CS276245B6 - Process for preparing modification of one of hv1, hv2, hv3 hirudin forms - Google Patents
Process for preparing modification of one of hv1, hv2, hv3 hirudin forms Download PDFInfo
- Publication number
- CS276245B6 CS276245B6 CS878732A CS873287A CS276245B6 CS 276245 B6 CS276245 B6 CS 276245B6 CS 878732 A CS878732 A CS 878732A CS 873287 A CS873287 A CS 873287A CS 276245 B6 CS276245 B6 CS 276245B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- hirudin
- variant
- glu
- lys
- gly
- Prior art date
Links
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title claims description 73
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 title 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 title 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 62
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 62
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- OXFOKRAFNYSREH-BJDJZHNGSA-N Cys-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OXFOKRAFNYSREH-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 2
- ZAPFAWQHBOHWLL-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZAPFAWQHBOHWLL-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 2
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims description 2
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 claims description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims description 2
- 108010010967 hirudin HV1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N Asn-Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- QGNXYDHVERJIAY-ACZMJKKPSA-N Asn-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QGNXYDHVERJIAY-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N Asp-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N Cys-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims 1
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 1
- BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 claims 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 28
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 28
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 11
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 3
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 3
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010010968 hirudin HV2 Proteins 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZDZLBJVYWIIQU-AVGNSLFASA-N Asn-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JZDZLBJVYWIIQU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108700003599 Lys(47)- hirudin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N Pro-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical class [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby variant hirudinu, které obsahují v poloze 47 nebo 63 jiné aminokyseliny než ty, které se vyskytují v přírodní formě hirudinu.
V literatuře jsou popsány nejméně tři přírodní varianty hirudinu /Markwardt F.: Methods Enzymol. 19, 924 až 932 (1970), Petersen T. E. a spol.: Biol., Fluids Proč. Colloq. 23, 145 až 149 (1976), Markwardt a Walsmann (1976), Chang 0. Y.: FEBS Letters 164, 307 až 313 (1983), Oodt 3. a spol.: FEBS Letters 165, 1B0 až 184 (1984), Dodt J. a spol.: Biol. Chem. HoppeSeyler 366, 379 až 385 (1985), Dodt J. a spol.: Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803 až 811 (1986), Harvey R. P. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci., USA _8_3, 1084 až 1088 (1986)/.
Srovnání sekvencí těchto tří variant je uvedeno na obrázku 1.
První varianta, HV1, odpovídá hirudinu, který se izoluje z pijavic. Druhá varianta,
HV2 (Harvey R. P. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 1084 až 1088 (1986)) se od prvé varianty liší devíti aminokyselinami. Třetí varianta (Dodt 0. a spol.: Biol. Chem. HoppeSeyler 367, 803 až 811 (1986)) je shodná s variantou HV2 až k šeřinu 32, ale liší se deseti aminokyselinami v C-koncové části, která obsahuje navíc ještě další aminokyselinu (Ala63). Tato třetí varianta je zde označována HV3.
Tyto sekvence obsahují 65 nebo 66 aminokyselin. Mohou být považovány za 2 domény: globulární N-koncovou část, která obsahuje 3 disulfidové můstky, a kyselou C-koncovou část, která je homologická s místem štěpení trombinu v molekule protrombinu. Tato homologie poukazuje na to, že oblast obklopující polohu 47 by mohla být vazebným místem hirudinu na trombin.
Přírodní hirudin navíc obsahuje v poloze 63 sulfatovaný tyrosin (Chang J. Y.: FEBS Letters 164, 307 až 313 (1983)). Tento sulfatovaný tyrosin se znovu objevuje v poloze 64 u varianty HV3. Pro všechny varianty se zde tato poloha označuje jako poloha 63. Jeho funkce je stejná bez ohledu na jeho polohu.
Ze srovnávací analýzy sekvencí těchto přírodních variant hirudinu vyplývá, že je teoreticky možné vytvořit nové varianty, v nichž by byly různými způsoby spojeny vlastnosti přírodních molekul.
HV1 a HV3 mají lysin v poloze 47 situován mezi dvěma proliny. To je možná odpovědné za blokování aktivního místa trombinu (Harvey R. P. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA:
83, 1084 až 1088 (1986)).
Jelikož varianta HV2 nemá v této poloze bazický zbytek, ale má v této poloze asparagin, jeví se žádoucí, aby v tomto místě došlo k náhradě lysinem nebo argininem. Tím by se vytvořila molekula, jejíž vlastnosti by více odpovídaly očekávanému inhibitoru trombinu (Chang J. Y.: FEBS Letters 151, 217 až 224 (1985)) nebo také histidinu, který není dobrým substrátem pro trombin, ale také může zvýšit inhibiční sílu hirudinu.
