FI99211C - Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI99211C FI99211C FI875295A FI875295A FI99211C FI 99211 C FI99211 C FI 99211C FI 875295 A FI875295 A FI 875295A FI 875295 A FI875295 A FI 875295A FI 99211 C FI99211 C FI 99211C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- hirudin
- gly
- asn
- glu
- variant
- Prior art date
Links
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title claims description 63
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 title claims description 53
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 title claims description 53
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 title claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 108010010968 hirudin HV2 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- UPURLDIGQGTUPJ-ZKWXMUAHSA-N Cys-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N UPURLDIGQGTUPJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 1
- FNXOZWPPOJRBRE-XGEHTFHBSA-N Cys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CS)N)O FNXOZWPPOJRBRE-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 claims 1
- WJZLEENECIOOSA-WDSKDSINSA-N Gly-Asn-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O WJZLEENECIOOSA-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims 1
- BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asn Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 claims 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- LXVLKXPFIDDHJG-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LXVLKXPFIDDHJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 claims 1
- NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims 1
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 claims 1
- NKUGCYDFQKFVOJ-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NKUGCYDFQKFVOJ-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 claims 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 25
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 10
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 10
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 3
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 2
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 101150029062 15 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101100338242 Drosophila virilis His1.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100260702 Mus musculus Tinagl1 gene Proteins 0.000 description 1
- CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N O(4')-sulfo-L-tyrosine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 206010058990 Venous occlusion Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 101150088826 arg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- -1 casein amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010010967 hirudin HV1 Proteins 0.000 description 1
- 108010010961 hirudin HV3 Proteins 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 101150049514 mutL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229930192033 plastin Natural products 0.000 description 1
- 108010049148 plastin Proteins 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
99211
Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi
Kirjallisuudessa on kuvattu vähintään kolmea erilaista luontaisesti esiintyvää hirudiinia (Markwadt, 5 1970, Petersen et. ai., 1976, Markwardt ja Walsmann, 1976, Chang, 1983, Dodt et. ai., 1984, 1985, 1986, Harvey et. ai., 1986, FR-patenttijulkaisu nro 84.04755).
Näiden kolmen eri muodon sekvenssit on esitetty kuvassa 1.
Ensimmäinen muoto, HVl, vastaa iilimadosta peräi-10 sin olevaa hirudiinia; toinen, HV2 (Harvey et. ai., 1986) eroaa ensin mainitusta 9 aminohappojäännöksen osalta; kolmas (Dodt et. ai., 1986) on HV2:een nähden identtinen seriiniin asemassa 32 asti, mutta eroaa 10 aminohappo-jäännöksen osalta C-päädyssä, joka käsittää mm.yhden yli-15 määräisen aminohappojäännöksen (ala 63). Tätä kolmatta muotoa kutsutaan tästä eteenpäin HV3:ksi.
Kyseiset sekvenssit käsittävät 65 tai 66 aminohappo-jäännöstä ja niiden voidaan katsoa koostuvan kahdesta alueesta: kolme disulfidisiltaa käsittävä pallomainen N-20 päätyosuus ja hapan C-päätyosuus, joka on homologinen trom-biinin lohkeamiskohtaan protrombiinimolekyylissä nähden. Tämän homologian nojalla arvellaan asemaa 47 ympäröivän alueen muodostavan hirudiinin kiinnittymiskohdan trombii-niin. Toisaalta luontaisesti esiintyvä hirudiini käsittää 25 asemassa 63 sulfaatin muodossa olevan tyrosiinin (Chang, 1983). Muodossa HV3 tämä tyrosiinisulfaatti sijaitsee asemassa 64. Se nimetään tästä eteenpäin asemaan 63 kaikissa muodoissa sen toiminnallisten ominaisuuksien ollessa asemasta riippumattomia.
30 Luontaisesti esiintyvien hirudiinien vertailevan sekvenssianalyysin nojalla voidaan katsoa teoriassa mahdolliseksi muodostaa uusia variantteja, joissa luontaisten molekyylien ominaisuudet yhdistyvät vaihtelevilla tavoilla.
HVlrssä ja HV3:ssa esiintyy asemassa 47 kahden pro- 2 99211 liinin välissä lysiini, joka todennäköisesti aiheuttaa trombiinin aktiivisen keskuksen salpauksen (Dodt et. ai., 1984 ja 1985).
Koska HV2:ssa tässä asemassa ei esiinny emäksis-5 tä jäännöstä vaan asparagiinijäännös, on ilmeisesti tarkoituksenmukaista vaihtaa kyseiseen asemaan lysiini-tai arginiinijäännös, jolloin asemasta tulee paremmin trombiini-inhibiittorille asetettavia odotuksia vastaava (Chang 1985), tai jopa histidiinijäännös, joka ei tuota 10 hyvän trombiinisubstraatin ominaisuuksia, mutta joka saattaisi lisätä hirudiinin inhibiittörivaikutusta.
Toisaalta tyrosiinin asemassa 63 sulfataatio luo eron luontaisesti esiintyvän hirudiinin ja geenirekombi-naatiolla tuotetun hirudiinin välille, jolla eroavaisuu-15 della saattaa olla vaikutusta hirudiinin aktiivisuuteen, mistä Stonen ja Hofsteengen (1986) kineettiset tutkimukset antavat viitteitä. Luontaista proteiinia voidaan pyrkiä jäljittelemään korvaamalla tyrosiini happamalla jäännöksellä kuten jäännöksellä glu tai asp.
