PT100299B - Analogo de hirudina, metodo para a sua producao e anti-coagulante contendo-o, e vector de secrecao , microorganismos transformados com o referido vector e metodo para a producao de produtos a partir dos referidos microorganismos - Google Patents

Description

CAMPO TÉCNICO

O presente invento está relacionado com um novo análogo da hirudina, sequência de DNA codificadora do análogo da hirudina, método para a produção do análogo da hirudina usando a referida sequência de DNA e anti-coagulante.

presente invento também está relacionado com vectores de secreção para a produção de proteína estranha, microorganismos transformados com o referido vector e método para a obtenção de hirudina ou seus análogos usando o referido microorganismo transformado.

novo análogo da hirudina descrito no presente invento é útil como anti-coagulante pela sua elevada actividade anti-trombina assim como uma baixa tendência para as hemorregias comparado com a hirudina conhecida HV1.

Ainda, o vector de secreção para a secreção da proteína estranha como seja o análogo da hirudina descrito no presente invento dá vantagem na produção industrial de proteína estranha como sejam os análogos da hirudina, pois permite uma produção com um rendimento elevado de proteína estranha extracelular quando se usa E. coli transformada com o referido vector.

TRABALHOS ANTERIORES

A hirudina é um factor anti-coagulante secretado pelas glândulas salivares da sanguessuga, (Hirudo medicinalis) e é uma mistura de peptídeos consistindo em 65 e 66 aminoãcidos. A estrutura da hirudina foi determinada por Dodt et al., [FEBS Lett. 165, 180 (1984)] como a variante 1 da hirudina (HV1). Uma outra variante da hirudina HV2 [Harvey et al., Proc. Natl. Acad.

outra

Sei. USA, 83, 1084(1986) diferentes em comparação com a hirudina HV1 e * ainda uma variante da hirudina HV3 [Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, 803 (1986)] tem dez sequências de aminoácidos diferentes em comparação com HV1, tendo a mesma sequência de HV2 até à Ser e

3 mais um aminoãcido (Ala ) na região C-terminal. A estrutura destas três variantes da hirudina está apresentada na Figura 1.

Estas variantes tipo natural compreendem 65 ou 66 aminoácidos e são perceptíveis dois domínios. Estes são regiões N-terminais estruturadas de forma esférica com três ligações dissulfureto e e uma região C-terminal acida mostrando homologia com a região de clivagem da trombina da molécula de protrombina ou com a região de clivagem do fibrinogénio.

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Os presentes inventores encontraram que Leu -Glu de HV1 foi substituído por Asp^^-Glu^^ em HV3 quando a sequência de aminoácidos C-terminal das variantes de hirudina tipo natural HV1 e HV3 são comparadas. Foi feito um pedido de patente (Japanese Laid Open Patent Publication 3-164184 (1991)) para a síntese do gene sintético de HV1 e HV3 e sua expressão em E. coli.

Estas variantes da hirudina HV1, HV2 e HV3, tendo actividade anti-trombótica, não são drogas adequadas para utilização clínica devido aos seus efeitos secundários graves como seja o prolongamento do tempo de.hemorregia.

Por outro lado, foram propostos vários sistemas para produzir hirudina por tecnologia de engenharia genética, no entanto, não foi ainda desenvolvido um método satisfatório. Particularmente sob o ponto de vista industrial seria desejável um sistema de produção extracelular pois a proteína produzida pode ser secretada para o espaço extracelular, havendo vantagens

não só na simplificação da separação e purificação do produto devido à sua presença na forma activa, mas também a protecção do produto relativamente à digestão por proteases bacterinas dentro da célula.

Foram propostos métodos usando Bacillus subtilis, leveduras ou E. coli como hospedeiros para a produção de hirudina pelo processo de secreção.

Métodos usando Bacillus subtilis como hospedeiros têm desvantagens pois os plasmídeos são geralmente instáveis nas bactérias resultando no desaparecimento frequente dos plasmídeos que torna díficil a produção estável ou os produtos no meio são provavelmente digeridos por proteases bacterianas endógenas secretadas. Os métodos propostos para a produção de hirudina (por exemplo Japanese Laid Open Patent Publication 2-35084 (1990)) não resolveram tais problemas e o rendimento da produção é apenas cerca de 100 mg/1.

Nos métodos que utilizam as leveduras como hospedeiros sabe-se que de um modo geral que os aminoácidos do extremo C dos produtos são hidrolizados com carboxipeptidase.

Na publicação anterior (N. Riehl-Bellon et al., Biochemistry 1989, 28, 2941-2949) , são gerados os produtos secundários tendo 1 ou 2 resíduos de aminoácidos removidos por hidrólise do extremo C de HV2.

Para resolver o problema, foi proposto um método que utiliza uma estirpe de levedura deficiente em carboxipeptidase (Japanese Laid Open Patent Publication 2-104279 (1990)) como hospedeiro, o que não levou a uma produtividade suficiente.

Para o método que utiliza E. coli como hospedeiro, foi descrito um método que usa a sequência sinal ^;da fosfatase alcalina (J. Dodt et al., FEBS Lett. 202, 373-377 (1986)). Se bem que este seja um sistema de secreção, o produto é secretado principalmente para o espaço periplasmático o que não é satisfatório pois requere a destruição da célula bacteriana por um processo de recuperação adicional como seja choque osmótico e o rendimento da produção é tão baixo como 4 mg/1.

DESCRIÇÃO DO INVENTO

Os presentes inventores produziram vários análogos da hirudina baseados na estrutura primária das hirudinas HV1, HV2 e HV3 referidas atrás para comparar as propriedades em modelos animais e encontraram que o análogo da hirudina (hirudina quimérica) , tendo a sequência de aminoácidos da hirudina HV1 na qual a sequência após o 532 aminoácido foi substituida pela sequência após o 53^e aminoácido de VH3, mostrando não só alta actividade anti-trombina como também abaixamento do efeito do prolongamento do tempo de hemorregia e completaram o presente invento.

