DE3686136T2

DE3686136T2 - Fibrinolytisches agens.

Info

Publication number: DE3686136T2
Application number: DE8686810518T
Authority: DE
Inventors: Bhabatosh Dr Chaudhuri; Jutta Dr Heim; Bernd Dr Meyhack; Oostrum Jan Dr Van
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1985-11-18
Filing date: 1986-11-13
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2006-11-14
Also published as: FI864654L; KR920007666B1; DE3686136D1; EP0225286A2; FI91160C; DK549186D0; NO175266C; NZ218305A; ES2043607T3; IE57866B1; NO864569D0; AU598490B2; ZA868689B; DK549186A; JPS62272976A; NO175266B; GR3006041T3; DK174977B1; PT83752B; IL80659A0

Description

Die Erfindung betrifft modifizierte fibrinolytische Agenzien und Mittel zur Herstellung solcher fibrinolytischer Agenzien. Mehr im besonderen betrifft die Erfindung deglycosylierte oder teilweise deglycosylierte Gewebe-Plasminogenaktivatoren, Hybridvektoren, die für solche Gewebe-Plasminogenaktivatoren codierende DNA-Sequenzen enthalten, und eukaryotische Wirtszellen, die mit diesen Hybridvektoren transformiert wurden. Die Erfindung betrifft auch die Verfahren zur Herstellung der genannten Hybridvektoren, der transformierten Wirtszellen und der Gewebe-Plasminogenaktivatoren.

Hintergrund der Erfindung:

Blutgerinnsel sind die Hauptursache für Morbidität und Mortalität der Menschen in den Industrieländern. Blutgerinnsel bestehen aus Fibrin, das aus seinem löslichen Vorläufer Fibrinogen durch die Wirkung des Enzyms Thrombin gebildet wird. Eine Gruppe von Enzymen und anderen Substanzen gewährleistet, daß sich Gerinnsel normalerweise nur bilden, wenn und wo sie erforderlich sind, um Blutverlust zu verhindern.
Das Plasma von Säugern enthält ein enzymatisches System, das in der Lage ist, das Fibrin in Blutgerinnseln aufzulösen. Eine Komponente des fibrinolytischen Systems ist eine Gruppe von Enzymen, die Plasminogenaktivatoren genannt werden, die Plasminogen (eine inaktive Proenzymform von Plasmin) in das proteolytische Enzym Plasmin überführen. Plasmin baut dann das Fibrinnetzwerk der Gerinnsel ab, um lösliche Produkte zu bilden. In Fällen, wo das thrombolytische Potential des Körpers unzureichend ist, um intravaskuläre Thromben zu entfernen, zum Beispiel bei Patienten, die an Thromboembolien oder post-chirurgischen Komplikationen leiden, kann es unerläßlich sein, exogen verabreichte thrombolytische Mittel zu verwenden.
Es können zwei Arten von Plasminogenaktivatoren aus menschlichen Körperflüssigkeiten oder Zellen isoliert werden: Urokinase, eine Serinprotease, die z.B. in menschlichem Urin und Nierenzellen vorkommt, und Gewebe-Plasminogenaktivator, (im folgenden hier als "t-PA" bezeichnet), der in Endothelzellen und einer Anzahl endokriner Gewebe vorliegt. Der Gewebe-Plasminogenaktivator unterscheidet sich von Urokinase in bezug auf seine chemischen und immunologischen Eigenschaften, seine stark erhöhte fibrinolytische Wirkung in Gegenwart von Fibrin sowie in seiner hohen Affinität für Fibrin. t-PA existiert in zwei molekularen Formen: der aktiven Zweiketten-Form und einer Einketten-Vorläuferform (oft als "Pro-t-PA" bezeichnet). Die Einketten-Form (one-chain form) kann durch Inkubation mit katalytischen Mengen von Plasmin vorzugsweise in Gegenwart von Fibrin in die Zweiketten-Form (two-chain form) übergeführt werden.
Die Nucleotidsequenz von cDNA, die für Human-t-PA codiert, wurde bestimmt und die Aminosäuresequenz daraus abgeleitet [D. Pennica u.a., Nature 301, 214 (1983)]. Vier potentielle N-Glycosylierungsorte wurden identifiziert von denen einer scheinbar nicht für Kohlenhydratbindung verwendet wird. [G. Pohl u.a., Biochemistry 23, 3701 (1984)].
Quellen von Human-t-PA schließen beispielsweise Extrakte von menschlichem Gewebe ein (die nicht für kommerzielle Verwertung verfügbar sind) und verschiedene menschliche Tumorzellen, von denen gezeigt wurde, daß sie t-PA in variierendem Ausmaß freisetzen. In der europäischen Patentanmeldung 41,766 wird ein t-PA geoffenbart, der aus einer kultivierten Human-Melanomzellinie isoliert wurde. Die DNA-Rekombinationstechnik wurde auch für die Produktion von Human-t-PA herangezogen. Doppelsträngige t-PA-cDNA, abgeleitet aus menschlichen Tumorzellen, wurde kloniert und in "Chinese hamster ovary (CHO)"-Zellen und in E. coli- (Europäische Patentanmeldung 93,619) oder Hefe (S. cerevisiae)-Zellen (Europäische Patentanmeldungen 123,544 und 143,081) exprimiert. Aus kultivierten Human-Melanomzellen oder aus transformierten CHO- Zellen erhaltener t-PA entspricht wahrscheinlich dem authentischen t-PA-Glycoprotein. Aus transformierten Hefezellen isolierter t-PA hat wahrscheinlich für Hefe spezifische Kohlenhydratketten. Unterschiede in der Struktur der Kohlenhydratketten von Hefe und höheren Eukaryoten sind gut dokumentiert und betreffen die äußere Kettenaddition von Mannose-Resten und die Modifizierung der Kern-Kohlenhydrate [Vgl. R. und S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54, 631 (1985); J.C. Byrd u.a., J. Biol. Chem. 257, 14657 (1982); R.B. Trimble u.a., J. Biol. Chem. 258, 2562 (1983)]. Der in E. coli exprimierte t-PA ist nicht glycosyliert, aber fibrinolytisch aktiv, obwohl er eine relativ niedrige spezifische Aktivität hat. Das meiste Protein akkumuliert im Cytoplasma in einer inaktiven Form, wahrscheinlich aufgrund inkorrekter Faltung des Moleküls. Die korrekte Faltung hängt von der Bildung einer Anzahl spezifischer Disulfid-Brücken innerhalb des t-PA-Moleküls ab, die für die Enzymaktivität essentiell sind.
Es wurde gezeigt, daß die Kohlenhydratreste von t-PA mit Oxidationsmitteln, wie Natriumperiodat, (PCT-Anmeldungen Nr. 84/1786 und 84/1960) chemisch abgebaut werden können. Vom resultierenden t-PA-Derivat sagt man, daß es eine physiologische Clearance-Rate hat, die langsamer ist als die von unbehandeltem t-PA. Das Ausmaß des chemischen Abbaus der Kohlenhydratreste, die spezifische Aktivität des modifizierten t-PA und der wahrscheinlich schädliche chemische Effekt des Oxidationsmittels auf empfindliche Aminosäurereste der t-PA-Kette [es wird erwartet, daß z.B. Tryptophan-Reste durch Periodat angegriffen werden; Vgl. A. S. Inglis u.a., FEBS Lett. 104, 115 (1979)] sind nicht geoffenbart.
S.P. Little u. a. [Biochemistry 23, 6191 (1984)] beschreiben die Wirkung des Glycosylierungsinhibitors Tunicamycin auf t-PA produzierende Melanomzellen. Sie stellten fest, daß die Glycosylierung um 90 % inhibiert wird. Zur gleichen Zeit wird auch die Proteinsynthese um 30 % inhibiert, was zeigt, daß Tunicamycin direkt oder indirekt vitale Prozesse in der Zelle stört. Das resultierende t-PA Protein behält die fibrinolytische Aktivität. Die potentielle Gegenwart von Spuren des schädlichen Glycosylierungs- und Proteinbiosynthese-Inhibitors Tunicamycin muß jedoch notwendigerweise die Verwendung dieses t-PA als therapeutisches Mittel einschränken. In der gleichen Publikation wird die enzymatische Deglycosylierung von t-PA durch endo-β-N-Acetylglucosaminidase H (Endo H) beschrieben. Endo-H-Behandlung führt zu einer Mischung von t-PA-Spezies, aus der bis zu 85-90 % der Kohlenhydratreste entfernt sind. Es waren jedoch etwa 50 % t-PA gegen Endo-H-Behandlung vollkommen resistent. Es wird berichtet, daß das Produkt die Fibrin-gerichteten Eigenschaften von authentischem t-PA behält.
Im Hinblick auf die vermutlich günstigen Eigenschaften von t-PA-Molekülen, denen ein Teil oder alles von den Kohlenhydratresten fehlt, besteht Bedarf an solchen Verbindungen sowie an Methoden, die die geeignete Synthese dieser Proteine ermöglichen. Außer dem aus transformierten E.coli-Zellen isolierten Produkt (das jedoch für therapeutische Zwecke nicht von besonderem Wert zu sein scheint, supra) sind die in der Literatur beschriebenen deglycosylierten t-PA-Spezies chemisch undefinierte Moleküle, und außerdem liegen sie derzeit in komplexen Mischungen vor, die eine unbestimmte Zahl individueller Spezies enthalten. T-PA-Spezies, in denen eine oder alle der N-verknüpften Kohlenhydratketten vollständig entfernt sind, sind bisher unbekannt.
Da alle Eukaryoten die gemeinsamen Mechanismen für die Expression genetischer Information teilen, kann die Expression eukaryotischer Gene mit größerer Effizienz in einem eukaryotischen Wirt fortschreiten als in E.coli. Unter den eukaryotischen Organismen, die sich für die Ausnutzung eignen, ist Hefe am leichtesten zu handhaben. Da Hefe ein Mikroorganismus ist, sind Hefezellen leicht zu kultivieren. Die pro Volumen Kulturflüssigkeit erhältliche Zellmasse ist für Hefe beträchtlich höher als für E.coli und frei von Endotoxinen. Weiters kennt man das Fermentationsverhalten von Hefe gut, und Bedingungen für Fermentationen in großem Maßstab sind bereits festgelegt. Der sekretorische Weg von Hefe ist dem höherer Zellen, einschließlich menschlicher Zellen, ähnlich. Es ist bekannt, daß Hefezellen ihre eigenen Proteine sowie fremde Proteine durch Spaltung der entsprechenden Signalsequenzen prozessieren können. Weiters scheint es, daß Proteine, die in den sekretorischen Weg eines eukaryotischen Wirts eintreten und ihn passieren, einen höheren Grad an Tertiärstruktur im Vergleich zu Proteinen, die im Cytoplasma synthetisiert werden, bilden. Es ist zu beachten, daß Prokaryoten wie E.coli keine großen Proteine mit Strukturen höherer Ordnung zu haben scheinen.
Mit dem sekretorischen Weg höherer Organismen ist das Glycosylierungssystem assoziiert. Es wird erwartet, daß Unterschiede bei der Glycosylierung das "Sortieren" der Proteine beeinflußt. Hefe-Carboxypeptidase Y, die einfach durch 13 Mannosereste Core-glycosyliert ist, wird in die Vakuole transferiert, während Hefe-Invertase, die äußere Kohlenhydratketten hat, die aus etwa 100-150 Mannoseresten bestehen, durch die sekretorischen Vesikel geht und in den periplasmatischen Raum eintritt [L. Lehle u.a., J. Biol. Chem. 254, 12209 (1979); C. Hashimoto u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2244 (1981)]. Es steht daher außer Frage, daß Änderung der Kohlenhydratketten einen Einfluß auf das sekretorische Verhalten von t-PA haben kann.

Ziel der Erfindung:

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Human-t-PA-Proteine zu bieten, denen eine oder mehrere der N-verknüpften Kohlenhydratketten fehlt, die jedoch wertvolle biologische Eigenschaften beibehalten, wie fibrinolytische Aktivität, eine langsamere physiologische Clearance-Rate und längere Stabilität in vivo als bei natürlichem t-PA. Weitere Ziele der Erfindung sind Hybridvektoren, DNA-Sequenzen enthaltend, die für solche t-PAs codieren, und ein starkes Promotorsystem, das die Expression der genannten DNA-Sequenzen wirksam kontrolliert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung bietet neue Human-Mutanten-t-PA-Proteine, in denen einer oder mehrere der natürlich vorkommenden N-Glycosylierungsorte auf solche Weise geändert ist (sind), daß Glycosylierung an diesen Orten nicht stattfinden kann. Dieses Ziel erreicht man durch Bereitstellung von DNA-Sequenzen, die für solche t-PA- Proteine codieren, Hybridvektoren, die solche DNA-Sequenzen enthalten, und Wirtszellen, die mit solchen Hybridvektoren transformiert wurden, und Expression solcher t-PA-Proteine.