20 Kyseinen keksintö koskee hirudiinivariantteja, jotka tunnusomaisesti käsittävät asemassa 47 tai 63 muun aminohappojäännöksen kuin luontaisessa muodossa kyseisessä asemassa esiintyvän.
Edullisesti kyseessä on hirudiini HVl-, hirudiini 25 HV2- tai hirudiini HV3-variantti.
Kyseisistä varianteista mainittakoon seuraavat: 6 3 - variantit, joissa aminohappojäännös Tyr on korvattu happamalla jäännöksellä, erityisesti jäännöksellä Glu tai Asp, 30 - variantit, joissa luontaisessa muodossa asemassa 47 esiintyvä aminohappojäännös on korvattu jäännöksellä Arg tai His, 47 - variantit, joissa HV2:n luontaisen muodon jäännös Asn on korvattu jäännöksellä Lys.
35 Erityisesti mainittakoon seuraavat edulliset varian tit : 3 99211 [Lys**7] HV2 [Arg1*7] HV2 [His1*7] HV2 " 5 [Glu63] HV2 [Asp63] HV2 47
Kyseisen keksinnön mukaisen variantin, nimittäin (Lys )-HV2:n /tai rHV2-Lys 47:n/, sekvenssi on seuraava:
10 ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU
CYS GLU GLY SER ASN VAL GYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU
GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR
PRO LYS PRO GLU SEP. KIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO
GLU GLU TYR LEU GLN 15 6 3
Eri variantteja, joissa Tyr on tallella, voidaan käyttää sulfaatin muodossa tai sellaisenaan. Sulfaatin muodostus voidaan suorittaa kemiallisesti tai aikaansaada biologisesti.
20 Kyseisen keksinnön piiriin kuuluvat biologiset ja kemialliset menetelmät sekä niiden yhdistelmät edellä mainittujen varianttien muodostamiseksi.
Itse asiassa näitä variantteja voidaan muodostaa synteesillä, puolisynteettisesti ja/tai geenimanipulaation 25 piiristä tunnetuilla menetelmillä.
Täten esimerkiksi eri HVlrtä, HV2:ta ja HV3:a, erityisesti HVa:ta, koodaavien sekvenssien kloonausta ja ilmentämistä ja vastaavien hirudiinien eristystä hiivaviljelmistä on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa nro 200 655.
30 Keksinnön mukaisia variantteja voidaan tuottaa vas taavanlaisilla menettelyillä edellä mainittujen koodisek-venssien modifioinnin esimerkiksi ohjatuilla mutaatioilla jälkeen.
Erityisesti ohjatuilla mutaatioilla in vitro on 35 muodostettu variantteja, joissa asparagiinin asemassa 47 4 99211 korvaa lysiinijäännös, arginiinijäännös tai histidiini-jäännös ja joissa tyrosiinin asemassa 63 korvaa glutamii-nihappojäännös.
Erityisesti voidaan käyttää EP-hakemusjulkaisussa 5 nro 200 655 kuvatun kaltaisia toiminnallisia ilmaisuryh-mittymiä, joissa hirudiinisekvenssi koodaa edellä mainittuja variantteja; nämä toiminnalliset DNA-ryhmittymät voidaan siirtää plasmidivektorin avulla.
Eri variantteja vastaavien geenien ilmaisun hiivas-10 sa ja vastaavien varianttien tuotannon ohjaamiseksi kyseiset geenit insertoidaan hiivavektoriin, joka käsittää edullisesti seuraavat, EP-hakemusjulkaisussa nro 200 655 kuvatut yksiköt: - 2^u hiivaplasmidin replikaation alkukohdan, 15 - geenin ura 3, - replikaation alkukohdan E. colissa ja antibioottire-sistenssimerkin, - transkriptiopromoottorin, johtosekvenssin ja alfa-tekijä-prekursorin pre-prosekvenssin liittyneenä lukukehyksessä 20 ylävirtaan hirudiinivarianttia koodaavasta sekvenssistä, - hiivan PGK-geenin transkription lopetuskodonin, jonka tulee sijaita alavirtaan sanottua varianttia koodaavasta geenistä.
Kyseinen keksintö koskee myös näillä vektoreilla 25 tai mainitulla toiminnallisella DNA-ryhmittymällä trans formoituja hiivoja ja niiden käyttöä hirudiinivarianttien valmistuksessa.
Erityisesti keksintö koskee menetelmää hirudiini-variantin tuottamiseksi keksinnön mukaisella hiivalla fer-30 mentoimalla ja muodostuneen hirudiinin talteenottoa kasvualustasta valmiissa muodossa tai in vitro valmiiseen muotoon muuttumaan kykenevän prokursorin muodossa.
Käytettyjä menetelmiä ja menettelyitä on jo aikaisemmin kuvattu yksityiskohtaisemmin EP-hakemusjulkaisuissa 35 nro 200 655 ja nro 87 40149.6.
- 99211 5 Näin saatuja hirudiinivarlantteja voidaan käyttää kuten kuvattu EP-hakemusjulkaisussa nro 200 655 trom-biini-inhibiittoreina, sekä in vivo että in vitro.
Erityisesti näitä variantteja voidaan käyttää far-5 maseuttisten koostumusten ainesosina joko yksinään tai yhdistettyinä muihin vaikuttaviin aineisiin ja samoin analytiikan tai diagnostiikan piirissä; sekä in vitro että in vivo. Viimemainitussa tapauksessa saattaa olla tarkoituksenmukaista leimata variantti, esimerkiksi radioaktii-10 visella, fluoresoivalla, entsymaattisella tai muulla vastaavalla leimalla.