Ainda, os presentes inventores estudaram activamente o método da produção extracelular de proteínas estranhas com alto rendimento usando E. coli como hospedeiro e completaram o presente invento encontrando que quando se usava uma origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC como origem de replicação do vector de secreção com a sequência de DNA para o peptídeo sinal e promotor, a proteína estranha era secretada por E. coli em grande quantidade.

Assim, o presente invento está relacionado com novos análogos da hirudina tendo alta actividade anti-trombina.

Também o presente invento está relacionado com sequência de DNA codificadora da sequência de amiriõãcidos do análogo da hirudina tendo a actividade anti-trombina elevada atrás referida e baixa tendência para hemorregias, microorganismos transformados por transformação de E. coli com vectores de expressão incluindo a referida sequência de DNA e método de produção de análogos da hirudina pela expressão de análogos da hirudina usando os microorganismos transformados atrás referidos e sua recuperação.

Também o presente invento está relacionado com droga anti-coagulante tendo o análogo da hirudina atrás referido como ingrediente activo.

O novo análogo da hirudina HV1C3 no presente invento tem a sequência de aminoácidos mostrada na estrutura primária que se segue.

Vai 1	Vai	Tir	Tre Asp 5	Cis	tre	Glu	Ser	Gli 10
Gin	Asn	Leu	Cis	Leu	Cis	G1U	Gli	Ser	Asn
				15					20
Vai	Cis	Gli	Gin	Gli	Asn	Lis	Cis	Ile	Leu
				25					30
Gli	Ser	Asp	Gli	G1U	Lis	Asn	Gin	Cis	Vai
				35					40
Tre	Gli	Glu	Gli	Tre	Pro	Lis	Pro	Gin	Ser
				45					50
His	Asn	Gin	Gli	Asp	Fen	Glu	Pro	Ile	Pro
				55					60
Glu	Asp	Ala	Tir	Asp	Glu

(Fórmula 1)

E por exemplo, sequência de aminoácidos

deste análogo pode ^: -ser' mostrada pela fórmula que se segue.

GTT	GTA	TAC	ACT	GAT	TGT	ACT	GAA	TCT	GGC	30
CAG	AAC	CTG	TGT	CTG	TGT	GAA	GGA	TCC	AAC	60
GTT	TGT	GGT	CAG	GGT	AAC	AAA	TGT	ATC	CTC	90
GGG	TCT	GAT	GGT	GAA	AAG	AAC	CAG	TGT	GTT	120
ACT	GGT	GAA	GGT	ACC	CCG	AAA	CCG	CAG	TCT	150
CAT	AAC	CAG	GGT	GAT	TTC	GAA	CCG	ATC	CCG	180
GAA	GAC	GCG	TAC	GAT	GAA

análogo da hirudina do presente invento apresentado na fórmula 1 pode ser sintetizado por síntese química ou pode ser produzido por métodos da engenharia genética.

Para a produção pelo método de engenharia genética, primeiro, como descrito no último exemplo, o plasmídeo pMTSHVl secretor da hirudina HV1 e pMKSHVl foram construídos e usados para transformar E. coli e produziu-se hirudina HV1 por secreção usando o microorganismo transformado. Este plasmídeo pMTSHVl compreende o promotor (Ptrp), a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal (sinal PhoA), sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos de hirudina HV1, origem de replicação (ori) e sequência de DNA incluindo o sinal de terminação da tradução (rrnBTlT2) como mostrado na Fig. 3. No presente invento,

para substituir a sequência a seguir ao aminoácido '53 2 da hirudina HV1 com a sequência de aminoãcidos a seguir ao 532 de HV3, o plasmídeo pMTSHVl secretor de HV1 foi clivado com enzima de restrição para remover a sequência de DNA codificadora da sequência de aminoãcidos a seguir ao 532 da hirudina HV1. Por outro lado a sequência a seguir ao 532 retirado usando de DNA codificadora da sequência de do plasmídeo de expressão de HV3 enzimas de restrição. 0 DNA tendo codificadora dos aminoãcidos a seguir ao 532 da sequêna seguir ao aminoácido 532 da hirudina HV3 aminoãcidos

PUCHV3 foi removida a sequência de DNA hirudina HV1 do plasmídeo pMTSHVl e o DNA codificador da cia de aminoãcidos derivado do plasmídeo pUCHV3 foram ligados com DNA-ligase para construir o plasmídeo pMTSHVlC3 contendo o DNA codificador da sequência de aminoãcidos do análogo da hirudina no presente invento.

Este plasmídeo pMTSHVlC3 compreende a sequência de DNA codificadora do promotor, peptídeo sinal e origem de replicação (ori), derivados do plasmídeo pMTSHVl, sequência de DNA codificadora da sequência de aminoãcidos 1 a 52 da hirudina HV1 e sinal de terminação da tradução e sequência de DNA codificadora da sequência de aminoãcidos a seguir ao 532 da hirudina HV3 derivada do plasmídeo pUCHV3, a qual está inserida entre a referida sequência de DNA codificadora dos aminoãcidos 1 a 52 da hirudina HV1 e o sinal de terminação da tradução.

análogo da hirudina no presente invento foi produzido na célula e no meio quando o plasmídeo pMTSHVlC3 foi introduzido em E. coli por transformação, seguido de cultura do microorganisffio transformado.

No presente invento, o análogo da hirudina foi separado pelo método conhecido geralmente conhecido e purificado por

métodos de purificação tais como cromatografia em coluna, HPLC de fase reversa. ' ' ' análogo da hirudina obtido apresentou maior actividade anti-trombina e menos tendência para causar hemorregias comparado com a hirudina HV1 no modelo animal. Ele pode ser formulado para dar uma droga anti-coagulante excelente ao ser preparado por métodos de formulação do conhecimento geral.