1. Herstellung von reifem t-PA, dem eine oder mehrere der Kohlenhydratketten fehlen:

Es steht fest, daß eine Voraussetzung für N-verknüpfte Glycosylierung in Säugerzellen das Auftreten der Tripeptid-Sequenz -Asn-L-Ser(oder Thr)- ist, worin Asn der Akzeptor ist und L jedwede der 20 genetisch codierten Aminosäuren sein kann, außer Prolin oder Asparaginsäure, die Glycosylierung verhindert [Vgl. D.K. Struck und W.J. Lennarz in The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, Hrsg. W.J. Lennarz, Plenum Press 1980, S. 35; R.D. Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40, 17 (1974)]. Es gibt vier potentielle Orte für N-glycosidische Verknüpfung in dem t-PA-Molekül (die Zahlen beziehen sich auf die Position von Asn in der Aminosäuresequenz von t-PA, vgl. Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen): -Asn¹¹&sup7;-Ser- Ser-, Asn¹&sup8;&sup4;-Gly-Ser-, Asn²¹&sup8;- Pro-Ser und Asn&sup4;&sup4;&sup8;-Arg-Thr-. Wegen der Gegenwart von Pro in der Sequenz Asn²¹&sup8;-Pro-Ser wird Asn²¹&sup8; nicht für die Kohlenhydratbindung in Säugerzellen verwendet (G. Pohl u.a., supra).
Um Glycosylierung an individuellen (einem oder mehreren der) N-Glycosylierungsorte zu verhindern, müssen die als Signale für die N-Glycosylierung erkannten Tripeptidsequenzen geändert werden. Ersetzen von Asn- und/oder Ser (oder Thr)-Resten in obigen Tripeptidsequenzen durch irgendeine andere Aminosäure würde die Bildung glycosidischer Bindungen an diesen Stellen aufheben. Der Einfachheit halber erfolgt die Modifizierung des t-PA-Moleküls, d.h. die Änderung der N-Glycosylierungsorte, nicht am Protein-Level. Statt dessen ist es vorteilhaft, das für t-PA codierende Gen auf solche Weise zu modifizieren, daß beim Exprimieren des modifizierten Gens durch einen Wirt ein Mutanten-t-PA produziert wird, in dem einer oder mehrere der natürlich vorkommenden N-Glycosylierungsorte auf solche Weise geändert sind, daß Glycosylierung an diesen Orten nicht stattfinden kann.
Im besonderen betrifft diese Erfindung Human-Mutanten-t-PA-Proteine mit der Aminosäuresequenz
in der A&sub1;-&sub1;&sub1;&sub6; die N-terminale Aminosäuresequenz repräsentiert, die aus den Aminosäuren 1 bis 116 von reifem t-PA besteht, A&sub1;&sub2;&sub0;-&sub1;&sub8;&sub3; die Aminosäuresequenz repräsentiert, die aus den Aminosäuren 120 bis 183 von reifem t-PA besteht, A&sub1;&sub8;&sub7;-&sub2;&sub1;&sub7; die Aminosäuresequenz darstellt, die aus den Aminosäuren 187 bis 217 von reifem t-PA besteht, A&sub2;&sub2;&sub1;-&sub4;&sub4;&sub7; die Aminosäuresequenz darstellt, die aus den Aminosäuren 221 bis 447 von reifem t-PA besteht, A&sub4;&sub5;&sub1;-&sub5;&sub2;&sub7; die C-terminale Aminosäuresequenz darstellt, die aus den Aminosäuren 451 bis 527 von reifem t-PA besteht, und a) Y&sub1; und Y&sub3; Ser sind, Y&sub2; eine andere genetisch codierte Aminosäure als Ser und Thr ist, und Y&sub4; Thr ist; oder b) Y&sub1;, Y&sub2; und Y&sub3; jedes Ser sind und Y&sub4; eine andere genetisch codierte Aminosäure als Ser und Thr ist; oder c) Y&sub1;, Y&sub2; und Y&sub4; jedes unabhängig eine andere genetisch codierte Aminosäure als Ser und Thr sind und Y&sub3; Ser ist, in der Einketten- oder in der Zweiketten-Form.
Der Ausdruck "reifer t-PA" bezieht sich auf einen t-PA ohne Prä- oder Pro-Sequenzen, beginnend mit Ser in der Position 1. Es wird auf Fig. 1 der beigelegten Zeichnungen Bezug genommen, die die Aminosäuresequenz von reifem t-PA zeigt.
Genetisch codierte Aminosäuren sind die folgenden L-Aminosäuren: Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp und Pro, weiters die Aminosäure Gly.
Für das Ersetzen werden jene Aminosäuren bevorzugt, die ähnliche Größe und Polarität wie die zu ersetzenden Aminosäuren haben. Die Zahl der möglichen Substituenten der Thr- oder Ser-Reste wird eingeschränkt durch die gegebene Nucleotidsequenz und die möglichen Codons (Vgl. Abschnitt 2). Für das Ersetzen von Ser Y&sub1;, Y&sub2; und/oder Y&sub3; und für das Ersetzen von Thr Y&sub4; werden die Aminosäuren Ala und Asn bevorzugt.
Im besonderen betrifft die Erfindung ein t-PA-Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus [Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA, [Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA, [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA und [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA.
Verbindungen der Formel I, in denen zumindest einer der ursprünglichen N-Glycosylierungsorte von t-PA erhalten bleibt, sind N-glycosyliert. Verbindungen der Formel I, in denen keiner der ursprünglichen N-Glycosylierungsorte von t-PA erhalten bleibt, fehlt N-gebundene Glycosylierung.
Die Einketten-Form der t-PA-Mutanten gemäß dieser Erfindung entspricht der oben dargestellten Formel I. Die Zweiketten-Form wird durch Spaltung der Arg²&sup7;&sup5;Ile²&sup7;&sup6;-Peptidbindung (vgl. Fig. 1) generiert. Die zwei Ketten werden mittels einer Disulfidbrücke zusammengehalten. Wenn in der vorliegenden Erfindung verwendet und sofern nicht ausdrücklich anders definiert, bezieht sich der Ausdruck "t-PA" auf die Einketten-Form , die die bevorzugte Form der erfindungsgemäßen t-PAs ist.
Die Verbindungen der Formel I werden vorzugsweise durch biotechnologische Mittel hergestellt.
Das Verfahren zur Herstellung der Mutanten-t-PA-Proteine gemäß dieser Erfindung umfaßt das Kultivieren transformierter eukaryotischer Wirtszellen, die eine für irgendeines der genannten Mutanten-t-PA-Proteine codierende DNA-Sequenz enthalten, unter geeigneten Nährbedingungen und Isolieren des Mutanten-t-PA-Proteins und, falls gewünscht, Trennen einer erhaltenen Mischung der Einketten- und Zweiketten-Formen des Mutanten-t-PA in die individuellen Komponenten und für die Herstellung der Zweiketten-Form, die frei von Einketten-Form ist, Umwandeln der Einketten-Form der hergestellten t-PA-Mutante in die Zweiketten-Form.
Das Primärprodukt der t-PA-Genexpression gemäß dieser Erfindung ist die Einketten-Form von t-PA. Wenn jedoch Proteasen in der Wirtszelle oder in der Kulturflüssigkeit anwesend sind, kann der primär exprimierte Einketten-t-PA zumindest teilweise in Zweiketten-t-PA umgewandelt werden. Das tatsächlich isolierte Produkt kann daher aus Einketten-Mutanten-t-PA, Zweiketten- Mutanten-t-PA oder deren Mischungen bestehen.
Geeignete eukaryotische Wirtszellen sind Zellen höherer Organismen, insbesondere von Säugern, speziell etablierte menschliche oder tierische Zellinien, wie die menschliche Bowes-Zellinie oder HeLa-Zellen oder die CHO-Zellinie (Chinese hamster ovary), und Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae. Die bevorzugten Wirtszellen gemäß dieser Erfindung sind Zellen von Saccharomyces cerevisiae.
Die eukaryotischen Wirtszellen, speziell Hefezellen, die obige DNA-Sequenz enthalten, werden unter Anwendung von auf diesem Gebiet bekannten Methoden kultiviert.
Die erfindungsgemäßen transformierten Hefestämme werden in flüssigem Medium kultiviert, das assimilieibare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
Verschiedene Kohlenstoffquellen sind verwendbar. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, wie Natriumacetat, die allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen umfassen z.B. Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton, oder Fleischextrakte; weiters Hefe-Extrakte, Malzextrakt, Maiswasser, und auch Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die verwendet werden können, sind z.B. Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Das Nährmedium kann zum Beispiel auch wachstumsfördernde Substanzen enthalten. Substanzen, die das Wachstum fördern, schließen z.B. Spurenelemente, wie Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, oder individuelle Aminosäuren ein.
In unterschiedlichem Ausmaß neigen mit autonom replizierenden Plasmiden, z.B. Plasmiden, die Hefe-2u-Plasmid-DNA (infra) enthalten, transformierte Hefezellen dazu, eingeführtes Hybridplasmid zu verlieren. Aus diesem Grunde müssen solche Hefezellen unter selektiven Bedingungen wachsen, d.h. Bedingungen, die die Expression eines Plasmid-codierten Gens für das Wachstum erfordern. Die meisten derzeit verwendeten und in den erfindungsgemäßen Hybridvektoren (infra) anwesenden selektiven Marker sind Enzyme der Aminosäure- oder Purin-Biosynthese codierende Gene. Das macht die Verwendung synthetischer Minimalmedien erforderlich, denen die entsprechende Aminosäure oder Purinbase fehlt. Einige Gene, die Resistenz gegen entsprechendes Biozid verleihen, können ebenfalls verwendet werden [z.B. Gene, die Resistenz gegen Cycloheximid, Amino-Glycosid G 418, ein Schwermetall oder dergleichen verleihen]. Mit Vektoren, die Gene für antibiotische Resistenz enthalten, transformierte Hefezellen werden in Komplexmedien kultiviert, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, wobei größere Wachstumsgeschwindigkeiten und höhere Zelldichten erreicht werden.
Hefezellen, die transformiert sind mit DNA, die sich in Chromosome integriert, erfordern keine selektiven Wachstumsbedingungen. Diese transformierten Zellen sind ausreichend stabil, um Wachstum ohne selektiven Druck zu erlauben. Aus dem genannten Grund werden diese Zellen vorteilhaft in Komplexmedien kultiviert.
Hefezellen, die Hybridplasmide mit einem konstitutiven Promotor (z.B. ADHI, GAPDH) enthalten, exprimieren das t-PA-Gen, das an den Promotor gebunden ist, ohne Induktion. Wenn jedoch das t-PA- Gen unter der Kontrolle eines regulierten Promotors steht (z.B. PGK oder PHO5), muß die Zusammensetzung des Wachstumsmediums angepaßt werden, um maximale Niveaus von mRNA- Transcripten zu erhalten, d.h. wenn der PHO5-Promotor verwendet wird, muß das Wachstumsmedium eine niedrige Konzentration anorganisches Phosphat für die Dereprimierung dieses Promotors enthalten.
Die Kultivierung erfolgt durch Anwendung herkömmlicher Methoden. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit werden so gewählt, daß maximale Mengen t-PA produziert werden. Ein gewählter Hefestamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 25º bis 35ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC, bei einem pH-Wert von 4 bis 8, beispielsweise ungefähr pH 7, und etwa 4 bis 20 Stunden lang, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten an Protein erreicht sind, kultiviert.
Das hergestellte t-PA-Protein kann innerhalb der Hefezellen akkumulieren oder in den periplasmatischen Raum oder in das Kulturmedium sezerniert werden. Im Falle, daß das t-PA-Protein innerhalb der Zellen akkumuliert ist, besteht der erste Schritt der Gewinnung des t-PA-Proteins im Freisetzen des Proteins aus dem Zellinneren. Bei den meisten Methoden wird die Zellwand zuerst durch enzymatische Verdauung mit Glucosidasen entfernt (Vgl. Abschnitt 4). Anschließend werden die resultierenden Sphäroplasten mit Detergentien wie Triton X-100 behandelt. Alternativ eignen sich mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z.B. X-Presse, Frenchpress) oder Schütteln mit Glasperlen, für das Aufbrechen der Zellen. Die resultierende Mischung wird an Mutanten-t-PA durch herkömmliche Mittel angereichert, wie die Entfernung des meisten nichtproteinischen Materials durch Behandlung mit Polyethylenimin, Fällung der Proteine unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder Trichloressigsäure, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatographie, z.B. Ionenaustausch-Chromatographie, Größenausschluß- Chromatographie, HPLC oder Umkehrphasen-HPLC, Molekülgrößensortierung an einer geeigneten Sephadex -Säule oder dergleichen. Die Endreinigung des vorgereinigten Produktes erreicht man beispielsweise mittels Affinitäts-Chromatographie, z.B. Antikörper-Affinitäts-Chromatographie, speziell Affinitäts-Chromatographie mit monoklonalem Antikörper unter Verwendung von monoklonalen Anti-t-PA-Antikörpern, die an einer unlöslichen Matrix nach auf diesem Gebiet bekannten Methoden befestigt wurden, und dergleichen.
Weiters bevorzugte Methoden für die Isolierung des Mutanten-t-PA aus Kulturflüssigkeiten bestehen im selektiven Adsorbieren an einem Träger spezifischer Affinität von löslichen Fibrinfragmenten, die kovalent an einer unlöslichen Matrix fixiert sind, z.B. Dextran oder insbesondere DE-3-Sepharose . DE-3 ist ein Trypsin-Inhibitor, der in Samen der Leguminose Erythrina latissima (Europäische Patentanmeldung 112,122) enthalten ist. Es wurde festgestellt, daß DE-3 auch in der Lage ist, t-PA-Aktivität zu inhibieren. Der gereinigte DE-3-Inhibitor kann also unter Anwendung von Standardmethoden an eine unlösliche Matrix gekoppelt werden, z.B. BrCN-aktivierte Sepharose . t-PA-Proteine werden an der Inhibitormatrix adsorbiert und können durch einen Puffer, der ein chaotropes Agens enthält, eluiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Kulturmedium, gegebenenfalls nachdem es einen oder mehrere der obigen Reinigungsschritte durchlaufen hat, bei Raumtemperatur durch eine Säule geleitet oder in einer Batch-Methode mit BrCN-aktivierter Sepharose , an die DE-3-Inhibitor gekoppelt wurde, behandelt. Nach dem Waschen des Sepharose -Trägers wird der adsorbierte Gewebs-Plasminogenaktivator durch Behandlung mit einer Pufferlösung eluiert, z.B. mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von ungefähr 5,5-6,0 und ein chaotropes Agens, wie NH&sub4;SCN, etwa 1,0 bis etwa 2,0 molar, vorzugsweise 1,2 molar, enthaltend. Alternativ können Benzamidin oder Arginin als Freisetzungsmittel verwendet werden. Vorteilhaft wird ein Detergens, speziell ein nichtionisches Detergens, wie Triton X-100 oder Tween 80 allen Pufferlösungen zugesetzt, die in den Reinigungsschritten verwendet werden, um die Adsorption von Gewebs-Plasminogenaktivator an den Gefäßoberflächen zu verhindern und die Stabilität zu verbessern. Das Detergens kann in einer Endkonzentration von 0,01-0,1 % zugesetzt werden.
In dem Falle, wo der Gewebs-Plasminogenaktivator durch die Hefezelle in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, kann ein vereinfachtes Protokoll angewendet werden: Das Protein wird ohne Zell-Lyse durch enzymatische Entfernung der Zellwand oder durch Behandlung mit chemischen Agenzien, z.B. Thiol-Reagenzien oder EDTA, die zu Schädigung der Zellwand führen, was die Freisetzung des hergestellten Mutanten-t-PA erlaubt, gewonnen. In dem Fall, wo der Mutanten-t-PA in die Kulturbrühe sezerniert wird, kann er direkt daraus gewonnen werden.
Die Kultivierung von Hefezellen, die ein chromosomal integriertes t-PA-Gen beherbergen, und Reinigung des exprimierten t-PA erfolgt auf die gleiche Weise wie oben beschrieben.
Wenn die bevorzugten Hefestämme gemäß dieser Erfindung, nämlich Hefestämme mit Proteasemangel, verwendet werden, ist der isolierte Mutanten-t-PA hauptsächlich in der Einketten-Form. Wenn Hefestämme verwendet werden, die proteolytische Aktivität zeigen, wird ein Produktgemisch erhalten, das aus der Einketten- und der Zweiketten-Form der t-PA-Mutante in variierendem Verhältnis besteht.
Für die Herstellung der Zweiketten-Form der t-PA-Mutante, die im wesentlichen frei von der Einketten-Form ist, wird die Einketten-Form enzymatisch in die Zweiketten-Form umgewandelt durch Spaltung der Arg²&sup7;&sup5;-Ile²&sup7;&sup6;-Peptidbindung, beispielsweise durch die Wirkung von Plasmin oder einem Enzym mit einer gleichwertigen Wirkung auf die Einketten-Form von t-PA.
Für die geeignete Herstellung der Einketten-Form des Mutanten-t-PA, die im wesentlichen frei von Zweiketten-Form ist, wird ein Proteaseinhibitor, wie Aprotinin (Trasylol ) oder basischer pankreatischer Trypininhibitor vorteilhafterweise während der Reinigungsprozedur inkludiert, um Spuren von Proteasen zu inhibieren, die anwesend sein können und (teilweise) Umwandlung der Einketten-Form in die Zweiketten-Form verursachen können. Die Endreinigung erfolgt dann durch Chromatographie an einer Säule, die ein selektives Affinitätsreagens enthält, wie DE-3.
Die transformierten Wirtszellen gemäß dieser Erfindung können durch Rekombinante-DNA-Techniken hergestellt werden, umfassend die Schritte
- Herstellung eines Strukturgens, das für das erfindungsgemäße Mutanten-t-PA-Protein codiert,
- Einbringen des erhaltenen Strukturgens in einen passenden Vektor,
- Transformieren geeigneter Wirtszellen mit dem geschaffenen Hybridvektor,
- Selektion transformierter Wirtszellen von untransformierten Wirtszellen.