Navíc, sulfatace tyrosinu 63 znamená rozdíl mezi přírodním hirudinem a hirudinem získaným genetickou rekombinací, což může mít vliv na jeho aktivitu, jak předpokládají kinetické studie Stonea S. R. a Hofsteengeho J.: Biochem. 25, 4622 až 4628 (1986)). Lze provést pokus, který by náhradou tyrosinu kyselým zbytkem, jako je například Glu nebo Asp, vedl k přípravě látky podobné přírodnímu proteinu.
Předmětem vynálezu je způsob výroby varianty jedné z forem hirudinu HV1, HV2, HV3, obsahující odlišnou aminokyselinu od aminokyseliny přírodní formy v poloze 47 nebo 63, a to aminokyselinu ze skupiny zahrnující lysin, kyselinu glutamovou, arginin, histidin a kyselinu asparagovou, který spočívá v tom, že se na kultivačním médiu nechá fermentovat kultura kvasinek druhu Saccharomyces cerevlsiae, která byla transformována funkčním expresním segmentem sekvence, která kóduje uvedenou variantu hirudinu, a po fermentaci se izoluje varianta hirudinu takto produkovaná v kultivačním médiu v maturované formě nebo ve formě prekurzoru, který lze maturovat in vitro.
Pro řízení exprese a sekrece genů odpovídajících různým variantám v kvasinkách se geny integrují do vektoru pro kvasinky, který se vyznačuje tím, že s výhodou obsahuje následujíCS 276 245 B6 cí prvky (které byly popsány ve zveřejněné přihlášce EP-A-200 655):
- počátek replikace plasmidu kvasinek 2 ju Λ> ,
- gen ura3,
- počátek replikace v E. coli a markér antibiotické resistence,
- promotor transkripce, leader sekvenci a pre-pro sekvenci prekurzoru alfa-faktoru, přičemž tato frekvence je napojena ve fázi proti směru vlákna od sekvence kódující variantu hirudinu a
- terminátor transkripce genu PGK kvasinky, který je umístěn po směru od genu shora uvedené varianty.
Z variant, které se podle vynálezu vyrábějí, se jedná zejména o následující varianty:
- varianty, v nichž aminokyselina Tyr 63 je nahrazena Glu nebo Asp,
- varianty, v nichž aminokyselina v poloze 47 přírodní formy je nahrazena Arg nebo His a
- varianty, v nichž aminokyselina Asn v poloze 47 přírodní formy HV2 je nahrazena Lys.
Zvláště výhodné jsou následující varianty: (Lys47)HV2, (Arg47)HV2, (His47)HV2, (Glu63)HV2 a (Asp63)HV2.
Shora uvedená varianta (Lys47)HV2 (nebo rHV2-Lys47) odpovídá následujícímu vzorci:
| ILE | THR TYR | THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU | GLY SER | ASN VAL | CYS |
| GLY | LYS GLY | ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS | VAL THR | GLY GLU | GLY |
| THR | PRO LYS | PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU | GLU TYR | LEU GLN. | |
| Různé | varianty, které si zachovávají Tyr^3, se mohou připravovat v sulfatované | nebo |
nesuliatované formě, lato sulfatace se může provádět chemicky nebo biologicky.
lakto získané varianty hirudinu se mohou používat tak, jak je popsáno v patentové přihlášce EP-A-200 655, jako inhibitor trombinu, a to jak ín vfvo tak in vitro.
lyto varianty se používají zejména ve farmaceutických prostředcích, a to bud samotné, nebo v kombinaci s jinými aktivními látkami, nebo také v souvislosti s testy a diagnózami bud in vitro, nebo in vivo. V případě, že se používají in vivo, může být výhodné označit varianty, například radioaktivním, fluorescenčním, enzymatickým nebo jiným značením.
lento vynález je vysvětlen následujícími příklady spolu s pomocí připojených výkresů, kde na obr. 1 je sekvence tří přírodních variant hirudinu, jmenovitě HV1, HV2 a HV3 a na obr. 2 jsou procenta inhibice proteolytické aktivity trombinu na chromozymu v závislosti na objemech supernatantů kultur kvasinek, které produkují hirudin rHV2 nebo jeho varianty.
