PT86233B - Processo para a preparacao de uma variante da hirudina - Google Patents
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Description
A presente invenção refere-se ao processo de preparação de uma variante da hirudina compreendendo um ácido aminado diferente do ácido aminado da forma natural em posição 47 ou 63. O processo é caracterizado por compreender .a fermentação de uma levedura previamente transformada quer por um plasmídeo quer por um bloco funcional de ADN codificando para a variante da hirudina
27.N0V.1987
58900
Ref: D IIO54/3337O2
Descrição do objecto do invento que
TRANSGENE S. A., sociedade anónima francesa, industrial, com sede em 16 rue Henri Regnault 92400 COURBEVOTE, França, preten de obter em Portugal, para:PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VARIANTE DA HIRUDINA presente invento refere-se a um processo para a pre paração de uma variante da hirudina.
Na literatura encontram-se descritas pelo menos 3 variantes da hirudina (Markwardt 1970; Petersen e al. 1976; Markwardt e Walsmann 1976; Chang 19θ3ί Dodt e al. 1984, 1985, 1986; Harvey e al. 1986; patente francesa 84.04755)»
As sequências comparadas dessas três variantes são apresentadas na figura 1.
A primeira variante, HV1, corresponde a hirudina que se isola do corpo da sanguessuga; a segunda, HV2 (Harvey e al. 1986) difere da primeira em 9 ácidos aminados; a terceira (Dodt e al. 1986) é indentica à HV2 até à serina 32 mas difere em 10 ácidos aminados na parte C-terminal, que compreende, ainda, um ácido aminado suplementar (ala63)· Esta terceira variantejberá designada daqui em diante por HV3.
Estas sequências comportam 65 ou 66 ácidos aminados e podem ser considerados como dois dominiosí uma parte terminal N- globular, que contem 3 pontos dissulfúricos e uma parte terminal C- ácida que apresenta uma homologia com o ponto de clivagem para a trombina na molécula de protrombina. Esta homologia permite pensar que a região que
58900
Ref: D II054/333702 rodeia a posição 47 poderia ser o ponto de fixação da hirudina na trombina.
Por outro lado, a hirudina natural contem uma tirosina sulfatada, na posição 63 (Chang, 1983)· Esta tirosina sulfatada reencontra-se na posição 64 na variante HV3» Daqui em diante ela será designada como posição 63” para todas as variantes, dado que a sua função é a mesma seja qual for a sua posição.
A análise comparada das sequências das variantes naturais da hirudina permite encarar, teoricamente, a criação de novas variantes onde se combinam diferentemente as caracteristicas das moléculas naturais.
As HV1 e HV3 apresentam uma lisina na posição 47, situada entre duas prolinas, a qual é provavelmente respon sável pelo bloqueamento da localização activa da trombina (Dodt e al. 1984 e 1985).
Como a HV2 não apresenta nenhum residuo básico nessa posição mas sim uma asparagina, parece desejável substituir aí uma lisina ou uma arginina para a tornar mais conforme com o que se espera de um inibidor da trombina (Chang 1985) ou ainda uma histidina que não é conforme com um bom substrato da trombina mas que poderia aumentar o pjo der inibidor da hirudina.
Por outro lado, a sulfatação da tirosina 63 constitui uma diferença entre a hirudina natural e a hirudina obtida por recombinação genética que poderia ter consequên cias sobre a sua actividade, como sugerem os estudos cinéticos de Stone e Hoftsteenge (1986).
Pode tentar imitar a proteina nativa substituindo-a tirosina por um resíduo ácido como glu ou asp.
presente invento refere-se a um processo para a preparação das variantes da hirudina, caracterizadas por comportarem um ácido aminado diferente do ácido aminado
-258900
Ref: D 11054/333702 existente na forma natural nas posições 47 ou 63
Trata-se, de preferência, de uma variante das hidudinas HV1, HV2 ou HV3.
Entre as variantes em questão, devem citar-ses
- As variantes em que o ácido aminado Tyr -3 foi substituído por um resíduo ácido, particularmente Glu ou Asp;
- as variantes nas quais o ácido aminado na posição 47 da forma natural é substituído por uma Arg ou His;
4?