2. DNA-Sequenzen, die für Mutanten-t-PA-Proteine codieren:

Die Erfindung betrifft auch eine DNA, die eine Sequenz hat, die für ein humanes Mutanten-t-PA-Protein gemäß dieser Erfindung codiert.
Spezifisch betrifft die Erfindung eine DNA mit einer Sequenz der Formel
worin N&sub1;-&sub3;&sub4;&sub8; eine Desoxyribonucleotid-Sequenz darstellt, die aus den Desoxyribonucleotiden 1 bis 348 des Gens für reifen t-PA besteht, N&sub3;&sub5;&sub8;-&sub5;&sub4;&sub9; eine Desoxyribonucleotid-Sequenz darstellt, die aus den Desoxyribonucleotiden 358 bis 549 des Gens für reifen t-PA besteht, N&sub5;&sub5;&sub9;-&sub6;&sub5;&sub1; eine Desoxyribonucleotid-Sequenz darstellt, die aus den Desoxyribonucleotiden 559 bis 651 des Gens für reifen t-PA besteht, N&sub6;&sub6;&sub1;-&sub1;&sub3;&sub4;&sub1; eine Desoxyribonucleotid-Sequenz darstellt, die aus den Desoxyribonucleotiden 661 bis 1341 des Gens für reifen t-PA besteht, und N&sub1;&sub3;&sub5;&sub1;-&sub1;&sub5;&sub8;&sub1; eine Desoxyribonucleotid-Sequenz darstellt, die aus den Desoxyribonucleotiden 1351 bis 1581 des Gens für reifen t-PA besteht, W&sub1;, W&sub2;, W&sub3; und W&sub4; jeweils Codons darstellen, die für Aminosäuren Y&sub1;, Y&sub2;, Y&sub3; bzw. Y&sub4;, wie oben definiert, codieren.
Das für reifen Human-t-PA codierende Gen kann aus jedweder menschlichen Zelle abgeleitet werden, die in der Lage ist, t-PA zu produzieren. Solche Zellen sind kanzerösen oder nichtkanzerösen Ursprungs und werden vorzugsweise aus einer etablierten Zellinie abgeleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Gen für t-PA aus HeLa- Zellen abgeleitet. Es wird auf Fig. 1 der beigelegten Zeichnungen Bezug genommen, in der die DNA-Sequenz von reifem t- PA, vorkommend in HeLa-Zellen, beginnend mit TCT, das für Ser als die erste Aminosäure codiert, und die Numerierung der Desoxyribonucleotide dargestellt werden.
Im reifen t-PA vom Wildtyp ist W&sub1; AGC, W&sub2; ist TCA, W&sub3; ist AGT und W&sub4; ist ACA. In den Verbindungen der Formel II' wird zumindest eines dieser ursprünglichen Codons auf solche Weise geändert, daß das resultierende Codon für eine Aminosäure Y&sub1;, Y&sub2;, Y&sub3; oder Y&sub4;, wie oben definiert, codiert. Die Codons W&sub1;, W&sub2;, W&sub3; und/oder W&sub4; können durch jedwedes andere Codon ersetzt werden, das sich von einem Nonsens-Codon unterscheidet, unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe. Es werden diejenigen geänderten Codons bevorzugt, die für die bevorzugten Aminosäuren codieren, wie oben im Detail angegeben, und die sich von den ursprünglichen Codons um ein oder höchstens zwei Desoxyribonucleotide unterscheiden.
In den Verbindungen der Formel II' werden die Codons W&sub1;, W&sub2;, W&sub3; und/oder W&sub4; vorzugsweise wie folgt modifiziert: AGC (W&sub1;, codiert für Ser) wird geändert auf ATC (Ile) oder AAC (Asn), TCA (W&sub2;, codiert für Ser) wird geändert auf GCA (Ala) oder TTA (Leu), AGT (W&sub3;, codiert für Ser) wird geändert auf AAT (Asn) oder ATT (Ile), und ACA (W&sub4;, codiert für Thr) wird geändert auf ATA (Ile), GCA (Ala), AAC oder AAT (beide Asn).
Die DNA-Sequenzen der Formel II' sind vorzugsweise die, die für die Mutanten-t-PA-Proteine codieren, die hier zuvor als speziell bevorzugt beschrieben wurden.
Die DNAs mit den Sequenzen der Formel II' können nach auf dem Gebiet bekannten Methoden hergestellt werden. Die Verfahren zur Herstellung dieser DNA sind unter anderen chemische Synthese der DNA, Exzision eines Teils der DNA, umfassend das Codon für den unerwünschten Aminosäurerest, vom Stammgen von reifem t-PA und Ersetzen durch ein DNA-Segment, in dem besagtes Codon durch ein Desoxyribonucleotid-Triplett, das für den gewünschten Aminosäure-Rest codiert, substituiert ist, oder Ausführen der Desoxyribonucleotid-Substitution durch ortsgerichtete Mutagenese.
Die chemische Synthese von DNA ist auf diesem Gebiet gut bekannt und wendet herkömmliche Techniken an. Geeignete Techniken wurden von S.A. Narang zusammengestellt [Tetrahedron 39, 3 (1983)]. Insbesondere können die in der neuseeländischen Patentbeschreibung 210267 beschriebenen und hier durch Bezugnahme zum Inhalt gemachten Methoden angewendet werden.
Die Exzision eines Teils der reifen t-PA-DNA kann durch die Verwendung von Restriktionsenzymen erfolgen. Eine Voraussetzung für diese Methode ist die Verfügbarkeit geeigneter Restriktionsstellen in der Nachbarschaft des zu ändernden Codons. Ein kleines Restriktionsfragment, das das Codon für eine unerwünschte Aminosäure enthält, wird durch Endonuclease-Spaltung entfernt. Eine entsprechende doppelsträngige DNA-Sequenz wird hergestellt, z.B. durch chemische Synthese, in der Tripletts, die für die gewünschte Aminosäure codieren, verwendet werden. Das DNA-Fragment wird in passender Orientierung an das verbleibende große Fragment ligiert, um eine doppelsträngige DNA-Sequenz zu erhalten, die für einen Mutanten-t-PA codiert. Der Einfachheit halber und um die Handhabung des t-PA-Gens zu erleichtern, ist letzteres vorteilhaft in einem größeren DNA-Segment enthalten, das mit passenden Linkern versehen ist, die das Einsetzen und Klonieren des Segments in einem Klonierungsvektor erlauben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Herstellung von DNAs mit den DNA-Sequenzen der Formel II' durch ortsgerichtete Mutagenese. Dieses Verfahren ist eine in vitro-Mutagenesemethode, durch die ein definierter Ort innerhalb eines Bereiches klonierter DNA geändert werden kann [Vgl. die Review-Artikel von M.J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983); D. Botstein und D. Shortle, Science 229, 1193 (1985)].
Die Methode des Mutierens des Wildtyp-t-PA-Gens ist dadurch gekennzeichnet, daß das einzelsträngige Wildtyp-t-PA-Gen oder eine einzelsträngige DNA, die das Wildtyp-t-PA-Gen umfaßt, zu einem Oligodesoxyribonucleotid-Primer hybridisiert wird, der zu der Region des t-PA-Gens, die zu mutieren ist, komplementär ist, mit Ausnahme von "Mismatch(es)", der (die) die Mutation dirigiert (dirigieren), das hybridisierte Oligodesoxyribonucleotid als Primer verwendet wird, um die Synthese des komplementären DNA-Stranges zu initiieren, die resultierende (teilweise) doppelsträngige DNA in einen Rezipienten-Mikroorganismenstamm transformiert wird, der Mikroorganismenstamm kultiviert wird und DNA mit dem modifizierten t-PA-Gen enthaltende Transformanten selektiert werden.
Das Wildtyp-t-PA-Gen ist vorzugsweise in einem Plasmid enthalten, beispielsweise einem Plasmid, das in der neuseeländischen Patentbeschreibung 210266 beschrieben wird. Für die Mutagenese wird das t-PA-Gen vorteilhaft aus dem Plasmid isoliert, beispielsweise durch Verdauung mit Restriktionsendonuclease, was zu einer doppelsträngigen DNA führt, die das t-PA-Gen und wahlweise andere daran geknüpfte Funktionen enthält, zum Beispiel Promotor, Signalpeptid-DNA, etc., und klebrige Enden hat und an ein geeignetes Restriktionsfragment der replikativen Form (RF) eines einzelsträngigen DNA-Phagen ligiert wird, wie ein Derivat von Phage M13, z.B. M13mp8 oder M13mp9. Mit kompetenten Mikroorganismen, z.B. Ca-behandelten Zellen eines E.coli-Stammes, erfolgt Transfektion mit dem Hybridphagenvektor und, einzelsträngige Phagen- DNA, die das inserierte t-PA-Gen enthält, wird aus dem Überstand der kultivierten Zellen isoliert. Zu dieser Matrize wird der Mismatch-(mutagene)-Oligodesoxyribonucleotid-Primer hybridisiert.
Einige der in der Literatur beschriebenen Methoden hängen von der enzymatischen Extension des mutagenen Primers entlang der ringförmigen Matrize ab, gefolgt von Ligation, um ein kovalent geschlossenes, doppelsträngiges, ringförmiges Molekül zu bilden, das die Mutation(en) im neu synthetisierten Strang hat. Aufgrund der allgemein niedrigen Effizienz dieses Verfahrens wurde eine modifizierte Methode entwickelt [K. Norris u.a., Nucl. Acids Res. 11, 5103 (1983)], in der ein zweiter Primer verwendet wird. Im Falle eines M13-Phagenvektors wird vorzugsweise ein Universal-M13-Sequenzierungs-Primer verwendet.
Folglich werden der phosphorylierte mutagene Primer und der M13-Sequenzierungs-Primer gleichzeitig zu der ringförmigen, einzelsträngigen t-PA-Template-DNA hybridisiert (annealed). Das Annealing erfolgt schnell bei 55ºC für 5 Minuten und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur. Vorteilhafterweise ist das Molverhältnis Primer-Matrize etwa 20:1. Die Extension beider Primer wird durch E.coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) durchgeführt. Der neu synthetisierte DNA- Strang von dem Sequenzierungs-Primer wird an das 5'-phosphorylierte Ende des mutagenen Primers durch T4-DNA-Ligase ligiert. Diese Vorgangsweise formt partiell doppelsträngige Moleküle, die den (die) gewünschten "Mismatch(es)" tragen.
Der mutagene Primer und der M13-Sequenzierungs-Primer können chemisch synthetisiert werden (supra). Um ausreichend DNA-Synthese bei Raumtemperatur und darüber zu primen, ist es vorzuziehen, Oligodesoxyribonucleotide mit 14 bis 22 Nucleotiden Länge zu verwenden. Weiters werden solche Oligodesoxyribonucleotide wahrscheinlicher die einzelnen Zielstellen erkennen. Speziell hat ein mutagenes Oligodesoxyribonucleotid mit einem Mismatch eine Länge im Bereich von 14 bis 18 Nucleotiden, während mutagene Oligodesoxynucleotide mit zwei Mismatches eine Länge im Bereich von 17 bis 30 Nucleotiden haben. Die mutagenen Primer werden so bezeichnet, daß der (die) Mismatch(es) in der Nähe der Mitte des Moleküls lokalisiert ist (sind). Das ergibt die größte Bindungsdifferenz zwischen einem perfekt passenden Duplex und einem Duplex mit Mismatch(es) (infra).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die mutagenen Oligodesoxyribonucleotide Tripletts mit einem oder zwei Mismatches, für Aminosäurereste codierend, die Glycosylierung verhindern und hier als speziell bevorzugt beschrieben wurden.
Die partiell doppelsträngige DNA, die erwünschte Mismatch(es) trägt, kann direkt für die Transfektion eines Rezipientenmikroorganismus, insbesondere eines Stammes von E.coli, verwendet werden. Die Transfektion mit der DNA führt zu einer Mischung von Phagen, die Wildtyp-t- PA-Gen bzw. das mutierte t-PA-Gen enthalten. Die resultierenden Plaques werden hinsichtlich Phagen-DNA, die das mutierte t-PA-Gen enthält, gescreent.
Eine bevorzugte Methode zur Selektion von Phagen-DNA, die das mutierte t-PA-Gen enthält, aus der resultierenden Mischung von Phagen mit eingebrachtem Wildtyp- oder mutiertem t-PA ist die sogenannte Dot-Blot-Hybridisierung (Vgl. M.J. Zoller und M. Smith, supra). Das Verfahren basiert auf dem Unterschied in der thermischen Stabilität eines perfekt passenden DNA-Duplex und eines DNA-Duplex mit einem oder mehreren Mismatches. Die einzelsträngige Phagen-DNA wird auf einem festen Träger wie Filterpapier oder Nitrocellulosefolien immobilisiert durch Backen bei erhöhter Temperatur, z.B. 80ºC, und Hybridisierung an den ³²P-markierten mutagenen Oligodesoxyribonucleotid-Primer (supra). Bei niedriger Temperatur wechselwirken Mutanten- und Wildtyp-t-PA-DNA durch Bildung von Duplices. Anschließende Waschungen werden bei zunehmend höheren Temperaturen durchgeführt (z.B. in Intervallen von 10ºC), wobei der Primer selektiv von der Wildtyp-t-PA-DNA dissoziiert, bis nur perfekt gepaarte Mutantenmoleküle hybridisiert bleiben. Die Mutantenmoleküle werden durch Autoradiographie identifiziert. Die erforderliche Endtemperatur kann theoretisch berechnet werden. Vorzugsweise wird eine Temperatur gewählt, die die Schmelztemperatur To (Punkt von 50 % Dissoziation des Primers) um 4 bis 8ºC übersteigt. Die Temperatur To wird berechnet durch Addieren eines Inkrements von 2º für jedes AT-Basenpaar und eines Inkrements von 4º für jedes GC-Basenpaar des perfekt basengepaarten Primer-mutierten-t-PA-Gen-Duplex zwischen dem Oligodesoxyribonucleotid-Primer und dem mutierten t-PA-Gen.
Reine Mutantenphagen werden erhalten durch Retransfektion eines Rezipienten-Mikroorganismen- Stammes, wie eines E.coli-Stammes, mit den identifizierten primären Mutantenphagen und erneutes Screening der Plaques hinsichtlich Phagen-DNA, die das mutierte t-PA-Gen enthält, durch Dot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung des obigen mutagenen Oiigodesoxyribonucleotid-Primers (³²P-markiert).
Das mutierte t-PA-Gen wird aus der replikativen Form des Phagen mittels geeigneter Restriktionsendonucleasen exzisiert und für das Klonieren in einem Hybridvektor verwendet.