Příklad 1
Konstrukce různých variant HV2 mutagenezí in vitro
Při in vitro řízené mutagenezi se DNA fragment, který je žádoucno zmodifikovat, klonuje do replikativní formy jednovláknového fágu. Genom rekombinantního fágu se izoluje. Hybridizuje se syntetickým oligonukleotidem, který nese mutovanou sekvenci, lento oligonukleótid slouží jako přiměř pro syntézu doplňkového vlákna a DNA, nyní tedy již dvouvláknová, se používá pro transformaci receptorové bakterie, která bude produkovat fág nesoucí žádanou mutaci /Zoller M. J. a Smith Μ. N.: Methods in Enzymol. 100, 469 (1983)/.
Plasmid pTG720, který je popsán v EP-A-158 564, je vektor pro expresi hirudinu v E. coli. Plasmid TG730 byl odvozen od plasmidu pTG 720 přidáním EcoRI místa po vláknu od sekvence kódující hirudin. Místo EcoRI umožňuje, aby sekvence kódující hirudin byla izolována rozštěpením působením EcoRI na jedné straně a Clal na druhé straně.
Fragment Clal-EcoRI obsahuje úplnou kódující oblast hirudinu bez několika kodonů na 5 -konci. Tento Clal-EcoRI fragment se klonuje mezi místa AccI a EcoRI derivátu fágu M13 označeného M13tG131 /Kieny M.P., Lathe R. a Lecocq 3. P.: Gene 26, 91 až 99 (1983)/. Fág, y
CS 276 245 B6 který je odvozen od M13TG131 a který obsahuje sekvenci hirudinu, se označí M13TG1919.
Byly synthetisovány tři oligonukleotidy. Každý z nich je schopen párování se sekvencí 5 -GTACACCGAACCCTGAAAG-3’ fágu M13TG1919 až na centrální oblast, která odpovídá žádané mutaci. Sekvence těchto oligonukleotidů jsou následující:
TG435 5'-CTTTCAGGGTGCGGTGTAC-3',
TG436 5'-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3' a
TG437 5 '-CTTTCAGGGCGCGG TGTAC-3 '.
Tyto oligonukleotidy umožňují, aby kodon AAC (Asn) fágu M13TG1919 byl substituován kodonem CAC (His), AAA (Lys) nebo (Arg) CGC.
Sto dvacet pikomolů každého oligonukleotidu se fosforyluje ve 100 mikrolitrech reakčního média. Přibližně 20 pM fosforylovaného oligonukleotidu se hybridizuje 1 pM jednovláknové ONA fágu M13TG1919 ve 25 mikrolitrech hybridizačního pufru. Po hybridizaci se na směs DNA kyselin působí Klenowovou polymerasou a fágovou T4 ligasou. Každá takto zpracovaná směs se použije pro transfekc.i E. coli kmene 71/18 (mut L) na trávníku indikátorových bakterií JM103 /Messing J., Crea R., Seeburg P. H.: Nucl. Acids Res. 9, 309 (1981)/. Infektované buňky jsou identifikovatelné, protože tvoří plaky, které rostou pomaleji. Kolonie se subkultivují na úplném médiu. Potom se přenesou na papír Whatman 540, aby bylo možno vyhledat buňky, které mají mutované fágy. Toto vyhledávání (screening) se provádí in šitu hybridizaci oligonukleotidem, který byl shora používán jako primer. Byly tak získány tři nové fágy, které mají žádanou mutovanou sekvenci: M13TG1921 (Asn47 > Arg), M13TG1924 (Asn47 > His) a
M13TG1925 (Asn47 -> Lys).
Dále byl proveden stejný typ pokusu s oligonukleotidem TG 434, který má sekvenci 5'-ATTGTAACTCTTCTTCTG-3\- Tento oligonukleotid se hybridizuje sekvencí 5'-CAGAAGAATATTTACAAT, která je umístěna ve 3’-oblasti sekvence kódující HV2, s nepárovým tripletem, který je určen, k substituci kodonu TAT (Tyr^3) kodonem GAG (Glu). Získá se tak odpovídající mutovaný fág M13TG1922 (Tyr63 -> Glu).
Příklad 2
Substituce Pstl-HindlII fragmentu (600 párů nukleotidů) plasmidu pTG1828 mutovaným fragmentem
Plasmid pTG1828 nese sekvenci kódující hirudin, kterou předcházejí pre-pro-sekvence genu feromonu kvasinek alfa sexuálního typu. Toto uspořádání je umístěno po kontrolou promotoru PGK. Díky tomuto napojení mezi pre-pro-sekvencemi Mfalfa a hirudinu sleduje expresovaný protein normální cestu sekrece a maturace kvasinkou. V kultivačním médiu se tak objevuje opracovaný a aktivní hirudin.
Tento plasmid byl použit znovu pro expresi sekvencí mutovaného hirudinu místo přírodního hirudinu.
