FI91160C - Menetelmä modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI91160C
FI91160C FI864654A FI864654A FI91160C FI 91160 C FI91160 C FI 91160C FI 864654 A FI864654 A FI 864654A FI 864654 A FI864654 A FI 864654A FI 91160 C FI91160 C FI 91160C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dna
amino acid
ser
yeast
asn
Prior art date
Application number
FI864654A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI864654A (fi
FI864654A0 (fi
FI91160B (fi
Inventor
Jutta Heim
Bernd Meyhack
Bhabatosh Chaudhuri
Oostrum Jan Van
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of FI864654A0 publication Critical patent/FI864654A0/fi
Publication of FI864654A publication Critical patent/FI864654A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI91160B publication Critical patent/FI91160B/fi
Publication of FI91160C publication Critical patent/FI91160C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

91160
Menetelmå modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi
Keksinto koskee muunnettuja fibrinolyyttisiå ainei-ta ja menetelmåå tållaisten fibrinolyyttisten aineiden val-mistarniseksi. Tarkemmin sanottuna keksinto koskee degly-kosyloituneita tai osittain deglykosyloituneita plasminogeenin kudosaktivaattoreita, yhdistelmåvektoreita, jotka sisåltåvåt tållaisia plasminogeenin kudosaktivaattoreita koodittavia DNA-sekvensseja, seka mainituilla yhdistelmå-vektoreilla transformoituja hiivaisåntosolu-ja. KeksintQ koskee myds menetelmiå mainittujen yhdistel-måvektorien, mainittujen transformoitujen isåntSsolu-jen ja mainittujen plasminogeenin kudosaktivaattorien valmistamiseksi .
Veritulpat ovat huomattava ihmisten sairauksien ja kuolleisuuden syy kehittyneissM maissa. Verihyytymat koos-tuvat fibriinista, joka syntyy liukoisesta prekursoris-taan fibrinogeenistS trombiinientsyymin vaikutuksesta.
Suuri joukko entsyymeja ja muita aineita pitaa huolen sii-ta, ettå verihyytymiS muodostuu normaalisti vain silloin ja siella, misså niitå tarvitaan verenhukan eståmiseen.
Nisåkkåiden plasma sisåltåa entsymaattisen systee-min, joka kykenee liuottamaan verihyytymien fibriinin.
Yksi tåmån fibrinolyyttisen systeemin komponentti on entsyymiryhmå nimeltåån plasminogeenin aktivaattorit, jotka muuntavat plasminogeenin (plasmiinin inaktiivinen pro-entsyymimuoto) proteolyyttiseksi plasmiinientsyymiksi.
Tåmån jålkeen plasmiini hajottaa hyytymån fibriiniver-kon niin, ettå muodostuu liukoisia tuotteita. Tapauk-sissa, joissa kehon trombolyyttinen teho ei riitå pois-tamaan laskimonsisåisiå tulppia, kuten esimerkiksi po-tilaille, jotka sairastavat tromboemboliaa tai leikkauk-senjålkeisiå komplikaatioita, saattaa olla vålttåmåton-tå tuoda kehoon ulkopuolelta trombolyyttisiå aineita.
Ihmisen kehon nesteistå ja soluista voidaan eris-tåå kahta plasminogeeninaktivaattorityyppiå, jotka ovat 2 seriiniproteaasi urokinaasi, iota cn esirærkiksi ihnisen virt-sassa ja munuaissoluissa, ja kudostyyppinen plasminocjeenin akti-vaattori- (kaytetaan lyhennetta "t-PA", engl. tissue plasminogen activator), jota esiintyy endo-teelisoluissa ja useissa endokriinisissa kudoksissa. Plasminogeenin kudosaktivaattori eroaa urokinaasista kemiallisten ja immunologisten ominaisuuksiensa puolesta ja edellisellå on paljon tehokkaampi fibrinolyyttinen vaikutus fibriinin låsnaollessa seka korkeampi affini-teetti fibriinin suhteen. t-PA esiintyy kahdessa molekyy-limuodossa, jotka ovat aktiivinen kaksiketjuinen muoto ja yksiketjuinen prekursorimuoto (josta usein kaytetaan lyhennetta "pro t-PA"). Yksiketjuinen muoto voidaan muun-taa kaksiketjuiseksi muodoksi inkuboimalla katalyyttisen plasmiinimaåran kanssa mielellaSn fibriinin låsnåollessa.
Ihmisen t-PA:ta koodittavan cDNA:n nukleotidisekvens-si on måaritetty ja sen perusteella on påMtelty amino-happosekvenssi (D. Pennica et al.. Nature 301, 214 (1983)). On tunnistettu nelja mahdollista N-glykosyloitumiskohtaa, joista yhta ei ilmeisesti kayteta hiilihydraatin liitta-miseen (G. Pohl et al., Biochemistry T3, 3701 (1984)).
Ihmisen t-PA:n låhteita ovat esimerkiksi uutteet ihmisen kudoksista (eivat sovellu kaupalliseen kayttoon) ja erilaiset ihmisen kasvainsolut, joiden on osoitettu va-pauttavan t-PA:ta eri måaria. Niinpa eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 41 766 selostetaan vil-jellysta ihmisen melanoomasolulinjasta eristettya t-PA:ta. Ihmisen t-PA:n tuottamisessa on myos kaytetty hyvaksi yh-distelma-DNA-teknologiaa. Ihmisen kasvainsoluista johdet-tu kaksisaikeinen t-PA cDNA on kloonattu ja ilmennetty kiinalaisen hamsterin munasarjan soluissa (CHO) ja E. colissa (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no.
93 619) tai hiivasoluissa (S. cerevisiae) (eurooppalaiset patenttihakemusjulkaisut no. 123 544 ja 143 081). Vil-jellyistå ihmisen melanoomasoluista ja transformoituneis-ta CHO-soluista saatu t-PA luultavasti vastaa autenttista t-PA glykoproteiinia. Transformoituneista hiivasoluista
II
3 91160 eristetysså t-PA:ssa on todennakoisesti hiivalle omi-naisia hiilihydraattiketjuja. Hiivojen ja korkeampien eukaryoottien hiilihydraattiketjujen eroista on olemas-sa paljon tietoja kirjallisuudessa ja ne liittyvat man-noositahteiden lisayksiin ulommissa ketjuissa ja ydin-hiilihydraattien muunnoksiin (ks. R. ja S. Kornfeld,
Ann. Rev. Biochem. 54^ 631 (1985); J.C. Byrd et al., J. Biol. Chem. 257, 14657 (1982); R.B. Trimble et al., J. Biol. Chem. 258, 2562 (1983)). E. colin ilmentama t-PA ei ole glykosyloitunut, mutta se on fibrinolyyttises-ti aktiivinen, vaikkakin sen ominaisaktiivisuus on melko pieni. Suurin osa proteiinista kertyy sytoplasmaan inak-tiivisessa muodossa johtuen luultavasti molekyylin vir-heellisesta laskostumisesta. Oikea laskostuminen riippuu useiden spesifisten disulfidisiltojen muodostumisesta t-PA-molekyylin sisSån, jotka sillat ovat oleellisia entsyymin aktiivisuudelle.
On osoitettu, etta t-PA:n hiilihydraattitåhteet voidaan hajottaa kemiallisesti hapettimilla, kuten nat-riumperjodaatilla (PCT-patenttihakemusjulkaisut no.
84/1786 ja 84/1960). Saadun t-PA-johdannaisen fysiologisen clearance-nopeuden eli puhdistumanopeuden sanotaan olevan pienempi kuin kasittelemattoman t-PA:n. Hiilihyd-raattiradikaalien kemiallisen hajoamisen rnaaraa, muun-netun t-PA:n ominaisaktiivisuutta ja hapettimen kemial-lista haittavaikutusta t-PA-ketjun herkkiin aminohappo-ryhmiin (on odotettavissa, etta perjodaatti vaikuttaa esi-merkiksi tryptofaaniryhmiin; ks. A.S. Inglis et al., FEBS Lett. 104, 115 (1979)) ei selosteta.
S.P. Little et al. (Biochemistry 23, 6191 (1984)) se-lostavat tunikamysiinin, joka on glykosyloitumisen inhi-biittori, vaikutusta t-PA:ta tuottaviin melanomasoluihin.
He havaitsivat, etta glykosyloituminen estyy 90 %:sesti. Samanaikaisesti myds proteiinisynteesi estyy 30 %:sesti, mikå osoittaa, etta tunikamysiini håiritsee solun elin-tårkeita prosesseja suoraan tai epasuorasti. Syntynyt t-PA-proteiini on sSilyttanyt fibrinolyyttisen aktiivi- 4 suutensa. Kuitenkin se, ettå låsnå on mahdollisesti tunikamysiinin jååmiå, joka siis on haitallinen gly-kosyloitumisen ;j_a proteiinibiosynteesin inhibiittori, våiståmåttå rajoittaa tåmån t-PA:n kåyttoå terapeuttise-na aineena. Sainassa julkaisussa selostetaan t-PA:n entsymaattista deglykosyloitumista endo-(3-N-asetyyli-glukoosiaminidaasi H:n (endo H) toimesta. Endo H-kå-sittely johtaa t-PA-lajien seokseen, joista jopa 85-90 % hiilihydraattitåhteistå on poistettu. Kuitenkin noin 50 % t-PA:sta oli tåysin vastustuskykyistå endo H-kåsittelylle. Tuotteen mainitaan såilyttåneen alkuperåisen t-PA:n fibriinin ohjaamat ominaisuudet.
Koska sellaisilla t-PA-molekyyleillå, joista puut-tuu osa tai kaikki hiilihydraattitåhteet, on oletettavas-ti edullisia ominaisuuksia, on olemassa tarve saada ai-kaan tållaisia yhdisteitå sekå menetelmiå, joilla voi-daan syntetisoida nåitå proteiineja edullisesti. Lukuun-ottamatta transformoituneista E. coli-soluista eristettyå tuotetta (joka kuitenkaan ei nåytå olevan kovin arvokas hoitotarkoituksia ajatellen, supra) ovat kirjallisuudessa kuvatut deglykosyloituneet t-PA-lajit kemiallisesti måårit-telemåttomiå molekyylejå ja esiintyvåt monimutkaisina seok-sina, jotka sisåltavåt lukuisan joukon yksittåisiå lajeja. Tåhån mennesså ei tunneta t-PA-lajia, josta yksi tai kaikki typpeen liittyneet hiilihydraattiketjut on kokonaan poistettu.
Koska kaikilla eukaryooteilla on sama geneettisen in-formaation ilmentåmisiuekanismi, saattaa eukaryoottisten geenien ilmentyminen tapahtua tehokkaammin eukaryoottises-sa isånnåsså kuin E. colissa. Kåytettåviksi sopivista eukaryoottisista organismeista hiiva on helpoin kåsitellå. Koska hiiva on mikro-organismi, hiivasoluja on helppo vil-jellå. Viljelynesteen tilavuusyksikkoå kohti saatavissa oleva solumassa on huomattavasti suurempi hiivalla kuin E. colilla ja vapaa endotoksiineista. Lisåksi hiivan fer-mentaatiokåyttåytyminen tunnetaan hyvin, samoin suuren mittakaavan fermentoinnit. Hiivan eritysmekanismi muis- li 5 91160 tuttaa korkeampien solujen, ihminen mukaanluettuna, eritysmekanismeja. Tiedetåån, etta hiivasolut kyke-nevat prosessoimaan omia proteiinejaan sekå vieraita proteiineja katkaisemalla vastaavat signaalisekvenssit. Lisåksi nåyttåå siltå, etta proteiinit, jotka joutuvat eukaryoottisen isånnån eritystiehen ja låpaisevat sen, muodostavat todennåkoisesti korkeampiasteisen tertiåå-risen rakenteen kuin sytoplasmassa syntetisoituvat proteiinit. Huomattakoon, etta prokaryooteilla, kuten E. colilla, ei nayta olevan suuria proteiineja, joilla oli-si pitkalle jårjeståytynyt rakenne.
Glykosyloitumissysteemi liittyy korkeampien organis-mien erittymistiehen. Oletettavasti glykosyloituneisuus-erot vaikuttavat proteiinien erotteluun. Niinpå hiivan karboksipeptidaasi Y, joka on yksinkertaisesti 13 mannoo-sitåhteellå ydinglykosyloitunut, siirtyy vakuoliin, kun taas hiivan invertaasi,jossa on n. 100 - 150 mannoositåh-teen muodostamia ulompia hiilihydraattiketjuja, låpåisee eritysvakuolit ja siirtyy periplasmiseen tilaan (L. Lehle et al., J. Biol. Chem. 254, 12209 (1979); C. Hashimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2244 (1981)). Nåin olien on selvåå, etta hiilihydraattiketjujen muuntaminen saattaa vaikuttaa t-PA:n erittymiskåyttåytymiseen.
Esilla oleva keksinto tarjoaa uusia ihmisen t-PA-proteiineja, joista puuttuu yksi tai useampi typpeen liit-tynyt hiilihydraattiketju, mutta jotka ovat såilyttåneet arvokkaat biologiset ominaisuudet, kuten fibrinolyyttisen aktiivisuuden, pienemmån fysiologien clearance- eli puh-distumanopeuden ja pitemmån in vivo-stabiilisuuden kuin vastaavasti luontaisella t-PA:lla on. Muita tåmån kek-sinndn kohteita ovat yhdistelmåvektorit, jotka sisåltåvat tållaisia t-PA-lajeja koodittavia DNA-sekvensseja sekå voimakkaan promoottorisysteemin, joka ohjaa mainittujen DNA-sekvenssien ilmentymistå tehokkaasti.
Esilla oleva keksinto tarjoaa uusia ihmisen mutantti-t-PA-proteiineja, joissa yksi tai useampi luontaisesti esiintyvistå N-glykosyloitumiskohdista on muutettu niin, 6 ettå glykosyloituminen ei voi tapahtua kyseisesså(isså) kohdassa(issa). Tama paåmaåra on saavutettu tarjoamalla tållaisia t-PA-proteiineja koodittavia DNA-sekvensseja, tållaisia DNA-sekvensseja sisaltåviå yhdistelmåvektoreita ja isåntåsoluja, jotka ovat transformoituneet tållaisilla yhdistelmåvektoreilla ja ilmentåvåt tållaisia t-PA-prote-iineja.
1. Sellaisen kypsån t-PA:n tuottaminen, josta puuttuu yksi tai useampia hiilihydraattiketjuja
On tunnettu tosiasia, ettå N-glykosyloitumisen edel-lytyksenå nisåkåssoluissa on tripeptidisekvenssin -Asn-L-Ser(tai Thr) esiintyminen, jossa Asn on vastaanottaja ja L voi olla mikå tahansa geneettisesti kooditetuista 20 aminohaposta lukuunottamatta proliinia ja asparagiinihappoa, jotka eståvåt glykosyloitumisen (ks. D.K. Struck ja W.J. Lannarz, The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, toim. W.J. Lannarz, Plenum Press 1980, s. 35; R.D. Marshall, Biochem. Soc. Symp. £0, 17 (1974)). t-PA-mole-kyylisså on neljå mahdollista paikkaa N-glykosidisidoksel- le (numerot viittaavat Asn:n asemaan t-PA:n aminohapposek- 117 venssisså, ks. liitteenå oleva kuva 1): -Asn -Ser-Ser-, 184 218 448
Asn -Gly-Ser-, Asn -Pro-Ser- ja Asn -Arg-Thr-. Koska 1 li 218 sekvenssisså Asn -Pro-Ser on låsnå Pro, Asn ei sovi hiilihydraatin liittåmiseen nisåkåssoluissa (G. Pohl et al., supra).
Jotta voitaisiin eståå glykosyloituminen yksittåisis-så N-glykosyloitumiskohdissa (yhdesså tai useammissa), on N-glykosyloitumissignaaleina tunnistetut tripeptidisekvens-sit muunnettu. Asn- ja/tai Ser-(tai Thr-)tåhteen korvaa-minen edellåmainituissa tripeptidisekvensseisså millå tahansa muulla aminohapolla, eståå glykosidisidoksen muodos-tumisen kyseiseen kohtaan. Kåytånnon syistå ei t-PA-mole-kyylin muuntamista eli N-glykosyloitumiskohtien muunta-mista suoriteta proteiinitasolla. Sen sijaan on edullista muuntaa t-PA:ta koodittavaa geeniå siten, ettå mainitun gee-nin ilmentyesså isånnåsså muodostuu mutantti-t-PA:ta, jos- 7 91160 sa yksi tai useampia luonnostaan esiintyvistå N-glykosy-loitumiskohdista on muuttunut siten, ettei glykosyloitu-minen voi tapahtua naissa kohdissa.
Tarkeminin sanottuna keksinto koskee yleisen kaavan 1’ mukaisia ihmisen t-PA-proteiineja
Ai“i16-Aen-Ser-Yi-Ai2o~i e a—Asn-Gly-Y2—Αχ37-217—Asn-Pro-Y3- Α2 2ΐ-ι,ι,7-Αβη-Α^-Υι,-Α%5ΐ-5 2 7 (I’) jossa kaavassa edustaa N-påån aminohapposekvenssia, joka kattaa kypsan t-PA:n aminohapot 1 - 116, A120-183 edustaa kypskn t-PA:n aminohapot 120 - 183 kattavaa aminohapposekvenssia, Ai87-217 edustaa kypsan t-PA:n aminohapot 187 - 217 kattavaa aminohapposekvenssia, A22l-447 edustaa kypsan t-PA:n aminohapot 221 - 447 kattavaa aminohapposekvenssia, A45i-527 edustaa C-påan aminohapposekvenssia, joka kattaa kypsan t-PA:n aminohapot 451 - 527, ja a) Yj on Ser, Y2 on geneettisesti kooditettu amino-happo, joka ei ole Ser eika Thr, ja Y4 on Thr, tai b) Y, ja Y2 ovat kumpikin Ser ja Y4 on geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eika Thr, tai c) Yi, ^2 Da Y4 ovat kukin toisistaan riippumatta geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eika Thr, yksi- tai kaksiketjuisessa muodossa.
Termi "kypsa t-PA" tarkoittaa sellaista t-PA:ta, jossa ei ole mitMån pre- tai prosekvenssia, ja joka al-kaa asemassa 1 olevalla seriinilla. Tassa yhteydessa viitataan liitteenå olevaan kuvaan 1, joka esittaå kypsan t-PA:n aminohapposekvenssia.
Seuraavat L-aminohapot ovat geneettisesti kooditettu ja: Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin,
Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro ja Gly.
Korvaavina aminohappoina asetetaan etusijaile sel-laiset, joilla on vastaavanlainen koko ja polaarisuus kuin kyseisella korvattavalla aminohapolla. Niiden mah- 8 dollisten ryhmien lukumååråå, joilla Asn-, Thr- ja/tai Ser-tåhde voidaan korvata, rajoittavat kyseiset nukleo-tidisekvenssit ja mahdolliset kodonit (ks. kohta 2).
Kaavan 1' mukaiset yhdisteet, joissa ainakin yksi alkuperaisen t-PA:n N-glykosyloitumiskohdista on såily-nyt, eli jossa esimerkiksi -Asn-Ser-Y^ on Asn-Ser-Ser ja/tai -Asn-Gly-Y2 on Asn-Gly-Ser ja/tai -Asn-Arg-Y^ on Asn-Arg-Thr, voivat glykosyloitua. Kaavan 1' mukaiset yhdisteet, joissa mikaån alkuperaisisen t-PA:n glykosyloi-tumiskohdista ei ole sailynyt, eivåt pysty N-glykosyloi-tumaan.
Keksinnonmukaisten t-PA-mutanttien yksiketjuinen muoto vastaa edellakuvattua kaavaa I'. Kaksiketjuinen 275 276 muoto saadaan katkaisemalla Arg Ile -peptidisidos (ks. kuva 1). Kyseisiå kahta ketjua pitåå kiinni toi-sissaan disulfidisilta. TassS keksinnossa kaytetty termi "t-PA" tarkoittaa, ellei toisin ole mainittu, yksiket juista muotoa, joka on taman keksinndn mukaisten t-PA-lajien edullinen muoto.
Kaavan 1' mukaiset yhdisteet on edullista valmistaa bioteknologisesti.
