær minimal medium-plater uten leucin. Etter inkubering i 3 dager ved 30°C oppnås omtrent 200 transformerte celler.

En koloni fra hver av gjærtransformasjonene blir plukket. De forskjellige koloniene blir referert til som

Saccharom<y>ces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-MOTPA<Å>UPASaccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/ PH05-I-MOUPAATPAB Saccharom<y>ces cerevisiae GRF18/pJDB207/m)5-I-MOUK2TPAB Saccharom<y>ces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-M0UK2UPA

Gjærceller dyrkes ved 30" C i 20 ml HE-17 medium (8.4 g gjærnitrogenbase (Difco), 10 g L-aspargin (Sigma), 1 g L-histidin (Sigma), 40 ml 5056 glukose per 1 liter løsning) i en 50 ml Erlenmeyer-flaske med risting i 24 timer til en tetthet på 8-10xl0<7> celler/ml nås. Cellene blir sentrifugert, resuspendert i 10 ml 0.956 NaCl. To ml av de resuspenderte cellene blir brukt til å inokulere 50 ml lav-P-^ minimalmedium (som beskrevet i Europa patentsøknad nr. 143081) som blir tilsatt 10 g/l L-asparagin (Sigma), og 10 g/l L-histidin (Sigma), i 250 ml Erlenmeyerflasker. Inkubasjonen foregår ved 30°C ved 250 rpm.

Celler fra 10 ml lav V^ minimalmedium blir samlet etter 48 timer ved sentrifugering med 3000 rpm i 10 minutter i Falcon 2070 rør. Cellene vaskes en gang med 10 ml lav P^ medium og sentrifugeres. Cellebunnfallet blir suspendert i lysisbuffer [66 mM kaliumfosfat pH 7.4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem.)]. Til cellesuspensjonen tilsettes 8 g glassperler (0.5-0.75 mm i diameter) og en liten glass-stang og suspensjonen ristes på en Vortex Mixer (Scientific Instruments Inc., USA) ved full speed i 4x2 min. med intervaller av 2 min. på is. Mer enn 9056 av cellene blir knust ved denne prosedyren. Celle debris og glassperlene blir sedimentert ved sentrifugering i 5 min. ved 3000 rpm ved 4°C. Supernatanten blir brukt for bestemmelse av PA-aktivitet og for rensing og isolering av PA. Eksempel 17: Innsetting av hybrid PA kodingssekvenser inn i pattedvrcelle- ekspres. i onsvektor A) Innsetting av UPA<A>TPA 'perfekt' hybrid kodingssekvens.

RF DNA av mpl8/KpnI-HindIII/M0UPA<A>TPA blir kuttet ved Smal setet som ligger akkurat oppstrøms for begynnelsen av kodingssekvensen og er ligert til en SacI linker (CGAGCTCG). Deretter blir plasmidet kuttet med SacI, som kutter ved posisjonen til de ligerte linkerene og ved det naturlige SacI setet i den t-PA-deriverte delen av den hybride PA kodingssekvensen. Det minste av de to resulterende fragmenter blir renset via en agarosegel og ligert til Sacl-kuttet pCGA44 (se eksempel 4), transformert inn i E.coli HB101 og DNA fra kandidatkloner blir testet med EcoRI. En klon med det ventede restriksjonsmønsteret blir referert til som pCGCl/-

UPA<A>TPA<B.>

B) Innsetting av TJK2TPAB hybrid kodingssekvens.

RF DNA av mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2TPA blir kuttet ved Smal-setet som ligger akkurat oppstrøms for begynnelsen av kodingssekvensen og som er ligert til SacI som ovenfor. Etter kutting med SacI blir det resulterende lille fragmentet klonet inn i Sacl-kuttet pCGA44 som beskrevet ovenfor og en klon med det ventede restriksjonsmønsteret blir referert til som pCGC2/UK2TPA.

C) Innsetting av UK2UPA hybrid kodingssekvens.

RF DNA mpl8/KpnI-HindIII/M0UK2UPA blir kuttet ved Smal-setet oppstrøms for u-PA kodingssekvensen og ved Xhol setet nedstrøms for kodingssekvensen (i vektor DNA). De klebrige ender til DNA-f ragmentet blir fylt ved hjelp av E.coli DNA-polymerase I (jfr. eksempel 5D). SacI linkere blir ligert til de butte endene, DNA blir kuttet med SacI, det minste av de to resulterende fragmentene blir renset via en agarosegel og klonet inn i Sacl-kuttet pCGA44. En klon med det ventede EcoRI restriksjonsmønsteret blir referert til som pCGC3/-

UK2UPAB.

D) Innsetting av et TPA<A>UPA 'perfekt' kodingssekvens.

Steg 1: RF DNA til mpl8/BamHI/M0TPA<A>UPA blir kuttet med BamHI og det minste (~2.1 kb) fragmentet blir klonet inn i BamHI kuttet pJDB207/ PH05-I-TPAAUPAB (jfr. eksempel 9) vektor. Riktig orientering blir valgt ved kutting med Hindlll og et korrekt plasmid blir kalt pJDB207/PH05-I-MOTPA<A>UPA<B.>

Steg 2: Et ~600 bp Sacl-Narl fragment fra ptNC.UC (jfr. eksempel 3) og et -1350 bp Narl-Xhol fragment fra pJDB207/-PH05-I-TPA<A>UPA blir isolert og klonet inn i Sacl-Xhol kuttet pCS16 (jfr. eksempel 7) vektor. Det ~1.9 kb innskuddet blir bekreftet ved kutting med Sacl-Xhol og EcoRI. En korrekt plasmid blir kalt pCS16/MOTPA<A>UPA.

Steg 3: Plasmid pCS16/M0TPA<A>UPA blir kuttet ved Xhol-setet som er lokalisert nedstrøms for u-PA kodingssekvensen og de klebrige endene fylles ved hjelp av E.coli DNA-polymerase I. SacI linkere blir ligert til de butte endene og DNA blir kuttet med SacI. Det minste av de to fragmentene blir renset via en agarosegel og klonet inn i Sacl-kuttet pBR4a (jfr. eksempel 5) vektorfragment. Riktig orientering og størrelse av innskuddet blir bekreftet ved kutting med BamHI og SacI, respektivt. En riktig plasmid blir designert pCGC4a/-

TPA<A>UPA<B.>

Eksempel 18: Konstruksjon av flere hybride PA- kodingssekvenser og innsetting derav i pattedyrcelle- ekspres. ionsvektor A) Kloning av et pCGC4a/TPA<A>UPA fragment i M13mpl8. 3 pg av pCGC4a/TPA<A>UPA (jfr. eksempel 17) blir kuttet med 12 U SacI (Boehringer) i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanol ved 37° C i en time. Et ~1.9 kb fragment blir isolert på en 0.7 % preparativ agarosegel. DNA blir ekstrahert ved elektroeluering og presipitert.

0.5 pg av M13mpl8 (RF) blir kuttet med SacI. 7.3 kb vektorf ragmentet blir isolert på en 0.756 preparativ agarosegel. DNA blir elektroeluert og presipitert.

100 fmol av M13mpl8 SacI kuttet vektor og 200 fmol av SacI innskudd blir ligert i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 pg gelatin med 400 U T4 DNA ligase i 7 timer ved 15°C. Reaksjonen stoppes ved inkubering ved 65° C i 10 min. 5 pl av denne ligeringsblandingen blir brukt for transformasjon av E.coli JM101 kompetente celler. Seks fargeløse plaques blir plukket, og enkel-kjedet og replikativ form (RF) DNA blir fremstilt. Etter analyse av RF-DNA, viser fire kloner riktig størrelse på innskuddet og riktig orientering. En av disse klonene er referert til som mpl8/SacI/TPA<A>UPA (BC).

B) Kloning av et pBR4a SacI fragment inn i M13mpl8.

Et pBR4a (jfr. eksempel 5) SacI fragment blir klonet inn i M13mpl8. En av klonene som har et innskudd med riktig størrelse og en riktig orientering blir referert til som mpl8/Sad/TPAAUPAB (BR).

C) Delesjonmutagenese på TPA-UPA hybridkonstruksjoner.

1) Konstruksjon av K2UPA (BC) [d.v.s. tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)]

Delesjonmutagenese blir utført som beskrevet i den generelle protokollen (jfr. eksempel 14) på mpl8/SacI/TPA<A>UPA (BC). Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med SacI. I mutantene blir et ~1380 bp bånd observert i forhold til vill-type som har et -1900 bp fragment. Mutanter blir videre bekreftet ved kutting med EcoRI. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/SacI/K2UPA (BC). Delesjonen blir verifisert ved kjede terminatorsekvensmetoden ved hjelp av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens:

5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'

Denne primeren er komplementær til kodingskjeden til t-PA(853-821) med en feilparret base ved posisjon 838 (t-PA).

2) Konstruksjon av FUPA (BC) [d.v.s tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411)]

Delesjonmutagenese blir utført som beskrevet i den generelle protokollen (jfr. eksempel 14) på mpl8/SacI/TPA<A>UPA (BC). Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med SacI. I mutantene blir et ~1200 bp bånd observert i motsetning til vill-type som har et ~1900 bp fragment. Mutantene blir videre bekreftet med EcoRI kutting. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/SacI/FUPA (BC). Delesjonen blir verifisert ved kjede-terminatorsekvensmetode ved hjelp av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens

S' CAGAGCCCCCCCGGTGC 3'.

Denne primeren er komplementær til kodingskjeden til u-PA (666-682).

3) Konstruksjon av FK2UPA (BC) [d.v.s. tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)]

Delesjonmutagenese blir utført som beskrevet i den generelle protokollen (jfr. eksempel 14) på mpl8/SacI/TPA<A>UPA (BC). Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med SacI. I mutantene blir et ~1470 bp bånd observert i forhold til vill-type som gir et ~1900 bp fragment. Mutanter blir videre bekreftet ved EcoRI kutting. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/SacI/KF2UPA (BC). Delesjonen blir verifisert ved kjede-terminator-sekvenseringsmetoden ved hjelp av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens

5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

Denne primer er komplementær til kodingskjeden til t-PA(853-821) med en feilparret base ved posisjon 838 (t-PA).