3. Für Mutanten-t-PA-Proteine codierende DNA-Sequenzen enthaltende Hybridvektoren:

Die Erfindung betrifft auch Hybridvektoren, umfassend einen Promotor und eine für erfindungsgemäßes humanes Mutanten-t-PA-Protein codierende DNA-Sequenz, welche DNA-Sequenz unter der Transcriptionskontrolle des genannten Promotors steht.
Erfindungsgemäße Hybridvektoren werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Hybridplasmid und einem linearen DNA-Vektor und werden weiter ausgewählt in Abhängigkeit von dem für die Transformation ins Auge gefaßten Wirtsorganismus.
Promotoren von Säugerzellen sind beispielsweise virale Promotoren, wie HTLV, SV40, Vaccinia- Promotor und dergleichen.
Promotoren für Hefe, die die am meisten bevorzugten Wirtszellen gemäß dieser Erfindung sind, werden aus der genomischen DNA von Hefe erhalten, speziell von Saccharomyces cerevisiae. Vorzugsweise wird der Promotor eines hochexprimierten Hefegens für die Expression von t-PA-Mutanten verwendet. Also kann der Promotor vom TRP1-Gen, ADHI- oder ADHII-Gen, saure Phosphatase (PHO5)-Gen, Isocytochrom-c-Gen, oder ein Promotor von den Genen, die für glycolytische Enzyme codieren, wie der Promotor von Enolase-, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase- (GAPDH), 3-Phosphoglycerat-Kinase-(PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphat-Isomerase-, 3-Phosphoglycerat-Mutase-, Pyruvat-Kinase-, Triosephosphat-Isomerase-, Phosphoglucose-Isomerase-, Invertase- und Glucokinase-Genen, oder ein Promotor der kreuzenden Hefe-Pheromon-Gene, die für den a- oder α-Faktor codieren, verwendet werden. Bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Promotoren mit Transcriptionskontrolle. Promotoren dieses Typs, z.B. der Promotor des PHO5-Gens, können durch Variation der Wachstumsbedingungen auf- oder abgedreht werden. Beispielsweise kann der PHO5-Promotor nach Belieben reprimiert oder dereprimiert werden, allein durch Erhöhen oder Senken der Konzentration von anorganischem Phosphat in dem Medium. Der Promotor kann also während der exponentiellen Wachstumsphase der Hefe reprimiert werden, und nur während der frühen stationären Phase bei maximaler Zelldichte, die Expression des Gens, kontrolliert durch den PHO5-Promotor, erlaubt, aufgedreht (dereprimiert) werden. Diese Eigenschaft vereinigt mit einem hohen Niveau der Transcription macht den PHO5-Promotor zum bevorzugten Promotor dieser Erfindung.
In den erfindungsgemäßen Hybridvektoren ist der Promotor operabel verknüpft mit der Mutanten-t-PA codierenden Region, um effektive Expression des Mutanten-t-PA zu gewährleisten. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor direkt verknüpft mit der codierenden Region der reifen t-PA-Mutante, wobei ein Translationsstartsignal (ATG) an der Verbindungsstelle inseriert ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn Hefe als Wirtsorganismus verwendet wird, ist eine Signalsequenz in der Konstruktion inkludiert. Geeignete Signalsequenzen sind die natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpften, speziell die PHO5- oder Invertase-Signalsequenz, oder die t-PA-Signalsequenz. Andere Signalsequenzen wie die der Hefe-Invertase- oder α-Faktor-Gene, können auch verwendet werden. Alternativ können fusionierte Signalsequenzen durch Ligation eines Teils der Signalsequenz des natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpften Gens mit einem Teil der t-PA-Signalsequenz konstruiert werden. Es werden diejenigen Kombinationen favorisiert, die präzise Spaltung zwischen der Signalsequenz und der Aminosäuresequenz von reifem t-PA erlauben. Weitere Sequenzen wie Pro- oder Spacer-Sequenzen, die spezifische Processingsignale tragen können oder auch nicht, können auch in den Konstruktionen eingeschlossen sein, um genaues Processing von Vorläufer-Molekülen zu erleichtern. Alternativ können fusionierte Proteine generiert werden, die innere Processing-Signale enthalten, welche geeignete Reifung in vitro und in vivo erlauben. Vorzugsweise enthalten die Processing-Signale einen Lys-Arg-Rest, der durch eine in den Golgi-Membranen lokalisierte Hefe-Endopeptidase erkannt wird. Nach Expression des Mutanten-t-PA-Gens tritt das Genprodukt in den sekretorischen Weg ein und wird in den periplasmatischen Raum transportiert. Wenn weitere Exkretion durch die Zellwand hindurch in das Kulturmedium erreicht werden kann, sollte ein beträchtlicher Anstieg der Ausbeuten möglich sein. Auch das Gewinnungsverfahren kann vereinfacht werden, wenn keine Zellen aufzubrechen sind.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Hybridvektoren auch die 3'-flankierende Sequenz eines Gens, das die passenden Signale für Transcriptions-Termination und Polyadenylierung enthalten. Geeignete 3'-flankierende Regionen sind zum Beispiel die des natürlich mit dem verwendeten Promotor verknüpften Gens, im Falle von Hefe speziell flankierende Sequenzen des PHO5-Gens.
Die Erfindung betrifft speziell einen linearen DNA-Vektor, bestehend aus einer für erfindungsgemäßes humanes Mutanten-t-PA-Protein codierenden DNA-Sequenz, wahlweise einschließlich einer Signalsequenz, flankiert von natürlich in einem chromosomalen Gen vorkommenden Sequenzen, wie der Promotor-Region eines chromosomalen Wirt-Gens am 5'-Ende und (Teil einer) 3'-flankierenden Region des genannten Gens am 3'-Ende. Speziell betrifft die Erfindung eine lineare DNA, umfassend den Hefe-PHO5-Promotor, die Mutanten-t-PA codierende Region und die PHO5-3'-flankierende Region.
Auf Grund der homologen 3'- und 5'-flankierenden Sequenzen ist der gesamte lineare DNA-Vektor einschließlich des Mutanten-t-PA-Gens stabil integriert in das jeweilige Wirts-Chromosom, d.h. im Falle des Hefe-PHO5-Promotors und der 3'-flankierenden Sequenzen des Hefe-PHO5-Gens am PHO5-Locus im Hefe-Chromosom II.
Die Erfindung betrifft auch speziell ringförmige Hybridplasmide, die abgesehen vom Promotor, einer für erfindungsgemäßes humanes Mutanten-t-PA-Protein codierenden DNA-Sequenz, wahlweise einschließlich einer Signalsequenz, und 3'-flankierenden Sequenzen weitere DNA-Sequenz(en) enthalten, die nicht essentiell oder weniger wichtig für die Funktion des Promotors, d.h. für die Expression der modifiziertes t-PA codierenden Region sind, die aber wichtige Funktionen beispielsweise bei der Vermehrung der mit den besagten Hybridplasmiden transformierten Zellen haben. Die zusätzliche(n) DNA-Sequenz(en) kann (können) von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen abgeleitet werden und kann (können) chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Sequenzen einschließen. Zum Beispiel können die zusätzlichen DNA-Sequenzen von Plasmid- DNA stammen (oder daraus bestehen), wie bakterielle oder eukaryotische Plasmid-DNA, virale DNA und/oder chromosomale DNA, wie bakterielle, Hefe- oder höhere eukaryotische chromosomale DNA. Bevorzugte Hybridplasmide enthalten zusätzliche DNA-Sequenzen, die abgeleitet sind von bakteriellen Plasmiden, speziell Escherichia coli-Plasmid pBR322 oder verwandten Plasmiden, Bakteriophage λ, Hefe-2u-Plasmid und/oder chromosomaler Hefe-DNA.
In den bevorzugten Hybridplasmiden dieser Erfindung tragen die zusätzlichen DNA-Sequenzen einen Hefe-Replikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridplasmide, die einen Hefe-Replikationsursprung enthalten, z.B. ein autonom replizierendes Segment (ars), bleiben nach der Transformation extrachromosomal in der Hefezelle und werden autonom bei Mitose repliziert. Hybridplasmide, die zu Hefe-2u-Plasmid-DNA homologe Sequenzen enthalten, können auch verwendet werden. Diese Hybridplasmide werden durch Rekombination in 2u-Plasmide integriert, die schon in der Zelle vorhanden sind, oder replizieren autonom. 2u-Sequenzen sind speziell geeignet für Plasmide hoher Transformationsfrequenz und führen zu hohen Kopienzahlen.
Weiters können die bevorzugten Hybridplasmide gemäß dieser Erfindung eine DNA-Sequenz als Teil des Gens einschließen, das im Wirt-Hefechromosom vorliegt (z.B. PHO5-Gen oder sein Promotor, verknüpft mit der Mutanten-t-PA codierenden Region). Aufgrund der homologen Sequenz, die sich auf eine Ausdehnung von etwa 20 bis 100 Desoxynucleotiden belaufen sollte, kann das ganze Plasmid oder lineare Fragmente davon stabil durch Rekombination in das Wirt-Chromosom eingebracht werden. Während der Vermehrung werden die Progenitorzellen das eingeführte genetische Material sogar ohne selektiven Druck halten.
Was den selektiven Genmarker für Hefe betrifft, kann jedes Markergen verwendet werden, das die Selektion hinsichtlich Transformanten aufgrund phänotypischer Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker für Hefe sind insbesondere die, die antibiotische Resistenz exprimieren oder, im Falle auxotropher Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen z.B. Resistenz gegen das Antibiotikum Cycloheximid oder bieten Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, z.B. URA3-, LEU2-, HIS3- oder TRP1-Gen. Es ist auch möglich, als Marker Strukturgene zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt daß der zu transformierende Wirt auxotroph ist für das Produkt, das durch den Marker exprimiert wird.
Vorteilhafterweise enthalten die zusätzlichen DNA-Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Hybridplasmiden vorliegen, auch einen Replikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für einen bakteriellen Wirt, speziell Escherichia coli. Es gibt nützliche Merkmale, die mit der Gegenwart eines E.coli-Replikationsursprungs und eines E.coli-Markers in einem Hefe-Hybridplasmid assoziiert sind. Erstens können große Mengen Hybridplasmid-DNA durch Wachstum und Amplifikation in E.coli erhalten werden, und zweitens erfolgt die Konstruktion von Hybridplasmiden geeignet in E.coli unter Nützung des gesamten Repertoirs der auf E.coli basierenden Klonierungstechnik. E.coli-Plasmide, wie pBR322 und dergleichen, enthalten einen E.coli-Replikationsursprung und genetische E.coli-Marker, die Resistenz gegen Antibiotika, z.B. Tetracyclin und Ampicillin, verleihen, und werden vorteilhaft als Teil der Hefe-Hybridvektoren verwendet.
Die zusätzlichen DNA-Sequenzen, die z.B. den Replikationsursprung und genetische Marker für Hefe und einen bakteriellen Wirt enthalten, (s. oben) werden hier im folgenden als "Vektor- DNA" bezeichnet, die zusammen mit dem Hefe-Promotor und der Mutanten-t-PA codierenden Region ein erfindungsgemäßes Hybridplasmid bildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Hybridplasmide, die zu autonomer Replikation in einem Hefe-Wirtsstamm befähigt sind und selektive Marker haben, und auf lineare DNAs, die sich in das Wirtschromosom integrieren, umfassend einen Hefe-Promotor und eine DNA-Sequenz, die für ein humanes Mutanten-t-PA-Protein gemäß dieser Erfindung codiert, wobei besagte DNA-Sequenz zusammen mit Transcriptions-Start- und -Terminations-Signalen sowie codierten Translations-Start- und -Stop-Signalen in dem Hybridvektor unter der Kontrolle des Promotors steht, so daß in einem transformierten Wirtsstamm exprimiert wird, um den Mutanten- Gewebe-Plasminogenaktivator zu produzieren.
Die bevorzugten Hybridvektoren der vorliegenden Erfindung werden nach auf dem Gebiet bekannten Methoden hergestellt, z.B. durch Verknüpfen eines Hefe-Promotors, einer Mutanten-t-PA codierenden Region, der 3'-flankierenden Sequenz eines Hefegens und wahlweise Vektor-DNA.
Für die Herstellung von Hybridplasmiden kann geeignet kartierte ringförmige Vektor-DNA, zum Beispiel bakterielle Plasmid-DNA oder dergleichen (s. oben), die zumindest eine Restriktionsstelle hat, vorzugsweise zwei oder mehr Restriktionsstellen, verwendet werden. Vorteilhaft enthält die Vektor-DNA schon Replikationsursprünge und Genmarker für Hefe und/oder einen bakteriellen Wirt. Die Vektor-DNA wird unter Verwendung einer geeigneten Restriktionsendonuclease gespalten. Die restringierte DNA wird an ein DNA-Fragment ligiert, das den Hefe-Promotor enthält, und an das DNA-Segment, das für den Mutanten-t-PA codiert. Vor oder nach dem Anknüpfen des Promotors und der Mutanten-t-PA codierenden Region (oder auch gleichzeitig) ist es möglich, Replikationsursprünge und/oder Marker für Hefe oder einen bakteriellen Wirt einzuführen. In jedem Fall sind die Restriktions- und Ligationsbedingungen so zu wählen, daß es keine Störung der essentiellen Funktionen der Vektor-DNA und des Promotors gibt. Der Hybridvektor kann sequentiell oder durch Ligation zweier DNA-Segmente, die alle interessierenden Sequenzen enthalten, aufgebaut werden.
Verschiedene Techniken können herangezogen werden, um DNA-Segmente in vitro zu verbinden. Stumpfe Enden (vollständig basengepaarte DNA-Doppelstränge), die durch gewisse Restriktionsendonucleasen gebildet werden, können direkt mit T4-DNA-Ligase ligiert werden. Üblicher werden die DNA-Segmente durch ihre einzelsträngigen, kohäsiven Enden verknüpft und kovalent geschlossen durch eine DNA-Ligase, z.B. T4-DNA-Ligase. Solche einzelsträngige "kohäsive Enden" können durch Spaltung mit einer anderen Klasse von Endonucleasen gebildet werden, welche versetzte Enden (die beiden Stränge des DNA-Duplex werden an verschiedenen Punkten im Abstand von einigen Nucleotiden gespalten) bilden. Einzelne Stränge können auch durch Zugabe von Nucleotiden zu stumpfen Enden oder versetzten Enden unter Verwendung von Terminaler Transferase ("Homopolymer-Tailing") oder durch einfaches Zurückschneiden eines Stranges eines stumpfendigen DNA- Segmentes mit einer geeigneten Exonuclease, wie λ-Exonuclease, gebildet werden. Ein weiterer Weg zur Produktion versetzter Enden besteht im Ligieren einer chemisch synthetisierten Linker-DNA, die eine Erkennungsstelle für eine versetzte Enden bildende Exonuclease enthält, an das stumpfendige DNA-Segment und Verdauen der resultierenden DNA mit der entsprechenden Endonuclease.
Die Komponenten des erfindungsgemäßen Hybridvektors, wie der Hefe-Promotor, Strukturgen für den Mutanten-t-PA, wahlweise einschließlich einer Signalsequenz, Transcriptionsterminator, Replikationssystem, etc. sind in vorbestimmter Reihenfolge miteinander verknüpft, um richtige Funktion zu gewährleisten. Die Komponenten werden durch gemeinsame Restriktionsstellen verbunden oder durch synthetische Linker-Moleküle, um passende Orientierung und Reihenfolge der Komponenten zu gewährleisten.
Eine lineare Vektor-DNA wird nach auf dem Gebiet bekannten Methoden hergestellt, z.B. Anknüpfen des obigen Hefepromotors an die Mutanten-t-PA codierende Region derart, daß die Mutanten-t-PA codierende Region durch den Promotor kontrolliert wird, und Versehen der resultierenden DNA mit einem DNA-Segment, das Transcriptions-Terminations-Signale enthält, die von einem Hefegen abgeleitet sind.
Verbinden der DNA-Segmente erfolgt wie oben detailliert angeführt, nämlich durch Ligation stumpfer Enden, über kohäsive Enden oder durch chemisch synthetisierte Linker-DNAs.
Insbesondere muß für wirkungsvolle Expression das Mutanten-t-PA-Gen in bezug auf Sequenzen, die Transcriptions- (Hefe-Promotor) und Translationsfunktionen (Ribosomen-Bindungsstellen) haben, passend lokalisiert sein. Erstens muß die Ligation des DNA-Segments, das den Promotor umfaßt, mit der Mutanten-t-PA codierenden Region in passender Orientierung erreicht werden. Wenn zwei Orientierungen möglich sind, wird die korrekte durch herkömmliche Restriktionsanalyse bestimmt. Hybridvektoren, die ein inkorrekt orientiertes Mutanten-t-PA-Gen-Insert enthalten, werden reorientiert durch Exzision des Geninserts mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease und erneute Ligation des Gens mit dem Hybridvektor-Fragment. In jedem Fall wird unpassende Orientierung vermieden durch Ligation zweier DNA-Segmente, jedes mit unterschiedlichen Restriktionsstellen an den Enden. Weiters sollte die Konstruktion des Hybridvektors auf solche Art erfolgen, daß die korrekte Transcriptions-Initiation und -Termination möglich ist. Was den letzteren Punkt betrifft, sollte das Transcript vorzugsweise in einer DNA-Sequenz enden, die abgeleitet ist von chromosomaler Hefe-DNA oder Hefe-2u-Plasmid. Zweitens muß der passende Leserahmen etabliert werden. Gewöhnlich kennt man die Nucleotidsequenz der Promotorregion und der Mutanten-t-PA codierenden Region vor der Ligation, oder sie kann leicht bestimmt werden, so daß es keine Probleme beim Aufstellen des korrekten Leserahmens gibt.
Wenn die Expression von reifem Mutanten-t-PA für die Akkumulierung im Cytoplasma erwünscht ist, müssen Signalsequenzen oder Teile davon wahlweise anschließend an die Promotor-Region und/oder wahlweise vor der reifen Mutanten-t-PA codierenden Region eliminiert werden, z.B. durch Verdauung mit einer Exonuclease, z.B. mit Bal31. Eine bevorzugte Region für die direkte Verbindung eines Hefe-Promotors mit der Mutanten-t-PA codierenden Sequenz ist zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ATG des Gens, das natürlich mit dem Hefe-Promotor verknüpft ist. Für eine Verbindung in dieser Region sollte die Mutanten-t-PA codierende Sequenz ihr eigenes ATG für die Translations-Initiation haben, oder es muß mit einem weiteren synthetischen Oligonucleotid bereitgestellt werden. Der Hefe-Promotor kann auch mit der Mutanten-t-PA codierenden Sequenz durch ein synthetisches Oligodesoxyribonucleotid als verbindendes Molekül verknüpft werden. Die Promotor-Region kann also, wenn möglich, nahe dem 3'-Terminus restringiert werden, so daß ihr eine vorbestimmte Zahl von Basenpaaren fehlt. Analog kann die Mutanten-t-PA codierende Sequenz nahe ihrem 5'-Terminus restringiert werden. Ein synthetisches Oligodesoxynucleotid kann dann auf solche Art konstruiert werden, daß, wenn der Hefe-Promotor und die Mutanten-t-PA codierende Sequenz über das verbindende Oligodesoxynucleotid verbunden werden, die fehlenden Basenpaare wiederhergestellt werden einschließlich eines ATG-Translations-Initiationssignals und die Mutanten-t-PA codierende Sequenz ist im passenden Leserahmen in bezug auf das ATG-Initiations-Codon.

4. Transformation von Wirtszellen mit Hybridvektoren, die eine Mutanten-t-PA codierende Sequenz enthalten:

Ein anderer Aspekt der Erfindung involviert transformierte eukaryotische Wirtszellen, die eine für erfindungsgemäßes Mutanten-t-PA-Protein codierende DNA-Sequenz enthalten.
Geeignete eukaryotische Wirtszellen sind speziell die, die oben spezifiziert wurden, insbesondere Hefen, einschließlich Spezies der Gattungen Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis und verwandter Gattungen (vgl. J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971), speziell Stämme von Saccharomyces cerevisiae.
Die transformierten eukaryotischen Wirtszellen werden ausgewählt aus einer Wirtszelle, die transformiert ist mit einem Hybridplasmid umfassend einen Promotor und eine für menschlichen Mutanten-t-PA gemäß dieser Erfindung codierende DNA-Sequenz, welche DNA-Sequenz sich unter der Transcriptionskontrolle des genannten Promotors befindet, und einer Wirtszelle, in der besagte DNA-Sequenz stabil in ein Wirts-Chromosom integriert ist und unter Transcriptionskontrolle eines chromosomalen Wirts-Promotors ist.
Das Verfahren zur Herstellung besagter transformierter eukaryotischer Wirtszellen umfaßt das Transformieren eukaryotischer Wirtszellen mit einem Hybridvektor umfassend einen Promotor und eine für menschliches Mutanten-t-PA-Protein gemäß dieser Erfindung codierende DNA-Sequenz, welche DNA-Sequenz sich unter der Transcriptionskontrolle des besagten Promotors befindet.
Die Transformation der eukaryotischen Wirtszellen erfolgt nach auf dem Gebiet bekannten Methoden. Zum Beispiel kann die Transformation von Hefe mit den Hybridvektoren nach der von Hinnen u.a. beschriebenen Methode erfolgen [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Dieses Verfahren kann in drei Schritte unterteilt werden:
(1) Entfernung der Hefezellwand oder von Teilen davon. (2) Behandlung der "nackten" Hefezellen (Sphäroplasten) mit der transformierenden DNA in Gegenwart von PEG (Polyethylenglycol) und Ca²&spplus;-Ionen. (3) Regenerieren der Zellwand und Selektion der transformierten Zellen in einer festen Agar-Schicht.
Bevorzugte Verfahren: ad (1): Die Hefezellwand wird enzymatisch unter Verwendung verschiedener Zubereitungen von Glucosidasen, wie Darmsäfte der Schnecke (z.B. Glusulase oder Helicase ) oder Enzymmischungen, die von Mikroorganismen (z.B. Zymolyase ) erhalten werden, in osmotisch stabilisierten Lösungen (z.B. 1 M Sorbitol).
ad (2): Die Hefe-Sphäroplasten aggregieren in Gegenwart von PEG und lokale Fusionen der cytoplasmatischen Membranen werden induziert. Das Generieren von "fusionsähnlichen" Bedingungen ist kritisch, und viele transformierte Hefezellen werden während des Transformationsverfahrens diploid oder sogar triploid. Verfahren, die Selektion fusionierter Sphäroplasten erlauben, können angewendet werden, um Transformanten anzureichern, d.h. transformierte Zellen können unter vorgewählten Fusionsprodukten leicht gescreent werden.
ad (3): Da sich Hefezellen ohne Zellwände nicht teilen, muß die Zellwand regeneriert werden. Dieses Regenerieren erfolgt passend durch Einbetten der Sphäroplasten in Agar. Beispielsweise wird geschmolzener Agar (etwa 50ºC) mit den Sphäroplasten vermischt. Beim Abkühlen der Lösung auf Wachstumstemperaturen der Hefe (etwa 30ºC) wird eine feste Schicht erhalten. Diese Agar- Schicht soll schnelle Diffusion und Verlust essentieller Makromoleküle aus den Sphäroplasten verhindern und dadurch die Regeneration der Zellwand erleichtern. Die Regeneration der Zellwand kann jedoch auch (obgleich bei geringerer Effizienz) durch Plattieren der Sphäroplasten auf die Oberfläche vorgeformter Agar-Schichten erreicht werden.
Vorzugsweise wird der Regenerationsagar derart hergestellt, daß Regeneration und Selektion transformierter Zellen gleichzeitig möglich sind. Da Hefe-Gene, die für Enzyme von biosynthetischen Aminosäure-Wegen codieren, im allgemeinen als selektive Marker (supra) verwendet werden, erfolgt die Regeneration vorzugsweise in Hefe-Minimalmedium-Agar. Wenn sehr hohe Effizienz der Regeneration erforderlich ist, ist die folgende Vorgangsweise in zwei Schritten vorteilhaft: (1) Regeneration der Zellwand in einem reichen Komplexmedium und (2) Selektion der transformierten Zellen durch Replika-Plattierung der Zellschicht auf selektive Agarplatten.
Wenn der Hybridvektor kein Markergen enthält, können die transformierten Zellen auch mittels anderer Methoden identifiziert werden. Solche Methoden schließen z.B. in situ-Hybridisierung mit einem markierten DNA-Fragment, das zu Sequenzen des Hybridvektors homolog ist [z.B. nach Hinnen u.a., supra], in situ-Immunoassays, vorausgesetzt daß ein Antikörper für das Produkt des eingeführten Gens verfügbar ist, oder andere Screening-Methoden, die Genprodukte ermitteln, für die vom (von den) transformierenden Plasmid(en) codiert wird, ein.
Alternativ kann die Hefe co-transformiert werden mit einem Hybridvektor gemäß dieser Erfindung und einem zweiten Vektor, der einen genetischen Marker für Hefe enthält. Wenn die beiden unterschiedlichen Vektoren DNA-Sequenzen gemeinsam haben (das können bakterielle Sequenzen sein, die auf den Vektoren vorhanden sind), erfolgt Rekombination, die zu einem fusionierten, selektierbaren Hybridmolekül führt.
Die Hefe kann auch mit einem linearen DNA-Vektor cotransformiert werden, bestehend aus dem Hefe-Promotor, der Mutanten-t-PA codierenden Region, wahlweise einschließlich einer Signalsequenz, kontrolliert durch den besagten Promotor, und Transcriptions-Terminationssignalen eines Hefe-Gens, und einem Vektor, der einen selektiven Marker für Hefe enthält. Die Cotransformation erlaubt Anreicherung jener Hefezellen, die DNA aufgenommen haben, für die nicht direkt selektiert werden kann. Da kompetente Zellen jedweden Typ DNA aufnehmen, wird ein hoher Prozentsatz von Zellen, die mit einem selektiven Vektor transformiert wurden, auch zusätzliche DNA (wie den obigen linearen DNA-Vektor) enthalten. Aufgrund ausreichend langer homologer Sequenzen (z.B. etwa 20 bis 100 Desoxynucleotide lang) wird das Polypeptid-Gen stabil in das Wirts-Chromosom integriert.
Die transformierten eukaryotischen Wirtszellen, speziell die transformierten Hefestämme, die die erfindungsgemäßen Hybridplasmide enthalten oder den linearen Vektor haben, der das Mutanten-t-PA-Gen stabil in ein Wirts-Chromosom integriert hat, können bei der Produktion von Mutanten-t-PA durch Mutation und Selektion unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Methoden verbessert werden. Die Mutation kann zum Beispiel durch UV-Strahlung oder geeignete chemische Agenzien erfolgen. Speziell bevorzugt wird die Produktion von Mutanten mit Proteasemangel, speziell Hefemutanten, um proteolytischen Abbau des produzierten Mutanten-t-PA innerhalb der Zellen zu vermeiden.

5. Pharmazeutische Zubereitungen:

Die neuartigen Mutanten-t-PA-Proteine, die vorzugsweise in der Einketten-Form vorliegen, die erfindungsgemäß erhältlich sind, weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf. Sie können analog zu bekannten Plasminogenaktivatoren in Menschen verwendet werden zur Prevention oder Behandlung von Thrombose oder anderen Zuständen, wo es wünschenswert ist, lokale fibrinolytische oder proteolytische Aktivität über den Mechanismus der Plasminogenaktivierung hervorzurufen, wie Arteriosklerose, Myokard- oder Cerebralinfarkt, Venenthrombose, Thromboembolie, postchirurgische Thrombose, Thrombophlebitis und diabetische Vasculopathien.
Es wurde überraschend festgestellt, daß die erfindungsgemäßen neuen Mutanten-t-PA-Proteine biologische Aktivitäten haben, die denen von voll glycosyliertem natürlichem t-PA vergleichbar oder überlegen sind. Die neuen t-PA-Mutanten sind also fibrinolytisch aktiv. Die einzigartigen auf Fibrin gerichteten Eigenschaften, d.h. die Fähigkeit, Plasminogen nur in Gegenwart von Fibrin zu aktivieren, werden voll beibehalten. Weiters haben die neuen Proteine verlängerte Stabilität in vitro im Vergleich zu authentischem t-PA. Offensichtlich sind die neuen Proteine, denen es teilweise oder vollständig an N-verknüpften Kohlenhydratketten mangelt, weniger empfindlich gegen proteolytischen Abbau als das voll glycosylierte Produkt.
Das Beibehalten der biologischen Aktivität von Glycoproteinen ohne Kohlenhydratreste ist unvorhersehbar und variabel. In einigen Fällen führte Deglycosylierung oder sogar teilweise Deglycosylierung zu Beeinträchtigung oder Verlust der biologischen Aktivität [D.R. Karp u.a., J. Biol. Chem. 257, 7330 (1982); H.T. Kentmans u.a., Biochemistry 22, 3067 (1983); H.R. Gradnick u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2771 (1983)]. Die überraschenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mutanten-t-PAs sind nicht ganz von früheren Ergebnissen herleitbar, die aus chemisch oder enzymatisch deglycosyliertem t-PA erhalten wurden (S.P. Little u.a., supra; PCT 84/1960, supra), da chemische oder enzymatische Behandlung von t-PA offensichtlich nicht zu einem Produkt führt, in dem N-verknüpfte Kohlenhydratketten vollkommen abwesend sind oder zumindest einige der N-verknüpften Kohlenhydratketten fehlen.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffes (Einketten- oder Zweiketten-Mutanten-t-PA oder Gemische davon, vorzugsweise die Einketten-Form) zusammen mit anorganischen oder organischen, festen oder flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die für parenterale, d.h. intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung geeignet sind und mit den Wirkstoffen nicht in nachteiliger Wechselwirkung stehen, enthalten.
Es gibt geeignete Infusionslösungen, vorzugsweise wäßrige Lösungen oder Suspensionen, wobei es möglich ist, diese vor der Verwendung herzustellen, z.B. aus lyophilisierten Zubereitungen, die den Wirkstoff allein oder zusammen mit einem Träger, wie Mannitol, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen, enthalten. Die pharmazeutischen Zubereitungen werden sterilisiert und, falls gewünscht, mit Adjuvantien vermischt, z.B. mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Emulgatoren, Solubilisierungsmitteln, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks. Die Sterilisation kann durch Sterilfiltration durch Filter kleiner Porengröße (0,45 um Durchmesser oder kleiner) erreicht werden, wonach die Zubereitung lyophilisiert werden kann, falls das erwünscht ist. Antibiotika können auch zugesetzt werden, um das Konservieren der Sterilität zu unterstützen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen werden in Dosierungseinheitsformen, z.B. Ampullen, abgegeben, umfassend 1 bis 2000 mg eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers pro Dosierungseinheit und etwa 1 bis 100 mg, vorzugsweise etwa 3 bis 25 mg Wirkstoff (Einketten- oder Zweiketten-Mutanten-t-PA oder Gemische davon, bevorzugt Einketten-Form) pro Dosierungseinheit.
In Abhängigkeit von der Art der Erkrankung und dem Alter und Zustand des Patienten liegt die zu verabreichende tägliche Dosis für die Behandlung eines Patienten mit, ungefähr 70 kg im Bereich von 3 bis 100 mg, vorzugsweise 5 bis 50 mg pro 24 Stunden. Im Falle eines Myocardinfarktes wird vorzugsweise eine Dosis von etwa 30 bis etwa 80 mg innerhalb von 60 bis 120 Minuten verabreicht, vorzugsweise in drei Aliquoten und innerhalb von etwa 90 Minuten.
Die Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß ein biologisch aktives Protein gemäß dieser Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt wird.
Die Verwendung der neuen Proteine für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung des menschlichen Körpers ist ebenfalls ein Gegenstand dieser Erfindung.
Die Erfindung betrifft speziell die DNA-Sequenzen, die Hybridvektoren, die transformierten Wirtsstämme, die Mutanten-t-PA-Proteine und Verfahren zur Herstellung davon, wie in den Beispielen beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Im folgenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen Fig. 1 die DNA und entsprechende Aminosäuresequenzen von t-PA-DNA von HeLA-Zellen bietet. Die Glycosylierungsorte sind unterstrichen. Der Pfeil zeigt die vermutliche Spaltstelle zwischen Arg und Ile, die die Zweiketten-Form von t-PA aus der Einketten-Form generiert. Fig. 2 stellt die DNA-Sequenzen der mutierten t-PA-Gene und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der Mutanten-t-PA-Proteine gemäß dieser Erfindung dar. Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Gerinnselauflösungs-Aktivität von Mutanten-t-PAs, nämlich [Asn¹¹&sup9;]-t-Pa (Gerade 3), [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;]-t-Pa (Gerade 4) und [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA (Gerade 5) im Vergleich mit authentischem Human-Melanom-t-PA (Gerade 1) und Hefe-Wildtyp-t-PA (Gerade 2) zeigt. Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm, das Immunodetektion von Mutanten-t-PAs durch Western Blots zeigt.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, sollen aber nicht als Einschränkung ausgelegt werden.

Experimenteller Teil:

Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet: BSA = Rinderserumalbumin; DTT = 1,4-Dithiothreitol (1,4-Dimercapto-2,3-butandiol); EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; PEG = Polyethylenglycol 6000; SDS = Natriumdodecylsulfat; SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, 0,5 mM EDTA enthaltende Lösung, mit HCl eingestellt auf pH 7,2; TBE = 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2,5 mM Titriplex enthaltende Lösung; TE = 10 mM Tris.HCl (pH 8,0) und 0,1 mM EDTA (pH 8,0) enthaltende Lösung; TNE = 100 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA enthaltende Lösung; Tris.HCl = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, pH mit HCl eingestellt.

Beispiel 1: Klonierung eines p31/PHO5-TPA18 BamHI-HindIII-Fragments, das das Gewebe-Plasminogenaktivator-Gen enthält, in M13mp8

a) das Plasmid p31/PHO5-TPA18 (wie in der europäischen Patentanmeldung 143,081 beschrieben), hat den PHO5-Promotor und die PHO5-Signalsequenz im Rahmen fusioniert zu dem t-PA-Strukturgen (Vgl. Fig. 1). Das Plasmid passiert DH-1 (F(-), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk(-), mk(+)), supE44, λ(-)), einen dam(-)-Stamm von E.coli. Zwei amp -Kolonien werden isoliert und in 100 ml LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNA wird aus den Zellen isoliert. Restriktionsenzym-Verdaue mit BamHI und HindIII (Boehringer) zeigen die korrekte Größe des t-PA-Gen-Inserts, was durch das Restriktionsmuster des PstI-Verdaus (Boehringer) bestätigt wird.
b) Drei ug p31/PHO5-TPA18 vom E.coli-Stamm DH-1 werden bei 37ºC 60 Minuten inkubiert mit 20 U HindIII (Boehringer, 20 U/ul) in 50 ul von 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol. Ein Aliquot wird auf 1%igem Agarosegel in TBE-Puffer geprüft, um vollständige Verdauung zu bestätigen. Der Verdau wird bei 65ºC 10 min inkubiert. Dann werden 0,5 ul 5 M NaCl zugesetzt, gefolgt von 18 U BamHI (Boehringer, 18 U/ul). Das wird bei 37ºC 60 min inkubiert. Analyse eines Aliquots auf 1%igem Agarosegel in TBE-Puffer zeigt das 2,3-Kb-Insert neben dem 3,6-Kb-Vektorfragment. Das Insert wird an 0,8%igem präparativem Agarosegel isoliert. Das Gelstück wird in ein Micro-Colloidon -Röhrchen (Sartorius GmbH) transferiert, mit 100 ul TE bedeckt und elektroeluiert (Elektrophorese bei 90 mA, 50 min). Die TE-Lösung wird in einem siliconisierten Röhrchen gesammelt. Die DNA wird mit 2,5 Volumina absoluten Ethanol nach Zugabe von 0,1 Volumen 10xTNE ausgefällt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem 80%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 20 ul TE (13 fmol/ul) resuspendiert.
c) Drei ug M13mp8 (RF-Form) werden mit HindIII und BamHI geschnitten, und das 7,3 Kb-Fragment wird an 0,8%igem präparativem Agarosegel isoliert, elektroeluiert und wie oben ausgefällt. Die DNA wird in 20 ul TE (30,8 fmol/ul) resuspendiert.
d) 92 fmol M13mp8 BamHI-HindIII-geschnittener Vektor und 130 fmol BamHI-HindIII-t-PA-Insert werden in 20 ul von 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 1 ug Gelatine (Sigma) mit 400 U T4-DNA-Ligase (New England Bio Labs, 400 U/ul) 18 Stunden bei 15ºC ligiert. Nach Inkubation bei 65ºC für 10 Minuten wird ein 1-ul-Aliquot des Ligationsgemischs verdünnt (1:10 mit TE). 2 ul und 8 ul dieses verdünnten Ligationsgemischs werden für die Transformation von E.coli JM101-Ca²&spplus;-Zellen gemäß dem Manual "M13 Cloning and sequencing handbook", publiziert v. Amersham, verwendet. Aus den 200 farblosen Plaques (8 ul, 1:10 verdünntes Ligationsgem.) werden 25 herausgenommen, und einzelsträngige und Replikativ-Form (RF)-DNA werden präpariert [J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)]. Bei Analyse von RF-DNA zeigen zwei Klone das Insert korrekter Größe (2,3 Kb BamHI-HindIII t-PA-Genfragment). Diese beiden Klone, die das t-PA-Gen mit dem PHO5-Promotor und Terminator enthalten, werden weiter analysiert. Die PstI-, HindIII-EcoRI-, BamHI-EcoRI-Verdaue bestätigen die Gegenwart des 2,3 Kb-Fragments. Einer der Klone wird für weitere Konstruktionen verwendet und als p8A-7 bezeichnet. Beispiel 2: Mutation des ersten Glycosylierungsortes bei Asn 117 unter Verwendung von einzelsträngigem p8A-7 codierender Strang von t-Pa mutagener Primer I mutierter codierender Strang
Alle mutagenen und Sequenzierungs-Primer werden unter Verwendung der Phosphoramidit-Methode [M.H.Caruthers, in Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen u. A. Lang, Hrsg.), Verlag Chemie, Weinheim, BRD] an einem Applied Biosystems synthesizer (Modell 380B) synthetisiert.
Die folgenden Sequenzierungs-Primer werden synthetisiert:
Sequenzierungs-Primer I: dGCCCAGCCTGATGGCGT
Sequenzierungs-Primer II: dCCACGGGAGGCAGGAGG
Sequenzierungs-Primer III: dCAGCACGTGGCACCAGG
Sequenzierungs-Primer IV: dTGGCAGGCGTCGTGCAA
Universal-M13-Sequenzierungs-Primer: dGTAAAACGACGGCCAGT
a) Phosphorylierung von mutagenem Primer: 200 pmol des mutagenen Primers I werden in 20 ul von 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, 1 ul 10 mM ATP enthaltend, unter Verwendung von 8 U T4-Polynucleotidkinase (Boehringer, 8 U/ul) phosphoryliert. Nach Inkubation bei 37ºC für 45 min wird die Reaktion durch 10minütiges Erhitzen bei 65ºC gestoppt.
b) Annealing von mutagenem Primer I und Universal-Sequenzierungs-Primer zu einzelsträngiger Matrize (Template) p8A-7: 0,88 ug (123 fmol) einzelsträngige Matrize p8A-7 werden mit 20 pmol phosphoryliertem mutagenem Oligodesoxyribonucleotid I (10 pmol/ul) und 10 pmol Universal-M13- Sequenzierungs-Primer in 10 ul von 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT bei 55ºC 5 min inkubiert, dann bei RT 5 min abgekühlt.
c) Extensions-Ligations-Reaktion: Zu obiger hybridisierter Mischung gibt man 10 ul Enzym-dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)-Lösung, enthaltend 1 ul Puffer [0,2 mM Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M DTT), 4 ul 2,5 mM dNTP-Mischung, 1 ul 10 mM γ-ATP, 1,4 ul T4-DNA-Ligase (Amersham, 2,5 U/ul), 0,6 ul Klenow-DNA-Polymerase (BRL, 2,99 U/ul)]. Das wird bei 15ºC 8 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Inkubieren bei 65ºC für 10 Minuten gestoppt.
d) Transformation der Ligationsmischung: Die Ligationsmischung wird mit TE 1:20 und 1:200 verdünnt. 1 ul und 5ul jeder dieser verdünnten Lösungen werden verwendet, um 0,2 ml kompetente E.coli JM101-Zellen [J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)] zu transformieren. 36 Plaques werden genommen, Phagen durch PEG-Präzipitation isoliert und in 50 ul TE (0,1-0,16 ug/ul) wiederaufgelöst.
e) Screening von Phagen: 2 ul Phagen-DNA werden auf trockenes Nitrocellulosepapier (Millipore SA., Cat.No. HAWP090, Porengröße 0,45 um) gebracht. Nach Trocknen an Luft wird das Filter 2 Stunden bei 80ºC im Vakuum gebacken.
Das Filter wird mit 5 ml 6x SSC, 10x Denhardt's (0,2 % BSA, 0,2 % Polyvinylpyrrolidon, 0,2 % Ficoll), 0,2 % SDS bei 67ºC eine Stunde in einem heißsiegelbaren Beutel prä-hybridisiert.
Das Filter wird entfernt und in 50 ml 6x SSC bei Raumtemperatur 1 min gespült. Das Filter wird in einem verschließbaren Beutel gebracht. Drei ml 6x SSC, 10x Denhardt's und 100 ul ³²P-markierter mutagener Primer I (5x10&sup6; cpm) werden zugesetzt.
Der Beutel wird 1 Stunde auf Raumtemperatur gehalten. Das Filter wird entfernt und mit 6x SSC (50 ml x 3) insgesamt 10 min bei Raumtemperatur gewaschen. Das Filter wird eine Stunde bei -70ºC mit einer Verstärkerfolie autoradiographiert. Das Filter wird bei 50ºC mit 6x SSC (50 ml) gewaschen und 1 Stunde bei -70ºC mit Verstärkerfolie autoradiographiert.
Das Filter wird bei 60ºC mit 6x SSC (50 ml) gewaschen und 2 Stunden bei -70ºC mit Verstärkerfolien autoradiographiert. Auf dem bei 60ºC gewaschenen Filter finden sich nach Anfangsscreening fünf Klone mit Mutationen.
f) Sequenzierung: Die Mutation des AGC-Codons (Ser119) zum AAC-Codon (Asn119) wird für einen positiven Klon durch die Bestimmung der DNA-Sequenz mit dem Sequenzlerungs-Primer I unter Anwendung des Kettenabbruchverfahrens [F. Sanger, S. Nickler und A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] bestätigt. Die Mutation in der DNA führt zu einem SerT Asn-Austausch in der Aminosäure-Position 119 von reifem t-PA ([Asn¹¹&sup9;]-t-PA).
g) Plaque-Reinigung: Der mit p8A-7-MO1 bezeichnete Klon wird Plaque-gereinigt. Das Phagengut wird verdünnt (1:10&sup7;, 10&sup8;, 10&sup9;), auf YT-Platten plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Dann werden Plaques ausgewählt, Phagen isoliert und dann mit ³²P-markiertem mutagenem Primer I gescreent. DNA von 7 von den 10 Phagen hat die gewünschte Mutation (Vgl. Fig. 2). Von einem davon, p8A-7-MO1, wird RF-DNA hergestellt und für das Klonieren in pJDB207 verwendet. Beispiel 3: Mutation des zweiten Glycosylierungsortes bei Asn 184 unter Verwendung von einzelsträngigem p8A-7. codierender Strang mutagener Primer II mutierter codierender Strang
Phosphorylierung von Primer II, Annealing, Extensions-Ligation und Transformation erfolgen exakt wie im Beispiel 2.36 Plaques werden genommen und Phagen mit ³²P-markiertem mutagenem Primer II gescreent. Die Temperaturen, bei denen das Filter gewaschen wird, sind: Raumtemperatur, 50ºC und 60ºC. Die Waschung bei 60ºC zeigt, daß es vier mutagene Klone gibt. Die DNA von einem Klon wird mit dem Sequenzierungs-Primer II sequenziert, Mutation am zweiten Glycosylierungsort bestätigt (Vgl. Fig. 2). Phage von diesem Klon wird Plaque-gereinigt und hinsichtlich positiver Mutationen gescreent. Einer der positiven Klone wird als p8A-7-MO2 bezeichnet. Die Mutation ändert das Codon TCA (Ser 186) in GCA (Ala 186), was zu einem Wechsel SerT Ala an der Position 186 von reifem t-PA führt ([Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA).

Beispiel 4: Mutation des zweiten Glycosylierungsortes bei Asn 184 unter Verwendung von einzelsträngigem mutiertem p8A-7-MO1.

Die Vorgangsweise von Beispiel 2 wird unter Verwendung von einzelsträngigem p8A-7-MO1 und mutagenem Primer II wiederholt. Nach Plaque-Reinigung und Screening wird einer der positiven Klone als p8A-7-MO21 bezeichnet. Die DNA des Klons wird mit Sequenzierungs-Primern I und II sequenziert. Die Mutation an den Glycosylierungsorten 117 und 184 wird bestätigt (Vgl. Fig. 2). Die Kombination von zwei Mutationen in der DNA führt zu einem Mutanten-t-PA-Molekül mit zwei Aminosäureänderungen an den Positionen 119 und 186 ([Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA). Beispiel 5: Mutation des vierten Glycosylierungsortes bei Asn 448 unter Verwendung von einzelsträngigem mutiertem p8A-7-MO21 (1. Konstrukt) codierender Strang mutagener Primer IV mutierter codierender Strang
Die Vorgangsweise von Beispiel 2 wird unter Verwendung von einzelsträngigem p8A-7-MO21 und mutagenem Primer IV wiederholt. Die Temperaturen, bei denen das Filter gewaschen wird, sind: Raumtemperatur, 50ºC, 60ºC und 68ºC. Die Waschung bei 68ºC identifiziert die positiven Klone. Ein solcher positiver Klon wird nach Plaque-Reinigung als p8A-7-MO421 bezeichnet. Die DNA des Klons wird mit Sequenzierungs-Primern I, II und IV der Sequenzanalyse unterworfen, Mutationen an den Glycosylierungsorten 117, 184 und 448 bestätigt (Vgl. Fig. 2). Mit drei Mutationen an der DNA hat das resultierende Mutanten-t-PA-Molekül drei Aminosäure-Austausche an den Positionen 119, 186 und 450 ([Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA). In dieser Mutante wurde ein neuer Glycosylierungsort am vierten Ort durch Ersetzen von Thr&sup4;&sup5;&sup0; durch Asn geschaffen. Beispiel 6: Mutation des vierten Glycosylierungsortes bei Asn 448 unter Verwendung von einzelsträngigem mutiertem p8A-7-MO21 (2. Konstrukt) codierender Strang mutagener Primer Primer IV-1 mutierter codierender Strang
Die Vorgangsweise von Beispiel 2 wird unter Verwendung von einzelsträngigem p8A-7-MO21 und mutagenem Primer IV-I wiederholt. Die Temperaturen, bei denen das Filter gewaschen wird, sind: Raumtemperatur, 50ºC und 60ºC in 6xSSC. Nach Plaque-Reinigung wird einer der positiven Klone isoliert und als p8A-7-MO421(1) bezeichnet. Die DNA des Klons wird mit Sequenzierungs- Primern I, II und IV sequenziert, die Mutationen an den Glycosylierungsorten 117, 184 und 448 werden bestätigt (Vgl. Fig. 2). Mit drei Mutationen an der DNA hat das resultierende Mutanten-t-PA-Molekül drei Aminosäure-Austausche an den Positionen 119, 186 und 450 ([Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;-t-PA). Beispiel 7: Mutation des dritten Glycosylierungsortes bei Asn 218 unter Verwendung von einzelsträngigem mutiertem p8A-7-MO421(1) codierender Strang mutagener Primer III mutierter codierender Strang
Die Vorgangsweise von Beispiel 2 wird unter Verwendung von einzelsträngigem p8A-7-MO421(1) und mutagenem Primer III wiederholt. Die Temperaturen, bei denen das Filter gewaschen wird, sind: Raumtemperatur, 50ºC und 60ºC. Die 60ºC-Waschung identifiziert die positiven Klone. Nach Plaque-Reinigung wird einer der positiven Klone isoliert und als p8A-7-MO4321(1) bezeichnet. Die DNA des Klons wird unter Verwendung von Sequenzierungs-Primern I bis IV sequenziert. Die Mutationen an den Glycosylierungsorten 117, 184, 218 und 448 wird bestätigt (in Fig. 2). Die vier Mutationen an der DNA führen zu einem Mutanten-t-PA-Molekül mit vier Aminosäure-Austauschen an den Positionen 119, 186, 220 und 450 ([Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn²²&sup0;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA).

Beispiel 8: Klonieren der mutierten t-PA-Gen-Inserts in pJDB207:

a) Herstellung von RF-DNA: RF-DNA wird für p8A-7-MO1, p8A-7-MO2, p8A-7-MO21, p8A-7-MO421, p8A-7-MO421(1) und p8A-7-MO4321(1) durch die "Schnell-DNA-Isolierungsmethode" [D.S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)] hergestellt.
b) Isolierung von Inserts: Die sechs RF-DNAs (0,5 ug) werden mit 16 U BamHI und 20 U HindIII in 50 ul von 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Zugabe von 2 ul RNase (Serva, 1 mg/ml) und 5minütigem Inkubieren bei 37ºC werden die 2,3 Kb-Inserts auf 0,8%igem präparativem Agarosegel. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und nach Präzipitation in 5 ul TE (46,8 fmol/ul) gelöst.
c) Drei ug pJDB207 [J. Beggs in "Genetic Engineering" (Hrsg. R. Williamson), Vol. 2, S. 175-203, Academic Press, New York 1981] werden mit BamHI und HindIII geschnitten, und der 6,6 Kb-Vektor wird isoliert. Nach Elektroelution und Präzipitation wird die DNA in 20 ul TE wiederaufgelöst (35 fmol/ul).
d) 140 fmol BamHI-HindIII-geschnittener pJDB207-Vektor, 234 fmol BamHI-HindIII-mutierte-t-PA-Inserts werden in 20 ul von 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 1 ug Gelatine mit 400 U T4-DNA-Ligase 16 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65ºC für 10 Minuten gestoppt. 2 ul und 5 ul dieser Ligationsmischungen werden für die Transformation von E.coli HB101-Ca&spplus;&spplus;-Zellen verwendet [M. Dagert und S.D. Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1979)]. 6 ampR-Kolonien werden aus jeder der sechs Ligationen genommen. DNA wird nach der "Schnellisolationsmethode" hergestellt. Bei Analyse der DNA mit BamHI-HindIII und PstI werden Banden korrekter Größe beobachtet. Ein Klon von jeder der fünf Ligationen wird in 100 ml LB-Medium gezüchtet, das 100 ug/ml Ampicillin enthält. Plasmid-DNAs, die abgeleitet sind von p8A-7-MO1, p8A-7-MO2, p8A-7-MO21, p8A-7-MO421, p8A-7-MO421(1) und p8A-7- MO4321(1) werden isoliert und als pJDB207/PHO5-TPA18-MO1, pJDB207/PHO5-TPA18-MO2, pJDB207/PHO5-TPA18-MO21, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421(1) und pJDB207/PHO5-TPA18-MO4321(1) bezeichnet.

Beispiel 9: Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors, enthaltend den PHO5-Promotor, Invertase-Signalsequenz und t-PA codierende Region

A) Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden für Invertase-Signalsequenz:

Vier Oligodesoxyribonucleotide: I-1, I-2, I-3, I-4 werden durch DNA-Synthesizer (Modell 380B Applied Biosystems) synthetisiert. Nach Entblocken werden die synthetischen Fragmente an 12%igem Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, gereinigt. Salzfreie, reine Oligodesoxyribonucleotide werden unter Verwendung von Sep. Pak (Waters Associates) erhalten. Diese Fragmente stellen einen Duplex dar, der für die Invertase-Signalsequenz codiert, mit den häufig verwendeten Hefe-Codons.

B) Subklonieren der Invertase-Signalsequenz in Plasmid p31: a) Vektor-Herstellung:

1,5 ug p31R/SS-TPAΔ2 [Siehe Europ. Patentanmeldung 143,081] wird mit 10 U EcoRI (Boehringer) in 50 ul von 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Zugabe von 1 ul 2,5 M NaCl werden 10 U XhoI (Boehringer) zugesetzt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Der 4,2 kb-Vektor wird auf 0,8%igem präparativem Agarosegel isoliert. Das Gelstück wird in ein Micro Colloidon-Röhrchen (Sartorius GmbH) transferiert, mit 200 ul TE bedeckt und elektroeluiert (Elektrophorese bei 90 mA, 50 min). Die TE-Lösung wird gesammelt und in 2,5 Volumina absolutem Ethanol nach Zugabe von 0,1 Volumina 10 x TNE ausgefällt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem 80%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 6 ul TE (40 pmol/ul) resuspendiert.

b) Annealing von Oligodesoxyribonucleotiden (I-1, I-2, I-3, I-4), Kinasierung und Ligation mit dem Vektor:

Eine Lösung, die 10 pmol von jedem der vier Desoxyribonucleotide in 10 ul 0,5 M Tris.HCl pH 8 enthält, wird bei 95ºC 5 Minuten auf einem Wasserbad inkubiert. Das Wasserbad wird langsam über eine Dauer von 5 Stunden auf 30ºC gekühlt. Zu dieser hybridisierten (annealed) Mischung werden jeweils 2 ul 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M NaCl, 30 mnM DTT, 4 mM ATP und 8 U (1 ul) Polynucleotidkinase (Boehringer) zugesetzt. Die Kinasierung erfolgt bei 37ºC eine Stunde lang. Die hybridisierten (annealed), kinasierten Oligodesoxyribonucleotide und 60 pmol p31R/SS-TPAΔ2 EcoRI-XhoI-geschnittener Vektor (1,5 ul) werden mit 400 U (1 ul) T4-DNA-Ligase (Biolabs) 17 Stunden bei 14ºC ligiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65ºC für 10 Minuten gestoppt. 10 ul dieses Ligationsgemischs werden zur Transformation von E.coli HB101 Ca&spplus;&spplus;-Zellen [M. Dagert und S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)] verwendet. 20 ampR-Kolonien werden genommen. DNA wird nach der "Schnellisolationsmethode" hergestellt [D.S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-179 (1981)]. DNA wird mit EcoRI und XhoI verdaut, am EcoRI-Ende radiomarkiert und an einem 6-%-Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, unter Verwendung von radiomarkiertem pBR322 HaeIII-geschnittener DNA als Marker analysiert. Bande korrekter Größe werden für aus allen 20 Klonen erhaltene DNA beobachtet. Ein Klon wird in 100 ml LB-Medium gezüchtet, das 100 ug/ml Ampicillin enthält. Plasmid-DNA wird isoliert und als p31RIT-12 bezeichnet.

C) Konstruktion von pJDB207/PHO5-I-TPA:

a) Vektor-Herstellung:

Drei ug pJDB207/PHO5-TPA18 [Europäische Patentanmeldung 143,081] werden 1 Stunde bei 37ºC mit 10 U BamHI in 50 ul von 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol inkubiert. Ein Aliquot wird auf 1-%-Agarosegel in TBE-Puffer geprüft, um vollständige Verdauung zu bestätigen. Der Verdau wird 10 min bei 65ºC inkubiert. Dann werden 0,5 ul 5 M NaCl zugesetzt, gefolgt von 15 U XhoI (Boehringer). Das wird bei 37ºC 1 Stunde inkubiert. Der 6,8 kb-Vektor wird an 0,8%igem präparativem Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und nach Fällung in TE aufgelöst.

b) XhoI-Verdau von p31/PHO5-TPA18:

30 ug p31/PHO5-TPA18 [Europäische Patentanmeldung 143,081] werden 1 Stunde bei 37ºC mit 60 U XhoI (15 U/ul) in 200 ul 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol inkubiert, mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert und in Ethanol gefällt.

c) Partieller PstI-Verdau von XhoI-geschnittenem p31/PHO5-TPA18:

Die ausgefällte, XhoI-geschnittene p31/PHO5-TPA18-DNA wird in 250 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol, 2,5 mg Ethidiumbromid 35 min bei 37ºC mit 22,5 U PstI inkubiert, mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert, gefolgt von einem gleichen Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (50:1). Das 1,6-kb-Fragment wird an 1%igem präparativem Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und gefällt [Insert 1].

d) SalI-XhoI-Verdau von p31RIT-12:

Dreißig ug p31RIT-12 werden 1 Stunde bei 37ºC mit 60 U SalI (Boehringer 12 U/ul) und 60 U XhoI (15 U/ul) in 200 ul Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol inkubiert, mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt. Das 869 bp-Fragment wird an 1,2%igem präparativem Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert, über DE-52 entsalzt und in Ethanol gefällt.

e) HgaI-Verdau von SalI-XhoI-geschnittenem P31RIT-12:

SalI-XhoI-geschnittenes p31RIT-12 wird in 100 ul 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol, 10 mg Rinderserumalbumin resuspendiert und 1 Stunde bei 37ºC mit 6 U HgaI (Biolabs, 0,5 U/ul) inkubiert. Das 600 bp-Fragment wird an 1,2%igem Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und in Ethanol gefällt.

f) Annealing von Linker-Oligonucleotiden:

90 pmol von zwei Oligodesoxyribonucleotiden mit den Sequenzen
werden in 10 ul 0,5 mM Tris.HCl pH 8 in einem siliconisierten Eppendorf-Röhrchen suspendiert. Die Lösung wird 5 min bei 95ºC inkubiert und dann langsam über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt.

g) Linker-Kinasierung:

Zu obiger Lösung werden 2 ul 0,1 M KCl, 2 ul 0,1 M MgCl&sub2;, 3 ul 30 mM DTT, 1 ul 200 mM ATP, 8 U Polynucleotid-Kinase (8 U/ul) zugesetzt. Das wird 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.

h) Ligation des HgaI-Fragments von P31RIT-12 mit dem kinasierten Linker:

Die kinasierte Linker-Lösung wird in ein Röhrchen transferiert, das das trockene HgaI-Fragment enthält, und 400 U T4-DNA-Ligase werden zugesetzt. Die Lösung wird dann 90 Minuten bei Raumtemperatur (21-22ºC) inkubiert, auf 100 ul mit TE verdünnt und mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert. Das Fragment wird durch Zugeben von 0,6 Volumen Isopropanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat bei Raumtemperatur zu der wäßrigen Lösung ausgefällt.

i) BamHI-PstI-Verdau von obigem:

Die obige trockene DNA wird mit 10 U BamHI und 10 U PstI in 20 ul von 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Verdünnung auf 100 ul wird die Lösung mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert, und die wäßrige Schicht wird in Isopropanol präzipitiert [Insert 2].

j) Ligation der drei Fragmente:

100 pmol pJDB207/PHO5-TPA18 BamHI-XhoI-geschnittenes Vektorfragment, 200 pmol von jedem der beiden Insertfragmente [1 und 2] werden in 10 ul 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 ug Gelatine mit 400 U T&sub4;-DNA-Ligase 16 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch 10minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 ul dieses Ligationsgemischs werden für Transformation von E.coli HB101 Ca&spplus;&spplus;-Zellen verwendet. 10 ampR-Kolonien werden gewählt, und DNA wird nach der "Schnellisolationsmethode" hergestellt. Bei Analyse mit EcoRI, PstI und BamHI-HindIII werden Fragmente korrekter Größe beobachtet. Ein Klon wird in 100 ml LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNA wird isoliert und als pJDB207/PHO5-I-TPA bezeichnet.

Beispiel 10: Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors, der den PHO5-Promotor, die PHO5- Signalsequenz oder die Invertase-Signalsequenz und die t-PA codierende Region enthält, wobei nur der vierte Glycosylierungsort entfernt ist

Das BamHI-HindIII-Vektorfragment von Plasmid pJDB207 wird ligiert mit BamHI-ScaI-Fragment, erhalten aus pJDB207/PHO5-I-TPA oder pJDB207/PHO5-TPA18, und ScaI-HindIII-Fragment, erhalten aus pJDB207/PHO5-TPA18-MO421(1).

a) Herstellung eines Vektors:

Drei ug pJDB207 werden mit BamHI und HindIII geschnitten, und der 6,6 kb-Vektor wird isoliert. Nach Elektroelution wird die DNA in Ethanol präzipitiert.

b) ScaI-HindIII-Verdau von pJDB207/PHO5-TPA18-MO421(1):

1,5 ug Plasmid-DNA werden mit 7 U ScaI (Boehringer) und 6 U HindIII in 20 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Phenolisierung und Fällung in Ethanol wird das 987 bp-Fragment an 1,2%igem präparativem Agarosegel (Insert 1) isoliert.

c) BamHI-ScaI-Verdau von pJDB207/PHO5-TPA18 und pJDB207/PHO5-I-TPA:

1,5 ug der beiden Plasmid-DNAs werden mit 7 U BamHI und 7 U ScaI in 20 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Phenolisierung und Fällung in Ethanol werden die 1300 bp-Fragmente auf 1,2%igem präparativem Agarosegel isoliert (Insert 2).

d) Ligation der drei Fragmente:

100 pmol pJDB207/PHO5-TPA18 BamHI-HindIII-geschnittenes Vektorfragment, 200 pmol von jedem der beiden anderen Insertfragmente [1 und 2] werden in 10 ul 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 ug Gelatine mit 400 U T&sub4;-DNA- Ligase 16 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktionen werden durch Inkubation für 10 Minuten bei 65ºC gestoppt. 5 ul dieses Ligationsgemischs werden für die Transformation von E.coli HB101 Ca&spplus;&spplus;-Zellen verwendet. 10 ampR-Kolonien werden gewählt, und DNA wird nach der "Schnellisolationsmethode" hergestellt. Bei Analyse mit EcoRI, PstI und BamHI-HindIII werden Fragmente korrekter Größe beobachtet. Ein Klon von jeder der beiden Konstruktionen wird in 100 ml LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNAs werden isoliert und als pJDB207/PHO5-TPA18-MO4 und pJDB201/PHO5-I-TPA-MO4 bezeichnet.

Beispiel 11: Klonierung der mutierten t-PA-Gen-Inserts in einen Hefe-Expressionsvektor, der den PHO5-Promotor und die Invertase-Signalsequenz enthält

Das BamHI-HindIII-Vektorfragment von Plasmid pJDB207 wird ligiert mit einem BamHI-NarI-Fragment, erhalten von pJDB207/PHO5-I-TPA, und einem NarI-HindIII-Fragment, erhalten von den mutierten t-PA-Genen.
a) Herstellung von RF-DNA:RF-DNA wird für p8A-7-MO1, p8A-7-MO2, p8A-7-MO21, p8A-7-MO421, p8A-7-MO421(1) und p8A-7-MO4321(1) hergestellt.
b) Isolierung der NarI-HindIII-Inserts von mutierten t-PA-Genen: Die sechs RF-DNAs (1 ug) werden jeweils mit 6 U NarI (Biolabs) in 20 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Der Verdau wird 10 min bei 65ºC inkubiert, dann wird 1 ul 1 M NaCl zugesetzt, gefolgt von 6 U HindIII. Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC wird RNase (2 ul, 0,5 ug/ul) zugesetzt. Nach 15 min bei 37ºC und Phenolisierung werden DNAs in Ethanol gefällt. Die 1450 bp-DNA-Fragmente werden an 1,2%igem präparativem Agarosegel isoliert. Die DNAs werden durch Elektroelution extrahiert und in Ethanol gefällt (Insert 1).
c) Isolierung des BamHI-NarI-Inserts: Drei ug pJDB207/PHO5-I-TPA werden mit 6 U NarI in 20 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Dann werden 2 ul 1 M NaCl zugesetzt, gefolgt von 6 U BamHI. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC, Phenolisierung, wird DNA in Ethanol präzipitiert. Das 930 bp-DNA-Fragment wird an 1,2%igem präparativem Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und in Ethanol gefällt (Insert 2).
d) Vektor-Herstellung: Drei ug pJDB207 werden mit BamHI und HindIII geschnitten, und der 6,6 Kb-Vektor wird isoliert. Nach Elektroelution wird die DNA in Ethanol präzipitiert.
e) Ligation der drei Fragmente: 100 pmol pJDB207/PHO5-TPA18 BamHI-HindIII-geschnittenes Vektorfragment, 200 pmol von jedem der beiden anderen Insert-Fragmente [1 und 2] werden in 10 ul 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 ug Gelatine mit 400 U T&sub4;-DNA- Ligase 16 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktionen werden durch Inkubation für 10 Minuten bei 65ºC gestoppt. 5 ul dieses Ligationsgemischs werden für die Transformation von E.coli HB101 Ca&spplus;&spplus;-Zellen verwendet. 10 ampR-Kolonien werden gewählt, und DNA wird nach der "Schnellisolationsmethode" zubereitet. Bei Analyse mit EcoRI, PstI und BamHI-HindIII werden Fragmente korrekter Größe beobachtet. Ein Klon von jeder der sechs Konstruktionen wird in 100 ml LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNAs werden isoliert und als pJDB207/PHO5-I-TPA18-MO1, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO21, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421(1) und pJDB207/PHO5-I-TPA- MO4321(1) bezeichnet.

Beispiel 12: Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18:

Die Plasmide pJDB207/PHO5- TPA18-MO1, pJDB207/PHO5-TPA18-MO2, pJDB207/PHO5-TPA18-MO4, pJDB207/PHO5- TPA18-MO21, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421, pJDB/PHO5-TPA18-421(1), pJDB207/PHO5- TPA18-MO4321(1), pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2, pJDB207/PHO5- I-TPA-MO4, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO21, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421, pJDB207/PHO5-I-TPA- MO421(1) und pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4321(1) werden jedes in Saccharomyces cerevisiae-Stamm GRF18 (α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR) eingeführt unter Anwendung des von Hinnen u.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] beschriebenen Transformationsprotokolls. Jeweils fünf ug Plasmid-DNA werden zu 100 ul einer Sphäroplast-Suspension zugegeben, und das Gemisch wird mit Polyethylenglycol behandelt. Die Sphäroplasten werden mit 10 ml Regenerationsagar gemischt und auf Hefe-Minimalmedium-Platten ohne Leucin plattiert. Nach 3 Tagen Inkubation bei 30ºC werden etwa 200 transformierte Zellen erhalten. Eine Kolonie von jeder der Hefe-Transformationen wird herausgenommen. Die verschiedenen Kolonien werden wie folgt bezeichnet:
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO1,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO2,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO4,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO21,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO421,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO421(1),
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-MO4321(1),
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO21,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421(1),
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4321(1).

Beispiel 13: Transformation von Saccharomyces cerevisiae-Stamm HT246:

Der Stamm S. cerevisiae HT246 wird erhalten durch wiederholtes Backcrossing des Mutanten-S. cerevisiae-Stamms HT-232, dem es an Protease-B-Aktivität fehlt [D.H. Wolf u.a., in G.N. Cohen und H. Holzer (Hrsg.), Limited Proteolysis in Microorganisms, Conference Report, Bethesda 1978, S. 61], und S. cerevisiae H423 (Europäische Patentanmeldung 143,081).
S. cerevisiae HT246 wird transformiert mit den Plasmiden pJDB207/PHO5-TPA18-MO1, pJDB207/PHO5-TPA18-MO2, pJDB207/PHO5-TPA18-MO4, pJDB207/PHO5-TPA18-MO21, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421, pJDB/PHO5-TPA18-421(1), pJDB207/PHO5-TPA18-MO4321(1), pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO21, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421(1) und pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4321(1) unter Anwendung des Transformationsprotokolls von Hinnen u.a. (oben erwähnt), selektierend hinsichtlich Leucin-Prototrophie (vgl. Beispiel 12). Es wird jeweils ein Klon ausgewählt und bezeichnet.
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO1,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO2,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO4,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO21,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO421,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO421(1),
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-MO4321(1),
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO21,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421,
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421(1),
Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4321(1).