- as variantes nas quais a Asn ’ da forma natural da HV2 é substituído por uma Lys.
Devem referir-se particularmente as variantes preferidas seguintes:
[Lys^7]HV2 [Arg^7]HV2 [His47lHV2 1 [G1u63]HV2 [asP 63]HV2
A variante referida no processo do presente invento, a saber (Lys^7) HV2 |ou ”rHV2-Lys 47” J, responde à formula seguinte:
-358900
Ref; D 11054/333702
| ILE | THR | TYR | THR | ASP | CYS | THR | GLU | SER | GLY | GLN | ASN | LEU | CYS |
| LEU | CYS | GLU | GLY | SER | ASN | VAL | GYS | GLY | LYS | GLY | ASN | LYS | CYS |
| II | |||||||||||||
| ILE | LEU | GLI | SER | ASN | GLY | LYS | GLY | ASN | GLN | CYS | VAL | THR | GLY |
| GLU | GLY | THR | PRO | LYS | PRO | GLU | SER | HIS | ASN | ASN | GLY | ASP | PHE |
| GLU | GLU | ILE | PRO | GLU | GLU | TYR | LEU | GLN |
As diferentes variantes que conservaram a Tyr J podem ser utilizadas sob forma sulfatada ou não. Esta sulfatação pode ser obtida quimicamente ou por via biológica.
Por consequência o presente invento abrange igualmen te os processos biológicos e/ou químicos que permitem preparar as variantes acima mencionadas.
Com efeito, podem obter-se essas variantes por síntese e/ou por meio de técnicas conhecidas de manipulação genética.
Assim, por exemplo, a clonagem e a expressão das diferentes sequências codificantes para as HV1, HV2 e HV3, particularmente a HV2 e a obtenção das hirudinas correspon dentes a partir de culturas de leveduras, foram descritas no pedido de patente EP-A-2OO 655*
As variantes de acordo com o invento podem ser obtidas por meio de técnicas equivalentes, depois de se terem modificado as sequências codificantes mencionadas anteriormente, por exemplo, por meio de mutagenese dirigida.
Particularmente, por mutagenese dirigida in vitro. constroem-se variantes em que a asparagina 47 é substitui da por uma lisina, uma arginina ou uma histidina e em que a tirosina 63 é substituída por um ácido glutâmico.
Particularmente, é possível utilizar blocos de expressão funcionais, como os descritos no pedido de patente EP-A-200 655enosquais a sequência da hirudina é código para as variantes precedentes; esses blocos funcionais
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Refí D 11054/333702
de ADN podem ser transportados por um plasmídeo vector.
Para dirigir a expressão e a secreção pela levedura dos genes correspondentes às diferentes variantes, estas são integradas num vector de levedura que compreende, de preferência, os seguintes elementos, que foram descritos no pedido de patente EP-A-2OO 655s
- a origem de replicação do plasmídeo de levedura 2 ju
- o gene ura3,
- uma origem de replicação no E.coli e um marcador de resistência a um.antibiótico,
- um promotor de transcrição, a sequência leader” e a sequência pre-pro do percursor do factor alfa, fundido em fa se, a montante da sequência codificadora da variante da hi rudina,
- o terminador de transcrição do gene PGK da levedura, que será colocado a jusante do gene da referida variante da hirudina.
presente invento refere-se igualmente às leveduras transformadas por esses vectores ou por esse bloco funcional de ADN e sua aplicação à preparação das variantes da hirudina.
presente invento refere-se particularmente a um processo para a preparação de uma variante da hirudina por meio da fermentação de uma levedura de acordo com o invento e recuperação da hirudina produzida no meio de cultura sob forma matura ou sob a forma de um percursor maturável in vitro.
As técnicas utilizadas já foram descritas mais pormenorizadamente nos pedidos de patente EP-A-200 655 e EP-87 401649.6
As variantes da hirudina assim obtidas podem ser
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Ref» D 11054/333702 utilizadas conforme é descrito no pedido de patente EP-A-200 655 como inibidores da trombina, tanto in vivo como in vitro.