Keksinnonmukaisessa mutantti-t-PA-proteiinien val-mistusmenetelmasså viljellaan transformoitunutta euka-ryoottista isantaorganismia sopivissa ravinneolosuhteissa, joka transformoitunut isantåorganismi sisaltSa sellaista mutantti-t-PA-proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvista N-glykosyloitumiskohdista on muuttunut niin, ettei glykosyloitumis- 9 91160 ta voi tapahtua tåsså(nåisså) kohdassa(dissa), eristetåån mainittu mutantti-t-PA-proteiini.
Tåman keksinnon mukainen t-PA-geenin ilmentymisen paaasiallinen tuote on t-PA;n yksiketjuinen muoto. Jos kuitenkin isåntåsolussa tai kasvatusliuoksessa on lasna proteaaseja, voi ensisijaisesti ilmentynyt yksiketjuinen t-PA ainakin osittain muuttua kaksiketjuiseksi t-PA:ksi. Eristetty tuote voi nain olien koostua yksiketjuisesta mutantti-t-PA:sta, kaksiketjuisesta mutantti-t-PA:sta tai nåiden jonkinasteisesta seoksesta.
Sopivat eukaryoottiset isåntåorganismit ovat korke-ampien organismien soluja, erityisesti nisåkassoluja, ja edustavat erityisesti jotakin vakiintunutta ihmisen tai elåimen solulinjaa, kuten ihmisen Bowes-solulinjaa tai HeLa-soluja tai kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO) solulinjaa, hiivasoluja, kuten Saccharomyces cerevisiae-soluja. Tåman keksinnon mukainen edullinen isåntåorganis-mi on Saccharomyces cerevisiae.
Eukaryoottista isåntåorganismia, erityisesti hiivaa, joka sisåltåå edellåmainitun DNA-sekvenssin, viljellåån alalla tunnetuilla menetelmillå.
Niinpå keksinnonmukaisia transformoituneita hiiva-kantoja viljellåån nestemåisesså kasvualustassa, joka sisåltåå assimiloituvia hiili- ja typpilåhteitå sekå epåor-gaanisia suoloja.
Voidaan kåyttåå erilaisia hiililåhteitå. Edullisia hiililåhteitå ovat esimerkiksi assimiloituvat hiilihyd-raatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi, tai asetaatit, kuten natriumasetaatti, joita voidaan kåyttåå joko yksin tai seoksina. Sopivia typpilåhteitå ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, 10 peptoni tai lihauutteet, edelleen hiivauute, mallasuute, maissinliuotusvesi sekå ammoniumsuolat, kuten ammonium-kloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita typpilahteita voidaan kåyttåå joko yksin tai seoksina. Sopivia epaor-gaanisia suoloja ovat esimerkiksi sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit, joissa kationi voidaan valita natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin joukosta. Kasvualusta voi sisåltåå myos kasvua edistaviå aineita. Kasvua esitavia aineita ovat esimerkiksi hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms., ja yksittaiset amino-hapot.
Autonomisesti replikoituvilla plasmideilla, kuten hiivan 2μ-plasmidi-DNA:ta (infra) sisåltåvillå plasmideilla, transformoituneet hiivasolut ovat taipuvaisia menettamaan niihin tuodun yhdistelmåplasmidin. Tåstå syystå hiivasoluja pitaa kasvattaa selektiivisisså olo-suhteissa, so. olosuhteissa, jotka vaativat plasmidin koodittaman geenin ilmentymista kasvun tapahtumiseksi. Useimmat tållS hetkella kaytdssa olevat valintamerkit, jotka ovat låsnå tamån keksinnon mukaisissa yhdistelma-vektoreissa (infra), ovat aminohappo- tai puriinibiosyn-teesin entsyymeja koodittavia geeneja. Tama edellyttåa synteettisten minimialustojen kåyttoa, joista puuttuu vastaava aminohappo tai puriiniemas. Kuitenkin voidaan yhtå hyvin kayttaå geeneja, jotka antavat vastustusky-vyn sopivalle biosidille (esim. geenia, joka antaa vas-tustuskyvyn sykloheksimidille, aminoglykosidi G 418:Ile, raskasmetallille tms.). Antibioottiresistenssigeenin si-såltavSlla vektorilla transformoituneita hiivasoluja kas-vatetaan kompleksialustassa, joka sisåltåå vastaavaa an-tibioottia, jolloin saavutetaan suuremmat kasvunopeudet ja korkeammat solutiheydet.
Hiivasolut, jotka ovat transformoituneet kromoso-meihin integroituvalla DNArlla, eivåt vaadi selektiivisia kasvuolosuhteita. Nåin transformoituneet solut ovat riittåvån stabiileja kasvatettaviksi ilman valintapainet-ta. TMsta syystå nåitå soluja on edullista kasvattaa li '1 91160 monipuolisia ravinteita sisåltåvissa alustoissa.
Hiivasolut, joissa on konstitutiivisen promoottorin (esim. ADHI, GAPDH) sisaltava yhdistelmaplasmidi, ilmentå-våt mainittuun promoottoriin liitettyS t-PA:geenia ilman indusointia. Jos taas t-PA-geeni on såådellyn promootto-rin (esim. PGK tai PH05) ohjauksessa, pitåå kasvuliuoksen koostumus sovittaa niin, etta saadaan maksimimaårå mRNA-transkripteja, so. kåytettåesså PH05:tta pitåa kasvualus-tan sisaltaa epåorgaanista fosfaattia pienena pitoisuute-na, jotta tåmå promoottori kytkeytyy paaile.
Viljely suoritetaan tavanomaisia menetelmiS noudatta-en. Viljelyolosuhteet, kuten lampotila, alustan pH ja fer-mentointiaika valitaan siten, etta syntyy maksimaalinen mSåra t-PA:ta. Valittua hiivakantaa on edullista kasvat-taa aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmåna ravis-telemalla tai sekoittamalla vålilla noin 25 - 35°C ole-vassa lampotilassa, mielellaan noin 30°C:ssa, pH-alueella 4-8, esimerkiksi pH:ssa 7, noin 4-20 tuntia, mielellaan niin pitkaån, etta saadaan maksimaalinen proteiini-saanto.
Tuotettu t-PA-proteiini voi kertyå hiivasolujen si- saan tai erittya periplasmiseen tilaan tai kasvualustaan.
Jos t-PA-proteiini on kertynyt solujen sisaan, muodostuu t-PA-proteiinin talteenoton ensimmåinen vaihe proteiinin vapauttamisesta solun sisalta. Useimmissa menetelmissa soluseina poistetaan ensin suorittamalla entsymaattinen hajotus glukosidaaseilla (ks. kohta 4). Sitten nåin saa- dut sferoplastit kasitellåån pinta-aktiivisella aineella,
R
kuten Triton X-100:lla. Vaihtoehtoisesti voidaan solujen rikkomiseen kayttaå mekaanisia voimia, kuten leik-kausvoimaa (esim. X-puristin, ranskalainen puristin) tai ravistelua lasihelmien kanssa. Saatu seos rikastetaan mutantti-t-PA:n suhteen tavanomaisilla menetelmillå, kuten poistamalla suurin osa ei-proteiinimateriaalista polyetyleenrimiinikasittelylla, saostamalla proteiinit kayttåmållå ammoniumsulfaattia tai trikloorietikkahappoa, geelielektroforeesilla, dialyysilla, kromatografialla, 12 esimerkiksi ioninvaihtokromatografialla, syrjåytyskromato- grafialla, HPLC:lla tai kåånteisfaasi-HPLC:llå, erotte-
R
lulla molekyylikoon mukaan sopivassa Sephadex -pylvååsså, tms. Esipuhdistetun tuotteen lopullinen puhdistus voidaan suorittaa esimerkiksi affiniteettikromatografialla, kuten vasta-aineaffiniteettikromatografialla, erityisesti monoklonaalisilla t-PA:n vasta-aineilla, jotka on kiinni-tetty liukenemattomaan matriisiin, alan tavanomaisia mene-telmia noudattaen, tms.
Viela eråat edulliset menetelmåt mutantti-t-PA:n eriståmiseksi kasvuliuoksista sisaltåvat t-PA:n selektii-visen adsorboinnin affiniteetiltaan spesifiseen kåntaja-aineeseen, jossa liukoiset fibriinifragmentit on kovalent-tisesti kiinnitetty liukenemattomaan matriisiin, esimerkiksi dekstraaniin, tai erityisesti adsorboimalla DE-3-£
Sepharose :een. DE-3 on trypsiinin inhibiittori, jota palkokasvin Erythrina latissima siemenet sisaltåvat (eurocppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 112 122).
On havaittu, ettå DE-3 kykenee eståmåån myds t-PA-aktiivi-suuden. Nåin olien puhdistettu DE-3-inhibiittori voidaan liittåå liukenemattomaan matriisiin, esim. BrCNtllå
R
aktivoituun Sepharose :een, tavanomaisilla menetelmillå. t-PA-proteiinit adsorboituvat inhibiittorimatriisiin ja ne voidaan sen jålkeen eluoida puskurilla, joka sisåltåå kaotrooppista ainetta.
Tåmån keksinndn edullisessa toteutustavassa kasvu-alusta, jolle mahdollisesti on ensin suoritettu yksi tai useampia edellåmainituista puhdistusvaiheista, lasketaan huoneenlåmpotilassa BrCNtllå aktivoidun Sepharose -pylvåån låpi, johon on kiinnitetty DE-3-inhibiittoria, tai suori-tetaan panoskåsittely vastaavasti. Sen jålkeen Sepharo-se -kantaja-aine peståån ja adsorboitunut plasminogeenin kudosaktivaattori eluoidaan puskuriliuoksella, esimerkiksi fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suo-laliuoksella, jonka pH on noin 5,5 - 6,0, ja joka sisåltåå kaotrooppista ainetta, kuten NH^SCN, vålillå noin 1,0 -noin 2,0 M, mielellåån 1,2 M pitoisuutena. Vaihtoehtoi-
II
,, 91160 sesti voidaan vapauttavana aineena kåyttåå bentsamidiinia tai arginiinia. Puhdistusvaiheissa kåytettyihin pusku- riliuoksiin on edullista lisata pinta-aktiivista ainetta,
erityisesti ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, kuten R R
Triton X-100 tai Tween 80 , jotta plasminogeenin kudosaktivaattorin adsorptio astian pintoihin saa- daan estetyksi ja sen stabiilisuutta.saadaan parannetuksi. Pinta-aktiivista ainetta voidaan lisata lopulliseen pitoi-suuteen 0,01 - 0,1%.
Jos hiivasolu erittåå plasminogeenin kudosaktivaattorin periplasmiseen tilaan, voidaan kayttaa yksinkertais-tettua menettelytapaa: Proteiini otetaan talteen ilman so lun lyysia suorittamalla solunseinån entsymaattinen pois-to tai kasittelemålla kemiallisilla aineilla, esimerkiksi tiolireagensseilla tai EDTArlla, jotka vahingoittavat so-lunseinåa niin, ettå tuotettu mutantti-t-PA vapautuu. Jos mutantti-t-PA erittyy kasvualustaan, se voidaan ottaa suoraan talteen siita.
Sellaisten hiivasolujen viljely, joissa on kromoso-miin integroitunut t-PA-geeni, seka ilmentyneen t-PA:n eriståminen ja puhdistus suoritetaan edellåkuvatulla ta-valla.
Kun kåytetåMn keksinnonmukaisia edullisia hiivakan-toja, nimittåin hiivakantoja, joissa ei ole proteaaseja, on eristetty mutantti-t-PA useimmiten yksiketjuisessa muo-dossa. Kun kåytetaan hiivakantoja, joilla on proteolyyt-tista aktiivisuutta, saadaan seoksia, joissa on vaihtele-via maaria mutantti-t-PA:n yksiketjuista ja kaksiketjuista muotoa.
Jotta saataisiin valmistetuksi yksiketjuisesta muo- dosta oleellisesti ottaen vapaa mutantti-t-PA:n kaksiket- juinen muoto, muunnetaan yksiketjuinen muoto entsymaat- 275 tisesti kaksiketjuiseksi muodoksi katkaisemalla Arg 1
Ile -peptidisidos esimerkiksi plasmiinilla tai jollakin entsyymillå, jolla on vastaava vaikutus t-PA:n yksiketjui-seen muotoon.
Mutantti-t-PA:n yksiketjuinen muoto, joka on oleel- 14 lisesti ottaen vapaa kaksiketjuisesta muodosta, on edul-lista valmistaa proteaasien inhibiittorin, kuten apro-tiniinin (Trasylol ) tai haiman emaksisen trypsiinin inhibiittorin, låsnåollessa siten, etta se sisållytetåån puhdistusvaiheisiin inhiboimaan proteaasijååmiå, joita saattaa olla lasna, ja jotka saattavat aiheuttaa yksi-ketjuisen muodon (osittaisen) muuttumisen kaksiketjui-seksi muodoksi. Lopullinen puhdistus suoritetaan ta-man jalkeen kromatografisesti pylvååssa, joka sisaltaa selektiivista affiniteettireagenssia, kuten DE-3:ta.
Keksinndnmukaiset transformoituneet isåntaorganis-mit voidaan valmistaa yhdistelmå-DNA-tekniikalla seuraa-vien vaiheiden avulla: valmistetaan keksinnonmukaista mutantti-t-PA-proteii-nia koodittava rakennegeeni, sisallytetåån nåin saatu rakennegeeni sopivaan vek-toriin, transformoidaan sopiva isåntaorganismi nSin saadulla yhdistelmavektorilla ja erotellaan transformointuneet isantakannat transformoi-tumattomien joukosta.
2. Sellaisia mutantti-t-PA-proteiineja koodittavat DNA-sekvenssit, joista puuttuu vahintåån yksi typpeen sitou-tuneista hiilihydraattiketjuista
Keksinto koskee myos DNA:ta, joka sisaltaa sellaista ihmisen mutantti-t-PA:ta koodittavan sekvenssin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvista N-glykosyloitu-miskohdista on muunnettu siten, ettS glykosyloituminen ei voi tapahtua kyseisessa(isså) kohdassa(issa).
Tarkemmin sanottuna keksintå koskee DNA:ta, jossa on mutantti-t-PA-proteiinia koodittava sekvenssi, ja jolle on tunnusomaista se, ettå yksi t-PA-proteiinin N-glykosy-loitumiselle oleellista aminohappoa koodittava kodoni on korvattu toisella kodonilla, joka koodittaa sellaista eri-laista aminohappoa, joka ei muodosta N-glykosyloitumisen 15 91160 tunnistuskohtaa.
Tarkemmin sanottuna keksinto koskee DNA:ta, jolla on DNA-sekvenssi, joka koodittaa modifioitua ihmisen t-PA-proteiinia, jonka aminohapposekvenssi on
Ai.ii6“Asn-Ser-Yj-A120.183-Asn-Gly-Y2-A187_217-Asn-Pro-Ser- A22i-»47-Asn~Arg-Y4-A4s1.j27 (11) jossa A,.116 edustaa N-påån aminohapposekvenssiå, joka kat-taa kypsån t-PA:n aminohapot 1 - 116, A,edustaa kyp-sån t-PA:n aminohapot 120 - 183 kattavaa aminohapposekvenssiå, A187.2n edustaa kypsån t-PA:n aminohapot 187 - 217 kattavaa aminohapposekvenssiå, A^,^ edustaa kypsån t-PA:n aminohapot 221 - 447 kattavaa aminohapposekvenssiå, A431.S27 edustaa C-påån aminohapposekvenssiå, joka kattaa kypsån t-PA:n aminohapot 451 - 527, ja a) Yj on Ser, Y2 on geneettisesti kooditettu amino-happo, joka ei ole Ser eikå Thr, ja Y4 on Thr, tai b) Y, ja Y2 on kumpikin Ser ja Y4 on geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eikå Thr, tai c) Yj, Y2 ja Y4 ovat kukin toisistaan riippumatta geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eikå Thr, joka t-PA-proteiini on yksi- tai kaksiketjuisessa muodossa.
Ihmisen kypsåå t-PA:ta koodittava geeni on enneståån tunnettu ja se voidaan johtaa mistå tahansa ihmisen so-lusta, joka kykenee tuottamaan t-PA:ta. Tållaiset solut ovat syopåperåisiå tai ei-syopåperåisiå ja mielellåån ne ovat vakiintuneesta solulinjasta johdettuja. Tåmån kek-sinnon edullisessa toteutustavassa geeni on johdettu HeLa-soluista. Tåsså yhteydesså viitataan liitteenå ole-vaan kuvaan 1, jossa on esitetty HeLa-soluissa esiintyvån kypsån t-PA:n DNA-sekvenssi, joka alkaa ensimmåistå ami- 16 nohappoa Ser koodittavalla TCT-kodonilla, ja jossa on myos esitetty deoksiribonukleotidien numerointi.
Etusijalle asetetaan sellaiset keksinnon mukaiset DNA-sekvenssit, jotka koodittavat edella erityisen edul-lisiksi mainittuja mutantti-t-PA-proteiineja.
DNA:t, joilla on keksinnon mukainen sekvenssi, voi-daan valmistaa alalia tunnetuilla menetelmillå. Tahan sopivia DNA:n valmistusmenetelmia ovat mm. DNA:n kemial-linen syntetisointi, se, etta kypsån t-PA:n perusgeenistå leikataan pois ei-toivotun aminohappotahteen kodonin si-saltavå DNA-jakso ja korvataan se DNA-segmentilia, jossa mainittu kodoni on korvattu haluttua aminohappotahdetta koodittavalla deoksiribonukleotiditripletillå, tai se, etta deoksiribonukleotidi korvataan toisella suorittamal-la paikkaan ohjattu mutatointi.
DNA:n kemiallinen syntetisointi tunnetaan alalia hyvin ja siinå kaytetaSn tavanomaisia menetelmia. Sopivia menetelmia on selotettu julkaisussa S.A. Narang, Tetra-hedoron 39, 3 (1983). Erityisen sopivia ovat euroop-palaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 146 785 kuvatut menetelmåt, jotka sisallytetåån tahan viitteeksi.
Osan leikkaaminen pois kypsåsta t-PA:sta voidaan
II
17 91160 suorittaa restriktioentsyymeillå. Taman menetelmån edel-lytyksenå on sopivien restriktiokohtien tarjollaolo muun-nettavan kodonin låheisyydesså. Pieni restriktiofragment-ti, joka sisåltåå ei-toivotun aminohapon, poistetaan endo-nukleaasikatkaisulla. Valmistetaan vastaava kaksisåikei-nen DNA-sekvenssi, esimerkiksi kemiallisen synteesin avul-Xa, kayttamalla halutun aminohapon triplettejå. Saatu DNA-fragmentti liitetaan oikeassa suunnassa jåljelle jåå-neeseen suureen fragmenttiin niin, ettå saadaan mutantti-t-PA:ta koodittava kaksisåikeinen DNA-sekvenssi. Muka-vuussyista ja t-PA-geenin kåsittelyn helpottamiseksi se on mielellåan sisallytetty suurempaan sopivilla kytki-joillå varustettuun DNA-jaksoon, jotka kytkijåt mahdollis-tavat mainitun jakson sijoittamisen kloonausvektoriin ja kloonaamisen siina.
Tamån keksinnon edullisessa toteutustavassa valmistetaan DNA:t, joilla on keksinnon mukainen sekvenssi, paik-kaan ohjatulla mutatoinnilla. Tåmå on in vitro-mutatointi-menetelmM, jossa tietty kohta kloonatun DNA:n alueella voi-daan muuttaa (ks. yleiskatsausartikkelit M.J. Zoller ja M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983) ; D. Botstein ja D. Shortle, Science 2^9, 1193 (1985)).
Normaalin t-PA-geenin mutatointimenetelmalle on tunnusomaista se, etta yksisaikeinen normaali t-PA- geeni tai yksisaikeinen DNA, joka sisåltåå normaalin t-PA-geenin, hybridisoidaan oligodeoksiribonukleotidialuk-keeseen, joka on komplementaarinen t-PA-geenin mutatoitavan alueen kanssa lukuunottamatta sitå(hiitå) yhteensopimaton-ta(mattomia) kohtaa(ia), joka(tka) ohjaa(vat) mutatoitu-mista, ja hybridisoitunutta oligodeoksiribonukleotidia kåy-tetåån alukkeena saattamaan alulle komplementaarisen DNA-såikeen synteesi, vastaanottajamikro-organismikanta trans-formoidaan saadulla (osittain) kaksisåikeisellå DNA:11a, mikro-organismikantaa viljellåån ja valitaan transformantit, joissa on muuntuneen t-PA-geenin sisåltåvå DNA.