Kyseistä keksintöä havainnollistetaan seuraavien esimerkkien ja kuvan 1 avulla kyseisen kuvan esittäessä kolmen luontaisesti esiintyvän hirudiinin, nimittäin HVl:n, 15 HV2:n ja HV3:n, sekvenssejä sekä kuvan 2 avulla, joka esittää trombiinin proteolyyttisen aktiivisuuden prosentuaalista inhibitiota kromosyymiin nähden hirudiini rHV2: ta tai sen variantteja tuottavien hiivaviljelmien superna-tanttitilavuuden funktiona.
20 Esimerkki 1
Eri HV2-varianttien rakentaminen mutageneesillä in vitro
Ohjatun mutaation tuottamiseksi in vitro modifioitava DNA-fragmentti kloonataan toisiintumiskykyiseen yksi-25 säikeiseen fagiin; rekombinanttifagin genomi eristetään ja saatetaan hybridisoitumaan synteettiseen oligonukleotidiin, joka sisältää modifioidun sekvenssin. Tämä oligonukleotidi toimii komplementoivan säikeen synteesin mallina ja saatua kaksisäikeistä DNA:ta käytetään transformoimaan vastaan-30 ottava bakteeri, joka siis tuottaa halutun mutaation kä-• sittävää fagia (Zoller ja Smith, 1983) .
EP-patenttijulkaisussa nro 158564 kuvattu plasmidi pTG720 on hirudiinin ilmaisuvektori E.colissa. Plasmidi pTG730 saadaan pTG720:sta liittämällä EcoRI-keskus ala-35 virtaan hirudiinia koodaavasta sekvenssistä. EcoRI-keskus 6 99211 mahdollistaa hirudiinia koodaavan sekvenssin uudelleen eristyksen sulattamalla ketjua toiselta puolelta EcoRI: 11a ja toiselta puolelta Clal:llä.
Clal-EcoRI-fragmentti käsittää kokonaisuudessaan 5 hirudiinia koodaavan alueen lukuunottamatta muutamia 5'-päätykodoneja. Tämä Clal-EcoRI-fragmentti kloonattiin Accl- ja EcoRI-keskuksien väliin Ml3-fagin johdannaiseen nimeltä M13TG131 (Kieny et. ai., 1983). Kyseisen hirudii-nisekvenssin sisältävää M13TG131-fagi-johdannaista kut-10 sutaan M13TG1919:ksi.
Syntetisoitiin kolme oligonukleotidia, joista kukin kykenee liittymään M13TG191i:n 5'-GTACACCGAACCCTGAAAG-3'-sekvenssiin paitsi keskialueensa kohdalla kyseisen keskialueen vastatessa haluttua mutaatiota. Näiden oligonuk-15 leotidien sekvenssit ovat seuraavat: TG435 5'-CTTTCAGGGTGCGGTGTAC-3' TG436 5'-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3' TG437 5'-CTTTCAGGGCGCGGTGTAC-3' 20 Nämä oligonukleotidit rakennettiin, jotta Ml3TG1919:n AAC-kodoni (Asn) voitaisiin korvata CAC:llä (his), AAA: 11a (lys) tai vastaavasti CGC:llä (arg).
120 pikomoolia kutakin oligonukleotidia fosfory-loitiin 100^ul:ssa reaktioseosta ja noin 20 pikomoolia 25 fosforyloitua oligonukleotidia hybridisoitiin 1 pikomoo- liin Ml3TGl919-fagin yksisäikeistä DNA:ta 25 mikrolitrassa hybridisaatiopuskuria.
Hybridisaation tapahduttua DNA-seosta käsiteltiin Klenowin polymeraasilla ja T4-fagiligaasilla. Kullakin 30 näin käsitellyllä seoksella transfektoitiin E. coli 71/18 (mutL) -kantaa indikaattoribakteerien JM103 läsnäollessa (Messing et. ai., 1981). Tartutetut solut ovat paikannettavissa, koska ne muodostavat hitaammin kasvavia plakkeja; pesäkkeet siirrostettiin täydelliseen kasvualustaan ja 35 siirrettiin sitten Whatman 540 - suodatinpaperille fagi- 7 99211 mutaation käsittävien solujen esiinseulomiseksi.
Seulonta suoritettiin hybridisoimalla solujen DNA: ta in situ aiemmin toisiintumisen mallina toimineeseen oligonukleotidiin. Näin saatiin kolme uutta halutun mutaa-5 tiosekvenssin käsittävää fagia: M13TG1921 (asn 47—*arg) , M13TG1924 (asn^—>his) ja M13TG1925 (asn47—► lys) .
Toisaalta samantapainen menettely suoritettiin 10 käyttämällä sekvenssin 5*-ATTGTAACTCTTCTTCTG-31 omaavaa oligonukleotidiä TG434. Tämä oligonukleotidi hybridisoituu sekvenssiin 51-CAGAAGAATATTACAAT, joka sijaitsee HV2:ta koodaavan sekvenssin 3'-alueella, käsittäen parittoman 6 3 triplettikoodin, jolla korvataan kodoni TAT (tyr ) kodo-15 nilla GAG (glu). Täten saatiin vastaava mutanttifagi M13TG1922 (tyr63—> glu) .