4) Konstruksjon av FGK2UPA (BC) [d.v.s. tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411)]

Delesjonmutagenese blir utført som beskrevet i den generelle protokollen (jfr. eksempel 14) på mpl8/Sad/TPA<A>UPA (BC). Positive kloner fra hybridiseringen blir bekreftet ved restriksjonsanalyse med SacI. I mutantene blir et ~1580 bp bånd observert i forhold til vill-type som gir et ~1900 bp fragment. Mutantene blir videre bekreftet ved EcoRI kutting. En mutant klon som har den riktige strukturen blir referert til som mpl8/SacI/FGK2UPA (BC). Delesjonen blir verifisert ved kjede terminatorsekvenserings-metoden ved hjelp av en sekvenseringsprimer med følgende sekvens

5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

5) Lignende delesjonsmutageneseprotokoller blir brukt til å generere

K2UPA(BR) [tPA(l-3)-tPA(176-262)-uPA(132-411)] FUPA(BR) [tPA(1-49)-uPA(134-411)]

FK2UPA(BR) [tPA(l-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)] og FGK2UPA(BR) [tPA(l-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)]. D) Innsetting av hybrid PA-kodete sekvenser inn i pattedyrcelle-ekspresjonsvektor

1. Innsetting av FUPA(BC), K2UPA(BC), FK2UPA(BC) og

FGK2UPA(BC).

RF DNA fra mpl8/Sad/K2UPAB(BC ), mpl8/SacI/FUPA(BC), mpl8/SacI/FK2UPA(BC) og mpl8/SacI/FGK2UPA(BC) blir hver kuttet med SacI. Det minste av de to resulterende fragmentene blir isolert og blir ligert til SacI kuttet pBR4a (jfr. eksempel 5) vektorfragment. Overført til E.coli HB101 og riktig orientering og riktig størrelse av innskuddet blir bekreftet ved kutting med BamHI og SacI, respektivt. De resulterende plasmidene blir designert pCGC5/K2UPA, pCGC6/FUPA, pCGC7/FK2UPA og pCGC8/FGK2UPA, respektivt. 2. Likeledes, K2UPA(BR), FUPA(BR), FK2UPA(BR) og FGK2UPA(BR) DNA (se ovenfor) blir også satt inn i pBR4a. De oppnådde plasmidene blir designert pBR5, pBR6,pBR7 og pBR8, respektivt.

Eksempel 19: Pattedvrekspresjonsvektorer som inneholder DHFR-genet

Plasmid pSV2dhfr (ATCC 37145) er et plasmid som tillater seleksjon av transformanter av DHFR-inneholdende celler ved seleksjon ved bruk av antifolat-medikament metotreksat eller seleksjon av DHFR<+> transformanter til DHFR" CHO celler [DUKXB] celler; G. Urlaub, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77, 4216-4220 (1980)]. Inn i det eneste BamHI setet til dette plasmidet kan BamHI fragmentet til pCGA28 som inneholder det modulære t-PA genet bli klonet. Plasmider som inneholder en hvilken som helst av de mulige orienteringene blir designert pCGA700a/tPA og pCGA700b/tPA. Begge kan bli brukt til å uttrykke t-PA i vev-kulturceller men pCGA700a/tPA er å foretrekke, hvor transkripsjonen av t-PA-genet er i samme retning som i DHFR-genet, da denne orienteringen ofte fører til en noe høyere ekspresjonsgrad i forhold til plasmider som er konvergent transkribert.

På en analog måte kan de modulære genene som koder for hybrid plasminogenaktivorer (ovenfor) fra plasmidene pBRla/tPA, pBR2a/UPA<A>TPA, pCGCl/UPA<A>TPA, og pCGC2/UK2TPA bli kombinert som BamHI fragmentene med DHFR-genet til pCGA700a/tPA for å danne plasmidene pCGA701a/tPA, pCGA702a/UPA<A>TPA, pCGA705a/UPA<A>TPA, og pCGA707a/UK2TPA respektivt, hvor det modulære plasminogenaktivator-genet blir transkribert i samme retning som DHFR-genet, og pCGA701b/tPA, pCGA702b/UPA<A>TPA, pCGA705b/UPA<A>TPA, pCGA707b/UK2TPA hvor begge genene blir transkribert i motsatte retninger. På grunn av tilstedeværelse av en BamHI sekvens i den delen som koder for u-PA B-kjeden kan det modulære plasminogenaktivator-genet bare bli isolert ved en delvis kutting (2 ut av 3 BamHI seter) av neo^ plasmidet etterfulgt av isolering av de hensiktsmessige fragmentene (jfr. figurer) ved agarosegel elektroforese. Således, fra pBR3a/uPA, pBR4a/TPA<A>UPA, pBr5/K2UPA, pBR6/FUPA, pBR7/FK2UPA, pBR8/FGK2UPA, pCGC3/UK2UPA, pCGC4a/TPA<A>UPA, pCGC5/K2UPA, pCGC6/FUPA, pCGC7/FK2PAB, og pCGC8/FGK2UPA kan bli konstruert pCGA703a/uPA, pCGA704a/TPA<A>UPA, pCGA705a/K2UPA, pCGA708a/FUPA, pCGA706a/FK2UPA, pCGA707a/FGK2UPA, pCGA709a/UK2UPA, pCGA711a/TPA<A>UPA, pCGA712a/K2UPA, pCGA713a/FUPA, pCGA714a/FK2UPA, og pCGA715a/FGK2UPA, respektivt, hvor alle plasminogenaktivator-genene blir transkribert i samme retning som DHFR-genet, og videre pCGA703b/uPA, pCGA704b/TPA<A>UPA, pCGA708b/FUPA, pCGA705b/K2UPA, pCGA706b/FK2UPA, pCGA707b/FGK2UPA, pCGA709b/UK2UPA, pCGA711b/TPA<A>UPA, pCGA712b/K2UPAB, pCGA713b/FUPA, pCGA714b/FK2UPA og pCGA715b/FGK2UPA, hvor begge genene blir transkribert på en ikke-konvergent måte.

Eksempel 20: Fremstilling av hybrid plasminogenaktivatorer ved h. ielp av transformerte pattedyrceller A) Opprettholdelse og DNA-transfeksjon av vevs-kulturceller; generell fremgangsmåte.

DNA konstruksjoner kommer til uttrykk i DUKXB1, en mutant av kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler som mangler enzym dihydrofolat-reduktase [G. Urlaub et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 77, 4216-4220 (1980)]. DUKXB1 cellene blir dyrket opp i alfa-MEM medium som inneholder nukleosider (GIBCO) supplementert med 5% føtalt kalveserum.

Cellene blir platet ut med en tetthet på 10000/cm i 6-brønn multiplater (3.4 cm diameter) og transformert med 4 pg DNA: DNA blir løst i 50 pg/ml i 10 mM Tris-HCl pH 7.0 som inneholder 0.1 mM EDTA, avkjølt på is i .5 min., deretter tilsettes 0.25 volum 1 M CaCl2 og dette inkuberes på is i 10 min. Denne blandingen blir deretter blandet med et likt volum 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 0.75 mM Na2HP04, 0.75 mM NaH2P04. pH 7.12) etterfulgt av 10 min. inkubasjon på is. Deretter tilsettes dette DNA-Ca-fosfat-kopresipitatet til kulturmediet og cellene blir inkubert med DNA i 16-18 t, etterfulgt av et glyserol sjokk, d.v.s. cellene blir skylt med TBS (80 g/l NaCl, 3.8 g/l KC1, 1 g/l Na2HP04.2H20, 0.114 g/l CaCl2.2H20, 0.11 g/l MgCl2.6H20, 25 mM Tris/Hel pH 7.5), inkubert 1 min. med 20% (v/v) glyserol i TBS, skylt igjen med TBS og dyrket 24 t i vevkulturmedium. Cellene blir deretter trypsinert og overføres til 8 cm diameter Petri-skåler. Neste dag blir det opprinnelige kulturmediet uten selektiv agens skiftet ut med medium som inneholder 1 mg/ml geneticin. Mediet blir skiftet ut hver tredje eller fjerde dag. Kolonier kan sees omtrent på dag 14. Celler fra individuelle kolonier blir isolert ved å skrape dem av med spissen til en pipette mens man samtidig drar dem inn i spissen som er fylt med en trypsin løsning og deretter overføres hver til en brønn i en 24 brønn multiskåler som er tilsatt medium som inneholder geneticin. Når disse er fulle blir kulturene flyttet inn i brønnene til en 6-brønn multiskål og deretter inn i 8 cm diameter Petri-skåler.