Normaali t-PA-geeni sisåltyy mielellåan plas- midiin, esimerkiksi eurooppalaisessa patenttihakemusjulkai- 1 δ sussa no. 143 081 kuvattuun plasmidiin. Mutatointia vårten t-PA-geeni on edullista eristaS plasmidista, esi-itierkiksi restriktioendonukleaasikatkaisulla, jotta saa-daan kaksisSikeinen DNA, joka sisåltaå t-PA-geenin ja mahdollisia muita siihen liitettyja funktioita, kuten promoottorin, signaalipeptidin jne., ja jolla on porrastetut pååt, ja tamå DNA-jakso liitetaan yksisaikeisen DNA-faagin replikoituvan muodon (RF) kuten M13-faagin johdannaisen, esim. M13mp8 tai M13mp9, sopivaan restriktiofragmenttiin. Transfektointikelpoinen mikro-organismi, esimerkiksi Ca:lla kåsitellyt E. coli-kannan solut, transfketoidaan yhdistelmåfaagivektorilla ja yksisaikeinen faagi-DNA, joka sisåltåa liitetyn t-PA-geenin eristetaan viljeltyjen solujen emaliuoksesta. Yhteensopimattoman(mia) kohdan(tia) sisaltåva (mutageeni-nen) oligodeoksiribonukleotidialuke hybridisoidaan tahån templaattiin.
Eråissa kirjallisuudessa kuvatuissa menetelmissM mutatoivaa aluketta gatketaan entsymaattisesti rengas-maista templaattia pitkin ja sen jålkeen suoritetaan yh-teenliittaminen niin, ettå saadaan kovalenttisesti sul-jettu kaksisaikeinen rengasmainen molekyyli, jossa on mutaatio(t) vastasyntetisoidussa saikeessa. Koska tama menetelma on yleensa teholtaan pieni, on sille kehitetty muunnos (K. Norris et al., Nucl. Acids. Res. Vl_, 5103 (1983)), jossa kaytetaan toista aluketta. M13rfaa- givektorin tapauksessa kaytetaSn ir.ielellaan universaalis-ta M13-sekvenssointialuketta.
Nain olien fosforyloitu mutatointialuke ja M13-sek-venssointialuke emaspariutetaan samanaikaisesti yksisSi-keisen rengasmaisen t-PA-templaatti-DNA:n kanssa. Emas-pariutuminen tapahtuu nopeasti pitåmalla 55°C:ssa 5 mi-nuuttia ja huoneenlampotilassa 5 minuuttia. Edullinen moolisuhde aluke:templaatti on noin 20:1. Kuramankin aluk-keen jatkaminen suoritetaan E. coli DNA-polymeraasilla (Klenow-jakso). Sekvenssointialukkeesta vasta syntetisoi-tu DNA liitetaan mutatointialukkeen fosforyloituun 5'-paa-
II
91160 1 9 han T4 DNA-ligaasilla. Talla tavalla saadaan osittain kaksisaikeisiå molekyylejå, joissa on haluttu(tut) yh-teensopimaton(tomat) kohta(dat).
Mutatointialuke ja M13-sekvenssointialuke voidaan syntetisoida kemiallisesti (supra). Jotta DNA-synteesin alkuunsaattaminen olisi riittavå huoneenlampotilassa ja sen ylåpuolella, on edullista kayttaa oligodeoksiribo-nukleotideja, joiden pituus on alueella noin 14-22 nukleotidia. Lisåksi tallaiset oligodeoksiribonukleoti-dit tunnistavat ainoat kohdekohtansa todennåkoisemmin. Erityisesti yhden yhteensopimattoman kohdan sisaltavien oligodeoksinukleotidien pituus on alueella 14 - 18 nuk leotidia, kun taas kaksi yhteensopimatonta kohtaa sisaltavien oligodeoksinukleotidien pituus on alueella noin 17-30 nukleotidia. Mutatointialukkeet on suunni-teltu siten, etta yhteensopimaton(tomat) kohta(dat) on (ovat) lahellM molekyylin keskikohtaa. Talloin saadaan aikaan suurin sitoutumisero tarkalleen yhteensopivan kahdenteen ja yhteensopimattoman kahdenteen valille (infra).
Esillå olevan keksinnon edullisessa toteutustavassa sisaltåvat mutageeniset oligodeoksiribonukleotidit tripletteja, joissa on yksi tai kaksi yhteensopimatonta nukleotidia, ja jotka nain olien koodittavat glykosyloitumisen estavia aminohappotahteitå,·jotka on edellå kuvattu erittåin edullisiksi.
Halutun(ut) yhteensopimattoman(at) nukleotidin(t) sisåltavalla osittain kaksisaikeisella DNA:lla voidaan suoraan transfektoida vastaanottajamikro-organismi, erityisesti E. coli-kanta. DNArlla suoritettu transfek-tio johtaa faagiseokseen, jonka faageissa on vastaavasti normaali t-PA-geeni ja mutatoitunut t-PA-geeni.
SyntyneistS plakeista seulotaan esiin mutatoituneen t-PA-geenin sisåltSvM faagi-DNA.
Ns. dot-blot-hybridisaatio (ks. M.J. Zoller ja M.
Smith, supra) on edullinen menetelma mutatoituneen t-PA-geenin sisaltavan faagi-DNA:n valintaan seoksesta, jossa 20 on normaalin t-PA-geenin sisaltaviå faageja ja mutatoituneen t-PA-geenin sisaltavia faageja. Tama menetelma perustuu siihen låmpostabiilisuuseroon, joka on tarkoin yhteensopivan DNA-kahdenteen ja yhden tai useampia yhteensopimattomia kohtia sisaltåvån DNA-kahdenteen vålilla. Yksisaikeinen faagi-DNA immobilisoidaan kiinteaan kantaja-aineeseen, kuten suodatinpaperiin tai nitroselluloosalevyyn, kuumentamalla uunissa korotetussa låmpotilassa, esim. 80°C:ssa, ja hybridisoidaan "^P:lla leimatun mutatointioligodeoksiribonukleotidialukkeen (supra) kanssa. Matalassa lampotilassa seka mutantti-t-PA-DNA ettå normaali t-PA-DNA muodostavat kah- denteen. Taman jalkeen suoritetaan pesut kohoavissa lampotiloissa (kohoamisvåli esim. 10°C), jolloin aluke dissosioituu selektiivisesti normaalista t-PA-DNA:sta ja lopuksi vain taysin yhteensopivat mutanttimolekyylit jaavåt hybridisoituneiksi. Mutanttimolekyylit tunniste-taan autoradiografialla. Tarvittava lopullinen ISmpotila voidaan laskea teoreettisesti. Mielellåan valitaan lampotila, joka ylittaa sulamislampotilan TQ (alukkeen 50 %:nen dissosioituminen) 4 - 8°C:lla. Lampotila TQ las-ketaan lisaamallS 2° jokaista ΑΤ-emåsparia kohti ja 4° jokaista GC-emasparia kohti, jotka sisåltyvat taydelli-sesti emaspariutuneeseen oligodeoksiribonukleotidialukkeen ja mutatoituneen t-PA-geenin våliseen kahdenteeseen.
Puhtaita mutanttifaageja saadaan uudelleentransfek- toimalla vastaanottajamikro-organismikanta, kuten E. coli- kanta, tunnistetuilla primaarisilla mutanttifaageilla ja seulomalla faagi-DNA-plakit uudestaan mutatoituneen t-PA- geenin sisåltavien suhteen dot-blot-hybridisaatiolla kayt- tåmalla edellamainittua mutatointioligodeoksiribonukleo-32 tidialuketta ( P-leimattu).
Mutatoitunut t-PA-geeni leikataan irti faagin repli-koituvasta muodosta sopivien restriktioendonukleaasien avul-la ja kåytetaån yhdistelmåvektoriin kloonaamiseen.
ii 21 91160 3. Mutantti-t-PA-proteiineja koodittavia DNA-sekvensse-ja sisaltåvat yhdistelmavektorit
Esillå oleva keksinto koskee myos yhdistelmavekto-reita, jotka sisaltåvat promoottorin ja sellaista ihmisen mutantti-t-PArta koodittavan DNA-sekvenssin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvå N-glykosyloitumiskohta on muunnettu niin, ettei glykosyloituminen voi tapahtua tåsså(nåisså) kohdassa(issa), ja kyseinen DNA-sekvenssi on mainitun promoottorin transkriptionaalisessa ohjauk-sessa.
Keksinnonmukainen yhdistelmåvektori voi olla yhdis-telmåplasmidi tai lineaarinen DNA-vektori ja sen valinta voidaan tehdå pitåen lisåksi silmållå transformoitavaa isåntåorganismia.
Nisåkåssoluissa kåytettåviksi soveltuvia promootto-reita ovat esimerkiksi viruspromoottorit, kuten HTLV-, SV40- ja vaccinia-promoottori tms.
Hiivan, joka on edullinen isantåorganismi tåsså kek-sinn6sså kåytettåvåksi, promoottorit johdetaan hiivan, eri-tyisesti Saccharomyces cerevisiaen, perimån DNAista. Voi-makkaasti ilmentyvån hiivageenin promoottoria on edullis-ta kåyttåå mutantti-t-PA:n ilmentåmiseen. Niinpå voidaan kåyttåå TRP1-geenin, ADHI-geenin, ADHII-geenin, happofos-fataasigeenin (PH05) tai isosytokromi c-geenin promotto-ria, glykolyyttistå entsyymiå koodittavan geenin promoottoria, kuten enolaasin, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydroge-naasin (GAPDH), 3-fosfoglyseraattikinaasin (PGK), heksoki-naasin, pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofruktokinaasin, glukoosi-6-fos faatti-isomeraasin, 3-fosfoglyseraattimutaa-sin, pyruvaattikinaasin, trioosifosfaatti-isomeraasin, fos-foglukoosi-isomeraasin, invertaasin tai glukcSc inaasin promoottoria, tai a- tai α-tekijåå koodittavan hiivan parit-teluferomonigeenin promoottoria. Tåmån keksinnon mukaiset edulliset vektorit sisåltåvåt promoottorin, jolla on trans-kriptiota sååtelevå vaikutus. Tåmåntyyppiset promoottorit, esimerkiksi PH05-geenin promoottori, voidaan kytkeå påålle tai pois pååltå kasvuolosuhteita muuttamalla. Esimerkiksi 22 PH05-promoottori voidaan kytkea pois paalta ja kytkea paålle tarpeen mukaan vain nostamalla tai laskemalla kasvualustan sisåltåmaS epåorgaanisen fosfaatin pitoi-suutta. Niinpå promoottori voidaan kytkea pois paalta hiivan eksponentiaalisen kasvuvaiheen ajaksi ja kytkea påalle vain stationåarivaiheen ajaksi solutihey-den ollessa suuriminillaan niin, ettå PH05-promoottorin kontrolloima geeni ilmentyy talloin. Tåma ominaisuus yh-distettyna korkeaan transkriptiotasoon tekee PH05-pro-moottorista edullisen tåssa keksinnossa kåytettavaksi.
Taman keksinnon mukaisissa yhdistelmavektoreissa on promoottori liitetty toimivasti mutantti-t-PA:ta koodit-tavaan alueeseen, jotta saavutettaisiin mahdollisimman tehokas mutantti-t-PA:n ilmentyminen. Erååssa taman keksinnon edullisessa toteutustavassa promoottori on valit-tdmasti liitetty kypsåa t-PA:ta koodittavaa alueeseen niin, etta luennanaloitussignaali (ATG) on liitoskohdassa. Toi-sessa tSmMn keksinnon edullisessa toteutustavassa, eri-tyisesti, jos kaytetaån hiivaa, rakenteeseen sisallyte-tåan signaalisekvenssi. Sopivia signaalisekvensseja ovat kaytettyyn promoottoriin luontaisesti liittyvat, erityi-sesti PH05:n tai invertaasin signaalisekvenssi, tai t-PA:n signaalisekvenssi. Voidaan myos kayttaa muita signaalisekvensse ja, kuten hiivan invertaasigeenin tai a-tekijån geenin signaalisekvenssia. Vaihtoehtoisesti voidaan kayt-tåa yhteenliitettyja signaalisekvensseja, joissa osa kaytettyyn promoottoriin luontaisesti liittyvan geenin sig-naalisekvenssista on liitetty osaan t-PA:n signaalisekvens-sistå. Sellaiset yhdistelmat asetetaan etusijalle, jotka sallivat tarkan katkeamisen signaalisekvenssin ja kypsan t-PA:n aminohapposekvenssin valista. Prekursorimolekyy-lien tarkkaa prosessointia helpottamaan voidaan rakentei-siin sisållyttåM myos lisasekvenssejS, kuten pro- tai spacer-sekvensseja, jotka saattavat sisåltMa spesifisia prosessointisignaaleja tai eivåt. Vaihtoehtoisesti voidaan saada aikaan yhdistelmåproteiineja, jotka sisaltavat sisåisia prosessointisignaaleja, jotka mahdollistavat 23 91160 oikean kypsymisen in vivo tai in vitro. Prosessointi-signaalit sisaltavat mielellaan Lys-Arg-tåhteen, jonka Golgin kalvoissa sijaitseva hiivan endopeptidaasi tun-nistaa. Mutantti-t-PA-geenin ilmentymisen jålkeen gee-nituote joutuu erittymistiehen ja siirtyy periplasmiseen tilaan. Jos voidaan saada aikaan kulkeutuminen solu-seinan låpi kasvualustaan, pitaisi olla saavutettavis-sa huomattavat saantojen kohoamiset. Myos talteenotto-prosessi yksinkertaistuu, jos soluja ei tarvitse rikkoa.
Taman keksinnon mukaiset yhdistelmavektorit sisal-tåvåt mielellaan myos geenin 31-reunasekvenssin, jossa on oikeat singaalit transkription lopettamiselle ja po-lyadenyloitumiselle. Sopivia 3'-reunasekvensseja ovat esimerkiksi promoottoriin luonnostaan liittyvan geenin vastaavat sekvenssit ja hiivan tapauksessa erityisesti PH05-geenin reunasekvenssit.
Keksinto koskee erityisesti lineaarista DNA-vekto-ria, joka sisåltåa sellaista ihmisen mutantti-t-PA-pro-teiinia koodittavan DNA-sekvenssin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvista N-glykosyloitumiskohdista on muunnettu niin, ettei glykosyloituminen voi tapahtua tassa(nåissa) kohdassa(dissa), seka mahdollisesti signaa-lisekvenssin, ja tåmån DNA-sekvenssin reunoissa on kro-mosomaalisessa geenissa luonnostaan esiintyvåt sekvenssit, kuten 5'-paassa isannan kromosomaalisen geenin promoot-torialue ja 3'-paassa mainitun geenin 3'-reuna-alue (tai sen osa). Erityisesti keksinto koskee lineaarista DNA: ta, joka sisåltåa hiivan PH05-promoottorin, mutantti-t-PA-alueen ja PH05:n 3'-reuna-alueen.
Homologisten 3'- ja 5'-reuna-alueiden ansiosta mu-tantti-t-PA-geenin sisåltåvå koko lineaarinen DNA-vektori integroituu stabiilisti vastaavaan isåntåkromosomiin eli hiivan PH05-promoottorin ja hiivan PH05-geenin 3'-reunasekvenssien ollessa kyseesså hiivan kromosomi II:n PH05-lokukseen.
Keksinto koskee myos erityisesti rengasmaisia yh-distelmåplasmideja, jotka promoottorin, DNA-sekvenssin, 24 joka koodittaa sellaista ihmisen mutantti-t-PA-proteiinia, josta yksi tai useampi luonnostaan esiintyva N-glykosy-loitumiskohta on muunnettu siten, ettei glykosyloitumis-ta voi tapahtua tåsså(nåisså) kohdassa(issa), ja mahdol-lisesti signaalisekvenssiå, ja 3'-reunasekvenssien lisåk-si sisaltaa liså-DNA-sekvenssin(ejå), jotka eivåt ole valttåmattoraia tai ovat våhemmån tarkeita promottorin toiminnalle eli muunnettua t-PA:ta koodittavan alueen il-mentymiselle, mutta jotka suorittavat tarkeita toimintoja esimerkiksi mainituilla yhdistelmåplasmideilla transfor-moituneiden solujen lisååntymisesså. Liså-DNA-sekvens-si(t) voi(vat) olla johdettu(ja) prokaryoottisista ja/tai eukaryoottisista soluista ja se(ne) voi(vat) sisåltåå kromosomaalisia ja/tai ekstrakromosomaalisia sekvensseja. Liså-DNA-sekvenssit voivat olla peraisin (tai koostua) plasmidi-DNA:sta, kuten bakteeriperåisestå tai eukaryoot-tisesta plasmidi-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromoso-maalisesta DNA:sta, kuten bakteerin, hiivan tai korkeam-man eukaryootin kromosomaalisesta DNA:sta. Etusijaile asetettavat yhdistelmaplasmidit sisåltavat bakteeriplas-mideista, erityisesti Escherichia colin plasmidista pBR 322 tai sen sukulaisplasmideista, bakteriofaagista λ, hiivan 2y-plasmidista ja/tai hiivan kromosomaalisesta DNA:sta johdettuja liså-DNA-sekvensseja.
Tåman keksinnon mukaisissa edullisissa yhdistelma-plasmideissa sisaltavat lisS-DNA-sekvenssit hiivan repli-koitumisen aloituskohdan ja selektiivisen geneettisen merkin hiivaa vårten. Yhdistelmaplasmidit, jotka sisåltavat hiivan replikoitumisen aloituskohdan, esim. autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), pysyvåt yllå hiivasolussa kromosomin ulkopuolella transformoitumisen jålkeen ja replikoituvat autonomisesti mitoosissa. Yhtå hyvin voidaan kayttaå yhdistelmåplasmideja, jotka sisåltå-våt hiivan 2u-plasmidi-DNA:n kanssa homologisia sekvensse ja. Nåmå yhdistelmåplasmidit integroituvat rekombinoi- tumalla solussa jo låsnå oleviin 2y-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. 2y-sekvenssit sopivat erityisen 25 91160 hyvin korkealla frekvenssilla transformoiviin plasmi-deihin ja saavat aikaan suuria kopiomaariå.
Lisaksi keksinnonmukaiset edulliset yhdistelmåplas-midit saattavat sisåltåå DNA-sekvenssin, joka on osa hiivan kromosomin geenista (esim. PH05-geenistå tai sen promoottorista liittyneenå mutantti-t-PA:ta kooditta-vaan alueeseen). Homologisen sekvenssin ansiosta, jonka pitåisi olla pituudeltaan noin 20 - 100 deoksinukleoti-dia, koko plasmidi tai sen osat saattavat sijoittua rekom-binaation avulla stabiilisti isånnån kromosomiin. Nain jålkelåissolut såilyttåvåt nåin tuodun materiaalin lisåån-tymisen aikana jopa ilman valintapainetta.
Mi tå tulee hiivan valintamerkkiin, voidaan sellaise-na kåyttåå mitå tahansa merkkigeeniå, joka mahdollistaa transformanttien valinnan merkin fenotyyppisen ilmentymi-sen perusteella. Hiivalle erityisen sopivia valintamerk-kejå ovat sellaiset, jotka ilmentåvat antibioottiresis-tenssiå tai auksotrofisten mutanttien ollessa kyseesså geeneja, jotka tåydentåvåt isånnan puutteellisuuk9ia. Tållaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn syk-loheksimidiantibiootin suhteen tai prototrofian auksotro-fiselle hiivamutantille, kuten URA3-, LEU2-, HIS3- tai TRP1-geeni. On myos mahdollista kåyttåå merkkeinå raken-negeenejå, jotka liittyvåt autonomisesti replikoituvaan segmenttiin, edellyttåen, ettå transformoitava isåntå on auksotrofinen merkin ilmentåmån tuotteen suhteen.