Esimerkki 2 pTG1828:n PstI-HindIII-fragmentin (0,6 kb) korvaaminen mutanttifragmentilla 20 Plasmidi pTG1828 (jota on kuvattu EP-hakemusjulkai sussa nro 87401649.6) sisältää hirudiinia koodaavan sekvenssin, jota edeltävät hiivan alfa-sukupuoliferomonigee-nin pre-prosekvenssit; muodostunutta kokonaisuutta säätelee PGK-promoottori. Tämän MFo<i-pre-pro- ja hirudiini-25 sekvenssien välisen fuusion tuloksena ilmaistu proteiini erittyy ja rakentuu valmiiksi proteiiniksi kuten muutkin hiivaproteiinit siten, että solutyöstön läpikäynyt ja aktiivinen hirudiini erittyy kasvualustaan. Tätä plasmidia käytettiin mutanttihirudiinisekvenssien ilmaisemiseksi luon-30 taisesti esiintyvän hirudiinin sekvenssien tilalla.
Katkaisemalla pTG1828 Pstl:llä ja HindIII:lla saadaan viisi kooltaan noin 3,8, 1,9, 1,5, 1,1 ja vastaavasti 0,6 kb:n suuruista fragmenttia. Viimemainittu fragmentti sisältää fuusioituneen pre-pro-hirudiinisek-35 venssin. Fragmentti ei käsitä kuin yhden Accl-keskuksen 99211 8 sekä EcoRI-keskuksen. Näiden kahden keskuksen rajaama alue käsittää kokonaisuudessaan hirudiinisekvenssin lukuunottamatta muutamia 5*-päätykodoneja. 0,6 kb:n Hind- III-PstI-fragmentti insertoitiin Hindlll- ja Pstl-keskuk-5 sien väliin vektoriin, joka ei käsittänyt EcoRI- eikä Accl-keskusta.
Näin rakennettu plasmidi (pTG1960) käsittää siis yhden yksittäisen Accl- ja yhden yksittäisen EcoRI-keskuk-sen, jotka sijaitsevat hirudiinisekvenssin alussa ja vas-10 taavasti siitä alavirtaan. Katkaisemalla pTG1960:tä Accl: llä ja EcoRI:11a saadaan fragmentti, joka käsittää hirudiinisekvenssin käytännöllisesti katsoen kokonaisuudessaan sekä loput plasmidista.
Hirudiinisekvenssistä deletoitunutta suurta DNA-15 fragmenttia puhdistettiin geelillä ja se sekoitettiin sitten AccI-EcoRI-hajotustuotteisiin, jotka oli saatu kunkin esimerkissä 1 kuvatun toisiintumiskykyisen mutant-tifagin genomista, pre-pro-hirudiinifuusion tuottamiseksi ohjatulla mutageneesillä tuotettuihin uusiin HV2-variant-20 teihin. Valittiin neljä uutta plasmidia: pTG1963 (asn^ —arg) , pTGl964 (tyr^ —^ glu) , pTG1965 (asn47-? his) ja pTG1966 (asn47—>lys), 25 jotka eroavat pTGl960:stä ainoastaan mutanttikodonien osalta.
Nämä mutanttikodonit käsittävät sekvenssit voidaan eristää Pstl-Hindlll-fragmentteina uudelleenkloonattaviksi vektoriin pTG1828 alkuperäisen Pstl-Hindlll-fragmentin 30 tilalle.
47 Näin saatiin 4 uutta plasmidia: pTGl977 (asn —> arg) , pTG1978 (tyr®^—y glu) , pTG1979 (asn47—> his) 47 ja pTG1980 (asn -> lys), jotka poikkeavat edellä kuvatus ta pTG1828:sta ainoastaan in vitro tuotettujen mutaatioi-35 den osalta.
9 99211
Esimerkki 3 TGYlsp4:n transformointi pTG1977-, pTGl978-, pTGl979- ja pTG1980-DNA:11a S.cerevisiae TGYlsp4-kannan (Mathura 3.251.373.383 5 his 3.11.15) soluja transformoitiin pTG1977-, pTGl978-, PTG1979- ja pTGl980-DNA:11a. Jokaisessa transformaatiossa muodostui ura -transformantteja. Kantoja oli täten neljä: TGYlsp4 pTG1977, TGYlsp4 pTG1978, TGYlsp4 pTG1979 ja TGYlsp4 pTG1980. Näiden neljän kannan tuottamaa hirudii-10 nia verrattiin TGYlsp4 pTGl828-kannan tuottamaan hirudii-niin.
Kutakin kantaa siirrostettiin 20 mlraari kasvualustaa (YNBG +0,5 % kaseiiniaminohappoja) pitoisuuteen ODggq = 0,02. 48 tunnin ravistelun 30°C:ssa jälkeen 15 viljelmät sentrifugoitiin (5000 kierr/min, 5 min) ja määritettiin supernatanttien tilavuus. Kontrollina käytettiin TGYlsp4 pTG881-kannan (plasmidi, joka ei sisällä HV2:ta koodaavaa sekvenssiä) viljelmää.
Raakasupernatanttien aktiivisuus määritettiin nii-20 den trombiiniaktiivisuutta (proteolyyttinen aktiivisuus synteettisen substraatin kromotsyymin TH - Boehringer Mannheim suhteen) inhiboivana vaikutuksena. Prosentuaalinen inhibitio supernatanttitilavuuden funktiona on esitetty kuvassa 2.
47 47 25 Todetaan, että varianteilla arg ja lys saata va inhibitiovaikutus on vähintäänkin yhtä suuri kuin luontaisella HV2:lla saatava. Varianttien glu^ ja his inhibitiovaikutus on lievästi vähäisempi kuin HV2:n.
Esimerkki 4 30 Trombiiniaktiivisuuden inhibitio
Keksinnön kohteena olevien hirudiinivarianttien hyödyllisyyden erityisesti farmaseuttisissa käyttöyhteyksissä osoittamiseksi selvemmin tutkittiin seuraavalla ver-tailuesimerkillä HV2-hirudiinin inhibitiovaikutusta trom-35 biiniin sekä kahden DNA-rekombinaatiotekniikalla tuotetun 99211 10 HV2-variantin, joissa aminohappo asemassa 47 oli korvattu jäännöksellä Arg tai Lys, vaikutusta.