Štěpení plasmidu pTG1828 působením Pstl a HindlII poskytne pět fragmentů o přibližných velikostech: 3 800, 1 900, 1 500, 1 100 a 600 párů nukleotidů. Poslední fragment obsahuje pre-pro hirudinovou napojenou sekvenci. Tento fragment obsahuje pouze jediné místo AccI a jediné místo EcoRI. Oblast, která je vázána těmito dvěma místy, obsahuje úplnou hirudinovou sekvenci bez několika kodonů na 5'-konci. Fragment HindlII-Pstl (o 600 párech nukleotidů) se vloží mezi místa Hind III a Pstl vektoru, který nemá ani místo EcoRI ani místo AccI.
Plasmid, který se tímto způsobem sestaví (pTG1960), má tedy jediné místo AccI a jediné místo EcoRi. Tato místa jsou umístěna na počátku hirudinové sekvence a ve směru hirudinové sekvence na jejím konci. Štěpením plasmidu pTG1960 působením AccI a EcoRi se tedy uvolní fragment, který obsahuje skutečně úplnou hirudinovou sekvenci a zbytek plasmidu.
Velký ONA fragment, z něhož byla.deletována sekvence hirudinu, se vyčistí na gelu a smíchá se s produktem AccI/EcoRI štěpení replikativní formy každého z mutovaných fágů popsaných
CS 276 245 B6 4 v příkladu 1, aby se rekonstituoval pre-pro-hirudin s novými HV2 variantami, které byly získány řízenou mutagenesí. Byly vybrány čtyři nové plasmidy: pTG1963 (Asn47 —> Arg), pTG1964 (Tyr63 -> Glu), pTG1965 (Asn47 -» His) a pTG1966 (Asn47 -> Lys), které se od plasmidu pTG1960 liší pouze v mutovaných kodonech. Tyto sekvence, které nesou mutované kodony, se mohou izolovat ve formě fragmentů Pstl-HindlII a reklonovat do vektoru pTG1828 na místo původního fragmentu Pstl-HindlII. Tímto způsobem byly získány čtyři nové plasmidy: pTG1977 (Asn47 —v Arg), pTG1978 (Tyr63 —i Glu), pTG1979 (Asn47 -» His) a pTG1980 (Asn —> Lys). Tyto plasmidy se od shora popsaného plasmidu pTG1828 liší pouze mutacemi vytvořenými in vitro.
Příklad 3
Transformace TGYlsp4 působením DNA kyselin z plasmidů pTG1977, pTG1978, pTG1979 a pTG198O
S. cerevisiae TGYlsp4 (Mat alfa ura3.251.373.382 his-3.11.15) se transformují působením DNA kyselin z plasmidů pTG1977, pTG1978, pTG1979 a pTG198O. Ve všech případech se získají transformanty ura+. Získají se tedy 4 kmeny, TGYlsp4 pTG1977, pTGYlsp4 pTG1978, TGYlsp4 pTG1979 a TGYlsp4 pTG1980. Produkce hirudinu těmito čtyřmi kmeny byly srovnávány s produkcí hirudinu kmenem TGYlsp4 pTG1828.
Vyseje se 20 ml kultury (YNBG+ 0,5 % kasaminokyselin) (θθ660 0,02) každého kmenu. Po 48 hodinách třepání při teplotě 30 °C se kultury odstředí (5 000 otáček za minutu, 5 minut). Supernatant se testuje, jako kontrola se používá kultura TGYlsp4 pTG1881 (plasmid, který nenese sekvenci kódující HV2).
Aktivita surových supernatantů se změří jako jejich inhibiční účinek na thrombinovou aktivitu (proteolytická účinnost na syntetický substrát, chromozym TH-Boehringer Mannheim) Procento inhibice v závislosti na ohjemu supernatantu je uvedeno na obrázku 2. Ze zjištěných hodnot plyne, že inhibiční účinek způsobený variantami s Arg47 a Lys47 je alespoň stejný jako inhibiční účinek přírodního HV2. Varianty s Glu63 a His47 jsou nepatrně slabšími inhibitory než přírodní HV2.
Příklad 4
Inhibice trombinové aktivity
Pro zřetelnější demonstraci hodnoty variant hirudinu podle tohoto vynálezu, zvláště jejich farmaceutických aplikací, jsou uvedeny následující srovnávací příklady. Tyto příklady Ilustrují inhibiční vlastnosti k trombinu varianty HV2 a dvou dalších variant formy HV2, v nichž aminokyselina v poloze 47 je nahrazena Arg nebo Lys. Všechny tyto varianty byly získány technikou rekombinantní DNA.