On edullista, jos keksinnonmukaisissa DNA-sekvens-seisså låsnå olevat liså-DNA-sekvenssit sisåltåvåt mybs replikoitumisen aloituskohdan ja geneettisen valintamer-kin bakteeri-isåntåå, erityisesti Escherichia colia vårten. On olemassa hyodyllisiå seikkoja, jotka liittyvåt E. colin replikoitumisen aloituskohdan ja E. colin merkin låsnåoloon hiivan yhdistelmåplasmidissa. Ensinnåkin voidaan saada aikaan suuria mååriå yhdistelmåplasmidi-DNA:ta kasvattamalla ja lisååmållå E. colissa ja toiseksi, yhdis-telmåplasmidien rakentaminea on edullista suorittaa E. colissa kåyttåmållå hyvåksi koko E. coliin perustuvaa kloo- 26 nausteknologiaa. E. colin plasmideja, kuten pBR322 tms., jotka sisaltavat seka E. colin replikoitumisen aloituskoh-dan etta E. colin geneettisiå merkkejå, jotka antavat antibioottiresistenssin, esimerkiksi tetrasykliinin ja ampisilliinin suhteen, on edullista kåyttaa hiivan yh-distelmåvektorien osina.
Liså-DNA-sekvenssejå, jotka sisaltavat esimerkiksi replikoitumisen aloituskohdat ja geneettiset merkit hii-va- ja bakteeri-isånnålle (ks. edella) kutsutaan tåstedes "vektori-DNA":ksi, joka yhdesså hiivan promoottorin ja mutantti-t-PA:ta koodittavan alueen kanssa muodostaa taman keksinnon mukaisen yhdistelmåplasmidin.
Tåmån keksinnSn edullinen toteutustapa koskee yhdis-telmaplasmideja, jotka kykenevåt replikoitumaan autonomisesti hiivakannassa, ja joissa on valintamerkit, ja line-aarisia DNA-sekvensseja, jotka integroituvat isannån kro-mosomiin, ja jotka plasmidit ja lineaariset sekvenssit sisaltavat hiivan promoottorin ja sellaista ihmisen mutantti-t-PA: ta koodittavan DNA-sekvenssin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyva N-glykosyloitumiskohta on muuntunut niin, ettei siina(niisså) voi tapahtua gly-kosyloitumista, ja viimeksi mainittu DNA-sekvenssi on si-joitettu transkriptionaloitus- ja transkriptionlopetus-signaalin seka luennanaloitus- ja lopetuskoodin kanssa mainittuun yhdistelmavektoriin mainitun promoottorin oh-jaukseen niin, etta mainittu sekvenssi ilmentyy trans-formoituneessa hiivasolussa tuottaen mainittua plasmino-geenin kudosaktivaattorimutanttia.
Taman keksinndn mukaiset edulliset yhdistelmavekto-rit valmistetaan alalla tunnetuilla menetelmilla, esimerkiksi liittåmallå yhteen hiivan promoottori, mutantti-t-PA: ta koodittava alue, hiivageenin 31-reunasekvenssi ja mahdollinen vektori-DNA.
Yhdistelmåplasmidien valmistuksessa on edullista kåyttaa kartoitettua rengasmaista vektori-DNA:ta, esimerkiksi bakteeriplasmidi-DNA:ta tms. (ks. edella), jossa on våhintåån yksi katkaisukohta, mielellåån kaksi tai 27 91160 enemmån. On edullista, jos vektori-DNA sisaltaa jo val-miiksi replikoitumisen aloituskohdan(at) ja geneettisen(et) merkin(it) hiiva- ja/tai bakteeri-isånnålle. Vektori-DNA katkaistaan sopivalla restriktioendonukleaasilla. Kat-kaistuun DNA:han liitetåån hiivan promoottorin sisåltå-va DNA-fragmentti ja mutantti-t-PA:ta koodittava DNA-jakso. Ennen promoottorin ja mutantti-t-PA:ta koodittavan alueen liittamista tai niiden liittåmisen jalkeen (tai sa-manaikaisesti) on myos mahdollista liittåå replikoitumisen aloituskohta ja/tai merkit hiiva- tai bakteeri-isannalle. Joka tapauksessa pitåå katkaisu- ja yhteenliittåmisolosuh-teet valita niin, ettei vektori-DNA:n eika promoottorin oleellisia toimintoja håiritå. Yhdistelmåvektori voidaan rakentaa peråkkaisilla yhteenliittåmisillå tai liittåmål-lå yhteen kaksi DNA-jaksoa, jotka sisaltavat kaikki tar-vittavat sekvenssit.
DNA-jaksojen in vitro-yhteenliittåmisesså voidaan kåyttåå erilaisia menetelmiå. Tasaiset pååt (taydelliset-emasparit sisåltåvat kahdenteet) voidaan saada aikaan tietyilla restriktioendonukleaaseilla ja liittaå yhteen T4 DNA-ligaasilla. Tavallisemmin DNA-jaksot liitetåån yhteen yksisåikeisten porrastettujm paidenså vålityksel-lå ja sulkeminen suoritetaan DNA-ligaasilla, esim. T4 DNA-ligaasilla. Tållaiset yksisåikeiset "kohesiiviset pååt" voidaan muodostaa katkaisemalla DNA toiseen luok-kaan kuuluvilla endonukleaaseilla, jotka tuottavat por-rastettuja påita (DNA-kahdenteen kaksi såiettå katkaistaan eri kohdista, jotka ovat muutaman nukleotidin pååsså toi-sistaan). Yksisåikeisiå ketjuja voidaan muodostaa myos 1iittamallå nukleotideja tasaisiin påihin tai porrastet-tuihin påihin kåyttåmållå terminaalista transferaasia ("homopolymeerihånnitys") tai yksinkertaisesti vain naker-tamalla tasapåisen DNA-jakson toista såiettå sopivalla eksonukleaasilla, kuten λ-eksonukleaasilla. Vielå erås tapa saada aikaan porrastettuja paitå on liittåå tasapåi-seen DNA-jaksoon kemiallisesti syntetisoitu kytkijå-DNA, joka sisåltåå porrastettuja påitå synnyttåvån endonuk- 28 leaasin tunnistuskohdan ja katkaisemalla saatu DNA vas-taavalla endonukleaasilla.
Keksinnonmukaisen yhdistelmåvektorin komponentit, kuten hiivan promoottori, mutantti-t-PA:n, joka mahdol-lisesti sisåltåå signaalisekvenssin, rakennegeeni, trans-kriptionlopettaja, replikoitumissysteemi jne., liitetåån yhteen tiettyyn jårjestykseen, jotta voidaan taata oikea toiminta. Komponentit liitetaan yhteen yhteisten kat-kaisukohtien tai synteettisten kytkijamolekyylien vålityk-sellå, jotta voidaan taata komponenttien oikea suunta ja jårjestys.
Lineaarinen DNA-vektori valmistetaan alalla tunne-tuilla menetelmillå, esimerkiksi liittåmållå edellåmainit-tu hiivan promoottori mutantti-t-PA:ta koodittavaan alu-eeseen siten, etta mutantti-t-PA:ta koodittava alue on mainitun promoottorin ohjauksessa, ja varustamalla saatu DNA hiivan geenistå johdetun transkriptionlopetussignaalin sisaltavålla DNA-jaksolla.
DNA-jaksojen yhteenliittaminen voidaan suorittaa edella kuvatulla tavalla eli liittSmalla yhteen tasaiset paat, kohesiiviset pååt tai kayttamållå apuna kemial-lisesti syntetisoituja DNA-kytkijdita.
Erityisesti, ilmentyakseen tehokkaasti pitåa mutant-ti-t-PA-geenin sijaita oikealla tavalla transkriptionfunk-tioihin (hiivan promoottori) ja luentafunktioihin (riboso-minsitoutumiskohta) nahden. Ensinnåkin, promoottorin si-saltavan DNA-segmentin liittaminen mutantti-t-PA:ta koodittavaan alueeseen pitåa tapahtua oikeassa suunnassa.
Jos kaksi suuntaa on mahdollista, oikea pitåa måårittåå ta-vanomaisella restriktioanalyysillå. Yhdistelmåvektoreis- sa, jotka sisåltåvåt vååråsså suunnassa olevan mutantti-t-PA-geenin, pi-tå.å suorittaa uudelleensuuntaaminen leikkaa-malla geeniliitånnåinen irti sopivalla restriktioendonuk-leaasilla ja liittåmållå geeni uudestaan vektorifragment-tiin. Joka tapauksessa voidaan våårå suuntautuminen vålt-tåå liittåmållå yhteen kaksi DNA-jaksoa, joiden påisså on eri katkaisukohdat. Lisåksi vhdistelmåvektorin rakentaminen
II
29 91160 pitaisi tehdå niin, ettå transkriptionaloitus ja -lopetus tapahtuvat oikein. Mitå tulee viimeksimainittuun seik- kaan, transkription pitaisi mielellåån påattyå hiivan kromosomaalisesta DNA:sta tai hiivan 2y-plasmidista joh-dettuun DNA-sekvenssiin. Toiseksi, pitåå saada aikaan oikea lukuvaiheistus. Tavallisesti promoottorialueen ja mutantti-t-PA:ta koodittavan alueen nukleotidisekvens-sit tunnetaan ennen yhteenliittåmistå tai ne voidaan hel-posti måårittåå, joten oikean lukuvaiheistuksen aikaansaa-misessa ei ole mitåån vaikeuksia.
Jos kypsån mutantti-t-PA:n halutaan ilmentyvån niin, etta se kertyy sytoplasmaan, voidaan signaalisekvenssit tai osia niistå, jotka mahdollisesti ovat promoottorialueen jåljesså, ja/tai jotka mahdollisesti edeltåvåt kypsaå mutantti-t-PA:ta koodittavaa aluetta, eliminoida esimerkik-si eksonukleaasilla, esim. Bal31, pilkkomalla. Edullinen alue hiivan promoottorin suoralle liittåmiselle mutantti-t-PA: ta koodittavaan sekvenssiin on hiivan promoot- toriin luontaisesti liittyvån geenin suuren mRNA:n alun ja ATG:n vålissa. Tålla alueella tapahtuvaa liittåmistå vårten pitaisi mutantti-t-PA:ta koodittavalla sekvenssillå olla oma ATG luennanaloitusta vårten tai muuten ATG pitåå tuoda synteettisen lisåkytkijån avulla. Hiivan promoottori voidaan myos liittåå mutantti-t-PA:ta koodittavaan sekvenssiin kåyttåmållå yhdiståvånå molekyylinå synteettistå oli-godeoksiribonukleotidia. Nåin olien voidaan promoottori-alue, miikåli mahdollista, katkaista låheltå 3'-pååtåån niin, ettå tietty måårå emåspareja jåå puuttumaan. Vas-taavasti voidaan mutantti-t-PA:ta koodittava sekvenssi katkaista låheltå 5'-pååtåån. Tåmån jålkeen voidaan ra-kentaa synteettinen oligodeoksinukleotidi siten, ettå liitettåesså yhteen hiivan promoottori ja mutantti-t-PA: ta koodittava sekvenssi yhdiståvån oligonukleotidin vå-lityksellå palautuvat puuttuvat emåsparit luennanaloitus-kodoni ATG mukaanlukien ja mutantti-t-PA:ta koodittava sekvenssi tulee oikeaan lukuvaiheistukseen suhteessa ATG-aloituskodoniin.
30 4. Isåntåorganismien transformointi yhdistelmåvektoreil-la, jotka sisåltåvåt mutantti-t-PA:ta koodittavan sekvens-sin
Esilla oleva keksinto koskee myos transformoitu-ja eukaryoottisia isåntåorganismeja, jotka sisåltavat sel-laista mutantti-t-PA-proteiinia koodittavan DNA-sekvens-sin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvå N-gly-kosyloitumiskohta on muunnettu siten, ettei glykosyloitu-mista voi tapahtua tåsså(nåisså) kohdassa(issa), ja nimen-omaisesti patenttivaatimuksen 7 mukaista hiivaa.
Sopivia eukaryoottisia isantaorganismeja ovat erityi-sesti edellåmainitut ja varsinkin hiivat, joista mm. sukui-hin Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccahromyces ja Torulopsis sekå nåitå låhellå ole-viin sukuihin kuuluvat lajit (ks. J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam, 1971), erityisesti Saccharomyces cerevisiae-kannat.
Transformoitu eukaryoottinen isåntåorganismi voi olla isåntåorganismi, joka on transformoitu yhdistelmå-plasmidilla, joka sisåltåå promoottorin ja sellaista ihmi-sen mutantti-t-PA:ta koodittavan DNA-sekvessin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvå N~g lykosyloitumiskohta on muunnettu niin, ettei glykosyloituminen voi tapahtua tåsså(nåisså) kohdassa(issa), ja mainittu DNA-sekvenssi on mainitun promoottorin transkriptionaalisessa ohjaukses-sa, tai isåntåorganismi, jossa mainittu DNA-sekvenssi on stabiilisti integroituneena isånnån kromosomiin ja isånnån kromosomaalisen promoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa.
Mainittujen transfromoituneiden eukaryoottisten isån-tåsolujen tuotantomenetelmåsså transformoidaan eukaryoot-tiset isåntåsolut yhdistelmåvektorilla, joka sisåltåå promoottorin ja sellaista ihmisen mutantti-t-PA:ta koodittavan DNA-sekvenssin, jossa yksi tai useampi luonnostaan esiintyvistå N-glykosyloitumiskohdista on muunnettu niin, ettei siinå(niisså) voi tapahtua glykosyloitumista, ja il 31 91160 mainittu DNA-sekvenssi on mainitun promoottorin trans-kriptionaalisessa ohjauksessa.
Eukaryoottisten isSntasolujen transformointi suo-ritetaan alalla tunnetuilla menetelmi11a. Esimerkiksi hiivan transformointi yhdistelmåvektoreilla voidaan suo-rittaa menetelmMllå Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 7_5/ 1929 (1978). Kyseinen menetelmå koostuu kol-mesta vaiheesta: (1) Hiivan solunseina tai osia siita poistetaan.
(2) "Alastomat" hiivasolut (sferoplastit) kasitellaan transformoivalla DNA:lla PEG:n (polyetyleeniglykoli) ja 2 +
Ca -ionien låsnaollessa.
(3) Solunseina regeneroidaan ja transformoituneet solut valitaan kiinteåssa agar-kerroksessa.
Edullinen menetelmå koostuu seuraavista vaiheista: (1) : Hiivan solunseina poistetaan entsymaattisesti kåyttåmållå erilaisia glukosidaasivalmisteita, kuten etanan suolinestettå (esim. Glusulase tai Helicase ) tai mikro-organismeista saatuja entsyymiseoksia (esim. Zymolase ), osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esim. 1M sor-bitoli).
(2) : Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n lasna ollessa ja sytoplasmakalvojen paikallisia fuusioita indu-soituu. "Fuusionkaltaisten" olosuhteiden syntyminen on erittain tårkeåta ja monista transformoituneista hiivaso-luista tulee diploidisia tai jopa triploidisia transfor-mointiprosessin aikana. Menetelmiå, jotka mahdollistavat fuusioituneiden sferoplastien valinnan, voidaan kayttåå transformanttien rikastamiseen, so. transformoituneet solut voidaan helposti seuloa ennalta valittujen fuusio-tuotteiden joukosta.
(3) : Koska solunseinåttdmåt hiivasolut eivat ja- kaannu, solunseina pitaa regeneroida. Tåma regenerointi on edullista suorittaa upottamalla sferoplastit agariin. Esimerkiksi voidaan toimia niin, ettå sferoplastit sekoi-tetaan sulaan agariin (noin 50°C). Kun liuos jåahdyte-tSSn hiivan kasvulåmpotilaan (noin 30°C), saadaan kiintea 32 kerros. Taman agar-kerroksen tarkoituksena on eståa nopea diffuusio ja oleellisten makromolekyylien poistu-minen sferoplasteista, jotta solunseinån regeneroitumi-nen helpottuu. Solunseinån regeneroituminen voidaan kuitenkin saavuttaa (vaikkakin pienemmållå teholla) kas-vattamalla sferoplasteja ennalta muodostetun agar-kerroksen pinnalla.
Regenerointiagar on edullista valmistaa sellaisek-si, ettå se mahdollistaa transformoituneiden solujen re-generoitumisen ja valinnan samanaikaisesti. Koska valin-tamerkkeinå kåytetåån tavallisesti sellaisia hiivageene-ja, jotka koodittavat aminohappojen biosynteesisså tarvit-tavia ensyymejå (supra), on regenerointi edullista suo-rittaa hiivan minimiagaralustassa. Jos tarvitaan hyvin korkeita regeneroitumistehoja, on seuraava kaksivaiheinen menetelmå edullinen: (1) solunseinå regeneroidaan ra- vinnerikkaassa kompleksialustassa ja (2) transformoituneet solut valitaan maljaamalla solukerroksen kopio selektii-visellå agarmaljalla.
Jos yhdistelmåvektori ei sisållå merkkigeeniå, voidaan transformoituneet solut tunnistaa myos vaihtoehtoi-silla menetelmillå. Nåitå ovat esimerkiksi in situ-hybri-disointi leimatun DNA-fragmentin kanssa, joka sisåltåå yhdistelmåvektorin kanssa homologisia sekvenssejå (esim. menetelmållå Hinnen et al., supra), in situ-immunomååri-tykset edellyttåen, ettå sijoitetun geenin tuotteen vas-ta-ainetta on saatavissa, tai muut seulontamenetelmåt, joissa mitataan transformoivan(ien) plasmidin(ien) geeni-tuotteita.
Vaihtoehtoisesti voidaan hiiva yhteistransformoida kek-sinnonmukaisella yhdistelmåvektori11a ja toisella vektoril-la, joka sisåltåå geneettisen merkin hiivaa vårten. Jos nåillå kahdella eri vektorilla on samanlaisia DNA-sek-venssejå (nåmå voivat olla vektoreissa låsnå olevia baktee-risekvenssejå), tapahtuu rekombinoituminen, joka johtaa fuusioituneeseen valittavissa olevaan yhdistelmåmolekyy-liin.
II
33 91160
Hiiva voidaan myos yhteistransforraoida lineaarisella DNA-vektorilla, joka sisåltaa hiivan promoottorin, mutant-ti-t-PA:ta koodittavan alueen ja mahdollisesti signaalisek-venssin, jotka ovat mainitun promoottorin ohjauksessa, seka hiivageenin transkriptionlopetussignaalit, seka vektorilla, joka sisaltaa valintamerkin hiivaa vårten. Yhteistransfor-mointi mahdollistaa rikastamisen sellaisten hiivasolu-jen suhteen, jotka ovat ottaneet sisaansa sellaisen DNA:n, jota ei voida suoraan valita. Koska transformointikelpoi-set solut ottavat sisaansa mita tahansa DNA-tyyppiå, si-såltaS suuri osa valintavektorilla transformoituneista soluista myos muuta transformoivaa DNA:ta (kuten edella-mainitun lineaarisen vektori-DNA:n). Riittavan pitkien homologisten sekvenssien (esim. noin 20 - 100 deoksinuk-leotidin pituiset) ansiosta polypeptidigeeni integroi-tuu isantSkromosomiin stabiilisti.
Transformoituneita eukaryoottisia isåntaorganismeja, erityisesti transformoituneita hiivakantoja, jotka sisålta-vMt keksinndnmukaisen yhdistelmaplasmidin tai lineaarisen DNA-vektorin, jonka sisaltSma mutantti-t-PA-geeni on integroitunut stabiilisti isannan kromosomiin, voidaan parantaa mutantti-t-PA:n tuotannon suhteen suorittamalla mutatointi ja valinta alalla tunnetuilla menetelmilla. Mutatoituminen voidaan saada aikaan esimerkiksi UV-sa-teilylla tai sopivilla kemiallisilla aineilla. Erityi-sen edullista on saada aikaan proteaasivajaita mutantteja, erityisesti hiivamutantteja, jotta saadaan våltetyksi tuo-tetun t-PA:n proteolyyttinen hajoaminen solujen sisalla.