Näiden varianttien trombiini-inhibition reaktio-kinetiikan selvittämiseksi sovelletaan voimakkaan affini-5 teetin omaavien inhibiittorien teoriaa, jota ovat kuvanneet J.W. Williams ja J.F. Morrison julkaisussa Methods in Enzymology 63 (1979) 437-467, hirudiinin trombiini-inhibition ollessa reversiibeli inhibitio.
Käytettävät hirudiinivariantit puhdistettiin 95 %:n 10 puhtausasteeseen Sigman puhtaan humaanitrombiinin aktiivisen keskuksen titrauksella saadun prosentuaalisen aktiivisuuden (määrittämän puhtausasteen) ollessa yli 92 %.
Kaikissa määrityksissä käytettiin samaa humaanitrombii- -9 nipitoisuutta, joka oli 5,5 x 10 mol. Reaktioväliainee-15 na käytettiin Pipesin 0,05 M natriumpuskuria, pH 7,9, joka sisälsi 0,18 M KCl:ää ja 0,1 % PEG:tä, 37°C:ssa. Trombiinin substraattina käytettiin Boehringerin kromo-syymiä PL. Käytettiin 2 minuuttia kestävää trombiinin ja hirudiinin esi-inkubointia, minkä jälkeen reaktio käynnis-2Q tettiin lisäämällä substraatti.
Seuraavaan taulukkoon on koottu kokeissa saadut hirudiinimäärät, jotka tarvittiin inhiboimaan 95 %:sesti -9 sama määrä humaanitrombiinia (5,5 x 10 mol).
-9
Trombiinin (5,5 x 10 ) 95 %:seen inhibitioon ^ tarvittu määrä HV2 Lys47 7,6 HV2 Arg47 8,5 HV2 32,2 Täten vaikuttaa siltä, että saman humaanitrombiini- '! 30 inhibition saavuttamiseksi tarvitaan 4 kertaa vähemmän 47 47 HV2 Arg - tai HV2 Lys -hirudiinia kuin HV2-hirudiinia. Keksinnön mukaisten varianttien inhibitiovaikutus trombiinkin on täten selvästi parempi kuin luontaisesti esiintyvän muodon.
35 11 99211
Esimerkki 5
Farmakologinen esitutkimus kahden rekombinantti- ’ . 47 hirudiinivariantin, rHV2:n ja rHV2 Lys :n, vertaamiseksi standardihepariiniin 5 1. Kokeen päämäärä
Kahden rekombinanttihirudiinivariantin, rHV2:n (tai HV2:n) ja rHV2 Lys^7:n (tai (Lys^7)HV2:n), ominaisuuksien arviointi ja niiden antitromboottisen tehon vertaaminen standardihepariiniin. Näiltä kahdelta variantil-6 3 10 ta puuttuu Tyr -jäännöksen transkriptionjälkeinen sulfa-taatio.
2. Koeolosuhteet a) Kyseisten kahden rekombinanttihirudiinin spesifinen antitrombiiniaktiivisuus (humaanitrombiinin ja nau- 15 tatrombiinin suhteen) fysiologisessa seerumissa määritetään trombiinin proteolyyttisen aktiivisuuden kromosyy-min suhteen inhiboitumisena.
b) Kyseisten kahden hirudiinin antikoagulanttiak-tiivisuutta verrataan in vitro rotan ja kaniinin plas- 20 massa seuraamalla trombiiniviipymän pitenemistä ja anti-Ila-vaikutus määritetään värireaktiomenetelmällä. .
c) I.v.-kertaruiskeen jälkeisen hirudiinin poistumisen plasmasta kinetiikkaa tutkitaan määrittämällä anti-Ila-vaikutus trombiiniviipymän perusteella sekä värireak- 25 tiomenetelmällä standardikäyrien avulla.
d) 30 minuutin jatkuvan i.v.-perfuusion jälkeiset plasmapitoisuudet kaniinissa määritetään samoilla menettelyillä .
e) Kyseisten kahden hirudiinivariantin ja standar- .. 30 dihepariinin antitromboottista aktiivisuutta tutkitaan
Wesslerin kaniini- ja rottamallin avulla käyttäen trombo-geenisenä aineena tromboplastiinia sekä veritukosmallis-sa kaniinissa (Fareed). Yhdisteet annetaan kaniinille jatkuvana perfuusiona ja rotalle i.v.-kertaruiskeena.
35 Käytetyt mallijärjestelyt olivat seuraavat: 12 99211
Wesslerin kaniinimalli
Kokeessa käytettiin urospuolisia 2,5-3 kg:n painoisia Uuden Seelannin kaniineja. Suonensisäisellä natrium-pentobarbitaalisuiskeella (30 mg/kg) suoritetun nukutuk-5 sen jälkeen vasempaan päänvaltimoon asennettiin kanyyli ja eristettiin kaulalaskimot (2 kpl); kumpaakin tehtiin kaksi löyhää sidosommelta 2,5 cm:n päähän toisistaan. Kaniineille annettiin tämän jälkeen joko fysiologista seerumia tai hirudiini- tai hepariiniliuosta jatkuvana 30 mi-10 nuutin perfuusiona virtausnopeuden ollessa 2,5 ml/tunti.