Při studiu kinetiky inhibice trombinu těmito variantami se použije teorie vysokoafinitních inhibitorů, jak ji popsali 3. W. Williams a 3. F. Morrison: Methods in Enzymology 63, 437 až 467 (1979), protože hirudin je reverzibilním inhibitorem trombinu.
Používané varianty hirudinu mají čistotu 95 %. Čistý lidský trombin (Sigma) má procentuální aktivitu vyšší než 92 % (měřeno titrací aktivního místa). Koncentrace lidského _g trombinu je u všech měření stejná: 5,5 10 M. jako prostředí se používá 0,05M sodný pufr PIPES, pH = 7,9, 0,18M KC1 a 0,1 % PEG při teplotě 37 °C. Trombinovým substrátem je Boehringův chromozym PL. Bylo pozorováno, že preinkubační doba pro trombin a pro hirudin je 2 minuty. Potom začíná reakce se substrátem.
V následující tabulce jsou souhrnně uvedeny experimentálně stanovené hodnoty množství hirudinu, kterého je zapotřebí pro 95¾ inhibici stejného množství lidského trombinu (5.5.10-9 M).
. CS 276 245 B6
HV2 Lys47 HV2 Arg47 HV2 množství, kterého je zapotřebí pro 95¾ inhibici trombinu (ΙΟ-9 M)
7,6
8,5
32,2
Z této tabulky je vidět, že pro inhibici stejného množství lidského trombinu je potřeba přibližně 4x méně hirudinu HV2 Arg47 a HV2 Lys47 než hirudinu HV2. Navržené varianty mají tedy značně lepší inhibiční vlastnosti na trombin.
Příklad 5
Předběžná farmakologická studie srovnání dvou variant rekombinantního hirudinu, rHV2 a rHV2-Lys 47, se standardním heparinem
1) Předmět studia: stanovit dvě varianty rekombinantního hirudinu, rHV2 (nebo HV2) a rHV2-Lys 47 /nebo (Lys47)HV2/ a srovnat jejich antitrombotickou aktivitu vzhledem ke standardnímu heparinu. Obě tyto varianty jsou bez post-transkripční sulfatace skupiny Tyr 63.
2a) Experimentální podmínky: Na základě inhibice proteolytické aktivity trombinu na chromozym se stanovuje specifická antitrombinová aktivita (lidského a hovězího trombinu) dvou rekombinantních hirudinů ve fyziologickém solném roztoku.
b) Srovnává se antikoagulační aktivita dvou hirudinů in vitro v krysí a v králičí plasmě jako prodloužení trombinové doby. Chromogenně se měří efekt antl-IIa.
c) Kinetika mizení hirudinu z plasmy po intravenózní injekci (bolus injekce) se zjišíuje změřením efektu anti-IIa za použití trombinové doby a chromogenně pomocí kalibračních křivek.
d) Stejnými technikami se stanoví koncentrace v plasmě po třicetiminutové nepřetržité intravenózní perfusi u králíků.
e) Na VJesslerově modelu (králíci, krysy) s tromboplastinem jako trombogenním činidlem a na modelu stase (městnání krve) u králíků (Fareed) se studuje antitrombinová aktivita dvou variant hirudinu a standardního heparinu. Sloučeniny se králíkům podávají kontinuální perfusi, krysám i. v. bolus.
Při studiích se používají následující modely:
Wesslerův model u králíků - v této studii se používají novozélandští králičí samci o hmotnosti 2,5 až 3 kg. Po anesthesi intravenózní injekcí pentobarbitalu sodného (30 mg/kg) se levá karotida kanyluje. Izolují se dvě krční žíly. Na každou žílu se umístí dvě volná podvázání ve vzdálenosti 2,5 cm od sebe. Králíkům se potom podává fyziologický solný roztok nebo roztoky hirudinu nebo heparinu kontinuální perfuzí po dobu třiceti minut při průtoku 2,5 ml/hodinu. Dvě minuty před koncem perfúze se odeberou vzorky arteriální krve, aby se mohla stanovit hladina antikoagulantů v plasmě. Jednu minutu před koncem perfuze se podá injekčně lidský tromboplastin (Manchester Comparative Reagents Ltd.j, standardizovaný postupem podle M. Buchanana, v dávce 600 mikrogramů na kilogram během přesně třiceti sekund do aorty via karotida. Po 30 sekundách se perfuze zastaví. Ztenčením a podvázáním dvou žilních segmentů na dobu 15 minut se získá krevní stase. Krční žíly se potom otevřou a tromby se extrahují, promyji ve fyziologickém solném nálevu a po blotacl na filtrační papír se odváží.
