JPS63152987A - ヒルジンの変異体、その使用及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジンの自然変異体の少くとも３種が、文献に開示さ
れている（マルクヴアルト（Ｍａｒｋｗａｒｄｔ）、１
９７０；ペターセン（Ｐ　ｅｔｅｒｓｅｎ　）等、１９
７６；マルクヴアルト及びヴアルスマン（Ｗａｌｓｍａ
ｎｎ　）　、１９７６　；チャン（Ｃｈａｎｇ）、１９
８３、ドツト（Ｄｏｄｔ）等、１９８４．１９８５．１
９８６；ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ　）等、１９８６；フ
ランス国特許第８４．０４，７５５号）。

これら３踵の変異体の配列の比較を第１図に示す。

第１の変異体ＨＶＩは、ヒルの体より単離されるヒルジ
ンに対応し；第２の変異体ＨＶ２　（ハーベイ等、１９
８６）は、ＨＶＩとは９個のアミノ酸が異なり；第３の
変異体（ドツト等、１９８６）は、３２位のセリンまで
ＨＶ２と同様であるが、Ｃ末端部分のアミノ酸１０個が
異なり、更に６３位に付加アミノ酸（Ａｌａ６３）を有
する。この第３の変異体をＨＶ３と称する。

これらの配列は、６５又は６６個のアミノ酸を有し、２
つのドメイン（ｄｏｍａｉｎ）とみなされる。

即ち、３つのＳ−８結合を含有する球状Ｎ末端部分及び
プロトロピン分子におけるトロンビンによる切断部位と
相同である酸性、Ｃ末端部分である。

この相同性は、位置４７位の周辺領域がヒルジンのトロ
ンビンへの結合部位であることを示唆する。

更に、天然ヒルジンは６３位に硫酸化されたチロシンを
有する（チャン、１９８３）。この硫酸化子ロジンは、
変異体ＨＶ３の６４位に再出現する。該硫酸化チロシン
を全変異体について“ポジション６３　（ｐｏｓｉｔｉ
ｏｎ　　６３）　’と称し、その機能は、その位置とは
無関係に同じである。

ヒルジンの自然変異体の配列の比較分析により、天然分
子の特性を種々の方法で組み入れた新しい変異体の創造
を理論的に期待できる。

ＨＶＩ及びＨＶ３は２つのプロリンの間に位置する４７
位にリジンを有し、おそらく、このことがトロンビンの
活性部位の遮断に関係する（ドツト等、１９８４．１９
８５）。

ＨＶ２は４７位に塩基性残基の代わりにアスパラギンを
有するので、Ｈｖ２がトロンビン抑制物質として期待さ
れる特性により良く適合するようにするため、リジン又
はアルギニンで（チャン、１９８５）、あるいは、ヒス
チジンで置換することが望ましい。ヒスチジンは、トロ
ンビンの良い基質ではないが、ヒルジンのトロンビン抑
制作用を増強する。

更に、チロシン６３の硫酸化は、ストーン（Ｓ　ｔｏｎ
ｅ）及びホフスティーウゲ（Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ　）
（１９８６）による動態試験に示されるように、天然ヒ
ルジンと活性に影響し得る遺伝子組換えにより得られた
ヒルジンとの相異をもたらす。チロシンをＧｌｕ又はＡ
ｓｐ等の酸性アミノ酸残基で置換することにより天然蛋
白に擬態させることができる。

本発明は、自然体の４７位又は６３位に存在するアミノ
酸と異なるアミノ酸を有するヒルジンの変異体に関する
。

咳体は、ヒルジンＨｖ１、ＨＶ２又はＨＶ３の変異体で
あることが好ましい。

本発明の変異体としては、下記のものが特に具体的に挙
げられるニ ーアミノ酸Ｔｒｙ６３が酸性残基、特にＧｌｕ又はＡｓ
ｐにより置換された変異体、 一自然体の４７位のアミノ酸をＡｒｇ又はＨｉｓで置換
された変異体、及び 一自然変異体ＨＶ２のＡｓｎ４７がＬｙｓにより置換さ
れた変異体。

好ましい変異体としては、（Ｌｙｓ４７）　ＨＶ２、（
Ａｒｇ４７）　ＨＶ２、（Ｈ１ｓ４７）　ＨＶ２、〔Ｇ
１ｕ６３〕ＨＶ２及び［Ａｓｐ６３）　ＨＶ２について
特に挙げられる。

上記の本発明の変異体、（Ｌ　ｙｓ４７）　Ｈ￥　２　
（又は“ｒ　ＨＶ　２−　Ｌ　ｙｓ４７″）は、下記の
配列に対応する。

ＩＬＥ　ＴＨＲＴＹＲＴＨＲＡＳＰ　ＣＹＳ　ＴＨＲＧ
ＬＵ　ＳＥＲＧＬＹ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＬＥＵＣＹＳ　
ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＧＬＹ　ＳＥＲＡＳＮ　ＶＡ
Ｌ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＡＳＮＬＹＳ　
ＣＹＳ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＳＥＲＡＳＮ　ＧＬ
Ｙ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＣＹＳＶＡＬ　
ＴＨＲＧ；ＬＹ　ＧＬＵ　ＧＬＹ　ＴＨＲＰＲＯＬＹＳ
　ＰＲＯにＬＵ　ＳＥＲＨＩＳ　ＡＳＮＡＳＮ　ＧＬＹ
　ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＩＬＥ　ＰＲＯＧ
ＬＵ　ＧＬＵ　ＴＹＲＬＥＵ　ＧＬＮＴｙｒ６３を保有
する種々の変異体を、硫酸化の形又は他の形で用いて良
い。この硫酸化は、化学的もしくは生物学的に行われる
。