5. Farmaseuttiset valmisteet
Keksinnonmukaisesti saatavissa olevilla uusilla mu-tantti-t-PA-proteiineilla, jotka mielellaan ovat yksiket-juisessa muodossa, on arvokkaita farmakologisia ominaisuuk-sia. Niitå voidaan kayttåå enneståan tunnettujen plasmi-nogeenin kudosaktivaattorien tavoin ihmisilla eståmaan tai parantamaan verihyytymia tai muita tiloja, joissa halutaan saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen tai proteolyyt- 34 tinen aktiivisuus plasminogeenin aktivoitumismekanismin kautta, jollaisia tiloja ovat arterioskleroosi/ sydan- ja aivoinfarkti, laskimoveritulppa, tromboembolia, leik-kauksenjålkeinen veritulppa, tromboflebiitti ja diabe^-tekseen liittyvat verisuonitaudit.
Nyt on yllattaen havaittu, etta tåmån keksinnon mu-kaisilla uusilla mutantti-t-PA-proteiineilla on taysin glykosyloituneiden luonnon-t-PA-proteiinien biologisiin aktiivisuuksiin verrattavia tai parempia biologisia ak-tiivisuuksia. Ainutlaatuiset fibriinin ohjaamat ominai-suudet eli kyky aktivoida plasminogeenia vain fibriinin låsnåollessa ovat taysin sailyneet. Lisåksi uusilla pro-teiineilla on pitempi in vivo-stabiilisuus kuin aidolla t-PA:lla. Ilmeisesti uudet proteiinit, joista puuttuvat typpeen sitoutuneet hiilihydraattiketjut osaksi tai ko-konaan, ovat våhemmån alttiita proteolyyttiselle hajoa-miselle kuin taysin glykosyloitunut tuote.
Sellaisten glykoproteiinien biologisen aktiivi-suuden såilyminen, joista puuttuu hiilihydraattitåhtei-tå, on ennalta arvaamatonta ja vaihtelevaa. Joissakin tapauksissa deglykosyloituminen tai vain osittainen de-glykosyloituminen on johtanut biologisen aktiivisuu-den heikkenemiseen tai håviåmiseen (D.R. Karp et al., J. Biol. Chem. 257, 7330 (1982); H.T. Kentmans et al., Biochemistry 22_, 3067 (1983); H.R. Gradnick et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2771/1983)). Tåmån keksinnon mukaisten mutantti-t-PA-proteiinien yllåttåvåt ominaisuudet eivåt ole olleet pååteltåvisså aikaisemmista tuloksista, jotka on saatu kemiallisesti tai entsymaat-tisesti deglykosyloiduilla t-PA-proteiineilla (S.P.
Little et al., supra; PCT 84/1960, supra), koska t-PA:n kemiallinen tai entsymaattinen kåsittely ei selvåstikåån anna tuotetta, josta typpeen sitoutuneet hiilihydraatti-ketjut puuttuvat kokonaan, tai josta ainakin jotkut typpeen sitoutuneet hiilihydraattiketjut puuttuvat.
Keksinto koskee myos farmaseuttisia valmisteita, jotka sisåltåvåt terapeuttisesti tehokkaan måårån vaikuttavaa li 35 91160 ainetta (mutantti-t-PA:n yksiketjuinen muoto tai kak-siketjuinen muoto tai nåiden seos, mielellåån yksiket-juinen muoto) sekå orgaanisia tai epåorgaanisia, kiin-teitå tai nestemåisia farmaseuttisesti hyvåksyttåviå kantaja-aineita, jotka soveltuvat parenteraaliseen, so. intramuskulaariseen, subkutaaniin tai intraperitone-aaliseen, antotapaan eivatka vuorovaikuta vaikuttavien aineiden kanssa haitallisesti.
Sopivia ovat mm. infuusioliuokset, mielellåån vesi-liuokset tai -suspensiot, jotka voidaan valmistaa ennen kåyttoå, esimerkiksi lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisaltavat aktiivista aineosaa yksin tai kantaja-aineen, kuten mannitolin, laktoosin, glukoosin, albumiinin tms., kanssa. Farmaseuttiset valmisteet steriloidaan ja niihin sekoitetaan haluttaessa apuaineita, kuten såilontåainei-ta, stabilointiaineita, emulgointiaineita, liuotusainei-ta, puskurointiaineira ja/tai osmoottista painetta såå-televiå suoloja. Sterilointi voidaan suorittaa steriili-suodattamalla pienihuokoisten (halkaisija 0,45 ym tai pienempi) suodattimien låpi, jos nåin halutaan. Ste-riilisyyden såilyttåmiseksi voidaan lisåtå myos anti-biootteja.
Keksinnonmukaiset farmaseuttiset valmisteet anne-taan yksikkoannosmuodossa, esimerkiksi ampulleissa, jotka sisåltåvåt 1 - 2000 mg farmaseuttisesti hyvåksyttåvåå kanta ja-ainetta yksikkoannosta kohti ja noin 1 - 100 mg, mielellåån noin 3 - 25 mg vaikuttavaa ainetta (mutantti-t-PA:n yksiketjuista muotoa tai kaksiketjuista muotoa tai nåiden seosta, mielellåån yksiketjuista muotoa) yksikkoannosta kohti.
Riippuen sairauden laadusta ja potilaan iåstå ja ti-lasta, on noin 70 kg painavan potilaan hoitamiseksi tar-vittava vuorokausiannos alueella 3 - 100 mg, mielellåån 5 - 50 mg kerran 24 tunnissa annettuna. Sydåninfraktin ollessa kyseesså on edullinen annos n. 30 - 80 mg 60 - 120 minuutin sisållå annettuna, mutta mielellåån kolmessa eråsså noin 90 minuutin sisållå annettuna.
36
Keksinto koskee myds menetelmåå farmaseuttisen val-misteen valmistamiseksi siten, ettå tåmån keksinnon mukai-nen biologisesti aktiivinen proteiini sekoitetaan far-maseuttisesti hyvåksyttåvåån kantaja-aineeseen.
Lisaksi keksinto koskee naiden uusien proteiinien kåyttoå ihmiskehossa ennaltaehkaisevasså tai hoitotarkoi-tuksessa.
Keksinto koskee erityisesti DNA-sekvensseja, yh-distelmåvektoreita, transformoituneita isåntåkantoja, mutantti-t-PA-proteiineja ja naiden valmistusmenetelmiå, kuten esimerkeisså on selostettu.
Seuraavassa kokeellisessa osassa selostetaan tamån keksinnon erilaisia toteutustapoja liitteenå oleviin piir-roksiin viitaten.
Kuva 1 esittaå HeLa-soluista johdetun t-PA:n DNA-sekvenssiå ja vastaavaa aminohapposekvenssiå. Glykosyloi-tumiskohdat on alleviivattu. Nuoli osoittaa Arg:n ja Ile:n vålisså olevaa oletettua katkaisukohtaa, joka katkaisu synnyttåå kaksiketjuisen t-PA-muodon yksiketjuisesta muo-dosta.
Kuva 2 esittaå keksinnonmukaisten mutatoituneiden t-PA-geenien DNA-sekvenssejå ja mutantti-t-PA-proteiinien vastaavia aminohapposekvenssejå.
Kuva 3 on mutantti-t-PA-lajien hyytymiå liuottavan aktiivisuuden kåyråsto, jossa suorat ovat seuraavat:
11Q 11Q
(Asn )-t-PA (suora 3), (Asn , Ala )-t-PA (suora 4) /tv 119 .. 186 . 450. . c.
3a (Asn , Ala , Asn )-t-PA (suora 5) verrattuna aitoon ihmisen melanooma-t-PA:han (suora 1) ja hiivan tuottamaan normaaliin t-PA:han (suora 2).
Kuva 4 on kaavio mutantti-t-PA-lajien havaitsemi-sesta immunologisesti Western:in blottauksella.
Keksintoå valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraavil-la esimerkeillå.
Esimerkeisså kåytetåån seuraavia lyhenteitå: BSA: naudan seerumialbumiini DTT: 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaani- dioli)
II
37 91160 EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo PEG: polyetyleeniglykoli 6000 SDS: natriumdodekyylisulfaatti SSC: liuos, joka sisåltåå 150 mM NaCl, 15 mM natrium- sitraattia, 0,5 mM EDTA, ja jonka pH on såå-detty suolahapolla arvoon 7,2 TBE: liuos, joka sisåltåå 90 mM Tris, 90 mM boori- p happoa ja 2,5 mM Titriplex :iå.
TE: liuos, joka sisåltåå 10 mM Tris.HCl (pH 8,0) ja 0,1 mM EDTA (pH 8,0).
TNE: liuos, joka sisåltåå 100 mM NaCl, 10 mM Tris.
HC1 (pH 7,5) ja 1 mM EDTA
Tris.HCl: tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani, jonka pH on såådetty HCl:llå.
Esimerkki 1: Plasminogeenin kudosaktivaattorin sisåltåvån p31/PH05-TPA18 BamHI-HindIII-fragmentin kloonaus M13mp8:aan a) Plasmidissa p31/PH05-TPA18 (selostettu eurooppa-laisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 143 081) on PH05-promoottori ja PH05-signaalisekvenssi liitettyinå lukuvai-heistuksessat-PA:n rakennegeeniin (ks. kuva 1). Plasmidi lasketaan DH-1:n (F , recAl, endA1, gyrA96, thi-1, hsdRl7, (rk,mk), SUPE44»^ ) lapi, joka on E. colin dam -kanta. Eristetåån kaksi amp^-pesåkettå ja niitå kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisåltåå 100yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetåån soluista. Restriktioentsyymikat-kaisutBamHI:llå ja HindIII:lla (Boehringer) osoittavat, ettå t-PA-geeniliitånnåinen on kooltaan oikea, ja tåmå varmistetaan Pstl-katkaisun (Boehringer) restriktiokaa-violla.
b) 3 yg E. coli-kannasta DH-1 saatua p31/PH05-TPAl8:aa inkuboidaan 60 minuuttia 37°C:ssa 20 yksikon kanssa HindIII:a (Boehringer, 20 yksikkoå/yl) 50 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^* 50 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia. Erå tarkistetaan 1 %: sessa agaroosigeelisså, joka on tehty TBE-puskuriin, jot-ta tåydellinen katkeaminen saadaan varmistetuksi. Katkai- 38 suseosta inkuboidaan 10 minuuttia 65°C:ssa. Sitten liså-tåan 0,5 μΐ 0,5 M NaCl ja sen jålkeen 18 yksikkoå BamHI: ta (Boehringer, 18 yksikkoå/yl). Saatua seosta inkuboidaan 60 minuuttia 37°C:ssa. Analyysi, joka suoritetaan TBE-puskuriin tehdysså 1 %:sessa agaroosigeelissa, osoit-taa 2,3 ke:n liitannaista 3,6 ke:n vektorifragmentin lisaksi. Liitannainen eristetaan 0,8 %:sella preparatii-visella agaroosigeelillå. Geeliviipale siirretaan Micro- p
Colloidon -putkeen (Sartorius GmbH), peitetaan 100 yl:lla TE-puskuria ja elektroeluoidaan (elektroforesoidaan 90 mA:ssa 50 minuuttia). TE-liuos keråtåan silikonoituun putkeen. DNA saostetaan 2,5 tilavuudella absoluuttista etanolia sen jalkeen, kun on lisåtty 0,1 tilavuutta 10x TNE:tå. DNA-pelletti peståan kylmålla 80 %:sella etano-lilla ja kuivataan vakuumissa. DNA uudelleensuspendoidaan 20 yl:aan TE:tå (13 fmol/yl).
c) 3 yg M13mp8 (RF-muoto) katkaistaan Hindllrlla ja BamHI:11a ja 7,3 ke:n fragmentti eristetaan 0,8 %:sessa preparatiivisessa agaroosigeelissa, elektroeluoidaan ja saostetaan kuten edellå. DNA uudelleensuspendoidaan 20 yl:aan TE:ta (30,8 fmol/yl).
d) 92 fmol M13mp8 BamHI-Hindlll-vektorifragmenttia ja 130 fmol BamHI-HindIII-t-PA-liitannaista liitetåån yh-teen 20 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^f 10 mM DTT, 2 mM ATP ja 1 yg liivatetta (Sigma) , kåyttamållå 400 yksikkoå T4 DNA-ligaasia (New England Bio
Labs, 400 yksikkoa/yl) reaktioajan ollessa 18 tuntia 15°C: ssa. Kun sen jalkeen on inkuboitu 10 minuuttia 65°C:ssa, 1 yl:n erå yhteenliittåmisseosta laimennetaan TE:11a suh- teessa 1:10. 2 yl:lla ja 8 yl:lla tåta laimennettua yh- 2 + teenliittamisseosta transformoidaan Ca :11a kasitellyt E. coli JM101-solut noudattamalla kasikirjan "M13 Cloning and Sequencing Handbook" (julkaisija Amersham). 200 vårit-tdmasta plakista (8 yl, 1:10 laimennettu seos) poimitaan 25 ja valmistetaan yksisaikeinen replikoituva DNA-muoto (RF) (J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)). Kun RF-DNA analysoidaan, havaitaan kaksi kloonia, joissa 39 91160 on oikeankokoinen liitannainen (2,3 ke:n BamHI-Hindlll t-PA-geenifragmentti) . Nåmå kaksi kloonia, jotka si-såltåvåt t-PA-geenin, jossa on PH05-promoottori ja ter-minaattori, jatkoanalysoidaan. PstI-, Hindlll-EcoRI-ja BamHI-EcoRI-katkaisu varmistavat 2,3 ke:n fragmentin låsnåolon. Toista nåistå klooneista, josta kåytetåån nimeå p8A-7, kåytetåån jatkorakentamisissa.
Esimerkki 2: Kohdassa Asn 117 olevan ensimmåisen glyko- syloitumiskohdan mutatointi kåyttåmållå yksisåikeistå p8A-7:åå 117 119
Aen SerjSeri t-PA:n koodittava såie ^\jqq AAC AGC AGC GCG TIG GCC3...
mutatoiva aluke I 3 ς jCG jjg AAC C3 S’ — 3' mutatoitunut koodittava ,;.TGG AAC AGC AAC GCG TTG GCC ...
S^^"e Asn SerjAen 1
Kaikki mutatoivat ja sekventointialukkeet synteti-soidaan fosforamidiittimenetelmållå (M.H. Caruthers, teok-sessa Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen ja A. Lang, toim.), Verlag Chemie, Weinheim, Lånsi-Saksa) Applied Biosystems-syntetisaattorilla (Model 380B).
Seuraavat sekventointialukkeet syntetisoidaan: Sekventointialuke I: dGCCCAGCCTGATGGCGT
Sekventointialuke II: dCCACGGGAGGCAGGAGG
Sekventointialuke III: dCAGCACGTGGCACCAGG
Sekventointialuke IV: dTGGCAGGCGTCGTGCAA
Universaalinen M13-sekventointialuke: dGTAAAACGACGGCCAGT
40 a) Mutatoivan alukkeen fosforylointi:
200 pmol mutatoivaa aluketta I fosforyloidaan 20 yl: ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM
MgCl2/ 5 mM DTT, 0,1 mM spermidiinia ja 0,1 mM EDTA, ja joka sisaltaa 1 yl:n 10 mM ATP:tå, kåyttåmålla 8 yksikk6å T4-polynukleotidikinaasia (Boehringer, 8 yksikk5å/yl). In-kuboidaan 45 minuuttia 37°C:ssa ja sen jålkeen reaktio py-såytetåån kuumentamalla 10 minuuttia 65°C:ssa.
b) Mutatoivan alukkeen I ja universaalisen sekventointi-alukkeen emåspariuttaminen yksisåikeisen templaatin p8A-7 kanssa 0,88 yg (123 fmol) yksisåikeistå templaattia p8A-7 inkuboidaan fosforyloidun mutatoivan oligodeoksinukleo-tidin I (20 pmol; 10 pmol/yl) ja universaalisen M13-sek-ventointialukkeen (10 pmol) kanssa 55°C:ssa 5 minuuttia 10 yl:ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^r 50 mM NaCl ja 1 mM DTT, ja sen jålkeen jååh-dytetåån huoneenlåmpotilassa 5 minuuttia.
c) Jatkamis-yhteenliittåmisreaktio:
Edellå saatuun emåspariutettuun seokseen lisåtåån 10 yl entsyymi-dNTP-liuosta (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), joka sisåltåå 1 yl:n puskuria (0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgC^f 0,1 M DTT), 4 yl 2,5 mM dNTP-seosta, 1 yl:n 10 mM γ-ΑΤΡ, 1,4 yl T4DNA-ligaasia (Amersham, 2,5 yksikkoå/yl) ja 0,6 yl Klenow DNA-polymeraasia (BRL, 2,99 yksikk5å/yl). Tåtå seosta inkuboidaan 15°C:ssa 8 tuntia. Reaktio pysåy-tetåån inkuboimallå 10 minuuttia 65°C:ssa.
d) Transformointi yhteenliittåmisseoksella
Yhteenliittåmisseos laimennetaan 1:20 ja 1:200 TE: llå. 1 yl:lla ja 5 ylslla kutakin nåitå laimennettuja liuoksia transformoidaan 0,2 ml transformointikelpoisia E. coli JM101-soluja (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21 - 78 (1983)). Poimitaan 36 plakkia ja faagit ,, 91160 41 eristetaan PEG-saostuksella ja liuotetaan uudelleen 50 yl:aan TE-liuosta (0,1 - 0,16 yg/yl) .
e) Faagien seulonta: 2 y1 faagi-DNA:ta tåplitetåån kuivalle nitrosellu-loosapaperille (Millipore S.A., luettelon numero HAWP090, huokoskoko 0,45 ym) . Suodatinta kuivataan ilmassa ja sen jålkeen sita kuumennetaan 2 tuntia vakuumissa 80°C:ssa.
Suodatinta esihybridisoidaan 1 tunti 67°C:ssa kuu-massa suljettavassa pussissa, jossa on 5 ml liuosta, joka sisaltaa 6x SSC, Denhardt'in liuosta (x10) (0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyylipyrrolidonia, 0,2 % Ficoll'ia) ja 0,2 % SDS.
Suodatin poistetaan ja sita huuhdellaan huoneenlam- potilassa 1 minuutti 50 ml:ssa 6xSSC-liuosta. Lisatåan 32 3 ml liuosta, jossa on 6xSSC, 10xDenhardt ja 100 yl P: 11a leimattua mutatointialuketta I (5 x 10^ cpm).
Pussia pidetåån huoneenlampotilassa 1 tunti. Suodatin poistetaan ja sita pestaan kaikkiaan 10 minuuttia huoneenlampotilassa 6xSSC-liuoksella (50 ml x 3). Suodatinta autoradiografoidaan 1 tunti -70°C:ssa vahvistusvarjos- timen kanssa. Suodatin pestaan 50°C:ssa 6xSSC-liuoksella (50 ml) ja autoradiografoidaan -70°C:ssa 1 tunti vahvistusvar jostimen kanssa.
Suodatin pestaan 60°C;ssa 6xSSC-liuoksella (50 ml) ja autoradiografoidaan -70°C:ssa 2 tuntia vahvistusvarjostimen kanssa. 60°C:ssa pestystå suodattimesta loydetåån viisi kloonia, joiden mutaatiot erottuvat alkuperaisen seulonnan jalkeen.
f) Sekventointi:
Yhdesta positiivisesta kloonista varmistetaan AGC-kodonin (Ser 119) mutatoituminen AAC-kodoniksi (Asn 119) suorittamalla DNA-sekvenssinmaaritys sekventointialuk-keella I kayttåmallM ketjunkatkaisumenetelmåa (F. Sanger,
S. Niclder ja A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
42 74, 5463-5467 (1977)). Mutaatio DNA:ssa johtaa Ser:in muuttumiseen Asnrksi kypsån t-PA:n aminohappoasemassa 119 119 ((Asn )-t-PA).
g) Plakkien puhdistus:
Positiiviselle kloonille nimeltåån p8A-7-M01 suo- ritetaan plakkien puhdistus. Faagivarasto laimennetaan 7 8 9 (1:10 , 10 , 10 ), levitetaan YT-maljoihin ja inkuboidaan yon yli 37°C:ssa. Sitten plakit poimitaan, faagit eris- 32 tetåån ja seulotaan P:lla leimatulla mutatointialukkeel-la I. 10 faagista seitsemån DNA:ssa on haluttu mutaatio (ks. kuva 2) Yhdesta nåista, p8A-7-M01, valmistetaan RF-DNA ja sitå kåytetaån pJDB207:n kloonaamiseen.