Wesslerův model u krys - používají se myší samci Sprague-Dawley (CD-COBS) o hmotnosti
CS 276 245 B6 přibližně 300 gramů. Po intraperitoneálni anestézii pentobarbitalem sodným (30 mg/kg) a mediální heparotonii se dolní dutá žíla vystaví na 1 cm měřeno od renální intersekce. Flexibilní uzávěr se umístí ve vzdálenosti 0,7 cm.
Testované produkty, zředěné ve fyziologickém solném nálevu, se podávají injekčně jako intravenózní bolus v dávce 1 ml/kg 5 minut 40 sekund nebo 1 minutu (heparin) před vznikem žilní stase. Čtyřicet sekund před touto stasí se injekčně podá trombogenní činidlo (králičí tromboplastin, E. Dade) v dávce 25 ng/ml/kg do žíly penisu během 30 sekund, měřených velmi přesně. Deset minut po ukončení injekčního podávání se vytvoří stase zúžením dvěma podvázáními, prvním blíže, druhým dále. Stase se udržuje 10 minut. Potom se trombus odstraní, ponoří se do 0,38¾ roztoku citranu, vysuší se obvyklým filtračním papírem a následující den se po jednohodinovém sušení při teplotě 50 °C zváží.
Model trombosy krevní stase u králíků - Pro toto studium se používají novozélandští králičí samci o hmotnosti 2,5 až 3 kg. Po anesthesi intravenózní injekcí pentobarbitalu sodného (30 mg/kg) se levá karotida kanyluje. Izolují se dvě krční žíly. Na každou žílu se umístí dvě volná podvázání ve vzdálenosti 2,5 cm od sebe. Králíkům se potom podává bud fyziologický solný roztok, nebo roztoky hirudinu nebo heparinu kontinuální perfuzí po dobu 30 minut při průtoku 2,5 ml/ hodinu. Dvě minuty před koncem perfuze se odeberou vzorky arteriální krve, aby se mohla stanovit hladina antikoagulantů v plasmě. Ve stejné době, kdy se zastaví perfuze, se vytvoří stase zúžením čtyřmi podvázáními (první nejblíže, potom vzdálenější). Stase se udržuje dvě hodiny. Potom se otevřou krční žíly a tromby se extrahují, promyjí se ve fyziologickém solném roztoku a po blotaci na filtrační papír se odváží.
3a) Výsledky: Připraví se zásobní roztok o koncentraci 1 mg na ml. V tabulce 1 níže je uvedena specifická antitrombinová aktivita dvou variant hirudinu na lidský a hovězí trombin.
Tabulka 1
| r HV2 | rHV2-Lys 47 | |
| pro lidský trombin | 14 800 | 19 000 |
| pro hovězí trombin | 15 500 | 19 200 |
| (očekávané výsledky pro lidský | ||
| trombin) | (13 000) | (16 000) |
Specifická antitrombinová aktivita varianty hirudinu rHV2 je - 15 000 ATU/mg, varianty rHV2-Lys 47 - 19 000 ATU/mg. Tyto specifické účinnosti jsou vyšší než byla očekáváno. Specifická aktivita je stejná pro lidské i hovězí trombiny.
b) Při nízkých koncentracích obou hirudinů je antikoagulační aktivita obou hirudinů v plasmě krys a králíků (stanovená jako trombinový čas) ekvivalentní. U vyšších koncentrací je znatelně lepší varianta rHV2-Lys 47. Množství reziduálního trombinu v plasmě krys a králíků (stanovené pomocí chromogenní látky) je po přidání obou hirudinů srovnatelné až do 60 ATU/ml. Při další neutralizaci stop zbytkové trombinu je účinnější varianta rHV2-Lys 47. To se projevuje v rozdílu hodnot K^.
c) Kinetiky mizení obou hirudinů z plasmy po intravenózní bolus injekci jsou při chromogenním stanovování srovnatelné, nepatrně se však liší při stanovování jako trombinový čas (tabulka 2). Hirudiny mizí podle dvou exponenciál. První fáze (distribuce) s t 1/2 alfa přibližně 3 minuty snižuje původní množství u obou hirudinů o 60 ¾ během 5 minut. Druhá fáze (eliminace) má t 1/2 beta 16 minut pro rHV2-Lys 47 a 28 minut pro rHV2 (jestliže uvažujeme trombinový čas) a 28 respektive 30 minut, jestliže používáme metodu chromogenní. Standardní heparin mizí podle jediné exponenciální fáze (t 1/2 = 9 minut).