本発明は、上記の変異体を生産する生物学的及び／又は
化学的方法を含む。

実際、これらの変異体は、合成的に、半合成的に及び／
又は既知の遺伝子操作法により得られる。

従って、例えば、ＨＶ１、ＨＶ２及びＨＶ３、特にＨＶ
２をコードする種々の配列のクローニング及び発現、並
びに対応するヒルジンの酵母培養物からの回収は、欧州
特許出ｆｉＥＰ−−Ａ　　２００．６５５に開示されて
いる。

本発明の変異体は、上記のコード化配列を例えば定方向
突然変異により変異させた後に同等の方法（ｅｑｕｉｖ
ａｌｅｎｔ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によっても得ら
れる。

特に、イン　ビトロでの定方向突然変異により、アスパ
ラギン４７がリジン、アルギニン又はヒスチジンで置換
され、チロシン６３がグルタミン酸で置換された変異体
が構築される。

特に、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−２００，６５５に記載の
機能的発現ブロックを用いることが可能であり、この場
合、ヒルジン配列は、上記の変異体をコードする。これ
らの機能的ＤＮＡブロックはベクタープラスミドにより
移入される。

種々の変異体に相当する遺伝子の酵母による発現及び分
泌を指示するため、該ブロックは、下記要素 一酵母の２μプラスミドの複製起点、 −ｕｒａ３遺伝子、 一大腸菌の複製起点及び抗生物質に対する耐性を示すマ
ーカー、 一転写プロモーター、“リーダー″配列、及びヒルジン
の変異体をコードする配列の上流で同位相にて融合され
るα因子の前駆体のプレプロ（ｐｒｅｐｒｏ）配列、及
び 一該ヒルジンの変異体をコードする遺伝子の下流に位置
する酵母のＰＧＫ遺伝子の転写ターミネータ− を好ましくは有する酵母のベクターに組込まる。

上述の要素は欧州特許出＠ＥＰ−Ａ−２００，６５５に
開示されている。

更に、本発明は、これらのベクターあるいはこの機能的
ＤＮＡブロックにより形質転換された酵母及びヒルジン
変異体の製造へのその適用に関する。

特に、本発明は、本発明の酵母を発酵させ、成熟体もし
くはイン　ビトロで成熟し得る前駆体の形で、培地上に
生産されたヒルジンを回収することによりヒルジン変異
体を製造する方法に関する。

用いられた手法については、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−２
００，６５５及びＥＰ−８７４０１６４９，６に更に詳
しく述べられている。

得られたヒルジンの変異体は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−
２００，６５５に開示されるように、イン　ビトロ及び
イン　ビボでトロンビン阻害剤として用いられ得る。

特に、これらの変異体は、単独又、は他の活性成分と併
用して医薬品製剤として、或いは、インビトロ又はイン
　ビボでの試験薬又は診断薬として用いられる。試験薬
や診断薬として用いる場合、放射性物質、蛍光性物質、
酵素性物質又は他の標識物で変異体を標識することが有
利である。

下記の実施例により、本発明を更に詳しく説明する。

実施例 実施例１ イン　ビトロにおける変異誘発による種々のＨＶ２変異
体の構築 イン　ビトロで定方向突然変異を誘発させるため、変異
されるべきＤＮＡフラグメントを、−末鎖のファージの
複製型にクローン化させる。組換えファージのゲノムを
単離し、変異された配列を有する合成オリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成させる。該オリゴヌクレオチドは
、相補鎖の合成の為のブライマーも兼ねる。かくして二
本鎖となったＤＮＡは、所望の変異を担うファージを生
産するレセプターバクテリアを形質転換させるのに用い
られる（シラー（Ｚｏｌｌｅｒ　）及びスミス（Ｓｍｉ
ｔｈ）　、１９８３）。

欧州特許ＥＰ−Ａ−１５８，５６４号に記載のプラスミ
ドｐＴＧ７２０は、大腸菌におけるヒルジンの発現用ベ
クターである。プラスミドｐＴ０７３０は、ヒルジンを
コードする配列の下流にＥｃｏＲＩサイトを加えること
により、ｐＴＧ７２０から構築される。ＥｃｏＲＩサイ
トは、一方ではＥｃｏＲＩで、他方ではＣ］ａＩで消化
することにより、ヒルジンをコードする配列の回収を可
能にする。

ＣｌａＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントは、５′末端コド
ンが数個欠失したヒルジンコード化領域の全域を含む。

該ＣＩａＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントは、ファージＭ
１３の誘導体のＡｃｃＩとＥｃｏＲＩサイトの間でクロ
ーン化された（キーニー（Ｋ　１ｅｎｙ）等、１９８３
）。このヒルジンコード化配列を有するＭ１３７０１３
１由来のファージは、Ｍ１３ＴＧ１９１９と称される。