Esimerkki 3: Kohdassa Asn 184 olevan toisen glykosyloi- tumiskohdan mutatointi kayttamalla yksisaikeista p8A-7:aa 184 186
Asn GlyjSerj koodittava saie .3.GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT3!..
Of c f
mutatointialuke II J cc TTA CCC CGT CGG ATGJ
mutatoitunut koodittava .?!ggG AAT GGG GCA GCC TAC CGT3 ...
saie ,-,
Asn Gly1Alai
Alukkeen II fosforylointi, jatkaminen ja yhteenliit- taminen ja transformointi tehdåan samoin kuin esimerkissa 32 2. 36 plakkia poimitaan ja faagit seulotaan P:lla lei matulla mutatointialukkeella II. Lampotilat, joissa suo-datin pestaan, ovat: huoneenlMmpotila, 50°C ja 60 C. 60 °C:een pesu osoittaa, etta mutatoituneita klooneja on kolme. Yhden kloonin DNA sekventoidaan sekventointi-alukkeella II, jolloin saadaan varmistetuksi toisessa glykosyloitumiskohdassa tapahtunut mutaatio (ks. kuva 2). Taman kloonin faagiplakit puhdistetaan ja seulotaan positiivisten mutaatioiden suhteen. Yksi positiivinen klooni nimetåån p8A-7-M02:ksi. Mutaatio muuttaa TCA-kodonin (Ser 186) GCA-kodoniksi (Ala 186), jolloin siis 43 91160 on seurauksena Ser:in muuttuminen Alarksi kypsan t-PA:n asemassa 186 ((Ala )-t-PA).
Esimerkki 4: Kohdassa Asn 184 olevan toisen glykosyloi- tumiskohdan mutatointi kayttåmållå yksisaikeista mu-tatoitunutta p8A-7-M01:ta
Esimerkin 2 mukainen menettely toistetaan kaytta- malla yksisaikeista p8A-7-M01:ta ja mutatointialuketta II. Plakkien puhdistuksessa ja seulonnassa loytyneista positiivisista klooneista yhdelle annetaan nimeksi p8A- 7-M021. Kloonin DNA sekventoidaan sekventointialukkeilla I ja II. Nain saadaan varmistetuksi mutatoituminen gly- kosyloitumiskohdissa 117 ja 184 (ks. kuva 2). Naiden kah- den DNArssa tapahtuneen mutaation yhdistelmå johtaa mutant- ti-t-PA-molekyyliiin, jossa on kohdissa 119 ja 186 olevat 119 186 kaksi aminohappomuutosta ((Asn , Ala )-t-PA).
Esimerkki 5: Kohdassa Asn 448 olevan neljMnnen glykosy- loitumiskohdan mutatointi kayttSmalla yksisaikeista mu-tatoitunutta p8A-7-M021:ta (ensimmainen rakentamistuote) 448 450
Asn ArglThrtVal Thr 5' 3’ koodittava saie ...CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC A...
V 5*
mutatointialuke IV GAA TTG TCT TIG CAG TGG CTG T
mutatoitunut koodittava saie.?!cTT AAC AGA AAC GTC ACC GAC A.?.
Asn ArglAsnlval Thr
Esimerkin 2 mukainen menettely toistetaan kayttamal-lå yksisaikeista p8A-7-M021:ta ja mutatointialuketta IV. Låmpdtilat, joissa suodatin peståån, ovat: 50°C, 60°C ja 68°C. 68°C:een pesu paljastaa positiiviset kloonit. Plak-kienpuhdistuksen jalkeen saaduista positiivisista klooneista yhdelle annetaan nimeksi p8A-7-M0421. Taman kloonin DNA sekventoidaan sekventointialukkeiden I, II ja IV avulla, jolloin saadaan varmistetuksi glykosyloitumiskoh-dissa 117, 184 ja 448 (ks. kuva 2) tapahtuneet mutaatiot.
44
Kolmen mutaation tapahduttua on saadussa mutantti-t-PA- molekyylisså kolme aminohappomuutosta, jotka ovat koh- dissa 119, 186 ja 450 ((Asn119, Ala186, Asn450)-t-PA).
Tassa mutantissa on syntynyt uusi glykosyloitumiskohta 450 neljånteen kohtaan siten, ettå Thr on korvautunut Asn:11a.
Esimerkki 6: Kohdassa Asn 448 olevan neljannen glykosy- loitumiskohdan mutatointi kayttåmalla yksisåikeistå muta-toitunutta p8A-7-M021:tå (toinen rakentamistuote) 448 450 5' Leu Leu Asn Arg I Thrl Val Thr 3' koodittava saie ...TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC...
3' 5' mutatointialuke IV-I AA TTG TCT CGT CAG TGG 3> mutatoitunut kooditta-. . ,TCA caa cat TTA CTT AAC AGA GCA GTC ACC GAC...
va såie ,__
Asn Arg|Ala|V>1 Thr
Esimerkin 2 mukainen menettely toistetaan kåyttåmål-la yksisMikeistS p8A-7-M021:ta ja mutatointialuketta IV-I. Suodattimenpesulåmpotilat ovat: huoneenlampotila, 50°C ja 60°C 6xSSC-liuoksessa. Plakkienpuhdistuksen jålkeen eristetaån yksi positiivisista klooneista ja se nimetåan p8A-7-M0421 (1) :ksi. Tainan kloonin DNA sekventoidaan kåyt-tamållå sekventointialukkeita I, II ja IV, jolloin saadaan varmistetuiksi glykosyloitumiskohdissa 117, 184 ja 448 tapahtuneet mutaatiot (ks. kuva 2). Kolmen mutaation tapahduttua on saadussa mutantti-t-PA-molekyylissM kolme aminohappomuutosta, jotka ovat kohdissa 119, 186 ja 450 ((Asn119, Ala186, Ala450)-t-PA).
Esimerkki 7: Kohdassa Asn 218 olevan kolmannen glykosy- loitumiskohdan mutatointi kayttamalla yksisåikeistå mu-tatoitunutta p8A-7-M0421(1):ta 91160 45 218 220 Aen Pro|Ser) il 41 koodittava saie .7.G AAC CCC AGT GCC CAG G.f.
O · »1 mutatointialuke III C TTG GGG TTA CGG GTC C 3 mutatoitunut koodittava saie .?.g AAC CCC AAT GCC CAG G.?!
Aen ProIAsn1
Esimerkin 2 mukainen menettely toistetaan kåyttå-mållå yksisaikeista p8A-7-M0421(1):tå ja mutatointialuket-ta III. Suodattimenpesulåmpotilat ovat: 50°C ja 60°C. Positiiviset kloonit ilmenevåt 60°C:een pesussa. Plak-kienpuhdistuksen jålkeen eristetåån yksi positiivisista klooneista ja se nimetåån p8A-7-M04321(1):ksi. Tåmån kloonin DNA sekventoidaan kåyttåmållå sekventointialukkei-ta I - IV. Tållå varmistetaan mutatoituminen glykosyloi-tumiskohdissa 117, 184, 218 ja 448 (kuva 2). Neljån mu-taation tapahduttua on saadussa mutantti-t-PA-molekyylis-så nelja aminohappomuutosta, jotka ovat kohdissa 119, 186, 220 ja 450 ((Asn119, Ala186, Asn220, Ala450)-t-PA).
Esimerkki 8: Mutatoituneiden t-PA-geeniliitånnåisten kloo- naaminen plasmidiin pJDB207 a) RF-DNA:n valmistaminen: RF-DNA valmistetaan p8A-7-M01:stå, p8A-7-M02:sta, p8A-7-M021:stå, p8A-7-M0421:stå, p8A-7-M0421(1):stå ja p8A-7-M04321(1):stå nopealla DNA:neriståmismenetelmållå (D.S. Holmes ja M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)).
b) Liitånnåisten eriståminen:
Kukin kuusi RF-DNA:ta (0,5 yg) katkais-taan 16 yksikollå BamHI:tå ja 20 yksikollå Hindlllra 50 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 46 6 mM MgC]^/ 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, reak-tioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sen jalkeen lisatåån 2 μΐ RNaasia (Serva, 1 mg/ml) ja inkuboidaan 5 minuuttia 37°C:ssa ja 2,3 ke:n liitånnaiset eristetaan 0,8 %:sella preparatiivisella agaroosigeelillå. DNA uutetaan elektro-eluutiolla ja liuotetaan saostamisen jalkeen 5 yl:aan TE-liuosta (46,8 fmol/yl).
c) 3 yg plasmidia pJDB207 leikataan BamHIillå ja Hindlll: 11a ja 6,6 ke:n vektori eristetaan. Elektroeluution ja saostuksen jalkeen DNA uudelleenliuotetaan 20 yl:aan TE-liuosta (35 fmol/μΐ).
d) 140 fmol vektorifragmenttia pJDB207 BamHI-Hindlll ja 234 fmol mutatoituneen t-PA-liitånnåisen BamHI-
Hindlll-fragmenttia liitetaan yhteen 16 tuntia 15°C:ssa 20 ylsssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^» 10 mM DTT, 2 mM ATP ja 1 yg liivatetta, kayt- tamalla 400 yksikkda T4 DNA-ligaasia. Reaktio pysayte- taan inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 2 yl:lla ja 5 yl:lla saatua reaktioseosta transformoidaan E. coli HB101
Ca^+-solut (M. Dagert ja S.D. Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1979)). Kustakin kuudesta yhteenliittåmisesta poimitaan £ 6 amp -pesakettå. DNA valmistetaan nopealla eristysmene-telmalla. Oikeankokoiset vyohykkeet havaitaan analysoi-malla DNA BamHI-Hindlll:11a ja PstI:llS. Yhta kloonia kustakin kuudesta yhteenliittåmisesta kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisåltåå 100 yg/ml ampisilliinia. p8A-7-M01s stå, p8A-7-M02:sta, p8A-7-M021:stå, p8A-7-M0421 : stå, p8A-7-M0421 (1) :stå ja p8A-7-i£>4321 (1) :sta johdetut plasmidi-DNA:t eristetåån ja nimetåån seuraavasti: pJDB207/PH05-TPA18-M01, pJDB207/PH05-TPA18-M02.
pJDB207/PH05-TPA18-M021, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421, pJDB207/PH05-TPA18-M0421(1) ja pJDB207/PH05 TPA18-M04321(1).
47 9116°
Esimerkki 9: Sellaisen hiivan ilmentåmisvektorin raken- taminen, joka sisåltåa PH05-promoottorin, invertaasin signaalisekvenssin ja t-PAita koodittavan alueen A) Oligodeoksiribonukleotidien syntetisointi invertaasin signaalisekvenssia vårten
Nelja oligodeoksiribonukleotidia, 1-1/ 1-2, 1-3 ja 1-4, syntetisoidaan DNA-syntetisaattorilla (Applied Bio-systems, Model 380B). Suojauksen poiston jalkeen syn-teettiset fragmentit puhdistetaan 12 %:sessa polyakryy-liamidigeelisså, joka sisaltåa 8 M ureaa. Suolattomat, puhtaat oligodeoksiribonukleotidit saadaan kayttamållå Sep. Pak:ia (Waters Associates). Nama fragmentit muo-dostavat kahdenteen, joka koodittaa invertaasin signaalisekvenssia, jossa on usein hiivoissa kaytetyt kodonit.
EcoRI HindiII
_HetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5'AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3’ 1-2 3’GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'
AlaGlyPheAlaAlaLyel leSerAla 1-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3' 1-4 3 * CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'
Hgal_
Xhol B) Invertaasin signaalisekvenssin alakloonaus plasmidiin P31 a) Vektorin valmistus: 1,5 yg p31R/SS-TPA£2:ta (ks. eurooppalainen patent-tihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan 10 yksikolla EcoRI:ta (Boehringer) 50 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa.
Sen jålkeen lisataån 1 yl 2,5 M NaCl ja seuraavaksi 10 yksikkoå Xhol:ta (Boehringer) ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Eristetåån 4,3 ke:n vektori 0,8 %:sessa pre-paratiivisessa agaroosigeelissa. Geelisiivu siirretaån 48
Micro Colloidon-putkeen (Sartorius GmbH), peitetåan 200 yl:lla TE-liuosta ja elektroeluoidaan (elektroforesoidaan 90 mA:ssa 50 minuuttia). TE-liuos kerataån ja saostetaan 2,5 tilavuudella absoluuttista etanolia sen jalkeen, kun on lisatty 0,1 tilavuutta 1OxTNE-liuosta. DNA-pelletti peståån kylmalla 80 %:sella etanolilla ja kuivataan vakuu-missa. DNA uudelleensuspendoidaan 6 yl:aan TE-liuosta (40 pmol/yl).
b) Oligodeoksiribonukleotidien (1-1, 1-2, 1-3) 1-4) emaspariuttaminen, kinasointi ja liittaminen vektoriin
Liuosta, joka sisaltåa 10 pmol kutakin neljaa deok-siribonukleotidia 10 yl:ssa 0,5 M Tris.HCl pH 8, inkuboi-daan 95°C:ssa 5 minuuttia vesihauteella. Vesihaude jååh-dytetaan hitaasti 5 tunnin kuluessa 30°C:een. Tahån emås-pariutettuun seokseen lisatåån 0,1 *' MgC^, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT ja 4 mM ATP (2 yl kutakin liuosta): ja 8 yksik-k6å (1 yl) polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kinasointi suoritetaan 37°C:ssa 1 tunnissa. Emaspariutetut, kina-soidut oligodeoksiribonukleotidit ja 60 pmol EcoRI-XhoI-katkaistua p31R/SS-TPAÅ2-vektori-DNA:ta (1,5 yl) liitetMan yhteen 400 yksikolla (1 yl) T4 DNA-ligaasia (Biolabs) 14 °C:ssa 17 tunnissa. Reaktio pysaytetaan inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 10 yl:lla tåtå yhteenliittamisseosta 2 + transformoidaan E. coli HB101 Ca -solut (M. Dagert ja S.D. Ehrlich, Gene 56^, 23-28 (1979)). Poimitaan 20 ampR-pesåketta. DNA valmistetaan nopealla eristysmenetelmalla (D.S. Holmes ja M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)). DNA katkaistaan EcoRIrlla ja XhoI:lla, leima-taan radioaktiivisesti EcoRI-pSSsta ja analysoidaan 6 %: sessa polyakryyliamidigeelissa, joka sisaltåa 8 M ureaa, kåyttåmållå DNA-merkkinå radioaktiivisesti leimattua HaeIII:lla leikattua pBR322:ta. Kaikista 20 kloonista havaitaan oikeaa kokoa olevat vyohykkeet. Yhtå kloonia kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisaltåa 100y g/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetåån ja nimetåån p31RIT-12:ksi.
II
91160 49 C) pJDB207/PHO5-I-TPA:n rakentaminen a) Vektorin rakentaminen 3 yg pJDB207/PHO5-TPA18 (eurooppalainen patentti-hakemusjulkaisu no. 143 081) inkuboidaan 37°C:ssa 1 tunti 10 yksikon kanssa BamHIrtå 50 yl:ssa liuosta, ioka si-saltaa 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2/ 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia. Nayte tarkistetaan 1 %:sessa aga'roosigeelisså, joka on tehty TBE-liuokseen, jotta tåy-dellinen katkeaminen saadaan varmistetuksi. Hajoamistuo-tetta inkuboidaan 10 minuuttia 65°C:ssa. Sitten lisatåån ensin 0,5 yl 5 M NaCl ja 15 yksikkoå Xholrtå (Boehringer). Saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. 6,8 kern vek- tori eristetåån 0,8 %:sessa preparatiivisessa agaroosi-geelisså. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja liuotetaan saostamisen jålkeen TE-liuokseen.
b) p31/PH05-TPA18:n katkaisu Xholrllå: 30 yg p31PH05-TPA18 (eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 143 081) inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 60 yksikdn kanssa Xholrtå (15 yksikkda/yl) 200 ylrssa liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl pH 8, 6 mM MgC^, 150 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, uutetaan yhtå suurella ti-lavuudella fenoli-kloroformia ja saostetaan etanolilla.
c) Xholrllå leikatun p31/PH05-TPA18 osittainen katkaisu Pstlrllå
Saostettu, Xholrllå leikattu p31/PH05-TPA18-DNA uu-delleensuspendoidaan 250 ylraan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2» 50 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanolia ja 2,5 mg etidiumbromidia, inkuboidaan 35 minuuttia 37°Crssa 22,5 yksikdn kanssa Pstlrtå ja uutetaan ensin yhtå suurella tilavuudella fenolia ja sen jålkeen yhtå suurella tilavuudella kloroformi-isoamyylialkoholiseosta (50:1). 1,6 kern fragmentti eristetåån 1 %rsessa prepara tiivisessa agaroosigeelisså. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan (liitånnåinen 1).
50 d) p31RIT-12:n Sall-Xhol-katkaisu 30 yg p31RIT-12 inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa Sall:n (60 yksikkoå; Boehringer, 12 yksikkoå/yl) ja XhoI:n (60 yksikkdå; 15 yksikkoå/yl) kanssa 200 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 8, 6 mM MgC^r 150 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, uutetaan yhta suurella tilavuudella fe-noli-kloroformia ja saostetaan etanolilla. 869 emasparin fragmentti eristetaån 1,2 %:sessa preparatiivisessa aga-roosigeelisså. DNA uutetaan elektroeluutiolla, suola poistetaan DE-52:ssa ja suoritetaan etanolisaostus.
e) Sall-Xhol:11a katkaistun p31RIT-12 katkaisu Hgalillå
Sall-Xhol:11a katkaistu p3lRIT-12 uudelleensuspen-doidaan 100 yl:aan liuosta, jossa on 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^/ 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolia ja 10 mg naudan seerumialbumiinia, ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 6 yksikon kanssa Hgal:ta (Biolabs, 0,5 yksikkoå/y.l) . 600 emasparin fragmentti eristetaan 1,2 %:sessa agaroosigee-lissa. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan etanolilla.
f) Kytkijaoligonukleotidien emMspariuttaminen 90 pmol kutakin kahta oligodeoksiribonukleotidia, joiden sekvenssit ovat
PatI
5' CTGCATCTTACCAAGTGATCTGCA 3' 3’ AGAATGGTTCACTAG 5’ suspendoidaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 0,5 mM Tris.HCl pH 8, silikonoidussa Eppendorf-putkessa. Liuosta inkuboidaan 5 minuuttia 95°C:ssa ja sen jålkeen jaahdytetåan hi-taasti yon aikana huoneenlSmpdtilaan.
g) Kytkijån kinasointi
Edella saatuun liuokseen lisatMan 2 yl 0,1 M KC1-liuosta, 2 yl 0,1 M MgC^-liuosta, 3 yl 30 mM DTT-liuos- 91160 51 ta, 1 yl 200 mM ATP-liuosta ja 8 yksikkoa polynukleoti-dikinaasia (8 yksikkoå/yl). Saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa.
h) p31RIT-12:n Hgal-fragmentin liittåminen kinasoituun kytkijåån
Kinasoidun kytkijan liuos siirretåån putkeen, joka sisåltåa kuivan Hgal-fragmentin ja sen jalkeen lisåtåån 400 yksikkoa T4 DNA-ligaasia. Liuosta inkuboidaan huo-neenlåmpotilassa (21 - 22°C) 90 minuuttia, laimennetaan 100 yl:ksi TE-liuoksella ja uutetaan yhta suurella tila-vuudella fenoli-kloroformia. Fragmentti saostetaan li- . saamalla 0,6 tilavuutta isopropanolia ja 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia huoneenlåmpbtilassa vesiliuokseen.
i) Edellå saadun fragmentin katkaisu BamHI-PstI:11a
Edella saatu kuiva DNA katkaistaan BamHI:lla (10 yksikkba) ja Pstl:lla (10 yksikkoa) 20 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa.