B. Ågaroseplateanalyser for plasminogenaktivatorer.

Disse sensitive analysene for plasminogenaktivatorer bruker agarosegeler som tilsettes plasminogen (stokk-løsninger som lages ved å løse plasminogen Sigma A-6877 ved 1 mg/ml og deretter dialyse to ganger mot 100 volum 50 mM Tris/ECl pH 8.0) eller enten casein (tilsatt som ikke-fett melk) eller fibrin (tilsatt som fibrinogen pluss trombin). Prøven som inneholder plasminogenaktivator blir aktivisert inn i hull som er støpt inn i et 4 mM tykt agaroselag og gelen blir deretter inkubert ved 37°C. Enzymaktiviteten blir deretter detektert ved at plasminogenaktivatoren diffunderer radialt bort fra prøvebrønnen, og overfører plasminogen i gelen til plasmin som igjen bryter ned casein eller fibrin og dermed produseres en klar ring i den opaque gelen rundt prøvebrøn-nen. Radiusen til ringen (målt fra kanten av prøvebrønnen) er et mål på mengden av aktivert plasminogen. Analysen viser ikke en lineær respons til mengden av plasminogenaktivator som er tilsatt. For analyser av lave mengder av plasminogen-aktivator kan inkubasjonen bli forlenget til flere dager. Fremgangsmåten og kalibreringen av casein-analysen blir beskrevet i Tang et al. [Ann. N.Y. Acad. Sei. 434, 536-540

(1984)] med unntagelse av at istedenfor 2% (w/v) Carnation ikke-fett melkepulver blir 12.55é (v/v) sterilisert (UHT) fett-fri melk fra Migros Corp. (Sveits) brukt. Når fibrin

[Granelli-Piperno og Reich, J. Exp. Med. 148, 223-234 (1978)]

blir brukt som substrat blir 0.2 g agarose løst i 15 ml 0.9$ NaCl og avkjølt til 42°C. Ved dette tidspunktet tilsettes 5 ml 0.9$ NaCl som inneholder 80 mg bovinfibrinogen (Sigma F-8630), 0.1 ml plasminogenløsning (ovenfor) og 0.1 ml 100 mg/ml natriumazid ved 42°C. Til slutt tilsettes 0.2 bovin-trombin (Sigma T-6634, løst ved 16.6 NIH enheter/ml i 0. 9% NaCl) og løsningen helles raskt på en Petri-skål (8 cm

diameter), og dette avkjøles til romtemperatur i en time. Den resulterende gelen er omtrent 4 mm tykk og kan bli oppbevart ved 4°C i flere dager eller bli brukt med en gang på samme måte som den casein-inneholdende gelen som ble beskrevet ovenfor.

C. Produksjon av hybride PA-proteiner i hamster-celler.

CEO DUKXB1 celler blir transformert med DNA fra plasmidene PBR1A, pBRlB, pBR2A, pBR2B, pBR3A, pBR3B, pBR4A, pBR5, pBR7, pBR8, pCGCl, pCGC2, pCGC3, pCGC4a, pCGC5, pCGC6, pCGC7 og pCGC8, respektivt, som beskrevet ovenfor (eksempel 20A). Kolonier er synlige rundt dag 10, og blir plukket rundt dag 15 som beskrevet ovenfor og to uker senere er celletallet høyt nok til at PA-verdiene kan måles som beskrevet ovenfor. Ikke-transformerte celler og cellelinjer som er transformert med pBRlB, pBR2B, pBR3B, som inneholder det insatte SacI fragmentet i feil (antisense) orientering produserer ikke detekterbare mengder av PA. D. Enzymaktivitet i media kondisjonert med transformerte CEO-celler.

Kondisjonert medium fra plasmid transformert og kontroll CEO-celler blir fremstilt ved oppdyrking av 200,000-500,000 celler/ml i 24 timer i Alpha-MEM med nukleosider og 5% føtal kalveserum og 0.03 ml blir inkubert på agaroseplater som inneholder casein eller fibrin i tidsperioden som er nevnt nedenfor. På fibrinplaten blir en minimal bakgrunnsaktivitet detektert, antagelig på grunn av endogen hamster t-PA, i det DUKXBl-kondisjonert medium. Ingen ring fremkommer på casein-platene hvis hybridproteinprøvene blir blandet med 3 mikro-liter kanin anti-tPA antistoffer (laget mot renset Bowes melanoma (t-PA) eller anti-urokinase antistoffer (laget mot Serono urokinase).

Anti-tPA antistoff inhiberer ikke u-PA enzym, heller ikke anti-urokinase-antistoff inhiberer t-PA i nevneverdig grad. Resultatene blir oppsummert i Tabell 1.

Eksempel 21: Fremstilling av hvbridoma- celler og isolering av monoklonale antistoffer a) Immuno<g>enkilde: En prøve av semi-renset naturlig human (melanoma t-PA) som har en antatt renhet på >90#. b) Immuniseringsprotokoll: Tre grupper BALB/c mus (Tierfarm Sisseln, Sveits) som er 10-14 uker gamle blir immunisert ved injeksjon inn i de to bakre fotputene og subkutant 100 pg melanoma t-PA emulgert i fullstendig Freund's adjuvant (Difco). Deretter, får første gruppe (Nr. 405) 10 pg t-PA i ufullstendig adjuvant, hver uke i seks uker, mens den andre gruppen (406) får samme mengde annenhver uke. Den tredje gruppen (407 ) får to ganger 50 pg t-PA i intervaller på tre uker. Alle dyrene tappes ved uke 4 og uke 8. Ved siste injeksjon gir 100 pg t-PA i PBS i.p. og fire dager senere fuseres miltceller med SP2/o myeloma-linje i henhold til standard prosedyre. Bare de mus med høy anti-t-PA antistoff-titer blir brukt ved fusjoneringen.

c) Cellefus. ionering: Alle fus j oner ingseksperimenter blir utført i henhold til prosedyrene til G. Kohler og C. Milstein

[ Nature 256, 495 (1975)] som bruker den ikke-utskillende Sp 2/0-Agl4 myeloma-linje [p. Shulman, CD. Wilde og G. Kohler, Nature 276, 269 (1978)]. 10<8> miltceller blir blandet med 10<7 >myeloma-celler med tilstedeværelse av 1 ml 5056 polyetylenglykol (PEG 1500, Serva). Etter vasking, blir cellene resuspendert i 48 ml standard Dulbecco's minimum essensiell medium (Gibco No. 042501). 3x10^ normale muse-peritoneale utsugde celler per fusjon blir tilsatt som feeder-celler. Cellene blir fordelt inn i 48x1 ml costar-brønner og matet 3 ganger per uke med standard BAT seleksjonsmedium i 3 til 6 uker. Når veksten av hybridomaceller blir synlig, blir supernatantene screenet ved både direkte antigen-binding (ELISA) og nøytralisering (casein) analyser (se nedenfor). Resultatene av 4 fusjoneringseksperimenter er som følgende: Av 192 utsådde brønner, ble 192 hybridoma oppnådd. Av disse, produserte 24 anti-t-PA antistoff. Av 24 positive hybridoma, ble 14 klonet og ut av 574 kloner, produserte 31 anti-t-PA mAb stabil. Tre (kloner 405B.33.3, 406A.23.7 og 407A.15.27) av disse ble injisert i mus og ascitesvæske er produsert for videre studier.

d) Isolering og rensing av monoklonale antistoffer:

BALB/c mus 8-10 uker gamle (Tierfarm Sisseln, Sveits) blir

forbehandlet intreperitonealt med 0.3 ml pristan (Aldrich). 2-3 uker senere, ble 2-5xl0<6> klonet hybridomaceller

405B.33.3, 406A.23.7 og 407A.15.27 og 0.2 ml pristan inokulert intraper i tonealt. Etter 8-10 dager ascites-vaeske samlet, og sentrifugert ved 800 x g og oppbevart ved -20°C.

Tint ascitesvæske blir sentrifugert ved 50000 x g i 60 min. Et fettlag som flyter på overflaten blir forsiktig fjernet, og proteinkonsentrasjonen blir justert til en konsentrasjon på 10-12 mg/ml. Rå immunoglobulin blir presipitert ved dråpevis tilsetting av 0.9 volum ekvivalenter av mettet ammoniumsulfat ved 0°C, deretter løst i 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7.9) og dialysert mot samme buffer. En immunoglobulin-fraksjon oppnåes ved DEAE-D52 cellulose (Whatman) kromatografi hvor et buffer-gradientsystem med 20 mM Tris-HC1/25-400 mM NaCl, pH 7.9 blir brukt. Immunoglobulinet blir igjen presipitert med ammoniumsulfat og løst i PBS ved en konsentrasjon på 10 mg/ml.

Natriumdodecyl-sulfat polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) av monoklonale antistoffer demonstrerer en renhetsgrad på mer enn 95$. e) Bestemmelse av klasse og subklasse av monoklonale antistoffer: Klasse og subklasse til monoklonale antistoffer fremstilt av klonede hybridoma-celler blir bestemt ved kjente immuno-diffusjonsteknikker til Ouchterlony (agar-gel immunodiffu-sjonsmetode) ved bruk av klasse og subklasse spesifikke kanin antistoffer (Bionetics).

Subklassene til mAbs er som følger:

405B.33.3 : 7 i<

406A.23.7 : y2b<

407A.15.27 : 12aK

f) Enzymimmunoanalyse (ELISA):

Mikrotiterplater dekkes med 0.5 g per brønn av et t-PA preparat (renhet >95#) i 100 pl PBS. Fri bindingskapasitet til platen blir mettet med en buffer som består av 0.256 gelatin i PBS som inneholder 0. 2% NaN3 (w/v), pH 7.4. 100 pl probe som inneholder de monoklonale antistoffene 405B.33.3, 406A.23.7 og 407A.15.27, respektivt, blir inkubert i brønnene ved 37°C i 2 timer. Platene blir vasket med PBS som inneholder 0.0556 Tween 20, deretter inkubert ved 37°C i 2 timer med et fosfatase-konjugert kanin anti-muse immunoglobulinpre-parat. Det fikserte enzymet blir vider utviklet ved inkubering (37"C, 30 til 60 min.) med en løsning av enzymsubstrat p-nitrof enyl-f osfat (1 mg/ml i dietanolaminbuf fer 1056 som inneholder 0.5 mM MgCl2 og 0.0256 (w/v) NaN3, pH 9.8) og måling av optisk tetthet ved 405 nm.

Den samme ELISA ble også utført ved bruk av urokinase. Ingen av mAb binder seg til urokinase. Alle mAb'ene er t-PA spesifikke.

g) Casein-lyseanalyse (nøytraliseringstest):

For å bestemme den inhibitoriske effekten av mAb'en, blir t-PA først blandet med mAb'ene 405B.33.3, 406B.23.7 og 407A.15.27, respektivt, og inkubert i 30-60 min. ved 4°C og deretter blir den vanlige casein/plasminogen agar-analysen utført (se eksempel 20B). Ingen av mAb'ene inhiberer t-PA aktiviteten med unntagelse av at mAb 405B.33.3 forårsaker en utsetting (mer enn 6 timer) av casein-lyse.