Estas variantes podem utilizar-se, particularmente, em composições farmacêuticas, sós ou em combinação com outros princípios activos, ou no quadro de testes ou de diagnósticos, in vitro ou in vivo. Neste último caso, pode ser interessante marcarem-se as variantes, por exemplo por meio duma marcação fluorescente, radioactiva, enzimática ou outra.
presente invento é ilustrado pelos exemplos seguintes, com o auxilio da figura 1 que representa as sequências de 3 variantes naturais da hirudina, a saber HV1, HV2 e HV3 e com o auxilio da figura 2, que representa a per centagem de inibição da actividade proteolítica da trombina sobre o cromozima, em função dos volumes de sobrenadante das culturas de levedura que produzem a hirudina rHVg ou as suas variantes.
Exemplo I Construção de diferentes variantes de HV-2 por meio de mutagenese in vitro.
Para se efectuar uma mutagenese dirigida in vitro. o fragmento do ADN que se deseja modificar é clonado na forma replicativa de um fago simples brinj o genoma do fago recombinante é isolado e posto a hibridar com um oligonucleótido sintético que é portador da sequência modificada. Este oligonucleótido serve de isco à sintese do germen complementar e o ADN, assim tornado duplamente germinado, é utilizado para transformar uma bactéria receptora que vai produzir um fago portador da mutação procurada (Zeoller e Smith, 1983) plasmideo pTG720, descrito na patente EP-A-158564 z um vector de expressão da hirudina no E.colo. 0 plasmideo pTG73O foi derivado de pTG720 por acrescentamento de um pon to EcoRI a jusante da sequência codificadora da hirudina.0 ponto EcoRI permite recuperar a sequência codificante da
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Ref: D 11054/333702
hirudina por digestão EcoRI de uma parte, e Ciai de outra.
fragmento Clal-EcoRI cobre a totalidade da região codificadora da hirudina, menos alguns codons 5'- terminais. Este fragmento Ciai-EcoRI foi clonado entre os pontos AccE e EcoRI de um derivado do fago M13, chamado M13TG31 (Kieny e al., 1983). 0 fago derivado do M13TG131 e que compreende esta sequência da hirudina é chamado M13TG1919.
Sintetizaram-se três oligonucleótidos capazes, cada um deles, de se emparalharem com a sequência 5’-GTACACCGAACCCTGAAAG-3· do M13TG1919 com excepção da sua região central que corresponde à mutação desejada. As sequências desses oligonucleótidos são as seguintes:
TG435 5’-CTTTCAGGGTGCGGTGTAC-3'
TG436 5»-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3’
TG437 5’-CTTTCAGGGCGGGGTGTAC-3’
Estes oligonucleótidos foram concebidos para permitirem a substituição do codon AAC (Asn) do M13TCrl919 por CAC (his) ou AAA (lys) ou CGC (arg) respectivamente.
120 picomoles de cada um dos oligonucleótidos foram fosforilados em 100 pl de meio reaccional e cerca de 20 picomoles de oligonucleótido fosforilado, foram híbrida — dos com 1 picomole de ADN simples germen do fago M13TG1919 em 25 microlitros de tampão de hibridação.
Depois da hibridação, a mistura de ADNs foi submetida à acção da polimerase de Klenow e à ligase do fago T4. Cada uma das misturas assim tratadas serviu para transfectar a estirpe de E. coli 71/18 (mut L) sobre um tapete de bactérias indicadoras JM103 (Nessing e al., 1981).
As células infectadas são distinguíveis por formarem zonas de crescimento mais lentoj as colónias foram repicadas sobre meio completo e depois transferidas para papel
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Ref: D 11054/333702
Whatman 540, tendo em vista uma crivagem das células que apresentam fagos mutados.
Essa crivagem é realizada por hibridação ”in situ com o oligonucleótido que serviu de isco anteriormente. Obtiveram-se assim três novos fagos que apresentam a sequência mutada que se procura:
M13TG1921 (asn2*7-» arg) , M13TG1924 ( asn**7-♦ his) , e
M13TG1925 ( asn^7 lys) .
Por outro lado, o mesmo tipo de experiência foi levado a efeito com um oligonucleótido TG434 de sequência 5 ’ -ATTGTTAACTCTTCTTCTG-3 *. Este oligonucleótido hibrida-se com a sequência 5'-CAGAAGAATATTTACAAT localizada na região 3’ da sequência codificadora para a HV-2, com um triplete não emparelhado que se destina a substituir o codon TAT (tyr^) por GAG (glu). Obteve-se assim o fago mutado correspondente M13TG1922 (tyr^^-> glu).
Exemplo 2 Substituição do fragmento Psil-HindlII (θ,6 kb) de pTG1828 pelo fragmento modificado.
plasmídeo pTG1828 (descrito no pedido de patente EP-87 401649.6) é portador da sequência codificadora da hirudina, precedida pelas sequências pre-pro do gene da feromona sexual alfa da levedura; 0 conjunto é colocado sob o controlo do promotor PGK. Para esta funsão entre as sequências pre-pro de e hirudina, a proteína expres sa segue o caminho normal de secreção e de maturação da levedura, de maneira que a hirudina processada e activa é encontrada no meio de cultura.
Este plasmídeo foi retomado para exprimir as sequências de hirudina modificada, em vez da hirudina nativa.
A digestão por Pstl e HindITI do pTG1828 liberta
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Ref: D 11054/333702
cinco fragmentos com os tamanhos aproximados de 3,8, 1.9, 1.5, 1,1 e 0.6 Kb respectivamente. 0 último fragmento compreende a sequência fundida pre-pro-hirudina. Este fragmen to não compreende senão uma unica localização Accl e uma só localização EcoRI. A região delimitada por essas duas localizações compreende integralmente a sequência hirudina menos alguns codons 5’-terminais. 0 fragmento HindlIT-Pstl de 0.6 Kb foi introduzido entre as localizações HindTII e PstI de um vactor que não apresenta nem localização EcoRI, nem localização Accl.
plasmídeo assim reconstituído (pTG1960) possui portanto uma localização Accl única e uma localização EcoRI única, localizadas respectivamente no inicio da sequência hirudina e a jusante desta. A digestão do pTG19úO por Accl e EcoRI, liberta um fragmento que compreende a quase totalidade da sequência da hirudina e o resto do plasmídeo.
grande fragmento de APN extraído da sequência de hirudina é purificada sobre gel e misturado ao produto de digestão AccI-EcoRI da forma replicativa de cada um dos fagos modificados descritos no exemplo 1, tendo como finalidade reconstituir a fusão pre-pro-hirudina com as novas variantes HV-2 obtidas por mutagenese dirigida. Quatro no vos plasmideos foram seleccionados: pTG19ú3 (asn arg), pTG1964 (tyr^3 glu), pTG19ú5 (asn^7 his) e pTG1966 (asn^7 lys) que não diferem do pTG19úQ senão pelos codons modificados.
Estas sequências que são portadoras dos codons modificados podem ser recuperados sob a forma de fragmentos Pstl-HindlII para serem reclonados no vector pTG1828 no lugar do fragmento Pstl-HindlII original.
Obtiveram-se assim 4 novos plasmideos t pTG1977 (asn^7 arg), pTG1978 (tyr^3 ·*» glu), pTG1979 (asn ^7·»
-=> his) e pTG198O (asn^7 - lys) que não diferem do pTG1828 descrito mais acima senão pelas mutações criadas
927.N0V.1987
58900
Refí D 11054/333702
in vitro.
Exemplo 3 Transformação do TGYlsp4 pelas ADNs de pTG1977, pTG1978, pTG1979 e pTG198O.
As células de S.cerevisiae TGYlsp4 (Mato( ura3.-251.373.382 his3.H.15) foram transformadas pelas ADNs de pTG1977, PTG1978, PTG1979 e pTG198O. Em cada um dos casos obteve-se um transformador ura+.
Tem-se portanto quatro estirpes TGYlsp4 pTG1977, TGYlsp4 pTG1978, TGYlsp4 pTG1979 e TGYlspU pTG198O. Comparou-se as produções de hirudina dessas quatro estirpes e do TGYlsp4 pTG1828.