Por outras palavras, o análogo da hirudina no presente invento pode ser ainda preparado por quaisquer métodos normalmente conhecidos usando qualquer um de vários métodos conhecidos usando veículos comuns para utilização farmacêutica ou aditivos para formulação. As administrações podem ser feitas por via intravenosa, intracutânea, subcutânea ou intramuscular ou tópica não oral. Se bem que a quantidade correcta a ser administrada para cada um dos casos seja determinada considerando os sintomas, idade e sexo do doente, geralmente é de 0,1 mg a 100 mg para um adulto por dia e a quantidade total será administrada em uma ou mais vezes.

Ainda, como anteriormente descrito, o presente invento está relacionado com o vector de secreção para a produção de proteína estranha, particularmente com o vector de secreção para a produção de elevado rendimento da hirudina ou do seu análogo para o meio extracelular.

Também o presente invento está relacionado com ovector de secreção contendo a sequência de DNA codificadora da hirudina ou dos seus análogos, microorganismo (E. coli) transformado com o referido vector de secreção e método para a a produção de hirudina ou de seus análogos pela cultura do referido microorganismo transformado e recuperação do produto a partir do meio.

vector de secreção da proteína estranha’ no presente invento compreende a sequência de DNA da origem de replicação (ori) derivado do plasmídeo pUC, sequência de DNA do promotor tac ou do promotor trp, sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal e sequência de DNA codificadora da proteína estranha.

O fragmento de DNA contendo a origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC no presente invento pode ser preparado clivando os plasmídeos da família pUC que podem ser adquiridos comercialmente, por exemplo, pUC9, pUC18 ou pUC19, com enzimas de restrição de combinação adequada. Por exemplo, o fragmento de DNA de aproximadamente 1440 pares de bases, incluindo uma origem de replicação (ori) preparada por clivagem de pUC18 com as enzimas de restrição Pvul ou PvuII e PvuII pode ser usado como uma origem de replicação do plasmídeo pUC.

Um fragmento do promotor tac ou do promotor triptofano no presente invento tem sequências de nucleótidos mostradas na Figura 7 e 8 respectivamente e podem ser facilmente sintetizados por um sintetizador de DNA, etc. Portanto estes promotores podem ser sintetizados e ligados a fragmentos contendo a origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC18. Como alternativa, eles podem ser preparados de uma froma relativamente fácil pela ligação de fragmentos de DNA gerados pela clivagem de plasmídeos disponíveis comercialmente com enzimas de restrição. Por exemplo, o plasmídeo pMK2 pode ser preparado, usando DNA-ligase de T4, ligação de fragmentos de DNA incluindo a sequência de DNA do promotor tac obtido por clivagem do plasmídeo adquirido comercialmente pKK223-3 (Pharmacia) com as enzimas de restrição Pvul e NruI e o fragmento de DNA incluindo uma origem de replicação (ori) obtido por clivagem do plasmídeo comercial pUC18 com as enzimas de restrição Pvul e PvuII.

Por outro lado o plasmídeo pMTl pode ser obtido por remoção do fragmento incluindo a sequência de DNA do promotr tac por clivagem do plasmídeo atrás referido pMK2 com as enzimas de restrição EcoRI e Eco47III e depois inserção de um fragmento incluindo a sequência do promotor trp que foi sintetizada pelo sintetizador de DNA.

Para a sequência de DNA dos peptídeos sinal no presente invento, pode ser usada a sequência codificadora do preptídeo sinal de proteínas localizadas no periplasma de E. coli, por exemplo enzimas tais como fosfatase alcalina (pho A) e b-lactamase (bla) ou proteínas da membrana externa tais como OmpA,OmpB e OmpF. Estes fragmentos de DNA podem ser facilmente preparados usando um sintetizador de DNA.

Se bem que qualquer proteína possa ser a proteína estranha descrita no presente invento, a hirudina e suas variantes são particularmente adequadas. A sequência de aminoácidos destas proteínas está apresentada na Figura 1 como hirudinas HV1, HV2 HV3 e HV1C3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra a sequência de aminoácidos das hirudinas HV1, HV2, HV3, HV1C3.

Fig. 2 mostra a sequência de DNA do pqptídeo sinal phoA.

Fig. 3 mostra o esquema da construção do plasmídeo de secreção de HV1 pMTSHVl.

Fig. 4 mostra o esquema da construção do plasmídeo

pMKSHVl.

Fíg. 5 mostra o esquema da construção do plasmídeo de secreção de HV1C3 pMTSHVlC3.

Fig. 6 (A) mostra o perfil de HPLC de fase reversa em C4 da hirudina HV1, (B) mostra o perfil de HPLC em fase reversa C4 de hirudina HV1C3, respectivamente.

Fig. 7 mostra a sequência de DNA do promotor tac usado no presente invento.

Fig. 8 mostra a sequência de DNA do promotor trp usado no presente invento.

Fig. 9 mostra o esquema da construção do plasmídeo de secreção da hirudina HV3 pMTSHV3.

Fig. 10 mostra a sequência de DNA do peptídeo sinal PhoA para a secreção da hirudina HV3 usada no exemplo 5.

Fig. 11 mostra um perfil da hirudina HV3 purificada por HPLC em fase reversa C4.

REALIZAÇÃO PREFERIDA DO INVENTO

O processo de construção do plasmídeo pUCHVl, pMTl e pMK2 para construir pMTSHVl ou pMKSHVl como plasmídeo de secreção da hirudina HV1 usado no presente invento e do plasmídeo pUCHV3 para construir o plasmídeo pMTSHVlC3. está apresentado nos exemplos de referência que se seguem.

[EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1]

Preparacao do plasmídeo pUCHVl e do plasmídeo PUCHV3 ^g do plasmídeo adquirido comercialmente pUC18 foi digerido com 30 unidades de EcoRI e 30 unidades de HindIII a 37°C durante 2 horas. Em seguida o vector foi separado e extraído por electroforese em gel de agarose, removidas as proteínas por extração com fenol, precipitado com etanol frio e dissolvido em 50 μΐ de solução tampão TE (10 mM Tris-HCl. pH8,0, 1 mM EDTA). À quantidade desta solução que deverá conter 50 ng de DNA, adicionou-se 10 μΐ de uma solução (66 mM Tris-HCl.pH 7,5, 5 mM MgCl^, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP e 300 unidades de DNA-ligase de T4) contendo DNA de cadeia dupla de HV1 ou de HV3, seguido de reacção durante a noite a 16°C para gerar o plasmídeo pUCHVl ou pUCHV3 em que o gene HV1 ou o gene HV3 foi inserido respectivamente, entre os sítios EcoRI e HindIII do plasmídeo pUC18.

[EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2]

Preparação do plasmídeo pMK2 e do plasmídeo pMTl (a) Preparação do plasmídeo pMK2

Um fragmento contendo o promotor tac que foi obtido por clivagenm do plasmídeo comercial pKK223-3 (Pharmacia) com as enzimas de restrição PvuII e NruI, um fragmento contendo a origem de replicação (ori) obtida por clivagem do plasmídeo comercial pUC18 com as enzimas de restrição Pvul e pvuli e um fragmento contendo o gene de resistência à ampicilina foram ligados usando DNA-ligase de T4. O fragemento assim obtido foi introduzido em E. coli estirpe JM109, seguido de cultura, despiste por resistência

à ampiclina e obtido o vector tendo promotor tac' e origem de replicação (ori) do pUC18 e designado pMK2.

(b) Preparação do plasmídeo pMTl do plasmídeo pMK2 foram digeridos com 30 unidades de EcoRI e Eco47III, removido o fragmento contendo o promotor tac e depois recuperado o fragmento contendo a origem de replicação (ori) por electroforese em gel de agarose. Por outro lado, o fragmento de DNA contendo o promotor trp foi sintetizado num sintetizador de DNA. Este fragmento foi ligado ao fragmento atrás referido gerado por digestão de pMK2 com EcoRI e Eco47III, usando a DNA-ligase de T4 a 16°C durante a noite. Isto foi usado para transformar E. coli JM109 para preparar um vector tendo promotor trp e a origem de replicação (ori) do plasmídeo pMK2. A sequência de DNA deste plasmídeo foi confirmada pelo método de Sanger et al., e designado pMTl.

O presente invento está apresentado detalhadamente nos Exemplos que se seguem.

[EXEMPLO 1] (1) Construção do plasmídeo de secreção da hirudina HV1, pMTSHVl plasmídeo pMTSHVl foi construído de acordo com o método apresentado na Figura 3. Quatro oligonucleótidos indicados na Fig. 2 foram sintetizados para construir um fragmento de DNA correspondendo ao pepptídeo sinal da fosfatase alcalina (phoA) de 1 2

E. coli e ao fragmento de DNA codificador de Vai -Vai do ammoácido N-terminal da hirudina HV1. Após desprotecção, cada um dos nucleótidos foi purificado por electroforese em gel de 10% de poliacrilamida.

Após 500 pmoles de cada um dos dois oligonucleótidos (S2, S4) serem fosforilados, 20 pmoles dos 4 oligonucleótidos foram misturados, emparelhados e depois tratados a 16°C durante a noite em 20 πμΐ de solução contendo DNA-ligase de T4. Após remoção da proteína por extracção com fenol e clorofórmio e precipitação com etanol frio, obteve-se o fragmento de DNA de cadeia dupla pretendido. 1/10 da quantidade do fragmento assim obtido e 100 ng do plasmídeo pUCHVl (Japanese Laid Open Patent Publication 3-164184 (1991)) clivado com as enzimas de restrição EcoRI e Accl reagiram com DNA-ligase de T4 a 16°C durante a noite. 0 plasmídeo pSHVl, contendo o gene de fusão em que a sequência de DNA codificadora da hirudina HV1 está ligado imediatamente a seguir à sequência codificadora do peptídeo sinal phoA, foi obtido por transformação de E. coli estirpe JM109. A sequência de DNA deste plasmídeo pSHVl foi confirmada pelo métodp de Sanger et al.

gg de pSHVl foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI (30 unidades) e HindIII (30 unidades) e o fragmento de 276

17. -

pb do fragmento de genes fundidos foi purificàdo por electroforese em gel de agrose.

100 ng do fragmento de DNA assim obtido e 100 ng do fragmento de DNA preparado por digestão do vector de expressão em E. coli pMTl (Japanese Laid Open Patent Publication 3-76579 (1991)) com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII, seguido de purificação dos fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose, foram ligados usando DNA-ligase de T4 a 16°C durante a noite. A mistura de reacção resultante foi usada para transformar E. coli JM109 para se obter o plasmídeo de secreção da hirudina HV1 pMTSHVl, no qual o gene fundido codificador do peptídeo sinal phoA e da hirudina HV1 estão a seguir à região do promotor. A sequência de DNA de pMTSHVl foi confirmada pelo método de Sanger et al.

(2) Construção do plasmídeo de secreção da hirudina HV1, pMKSHVl plasmídeo pMKSHVl foi construído de acordo com o método apresentado na Figura 4.

O referido DNA fundido codificador do peptídeo sinal phoA e da hirudina HV1 e o fragmento de DNA obtido por digestão do plasmídeo de expressão em E. coli pMK2 (Japanese Laid Open Patent Publication 3-76579 (1991)) com a enzima de restrição EcoRI e HindIII foram ligados usando DNA-ligase de T4, usados para transformar E. coli JM109 e obtido o plasmídeo de secreção da hirudina HV1 pMKSHVl tendo o gene fundido inserido a jusante do promotor tac. A sequência de DNA do plasmídeo pMKSHVl foi confirmada pelo método de Sanger et al.