Eksempel 22: Rensing av hvbrid- plasminogenaktivator. generell prosedyre

Ekstrakter fra transformerte gjærceller blir fremstilt som beskrevet i eksempel 16. Ekstrakter fra plasmid-transformerte pattedyrceller, slik som CHO-celler, blir fremstilt som følger: Cellene blir først dyrket til 70-8056 tetthet. Deretter blir celle-monolaget skylt med medium som beskrevet ovenfor, med unntagelse av at man unnlater tilsetting av serum etterfulgt av dyrking av cellene i en tilleggsperiode på 5-7 dager. Mediet blir høstet hver 24 t, på samme tid suppleres friskt medium til cellene. Det kondisjonerte mediet som oppnåes på denne måten blir deretter sentrifugert ved 5000 x g i 30 min. og filtrert gjennom et 0.45 pm filter for fjerning av uønsket celle-debris før affinitetskromatografi. Som affinitets-matrise brukes enten immobilisert proteaseinhibitor DE-3 fra Erythrina latissima eller immobiliserte antistoffer til u-PA eller t-PA.

Hybride PA som inneholder den katalytiske B-kjeden til t-PA blir renset fra det kondisjonerte mediet som er fremstilt slik det er beskrevet ovenfor eller fra gjærcelleekstrakter ved bruk av protokollen som opprinnelig er utviklet for rensing av t-PA fra melanoma-celle-kondisjonert medium [jfr. C. Heussen et al., J. Biol. Chem. 259, 11635-11638 (1984)].

Alle hybrid PA er renset ved hjelp av polyklonale antistoffer som er dannet i kanin eller geit mot foreldre u-PA og t-PA enzymer eller ved hjelp av monoklonale antistoffer (med muse-opprinnelse) dannet mot foreldreenzymene oppdaget en epitope som er tilstede i det hybride PA som det gjelder (jfr. eksempel 21). Det valgte antistoffet blir immobilisert på en ikke-løselig matrise slik som Affigel eller Sepharose-4B. Det kondisjonerte mediet som er fremstilt slik det er beskrevet ovenfor eller gjærcelle-ekstraktet blir deretter applisert på en affinitets-matrise-kolonne, hvor uønskede proteiner blir vasket bort ved bruk av en hensiktsmessig buffer, for eksmpel Dulbecco's PBS [0.1 g/l CaCl2, 0.2 g/l KC1, 0.2 g/l KH2P04 0.047 g/l MgCl2, 8.0 g/l NaCl, 1.15 g/l Na2HP04; J. Exp. Med. 99, 167 (1954)] og deretter elueres PA fra kolonnen ved hjelp av det chaotropiske agens kalium-tiocyanat [jfr. M. Einarsson et al., Biochim. Biophys. Acta 830, 1-10 (1985)] eller en buffer med lav pH slik som 0.1-0.2 M glycin-HCl (pH 2.1).

Etter rensing med monoklonale antistoffer har hybride PA en renhet på mer enn 90$.

Eksempel 23: Rensing av UK2UPA(BC)

a. Preparering av en DE-3 Sepharose® kolonne.

Per ml cyanogen-bromidaktivert Sepharose 4B® (Pharmacia) er det koblet 5 mg renset inhibitor fra Erythrina latissima [F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol.Chem. 302, 531 (1981)], i henhold til produsentens instruksjoner. Matrisen blir ekvilibrert med 0.2 M ammoniumacetat-buffer pH 7.0 som inneholder 0.2 M NaCl, 0.1$ Synperionic® og 0.02$ natriumazid.

b. Kromatografisk rensing av UK2UPA(BC) på DE-3 Sepharose®

Det kondisjonerte mediet (jfr. eksempel 22) blir laget 0. 1% med hensyn til Synperonic® og settes deretter til DE-3 Sepharose®. Etter forsiktig røring i 1 time ved 4°C, helles DE-3 Sepharose 4B® i en kolonne og vaskes med 0.2 M NaCl, 0. 1% Synperonic til UV-absorbansen ved 280 nm når baselinje-nivået som indikerer at det ikke er noen gjenværende proteiner i eluatet. Vaskingen fortsetter med 0.2 M ammoniumacetat-buf fer pH 7.0 som inneholder 0.2 M ammonium-tiocyanat og 0. 1% Synperonic. Etter at UV-absorbansen ved 280 nm indikerer at det ikke er noe mere protein tilstede i eluatet, blir kolonnen eluert med 0.2 M ammoniumacetatbuffer pH 7.0 som inneholder 1.6 M ammoniumtiocyanat og 0. 1% Synperonic®. Fraksjoner som inneholder de høyeste amidolytiske aktiviteter, som måles ved hjelp av den fluorometriske analysen med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat [M. Zimmermann et al., Proe.Nati.Acad.Sei. USA. 75, 750 (1978)], blir slått sammen. Minst 8056 av aktiviteten som ble applisert på DE-3 Sepharose 4B® materiale gjenvinnes som en enkel topp.

De sammenslåtte aktive fraksjonene blir dialysert mot 0.2 M ammoniumacetatbuffer pH 7.0 som inneholder 0. 1% Synperonic® og applisert på en kolonne som inneholder monoklonal antistoff 407A.15.27 som er rettet mot den første kringledomenen til t-PA, og koblet til Sepharose 4B®, ekvilibrert i 0.2 M ammoniumacetatbuffer pH 7.0 som inneholder 0.156 Synperonic®, for å fjerne endogent t-PA. Eluatet, som inneholder UK2UPA(BC), blir samlet.

Revers fase HPLC av renset UK2UPA(BC) på en Nucleosil® 300-5-C18 kolonne med dimensjoner 4 x 110 mm viser en enkel topp ved eluering med en lineær gradient over 30 min som starter 7056 løsning A som består av vann som inneholder 0.156 trifluoroeddiksyre og <3>056 løsning B som består av acetonitril som inneholder 0.0856 trifluoreddiksyre og slutter ved 4056 A og 6056 B. De rensede proteinene viste ved N-terminal sekvensanalyse av de første ti aminosyreresidiene sekvensen SNELHOVPSN, som er identisk til den sekvensen som er ventet fra DNA-sekvensen som koder for molekylet.

Eksempel 24: Rensing av FK2UPA(BC) og K2UPA(BC)

a. Preparering av antistoff affinitetskolonner.

Kanin anti-uPA antistoffer renset fra kanin anti-uPA serum, monoklonale antistoffer 405B.33.3 og 406A.23.7, blir koblet til cyanogen-bromid-aktivert Sepharose 4B® (Pharmacia) i henhold til produsentens instruksjoner med bruk av 6 mg antistoff per ml aktivert Sepharose. Gelmatrisen er ekvilibrert med PBS som inneholder 0.156 Synperonic® og 0.156 natriumazid.

b. Kromatografisk rensing av FK2UPA(BC) og K2UPA(BC) på antistoff Sepharose 4B.

Kondisjonert medium (jfr. eksempel 22) blir laget til 0.156 med hensyn på Synperonic® og satt til anti-uPA Sepharose-4B eller til 405B.33.3 eller til 406A.23.7 Sepharose 4B. De siste to antistoffene er rettet mot den andre kringledomenen til t-PA. Etter forsiktig røring i 2 timer ved 4°C, helles antistoff Sepharose i en kolonne og vaskes med PBS som inneholder 1 M NaCl og 0. 1% Synperonic® til UV absorbansen ved 280 nm indikerer at det ikke er mere protein til stede i eluatet. Kolonnen blir deretter eluert med 0.2 M glysin-HCl buffer pH 2.5. Fraksjoner blir samlet i rør som inneholder en nøytraliserende mengde 1 M Tris. Fraksjoner som inneholder de høyeste amidolytiske aktivitetene, målt ved hjelp av fluorometrisk analyse med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat [M. Zimmermann et al., Proe.Nati.Acad.Sei USA. 75, 750

(1978)], blir samlet.

Revers fase HPLC av renset FK2UPA(BC) og K2UPA(BC) på en Nucleosil® 300-5-C18 kolonne med dimensjoner 4 x 110 mm viser en enkel topp ved eluering med en lineær gradient over 30 min. når man begynner med 7056 løsning A som består av vann som inneholder 0.156 trifluoroeddiksyre og 3056 løsning B som består av acetonitril som inneholder 0.0856 trif luoroeddiksyre og stopper ved 4056 A og 6056 B. N-terminal sekvensanalyse av de første fem residiene av de rensede proteinene resulterer i sekvensen SYQGN for K2UPA(BC) og SYQVI for FK2UPA(BC), som er identisk den sekvensen som er ventet fra DNA-sekvensen som koder for hvert molekyl.