Inseminaram-se 20 ml de cultura (YNBG + casaminoácidos 0,5 ^.) a ΟΟ^βθ o,O2 com cada estirpe. Após 48 horas de agitação a 30 ?C, as culturas são centrifugadas (5000 rpm, 5 min) e os sobrenadantes são doseados. Uma cultura de TGYlsp4 pTG881 (plasmidio que não é portador de sequên cia codificadora para a HV-2) é utilizada como controlo.
A actividade dos sobrenadantes brutos é medida pelo seu efeito inibidor sobre a actividade da trombina (actividade proteolitica sobre um substrato sintético, o cromozima TH - Boehringer Mannheim)· A percentagem de inibição em função dos volumes de sobrenadante é dada pela figura 2.
Constata-se que o efeito inibidor produzido pelas va riantes arg47 e lys^7 é pelo menos igual ao da HV2 nativa. As variantes glu^3 e his47 são ligeiramente menos inibidoras do que a HV-2.
Exemplo 4 Inibição da actividade da trombina
Para melhor por em evidência o interesse das variantes da hirudina que são objecto do presente invento, particularmente quanto à sua utilização farmacêutica, os exem
-1058900
Ref: D 11054/333702 pios comparativos seguintes ilustram as propriedades inibidoras em relação à trombina da variante HVg e de duas ou tras variantes da forma HVg, em que o ácido aminado na posição 47 é substituído por uma Arg ou uma Lys, todas obtidas por meio de ADN recombinante»
Para estudar a cinética de inibição da trombina para essas variantes, utilizam-se as teorias dos inibidores de grande afinidade, tal como ela é descrita em WILLIílMS J.W. e MORRISON J.F. Mehods in Enzymology 63 p.437-467, 1979, uma vez que a hirudina é um inibidor reversível da trombina.
As variantes da hirudina utilizadas são purificadas a 95 % e a trombina humana pura de Sigma apresenta uma per centagem de actividade medida por titulação da localização activa, que se situa para lá de 92 A concentração da trombina humana é a mesma para todas as medições, ou seja 5,5 10“^M, 0 meio é um tampão PlPES de sódio 0,05 pH 7.9, Kcl 0,18 M e PEG 0,1 % a 37 ?C. 0 substrato da trombina é o cromoziwa PL de Boehringer. Respeita-se um tempo de incubação previa de 2 minutos para a trombina e a hirudina, depois a reacção é desencadeada com o substrato.
quadro seguinte recapitula os valores determinados experimentalmente da quantidade de hirudina necessária para inibir 95 % de uma mesma quantidade de trombina humana (5,5 10-9M).
Quantidade para atingir 95% de inibição da trombina
HVg LYs '
HVg Arg 1
HIV 2
7.6
8.5
32,2
1158900
Ref: D 11054/333702
Parece portanto que são necessárias cerca de 4 vezes menos quantidades de hirudina HVgArg^-7 e HVp Lys^7 para inibir uma mesma quantidade de trombina humana do que de hirudina HVg.
As variantes propostas apresentam portanto propriedades inibidoras que são nitidamente melhoradas.
Exemplo 5 Estudo farmacológico perliminar de duas variantes da hirudina recombinante iilV2 e rHV2-Lys 47 comparadas com a heparina standard”
- Finalidade do estudo
Avaliar duas variantes de hirudina recombinante rHV2 (ou HV2) e rHV2-Lys 47 (ou Lys^7) HV2) e comparar a sua eficácia antitrombótica à da heparina standard”. Estas duas variantes são desprovidas de sulfatação pós-transcricional do agrupamento Tyr 63«
- Condições experimentais
a) A actividade antitrombinica específica (trombinas humana e bovina) das duas hirudinas recombinantes em soro fisiológico, é determinada pela inibição da actividade pro teolítica da trombina sobre o cromozima.
b) A actividade anticoagulante das duas hirudinas é com parada in-vitro no plasma de ratos e de coelhos, por meio do prolongamento do tempo de trombina e o efeito anti-IIa é medido pelo método cromogénico.
c) A cinética de desaparecimento plasmático da hirudina, após injecção por via i.v. de um comprimido solúvel, é seguida pela medição do efeito anti-TIa. com o auxilio do tempo de trombina e pelo método cromogénico por meio de curvas de calibragem.