(3) Secreção da hirudina HV1 produzida por -pMTSHVl

E. coli JM109 transformada com o plasmídeo pMTSHVl e pMKSHVl, construída em (1) e (2) atrás, foram cultivadas em meio 2X YT (16 g/1 de bactotriptona, 10g/l de extracto bacto-levedura e 5 g/1 NaCl) contendo 106 μ/ml de ampicilina. Após cultura a 37°C durante 24 horas, colheu-se 1 ml de meio de cultura.

As células precipitadas de cada uma das amostras foram ressuspensas em 1 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) contendo 25% de sucrose e 1 mM EDTA, seguido de tratamento à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após colheita das células por centrifugação a 6000 xg durante 10 minutos, as células foram suspensas em 1 ml de água fria para libertar a substância para o espaço periplasmático da célula por choque osmótico. As células foram removidas da fracção periplasmática por centrigugação a 6000 xg durante 10 minutos. A quantidade de huridina secretada e acumulada no espaço periplasmático foi determinada medindo a sua actividade anti-trombina no sobrenadante. A actividade anti-trombina baseia-se na medição quantitativa da intensidade de cor gerada pela actividade hidrolítica da trombina no substrato sintético cromogénico cromozima TH (Tocilglicil-prolilarginina-4-nitroanilidacetato, Boheringer-Manheim) e actividade inibidora da hirudina contra trombina que reprimirá a geração de cor.

Esta reacção foi realizada como se segue. Em 1 ml do referido volume de reacção, 0,36 NIH U de trombina humana (Sigma) foi adicionado a tampão contendo 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 150 mM NaCl e 0,1% de polietilenoglicol-6000, seguido da adição de hirudina padrão ou de amostra desconhecida e sujeito a pré-incubação a 37°C durante 3 minutos.

Tanto o substrato como a cromozima·'TH foram adicionados para uma concentração final de 200 μΜ para medir a libertação de p-nitroanileto pelo aumento da absorvância a 405 nm da solução por minuto e calculada a actividade anti-trombina (ATU).

Como resultado, a estirpe que utiliza o plasmídeo pMTSHVl apresentou 450 ATU de actividade anti-trombina por ml do meio de cultura. Também, a estirpe que utiliza o plasmídeo pMKSHHl apresentou 360 ATU de actividade anti-trombina por ml de meio de cultura. Resultados de outros estudos sobre a produção de hirudina com várias estirpes de E. coli tais como JM101, JM103, JM109, TG1, HB101, JA221, IF03301, C600, RR1 e DH5 em que o plasmídeo pMTSHVl foi introduzido pelo método de transformação de Hanahan et al., está apresentado na Tabela 1.

Quando RR1 foi usado como hospedeiro, cerca de 2000ATU/ml de HV1 foi produzido extracelularmente.

Espécies bacterianas	A660nm	Actividade (ATU/ml)	Actividade de HV1 produzida (ATU/ml/A660nm)
JM101	4,12	256,4	62,2
JM103	4,12	306,7	74,4
JM109	3,06	450,5	147,2
TG1	5,77	185,2	32,1
HB101	3,76	99,0	26,3
JA221	5,72	413,2	72,2
IF03301	2,61	148,1	56,8
C600	4,02	526,3	130,9
RR1	7,23	2000,0	276,6
DH5	7,00	10,6	1/5

(4) Secreção da hirudina HV1 para o meio de cultura com E. coli JM109/pMTSHVl transformada

Quando E. coli estirpe JM109 foi transformada com o plasmídeo pMTSHVl (E. coli JM109/pMTSHVl)(FERM BP-3266) e cultura em 2 1 de meio de cultura 2xYT contendo 2% de glucose num fermentador de 5 1 com agitação e arejamento a 37°C durante 24 horas, cerca de 5300 ATU por ml de hirudina HV1 foi produzida para o meio extracelular.

(5) Purificação de hirudina HV1 a partir do meio de cultura

Após fermentação, colheu-se 1,5 1 de meio de cultura e centrifugou-se a 6000 xg durante 10 minutos para separa o

sobrenadante dos detritos celulares. Uma vez que a concentração de sal do sobrenadante foi de 1,3% quando se mediu com um medidor de sal, o sobrenadante foi diluído 4 vezes comtampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0) e filtrado através de um filtro de 3,2 μπι (Pole Co. Ltd). 0 filtrado foi aplicado numa coluna QAE-toyopearl (4,4 x 7cm) equilibrado com tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0). Após aplicação da amostra, a coluna foi equilibrada com tampão seguido da eluição por passos da hirudina HV1 com 0,2M NaCl. A solução eluida foi concentrada com membrana Diaflow (YM5) da Amicon, seguido de filtração em gel com Sephacryl S-100HR pré-equilibrada com tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0) para remoção do sal.

As fracções activas foram aplicadas na coluna de DEAE-toyopearl (4,4 x 40 cm) equilibrada com tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0), lavada e depois eluida com um gradiente linear criado entre 3 1 de tampão de equilíbrio r 3 1 de 0,3M NaCl em tampão de equilíbri. A purificação final foi realizada em coluna de HPLC em fase reversa C4 com Delta-prep 3000 que é um produto da Water. A hirudina HV1 purificada foi obtida por eluição da coluna por um gradiente linear de 15 a 30% (v/v) de acetonitrilo contendo' 0,065% (v/v) de trifluoro-acetato.

grau de purificação de cada passo está apresentado na

Tabela 2.

TABELA 2

Passo de	Proteína total	Actividade
purificação	,(mg)	total (ATU)
meio de cultura	13680	6030297
QAE-toyopearl	1324	6132812
S-100HR	872	6162156
DEAE-toyopearl	821	6080019
C4RP-HPLC	570	4675211

Actividade	recuperação
relativa
(ATU/mg)	(%)
441	100
4630	101,7
7066	102,2
7407	100,8
8202	77,5

A composição em aminoácidos da hirudina HV1 assim obtida apresentou valor consistente comparado com hirudina HV1 natural conforme apresentado na Tabela 3. A sequência de aminoácidos N-terminal de hirudina HV1 purificada começou com Val-Val-Tir como se mostra na Tabela 4, o que indica a ocorrência da clivagem correcta do peptídeo sinal phoA. A actividade anti-trombina foi de 8202ATU/mg.