Eksempel 25: Aktivitetsanalvse av hybrid plasminogenaktivatorer ved tilstedeværelse og uten fibrinogenfragmenter

Dobbel rateanalyse som beskrevet av Verheyen et al. [Thromb. Haemost. 48, 266 (1982)], basert på overføringen av plasminogen til plasmin ved hjelp av plasminogenaktivator, etterfulgt av reaksjonen av plasmin med det kromogene plasmin-substratet H-D-valyl-L-leucyl-L-lysin-nitroanilid dihydroklorid, blir benyttet. Analysen utføres i en mikro-titerplate med 96 brønner og med en Titertek® mikrotiter-plate-avleser. Brønnene inneholder 120-X pl 0.1 mol/l Tris/HCl buffer ved pH 7.5 som inneholder 0.156 Tween 80, 20 pl Glu-plasminogen ved 1.3 pmol/1 i den ovenfornevnte Tris-buffer, 100 pl plasminsubstrat ved 0.7 mmol/1 i Tris-buffer, X pl prøver ved kjente konsentrasjoner (X korresponderer til 10, 20, 40 og 60 pl, respektivt), eller urokinasestandard med definert aktivitet uttrykt i Internasjonale Enheter, og 10 pl stimulator (fibrinogen fragmenter) ved 3 mg/ml i destillert vann eller 10 pl destillert vann hvis eksperimentene utføres uten simulator. Økingen i lysabsorpsjon delt på kvadratroten av inkuberingstiden er proporsjonal til plasminogenaktivator-aktiviteten ved en kjent konsentrasjon av aktivator og blir uttrykt i Internasjonale Enheter. Høy molekylvekt urokinase med en definert aktivitet uttrykt i Internasjonale Enheter (American Diagnostics) er blitt brukt som en standard. Hver plasminogenaktivator er blitt analysert under like betingelser uten og med fibrinogenfragmenter, respektivt. Under disse betingelsene blir forskjellene i aktiviteter som oppnåes et mål for stimuleringen av plasminogenaktivatorer ved hjelp av fibrinogenfragmentene. Tabell 2 inneholder resultatene fra analysen, som indikerer ingen stimulering for urokinasestandarden i kontrast til stimuleringen som utøves av fibrinogenfragmentene på de nye plasminogenaktivatormole-kylene som inneholder den katalytiske domenen til urokinase. Til tross for at en eller flere av de ikke-katalytiske domenene F, G, Kl eller K2 til vev-plasminogenaktivator ikke er tilstede, observeres en stimulering ved hjelp av fibri-nogenf ragmentene for alle hybride molekyler som er testet.

Eksempel 26: " Clot"- lysis aktivitet til mutant plasminogen-aktivatorer

"Clot"-lysisaktiviteter blir bestemt ved hjelp av analysen som er beskrevet av R.D. Philo og P.J. Gaffney [Thromb. Haemost. 45, 107-109 (1981)]. Et logaritmisk plott av lysis-tid mot plasminogenaktivatorkonsentrasjon resulterer i en rett linje. Den spesifikke aktiviteten til en plasminogen-aktivator blir bestemt ved sammenligning med kurvene som oppnåes i et standard preparat av vev-plasminogenaktivator eller urokinase.

Kurvene til alle aktivatorer som er målt har omtrent den samme stigningen som tillater en direkte relasjon mellom tiden som er nødvendig for "clot"-lysis og deres spesifikke aktivitet. Da de forskjellige plasminogenaktivatorene ikke har den samme molekylvekten, må de spesifikke aktivitetene bli uttrykt i en molar konsentrasjon, i steden for den vanlige vektkonsentrasjonen, for å oppnå et meningsfylt kriterie for virkningsgraden til de forskjellige molekylene. UK2TPA(BC) er minst så aktivt som standard t-PA, mens FGK2UPA(BC) og FK2UPA(BC) viser aktiviteter som nesten er lik t-PA men signifikant høyere enn u-PA standard. K2UPA(BC) har en aktivitet som er nesten lik u-PA standard. Aktivitetene til analysen er oppsummert i Tabell 3:

Eksempel 27: Fjerning av plasminogenaktivator mutantmolekyler fra sirkulasjonen til kaniner.

1. Merking.

Alle mutante molekyler blir merket med 12E>j ved bruk av Iodogen-metoden [P.J. Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978)].

For å fjerne fritt <125>J som er i overskudd blir de mutante molekylene affinitets-renset enten ved bruk av metoden beskrevet i eksempel 23 (PA som har t-PA B-kjeden) eller metoden beskrevet i eksempel 24 (PA som har u-PA B-kjeden).

Spesifikke radioaktiviteter på 2-20 jjCi/jjg proteiner oppnåes vanligvis. Homogeniteten til de merkede molekylene blir fulgt ved SDS elektroforese og deretter ved røntgen-autoradiografi. I alle tilfeller migrerer de mutante molekylene ved ikke-reduserende betingelser som enkeltvise bånd og med Mv'er som er identiske til de ikke-merkede proteinene.

2. Fjerningsstudier.

Eksperimentene utføres i New Zealand hvite kaniner som veier mellom 1.8 til 2.4 kg. Dyrene bedøves 1750 mg/kg Urethan®

(Merck, Darmstadt, Tyskland) subkutant. Operativ åpning av luftrøret utføres og et plastikkrør settes inn i den ytre jugularvenen og den vanlige halspulsåren. 0.5 ml fosfat-bufret saltoppløsning som inneholder omtrent 300-500 ng av mutant PA blir injisert inn i jugularvenen og blodprøve (2 ml hver) i serie blir tatt sekvensielt gjennom et 60 min. interval via halspulsåren.

Blodprøvene tas på citrat, blir sentrifugert med en gang ved 3000 rpm i 15 min. og plasma dekanteres. Aliquoter presipi-teres i 10% trikloreddiksyre og bunnfallene telles i en 7-teller.

I forhold til t-PA isolert fra Bowes melanoma-cellelinje viser de mutante molekylene følgende halveringstider i sirkulasjon.

Mønsteret på fjerning av t-PA er bi-eksponensiell med en veldig rask a-fase etterfulgt av en saktere p-fase eliminering. Eliminering av UK2TPA(BC) og K2UPA(BC) er nesten monofasisk, dette antyder at distribusjonen til en annen del er undertrykt.

3. Organ-distribusjon.

Kaniner behandles som ovenfor. 20 min. etter injeksjonen av de iodinerte mutante molekylene ofres kaninene, og hoved-organene blir tatt ut, og vekten bestemmes og en aliquot blir telt i "Y-teller etter homogeniseringen.

Mutante PA har enda en større fraksjon av de radioaktive molekylene i sirkulasjon (supra), dette tyder på en redusert lever-fjerning. Leverens reduserte opptak er derfor forklar-ingen på den utvidede halveringstiden og det monofasiske elimineringsmønsteret til de mutante molekylene, spesielt UK2TPA(BC) og K2TJPA(BC).

I eksemplene 28-34 blir plasmidene pCGC5/K2UPA, pCGC6/FTJPAB, pCGC7/FK2UPA og pCGC8/FGK2UPA (jfr. eksempel 18) brukt til konstruksjon av gjær ekspresjonsplasmider. Gjærinvertasesignalsekvensen blir fusert i rikte leseramme til forskjellige kodete sekvenser. De kommer til uttrykk under kontroll av den induserbare PHO5 promoter. I noen konstruksjoner blir glykosyleringssetet mutert.

Eksempel 28: Kloning av fag Fl replikasjonsorigo inn i ekspresjonsvektor pJDB207: Plasmider som tilhører pEMBL-familien [Dente et al., Nucl. Acids Res. 11, 1645-55 (1983)] inneholder en region av genomet til fag Fl med alle cis-virkende elementer for DNA-replikasjon og morfogenese. Bare ved superinfeksjon med fag Fl (hjelper) blir store mengder av enkel-kjedet plasmid DNA utskilt i mediet.

Plasmid pEMBL19(+) blir kuttet med Seal og EcoRI. Et 2.2 kb fragment blir isolert som inneholder deler av ampicillin-resistentgenet til pBR322 (Scal-setet), den Fl intergene regionen og deler av p<->galaktosidasegenet opp til polylinker-regionen (EcoRI-setet). Plasmid pJDB207 blir lineærisert ved kutting med Hpal. 10 pg av lineærisert plasmid blir delvis kuttet med 7.5 enheter av EcoRI ved tilstedeværelse av 0.1 mg/ml etidiumbromid i 40 min. ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved tilsetting av 10 mM EDTA. 1.8 kb EcoRI-Hpal fragmentet blir isolert på en preparativ 0.8 % agarosegel. 3 pg Hpal kuttet pJDB207 blir videre kuttet med Seal. Det 4.8 kb store Hpal-Scal fragmentet blir isolert. DNA-fragmentene blir elektroeluert fra agarosegelblokkene, renset ved DE52 kromatografi og etanolpresipitert.

0.2 pmol av hver av 2.2 kb Seal-EcoRI fragmentene og 1.8 kb EcoRI-Hpal fragmentet og 0.1 pmol av Hpal-Scal vektorfragmentet blir ligert. Ligeringsblandingen blir brukt til å transformere kompetente E.coli HB101 Ca<2+> celler.

Plasmid DNA til 12 ampicillin-resistente kolonier blir analysert ved EcoRI/Pstl dobbelkutting. DNA fra en enkel klon med riktige restriksjonsfragmenter blir valgt og referert til som pJDB207FlLac.

Eksempel 29: Konstruksjon av plasmid pJDB207/PH05-I-FK2UPA: Den kodete sekvensen til FK2UPA som den er i plasmid pCGC7/FK2UPA blir benyttet for ekspresjon i gjær ved fusering av gjærinvertasesignalsekvensen og uttrykking av genet under kontroll av PHO5 promoteren.

Plasmid pCGC7/FK2UPA (se eksempel 18D) blir kuttet med Pstl og BamHI. Det 1147 bp Pstl-BamHI fragmentet inneholder FK2UPA kodete sekvensen fra Pstl-setet ved nukleotid posisjon 199 til t-PA (Fig. 1) til BamHI-setet ved posisjon 1322 til u-PA (Fig. 3).

Plasmid pJDB207/ PH05-I-TPA (se eksempel 6C) blir kuttet med Sali og Pstl. 891 bp fragmentet blir isolert. Det inneholder PHO5 promoteren, invertasesignalsekvensen og 19 baser av t-PA (Pstl-setet).

Plasmid pJDB207/ PHO5-1-UPA (se eksempel 8) blir kuttet med Sali og BamHI. 6.6 kb vektorfragmentet inneholder 3' delen av u-PA genet fra BamHI setet ved nukleotide posisjon 1323 (Fig. 3) til posisjon 1441 (PvuII-setet med Xhol-linker tilsatt) og PHO5 transkripsjon termineringssignalene.