Sen jålkeen liuos laimennetaan 100 yl:ksi, uutetaan yhta suurella tilavuudella fenoli-kloroformia ja vesikerros saostetaan isopropanolilla (liitannainen 2).
j) Kyseisten kolmen fragmentin yhteenliittMminen 100 pmol BamHI-Xhol-katkaistua pJDB207/PHO5-TPA18- vektorifragmenttia ja 200 pmol kutakin kahta liitånnSis- fragmenttia (1 ja 2) liitetaån yhteen 10 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2f 10 mM DTT, 2 mM ATP ja 0,5 yg liivatetta, kayttamallS 400 yksikkbå T4 DNA-ligaasia reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa.
Reaktio pysMytetåån inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa.
5 yl:lla tåtå reaktioseosta transformoidaan E. coli HB101 2+ R
Ca -solut. 10 amp -pesaketta poimitaan ja DNA valmiste-taan nopealla eristysmenetelmalla. Oikeankokoiset frag-mentit havaitaan analysoimalla EcoRItllM, Pstl:lla ja 52
BamHI-Hindlll:11a. Yhta kloonia kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisåltaå 100 yg/ml ampisilliinia. Plas-midi-DNA eristetåån ja nimetåån pKDB207/PHO5-I-TPA:ksi.
Esimerkki 10: Hiivan ilmentåmisvektorin rakentaminen, joka sisåltåå PH05-promoottorin, PH05:n signaalisekvens-sin tai invertaasin signaalisekvenssin ja sellaista t-PA:ta koodittavan alueen, josta vain neljås glykosyloi-tumiskohta on poistettu
Plasmidin pJDB207 BamHI-Hindlll-vektorifragmentti liitetaån pJDB207/PHO5-I-TPA:sta tai pJDB207/PHO5-TPA18: sta saatuun BamHI-Scal-fragmenttiin ja pJDB207/PHO5-TPA18-M0421(1):sta saatuun ScaI-HindII-fragmenttiin a) Vektorin rakentaminen: 3 yg plasmidia pJDB207 katkaistaan BamHI:llå ja HindIII:lla ja 6,6 ke:n vektori eristetaan. DNA saoste-taan etanolilla elektroeluution jålkeen.
b) pJDB207/PHO5-TPA-MO421(1):n Scal-Hindlll-katkaisu: 1.5 yg plasmidi-DNA:ta katkaistaan 7 yksikollå Seal:ta (Boehringer) ja 6 yksikollå HindIII:a 20 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pJ 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Fenoloinnin ja saostuksen jålkeen eristetaan 987 emåsparin fragmentti 1,2 %:sessa prepa-ratiivisessa agaroosigeelisså (liitånnåinen 1).
c) pJDB207/PHO5-TPA18:n japJDB207/PHO5-I-TPA:n BamHI-Scal-katkaisu: 1.5 yg kutakin plasmidia katkaistaan 7 yksikollå BamHI:tå ja 7 yksikollå Scal:tå 20 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Fenoloinnin ja etanolisaostuksen jålkeen 1300 emåsparin fragmentit eristetåån 1,2 %:sessa pre- 53 91160 paratiivisessa agaroosigeelissa (liitånnåinen 2).
d) Kyseisten kolmen fragxnentin yhteenliittaminen: 100 pmol BairKI -Hindi 11 -katkaistua pJDB207 /PH05-TPA1 R-vpktryri -fragmenttia ja 200 pmol kahta muuta liitånnåistå kutakin (1 ja 2) liitetaan yhteen 10 yl:ssa liuosta, joka sisaltaa 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP ja 0,5 yg liivatetta, kayttamållå 400 yksikkoa T4 DNA-ligaasia reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. Reak-tiot pysaytetaan inkuboimalla 65°C:ssa 10 minuuttia.
5 yl:lla tata yhteenliittåmisseosta transformoidaan E.
2 + R
coli HB101 Ca -solut. Poimitaan 10 amp -pesaketta ja DNA valmistetaan nopealla eristamismenetelmalla. Oikeaa kokoa olevat fragmentit havaitaan, kun analysoidaan EcoRI: 11a, Pstlrlla ja BamHI-Hindlll:11a. Kustakin kahdesta rakentamisesta saatuja klooneja, yhta kustakin, kasva- tetaan erikseen 100 mlsssa LB-alustaa, joka sisaltaa 100 yg/ml ampisiilliinia. Plasmidi-DNA:t eristetSån ja nimetSSn pJDB207/PHO5-TPA18-M04:ksi ja pJDB207/PHO5-I- TPA-M04:ksi.
Esimerkki 11: Mutatoituneiden t-PA-geeniliitannaisten kloo-naus hiivan ilmentamisvektoriin, joka sisaltaa PH05-pro-moottorin ja invertaasin signaalisekvenssin
Plasmidin pJDB207 BamHI-Hindlll-vektorifragmentti liitetåån pJDB207/PHO5-I-TPA:sta saatuun BamHI-Narl-fragmenttiin ja mutatoituneen t-PA-geenin Barl-Hindlll-fragmenttiin.
a) RF-DNA:n valmistus: RF-DNA valmistetaan ρ8Α-7-Μ01:stS, p8A-7-M02:sta, p8A-7-M021:stå, p8A-7-M0421 :sta, p8A-7-M0421(1) :stS ja p8A-7-M04321(1):sta.
b) Narl-Hindlll-liitSnnaisten eristaminen mutatoituneista t-PA-geeneista: 54
Kukin kuudesta RF-DNA:sta (1 yg) katkaistaan erik-seen 6 yksikolla Narl:tå (Biolabs) 2 yl:ssa liuos-ta, joka sisåltåå 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C: ssa. Katkaisuseosta inkuboidaan 10 minuuttia 65°C:ssa ja sen jalkeen lisåtåån 1 yl 1 M NaCl ja seuraavaksi vielå 6 yksikkoå HindIII:a. Kun on inkuboitu 1 tunti 37 °C:ssa, lisåtåån RNaasia (2 yl/0,5 yg/yl). Inkuboidaan 15 minuuttia 37°C:ssa, fenoloidaan ja DNA saostetaan etanolilla. 1450 emåsparin DNA-fragmentit eristetåån 1,2 %:sessa preparatiivisessa agaroosigeelisså. DNA:t uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan etanolilla (lii-tånnåinen 1).
c) BamHI-Narl-liitånnåisen eriståminen: 3 yg pJDB207/PHO5-I-TPA:ta katkaistaan 6 yksikolla Narl:ta 20 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.
HC1 pH 7,5, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sitten lisatåån 2 yl 1M NaCl ja vielå 6 yksikkoå BamHI:tå. Kun on inkuboitu 1 tunti 37°C:ssa ja fenoloitu, DNA saostetaan etanolilla.
930 emåsparin DNA-fragmentti eristetåån 1,2 %:sessa preparatiivisessa agaroosigeelisså. DNA uutetaan elektroeluutiolla ja saostetaan etanolilla (liitånnåinen 2).
d) Vektorin valmistaminen: 3 yg pJDB207:åå katkaistaan BamHI:llå ja Hindlll: 11a ja 6,6 ke:n vektori eristetåån. Elektroeluution jål-keen DNA saostetaan etanolilla.
e) Kyseisten kolmen fragmentin yhteenliittåminen
100 pmol BamHI-Hindlll-katkaistua pJDB207/PHO5-TPAl8-vektorifragmenttia ja 200 pmol kutakin kahdesta muusta liitånnåisfragmentista (1 ja 2) liitetåån yhteen 10 yl:ssa liuosta, joka sisåltåå 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM
MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP ja 0,5 yg liivatetta, kåyttå-
II
91160 55 mållå 400 yksikkoå T4 DNA-ligaasia reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. Reaktiot pysaytetåån inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 5 yl:lla tåtå reaktioseosta transformoidaan E. coli HB101 Ca++-solut. Poimitaan 10 amp -pesakettå ja DNA valmistetaan nopealla eristysmene-telmållå. Oikeaa kokoa olevat fragmentit havaitaan EcoRI-, PstI- ja BamHI-Hindlll-analyysillå. Kustakin kuudesta rakentamisesta kasvatetaan yhtå kloonia erikseen 100 ml: ssa LB alustaa, joka sisåltåå 100 yg/ml ampisilliiniå. Plasmidi-DNA:t eristetåån ja nimetåån seuraavasti: pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2, pJDB207/ PH05-I-TPA-M021, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421, pJDB207/PHO5-I-TPA-M0421(1) ja pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4321 (1) .
Esimerkki 12: Saccharomyces cerevisiae GRF18:n trans- formointi
Kukin plasmideista pJDB207/PHO5-TPA18-M01, pJDB207/ PH05-TPA18-M02, pJDB207/PHO5-TPA18-M04, pJDB207/PHO5-TPA18-M021, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421, pJDB207/PHO5-TPA18-421(1), pJDB207/PHO5-TPAl8-MO4321(1), pJDB207/PHO5-I-TPA-M01, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4, pJDB207/PHO5-1-TPA—MO21, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421, pJDB207/PHO5-I-TPA—M0421(1) ja pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4321(1) siirretåån Saccharomyces cerevisiae-kantaan GRF18 (a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR) kåyttåmålla Hinnen et al:n transformointimenetelmåå ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)). 5 yg kutakin plasmidi-DNA:ta lisåtåån erillisesti 100 yl:aan sferoplastisuspensiota ja seos kåsitellåån polyetyleeniglykolilla. Sitten sfero-plastit sekoitetaan 10 ml:aan regenerointiagaria ja kasvatetaan hiivan minimialustamaljoissa ilman leusiinia.
Kun on inkuboitu 3 vuorokautta 30°C:ssa, saadaan noin 200 transformoitunutta solua.
Kustakin hiivantransformoinnista poimitaan yksi pe-såke. Eri pesåkkeet nimetåån seuraavasti: 56
Saccharomyces cerevieae GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M01 Saccharomyces cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M02 Saccharomyces cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M04 Saccharomycea cereviaae GRF18/pJDB207/PHO3-TPA18-M021 Saccharoaycea cereviaae GRT18/pJDB207/PH05-TPA18-M0421 Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M0421(1) Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M04321(1) Saccharoaycea cereviaae CKFl8/pJDB207/PH05-I-TPA-M01 Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M02 Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M04 Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M021 Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PHQ5-I-TPA-MO421 Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-MO421(1) Saccharoaycea cereviaae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M04321(1)
Esimerkki 13: Saccharomyces cerevisiae HT246-kannan trans- formointi S. cerevisiae-kanta HT246 saadaan takaisinristeyttå-mållå toistuvasti S. cerevisiae-mutanttikanta HT232, jolta puuttuu proteaasi B-aktiivisuus (D.H. Wolf et al., (toim. G.N. Cohen ja H. Holzer, toim.), Limited Proteolysis in Microorganisms, konferenssiraportti, Bethesda 1978, s. 61),;ja S. cerevisiae H423 (eurooppalainen patenttijul-kaisu no. 143 081).
S. cerevisiae HT246 transformoidaan plasmideilla PJDB207/PH05-TPA18-M01, pJDB207/PH05-TPA18-M02, pJDB207 / PH05-TPA18-M04, p JDB207 / PH05-TPA18-M021, pJDB207/PH05—TPA18-M0421, pJDB/PH05-TPA18-421(l) , pJDB207/PH05-TPA18-M04321(1), pJDB207/PH05-I-TPA-M01, pJDB207/PH05-I-TPA-M02, pJDB207/PH05-I-TPA-M04, pJDB207/PH05-I-TPA-M021, pJDB207/PH05-I-TPA-M0421, PJDB207/PH05-I-TPA-M0421 (1) ja pJDB2Q7/PH05-I-TPA-HO4321 (1) kåyttåmalla Hinnen et al:n transformointimenetelmaa (supra) ja valitsemalla leusiiniprototrofian perusteella (ks. esimerkki 12). Kustakin transformoinnista poimitaan yksi li 91160 57 klooni ja ne nimetåån seuraavasti:
Saccharomyces cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M01 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-IPA18-M02 Saccharomyces cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M04 Saccharomycee cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M021 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M0421 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M0421(1) Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M04321(1) Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PHQ5-I-TPA-M01 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PHO5-1-TPA-M02 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJPB207/PH05-I-TPA-M04 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-M021 Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-M0421 Saccharomycea cerevlaae Hl246/pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1) Saccharomycea cerevlaae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-M04321(1)
Esimerkki 14: Uutteiden valmistaminen hiivasoluista ja t-PA-aktiivisuuden maMrittSminen
Hiivasoluja kasvatetaan 50 ml:n Erlenmeyer-pulloissa 30°C:ssa 20 ml:ssa HE-17-alustaa (8,4 g Yeast Nitrogen Base: a (Difco), 10 g L-asparagiinia (Sigma), 1 g L-histi-diinia (Sigma), 40 ml 50 %:sta glukoosia per litra liuos-ta) ravistelemalla 24 tuntia, kunnes tiheys 8-10x10^ solua/ ml on saavutettu. Solut sentrifugoidaan talteen ja uudel-leensuspendoidaan 10 ml:aan 0,9 % NaCl-liuosta. 2 ml:11a uudelleensuspendoituja soluja ympataan 50 ml matala-P.-minimialustaa (kuten eurooppalaisessa patenttihakemusjul-kaisussa no. 143 081 on kuvattu), johon on lisåtty 10 g/1 asparagiinia (Sigma) ja 10 g/1 L-histidiinia (Sigma) 250 ml:n Erlenmeyer-pulloissa. Inkuboidaan 30°C:ssa nopeudel-la 250 1/min.
10 ml:sta matala-P^-alustaa otetaan solut talteen 24 ja 48 tunnin kuluttua sentrifugoimalla 10 minuuttia no- 58 peudella 3000 1/min Falcon 2070-putkissa. Solut peståån kerran 10 ml:11a matala-P^-alustaa ja sentrifugoidaan. Solupelletti suspendoidaan lyysipuskuriin (66 mM kalium-fosfaatti pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem)). Solu-suspensioon lisåtaan 8 g lasihelmia (0,5 - 0,75 mm:n halkai-sija) ja pieni lasitanko ja saatua suspensiota ravistel-laan Vortex-sekoittajassa (Scientific Instruments Inc., USA) taydella nopeudella 4x2 min 2 minuutin valein jåan påålla. Yli 90 % soluista rikkoutuu talla menetelmallå. Solujatteet ja lasihelmet sentrifugoidaan pohjaan 4°C:ssa 5 minuutissa nopeudella 3000 l/min. Emaliuos siirretåSn Eppendorf-putkiin.
t-PA-aktiivisuus mååritetåån kolorimetrisella mene-telmållå julkaisun J.H. Verheijen et al., Thromb. Haemost. 48, 226 (1982) mukaisesti.
Saaduista tuloksista on esitetty yhteenveto taulu-kossa 1.
Taulukko 1 S. cerevieiae-kanta ky/l/ODggo yg/l/ODg00 GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M01 250 9 GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M021 950 34 GRFI8/pJDB207/PH05-TPA18-M0421 650 23 HT246/pJDB207/PH05~TPA18-M01 1112 40 HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M021 5330 190 HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M0421 2240 80 HT246/pJDB207/PH05-TPA18 (control) 1112 40 ky = xansainvålinen yksikkO °Dftno= °Ptinen tiheys 600 nm:ssa
Esimerkki 15: Transformoituneiden hiivakantojen fermen- tointi 3 litran mittakaavassa
Kaikkia transformantteja sailytetSan nestetypen (hoy-ryfaasi) lampbtilassa alustassa, jonka koostumus on seuraa- 91160 59 va (mååråt g/1): natriumglutamaatti 50 sakkaroosi 50 destraani 50 3 litran fermentointia vårten valmistetaan kusta-kin transformoituneesta S. cerevisiae-kannasta kaksi esi-viljelmåå:
Yksi kierukallinen tuoreita agar-vinopinnalla kasva-neita soluja siirretåån 50 ml:aan esiviljelyalustaa, joka sisaltaa (g/1)
Yeast Nitrogen Base:a (Difco 0919-15) 8,4 L-asparagiinia 10 L-histidiiniå 1 glukoosia 20 ja inkuboidaan 30°C:ssa nopeudella 180 1/min 48 tuntia.
10 % ensinunMisestå esiviljelmåstå siirretåån toiseen esivil jelmaån ja inkuboidaan viela 24 tuntia.
Toinen esiviljelma sentrifugoidaan, solut uudelleen-suspendoidaan 0,9 %:seen NaCl-liuokseen ja silla ympataan 3 litran fermentointialusta, jonka koostumus on seuraava (g/1): glukoosi 20 bacto-peptoni 15 airanoniumsulfaatti 3 hiivauute, oksoidi 1 L-histidiini 0,1
MgS04-7H20 1 niin, etta optiseksi tiheydeksi tulee 0,2 (ODgQg).
Fermentoinnit suoritetaan 3 litran MBR-bioreaktoris-sa (MBR Bio Reactor AG, Wetzikon, Sveitsi) 30°C:ssa se-koitusnopeudella 500 kierr./min ja ilmastusnopeudella 150 1/h. 48 tunnin kuluessa saavutetaan optinen tiheys noin 12. Viljelmå jaahdytetaån 4°C:een, sentrifugoidaan ja solupelletti uudelleensuspendoidaan 150 ml:aan rikkomis- 60 puskuria, joka sisåltåå 4 mM Zwittergent 9-14 (Calbiochem) 50 mM fosfaattipuskurissa pH 7,4.
Lisåtåån 150 g lasihelmiå (halkaisija 0,5 mm) ja soluja rikotaan 30 minuuttia asennossa 5 moniputkivir-laajassa (Scientific Manufacturing Industries, USA).
Esimerkki 16: Tuotetun mutantti-t-PA:n puhdistus
Rikottujen solujen suspensio (ks. esimerkki 14) sentrifugoidaan ja emaliuokseen lisåtåån kiinteata am-moniumsulfaattia kunnes ammoniumsulfaatin kyllåstymis-aste on 35 %. Suspensio sentrifugoidaan ja pelletti liuo- tetaan 0,2 M ammoniumasetaattiin, joka sisåltåå 0,1 %
R R
Synperonic PE/68. 5 g (markapaino) Sepharose -4B-helmiin liitettya DE-3-rinhibiittoria lisataån ja suspensiota sekoitetaan hitaasti 4°C:ssa yon yli. Helmet erotetaan liuoksesta, peståån kahdesti 0,2 M natriumkloridiliuok- £ sella, joka sisaltåå 0,1 % Synperionic , pakataan pyl- vååseen, jonka halkaisija on 10 mm ja peståån 1C ml:11a 0,2 M natriumkloridiliuosta, joka sisåltåå 0,1 % Synper-£ onic :ia,ja sen jålkeen peståån 10 ml:11a liuosta, joka sisåltåå 0,2 M NH.SCN, 0,2 M ammoniumasetaattia ja 0,1 % Synperonic :ia. Sitten t-PA eluoidaan liuoksella, joka sisåltåå 1,2 M NH.SCN, 0,2 M ammoniumasetaattia ja 0,1 % Synperonic :ia, virtausnopeudella 30 ml/h.
Jakeet, joilla on suurin fibrinolyyttinen aktiivi-suus, yhdistetåån. Keråttyå liuosta, joka sisåltåå mu-tantti-t-PA:n, jonka puhtausaste on noin 90 % tai yli, kåytetåån ominaisuuksien måårityksiin ja biologisiin . måårityksiin.
Esimerkki 17: Mutantti-t-PA-lajien aktiivisuus biologi- sissa måårityksisså
Ilmentåmisplasmidit pJDB207/PHO5-TPA18-M01, pJDB207/PHO5-TPA18-M02, pJDB207/PHO5-TPA18-M04, pJDB207/PHO5-TPA18-M021, pJDB207/PHO5-TPA18-M0421, pJDB207/PHO5-TPAl8-M0421(1), pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1,
II
91160 61 ρ ΦΒ207/PHO5—1-TPA—MO2, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4, pJDB207/PH05-I-TPA-M021, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421 ja pJDB207/PH05-I-TPA—M0421(1) S. cerevisiae-kantaan HT246 sijcitettuina saavat aikaan biologisesti aktiivisten 119 mutantti-t-PA-lajien syntymisen, jotka cvat (Asn }-t-PA, (Ala186)-t-PA, (Ala450-t-PA), (Asn119,Ala186)-t-PA, (Asn119, Ala186,Asn450)-t-PA ja (Asn119,Ala186,Ala450)-t-PA, joiden aktiivisuus on samanlainen tai parempi kuin hiivan normaalin t-PA:n aktiivisuus. Kaikki mutant- ti-t-PA:t osoittavat aktiivisuutta kaseiinilevyilla ja fibriinilevyillå (J. Jespersen et al., Haemostasis 18, 301 (1983)) kolorimetrisesså maarityksessS, joka on se- lostettu julkaisussa J.H. Verheijen et al., Thromb.