TABELA 3 , . Γ . '
	HV1		HV1C3
Asx	9,00		9,95
Tre	3,86		3,84
Ser	3,70		3,67
Glx	13,78		12,65
Gli	8,89		8,86
Ala	0,00		1,06
Cis	5,40		5,40
vai	2,94		2,92
Met	0,00		0,00
Ile	1,89		1,86
Leu	4,04		3,01
Tir	2,06		2,06
Fen	1,00		1,00
His	1,13		1,11
Lis	3,02		3,02
Arg	0,00		0,00
Pro	3,05		4,09

TABELA 4

Número de ciclos	Aminoácido	Rendimento(pmol)
1	Vai	310
2	Vai	490
3	Tir	189
4	Tre	138
5	Asp	42
6	Cis	-
7	Tre	44
8	Glu	99
9	Ser	436
10	Gli	205
11	Gin	131
12	Asn	66
13	Leu	148
14	Cis	-
15	Leu	174

(6) Preparação do plasmídeo de secreção de hirudina quimérica HV1C3, PMTSHV1C3

Construiu-se o plasmídeo pMTSHVlC3 de acordo com o método descrito na Figura 5. Para substituir os resíduos de aminoácidos que se seguem ao aminoácido 53 da hirudina HV1 com a sequência de HV3, o plasmídeo de secreção de HV1 pMTSHVl (10 ^g) foi digerido com as enzimas de restrição Kpnl (30 unidades) e HuindIII (30 unidades) seguido de electroforese em gel de agarose para purificar o fragmento de DNA de 2,8 Kpb.

De forma semelhante, lC^g de plasmídeo>pUCHV3 (Japanese Laid Open Patent Publication 3-164184 (1991)) foi também digerido com Kpnl e HindIII e o fragmento de DNA de 80 pb codificador da sequência C-terminal do HV3 foi purificado.

100 ng de ambos os fragmentos de DNA reagiram com DNA-ligase de T4 a 16°C durante a noite e a mistura de reacção resultante foi usada para transformar E. coli JM109 para se obter o plasmídeo de secreção da hirudina quimérica HV1C3, pMTSHVlC3. A sequência de DNA do plasmídeo pMTSHVlC3 foi confirmada pelo método de Sanger et al.

(7) Produção por secreção da hirudina quimérica HV1C3 com o plasmídeo de secreção de hirudina HV1C3

E. coli RR1 (FERM BP-3130) transformada com o plasmídeo PMTSHV1C3 que foi construído em (6) atrás, foi cultivada em meio 2x YTcontendo 100 pg/ml de ampicilina. Após cultura a 37°C durante 24 horas, colheu-se 1 ml de meio de cultura e deu-se choque osmótico para medir a actividade anti-trombina da fracção periplasmática.

Como resultado detectou-se 3060 ATU de actividade anti-trombina por ml de meio de cultura.

(8) Secreção da hirudina quimérica HV1C3 para o meio de cultura com a estirpe transformada E. coli JM109ZpMTSHlC3

Quando E. coli JM109 (FERM BP-3104) transformada com o plasmídeo pMTSHVlC3 foi cultivada em 2 1 de meio de cultura 2x YT contendo 2% de glucose num fermentador de 5 1 com agitação e arejamento a 37°C durante 24 horas, detectou-se um total de

actividade de anti-trombina de 6050 ATU/ml, 350ATU/IÚ1 no periplasma e 5700 ATU/ml no meio de cultura.

(9) Purificação da hirudina quimérica HV1C3

A hirudina quimérica HV1C3 foi purificada a partir do meio de cultura obtido em (8) de acordo com o método referido em (5). Quando a sequência de aminoácidos da hirudina quimérica purificada HV1C3 foi determinada, a sequência de aminoácidos C-terminal foi confirmada como sendo diferente de HV1 como mostrado na Figura 1. A actividade específica foi de 11250 ATU/mg. O perfil de HPLC de HV1 e de HV1C3 purificadas está apresentado na Figura 6. A experiência foi realizada com coluna VYDAC C4 (0,46 x 25 cm) com um gradiente linear de acetonitrilo entre 15 e 30% com um fluxo de 1 ml/min durante 30 minutos.

[EXEMPLO 2]

Acção inibidora da hirudina contra morte induzida por trombina

Administrou-se intravenosamente a murganhos macho (20-25 g), sem anestesia, trombina (10 unidades NIH/10g) e aliou-se a actividade anti-trombina do composto testado por observação dos índices de desaparecimento de reflexos e morte. Todos os compostos testados foram dissolvidos em soro fisiológico e 0,05 ml/lOg foi administrado intravenosamente 5 minutos antes da injecçao de trombina. Os resultados estão apresentados na Tabela 5.

TABELA 5

Accão inibidora da hirudina contra morte induzida por trombina

Composto testado

Trombina + Soro

Quantidade de administração Pontuação* (10 ^g/10g de peso) fisiológico

(10 unidades NIH/10g peso)	1,7
Trombina + HV1	100	1,3
(10 unidades NIH/10g peso)	200	0,6
	500	0,4
Trombina + HV1C3	20	1,2
(10 unidades NIH/10g peso)	50	0,6
	100	0,4

*Pontuação pontuação 0: sem desaparecimento de reflexos (aparentemente normal) pontuação 1: desaparecimento de reflexos, mas não morte dentro de 20 minutos pontuação 2: morte dentro de 20 minutos

Como é claro a partir da tabela, nesta reacção de morte induzida pela trombina in vivo, a hirudina quimérica (HV1C3) no presente invento apresentou 4-5 vezes mais forte a reacção inibitória comparado com a hirudina HV1.