３種のオリゴヌクレオチドが合成され、各オリゴヌクレ
オチドは、Ｍ１３７Ｇ１９１９の配列５°−ＧＴＡＣＡ
ＣＣＧＪＣＣＴＧＡＡＡＧ−３゜と、対合することがで
きる。但し、所望の変異に対応するオリゴヌクレオチド
の中心部の領域は除く。これらオリゴヌクレオチドの配
列は下記の通りである： ＴＧ４３５　５°＜ｒ′ｆｒＣＡＧＧＧＴＧＣＧＧＴＧ
ＴＡＣ−３’ＴＧ４３８　５°＜ｖｖｒＣＡＧＧＴＩＴ
ＣＧＧＴＧＴＡＣ−３″ＴＧ４３７　５°−ＣＴＩＴＣ
ＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣ−３゜これらのオリゴヌ
クレオチドは、Ｍ１３ＴＧ１９１９のＡＣＣ（Ａｓｎ）
コドンが各々ＣＡＣ（Ｈｉｓ）　、ＡＡＡ　（Ｌｙｓ）
又はＣＧＣ（Ａｒｇ）で置換され得るように、構築され
た。

各オリゴヌクレオチドの１２０ピコモルが、１００μＱ
の反応培地でリン酸化され、リン酸化オリゴヌクレオチ
ドの約２０ピコモルが、ハイブリダイゼーション緩衝液
の２５μＱ中でファージＭ１３ＴＧ　１９１９の１本鎖
ＤＮＡの１ピコモルとハイブリッド形成せしめられた。

ハイブリッド形成後、ＤＮＡの混合物は、クレノーポリ
メラーゼ及びファージＴ４リゼーゼで処理された。処理
された各混合物を用いて、大腸菌株７１／　１８　（ｍ
ｕｔ　Ｌ）を指示菌株ＪＭ１０３（メシング（Ｍ　ｅｓ
ｓ　ｉ　ｎｇ）等、１９８７）の叢（ｔａｐｉｓ　）上
で形質移入させた。感染させた細胞は、よりゆっくりと
成長するプラークを形成するので、同定可能である。従
って、完全培地上で、コロニーを継代培養し、次いで変
異されたファージを有する細胞のスクリーニングのため
に、小ワツトマン５４０ペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ　　
５４０ｐａｐｅｒ　）に該コロニーを移した。

このスクリーニングは、ブライマーとして上記で用いら
れたオリゴヌクレオチドを用いてインシラ（ｉｎ　　５
ｉｔｕ）でハイブリッド形成することにより実施される
。従って、所望の変異された配列を有する３種の新しい
ファージが得られた：Ｍ１３ＴＧ１９２１　（Ａｓｎ４
７−Ａｒｇ）、Ｍ１３ＴＩ：１９２４　（Ａｓｎ４７−
Ｈｉｓ）及び　　Ｍ１３ＴＧ１９２５　（Ａｓｎ４７−
Ｌｙｓ）。

更に、配列　　５°−ＡＴｒＧＴＡＡ江エロＭ）３゜を
有するオリゴヌクレオチドＴＧ４３４を用い、同様の実
験が行われた。該オリゴヌクレオチドは、ＨＶ２をコー
ドする配列の３′領域にある配列５°−ＣＡＧＡＡＧＡ
ＡＩＡＩＴＴ′ＡｃＡＡＴとハイブリッド形成し、ＴＡ
Ｔ　（Ｔｒｙ６３）コドンをＧＡＧ　（Ｇｌｕ）で置換
するように構築された不対合トリプレットを持つ。従っ
て、対応する変異されファージＭ　１３　Ｔ　Ｇ　１９
２２　（Ｔｒｙ６３−Ｇ　Ｉｕ）が得られた。

実施例２ 変異されたフラグメントによるｐＴＧ１８２８の０、　
６−ｋ　ｂ　　Ｐｓｔｌ−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントの
置換 プラスミドｐＴＧ１８２８　（欧州特許出願ＥＰ−８７
，４０１６４９，６で開示）は、ヒルジンをコードする
配列を有し、該配列の上流に酵母のα性フェロモンをコ
ードする遺伝子のプレプロ配列が位置する。その構築は
、ＰＧＫプロモーターの制御下にある。ＭＦＤ及びヒル
ジンのプレプロ配列の間におけるこの融合により、発現
された蛋白質は、分泌及び成熟という正常な酵母経路を
もたらすので、処理された活性ヒルジンが培地に出現す
る。

このプラスミドは、変異されたヒルジンの配列を発現さ
せるため、天然ヒルジンの替わりに再度用いられた。

ＰｓｔＩ及びＨｌｎｄＩＩＩによるｐＴＧ１８２８の消
化は、各々約３．８．１．９．１，５．１．１及び０．
６ｋｂの大きさである５種のフラグメントを遊離する。

０．６ｋｂのフラグメントは、プレプロヒルジン（ｐｒ
ｅｐｒｏｈｉｒｕｄｌｎ　）融合配列を有し、ＡｃｃＩ
サイト及びＥｃｏＲＩサイトを１つずつ含む。

これら２つのサイトにより結合された領域は、数個の５
′末端コドンを欠失した全ヒルジン配列を有する。０．
６−ｋｂＨｌｎｄ　ｍ−ＰｓｔＩフラグメントを、Ｅｃ
ｏＲＩをもＡｃｃＩサイトをも、持たないベクターのＨ
ｉｎｄｍサイトとＰｓｔＩザイトの間に挿入した。