58900
Ref: D 11054/333702
d) As concentrações plasmáticas obtidas depois de decorridos 30 minutos de perfusão continua i.v. no coelho, são determinadas por intermédio das mesmas técnicas.
e) A actividade antitrombótica das duas variantes da hirudina e da heparina standard** é estudada 110 modelo de Wessler em coelho e rato, com a tromboplastina como agente trombogénico e no modelo de estase, no coelho (Fareed). As drogas são administradas em perfusão continua no coelho e em comprimido diluído i.v. no rato.
Os modelos utilizados são os seguintes:
Modelo de Wessler no coelho
Coelhos machos da raça New Zealand, que pesavam de 2,5 a 3 kg, foram utilizados neste estudo. ApÓs anestesia por meio de injecção intravenosa de pentobarbital sódieo (30 mg/kg) , a carótida esquerda foi canulada e as duas.vedas jugulares foram isoladas; duas ligaduras frouxas foram colocadas sobre cada uma delas, a 2,5 cm uma da outra. Os coelhos receberam a seguir, ou soro fisiológico, ou soluções de hirudina ou de heparina, em perfusão continua durante 30 minutos, a um débito de 2,5 ml/hora. Dois minutos antes do fim de perfusão, foram realizadas pré-extracções arteriais a fim de se determinarem as taxas dos anticoagulantes do plasma. Um minuto antes do final da perfusão, foi injectada tomboplastina humana (Manchester Cómparati-Reagents Ltd), estandardisada segundo o processo de M.Buchanan, numa dosagem de 600 31/kg durante exactamente 30 segundos, na aorta, via carótida. Trinta segundos mais tarde, a perfusão foi suspensa e uma estase sanguínea foi realizada por meio do aperto das ligaduras dos dois segmen tos venosos durante 15 minutos. As jugulares foram abertas e os trombos extraídos, lavados em soro fisiológico e pesja dos após tamponamento sobre papel de filtro.
58900
Ref: D 11054/333702
Modelo de Wessler no rato
Foram utilizados ratos machos Sprague-Dawley (CD-COBS) que pesavam cerca de 300 g cada. Após anestesia com pentobarbital sódio por via iop. (30 mg/kg) e laparotomia mediana, a veia cava inferior foi desembaraçada na extensão de 1 cm a partir da passagem renal. Duas ligaduras flexíveis foram colocadas a 0,7 cm de distancia uma da outra.
Os produtos a testar, diluídos no soro fisiológico, foram injectados por comprimido solúvel i.v, a 1 ml/kg 5 min 40 s ou 1 min (heparina) antes da realização da estase venosa. Quarenta segundos antes dessa estase, um agente trombogéneo (tromboplastina de coelho E. Dade) foi injectado a uma dosagem de 25 mg/ml/kg na veia do pénis, muito exactamente em 30 segundos. Dez segundos depois do fim da injecção, foi estabelecida uma estase apertando-se as duas ligaduras, primeiro a proximal, depois a distai. A estase foi mantida durante 10 minutos, depois o trombo foi extraído, imerso numa solução de citrato a O,38 seca sobre papel mata-borrão e pesado no dia seguinte após uma secagem de tuna hora a 5O5 C.
Modelo de trombose por estase sanguínea no coelho
Coelhos machos New Zealand pesando de 2,5 a 3 kg foram utilizados neste estudo. Após anestesia por via intravenosa com pentobarbital sódico (30 mg/kg), a carótida esquerda foi canulada e as duas veias jugulares foram isoladas; duas ligaduras frouxas foram colocadas em cada uma delas, separadas 2,5 cm uma da outra. Os coelhos receberam em seguida, ou soro fisiológico, ou soluções de liirudina ou de heparina em perfusão continua, durante 30 minutos, a um débito de 2,5 ml/hora. Dois minutos antes do fim da perfusão, efectuaram-se levantamentos arteriais para se determinarem as taxas dos anticoagulantes do plasma. Ao mesmo tempo que a perfusão era suspensa, foi estabele-1427.H0V.1987
58900
Ref: D 11054/333702
cida uma estase apertando-se as quatro ligaduras (primeiro a proximal e depois a distai). A estase foi mantida durante 2 horas, depois as jugulares foram abertas e os trombos extraídos lavados em soro fisiológico e pesados após tamponamento sobre papel de filtro*
- Resultados
a) Para uma preparação de solução-mãe com uma concentração de 1 mg/ml, a actividade antitrombinica especifica das duas variantes da hirudina, em relação à das trombinas humana e bovina, encontra-se expressa no quadro 1 que segue:
Quadro 1
Para a trombina humana
Para a trombina bovina (resultados esperados para a trombina humana)
| r HV2 14 800 15 500 | rIiV2-Lys 47 19 000 19 200 |
| (13 300) | (16 000) |
A actividade antitrombinica específica da hirudina variante rHV2 é de +/-.15 000 ATU/mg e de +/- 19 000 ATU/mg para a variante rHV2-Lys 47*
Estas actividades específicas são superiores ás esperadas. A actividade específica é idêntica para as trombinas humana e bovina.
b) A actividade anticoagulante no plasma do rato e do coelho determinada pelo tempo de trombina é equivalente para as concentrações fracas das duas hiructinas. A variante rHV2-Lys 47 é nitidamente superior para as concentrações mais elevadas. A quantidade de trombina residual no plasma do rato e do coelho, determinada por substrato cromogénio é comparável, após reunião das duas hirudinas até
-1558900
Ref: D 11054/333702
27.0.1987
ATU/ml. Para neutralizar ainda mais os vestígios de trombina residual, a variante rHV2-Lys 47 è mais eficaz. Isto reflete a diferença dos Ki.
c) A cinética de desapai*ecimento plasmático das duas hirudinas após injecção por via i.v. de comprimido solúvel, é comparável para a determinação por método cromogénico, mas ligeiramente diferente para a determinação pelo tempo de trombina (quadro 2). As hirudinas desaparecem segundo dois expoentes. Uma primeira fase (distribuição) com um t 1/2 de cerca de 3 minutos, que reduz de 60 a primeira quantidade inicial em 5 minutos para as duas hirudinas; uma segunda fase (eliminação) com um t 1/2 β de 16 minutos para a xfiV2-Lys 47 e de 28 minutos para a riIV2 se se considerar o tempo de trombina e de 28 e 30 minutos, respectivamente, se se utilizar o método cromogénio.
A heparina standard” desaparece de acordo com uma uma única fase exponencial (t 1/2 e 9 min).
Quadro 2 : Meia-vida em minutos das hirudinas, após injejc ção IV de comprimido solúvel no coelho.
| t 1/2 | t 1/2 £ | |||
| Método | TT | SC | TT | SC |
| rHV2 | 2,5 | 3,0 | 28 | 28 |
| rHV2-Lys 47 | 1,8 | 3,0 | 16 | 30 |
TT : tempo de trombina
SC : substrato cromogénio
d) As concentrações plasmáticas das duas variantes da hirudina obtidas após 30 minutos de perfusão contínua i.v.
no coelho, estão em relação linear com as doses perfundida^
-16__^2Z.J0M1987
589OO~
Ref: D 11054/333702
e) Efeitos antitrombóticos { Produtos Coelho i.v. perfusão Rato i.v.comprimido solúvel: , ug/kg/h ug/kg.
WESSLER ESTASE WESSLER $ $ : -5min 40s -Imin:
| rHV2 | 375 | — | 240 | » | |
| rHV2-Lys 47 | 20 | 47 | 16o | M» | * |
| Heparina | 110 | 110 | 160 | 110 | • |
| Standard | • • |
Com base nestes resultados farmacológicos preliminares, parece que em perfusão contínua no coelho, a variante da hirudina recombinante riIV2-Lys 47 tem uma actividade antitrombótica superior a da xHV2 e à da heparina. A farmacocinética das duas variantes da hirudina é idêntica.