CS 276 245 B6
Tabulka 2
Poločas (v minutách) hirudinů po intravenózní bolus injekci u králíků
| metoda | t 1/2 alfa | t 1/2 beta | ||
| TT CS | TT | CS | ||
| rHV2 | 2,5 3,0 | 28 | 28 | |
| rHV2-Lys 47 | 1,8 3,0 | 16 | 30 | |
| TT: trombinový čas CS: chromogenní látka | ||||
| d) Plasmové koncentrace | dvou variant hirudinu získané | po třicetiminutové | kontinuální | |
| intravenózní perfuzi u králíků jsou v lineárním vzájemném | vztahu | s podávanými | dávkami. |
e) Antitrombotické aktivity
| produkty | králíci: (ug/kg/h) Wessler | intravenózní perfuze stase | krysy: intravenózní bolus (ug/kg) Wessler | |
| -5 min 40 s | 1 min. | |||
| rHV2 | 375 | - | 240 | |
| rHV2-Lys 47 | 20 | 47 | 160 | |
| standardní heparin | 110 | 110 | 160 | 110 |
Na základě předběžných farmakologických výsledků se zdá, že při kontinuální perfuzi u králíků varianta rekombinantiiího hirudinů rHV2-Lys 47 má lepší antitrombinovou aktivitu než RHV2 a heparin. Farmakokinetiky obou variant hirudinu jsou totožné.
Příklad 6
Srovnání poměru antitrombinová aktivita/riziko krvácení pro hirudin rHV2-Lys 47 a standardní heparin
Provedené studie ukazují, že riziko krvácení u králíků a prodloužení doby krvácení u krys, kterým byl podán rHV2-Lys 47, jsou menší než u zvířat, jimž byl podán standardní heparin. U každého druhu byly tyto studie provedeny na základě dávek, které mají stejnou aktivitu u modelu trombosy.
V národní sbírce kultur mikroorganismů (National Collection de Microorganism Cultures) Pasteurova ústavu (Institut Pasteur), 28 Rue du Docteur Roux v Paříži (15), byly 6. listopadu 1986 uloženy následující kmeny:
TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Arg47) pod číslem 1-621 a
TGYlsp4 pTG1980 (HV2-Lys47) pod číslem 1-622. Dne 6. června 1986 byl uložen referenční kmen: TGYlsp4 pTG1828 pod číslem 1-569.
Claims (8)
1. Způsob výroby varianty jedné z forem hirudinu HV1, HV2, HV3, obsahující odlišnou aminokyselinu od aminokyseliny přírodní formy v poloze 47 nebo 63, a to aminokyselinu ze skupiny zahrnující lysin, kyselinu glutaroovou, arginin, histidin a kyselinu asparagovou, vyznačující se tím, že se na kultivačním médiu nechá fermentovat kultura kvasinek druhu Saccharomydes cerevisiae, která byla transformována funkčním expresním segmentem sekvence, která kóduje uvedenou variantu hirudinu, a po fermentaci se izoluje varianta hirudinu takto produkovaná v kultivačním médiu v maturované formě nebo ve formě prekurzoru, který lze maturovat in vitro.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se nechají fermentovat kvasinky transformované vektorem nebo funkčním ADN segmentem obsahujícím:
- počátek replikace plasmidu kvasinek 2 /i/nz ,
- gen ura3,
- počátek replikace v E. coli a markér antibiotické resistence,
- promotor transkripce, leader sekvenci a pre-pro sekvenci prekurzoru alfa-faktoru, přičemž tato sekvence je napojena ve fázi proti směru vlákna od sekvence kódující variantu hirudinu a
- terminátor transkripce genu PGK kvasinky, který je umístěn po směru od genu varianty hirudinu, a že se izoluje varianta hirudinu produkovaná v kultivačním médiu v maturované formě nebo ve formě prekurzoru,
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použije odpovídající výchozí produkt za vzniku varianty hirudinu, ve které je aminokyselina Tyr v poloze 63 přírodní formy nahrazena Glu nebo Asp.
4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použije odpovídající výchozí produkt za vzniku varianty hirudinu, ve které je aminokyselina v poloze 47 přírodní formy nahrazena Arg nebo His.
5. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se použije odpovídající výchozi produkt za vzniku varianty hirudinu, ve které je aminokyselina 47 přírodní formy HV2, Asn, nahrazena Lys.
6. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se použije odpovídající výchozí produkt za vzniku varianty hirudinu vybrané ze skupiny zahrnující (Lys47)HV2, (Arg47)HV2, (His47)HV2, (G1u63)HV2 a (Aspé3)HV2.
7. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se použije odpovídající výchozí produkt za vzniku varianty hirudinu, která odpovídá sekvenci:
8. Způsob podle bodů 1 až 7, vyznačující se tím, že se použije odpovídající výchozí produkt za vzniku varianty hirudinu, která- je nebo není sulfatovaná.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR868616723A FR2607517B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS8708732A2 CS8708732A2 (en) | 1991-07-16 |
| CS276245B6 true CS276245B6 (en) | 1992-05-13 |
Family
ID=9341393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS878732A CS276245B6 (en) | 1986-12-01 | 1987-12-01 | Process for preparing modification of one of hv1, hv2, hv3 hirudin forms |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650301A (cs) |
| EP (1) | EP0273800B1 (cs) |
| JP (1) | JP2567263B2 (cs) |
| KR (1) | KR960011918B1 (cs) |
| AT (1) | ATE73462T1 (cs) |
| AU (1) | AU617989B2 (cs) |
| BG (1) | BG49719A3 (cs) |
| CA (1) | CA1341416C (cs) |
| CS (1) | CS276245B6 (cs) |
| DE (1) | DE3777367D1 (cs) |
| DK (1) | DK173247B1 (cs) |
| ES (1) | ES2032465T3 (cs) |
| FI (1) | FI99211C (cs) |
| FR (1) | FR2607517B2 (cs) |
| GR (1) | GR3004556T3 (cs) |
| HU (1) | HU213871B (cs) |
| IE (1) | IE60544B1 (cs) |
| MC (1) | MC1884A1 (cs) |
| NO (1) | NO177500C (cs) |
| PL (1) | PL157254B1 (cs) |
| PT (1) | PT86233B (cs) |
| RO (1) | RO106890B1 (cs) |
| SU (1) | SU1687032A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA879011B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| GB8817161D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Modified proteins |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| ATE140929T1 (de) * | 1990-11-08 | 1996-08-15 | Japan Energy Corp | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
| JP7375012B2 (ja) * | 2019-04-16 | 2023-11-07 | サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド | ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
-
1986
- 1986-12-01 FR FR868616723A patent/FR2607517B2/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-11-25 NO NO874905A patent/NO177500C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 PT PT86233A patent/PT86233B/pt unknown
- 1987-11-27 AU AU81880/87A patent/AU617989B2/en not_active Expired
- 1987-11-27 IE IE323987A patent/IE60544B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 CA CA000553153A patent/CA1341416C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-30 DK DK198706276A patent/DK173247B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 EP EP87402696A patent/EP0273800B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AT AT87402696T patent/ATE73462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 ES ES198787402696T patent/ES2032465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 SU SU874203831A patent/SU1687032A3/ru active
- 1987-11-30 RO RO130679A patent/RO106890B1/ro unknown
- 1987-11-30 DE DE8787402696T patent/DE3777367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-01 PL PL1987269164A patent/PL157254B1/pl unknown
- 1987-12-01 HU HU875394A patent/HU213871B/hu unknown
- 1987-12-01 MC MC871932A patent/MC1884A1/xx unknown
- 1987-12-01 FI FI875295A patent/FI99211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 CS CS878732A patent/CS276245B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 BG BG82035A patent/BG49719A3/xx unknown
- 1987-12-01 KR KR1019870013708A patent/KR960011918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 ZA ZA879011A patent/ZA879011B/xx unknown
- 1987-12-01 JP JP62305504A patent/JP2567263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400903T patent/GR3004556T3/el unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,511 patent/US5650301A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0487591B1 (en) | Anticoagulant protein | |
| FI91160C (fi) | Menetelmä modifioidun ihmisen t-PA-proteiinin valmistamiseksi | |
| FI89723B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell | |
| JPH05279398A (ja) | ヒト抗トロンビンｉｉｉ | |
| CS276245B6 (en) | Process for preparing modification of one of hv1, hv2, hv3 hirudin forms | |
| JPH02121934A (ja) | 組合せ医薬組成物 | |
| US5516656A (en) | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same | |
| WO1989000192A1 (en) | Production of kallikrein | |
| US5420252A (en) | Human antithrombin III mutants | |
| Courtney et al. | Production and evaluation of recombinant hirudin | |
| DD274053A5 (de) | Verfahren zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators | |
| EP0677107A1 (de) | Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern. | |
| JPH08511157A (ja) | Ｘａファクター阻害活性を有する新規ポリペプチド | |
| US5661000A (en) | Serine protease and serine protease gene | |
| JPH08510903A (ja) | 蛭ヒルド・メディシナリスの組換えｘａ因子インヒビターの作製 | |
| EP0307478A1 (en) | Serine protease and serine protease gene | |
| JP3226289B2 (ja) | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 | |
| JPH0971600A (ja) | ヒトアンチトロンビンｉｉｉ 変異体 | |
| WO1994020537A1 (en) | Non-glycosylated tfpi analogues | |
| JPH06279497A (ja) | トロンビン結合性物質及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20071201 |