従って、このようにして構築されたスミド（ｐＴＧ１９
６０）は、各々ヒルジン配列の始め及びヒルジン配列の
下流に位置する単一のＡｃｃＩサイト及び単一のＥｃｏ
ＲＩサイトを有する。Ａｃｃ！及びＥｃｏＲＩによるｐ
ＴＧ１９６０の消化により、実質的に完全なヒルジン配
列及び該プラスミドの残りの配列を有するフラグメント
が遊離する。

ヒルジン配列が欠失した大ＤＮＡフラグメントをゲル上
で精製し、実施例１に記載の変異された各ファー゛ジの
複製型をＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩで消化してできた生産物
と混合し、プレプロヒルジンを、定方向突然変異により
得た新しいＨＶ２変異体と共に再形成する。４種の新し
いプラスミドが選択された：　ｐ　ＴＧ　１９６３　（
Ａｓｎ４７−Ａｒｇ）　、Ｔ）　ＴＧ１９６４　（Ｔｙ
ｒ６３−Ｇｌｕ）　、ｐＴＧ１９６５（Ａ　５ｎ４７−
　Ｈｉｓ）及びｐ　ＴＧ　１９６６　（Ａｓｎ４７−”
Ｌ　ｙｓ）。これらのプラスミドは、変異されたコドン
においてのみ、ｐＴＧ１９６０と相異する。

変異されたコドンを有するこりらのプラスミドは、Ｐｓ
ｔＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントの形で回収され、当
初のＰｓｔＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントに代ってベ
クターｐＴＧ１８２８に再クローン化される。

従って、４種の新しいプラスミドが得られた：ｐＴＧ１
９７７　（Ａｓｎ４７−Ａｒｇ）　、ｐＴＧｌ　９７８
　（”ｒｙｒ６３−Ｇｌｕ）　、ｐＴＧ　１９７９　（
Ａｓｎ４７−Ｈｉｓ）及びｐ　Ｔ　Ｇ　１９８０　（Ａ
ｓｎ４７−Ｌｙｓ）　、これらのプラスミドは、イン　
ビトロで行われた変異という点のみ、上記のｐＴＧ１８
２８とは異なる。

実施例３ ｐＴＧ１９７７、ｐＴＧ１９７８、ｐＴＧ１９７９及び
ｐＴＧ１９８０のＤＮＡによるＴＧＹ１ｓｐ４の形質転
換 ニス、セレヴイシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
　ＴＧＹ１ｓｐ４　（Ｍａｔ　　ａ　　ｕｒａ３．２５
１．３７３゜３８２　　ｈｉｓ−３，１１，１５）細胞
をｐＴＧ１９７７、ｐＴＧ１９７８、ｐＴＧ１９７９及
びｐＴＧ１９８０のＤＮＡで形質転換した。ｕｒａ”形
質転換体が各々につき得られた。

４種の細胞株ＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧ１９７７、ＴＧＹ１
ｓｐ４ｐＴＧ１９７８、ＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧＹ１９７
９及びＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧ１９８０が得られる。これ
ら４種の細胞株及びＴ　Ｇ　Ｙ　１　ｓｐ４　ｐＴＧ１
８２８によるヒルジンの生産について比較した。

０Ｄ６６ｏ０．０２の培養液（ＹＮＢＧ＋０．５％カザ
ミノ酸）２０ｍＱに各細胞株を接種した。３０℃で４８
時間撹拌後、培養液を遠心分離にかけ（５０００ｒｐｍ
、５分）、上清を分析した。ＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧ８８
１　（ＨＶ２をコードする配列を有さないプラスミド）
の培養液を対照として用いた。

粗製上清液の活性を、トロンビン活性（合成基質（タロ
モツァイム（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ）　Ｔ　Ｈ，ベーリ
ンガーマンハイム社製）に対するタンパク質分解活性）
への阻害作用について、測定する。上清液の８世に対す
る阻害率（％）を第２図に示す。

Ａｒｇ　　及びＬｙｓ４７変異体による阻害作用は、自
然変異体ＨＶ２の阻害作用と少くとも同じである。

Ｇｌｕ　　及びＨｉｓ４７変異体は、ＨＶ２よりやや阻
害作用が劣る。

実施例４ トロンビン活性の阻害 本発明のヒルジン変異体の価値をより一層明らかにする
ために、特に医薬品製剤への適用のため、下記に４７位
のアミノ酸がＡｒｇ又はＬｙｓによって置換され、組換
えＤＮＡを用いて得られる変異体ＨＶ２及び他の２つの
ＨＶ２型変異変異体いて、そのトロンビン阻害作用を比
較例として示す。

これら変異体によるトロンビン阻害の動態を試験するた
め、ヒルジンがトロンビンの可逆的阻害物質であるので
、ジエイ、ダヴリュー、ウィリアムス（Ｊ　、、　Ｗ、
　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）及びジエイ、エフ。