Haemost. £8, 266 (1982), ja fluorometrisessa maarityk-sessa kayttamSlla Cbz-Gly-Gly-Arg-AMS:aa substraattina (M. Zimmermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)).
Fluorometrista måSritystS vårten kaikki t-PA-liuok-set laimennetaan tarkalleen pitoisuuteen 20 FU/ml (0,28 yg/ml) 60 mM fosfaattipuskuriin, pH 7,4, joka sisål-taa 0,01 % Tween 80 ja 0,05 % HSA. Todetaan, etta ncin 90 % kaikista t-PA-lajeista on yksiketjuisessa muodcssa ja noin 10 % kaksiketjuisessa muodcssa.
Suoritetaan kokeet eri mutantti-t-PA-laatujen veri-hyytymia liuottavan aktiivisuuden maarittamiseksi kaytta-malla periaatteessa menetelmaa R.D. Philo ja P.J. Gaffney, Thromb. Haemost. £5, 107-109 (1981).
Kun liukenemisajan logaritmi piirretaan t-PA-pitoi-suuden logaritmin funktiona, saadaan suora viiva, jonka kulma edustaa kaytetyn plasminogeeninaktivaattorin fib-riinispesifisyytta. Vertailua vårten voidaan mSSrittaa standardivalmisteen hyytymia liuottava aktiivisuus kan-sainvålisinå yksikkoinå per ml (IU/ml). Eri mutantti-t- PA-laaduille saadut tulokset on esitetty kuvassa 3.
119
Kuvasta voidaan havaita, etta (Asn )-t-PA (suora 3) ja (Asn119,Ala188)-t-PA (suora 4) liuottavat hyytymia in vitro suunnilleen samalla kulmalla kuin referenssircela- 62 nooma-t-PA (suora 1). Voidaan paåtellå, etta kaikilla mitatuilla t-PA-laaduilla on samanlainen fibriiniaktii-visuus. Kuitenkin (Asn ,Ala ,Asn )-t-PA (suora 5) liuottaa hyytymia noin kaksi kertaa nopeammin kuin mela-nooma-t-PA, hiivan normaali t-PA (suora 2, ks.
eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081), (Asn )-t-PA tai (Asn ,Ala )-t-PA.
Edella kuvatuissa maarityksissa saaduista aktiivi-suussuhteista (kansainvalista yksikkoa/ml? IU/ml) on esi-tetty yhteenveto taulukossa 2.
Taulukko 2
VIU/FU CIU/FU CIU/VIU
et-PA 4.1 3.3 1.2 normaali t-PA 2.5 4.7 1.9 lAsn11’]-t-PA 3.2 5.1 1.6 (Asn119 , Ala1*4 J-t-PA 3.8 5.4 1.4 (Asn11’, Ala1·4, Asn44*]-t-PA 5.4 12.1 2.2 VIU = IU Verjeijen et al:n mukaan (supra) FU = fluorometrista yksikkoå Zimmermann et al:n mukaan (supra) CIU = hyytyman liukeneminen IU Philo et al:n mukaan (supra)
Esimerkki 18: Immunologinen havaitseminen
Epapuhtaista hiivauutteista puhdistetun t-PA:n hyytymia liuottava aktiivisuus tunnistetaan Western:in blottauksella kayttamallS melanoona-t-PA:ta vastaan koh-distettuja kanin polyklonaalisia vasta-aineita.
Noin 12 FU (FU = fluorometrinen yksikkS) erilaisia t-PA-molekyyleja erotetaan polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla kayttamalla 12,5 %:sia geeleja pelkistavissa olosuhteissa.
Sen jalkeen proteiini siirretaan nitroselluloosa-
II
91160 63 kalvolle noudattamalla periaatteessa valmistajan ohjeita (Schleicher & Schuell, Feldbach, Sveitsi). Siirto suori-tetaan siirtopuskurissa (g/1: glysiinia 14,4, Trisria 3 ja metanolia 20 %) 2,5 tunnissa (40 V/cm). Kun on tu-kittu 1 tunti 3 %:sella BSArlla, nitroselluloosaa inku-boidaan ydn yli vasta-aineen kanssa (kanin seerumi, 100 μ1/40 ml BSA-puskuria) 125
Sitten vasta-aine-t-PA-komplekseja peitetaan J-proteiinilla A (4 yCi/40 ml BSA-puskuria) 2 tuntia.
Kun on pesty perusteellisesti, nitroselluloosakalvo kuvataan rontgenfilmille. Saatu tulos on esitetty kuvassa 4. Kaikki mutantti-t-PA-laadut havaitaan polyklonaali-sella vasta-aineella ja niissa ilmenee glykolyyttisten sivuketjujen puuttumisen aiheuttama pienempi koko. Yksi mutaatio vastaa noin 1 kD:n pienenemista molekyylipai-nossa.
Esimerkki 19. Mutantti-t-PA-laatujen glykosyloitumis-aste 1 25
Glykosyloituminen mååritetåån J-konkanavaliini A-peittomenetelmalla geelielektroforeesin jalkeen. Konkana-valiini A on kasvilesitiini, joka tunnistaa spesifisesti mannoositahteita. Jalleen sijoitetaan 12 FU:ta kutakin mutanttia 12,5 %:seen polyakryyliamidigeeliin. Sitten kyseisia 10 proteiinia kiinnitetaån 30 minuuttia 7 %:sessa etikkahapossa. Sitten geeli peståan lesitiinipuskurissa, jolla on seuraava koostumus: 0,15 M NaCl 50,0 mM Tris pH 7,4 0,5 mM CaCl2 0,5 mM MnCl2
Pesua jatketaan, kunnes pH saavuttaa arvon 7,3.
Sitten geeli peitetaan huolellisesti 2 ml:11a lesi- tiinipuskuria, joka sisåltåå 3 mg hemoglobiinia, 100 yg 125 konkanavaliini A:ta ja 2 yCi J-konkanavaliim A:ta.
Kun on inkuboitu yon yli kosteuskammiossa, geeli 54 peståån perusteellisesti lesitiinipuskurilla, kuivataan ja kuvataan rontgenfilmille. Kaikki mutantti-t-PA-laa- 125 dut vårjåytyvåt j-konkanavaliini A:lla. Koska jopa (Asn119,Ala185,Asn^°,Ala450)-t-PA reagoi hieman lesi-siinin kanssa, on pååteltavisså, etta tåma mutantti si-saltaå happeen kytkettyjå sokeriryhmåjååmiå.
Esimerkki 20: Farmaseuttinen valmiste parenteraalista antoa vårten
Liuos, joka sisåltåå (Asn119,Ala188,Ala450)-t-PA: ta yksiketjuisessa muodossa, kaksiketjuisessa muodossa tai nåiden seoksena, dialysoidaan 0,3 M natriumkloridia p vasten, joka sisåltåå 0,01 % Tween 80 , ja sen jålkeen varastoidaan -80°C:ssa. Ennen antamista pitoisuudeksi saadetåan 75 yg/ml kokonais-t-PA:ta (so. yksiketjuinen plus kaksiketjuinen t-PA) ja 0,3 M NaCl. Liuos steri- loidaan suodattamalla 0,22 ym:n kalvosuodattimen lapi.
Edellåmainitun t-PA:n tilalla on myds mahdollista kåyttåa edellisissa esimerkeisså kuvattuja muita t-PA- 119 186 laatuja, kuten esimerkiksi (Asn )-t-PA, (Ala )-t-PA, (Ala450)-t-PA, (Asn119,Ala186)-t-PA tai (Asn119,Ala186, Asn450)-t-PA.
Tåma menetelmå soveltuu yksiketjuisessa muodossa ole-van mutantti-t-PA:n, kaksiketjuisessa muodossa olevan mu-tantti-t-PA:n tai nåiden seoksen liuosten valmistukseen parenteraalista, kuten intravenoosista, antoa vårten.

Claims (9)

91160 Patenttivaatimukset;
1. Menetelma modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi, jonka aminohapposekvenssi on A1.n6-Asn“Ser-Y,-A12o.,83-Asn“Gly-Y2-A,87-217-Asn“Pro-Ser-A22,^47-Asn-Arg-Y4-A451.527 (I·) jossa A].116 edustaa N-paan aminohapposekvenssiå, joka kat-taa kypsån t-PA:n aminohapot 1 - 116, A120-i83 edustaa kypsån t-PA:n aminohapot 120 - 183 kattavaa aminohapposekvenssia, A18?.2l7 edustaa kypsån t-PA:n aminohapot 187 - 217 kattavaa aminohapposekvenssiå, A^^ edustaa kypsån t-PA:n aminohapot 221 - 447 kattavaa aminohapposekvenssiå, A4S1_527 edustaa C-påån aminohapposekvenssiå, joka kattaa kypsån t-PA:n aminohapot 451 - 527, ja a) Yj on Ser, Y2 on geneettisesti kooditettu amino-happo, joka ei ole Ser eikå Thr, ja Y4 on Thr, tai b) Yj ja Y2 ovat kumpikin Ser ja Y4 on geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eikå Thr, tai c) γι/ *2 ja Y4 ovat kukin toisistaan riippumatta geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eikå Thr, yksi- tai kaksiketjuisessa muodossa, tunnettu siitå, ettå sopivissa ravinne-olosuhteissa viljellåån transformoitunutta eukaryoottista isåntåkantaa, joka sisåltåå mainittua ihmisen t-PA-prote-iinia koodittavan DNA-sekvenssin, ja eristetåån mainittu ihmisen t-PA-proteiini.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå valmistetaan (Ala,w)-t-PA.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå valmistetaan (Ala450)-t-PA.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå valmistetaan (Asn119, Ala186, Asn450) -t-PA.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå valmistetaan (Asn119, Ala1®6, Ala450) -t-PA.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitå, etta proteiini on yksiketjuisessa muodossa.
7. DNA, tunnettu siitå, etta silla on DNA-sekvenssi, joka koodittaa modifioitua ihmisen t-PA-pro-teiinia, jonka aminohapposekvenssi on Ai.i16-Asn-Ser-Yi-A12o-183-Asn-Gly“Y2-A187.2i7-Asn-Pro-Ser- ^221-447-ASn-Arg-Y4-A451.527 ( I ' ) jossa Ami6 edustaa N-paan aminohapposekvenssia, joka kat-taa kypsan t-PA:n aminohapot 1 - 116, A120.183 edustaa kyp-san t-PA:n aminohapot 120 - 183 kattavaa aminohapposekvenssia, Alg7.217 edustaa kypsan t-PA:n aminohapot 187 - 217 kattavaa aminohapposekvenssia, A^.447 edustaa kypsan t-PA:n aminohapot 221 - 447 kattavaa aminohapposekvenssia, A4S1.S27 edustaa C-paan aminohapposekvenssia, joka kattaa kypsan t-PA:n aminohapot 451 - 527, ja a) Yj on Ser, Y2 on geneettisesti kooditettu amino-happo, joka ei ole Ser eikå Thr, ja Y4 on Thr, tai b) Y, ja Y2 on kumpikin Ser ja Y4 on geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eikå Thr, tai c) Yw Y2 ja Y4 ovat kukin toisistaan riippumatta geneettisesti kooditettu aminohappo, joka ei ole Ser eikå Thr, joka t-PA-proteiini on yksi- tai kaksiketjuisessa muodossa.
8. Yhdistelmåvektori, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå promoottorin ja patenttivaatimuksen 7 mukai-sen DNA-sekvenssin, joka on mainitun promoottorin tran-skriptionaalisessa ohjauksessa.
9. Transformoitu hiiva, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå patenttivaatimuksen 7 mukaisen DNA-sek-venssin. 91160
FI864654A 1985-11-18 1986-11-14 Menetelmä modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi FI91160C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8528321 1985-11-18
GB858528321A GB8528321D0 (en) 1985-11-18 1985-11-18 Modified fibrinolytic agents

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI864654A0 FI864654A0 (fi) 1986-11-14
FI864654A FI864654A (fi) 1987-05-19
FI91160B FI91160B (fi) 1994-02-15
FI91160C true FI91160C (fi) 1994-05-25

Family

ID=10588363

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI864654A FI91160C (fi) 1985-11-18 1986-11-14 Menetelmä modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0225286B1 (fi)
JP (1) JPS62272976A (fi)
KR (1) KR920007666B1 (fi)
AT (1) ATE78514T1 (fi)
AU (1) AU598490B2 (fi)
DE (1) DE3686136T2 (fi)
DK (1) DK174977B1 (fi)
ES (1) ES2043607T3 (fi)
FI (1) FI91160C (fi)
GB (1) GB8528321D0 (fi)
GR (1) GR3006041T3 (fi)
IE (1) IE57866B1 (fi)
IL (1) IL80659A (fi)
NO (1) NO175266C (fi)
NZ (1) NZ218305A (fi)
PT (1) PT83752B (fi)
ZA (1) ZA868689B (fi)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE81135B1 (en) * 1984-10-01 2000-03-22 Genzyme Corp Recombinant DNA techniques and the products thereof
ZA869626B (en) * 1985-12-23 1987-10-28 Chiron Corp Peptide plasminogen activators
US5837518A (en) * 1986-01-31 1998-11-17 Genetics Institute, Inc. Thrombolytic proteins
US5258298A (en) * 1986-01-31 1993-11-02 Genetics Institute, Inc. Deletion and glycosylation mutant of human tissue plasminogen activator
US5002887A (en) * 1986-01-31 1991-03-26 Genetics Institute, Inc. Truncated thrombolytic proteins
IE81073B1 (en) * 1986-03-18 2000-01-12 Genentech Inc Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation
US5589361A (en) * 1986-03-18 1996-12-31 Genentech, Inc. Human tissue-type plasminogen activator variant
US5047241A (en) * 1986-07-11 1991-09-10 American Home Products Corporation Tris-Kringle plasminogen activator with novel K2 insert
EP0276846A3 (en) * 1987-01-29 1989-07-26 Zymogenetics, Inc. Colony-stimulating factor derivatives
JPH084501B2 (ja) * 1987-03-20 1996-01-24 エーザイ株式会社 糖鎖に関する変異ｔＰＡ
SE8702562L (sv) * 1987-06-18 1988-12-19 Kabigen Ab Nya fibrinolytiska enzymer
US6682733B1 (en) * 1987-06-18 2004-01-27 Roche Diagnostics, Gmbh Fibrinolytic enzymes
US5266474A (en) * 1987-06-24 1993-11-30 Genentech, Inc. Balanced inducible transcription system
US5302390A (en) * 1987-07-01 1994-04-12 Beecham Group Plc Hybrid proteins of human plasminogen and human t-PA, pharmaceutical compositions and methods of treatment
EP0394261A4 (en) * 1987-07-06 1991-09-11 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
AU1893988A (en) * 1987-07-13 1989-01-19 Collaborative Research Inc. Nonglycosylated plasminogen activator and method of preparation
US5346824A (en) * 1988-05-20 1994-09-13 Genentech, Inc. DNA encoding variants of tissue plasminogen activators and expression vectors and hosts thereof
US5270198A (en) * 1988-05-20 1993-12-14 Genentech, Inc. DNA molecules encoding variants of tissue plasminogen activators, vectors, and host cells
IL90146A (en) * 1988-05-20 1994-10-07 Genentech Inc Glycosylation derivatives of tissue plasminogen activator
US5258180A (en) * 1988-09-02 1993-11-02 Genetech, Inc. Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment
US5714145A (en) * 1988-09-02 1998-02-03 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
US5262170A (en) * 1988-09-02 1993-11-16 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells
US5108901A (en) * 1988-09-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
WO1991015235A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 Survival Technology, Inc. t-PA ENHANCER PROFILE
US5242688A (en) * 1990-12-24 1993-09-07 Eli Lilly And Company Method of treating thromboembolic disorders by administration of diglycosylated t-pa variants
ATE155816T1 (de) * 1992-06-03 1997-08-15 Genentech Inc Varianten des gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter therapeutischer wirkung
HUT72926A (en) * 1993-08-04 1996-06-28 Ciba Geigy Ag High molecular weight desulphatohirudin
US6706504B1 (en) 1996-11-12 2004-03-16 The Scripps Research Institute Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use
US20150239929A1 (en) * 2012-06-14 2015-08-27 Portola Pharmaceuticals, Inc. Method for purification of recombinant factor xa derivatives

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR241654A1 (es) * 1982-05-05 1992-10-30 Genentech Inc Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano.
SU1662352A3 (ru) * 1982-05-05 1991-07-07 Генентек, Инк (Фирма) Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент активатора плазминогена тканевого типа
EP0125254A1 (en) * 1982-10-28 1984-11-21 Beecham Group Plc Enzyme derivatives and their use in the treatment of thrombosis
AU572108B2 (en) * 1983-01-19 1988-05-05 Genentech Inc. Human tpa production using vectors coding for dhfr protein
IE81135B1 (en) * 1984-10-01 2000-03-22 Genzyme Corp Recombinant DNA techniques and the products thereof
DE3537176C2 (de) * 1984-10-18 1994-06-09 Zymogenetics Inc Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung
JPH0811066B2 (ja) * 1985-09-30 1996-02-07 インテグレーテッド・ジエネティックス・インコーポレーテッド 組換えｄｎａが生産するヒト子宮プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−

Also Published As

Publication number Publication date
JPS62272976A (ja) 1987-11-27
IL80659A0 (en) 1987-02-27
NO175266C (no) 1994-09-28
DK549186A (da) 1987-05-19
NO864569L (no) 1987-05-19
IE57866B1 (en) 1993-05-05
FI864654A (fi) 1987-05-19
GB8528321D0 (en) 1985-12-24
IE863028L (en) 1987-05-18
GR3006041T3 (fi) 1993-06-21
PT83752A (en) 1986-12-01
EP0225286B1 (en) 1992-07-22
ZA868689B (en) 1987-06-24
FI864654A0 (fi) 1986-11-14
DK549186D0 (da) 1986-11-17
EP0225286A2 (en) 1987-06-10
ES2043607T3 (es) 1994-01-01
DE3686136T2 (de) 1992-12-17
PT83752B (pt) 1989-06-30
IL80659A (en) 1991-12-15
DE3686136D1 (de) 1992-08-27
AU6520086A (en) 1987-05-21
KR870005094A (ko) 1987-06-04
KR920007666B1 (ko) 1992-09-14
AU598490B2 (en) 1990-06-28
FI91160B (fi) 1994-02-15
ATE78514T1 (de) 1992-08-15
DK174977B1 (da) 2004-04-05
EP0225286A3 (en) 1987-10-07
NZ218305A (en) 1990-01-29
NO175266B (no) 1994-06-13
NO864569D0 (no) 1986-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI91160C (fi) Menetelmä modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi
EP0100561B1 (en) Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
FI86746B (fi) Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer.
JP2610783B2 (ja) ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター
EP0225633A2 (en) Production of thrombin inhibitors
JP2641875B2 (ja) ハイブリッドタンパク質
FI98219C (fi) Menetelmä urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi
KR19990082479A (ko) 트롬빈 억제제에 대한 해독제인 트롬빈 돌연변이 단백질
US5580559A (en) Hybrid plasminogen activator
WO1989007146A1 (en) Rearranged tissue plasminogen activators and method for producing same
US5242819A (en) DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase
AU3064989A (en) Modified gene sequences encoding modified tpa and products therefrom
WO1994020537A1 (en) Non-glycosylated tfpi analogues
AU619803B2 (en) Rearranged tissue plasminogen activators and method for producing same
SI8810195A (sl) Hibridni proteini
IE61775B1 (en) Process for the production of proteins
HRP940440A2 (en) Hybride proteins

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVARTIS AG

FG Patent granted

Owner name: NOVARTIS AG

MA Patent expired