Exemplo 6 Comparação entre a relação actividade antitrombótica/risco hemorrágico da hirudina iHV2-Lys 47 e a heparina “standard”
Os estudos realizados mostram que o risco hemorrágico no coelho ou o alongamento do tempo de sangramento no rato, tratados com a rHV2-Lys 47, são inferiores aos dos tratados com a heparina satandard”, referindo-se, para cada uma das espécies, doses equi-activas num modelo de trombose.
Depósito das estirpes representativas do presente invento
As estirpes seguintes foram depositadas na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15), em 6 de
-1758900
Refí D IIO54/3337O2
21. M1987
Novembro de 1986:
TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Arg^) sob o n? 1-621
TGYlsp4 pTG198O (HV2-Lys *7) sob ο η» T-622
A estirpe de referência tinha sido depositada em 6 de Junho de 1986:
TGYlsp4 pTG1828 sob o n° I-569
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-1858900
Ref: D 11054/333702
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Zoller, M.J. & Smith M.N. Methods in Enzymol. 1OO, 469 (1983).
depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado em França em 1 de Dezembro de 1986, sob o n?, 86 16723
Claims (3)
1. segundo DODT e outros FEBS LETTERS 1984 165, 180-183.
1 HV1 VAL VAL
2HV2 ILE THR
3 HV3 ILE THR
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY
CYS GLU GLY 5ER ASN VAL CYS GLY
CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY
CLN
LYS
LYS
GLY ASN LYS CYS ILE LEU
GLY ASN LYS CYS ILE LEU
GLY ASN LYS CYS ILE LEU
LEU
LEU
CLN
CLN
ASP GLU
64 65 66
ALA
1 2
1*. - Processo para a preparação de uma variante da hirudina caracterizado por compreender os seguintes passos: sintese, hemi-síntese e/ou manipulação genética.
2. segundo HARVEY e outros Proc. Natl. Acad. EUA 1986 83, 1084-1088 63
2». - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender a fermentação de uma levedura previamente transformada quer por um plasmídeo que possui!
- a extremidade inicial de replicação do plasmídeo de levedura 2 ju,
- o gene ura 3
- uma extremidade de replicação em E. coli e um marcador de resistência a um antibiótico
- um promotor de transcrição, a sequência principal e a sequência pre-pro do precursor do factor alfa, fundido em fase, a montante da sequência codificante da variante da hirudina
- a extremidade final de transcrição do gene PGK da levedura que será colocada a jusante do gene do referido variante, quer por um bloco funcional de ADN codificando para a referida variante da hirudina.
3-. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma variante da hirudina que compreende um ácido aminado diferente do ácido aminado da forma natural em posição 47 ou 63.
27.N0V.1987
58900
Ref: D 11054/333702
4*. - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o ácido aminado Tyr na posição 63 na forma natural ser substituído por um resíduo ácido Glu ou Asp
5-· - Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por se preparar uma variante da hirudina HV1, HV2, HV3.
6». - Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por o ácido aminado na posição 47 na forma natural ser substituído por Arg ou His.
7-. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5 caracterizado por o ácido aminado 47 da forma natural de HV2, Asn ser substituído por Lys.
8*. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por se preparar uma variante da hirudina de entre o grupo;
9?. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por se preparar uma variante da hirudina possuindo a sequência;
ILE THR TYR CYS GLU GLY GLY SER ASN PRO LYS PRO GLU GLU TYR
THR ASP CYS SER ASN VAL GLY LYS GLY GLU SER HIS
LEU GLN
THR GLU SER CYS GLY LYS ASN GLN CYS ASN ASN GLY
GLY GLN ASN
GLY ASN LYS
VAL THR GLY
ASP PHE GLU
LEU CYS LEU CYS ILE LEU GLU GLY THR GLU ILE PRO
-2058900
Refj D 11054/333702
10*. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por se preparar uma variante da hirudina sulfatada ou não.
Lisboa,
27.H0V.W7
FIG.1
SEQUÊNCIAS DE 3 VARIANTES NATURAIS DA HIRUDINA
3. segundo DODT e outros Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1986 367, 803-811 • pTG1828
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