モリソン（Ｊ、Ｆ、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　）の方法（エ
ンザイモロジ−（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　６３、ｐ
ｐ４３７−４６７．１９７９）に記されるように、高親
和性インヒビターの理論が用いられる。

用いられたヒルジン変異体は、９５％に精製され、シグ
マ社製の精製トロンビンは、活性部位の滴定測定で９２
％以上の活性を持つ。ヒトトロンビンの濃度は、全測定
について同値の５．５×１０１Ｍを用いる。培地は、ｐ
Ｈ７，９，３７°Ｃで、０．０５Ｍピペラジン−Ｎ、Ｎ
’　　−ビス（２−エタンスルホン酸）ナトリウム（ｓ
ｏｄｉｕｍ　　Ｐ　ｌＰＥ５）緩衝液、０．１８ＭＫＣ
Ｑ及び０．１％ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）
より成る。トロンビンの基質は、ベーリングー社製のク
ロモツアイム（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ）　Ｐ　Ｌである
。培養前の２分間がトロンビン及びヒルジンについて観
察され、基質との反応が開始する。

下記の表は、同量のヒトトロンビン５．５×１０１Ｍを
９５％阻害するために必要なヒルジンの量を実験的に測
定した値を示す。

９５％トロンビン活性阻害、ｆｌ（１０’″９Ｍ）ＨＶ
２Ｌｙｓ４７７、６ ＨＶ２Ａｒｇ４７８゜５ ＨＶ２　　　　　　　　　　　　　Ｂ２．　２上記表か
ら、ＨＶ２の約１／４倍量のＨＶ２Ａｒｇ　　及びＨＶ
２Ｌｙｓ４７が、同量のヒトトロンビンを阻害するのに
必要だと考えられ、る。

従って、これら変異体は顕著に改善されたトロンビン阻
害作用を持つ。

実施例５ 標準ヘパリンと比較した場合の、組換えヒルジンの２種
の変異体、ｒＨＶ２及びｒ　ＨＶ　２−　Ｌ　ｙｓ４７
の予備薬理試験 １　本試験の目的 組換えヒルジンの２種の変異体、ｒＨＶ２（又はＨＶ２
）及びｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７（又は（Ｌｙｓ４７）　Ｈ
Ｖ２）を評価スルタメ、Ｌｎ　ｌ　ヘパリンとそれらの
変異体の抗トロンビン作用を比較した。これら２つの変
異体は、Ｔｙｒ６３の転写浸硫酸化がない。

２　実験条件 ａ）生理食塩液中の２種の組換えヒルジンの抗トロンビ
ン比活性（ヒト及びウシトロンビン）を、クロモツァイ
ムに対するトロンビンの蛋白質分解活性に基づき測定す
る。

ｂ）　２種のヒルジンの抗凝血活性が、イン　ビトロに
おいて、ラット及びウサギ血漿を用い、トロンビン時間
延長、抗ＩＩａ作用に関し、発色的に比較される。

Ｃ）濃縮塊静注後の血漿からのヒルジンの消失動態を、
トロンビン時間を用いた抗ＩＩａ作用の測定により、及
び発色性基質を用いて検量線を描（ことにより、試験す
る。

ｄ）ウサギに３０分間連続静注後に得られる血漿中濃度
を同様の方法で測定する。

ｅ）ヒルジンの２種の変異体及び標準ヘパリンの抗トロ
ンビン活性を、ウニスラー （Ｗ　ｅｓＳｌ　ｅｒ）のウサギ及びラットのモデルに
おいて、凝血剤としてトロンボプラスチンを用いて試験
し、更にウサギのうっ血モデル（ファリード（Ｆａｒｅ
ｅｄ　）　）を用いて試験する。化合物は、ウサギは連
続注入により、ラットは濃縮塊静注により、投与される
。

用いられた動物モデルは下記の通りである：ウサギのウ
ニスラーモデル（Ｗｅｓｓｌｅｒ’ｓ　ｍｏｄｅｌ）本
試験では、２．５〜３ｋｇの雄性ニューシーラントウサ
ギを用いた。ベンドパルビタールＮａ塩（３０ｍｇ／ｋ
ｇ）の静脈内注射で麻酔後、左頚動脈にカニユーレを挿
入し、２本の頚静脈を引出し、各静脈上に２．５ｃｍ離
して２個のゆるい結紮を作った。次に、ウサギに、生理
食塩水もしくはヒルジン又はヘパリンの溶液を、２．　
５ｍＱ／時間で３０分間、連続注入により投与した。注
入終了の２分前に、抗凝血剤（ヒルジン、ヘパリン）の
血漿濃度を測定するために、動脈血試料を採取した。

注入終了１分前に、ヒトトロンボプラスチン（マンチェ
スター　コンパラティブ　リージエント社（Ｍａｎｃｈ
ｅｓｔｅｒ　　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅａｇｅ
ｎｔ、　Ｌｔｄ。

製）をエム、ブキャナン（Ｍ、　　Ｂｕｃｈａｎａｍ　
）の処理方法に準じて標準化し、６００μｇ／ｋｇの用
二を頚動脈を経由して大動脈に正確に３０秒間注入した
。３０秒後に注入を中止し、２個の静脈セグメント上の
結紮を１５分間締めることによって、うっ面状態をつく
った。次いで、頚動脈を開き、血栓を単離し、生理食塩
水で洗い、沖紙でプロツト（ｂｌｏｔ）後、重量測定し
た。

ラットのウニスラーモデル 約３００ｇの雄性（ＣＤ−ＣＯＢＳ） スブラーグーダウレー　ラット（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄ　
Ｈｗｌｅｙ　　ｒａｔ）を用いた。ベンドパルビタール
Ｎａ塩を腹腔的投与（３０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔し、
開腹術施行後、腎交叉点から１　ｃｍ上方での工大静脈
を露出させた。０．７ｃｍ離して、２個のゆるい血紮を
作った。

被検体を生理食塩水で希釈し、静脈うつ血ができる５分
４０秒前又は１分前（ヘパリン）に、１ｍＱ／ｋｇの濃
縮塊静注を行った。うつ血の４０秒前に凝血剤（ウサギ
トロンボプラスチン、イー、ディプ（Ｅ、　Ｄａｄｅ　
）　）を２５＋ｎｇ／ｍＱ／ｋｇで正確に３０秒間陰茎
静脈に注入した。注入終了１０秒後、２個の結紮を、最
初に近い結紮、次に遠い結紮を締結し、うっ血させた。

うっ血状態を１０秒間維・持させ、血栓を取り、０．３
８％のクエン酸溶液に浸し、通常の吸取紙で乾燥し、次
の日に５０℃で１時間乾燥した後重量を測定した。

うっ血によるウサギの血栓症モデル ２．５〜３ｋｇの雄性ニューシーラントウサギを用いた
。ベンドパルビタールＮａ塩で静注麻酔（３０ｍｇ／ｋ
ｇ）後、左頚動脈にカニユーレを挿入し、２本の頚静脈
を引出した。各静脈上に２．５ａｍ離した２個のゆるい
結紮を作った。次に、生理　。

食塩水もしくはヒルジン溶液又はヘパリン溶液を、２．
５ｍＱ／時間の速度で、ウサギに３０分間連続注入した
。注入終了２分前に、動脈血試料を採取し、抗凝血剤（
ヘパリン、ヒルジン）の血漿中濃度を測定した。注入を
中止すると同時に、４個の結紮を締め（まず近い方から
、次に遠い方）、うっ血を作った。うっ血状態を２時間
維持し、頚静脈を開き、血栓を単離し、生理食塩水で洗
い、濾紙でプロット後、重量測定した。

３　結果 ａ）ｌＩＩｇ／ｍＱ濃度の母液を調製するために、ヒル
ジンの２種の変異体の抗トロンビン比活性を、ヒト及び
ウシトロンビンについて下記の第１表に示した。

第　　１　　表 ｒＨＶ２　　　　　ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７ヒトトロンビ
ン　　　１４，８００　　　１９．０００ウシトロンビ
ン　　　１５，５００　　　１９．２００ヒルジン変異
体ｒＨＶ２の抗トロンビン比活性は、＋／−１５，０Ｏ
ＯＡＴＵ／ｍｇで、変異体ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７のそれ
は＋／−１９゜０００であった。これらの比活性は、予
期された値よりも大きい。比活性は、ヒト及びウシトロ
ンビンで同様である。

ｂ）ラット及びウサギの血漿における抗凝血活性を、ト
ロンビン時間について測定したところ、低濃度の２種の
ヒルジンについては等価である。変異体ｒＨＶ２−Ｌｙ
ｓ”は、高濃度においては、着るしく優れた活性を示す
。発色性基質により測定された、ラット及びウサギの血
漿中の残存トロンビンの量は、２種のヒルジン変異体を
６０　Ａ　Ｔ　Ｕ　／　ｍＱまで加えた後に比較し得る
。微量の残存トロンビンを更に中和させるためには、変
異体ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の方がより効果的であり、こ
のことはＫｉ値（阻害定数）の相異を反映する。

Ｃ）濃縮塊静注後の血漿からの２種のヒルジンの消失動
態は、発色性測定について同値であるが、トロンビン時
間については若干異なっている（第２表）。ヒルジンは
２つの指数関数に従い、消失する。第１相（分布）は約
３分のｔ１／２αで、この両ヒルジン変異体は、この第
１相で５分間に初期濃度の６０％が失われる。第２段階
（排泄）は、トロンビン時間で観察する場合、ｒ　ＨＶ
　２−　Ｌ　ｙｓ４７で１６分、ｒＨＶ２で２８分のｔ
１／２βであり、発色性基質で測定する場合、各々２８
分及び３０分である。標準ヘパリンは、単−指数関数相
（ｔ　１／２＝９分）に従って、消失する。

第２表：ウサギにヒルジン変異体を 濃縮塊静注後の半減期（分） ＴＴニトロンビン時間 Ｃ８：発色性基質 ｄ）ウサギに２種のヒルジン変異体を３０分間連続静注
した後得られた血漿中濃度は、用量と直線的な関係にあ
る。

ｅ）抗トロンビン作用 これらの予備薬理試験から、ウサギの連続注入に於て、
組換えヒルジン変異体ｒ　ＨＶ　２−　Ｌ　ｙｓ４７は
、ｒＨＶ２やヘパリンより優れた抗トロンビン活性を持
つと思われる。２種のヒルジン変異体の薬物動態は類似
している。

実施例６ ヒ、ルジン変異体ｒ　ＨＶ　２−　Ｌ　ｙ３４７及び標
準ヘパリンの抗トロンビン活性／出血危険比の比較試験
の結果、各動物種の血栓症モデルにおいて等価の活性を
示す用量を投与した場合、ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７を投与
されたウサギの出血危険及びラットの出血時間延長は、
標準ヘパリンを投与された動物のそれらより小さいこと
が明らかにされた。

本発明の菌株の寄託 下記の菌株がパスツール研究所のコレクシオンナシオナ
ル　ドウ　クルチュール　ドウ　ミクロオルガニスム（
（Ｃ１ｌｅｃｔｉｏｎ　　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　　ｄｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄａ　　Ｍｌｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｓ、別名：ナショナルコレクション　オブ　ミクロ
オーガニズムカルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ１１
ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ〜Ｉｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）　）　　（２８り二デュ　ドツ
トゥール　ルウ、パリ　１５）に１９８６年１１月６日
に寄託された： ＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧ１９７７　（ＨＶ２−Ａｒｇ４７
）寄託Ｎｏ、　Ｉ　−６２１ ＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧ１９８０　（ＨＶ２−Ｌｙｓ４７
）寄託Ｎｏ、　Ｉ　−６２２ 参照菌株は、１９８６年６月６日に寄託された：ＴＧＹ
１ｓｐ４ｐＴＧ１８２８ 寄託Ｎｏ、　Ｉ　−５６９ 参考資料 上記の説明において参照した文献−を、下記に列記する
。

・チャン、ジエイ、ワイ、　　（Ｃｈａｎｇ、　　Ｊ、
　Ｙ、　）・エフイービーニス　レターズ（Ｆ　Ｅ　Ｂ
　５Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１６４，３０７−３１３　（１
９８・チャン、ジエイ、ワイ、　　（Ｃｈａｎｇ、　　
Ｊ、　Ｙ、　）、ユアロピアン　ジャーナル　オブ　バ
イオケミストリー（Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｌｏｃｈｅ
ｍ、　）、１５１．・ドツト、ジエイ、　　（Ｄｏｄｔ
、Ｊ、　）　、ミューシー。

エイチ、ピー、　　（Ｍｕｅｌｌｅｒ、　　Ｈ４Ｆ、　
）　、ゼーミュラー、ニー、　　（Ｓｅｅｍｕｅｌｌｅ
ｒ、Ｕ、　）　、チャン、ジエイ、ワイ、　　（Ｃｈａ
ｎｇ、　　Ｊ、　Ｙ、　）、エフイービーニス　レター
ズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ）、１６５，１８０−１８
４　（１９８・ドツト、ジエイ、　　（Ｄｏｄｔ、Ｊ、
　）　、ゼーミューラー、ニー、　　（Ｓｅｅｍｕｅｌ
ｌｅｒ、Ｕ、　）　、？シュラー、アール、　　（Ｍａ
ｓｃｈｌｅｒ、Ｒｏ）　、フリッブ。

エイチ、　　（Ｆｒｉｔｚ、　　Ｈ，）　、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ、３６６Ｊ３７９
−３８５　（１９８・ドツト、ジェイ、　　（Ｄｏｄｔ
、Ｊ、　）　、マヒライト。

ダヴリュ−（Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ、　Ｗ、　）　、ゼー
ミューラー、　ユ、　　（Ｓｅｅｍｕｅｌｌｅｒ、Ｕ、
　）　、？シニラー、アール、　　（Ｍａｓｃｈｌｅｒ
、Ｒ，）　、フリッブ。

エイチ、　　（Ｆｒｉｔｚ、　　Ｈ，）　、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅａ＋。

Ｈｏｐｐｅ　−Ｓ　ｅｙｌｅｒ　、　３６７．８０３−
８１１・ハーヴエイ、アール、ピー、　　（Ｈａｒｖｅ
ｙ、Ｈ６Ｆ。

）、デクリゼ、イー、　　（Ｄｅｇｙｒｓｅ、　Ｅ、　
）　％ステファ二、エル、　　（Ｓｔｅｆａｎｉ、　　
Ｌ、　）　、ジャムバー、エフ、　　（Ｓｃｈａｍｂｅ
ｒ、Ｆ、　）　、カツツエナブ、ジエイ、ピー、　　（
Ｃａｚｅｎａｖｅ、Ｊ、　　Ｐ、　）、コートニー、エ
ム、　　（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ、Ｍ、　）　、）ルストシ
エフ、ピー、　　（Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ｐ、）　、
ルコツク、ジエイ、ピー、　　（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、　
　Ｐ、　）、プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナ
ルアカデミ−オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイティ
ド　ステイツ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳ、Ａ）　、８３．・キーニ
ー、エム、ピー、　　（Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、Ｐ、）、ラ
セ、アール（Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，）及びルコック。