Kaksi minuttiia ennen perfuusion päättymistä otettiin valtimosta koepaloja antikoagulanttien plasmamäärin määrittämiseksi. Minuutti ennen perfuusion päättymistä annettiin 600 yUg:n/kg annos humaanitromboplastiinia (Manchester 15 Comparative Reagents LTD.) standardoituna M. Buchananin menetelmän mukaan, ruiskeena täsmälleen 30 sekunnin aikana päänvaltimonkautta aorttaan. 30 sekunttia tämän jälkeen perfuusio päätettiin ja aikaansaatiin veritukos kiristämällä mainitun kahden suonisegmentin sidosompeleita 15 mi-20 nuutin ajan. Kaulasuonet avattiin, eristettiin veritulok-set huuhdottiin ne fysiologisessa seerumissa ja punnittiin kuivatuksen suodatinpaperilla jälkeen.
Wesslerin rottamalli Käytettiin urospuolisia noin 300 g:n painoisia * 25 Sprague-Dawley-(CD-COBS) rottia. Nukutus suoritettiin natriumpentobarbitaali-i.p.-annoksella (30 mg/kg) ja keskivatsa avattiin, minkä jälkeen alempi onttolaskimo irrotettiin 1 cm:n matkalta alkaen munuaisliittymästä. Tehtiin kaksi joustavaa sidosommelta 0,7 cm:n päähän toi-30 sistaan.
Testiyhdisteet laimennettuina fysiologiseen seerumiin annettiin 1 ml:n/kg i.v.-kertaruiskeena 5 minuuttia 40 sek tai 1 minuutin (hepariini) ennen laskimotukoksen aikaansaamista. 40 sekuntia ennen tukoksen aiheutta-35 mistä annettiin trombogeenistä ainetta (kaniinin trombo- 13 99211 plastiini, E. Dade) ruiskeena 25 mg:n/ml/kg annos penis-laskimoon tasan 30 sekunnin aikana. 10 sekunnin kuluttua ruiskeen annosta aikaansaatiin tukos kiristämällä sidos-ompelteita, ensin proksimaali-, sitten distaaliommelta.
5 Tukosta ylläpidettiin 10 minuutin ajan, minkä jälkeen tukkeuma irrotettiin, upotettiin 0,38 %:seen sitraattiliuok-seen, kuivattiin imupaperilla ja punnittiin seuraavana päivänä tunnin kuivatuksen 50°C:ssa jälkeen.
Tromboosimalli veritukoksena kaniinissa 10 Kokeessa käytettiin urospuolisia 2,5-3 kg:n painoi sia Uuden Seelannin kaniineja. Nukutus suoritettiin laski-monsisäisellä natriumpentobarbitaaliruiskeella (30 mg/kg) ja vasempaan päänvaltimoon asetettiin kanyyli sekä eristettiin kaulalaskimot (2 kpl) ja tehtiin kaksi löyhää 15 sidosommelta kumpaankin 2,5 cm:n päähän toisistaan. Sitten kaniineille annettiin joko fysiologista seerumia tai hirudiini- tai hepariiniliuosta 20 minuutin jatkuvana per-fuusiona virtausnopeuden ollessa 2,5 ml/tunti. Kaksi minuuttia ennen perfuusion päättämistä otettiin valtimosta 20 koepaloja antikoagulanttien plasmamäärän määrittämiseksi. Perfuusion päättymisen kanssa samanaikaisesti aikaansaatiin tukos kiristämällä kyseisiä neljää sidosommelta (ensin proksimaalisia ja sitten distaalisia). Tukosta ylläpidettiin kahden tunnin ajan, minkä jälkeen kaulasuonet 25 avattiin ja irrotettiin tukkeumat, pestiin ne fysiologisessa seerumissa, kuivattiin suodatinpaperilla ja punnittiin .
3. Tulokset a) Emäliuosvalmisteiden, joiden pitoisuudet olivat .. 30 1 mg/ml, sisältämien kyseisten kahden hirudiinivariantin spesifiset antitrombiiniaktiivisuudet humaani- ja nauta-trombiinin suhteen on esitetty seuraavassa taulukossa 1: 14 99211
Taulukko 1 rHV2 rHV2 Lys47
Humaanitrombiini 14 800 19 000
Nautatrombiini 15 500 19 200 5 (humaanitrombiinille ennakoitu tulos) (13 300) (16 000)
Hirudiinivariantti rHV2:n spesifinen antitrombiini- 47 kokonaisaktiivisuus on +/- 15 000 U/mg ja rHV 2 Lys ^ variantin +/- 19 000 U/mg. Kyseiset spesifiset aktiivisuudet ovat odotettua korkeammat. Spesifinen aktiivisuus on sama humaani- ja nautatrombiinin suhteen.
b) Trombiiniviipymän perusteella määritetty anti-koagulanttiaktiivisuus rotan ja kaniinin plasmassa on kyseisten kahden hirudiinin pienillä pitoisuuksilla sama.