0.2 pmol av hver av 891 bp Sall-Pstl-fragmentet og 1147 bp Pstl-BamHI fragmentet og 0.1 pmol av 6.6 kb Sall-BamHI vektorfragmentet blir ligert og brukt til transformering av E.coli HB101 Ca<2+> celler. 8 ampicillin-resistente kolonier dyrkes i LB-medium som inneholder ampicillin (100 mg/l). Plasmid DNA blir isolert og analysert ved EcoRI og Hindlll restriksjonskutting. Et plasmid med de ventede restriksjonsfragmentene blir valgt og referert til pJDB207/PH05-I-FK2UPA.

Plasmid pCGC6/FUPA og pCGC8/FGK2UPA kan bli brukt på samme måte pCGC7/FK2UPA. De resulterende gjær ekspresjonsplasmid-ene blir designert pJDB207/ PH05-I-FUPAB og pJDB207/ PH05-I-FGK2UPA respektivt.

Eksempel 30: Mutasjon av glvkosvleringssetet ved fAsn 3021 til urokinase B- kjeden: a) Kloning av et Pstl-BamHI fragment fra u-PA inn i M13mpl8: Plasmidet pJDE207/ PHO5-1 -UPA (se eksempel 8) inneholder hele den kodete regionen til urokinase. DNA blir kuttet med Pstl og BamHI. 886 bp Pstl-BamHI fragmentet fra urokinasegenet inneholder glykosyleringssetet (Asn 302) ved de nukleotide posisjonene 1033-1041. Et annet fragment med lignende størrelse blir videre kuttet med BstEII. 886 bp Pstl-BamHI fragmentet blir isolert på en preparativ 0.856 agarosegel.

M13mpl8 RF-DNA blir kuttet med Pstl og BamHI. 7.3 kb fragmentet blir isolert på en preparativ 0.856 agarosegel. DNA-fragmentene blir elektroeluert fra agarosegelen og renset ved DE52 kromatografi og etanolpresipitering.

0.1 pmol av 7.3 kb Pstl-BamHI kuttet vektor og 0.2 pmol av 886 bp Pst-BamHI u-PA fragmentet blir ligert. 1 pl og 3 pl av 1igeringsblandingen blir brukt for transformering av E.coli JM109 Ca<2+> celler i henhold til manualen "M13 kloning og sekvenseringshåndbok" publisert av Amersham. 12 fargeløs plaques blir plukket og enkel-kjedet DNA fremstilt [J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)]. Den enkel-kjedete DNA blir brukt til å fremstille delvis dobbel-kjedet DNA ved baseparring og ved å utvide M13 universal-primer med Klenow polymerase. Reaksjonsproduktet blir ekstrahert med fenol/kloroform og DNA blir presipitert med etanol. DNA blir kuttet med Pstl og BamHI. Et 886 bp fragment indikerer at u-PA fragmentet er blitt klonet inn i M13mpl8 vektoren. En klon er videre analysert og det riktige innskuddet er bekreftet ved sekvensering. Klonen blir referert til som M13mpl8/UPA.

b) Mutasjon av glykosyleringssetet til Asn302:

De mutagene og sekvenseringsprimerene blir syntetisert ved bruk av fosforamidit-metoden [M.H. Caruthers, i: Kjemisk og enzymatisk syntese av gen-fragmenter, (ed. H.G. Gassen og A. Lang) Verlag Chemie, weinheim, Federal Republic of Germany] på en Applied Biosystem Model 380B syntesemaskin.

In vitro mutagenese på enkel-kjedet templat DNA blir utført som beskrevet ved T.A. Kunkel [Proe. Nat. Acad. Sei. USA 82, 488-492 (1985)]. Uracil som inneholder enkel-kjedet templat DNA blir fremstilt i løpet av en vekstcyklus på E.coli stammen RZ1032 (dut~, ung").

100 pmol av den mutagene oliginukleotid-primer W blir fosforylert i 20 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5 mM ATP og 20 enheter T4 polynukleotid kinase (Boehringer). Etter 30 min. ved 37° C blir reaksjonen stoppet ved oppvarming til 70°C i 10 min.

0.3 pmol uracil som inneholder M13mpl8/UPA templat DNA blir inkubert med 10 pmol fosforylert mutagen oligodesoksyribo-nukleotid-primer ¥ og 10 pmol av M13 universal sekvenseringsprimer i 30 pl 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2. Prøven blir varmet til 80° C og satt til avkjøling ved romtemperatur i et lite vannbad.

c) Ekstensjons-ligeringsreaksjon:

Til den ovenfor baseparrede prøven blir 10 pl av en enzym-dNTP blanding tilsatt som inneholder 1 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs, 400 (U/pl) og 6 enheter Klenow DNA- polymerase (Boehringer, 6 U/pl). Inkuberingen er ved 15°C over natt. d) Transformasjon av E.coli BMH71-celler: Ligeringsblandingen blir fortynnet til 200 pl med TE. 0.1 pl, 1 pl og 10 pl av ekstensjons-ligeringsblandingen blir tilsatt til kompetente E.coli BMH71 Ca<2+> celler (Kunkel, supra). Etter 30 min. på is blir cellene utsatt for varme-sjokk i 3 min. ved 42°C og deretter oppbevart på is. Cellene blir platet ut med topp-agar og E.coli JM101 indikatorceller. 6 plaques blir plukket og brukt til infeksjon av E.coli JM109. Fagene blir isolert fra supernatanten ved PEG-presipitasjon. Enkel-kjedet DNA blir fremstilt ved ekstra-hering med fenol og presipitering med etanol. Templat DNA blir resuspendert i TE.

Mutering av AAT-kodonet (Asn302) til CAA-kodonet (Gln302) blir bekreftet i en klon ved DNA-sekvensbestemmelse med den ovenfornevnte sekvenseringsprimer ved hjelp av kjedeterminer-ingsmetoden [F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 74, 5463-67 (1977)]. Mutasjonen resulterer i en Asn —> Gin forandring i aminosyreposisjon 302 til u-PA og dermed eliminerer det eneste glykosyleringssetet i urokinase. W betegner mutasjonen til glykosyleringssetet i u-PA B-kjeden (Asn 302 —> Gln302). Den positive klonen blir referert til som M13mpl8/UPA-W.

Eksempel 31: Overføring av mutasjonen [Gln302] i urokinase B-kjeden til et FK2UPA hybrid: Plasmid pJDB207/PE05-I-FK2UPA blir kuttet med Sali og Xhol. 2.2 kb Sall-Xhol fragmentet blir isolert, elektroeluert fra agarosegelen, renset ved DE52 kromatografi og presipitert i etanol. Dette DNA-fragmentet inneholder to Mstl seter i PE05 promoteren og u-PA sekvensen. 3 pg av 2.2 kb Sall-Xhol fragmentet blir delvis kuttet med 3 enheter Mstl i 10 min. ved 37°C. Eeaksjonsproduktene blir separert på en preparativ 0.856 agarosegel og 1651 bp Sall-Mstl fragmentet blir isolert og elektroeluert fra gelen. DNA-fragmentet inneholder Sall-BamHI sekvensen til pBR322, PHO5 promotoren, invertase signalsekvensen og FK2UPA kodete sekvensen opp til Mstl setet i u-PA delen ved den nukleotide posisjon 935.

RF-DNA blir fremstilt for M13mpl8/UPA-W (se eksempel 30) ved hjelp av den raske DNA-isoleringsprosedyren [D.S.Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193-97 (1981)]. 5 pg DNA blir kuttet med BamHI og Mstl. Etter tilsetting av 2 pg RNase (Serva) og inkubering 5 min. ved 37°C blir 387 bp Mstl-BamHI fragmentet isolert på en preparativ 0.856 agarosegel. DNA-fragmentet blir elektroeluert og presipitert i etanol. Fragmentet inneholder mutasjon AAT —> CAA ved de nukleotide posisjonene 1033-1035 (Asn302 —> Gin) i urokinase B-kjeden.

Plasmid JDB207/PH05-I-UPA blir kuttet med Sali og BamHI. 6.6 kb vektorf ragmentet (se eksempel 29) blir isolert. 0.2 pmol av 1651 bp Sall-Mstl fragmentet, 0.2 pmol av 387 bp Mstl-BamHI fragmentet og 0.1 pmol av 6.6 kb Sall-BamHI vektorfragmentet blir ligert. Kompetente E.coli HB101 Ca<2+ >celler blir transformert. 12 ampicillin-resistente transformanter dyrkes opp. Plasmid DNA blir isolert og analysert ved EcoRI og Hindlll restrik-sj onskutting. Mutasjonen (W) ved glykosyleringssetet ødelegger EcoRI setet ved nukleotide posisjonene 1032-1037. Tilstedeværelsen av mutasjonen blir bekreftet ved DNA-sekvensering. Et plasmid DNA med mutasjon i u-PA B-kjeden blir referert til som pJDB207/PH05-I-FK2UPA<B->w. Dette plasmidet har et intakt glykosyleringssete i kringle K2, men det mutante setet w(Asn302 —> Gin) i u-PA B-kjeden.

Plasmidene pJDB207/ PH05-I-FUPAB-W og

pJDB207/PH05-I-FGK2UPA<B->W

blir konstruert på samme måte ved å starte fra de korresponderende ikke-muterte plasmidene (se eksempel 29).

4.8 kb Sall-Hpal vektordelen til pJDB207/PH05-I-FK2UPAB-W blir erstattet av 6.2 kb Sall-Hpal vektorfragmentet til pJDB207/FlLac (se eksempel 28). 6.2 kb fragmentet har et 1.4 kb FILac innskudd til pEML19 klonet inn i 4.8 kb fragmentet til pJDB207. Etter ligering, transformering og analyse av den nye konstruksjonen blir en riktig plasmid med FILac innskuddet referert til som

pJDB207/FlLac/PH05-I-FK2UPA<B->W.

Plasmid pJDB207FlLac/ PH05-1-FGKoUPAB-W fås på samme måte.

På samme måte blir 4.8 kb Sall-Hpal vektordelen til pJDB207/- PH05 -1 -MOU-KoTPAB (se eksempel 15C) erstattet av 6.2 Sall-Hpal vektorfragmentet til pJDB207FlLac. Det resulterende plasmid blir referert til som PJDB207FlLac/PH05-I-UK2TPA. Plasmidene pJDB207FlLac/PH05-I-TJK2IJPAB, pJDB207FlLac/PH05-I-TPA<A>UPA og pJDB207FlLac/PH05-I-UPA<A>TPA fås på samme måte fra plasmidene uten FILac vektorfragmentet.

Eksempel 32: Mutasjon av glykosyleringssetet [Asnl84GlySer] i kringle K2 til FK2UPA<B->W:

a) Fremstilling av enkel-kjedet templat:

Plasmid pJDB207FlLac/ PH05-I-FKoUPAB-W blir brukt til å . transformere kompetent E.coli RZ1032 Ca<2+> celler [T.A. Kunkel, supra]. En ampicillin resistent koloni dyrkes i LB-medium supplementert med 100 pg/ml ampicillin, 20 pg/ml tymidin og 20 pg/ml desoksyadenosin. Ved en celletetthet på l*10<8>/ml blir cellene samlet, vasket i LB-medium og resuspendert i LB-medium som inneholder 100 jjg/ml ampicillin og 0.25

>jg/ml uridin. Ved en OD600 på 0.3 blir hjelperfag R408 (Pharmacia-PL Biochemicals, Inc.) tilsatt ved en m.o.i. på 20. Kulturen ristes kraftig i 5 timer ved 37°C. Uracil-inneholdende enkel-kjedet DNA i mediet blir isolert som

beskrevet av T.A. Kunkel (supra). Begynnende fra pEMBL19(+)

(se eksempel 28) blir Fl området klonet inn i pJDB207 i en orientering som er mot-klokke-retningen. Det isolerte enkel-kjedete DNA er i "sense"-kjeden til FKgUPA<2> innskuddet i ekspresjonsplasmidet.

b) Mutasjon av glykosyleringssetet i Asnl84 til kringle K2 til t-PA: Mutasjonen vedrører den tredje posisjonen til consensus aminosyre-gjenkjenningssekvens for glykosylering. Serl86 blir erstattet med Ala.

Protokoll for mutasjonen er slik den er beskrevet i eksempel 30. Istedenfor M13 universal-sekvenseringsprimer blir en PHO5 oligonukleotidprimer med formelen 5'-AGTCGAGGTTAGTATGGC-3' brukt som hybridiserer til nukleotidene -60 til -77 fra ATG i PHO5 promoteren. Etter ekstensjon og ligeringsreaksjonen, blir kompetente E.coli BMH71 Ca<2+> celler [Kunkel, supra] transformert. Ampicillinresistente kolonier blir plukket og dyrket i LB-medium som inneholder 100 mg/l ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt og analysert for tilstedeværelse av mutasjonen ved DNA-sekvensering. Mutasjonen av TCA-kodonet til GCA resulterer i et Ser —> Ala bytte i aminosyreposisjon 186 til t-PA. Mutasjonen i den tredje posisjonen i consensus sekvensen eliminerer glykosyleringssetet. En klon med det muterte DNA blir referert til som pJDB207FlLac/ PH05-I-FKoUPAB-WY.

Y designerer mutasjonen til glykosyleringssetet ved Asnl84 i K2 til t-PA og W-mutasjonen ved Asn302 i u-PA B-kjeden. Det resulterende ikke-glykosylerte FK2UPA hybridproteinet har to aminosyreforandringer: Serl86 —> Ala i t-PA kringle K2 og Asn302 —> Gin i u-PA B-kjeden.

Den analoge mutasjonen i plasmid pJDB207F^Lac/PE05-I-FGK2UPA<B->W (se eksempel 31) fører til plasmid pJDB307FlLac/ PH05-I-FKoUPAB-wY. som koder for en ikke glykosylert FGK2UPA hybridprotein.

Eksempel 33: Konstruksjon av plasmid pJDB207/PH05-I-K2UPA<B->

WY:

Den nukleotide sekvensen som koder for det hybride K2UPAproteinet som er definert ved aminosyresekvens tPA(Serl-Gln3)Glyl76-Arg275)-uPA(Ilel59-Leu411) oppnås i plasmid pCGC5/K2UPA<B.> For ekspresjon i gjær blir den induserbare PHO5 promoteren brukt og invertase signalsekvensen blir fusert i riktig leseramme til K2UPA kodete område. Plasmid pCGC5/K2UPA blir kuttet med Bglll og Accl. Det 487 bp Bglll-AccI fragmentet blir isolert. Det inneholder den kodete sekvensen fra Bglll setet til t-PA (nukleotid posisjon 178) til Accl setet i u-PA (nukleotid posisjon 779). Fragmentet blir kuttet med HphI som resulterer i 4 fragmenter .

To oligodesoksyribonukleotider med følgende formler

blir syntetisert ved hjelp av fosforamidit-metoden på en Applied Biosystem Model 380B syntesemaskin. 01igomikleotid-ene I og II danner en dobbel-kjedet DNA-linker. De 5 mikleotidene ved den overhengende 5'enden er deler av gjær-invertase-signalsekvensen, etterfulgt av den t-PA kodete sekvensen (Serl-Gln3)(Glyl76-Thrl91) til det første HphI kuttete setet ved nukleotidposisjon 752 (se fig. 1). Glykosyleringssetet ved posisjon 729-737 (AsnGLySer) blir mutert i den syntetiske sekvensen fra TCA (Ser) til GCA (Ala), dermed elimineres glykosylering oppdagelses-sekvensen. Mutasjonen av glykosyleringssetet ved aminosyreposisjonene 184-186 til t-PA (d.v.s. det andre glykosyleringssetet i opprinnelig t-PA) blir designert Y.

Oligonukleotidene I og II blir fosforylert ved deres 5'ender, varmet i 10 min. ved 85°C og sammensmeltet ved avkjøling til romtemperatur. 10.5 pg (270 pmol) av kinasebehandlet, dobbel-kjedet linker DNA blir ligert ved et 30-ganger molar overskudd til HphI kuttet DNA-fragmenter (se ovenfor) som beskrevet i eksempel 8B. Linkermolekyler som er i overskudd blir fjernet ved presipitasjon ved isopropanol. DNA blir videre kuttet med Seal. Det 252 bp fragmentet blir isolert på en preparativ 1.556 agarosegel, elektroeluert og presipitert i etanol.

Plasmid p31RIT-12 (se eksempel 6B) blir kuttet med Sali og Xhol. Det isolerte fragmentet blir videre kuttet med Hgal (se eksempel 6C) og BamHI. Det resulterende 591 bp BamHI-Hgal fragmentet blir isolert. Det inneholder PHO5 promoteren og invertasesignalsekvens.

Plasmid pJDB207/PH05-I-FK2UPAB-w blir kuttet med BamHI. 5 pg av det lineære DNA blir delvis kuttet med 10 enheter Seal i 10 min. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetting av 10 mM EDTA. 7.7 kb BamHI-Scal vektorfragmentet blir isolert, elektroeluert og presipitert i etanol. Det inneholder den 3'delen av den kodete sekvensen fra Scal-setet i t-PA (posisjon 953) til enden av u-PA B-kjeden (PvuII setet ved posisjon 1441 med Xhol linker tilsatt), PHO5 terminator og pJDB207 vektorsekvensene. 0.2 pmol av hver av 591 bp BamHI-Hgal fragmentet og 252 bp klebrige ender (linker)-ScaI fragmentet og 0.1 pmol av 7.7 kb vektorf ragmentet blir ligert. Etter transformasjon av E.coli HB101 Ca<2+> celler, dyrkes 12 ampicillin resistente kolonier. Plasmid DNA blir isolert og analysert ved EcoRI og Hindlll kutting. Tilstedeværelse av mutasjonene blir bekreftet ved DNA-sekvensering. En korrekt klon blir valgt og referert til som pJDB207/PH05-I-K2UPA<B->WY. Glykosyleringssetene i kringle K2 til t-PA og u-PA B-kjeden blir begge mutert (Y og W, respektivt).

Det resulterende ikke-glykosylerte K2UPA<B->hybridproteinet har to aminosyreforandringer: Serl86 —> Ala i t-PA K2 domenen og Asn302 —> Gin i u-PA B-kjeden.

Eksempel 34: Mutasjon av glykosyleringssetene [Asnl84GlySer] og [Asn 448ArgThr] i UK2TPA.

Uracil inneholdende enkel-kjedet templat [T.A. Kunkel, supra] til plasmid pJDB207FlLac/PH05-I-UK2TPA hybrid (se eksempel 31) er fremstilt som beskrevet i eksempel 30. Fremgangsmåten for mutasjonen for glykosyleringssetet ved Asnl84 er som beskrevet i eksempel 32. Mutasjon av glykosyleringssetet ved Asn448 resulterer i en Thr450 —> Ala aminosyreforandring. Protokoll for mutasjonen er beskrevet i eksempel 30. De fosforylerte mutagene prlmerene Y og Z blir begge baseparret til uracil-inneholdende enkel-kjede templatet til pJDB207FlLac/PH05-I-IJK2TPAB. Ytterligere bruk av PE05 oligonukleotid-primeren (se eksempel 32) er valgfritt.

Etter ekstensjonen og ligeringsreaksjonen blir kompetente E.coli BMH71 Ca<2+> celler transformert. Plasmid DNA fra ampicillin-resistente transformanter blir fremstilt og analysert for tilstedeværelse av begge mutasjoner ved hjelp av DNA-sekvensering med de indikerte sekvenseringprimerene.

Plasmid DNA fra en klon med begge mutasjoner blir referert til som pJDB207FlLac/PH05-I-UK2TPA<]B->YZ. Y betegner mutasjonen til glykosyleringssetet ved Asnl84 og Z mutasjonen ved Asn448. Det ikke-glykosylerte UK2TPA hybridproteinet har to aminosyreforandringer: Serl86 —> Ala i K2 kringle til t-PA og Thr450 —> Ala i t-PA B-kjeden.

Protokollen for mutasjonen kan også benyttes for templater av pJDB207FlLac/ PH05-I-UKoUPAB.

pJDB207FlLac/ PH05-I-TPAAUPAB og

pJDB207FlLac/ PH05-I-UPAATPAB (se eksempel 31)

med mutagen primer W for mutasjon av glykosyleringssetet i u-PA B-kjeden og/eller mutagen-primerene Y og Z og andre publisert i Europa patentsøknad nr. 225286 for mutasjon av glykosyleringssetene i t-PA.

Eksempel 35: Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae GRF18 og fremstilling av gjærcelleekstrakter.

Plasmidene pJDB207/PH05-I-FK2UPA,

pJDB207FlLac/ PH05-I-FK2UPAB-W, pJDB207FlLac/PH05-I-FK2UPA<B->WY, pJDB207FlLac/PH05-I-TJK2TPAB , pJDB207FlLac/PJ305-I-UK2TPAB-YZ,

PJDB2 0 7/ PHO 5-1-K2UPAB-WY. pJDB2 0 7/ PHO 5-1-FUPAB, pJDB 2 0 7/ PHO 5-1-FUPAB-W, pJDB207/PH05-I-FGK2UPA, pJDB207/PH05-I-FGK2UPA<B->W, pJDB207FlLac/PH05-I-FGK2UPA<B->W og pJDB207FlLac/ PHO 5-1-FGKoUPAB-WY

blir transformert inn i Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (DSM 3665). Transformasjon, cellevekst og preparering av celleekstrakter er beskrevet i eksempel 16.

De resulterende hybride plasminogenaktivorene kan bli renset på en lignende måte som det som er beskrevet i eksemplene 22 til 24.

Eksempel 36: Fremstilling av frystetørret hybrid plasminogen-aktivatorer .

Løsningene som oppnåes i eksemplene 22 til 24 blir videre renset og frysetørret som følger: Løsningen fortynnes med 10 volum 0.1 M ammoniumacetat pH 5.0 (totalt volum 80 ml) og applisert på en kolonne som inneholder 5 ml CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) med en elueringshastighet på 25 ml/h ved romtemperatur. (Kolonnen er blitt pre-ekvilibrert med 0.1 M ammoniumacetat). Produkt-frie eluatet blir kastet. Kolonnen blir vasket med 15 ml 0.1 M ammoniumacetat pH 5.0 og med 10 ml 0.1 M ammoniumacetat pH 7.0. Eluering av det adsorberte hybrid PA blir deretter utført ved 1 M ammoniumacetat pH 8.6 ved romtemperatur (elueringshastighet 5 ml/h). For å forhindre gassdannelse i kolonnen, blir elueringen utført ved et trykk i overskudd på 1 til 1.5 bar. Hybrid PA-innholdet i eluatet blir målt med en UV-monitor (280 nm). En fraksjon som inneholder omtrent 9056 av det eluerte hybrid PA blir samlet og frysetørret. Renheten av det faste hybrid PA frysetørrede materialet er omtrent eller høyere enn 95% vurdert etter HPLC. Produktet inneholder ingen detergenter.

Eksempel 37: Første farmasøytiske preparat for parenteral administrasjon.

En løsning som inneholder rent uPA(1-44)-tPA(176-527) oppnådd slik det er beskrevet ovenfor blir dialysert mot 0.3 molar natriumklorid som inneholder 0.0156 Tween 80® og oppbevart ved -80°C. Før administreringen blir konsentrasjonen justert til 75 jjg/ml av total PA og 0.3M NaCl. Løsningen blir sterilisert ved filtrering gjennom en 0.22 pg membranfilter.

Istedenfor den ovenfornevnte PA er det også mulig å bruke samme mengde av en annen PA som er beskrevet i de foregående eksemplene, slik som, for eksempel, uPA( 1-158 )-tPA(276-527), uPA(1-131)-tPA(263-527), tPA(1-275)-uPA(159-411), tPA(1-262)-uPA(132-411), uPA(l-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411) , tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(1-49 )-uPA(134-411 ) , tPA(l-49)-tPA(176-275 )-uPA(159-411),

tPA(1-49)-tpA(176-262)-uPA(132-411),

tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411),

tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) eller

tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411),

eller en mutant hybrid PA, slik som, for eksempel, tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301), Gin, 303-411), tPA(l-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gin, 303-411),

uPA(l-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527),

tPA(l-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275 )-uPA(159-301), Gin, 303-411) eller

tPA(l-86)-tPA(176-185, Ala, 187-275 )-uPA(159-301), Gin, 303-411).

Eksempel 38: Andre farmasøytiske preparat for parenteral administrasjon (dispersjon for injeksjon).

169.3 mg soyabønnelecitin (soyabønne fosfatid NC 95, produ-sent: Nattermann, Cologne, Tyskland; renhet 90-9696; innhold av fettsyrer: linolsyre 61-7156, linolsyre 4-756, oljesyre 6-1356 , palmitinsyre 10-1556, stearinsyre 1 .5-3. 556) og 92.7 mg ren natriumglykokolat blir løst i 752.5 ml sterilisert vann. Løsningen justeres til pH 7.4 med 1 N NaOE. 10 mg frysetør-ret uPA(l-44)-tPA(176-527) blir tilsatt. Blandingen blir rørt helt til en klar løsning fremkommer. Løsningen sterili-seres ved filtrering gjennom en 0.22 pm membranfilter og fylles i ampuller.

Istedenfor den ovenfornevnte PA er det også mulig å bruke samme mengde av en annen PA som er beskrevet i de foregående eksemplene, slik som, for eksempel, uPA(1-158)-tPA(276-527), uPA(1-131 )-tPA(263-527 ), tPA(1-275)-uPA(159-411), tPA(1-262)-uPA(132-411), uPA(l-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411), tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-uPA(134-411), tPA(1-49 )-tPA(176-275)-uPA(159-411),

tPA(l-49 )-tpA(176-262)-uPA(132-411),

tPA(1-3 )-tPA(176-275)-uPA(159-411),

tPA(1-86 )-tPA(176-275)-uPA(159-411) eller

tPA(l-86 )-tPA(176-262)-uPA(132-411),

eller en mutant hybrid PA, slik som, for eksempel, tPA(l-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301), Gin, 303-411), tPA(l-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275 )-uPA(159-301, Gin, 303-411),

uPA(l-44 )-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527), tPA(l-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275 )-uPA(159-301 ), Gin, 303-411) eller

tPA(l-86 )-tPA(l76-185 , Ala, 187-275 )-uPA(159-301), Gin, 303-411).

Eksempel 39: Tredje farmasøytiske preparat for parenteral administrasjon (inkludert stor pille (bolus) injeksjon).

100 mg hybrid plasminogenaktivator eller mutant hybrid plasminogenaktivator slik som en av de nevnte i eksemplene 37 og 38, blir løst i 1000 ml 50 mM glutaminsyre/natriumglutamat som inneholder 0. 7% NaCl, pH 4.5. Løsningen fylles i ampuller og kan bli brukt for intravenøs (bolus) infusjon.

Deponering av mikroorganismer

Følgende stammer ble deponert Oktober 23, 1987 ved "Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen" (DSM), Grlsebachstrasse 8, D-3000 Gottingen (aksesjonsnumrene som er gitt):

Følgende hybridoma cellelinjer ble deponert November 20, 1987 ved "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris (CNCM) med følgende aksesjonstall:

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en enkel-kjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser til human t-PA vist i figur 1 og human u-PA vist i figur 3, hvor den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-275 )-uPA(159-411, og tPA(1-86 )-tPA(176-275)-uPA(159-411), karakterisert ved å dyrke under hensiktsmessige næringsbetingelser en transformert gjær eller pattedyrvertcelle inneholdene et DNA kodende for nevnte hybride plasminogenaktivator og isolering av nevnte hybride plasminogenaktivator.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at tPA(l-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) produseres.

3. DNA sekvens, karakterisert ved at den består av nukleotidsekvensene kodende for en enkel-kjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser til human t-PA vist i figur 1 og av human u-PA vist i figur 3, idet den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(l76-275)-uPA(159-411, og tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

4 . DNA sekvens ifølge krav 3, karakterisert ved at den består av nukleotidsekvensene kodende for tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

5 . Hybridvektor for anvendelse i en gjær eller pattedyr vertcelle, karakterisert ved at den omfatter en DNA sekvens, kodende for en enkeltkjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser av human t-PA vist i figur 1 og av human u-PA vist i figur 3, idet den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(l-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411, og tPA(1-86)-tPA(176-275 )-uPA(159-411), idet den hybride vektoren kan uttrykke det gitte genet.

6. Hybrid vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at den omfatter en DNA sekvens kodende for tPA(l-3)-tPA(176-275 )-uPA(159-411).

7. Eukaryot vertcelle transformert med en hybrid vektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA sekvens kodende for en enkeltkjede hybrid plasminogenaktivator bestående av følgende aminosyresekvenser av human t-PA vist i figur 1 og human u-PA vist i figur 3, idet den hybride plasminogenaktivatoren blir valgt fra gruppen bestående av tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411, og tPA(l-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411), idet vertcellen kan uttrykke det gitte genet.

8. Eukaryot vertcelle ifølge krav 7, karakterisert ved at den er transformert med en hybrid vektor om-fattende en DNA sekvens kodende for tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411).