ジエイ、ピー、　　（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、　　Ｐ、　）
　、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　、２６．９１−９９　（１
９８３）・クラジエヴスキ、ティ（Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ
、　Ｔ、　）、ブロムベック、ビー（Ｂｌｏｍｂａｅｃ
ｋ、　　Ｂ、）　、アクタ　ケミ力　スカンジナヴイカ
（Ａ　ｅｔａ　　　　　’Ｃｈｅｍｉｃａ　　５ｃａｎ
ｄｉｎａｖｉｃａ　）　、２２．１３３９◆マルクヴア
ルト、エフ、　　（Ｍａｒｋｗａｒｄｔ、　Ｆ、　）、
メソズ　イン　エンザイモロジ−（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ、　）　１９．９２４−９３２　（１９７０
）・メシング、ジエイ、　　（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　　Ｊ
、　）　、クレア、アール、　　（Ｃｒｅａ、Ｒ，）　
、ジーブルク、ピー、エイチ、　　（Ｓｅｅｂｕｒｇ、
　　Ｐ、Ｈｏ）　、ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ
（Ｎｕｃｌ、Ａｃ、Ｒｅｓ。

）、９．３０９　　（１９８１） ・ペターセン、ティ、イー、（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｔ、
　Ｅ。

）、ローベルツ、エイチ、アール（Ｒｏｂｅｒｔｓ。

Ｈ，Ｒ，）、ゾットラプーイエンセン、エル。

（Ｓｏｔｔｒｕｐ　−Ｊｅｎｓｅｎ、Ｌ、　）　、マグ
ニュソン。

ニス、　　（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　　Ｓ、　）　、Ｐ
ｒｏｔｉｄｅｓ。

Ｂｉｏｌ、、　Ｆｌｕｉｄｓ、Ｐｒｏｃ、Ｃｏ１１ｏｑ
、、　２３．１４・ストーン、ニス、アール、　　（Ｓ
ｔｏｎｅ、　　Ｓ、　　Ｒ，）、ホフステイーンゲ（Ｈ
ｏｆｓｔｅｅｎｇｅ　）　、ジャーナル　オブ　バイオ
ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、２５．４６２２−４６２８　
（１・シラー、エム、ジエイ、　　（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ
、　　Ｊ、　）、スミス、エム、エヌ、　　（Ｓｍｉｔ
ｈ、　Ｍ、Ｎ、　）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、　、１００Ｓｐｐ４６９゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、３種のヒルジン自然変異体、ＨＶ１、ＨＶ２
及びＨＶ３のアミノ酸配列を示す。 第２図は、ヒルジンもしくはＨＶ２又はその変異体を産
生ずる酵母培養上滑液の容量について、クロモツァイム
に対するトロンビンの蛋白質分解活性阻害率を示すグラ
フである。 （以　上） −ＯＪの −へり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］自然体の４７位又は６７位にあるアミノ酸と相異
   するアミノ酸を有するヒルジンの変異体。 ［２］自然体の６３位のアミノ酸Ｔｙｒが酸性アミノ酸
   残基Ｇｌｕ又はＡｓｐにより置換された特許請求の範囲
   第１項に記載のヒルジンの変異体。 ［３］ヒルジンＨＶ１、ＨＶ２又はＨＶ３の変異体であ
   る特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の変異体。 ［４］自然体の４７位のアミノ酸がＡｒｇ又はＨｉｓに
   より置換された特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
   れかに記載の変異体。 ［５］自然体ＨＶ２の４７位のアミノ酸であるＡｓｎが
   Ｌｙｓにより置換された特許請求の範囲第１項乃至第３
   項のいずれかに記載の変異体。 ［６］（Ｌｙｓ＾４＾７）ＨＶ２、（Ａｒｇ＾４＾７）
   ＨＶ２、（Ｈｉｓ＾４＾７）ＨＶ２、（Ｇｌｕ＾６＾３
   ）ＨＶ２及び（Ａｓｐ＾６＾３）ＨＶ２より選択される
   ヒルジンの変異体。 ［７］アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 に対応するヒルジンの変異体。 ［８］硫酸化されるかされていない特許請求の範囲第１
   項乃至第７項のいずれかに記載の変異体。 ［９］特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記
   載の変異体を含有するトロンビン阻害剤。 ［１０］特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに
   記載の変異体の少くとも１種を主成分として含有する抗
   凝血剤。 ［１１］特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに
   記載の変異体を主成分とする医薬品製剤。 ［１２］合成的、半合成的製法及び／又は遺伝子操作を
   用いた特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記
   載の変異体の製造方法。 ［１３］下記の要素 −酵母菌の２μプラスミドの複製起点、 −ｕｒａ３遺伝子、 −大腸菌の複製起点及び抗生物質に対する耐性を示すマ
   ーカー、 −転写プロモーター、“リーダー”配列、及びヒルジン
   の変異体をコードする配列の上流で同位相にて融合され
   るα因子の前駆体のプレプロ（ｐｒｅｐｒｏ）配列、及
   び −該変異体をコードする遺伝子の下流に位置する酵母の
   ＰＧＫ遺伝子の転写ターミネータを有するプラスミド又
   は該ヒルジンの変異体をコードする機能的ＤＮＡブロッ
   クにより前もって形質転換された酵母の醗酵工程を含む
   特許請求の範囲第１２項に記載の製造方法。