15 47
Pitoisuuden kohotessa rHV2 Lys -variantti on selvästi tehokkaampi. Trombiinijäännös rotan tai kaniinin plasmassa määritettynä värireaktion tuottavan substraatin avulla on samaa suuruusluokkaa kyseisten kahden hirudiinin käytettyyn kokonaisaktiivisuuteen 60 U/ml asti. Jäännös- 20 47 trombiinin edelleenneutraloinnissa rHV2 Lys -variantti on tehokkaampi. Tämä heijastaa eroavaisuutta Ki-arvoissa.
c) I.v.-kertaruiskeen jälkeisen kyseisten kahden hirudiinin poistumisen plasmasta kinetiikka on samanlaa-tuinen, jos määritys tehdään värireaktiomenetelmällä, mutta arvot poikkeavat jossain määrin, mikäli määritys suoritetaan trombiiniviipymän perusteella (taulukko 2). Hirudiinit poistuvat plasmasta kahdessa eksponentiaalisessa vähenemävaiheessa. Ensimmäinen vaihe (hajaantuminen), jossa t 1/2 oL on noin 3 min, pienentää kummallakin hiru- • diinilla ensimmäistä lähtöpitoisuutta 60 % 5 minuutissa; 47 toisessa vaiheessa (eliminointi) t 1/2 p on rHV2 Lys variantille 16 min ja rHV2:lle 28 min, jos määritys suoritetaan trombiiniviipymän perusteella, mutta 28 ja vas-taavasti 30 minuuttia, jos käytetään värireaktiomenetelmää.
15 99211
Standardihepariini poistuu plasmasta yhden eksponentiaalisen vähenemävaiheen kautta (t 1/2 = 9 min) .
Taulukko 2
Hirudiinien puoliintumisaika minuuteissa seura-5 ten kaniinille annettua i.v.-kertaruisketta t 1/2 a t 1/2 3 TT SC TT se 10 - rHV2 2,5 3,0 28 28 rHV2-Lys 47 1,8 3,0 16 30 15 TT: trombiiniviipymä SC: värireaktion tuottava substraatti d) Kyseisten kahden hirudiinivariantin plasmapitoisuudet, jotka saadaan annettaessa yhdisteitä kaniinille 30 minuutin jatkuvalla i.v.-perfuusiolla, ovat li- 20 neaarisessa suhteessa annettuun annokseen.
e) Antitromboosivaikutus
Tuote Kaniini, i.v.-perfuusio Rotta, i.v.-kertaruiske /g/kg/tunti g
Wessler Tukos / Wessler -5 min 40 sek -1 min 25 _ ______________________________________________________ : rHV2 375 — 240 - : : r!IV2-Lys 47 20 47 160 - : . Standardi- no 110 160 110 : hepariini . - 30 i---------------------------------------------------------1 Näiden alustavien farmakologisten kokeiden tulos- 47 ten nojalla rekombinanttihirudiinivariantin rHV2 Lys antitromboosiaktiivisuus on ilmeisesti suurempi kuin rHV2:n ja hepariinin annettaessa mainittuja yhdisteitä 35 kaniinille jatkuvalla perfuusiolla. Farmakokineettisesti 16 99211 kyseiset kaksi hirudiinivarianttia ovat samanlaatuiset. Esimerkki 6
Antitromboosiaktiivisuuden ja verenvuotovaaran 47 välisen suhteen vertailu hirudiini rHV2 Lys 5 variantin ja standardihepariinin välillä
Suoritetut kokeet osoittavat, että annettaessa 47 rHV2 Lys -hirudiinia verenvuotovaara kaniinilla on pienempi ja verenvuodon kestoaika rotalla lyhyempi kuin annettaessa standardihepariinia, kun kaikki määritykset 10 suoritettiin käyttäen ekviaktiivisia annoksia tromboosi- mallissa.
Keksinnön edustavien kantojen talletus.
Seuraavat kannat on talletettu talletuslaitokseen, la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes 15 de 1'Institut Pasteur 28 Rue du Bocteur Roux, Paris (15), 6. marraskuuta 1986: TGYlsp4 pTGl977 (HV2-Arg47) numerolla 1-621 ja TGYlsp4 pTG1980 (HV2-Lys47) numerolla 1-622.
Referenssikanta talletettiin 6. kesäkuuta 1986: 20 TGYlsp4 pTG1828 numerolla 1-569.
17 99211
Viitteet;
Chang, J.Y. FEBS Letters 164, 307-313 (1983).
Chang, J.Y. Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985).
Dodt, J., Mueller, H.P., SeemUller, U & Chang, J.Y. FEBS Letters 165, 180-184 (1984).
Dodt, J., Seemiiller, U., Maschler, R. & Fritz, H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985).
Dodt, J., Machleidt, w., Seemuller, U., Maschler, R. & Fritz, H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986).
Harvey, R.P., Degryse, E., Stefani, L., Schamber, F.,
Cazenave, J.P., Courtney, M., Tolstoshev, P. & Lecocg, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1084-1088 (1986).
Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (1983).
Krajewski, T. & Blombäck, B. Acta Chemica Scandinavica 22, 1339-1346 (1968).
Markwardt, F. Methods Enzymol. 19, 924-932 (1970).
Messing, J., Crea, R., Seeburg, P.H. Nucl. Ac. Res. 9, 309 (1981).
Petersen, T.E., Roberts, H.R., Sottrup-Jensen, L. &
Magnusson, S. Protides, Biol., Fluids, Proc. Colloq. 23, 145-149 (1976).
Stone, S.R. & Hofsteenge, J. Biochem. 25, 4622-4628 (1986).
Zoller, M.J. 6 Smith M.N. Methods in Enzymol. 100, 469 (1983).