Beispiel 14: Herstellung von Hefe-Zellextrakten und Bestimmung der t-PA-Aktivität:

Hefezellen werden bei 30ºC in 20 ml HE-17-Medium (8,4 g Yeast Nitrogen Base (Difco), 10 g L-Asparagin, Sigma, 1 g L-Histidin (Sigma), 40 ml 50%ige Glucose pro 1 Liter Lösung) in einem 50-ml-Erlenmeyerkolben unter Schütteln für 24 Stunden gezüchtet, bis eine Dichte von 8-10x10&sup7; Zellen/ml erreicht ist. Die Zellen werden zentrifugiert, in 10 ml 0,9%igem NaCl resuspendiert. Zwei ml resuspendierter Zellen werden verwendet, um 50 ml niedriges Pi-Minimalmedium zu inokulieren, dem 10 g/l L-Asparagin, Sigma, und 10 g/l L-Histidin, Sigma, in 250-ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt werden (wie in der Europäischen Patentanmeldung 143,081 beschrieben). Die Inkubation erfolgt bei 30ºC bei 250 UpM.
Zellen von 10 ml niedrigem Pi-Minimalmedium werden nach 24 und 48 Stunden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 3000 UpM in Falcon-2070-Röhrchen gesammelt. Die Zellen werden einmal mit niedrigem Pi-Medium gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wird in Lysepuffer [66 mM Kaliumphosphat pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem.)] suspendiert. Zu der Zellsuspension werden 8 g Glasperlen (0,5-0,75 mm Durchmesser) und ein kleiner Glasstab zugegeben, und die Suspension wird auf einem Vortex-Mixer (Scientific Instruments Inc., USA) bei voller Geschwindigkeit 4x2 min mit Intervallen von 2 min auf Eis geschüttelt. Mehr als 90 % der Zellen werden durch diese Vorgangsweise aufgebrochen. Zelldetritus und Glasperlen werden durch Zentrifugieren für 5 min bei 3000 UpM bei 4ºC sedimentiert. Der Überstand wird in Eppendorf-Röhrchen transferiert.
Die t-PA-Aktivität wird unter Verwendung des Kolorimeter-Assays bestimmt, der von J.H. Verheijen u.a. [Thromb. Haemostat. 48, 226 (1982)] beschrieben wird.
Die erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 1 zusammengefaßt: Tabelle 1: S. cerevisiae-Stamm

Beispiel 15: Fermentation von transformierten Hefestämmen im 3-l-Maßstab:

Alle Transformanten werden auf der Temperatur von flüssigem N&sub2; (Dampfphase) gehalten, in einem Medium der folgenden Zusammensetzung (Werte in g/l): Natriumglutamat 50, Saccharose 50, Dextran 50.
Für eine Fermentation im 3-l-Maßstab von jedem der transformierten S. cerevisiae-Stämme werden zwei Vorkulturen hergestellt:
Ein "Loop" von Zellen einer frisch gezüchteten Kultur auf Schrägagar wird in 50 ml Vorkulturmedium inokuliert, bestehend aus (g/l): Yeast Nitrogen Base (Difco 0919-15): 8,4; L-Asparagin: 10; L-Histidin 1; Glucose: 20; und bei 30ºC und 180 UpM 48 Stunden inkubiert. 10 % der ersten Vorkultur werden in die zweite Vorkultur inokuliert und weitere 24 Stunden inkubiert.
Die zweite Vorkultur wird zentrifugiert, die Zellen in 0,9%igem NaCl resuspendiert und in 3 l Fermentationsmedium inokuliert, das die folgende Zusammensetzung hat (g/l):
Glucose 20 Hefeextrakt, Oxoid 1
Bacto-Pepton 15 L-Histidin 0,1
Ammoniumsulfat 3 MgSO&sub4;-7 H&sub2;O 1
um eine optische Dichte (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von 0,2 zu ergeben.
Fermentationen werden in einem 3-l-MBR-Bioreaktor (MBR Bio Reactor AG, Wetzikon, Schweiz) bei 30ºC, einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min und einer Belüftungsrate von 150 l/h durchgeführt. Nach 48 Stunden wird eine optische Dichte von etwa 12 erreicht. Die Kulturbrühe wird auf 4ºC gekühlt, zentrifugiert und das Zellpellet in 150 ml Brechungspuffer resuspendiert, der aus 4 mM Zwittergent 9-14 (Calbiochem) in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,4 besteht.
150 g Glasperlen (Durchmesser 0,5 mm) werden zugesetzt und die Zellen 30 min, Einstellung 5 an einem Multi-tube Vortexer (Scientific manufacturing industries, USA) aufgebrochen.

Beispiel 16: Reinigung des hergestellten Mutanten-t-PA:

Die Suspension der aufgebrochenen Zellen (S. Beispiel 14) wird zentrifugiert, und zu dem Überstand wird festes Ammoniumsulfat zugesetzt, bis 35 % Sättigung in Ammoniumsulfat erreicht ist. Die Suspension wird zentrifugiert, und das Pellet in 0,2 M Ammoniumacetat solubilisiert, das 0,1 % Synperonic PE/F 68 enthielt. 5 g (Naßgewicht) DE-3-Inhibitor, gekoppelt an Sepharose -4B-Perlen, werden zugesetzt und die Suspension leicht über Nacht bei 4ºC gerührt. Die Perlen werden von der Lösung abgetrennt, zweimal mit 0,2 M Natriumchlorid, das 0,1 % Synperonic enthält, gewaschen, in eine Säule von 10 mm Durchmesser gefüllt und mit 10 ml 0,2 M Natriumchlorid gewaschen, das 0,1 % Synperonic enthält, gefolgt von 10 ml 0,2 M NH&sub4;SCN in 0,2 M Arnmoniumacetat, das 0,1 % Synperonic enthält. T-PA wird dann mit 1,2 M NH&sub4;SCN in 0,2 M Ammoniumacetat, das 0,1 % Synperonic enthält, bei einer Fließrate von 30 ml/h eluiert.
Fraktionen mit der höchsten fibrinolytischen Aktivität werden zusammengefaßt. Der Pool, der Mutanten-t-PA bei einer Reinheit von etwa 90 % oder mehr enthält, wird für Charakterisierungsuntersuchungen und biologische Assays verwendet.

Beispiel 17: Aktivität des Mutanten-t-PA in biologischen Assays:

Die Expression von Plasmiden pJDB207/PHO5-TPA18-MO1, pJDB207/PHO5-TPA18-MO2, pJDB207/PHO5-TPA18-MO4, pJDB207/PHO5-TPA18-MO21, pJDB207/PHO5-TPA18-421, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421(1), pJDB207/PHO5-I-TPA-MO1, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO2, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO21, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO421 und pJDB207/PHO5-I-TPA- MO421(1) im S. cerevisiae-Stamm HT246 führt zu biologisch aktiven Mutanten-t-PAs, nämlich [Asn¹¹&sup9;]-t-PA, [Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA, [Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA, [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA, [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA und [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA, deren Aktivität der Aktivität von Hefe-Wildtyp-t-PA ähnlich oder überlegen ist. Alle Mutanten-t-PAs zeigen Aktivität an Casein-Platten und Fibrin-Platten [J. Jespersen u.a., Haemostasis 18, 301 (1983)], im von J.H. Verheijen u.a. beschriebenen kolorimetrischen Assay [Thromb. Haemost. 48, 266 (1982)] und in einem fluorimetrischen Assay unter Verwendung von Cbz-Gly-Gly-Arg-AMS als Substrat [M. Zimmerman u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)].
In dem fluorimetrischen Assay werden alle t-PA-Lösungen verdünnt auf exakt 20 FU/ml (0,28 ug/ml) in einem 60 mM Phosphatpuffer pH 7,4, der 0,01 % Tween 80 und 0,05 % HSA enthält. Es wird festgestellt, daß etwa 90 % aller t-PAs in Einketten-Form sind und etwa 10 % in der Zweiketten-Form.
Es werden Tests durchgeführt, um die Gerinnselauflösungsaktivität der verschiedenen Mutanten-t-PAs zu bestimmen, im Prinzip nach R.D. Philo und P.J. Gaffney (Thromb. Haemostat. 45, 107-109 (1981)).
Auftragen des log der Lyse-Zeit gegen log der t-PA-Konzentration führt zu einer Gerade, deren Anstieg ein Maß für die Fibrinspezifität des zugefügten Plasminogenaktivators ist.
Durch Vergleich der Gerinnselauflösung bei einer Standardzubereitung können I.U./ml bestimmt werden. Die mit den verschiedenen Mutanten-t-PAs erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt.
Man kann anhand der Fig. sehen, daß [Asn¹¹&sup9;]-t-PA (Gerade 3) und [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA (Gerade 4) in vitro Gerinnsel mit etwa dem gleichen Anstieg auflösen wie Referenz-Melanom-t-PA (mt-PA, Gerade 1). Es wird geschlossen, daß alle gemessenen t-PAs eine ähnliche Fibrin-Aktivität haben. [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA (Gerade 5) löst jedoch Gerinnsel etwa zweimal so schnell wie der Melanom-t-PA, der Hefe-Wildtyp-t-PA (Gerade 2, vgl. europ. Patentanmeldung 143,081), [Asn¹¹&sup9;]-t-PA und [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA.
Das Verhältnis der in den obigen Assays erhaltenen Aktivitäten (in I.U./ml) wird in der Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2: VIU = I.U. nach Verjeijen u.a. (supra); FU = fluorimetrische Einheiten nach Zimmermann u.a. (supra); CIU = Gerinnsel-Lyse I.U. nach Philo u.a. (supra).

Beispiel 18: Immunodetektion:

Die Identität der Gerinnsel auflösenden Aktivität, gereinigt aus Roh-Hefeextrakten mit t-PA, wird in Western-Blots unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern von Kaninchen, gerichtet gegen Melanom-t-PA, bestimmt.
Etwa 12 FU der verschiedenen t-PA-Moleküle werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von 12,5%igen Gelen unter reduzierenden Bedingungen getrennt.
Protein wird dann auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert, im wesentlichen nach der Anleitung des Herstellers (Schleicher & Schuell, Feldbach, Schweiz). Der Transfer erfolgt in Transferpuffer (g/l: Glycin 14,4, Tris 3, Methanol 20%) für 2,5 Stunden bei 40 V/cm. Nach Blockieren in 3%igem BSA für 1 Stunde wird die Nitrocellulose über Nacht mit dem Antikörper inkubiert (Kaninchenserum, 100 ul auf 40 ml BSA-Puffer).
Antikörper-t-PA-Komplexe werden dann mit ¹²&sup5;J-Protein-A-(4 uCi auf 40 ml BSA-Puffer) 2 Stunden versehen.
Nach ausgedehntem Waschen wird die Nitrocellulose-Membran auf einem Röntgenfilm exponiert. Das Ergebnis wird in der Fig. 4 gezeigt. Alle Mutanten-t-PAs werden durch den polyclonalen Antikörper nachgewiesen und zeigen eine Größenreduktion die dem Fehlen glycolytischer Seitenketten entspricht. Jede Mutation ist für einen Verlust von etwa 1 kD Molekulargewicht verantwortlich.

Beispiel 19: Glycosylierungszustand der Mutanten-t-PAs:

Die Glycosylierung wird mit einem ¹²&sup5;J-Concanavalin-A-Overlay-Assay nach Gelelektrophorese bestimmt. Concanavalin A ist ein Pflanzen-Lectin, das spezifisch Mannose-Reste erkennt. Wieder werden 12 FU jeder Mutante auf 12,5%iges PAGE aufgebracht. Dann werden die zehn Proteine 30 min in 7%iger Essigsäure fixiert. Das Gel wird dann in Lectin-Puffer mit der folgenden Zusammensetzung gewaschen: 0,15 M NaCl; 50,0 mM Tris pH 7,4; 0,5 mM CaCl&sub2;; 0,5 mM MnCl&sub2;.
Das Waschen wird fortgesetzt, bis der pH-Wert etwa 7,3 erreicht.
Das Gel wird dann vorsichtig mit 2 ml Lectin-Puffer, der 3 mg Hämoglobin, 100 ug Concanavalin A und 2 uCi ¹²&sup5;J-Concanavalin A enthält, überschichtet.
Nach Inkubation über Nacht in einer befeuchteten Kammer wird das Gel ausgiebig in Lectin-Puffer gewaschen, getrocknet und auf Röntgenfilm exponiert. Alle Mutanten-t-PAs werden mit ¹²&sup5;J-Concanavalin A angefärbt. Da sogar [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn²²&sup0;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA etwas mit dem Lectin reagiert, wird geschlossen, daß diese Mutante restliche O-verknüpfte Zuckereinheiten enthält.

Beispiel 20: Pharmazeutische Zubereitung für parenterale Verabreichung:

Eine Lösung, die [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA in der Einketten-Form, in der Zweiketten-Form oder Mischungen davon, die wie oben beschrieben erhalten wurden, enthält, wird gegen 0,3 molares Natriumchlorid, das 0,01 % Tween 80 enthält, dialysiert und bei -80ºC gelagert. Vor der Verabreichung wird die Konzentration auf 75 ug/ml Gesamt-t-PA (d.h. Einketten- plus Zweiketten-f-PA) und 0,3 M NaCl eingestellt. Die Lösung wird durch Filtration durch ein 0,22 um-Membranfilter sterilisiert.
Anstelle des oben erwähnten t-PA ist es auch möglich, die gleiche Menge eines anderen t-PA zu verwenden, der in den vorherigen Beispielen beschrieben wurde, wie z.B. [Asn¹¹&sup9;]-t-PA, [Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA, [Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA, [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA oder [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA.
Diese Vorgangsweise eignet sich für die Zubereitung von Lösungen von Mutanten-t-PAs in der Einketten- oder in der Zweiketten-Form oder von Mischungen davon für parenterale, wie intravenöse Verabreichung.

Claims

1. Human-t-PA-Proteine mit der Aminosäuresequenz

in der A&sub1;-&sub1;&sub1;&sub6; die N-terminale Aminosäuresequenz repräsentiert, die aus den Aminosäuren 1 bis 116 von reifem t-PA besteht, A&sub1;&sub2;&sub0;-&sub1;&sub8;&sub3; die Aminosäuresequenz repräsentiert, die aus den Aminosäuren 120 bis 183 von reifem t-PA besteht, A&sub1;&sub8;&sub7;-&sub2;&sub1;&sub7; die Aminosäuresequenz darstellt, die aus den Aminosäuren 187 bis 217 von reifem t-PA besteht, A&sub2;&sub2;&sub1;-&sub4;&sub4;&sub7; die Aminosäuresequenz darstellt, die aus den Aminosäuren 221 bis 447 von reifem t-PA besteht, A&sub4;&sub5;&sub1;-&sub5;&sub2;&sub7; die C-terminale Aminosäuresequenz darstellt, die aus den Aminosäuren 451 bis 527 von reifem t-PA besteht, und a) Y&sub1; und Y&sub3; Ser sind, Y&sub2; eine andere genetisch codierte Aminosäure als Ser und Thr ist, und Y&sub4; Thr ist; oder b) Y&sub1;, Y&sub2; und Y&sub3; jedes Ser sind und Y&sub4; eine andere genetisch codierte Aminosäure als Ser und Thr ist; oder c) Y&sub1;, Y&sub2; und Y&sub4; jedes unabhängig eine andere genetisch codierte Aminosäure als Ser und Thr sind und Y&sub3; Ser ist, in der Einketten- oder in der Zweiketten-Form.

2. t-PA-Protein nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus [Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA, [Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA, [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA und [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA.

3. [Ala¹&sup8;&sup6;]-t-PA nach Anspruch 1.

4. [Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA nach Anspruch 1.

5. [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Ala&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA nach Anspruch 1.

6. [Asn¹¹&sup9;, Ala¹&sup8;&sup6;, Asn&sup4;&sup5;&sup0;]-t-PA nach Anspruch 1.

7. Human-t-PA-Proteine in der Einketten-Form nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 6.

8. Verfahren zur Herstellung eines Human-t-PA-Proteins nach Anspruch 1, umfassend das Kultivieren transformierter eukaryotischer Wirtszellen, die eine für das Human-t-PA-Protein codierende DNA-Sequenz enthalten, unter geeigneten Nährbedingungen und Isolieren des Human-t-PA- Proteins und, falls gewünscht, Trennen einer erhaltenen Mischung der Einketten- und Zweiketten-Formen des t-PA-Proteins in die individuellen Komponenten und für die Herstellung der Zweiketten-Form, die frei von Einketten-Form ist, Umwandeln der Einketten-Form des hergestellten t-PA-Proteins in die Zweiketten-Form.

9. Human-t-PA-Proteine, die nach dem Verfahren nach Anspruch 8 erhältlich sind.

10. DNA mit einer für ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 codierenden DNA-Sequenz.

11. Verfahren zur Herstellung von DNA mit einer für ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 codierenden Sequenz, umfassend chemische Synthese der DNA oder Exzisieren eines Teils der DNA umfassend das Codon für den unerwünschten Aminosäurerest vom Stammgen von reifem t-PA und Ersetzen durch ein DNA-Segment, in dem besagtes Codon durch ein Desoxyribonucleotid-Triplett, das für den gewünschten Aminosäure-Rest codiert, substituiert wurde, oder Durchführung der Desoxyribonucleotid-Substitution durch ortsgerichtete Mutagenese.

12. Hybridvektor, umfassend einen Promotor und eine DNA-Sequenz, die für ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 codiert.

13. Verfahren zur Herstellung eines Hybridvektors, umfassend einen Promotor und eine DNA-Sequenz, die für ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 codiert, umfassend das Verknüpfen des Promotors, der Human-t-PA codierenden Sequenz und wahlweise Vektor-DNA.

14. Transformierte eukaryotische Wirtszelle, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 codiert.

15. Verfahren zur Herstellung transformierter eukaryotischer Wirtszellen, umfassend das Transformieren eukaryotischer Wirtszellen mit einem Hybridvektor, umfassend einen Promotor und eine DNA-Sequenz, die für ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 codiert.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

17. Human-t-PA-Protein nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen Körpers.

18. Verwendung eines Human-t-PA-Proteins nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.