[EXEMPLO 3]

Accão do prolongamento do tempo de hemorregia

Injectaram-se amostras em murganhos macho (20-25g) na veia da cauda com anestesia por pentobarbital sódico (40 mg/Kg i.p.).Fez-se uma ferida atravessando com uma agulha de 21G (diâmetro externo 0,85 mm) a veia da cauda 5 minutos após a administração dos compostos a testar e mediu-de o tempo de de hemorregia da ferida. Colocou-se um papel de filtro na ferida com mudas de 15 em 15 segundos. 0 tempo de hemorregia foi definido como o tempo necessário para deixar de se observar mancha vermelha no papel de filtro. Os resultados estão apresentados na Tabela 6.

TABELA 6

Accão de prolongamento do tempo de hemorregia

Composto testado	Quantidade de administração (gg/10g peso)	Tempo de hemorregia (seg)
Soro fisiológico		148,5 ± 14,6
HV1	20	223,7 ± 15,6
	50	376,7 ± 20,2
	100	501,7 ± 47,1
HV1C3	50	264,0 ± 17,6
	100	291,0 ± 30,2
	200	369,0 ± 34,9

Em geral, o prolongamento do tempo de hemorregia é um dos efeitos secundários dos anticoagulantes. Aqui, a hirudina quimérica (HV1C3) no presente invento foi claramente confirmada como tendo menos tendência para as hemorregias do que a hirudina HV1.

[EXEMPLO 4]

Preparação tendo hirudina quimérica HV1C3'¹ como ingrediente

A hirudina quimérica HV1C3 purificada no Exemplo l-(9) foi liberta do sal por cromatografia em Sephadex G25 (produto da

Pharmacia), seguido de filtração através de um filtro 0,22 μιη em condições de esterilidade. A solução foi distribuída por ampolas e liofilizada. 0 pó liofilizado assim obtido da hirudina quimérica HV1C3 pode ser dissolvida em soro fisiológico e usado como droga injectável.

[EXEMPLO 5]

Produção da hirudina HV3 (1) Construção do plasmídeo de secreção de hirudina HV3 (i) Como se mostra na Figura 9, a origem de replicação (ori) obtida por digestão do plasmídeo pUCHV3 preparado no exemplo de referência 1 com a enzima de restrição EcoRI e Accl, o fragmento de vector incluindo o gene de resistência à ampicilina e o gene sintético codificador da sequência sinal da fosfatase alcalina (phoA) cuja sequência de DNA se mostra na Figura 10 foram ligados usando DNA ligase de T4. Como resultado, obteve-se o plasmídeo pSHV3, no qual a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal do gene da fosfatase alcalina (phoA) foi ligada a montante da sequência de DNA codificadora de HV3. 0 plasmídeo foi introduzido em E. coli JM109, esta cultivada e feito o despiste da resistência à ampicilina.

(ii) Em seguida o plasmídeo pSHV3 foi clivado com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII para se obter um fragmento de gene de 275 pb tendo a sequência codificadora do peptídeo sinal do gene da fosfatase alcalina (phoA) ligado a montante da sequência de DNA codificadora de HV3.

(iii) Por outro lado, o plasmídeo pMTl foi preparado pelo método descrito no exemplo de referência 2. Este plasmídeo

compreende a sequência de DNA incluindo a origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC18 e o promotor trp como descrito no exemplo referência 2. 0 fragmento vector foi obtido por clivagem do plasmídeo pMTl com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII.

(iv) 0 fragmento de 275 pb atrás referido e o fragmento vector foi ligado por DNA-ligase de T4, introduzido em E. coli JM109, cultivado e feito o despiste por resistência à ampicilina, para se obter o plasmídeo pMTSHV3, o vector de expressão de HV3 de 2,87 Kb que compreende a sequência de DNA incluindo a origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC, a sequência de DNA do promotor trp, a sequência codificadora do peptídeo sinal do gene da fosfatase alcalina (phoA) e a sequência de DNA codificadora de HV3.

(2) Produção por secreção da hirudina HV3 com o plasmídeo de secreção de HV3

E. coli RR1 (E. coli RRl/pMTSHV3) (FERMBP-3267) transformada com o plasmídeo pMTSHV3 que foi construído pelo método atrás referido, foi cultivado em 2 1 de meio de cultura 2x YT contendo 100 gg/ml de ampicilina e 2% de glucose. A cultura decorreu em 2 1 de meio de cultura num fermentador de 5 1 a 37°C durante 24 horas. Como resultado, detectou-se 6073 ATU de actividade anti-trombina por ml de meio de cultura.

(3) Purificação de hirudina HV3 a partir do meio de cultura

A hirudina HV3 foi obtida a partir do meio de cultura pelo método descrito no Exemplo l-(5). Ou seja, após o meio de cultura ter sido centrifugado para separar o sobrenadante das células, o sobrenadante foi diluido 4 vezes com tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0) e filtrado. O filtrado obtido foi

aplicado na coluna (4,4 x 13 cm) de QAE-toyopearl como descrito no exemplo (5) seguido de filtração em gel com uma coluna de Sephacryl S-100HR.

A fracção activa foi alicada na coluna de DEAE toyopearl (4,4 x 40 cm) equilibrada com tampão de equílibrio e depois eluida com um gradiente linear de 0 a 0,3 M NaCl em tampão de equílibrio. Finalmente a hirudina HV3 foi purificada por HPLC de fase reversa em C4 usando uma coluna Vydac C4 (4,7 x 30 cm) eluida com um gradiente linear (1%/ min, 30 minutos ou mais) de acetonitrilo de 15% a 30% (v/v). O perfil está apresentado na Figura 11.

O grau de purificação de cada passo está apresentado na

Tabela 7.

TABELA 7
Passo de	Proteína total	Aetividade
purificação	(mg)	total (ATU)
meio de cultura	15600	11034400
QAE-toyopearl	2111	9227264
S-100HR	1453	9268963
DEAE-toyopearl	1327	8597892
C4-HPLC	795	6486480

Aetividade relativa (ATU/mg)	Recuperação (%)
707	100
4371	83,6
6381	84,0
6478	77,9
8139	58,8

Quando a composição em aminoácidos e a sequência de aminoácidos N-terminal do produto purificado foram analisadas, a composição em aminoácidos apresentou um valor consistente comparado com o vaklor teórico da hirudina HV3 como se mostra na Tabela 8. Como se mostra na Tabela 9, até 152 da sequência de aminoácidos N-terminal era idêntica à da hirudina HV3. Estes

resultados mostram o processamento correcto do peptídeo sinal e o produto foi confirmado como sendo hirudina HV3.

TABELA 8

	HV3	Teórico
Asx	9,76	10
Tre	4,74	5
Ser	3,68	4
Glx	11,55	11
Gli	8,77	9
Ala	1,07	1
cis	5,22	6
vai	2,03	2
Met	0,00	0
Ile	2,97	3
Leu	3,08	3
Tir	2,04	2
Fen	1,00	1
His	1,22	1
Lis	4,03	4
Arg	0,00	0
Pro	4,06	4
Total		66

TABELA 9

Número de ciclos	Aminoácido	Rendimento (pmoles)
1	Ile	469
2	Tre	108
3	Tir	106
4	Tre	102
5	Asp	122
6	Cis	-
7 '	Tre	100 .
8	Glu	76
9	Ser	32
10	G1 i	172
11	Gin	145
12	Asn	93
13	Leu	211
14	Cis	-
15	Leu	189

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

O presente invento proporciona um novo análogo da hirudina. 0 análogo da hirudina no presente invento é útil como anti-coagulante tendo forte actividade anti-trombina e menor tendência para hemorregia.

Também, o presente invento proporciona vectores de secreção para secretar proteína estranha incluindo o análogo de hirudina atrás referido, microorganismos transformados e método de produção de proteína estranha usando os referidos

microorganismos transformados. Usando o método descrito no presente invento, proteínas estranhas são produzidas para o espaço extracelular com elevado rendimento, o que é industrialmente vantajoso para se obter proteínas estranhas.

REFERÊNCIA DO MICROORGANISMO (1) E. coli JM109/pMTSHVlC3 (A entrada E. coli JM109/pMTPHOHVlC3 foi emendada)

Organismo do Depósito:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry

Endereço:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japão

Data do Depósito:

de Setembro, 1990

Número do Depósito:

FERM BP-3104 (2) E. CO1ÍRR1/PMTSHV1C3

Organismo do Depósito:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology,

Ministry of International Trade and Industry

Endereço:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japão

Data do Depósito:

de Outubro, 1990

Número do Depósito:

FERM BP-3130 (3) E. coli JM109/pMTSHVl

Organismo do Depósito:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry

Endereço:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken,. Japão

Data do Depósito:

de Fevereiro, 1991

Número do Depósito:

FERM BP-3266 (4) E. coliRRl/OMTSHV3

Organismo do Depósito:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry

Endereço:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japão

Data do Depósito:

de Fevereiro, 1991

Número do Depósito:

FERM BP-3267

Lisboa, 26 de Março de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3,« 1200 LISBOA

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES ia. - Análogo da hirudina HV1C3, caracterizado por ter a sequência de aminoácidos apresentada a seguir:

   Vai Vai Tir Tre Asp cis tre Glu Ser Gli 1 5 10 Gin Asn Leu Cis Leu Cis Glu Gli Ser Asn 15 20 Vai Cis Gli Gin Gli Asn Lis Cis Ile Leu 25 30 Gli Ser Asp Gli Glu Lis Asn Gin Cis Vai 35 40 Tre Gli Glu Gli Tre Pro Lis Pro Gin Ser 45 50 His Asn Gin Gli Asp Fen Glu Pro Ile Pro 55 60 Glu Asp Ala Tir Asp Glu

   (Fórmula 1)
2. 2a. - Sequência de DNA, caracterizada por ser codificadora da sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula 1.
3. 3a. - Microorganismo transformado, caracterizado por ser obtido por transformação de E. coli com vector de expressão incluindo sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos mostrada na Fórmula 1.

   43. - Método para a produção do- análogo da hirudina HV1C3 descrito na Fórmula 1, caracterizado por compreender a cultura do microorganismo transformado descrito na reivindicação 3, a expressão do análogo da hirudina mostrado na Fórmula 1 e a sua recuperação.

   53. - Vector de secreção para a produção de proteína estranha, caracterizado por ter uma sequência de DNA incluindo a origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC, promotor tac ou trp, sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal e sequência de DNA codificadora da proteína estranha.

   63. - Vector de secreção de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal derivar da fosfatase alcalina.

   73. - Vector de secreção de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado por a sequência de DNA incluindo a origem de replicação (ori) do plasmídeo pUC ser obtida por digestão do plasmídeo pUC18 com as enzimas de restrição Pvul e PvuII.

   83. - Vector de secreção de acordo com as reivindicações 5 a 7, caracterizado por a proteína estranha ser hirudina HV1.

   93. - Vector de secreção de acordo com as reivindicações 5 a 7, caracterizado por a proteína estranha ser hirudina HV3.

   103. - Vector de secreção de acordo com as reivindicações 5 a 7, caracterizado por a proteína estranha ser o análogo da hirudina HV1C3 tendo a sequência de aminoácidos da Fórmula 1.

   χ.

   lia. _ Microorganismos, caracterizadças por E. coli ter sido transformada com o vector de secreção descrito nas reivindicações 5 a 10.

   12^. - Método para a produção de hirudina HV1, HV3 ou análogo da hirudina HV1C3 mostrado na Fórmula 1, caracterizado por compreender a cultura do microorganismo transformado descrito na reivindicação 11 e a recuperação do produto a partir do meio de cultura.

   13s. - Droga anti-coagulante, caracterizada por ter o análogo da hirudina HV1C3 mostrado na Fórmula 1 como ingrediente activo.