Claims (5)
- 99211
- 1. Menetelmä HV2-hirudiinlvariantin valmistamiseksi, jossa aminohappo Asn asemassa 47 on korvattu aminoha-5 polla Lys tai Arg, tunnettu siitä, että (a) tehdään ohjattu paikkaspesifinen mutaatio HV2:a koodittavaan DNA-fragmenttiin, (b) transformoidaan isäntäsolu mutatoidulla DNA-fragmentilla, 10 (c) viljellään mutatoidulla, jompa kumpa em. va rianteista koodaavalla heterologisella DNA-fragmentilla transformoitua isäntäsolua, joka pystyy ilmentämään DNA-fragmentin, ja (d) variantti otetaan talteen viljelmästä.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentoidaan hiiva, joka on transformoitu joko plasmidilla, joka käsittää: - 2 μ hiivaplasmidin replikaation aloituskohdan, - ura3-geenin,
- 20. E. colin replikaation aloituskohdan sekä anti- bioottiresistenssileiman, - transkriptiopromoottorin, alfa-tekijän prekursor-in leader-sekvenssin ja prepro-sekvenssin lukuvaiheessa ylävirtaan hirudiinivarianttia koodaavasta sekvenssistä, 25. hiivan PGK-geenin transkription lopetuskodonin, joka sijaitsee alavirtaan hirudiini variantin geenistä, tai toiminnallisella mainittua hirudiini varianttia koo-daavan DNA:n ryhmittymällä. .. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, : 30 tunnettu siitä, että hirudiinivariantilla on seu- raava aminohapposekvenssi: ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY
- 35 GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN. 99211
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8616723 | 1986-12-01 | ||
| FR868616723A FR2607517B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI875295A0 FI875295A0 (fi) | 1987-12-01 |
| FI875295A FI875295A (fi) | 1988-06-02 |
| FI99211B FI99211B (fi) | 1997-07-15 |
| FI99211C true FI99211C (fi) | 1997-10-27 |
Family
ID=9341393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI875295A FI99211C (fi) | 1986-12-01 | 1987-12-01 | Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650301A (fi) |
| EP (1) | EP0273800B1 (fi) |
| JP (1) | JP2567263B2 (fi) |
| KR (1) | KR960011918B1 (fi) |
| AT (1) | ATE73462T1 (fi) |
| AU (1) | AU617989B2 (fi) |
| BG (1) | BG49719A3 (fi) |
| CA (1) | CA1341416C (fi) |
| CS (1) | CS276245B6 (fi) |
| DE (1) | DE3777367D1 (fi) |
| DK (1) | DK173247B1 (fi) |
| ES (1) | ES2032465T3 (fi) |
| FI (1) | FI99211C (fi) |
| FR (1) | FR2607517B2 (fi) |
| GR (1) | GR3004556T3 (fi) |
| HU (1) | HU213871B (fi) |
| IE (1) | IE60544B1 (fi) |
| MC (1) | MC1884A1 (fi) |
| NO (1) | NO177500C (fi) |
| PL (1) | PL157254B1 (fi) |
| PT (1) | PT86233B (fi) |
| RO (1) | RO106890B1 (fi) |
| SU (1) | SU1687032A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA879011B (fi) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| GB8817161D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Modified proteins |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| ATE140929T1 (de) * | 1990-11-08 | 1996-08-15 | Japan Energy Corp | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
| JP7375012B2 (ja) * | 2019-04-16 | 2023-11-07 | サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド | ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
-
1986
- 1986-12-01 FR FR868616723A patent/FR2607517B2/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-11-25 NO NO874905A patent/NO177500C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 PT PT86233A patent/PT86233B/pt unknown
- 1987-11-27 AU AU81880/87A patent/AU617989B2/en not_active Expired
- 1987-11-27 IE IE323987A patent/IE60544B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 CA CA000553153A patent/CA1341416C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-30 DK DK198706276A patent/DK173247B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 EP EP87402696A patent/EP0273800B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AT AT87402696T patent/ATE73462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 ES ES198787402696T patent/ES2032465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 SU SU874203831A patent/SU1687032A3/ru active
- 1987-11-30 RO RO130679A patent/RO106890B1/ro unknown
- 1987-11-30 DE DE8787402696T patent/DE3777367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-01 PL PL1987269164A patent/PL157254B1/pl unknown
- 1987-12-01 HU HU875394A patent/HU213871B/hu unknown
- 1987-12-01 MC MC871932A patent/MC1884A1/xx unknown
- 1987-12-01 FI FI875295A patent/FI99211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 CS CS878732A patent/CS276245B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 BG BG82035A patent/BG49719A3/xx unknown
- 1987-12-01 KR KR1019870013708A patent/KR960011918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 ZA ZA879011A patent/ZA879011B/xx unknown
- 1987-12-01 JP JP62305504A patent/JP2567263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400903T patent/GR3004556T3/el unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,511 patent/US5650301A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2515468B2 (ja) | ヒト抗トロンビンｉｉｉ | |
| FI99211C (fi) | Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi | |
| US5087613A (en) | Hirudin variants | |
| IE861183L (en) | Expression of hirudin in yeasts | |
| US5516656A (en) | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same | |
| US4845076A (en) | DNA sequences coding for proteins having the biological activity of HUSI-type I inhibitors, biotechnological methods for the preparation of said proteins and pharmaceutical compositions containing said proteins | |
| EP0568833B1 (en) | Human antithrombin III mutants | |
| AU661515B2 (en) | Polypeptide, DNA fragment encoding the same, drug composition containing the same and process for producing the same | |
| US5616476A (en) | Synthetic isohirudins with improved stability | |
| JP3490444B2 (ja) | 昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤 | |
| Courtney et al. | Production and evaluation of recombinant hirudin | |
| CA1339875C (en) | Modified human psti | |
| JPH02117694A (ja) | デスルファトヒルジン変異体 | |
| JPH02119792A (ja) | デスルファトヒルジン変異体 | |
| WO1994020537A1 (en) | Non-glycosylated tfpi analogues | |
| GB2242681A (en) | Hirudin fragments | |
| JPH04258294A (ja) | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 | |
| CA2124330A1 (en) | Novel hirudine variant, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: TRANSGENE S.A. |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |