JPH06228000A

JPH06228000A - 気道閉塞改善剤

Info

Publication number: JPH06228000A
Application number: JP5012652A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Mihashi; 弘明三橋; Hironishi Inoue; 洋西井上
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1993-01-28
Filing date: 1993-01-28
Publication date: 1994-08-16

Abstract

(57)【要約】【目的】慢性閉塞性肺疾患等の気道閉塞症の改善剤を
提供する。【構成】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有
するポリペプチド（（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰ
Ｉ）もしくはそのアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド、又はそれらと生物学的に同等のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを含有する気道閉塞症の改善剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は気道閉塞改善剤に関す
る。さらに詳細には、本発明はヒト多形核白血球エラス
ターゼ阻害蛋白（Secretary Leukocyte Protease Inhib
itor、以下「ＳＬＰＩ」という）類を有効成分として含
有する気道閉塞症の改善剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】炎症性
肺疾患には、例えば急性ないし慢性の気管支炎、肺炎、
肺気腫；びまん性汎細気管支炎；喘息等のそれぞれ独立
した概念で定義されるいくつかの疾患が含まれている。
これら炎症性肺疾患の臨床症状は、息切れ、ぜい鳴、
咳、喀痰、呼吸困難感、胸痛などであり、多くは進行性
であって、急性増悪を繰り返しながら、経年的に悪化し
てゆくという共通点がある。このような共通点がある背
景には、個々の疾患の発生原因は異なるものの、それら
の病態には気道の攣縮、気道粘膜の浮腫、気道粘液過分
泌などの気道閉塞症という共通の現象が関わっているこ
とがある。そして事実、従来から炎症性肺疾患の治療に
は、疾患の種類にかかわらず、対処療法的に気管支拡張
薬、去痰薬やステロイドが用いられている。

【０００３】気道閉塞症のうちでも、例えば慢性気管支
炎；肺気腫；びまん性汎細気管支炎；喘息等の慢性閉塞
性肺疾患においては、その原因は未だ明らかにされてい
ないが、気道過敏性の亢進によって様々な物理的、化学
的、薬理的な刺激が気道の反応を極めて敏感にし、更に
気道閉塞症を増強していることが知られている。

【０００４】また炎症性肺疾患では気道への好中球や好
酸球などの炎症性細胞の浸潤が認められている。特に、
慢性呼吸器疾患や喘息患者の喀痰、気管支肺胞洗浄液中
には時として多数の好中球や好酸球などの炎症性細胞が
認められ、これらの疾患の増悪との密接な関係を有して
いると考えられる。

【０００５】現在までその因果関係は明らかにはされて
いないが、事実、実験的には好中球や好酸球が気道過敏
性を引き起こすことが報告されている（Romain et al.;
Am.Rev. Respir. Dis., 1990, 141 (540-545): Frew,
A.J. et al.; Am. Rev. Respir. Dis., 1990, 141 (407
-413)) 。したがって、白血球の惹起する気道過敏性を
抑制する薬物は気道閉塞症を改善する薬剤としておおい
に期待される。

【０００６】一方、ＳＬＰＩは人間の唾液、気道粘液や
精液中に存在し、すでに構造決定されている（R.C. Tho
mpson ら、Nucl. Acid Res. 14, 7883-7896, 1986 ；特
表昭６２―５０１２６２号公報）。

【０００７】このＳＬＰＩには、アミノ酸残基１０７か
ら構成される（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰ ⁷）ＳＬＰＩ、前半
のドメイン（Ｓｅｒ¹―Ｐｒｏ⁵⁴）を除去した後半ドメ
イン（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷）から構成される（Ａｓｎ
⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ等が知られており、（Ｓｅｒ
¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩは白血球エラスターゼ、カテ
プシンＧなどのキモトリプシン様酵素に対する阻害活性
と同時に生理的に重要なトリプシン様酵素、例えばトリ
プシンに対する阻害活性をあわせ有していること（特表
昭６２―５０１２６２号公報）（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌ
ａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩは前記ＳＬＰＩのエラスターゼ阻害活
性を維持しながらＳＬＰＩのトリプシン様酵素阻害活性
を実質的に有さないことがすでに確認されている（ＷＯ
８９／０６２３９号明細書）。

【０００８】しかし、ＳＬＰＩやその部分ポリペプチド
が白血球によって惹起される気道閉塞や気道過敏性の亢
進を抑制するかについてはこれまで全く知られていなか
った。

【０００９】なお、ＳＬＰＩに関しては、肥満細胞から
の脱顆粒及び／又は肥満細胞のメディエーターに親和性
を有するセリンプロテアーゼ阻害剤を有効成分とする肥
満細胞関連疾患の予防・治療方法が公開され（ＷＯ９２
／６７０６号明細書）、かかるセリンプロテアーゼ阻害
剤としてＳＬＰＩも例示されている。しかしながら、本
願発明は気道閉塞症の改善剤であるのに対して、ＷＯ９
２／６７０６号明細書に記載された発明は肥満細胞から
の脱顆粒等に基づく炎症の予防・治療剤であって、その
用途が作用機構の上からも明確に区別される。しかもＷ
Ｏ９２／６７０６号明細書には、本願発明の気道閉塞症
の改善剤については、何の記載も示唆もされていない。

【００１０】また、ＨＵＳＩ―Ｉ型インヒビターの生物
学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
前期タンパク質を製造する生物工学的方法及びタンパク
質を含む製剤組成物が公開されており（特開昭６２―２
５９５９１号公報）、かかるインヒビターの用途として
慢性炎症性疾患の例示がなされている。しかしながら、
その具体的な実施例及びその作用機構の提示もないばか
りか、抗炎症剤としての記載のみであり、本願発明の気
道閉塞症の改善剤については何の記載も示唆もされてい
ない。

【００１１】しかるに本発明者らは、例えば配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド等の
ＳＬＰＩ類が気道閉塞症に有効であること、なかでも好
中球が惹起する呼吸器疾患、とりわけ白血球から放出さ
れたエラスターゼによって惹起された気道閉塞症に極め
て有効であることを知見し、本発明に到達したものであ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は有効成分
として配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドもしくはそのアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチド、又はそれらと生物学的に同等のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを含有する気道閉塞症の改善剤で
ある。

【００１３】本発明の有効成分は、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその
アミノ酸配列を含有するポリペプチド、又はそれらと生
物学的に同等のアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。

【００１４】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を
有するポリペプチドとは、前記（Ｓｅｒ¹―Ａｌ
ａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの前半部分である（Ｓｅｒ¹―Ａｒｇ
⁵⁸）を除いた配列番号：１で表わされる４９個のアミノ
酸からなるポリペプチド（以下、「（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩ」という）をいう。

【００１５】かかる（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ
は、例えば本願出願人が既に出願した特願平３―３５５
５５３号明細書（平成３年（１９９１年）１２月２４日
出願；発明の名称「ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を
有する天然型ポリペプチドおよびそれを含有する医薬製
剤」）の例えば実施例１〜３に記載されているように、
蛋白分解酵素処理、例えば正常人唾液又はヒト喀痰由来
多形核白血球エラスターゼ等によるＳＬＰＩ（気道分泌
液、唾液鼻汁、精液、子宮粘液に存在する天然のＳＬＰ
Ｉ又は遺伝子工学的手法によって得られたＳＬＰＩ）又
は（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの分解物から単離
・精製して得られる分子量約５，５００の分解物とし
て、あるいは自動ペプチド合成機（アプライドバイオ
システムズ社製、４３１Ａ）により合成して、次いで逆
相クロマトグラフィーを用いて得られる精製物を（Ａｒ
ｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩスルホ化誘導体へ変換して
リホールディング（特願平２―１４１５２３号参照）
し、天然型分子内ジスルフィド結合を有するものとして
得ることができる。

【００１６】あるいは（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰ
Ｉは、同様に本願出願人が既に出願した特願平４―２１
２３９８号明細書（平成４年（１９９２年）７月１７日
出願；発明の名称「ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を
有する天然型ポリペプチドの製造方法」）の例えば第５
頁〜第１４頁、特に実施例１〜４に記載されているよう
に、単独あるいは融合蛋白、例えばヒト成長ホルモン断
片ポリペプチド等の担体蛋白をコーディングするＤＮＡ
配列、例えばトロンビン切断配列等の目的蛋白を変性し
ない条件下で化学的又は生物学的（酵素的）方法により
切断可能なアミノ酸配列を有する架橋ポリペプチドをコ
ーディングするＤＮＡ配列、及び配列番号：１で表わさ
れる（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩのアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコーディングするＤＮＡ配列が
この順序で連結された遺伝子を、遺伝子発現に必要なプ
ロモーター、停止コドン等を含む発現型プラスミドに組
み込んで得られた“担体蛋白―架橋ポリペプチド―（Ａ
ｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ”融合蛋白（以下、「融
合蛋白」という）発現型プラスミドで大腸菌等の微生物
細胞を組み換え、この組み換え微生物細胞を培養・遺伝
子発現し、培養物から目的蛋白を単離・精製、必要に応
じてヒドロキシルアミン、トロンビンで担体蛋白の切断
除去、ジスルフィド結合のリホールディングを実施する
ことにより、遺伝子工学的に得ることができる。

【００１７】なお、具体的にそのような組み換え微生物
細胞として既にプラスミドｐＧＨ―Ｔ５９を含有する大
腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５９）及びプラスミ
ドｐＧＨ―Ｅ５９を含有する大腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ
／ＧＨ―Ｅ５９）が得られており、各々、微工研条寄３
９６３号（ＦＥＲＭＢＰ―３８６３）、同３８６１号
（ＦＥＲＭＢＰ―３８６１）が工業技術院微生物工業
研究所に１９９２年５月２０日付で国際寄託されてい
る。

【００１８】本発明の有効成分である配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドとは、少
なくとも前記（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの４９
個からなるアミノ酸配列を有し、そのＡｒｇ⁵⁹側（Ｎ端
側）及び／又はＡｌａ¹⁰⁷側（Ｃ端側）に配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一か、又はその他の１又
はそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドをい
う。

【００１９】そのようなポリペプチドとしては具体的
に、例えば（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ、及び
（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの前半部分である
（Ｓｅｒ¹―Ｔｈｒ⁵⁷）が除去された５０個のアミノ酸
からなるポリペプチド（以下、「（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩ」という）；前記の（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩ；及び（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰ
Ｉ等、本発明の目的とする気道閉塞症の改善剤と同等の
効果を有するＳＬＰＩ類を挙げることができる。

【００２０】かかるＳＬＰＩ類のうち、（Ａｒｇ⁵⁸―Ａ
ｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩは、例えば本願出願人が既に出願し
た特願平４―２１２３９９号明細書（平成４年（１９９
２年）７月１７日出願、発明の名称「ヒト好中球エラス
ターゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチドおよびそれ
を含有する医薬製剤」の第７頁〜第１８頁、実施例１〜
８に記載されているような、上記（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩの製法と同様に、正常人唾液等の酵素的
方法によるＳＬＰＩ又は（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬ
ＰＩ分解物中から分子量約５，５００の分解物として、
自動ペプチド合成機により合成して、あるいは（Ａｒｇ
⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）のアミノ酸配列の代わりに（Ａｒｇ⁵⁸
―Ａｌａ¹⁰⁷）のアミノ酸配列をコーディングするＤＮ
Ａ配列を用いること以外は原則として（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌ
ａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの遺伝子工学的製法と同様にして得る
ことができる。

【００２１】なお、そのような遺伝子工学的製法に用い
ることのできる組み換え微生物細胞として既にプラスミ
ドｐＧＨ―Ｔ５８を含有する大腸菌ＨＢ１０１株（ＨＢ
／ＧＨ―Ｔ５８）は、微工研条寄３８６２号（ＦＥＲＭ
ＢＰ―３８６２）として、工業技術院微生物工業研究
所に１９９２年５月２０日付で国際寄託されている。

【００２２】また、以上のＳＬＰＩ類あるいはその製造
に用いるＳＬＰＩ（（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰ
Ｉ）、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩは、特表昭６
２―５０１２６２号明細書、ＷＯ８９／０６２３９号明
細書に記載の方法によって得ることができる。

【００２３】さらに本発明の有効成分は、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしく
はそのアミノ酸配列を含有するポリペプチドと生物学的
に同等のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。か
かる生物学的に同等のアミノ酸配列とは、本願発明の目
的とする気道閉塞症の改善剤としての効果においてどう
当のものであるという意であり、具体的には前述のポリ
ペプチドのアミノ酸配列のうちの１又はそれ以上のアミ
ノ酸が欠損、追加、置換したものをいう。

【００２４】本発明の有効成分としては、これらのＳＬ
ＰＩ類の１種又はそれ以上を組み合わせて用いることが
できるが、そのうちエラスターゼ阻害活性及びカテプシ
ンＧ阻害活性を示し、実質的にトリプシン阻害活性を示
さないＳＬＰＩ類が好ましい。

【００２５】ここで、「実質的にトリプリン阻害活性を
示さず」とは、本発明の目的とするエラスターゼ阻害活
性、カテプシンＧ阻害活性によるヒト疾患治療薬として
用いる場合に妨げとなるようなトリプシン阻害活性に起
因する生理的作用をほとんど生じない、という意味であ
り、例えば本発明の実施例の測定方法で天然ＳＬＰＩの
トリプシン阻害活性と比較した場合にそのトリプシン阻
害活性が約１／１０以下であり、また本発明の蛋白のト
リプシン阻害活性がそのエラスターゼ阻害活性の約１／
１００以下であることをいう。

【００２６】このようなＳＬＰＩ類としては具体的に、
（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ、（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ、（Ａｓｎ⁵⁵―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ
が好ましく、なかでも、例えば（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌ
ａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ、（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ
等の天然型ＳＬＰＩ類は、正常人唾液中の酵素によって
特異的に（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩが限定分解
を受けた結果生じることが確認された（特願平４―２１
２３９８号、特願平４―２１２３９９号）ポリペプチド
が、ヒトに対する抗原性がないか又は実質的に低減化さ
れているという性質を有するので好ましく、そのうち
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩが好ましい。

【００２７】これらのうちでも、遺伝子工学的手法によ
って得られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰ ⁷）ＳＬＰＩが好ま
しいものとして挙げられる。

【００２８】本発明の気道閉塞症とは、前記のように、
例えば気道の攣縮、気道粘膜に浮腫、気道粘液過分泌な
どの病態をいい、より具体的には、白血球が喀痰及び／
又は気管支肺胞洗浄液中に正常人に比べ前記病態が発現
する程度の数倍〜数十倍に増加する呼吸器疾患、例えば
慢性・急性の気管支炎、肺炎、びまん性汎細気管支炎；
肺気腫；喘息；気管支拡張症；ＡＲＤＳ（Adult Respir
atory Distress Syndrome ：成人呼吸促迫症候群）；慢
性副鼻腔炎などの疾患で白血球由来のプロテアーゼ、例
えばエラスターゼやカテプシンＧで惹起された気道閉塞
症、ないしは気道過敏性が亢進している疾患、例えば慢
性気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、びまん性汎細気管
支炎、喘息、ＡＲＤＳ、サルコイドーシス、アレルギー
性鼻炎、アレルギー疾患（アトピー性：皮膚や眼疾患も
含む）、急性気管支炎（ウイルス感染）、マイコプラズ
マ肺炎、百日咳、過敏性肺臓炎、塵肺、珪肺、ＡＣＥ
（アンギオテンシンコンバーティングエンザイム）阻害
剤の飲用時に伴う気道閉塞症をいう。なかでも、急性又
は慢性閉塞性肺疾患、特に慢性閉塞性肺疾患、例えば慢
性気管支炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、及び喘息
に伴う気道閉塞症が好ましいものとして挙げられる。

【００２９】本発明の気道閉塞症の改善剤は経口的に、
あるいは静脈内、皮下、筋肉内、経皮、吸入、直腸内等
の非経口的に投与することができる。

【００３０】経口投与の剤型としては、例えば錠剤、丸
剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、カプセル剤などが挙げられ
る。

【００３１】錠剤の形態にするには、例えば乳糖、デン
プン、結晶セルロースなどの賦形剤；カルボキシメチル
セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン
などの結合剤；アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリ
ウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどの崩壊剤等を用いて
通常の方法により成形することができる。

【００３２】丸剤、散剤、顆粒剤も同様に上記の賦形剤
等を用いて通常の方法によって成形することができる。

【００３３】液剤、懸濁剤は、例えばトリカプリリン、
トリアセチンなどのグリセリンエステル類、エタノール
等のアルコール類などを用いて通常の方法によって成形
することができる。カプセル剤は顆粒剤、散剤又は液剤
などをゼラチンなどのカプセルに充填することによって
成形することができる。

【００３４】皮下、筋肉内、静脈内投与の剤型として
は、水性又は非水性溶液剤などの形態にある注射剤が知
られている。水性溶液剤としては生理食塩水などが用い
られる。非水溶性溶液剤は、例えばプロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、オリーブ油、オレイン酸
エチルなどが用いられ、これらに必要に応じて防腐剤、
安定剤などが添加される。注射剤はバクテリア保留フィ
ルターを通す濾過、殺菌剤の配合等の処理を適宜行うこ
とによって無菌化される。

【００３５】吸入投与の剤型としては、経鼻又は経気道
的に投与可能な製剤、例えば液剤、エアロゾル剤、粉剤
等従来公知の製剤を挙げることができる。液剤として
は、前記注射剤と同様の水溶性液剤、非水溶性液剤を、
またエアロゾル剤としては、例えばフレオン等の噴霧助
剤を有するエアロゾル剤を、粉剤としては、前記錠剤に
例示した乳糖、血症セルロース、デンプンなどの賦形剤
を有する粉剤等、鼻粘膜、気道粘膜への刺激性が少ない
ものを例示できる。これらには必要に応じて吸収促進
剤、防腐剤、安定剤などが添加される。

【００３６】経皮投与の剤型としては、例えば軟膏剤、
クリーム剤などが挙げられ、軟膏剤はヒマシ油、オリー
ブ油などの脂肪油；ワセリン等を用いて、クリーム剤は
脂肪油；ジエチレングリコール、ソルビタンモノ脂肪酸
エステルなどの乳化剤等を用いて通常の方法によって成
形することができる。

【００３７】直腸投与のためには、ゼラチンソフトカプ
セルなどの通常の坐剤が用いられる。

【００３８】本発明の有効成分であるポリペプチドの投
与量は、投与経路、患者の年令、性別、疾患の程度によ
って異なるが、通常１〜１０００mg／回程度であり、投
与回数は通常１〜３回／日であり、このような条件を満
足するように製剤を調整するのが好ましい。

【００３９】本発明の気道閉塞症の改善剤は既存の薬剤
と併用することも可能である。

【００４０】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明をこれらの実施例に限定するものでな
いことはいうまでもない。

【００４１】

【参考例１】（１）ヒト成長ホルモン断片ポリペプチドと（Ａｒｇ58
―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩポリペプチドの融合蛋白発現プ
ラスミドの構築とその形質転換体の調製（１）架橋ペプチドがトロンビン切断配列を有する発現
プラスミド（Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹―Ｐｈｅ¹³⁹）ヒト成長ホルモン発
現プラスミドｐＧＨ―Ｌ９（M. Ikeharaら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 81, 5956, 1984）を制限酵素Ｂｇ
ｌIIとＳａｌＩ（宝酒造）で切断し、アガロース電気泳
動で分離、ゲルより約４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をGENE
CLEAN II ＫＩＴ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて回収し
た。

【００４２】また、ＳＬＰＩサブクローンｐＵＣ―Ｄ６
（ＷＯ８９／０６２３９）を制限酵素ＭｌｕＩとＸｈｏ
Ｉ（宝酒造）で切断し、アガロース電気泳動で分離、ゲ
ルより約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＭＥＲｍａｉｄ
^TMｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて回収した。

【００４３】一方、トロンビン切断配列遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメント（，図１）を全自動合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ社モデル３９２）にて合成
した。合成ＤＮＡフラグメントはＭＥＧＡＬＡＢＥＬ^TM
（宝酒造）を用いて１ｍＭＡＴＰ存在下で５′末端をリ
ン酸化した後、合成ＤＮＡフラグメントとアニーリン
グを行い、２本鎖ＤＮＡを得た。アニーリング反応は、
９０℃で５分間加熱後室温になるまで放置した。

【００４４】融合蛋白発現プラスミドの構築はまず最初
にｐＧＨ―Ｌ９ＢｇｌII―ＳａｌＩ約４．７ｋｂｐ
ＤＮＡ断片とスロンビン切断部位を含む２本鎖合成ＤＮ
Ａをモル比１：１０の割合でligation kit（宝酒造）を
用いてligation反応を行った後、ウルトラフリーＣ３Ｈ
ＫＵＦフィルター付き（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にて濃
縮した。さらにｐＵＣ―Ｄ６ＭｌｕＩ―ＸｈｏＩ約
０．１５ｋｂｐＤＮＡ断片とligation反応を行った後
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１コンピテントセル（宝酒造）
に導入し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で一晩培養
し、目的の融合蛋白発現プラスミドを含む形質転換体
（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５９）を得た。形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを抽出、ＱＩＡＧＥＮ（ＢＩＯ１０１社製）
で精製し、ヒト成長ホルモン断片と（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩ断片ポリペプチドの融合蛋白発現プラス
ミドｐＧＨ―Ｔ５９を取得した（図２）。ＤＮＡ塩基配
列はプラスミドＤＮＡを鋳型にして、Dye Terminator k
it（日立）を用いて、日立製蛍光式自動ＤＮＡシーケン
サーＳＱ３０００を用いて直接確認した。

【００４５】（２）架橋ペプチドがエンテロキナーゼ切
断配列を有する発現プラスミドｐＧＨ―Ｔ５９（図２）を鋳型ＤＮＡとし、合成ＤＮＡ
，フラグメント（図３）をプライマーとしてポリメ
ラーゼ連鎖反応；ＰＣＲ法（Saiki ら、Science, 239,
487-491, 1985 ）にて増幅、その増幅物を再び合成ＤＮ
Ａフラグメント，（図３）をプライマーとしてＰＣ
Ｒ法にて増幅した後、ＢｇｌII（宝酒造）にて切断し、
約１１５ｂｐのフラグメントを得た。

【００４６】なお、ＰＣＲ法の条件は、９３℃、５分間
変性した後、１サイクルを９３℃，１．５分間、５７
℃，２分間、７２℃，２分間として３０サイクル行い、
最後に７２℃，７分間にて反応を止めた。

【００４７】一方、ｐＧＨ―Ｔ５９をＢｇｌII（宝酒
造）にて切断後、アガロースゲル電気泳動により、約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を分離、GENECL
EAN II（ＢＩＯ１０１社製）を用いて回収した。この約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を宝酒造のプロ
トコールにそってBacterial Alkaline Phosphatase（宝
酒造）を用い、５′末端の脱リン酸化反応を行った。

【００４８】脱リン酸化した約４．６ｋｂｐのＢｇｌII
―ＢｇｌII断片と、ＰＣＲ法にて増幅した約１１５ｂｐ
のＢｇｌII―ＢｇｌII断片をligation kit（宝酒造）を
用いてligation反応を行った後、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１コンピテントセル（宝酒造）に導入し、アンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、目的の融合蛋白発現プ
ラスミドを含む形質転換体（ＨＢ／ＧＨ―Ｅ５９）を得
た。

【００４９】形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、ＱＩＡＧＥＮ（ＢＩＯ１０１社製）にて精製し、ヒ
ト成長ホルモン断片ポリペプチドとエンテロキナーゼ断
片配列遺伝子をもつ（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ
ポリペプチドの融合蛋白発現プラスミドｐＧＨ―Ｅ５９
を取得した（図４）。

【００５０】塩基配列は、プラスミドＤＮＡを鋳型にし
て、Dye Terminator kit（日立）を用いて日立製蛍光式
自動ＤＮＡシーケンサーＳＱ３０００にて直接確認し
た。

【００５１】（３）（Ｍｅｔ^-1Ｐｈｅ¹―Ｐｈｅ¹³⁹）
ヒト成長ホルモン断片ポリペプチドとエンテロキナーゼ
切断配列遺伝子をもつ（Ａｒｇ⁵⁹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰ
Ｉポリペプチドの融合蛋白発現プラスミドｐＧＨ―Ｅ５
９を鋳型ＤＮＡとし、合成ＤＮＡフラグメント，
（図５）をプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応：Ｐ
ＣＲ法（Saiki, R.K. Gelfand, D.H. Stoffel, S., Sch
are, S.J., Higuchi, R., Hoen, G.T., Mullis, K.B. &
Erlich, H.A.; Science, ２３９，４８７―４９１，１
９８５）にて増幅、その増幅物を再び合成ＤＮＡフラグ
メント，（図５）をプライマーとしてＰＣＲ法にて
増幅した後、ＢｇｌII（宝酒造）にて切断し、約１２０
ｂｐのフラグメントを得た。

【００５２】なお、ＰＣＲ法の条件は、９３℃５分後変
性した後、１サイクルを９３℃１．５分間、５７℃２分
間、７２℃２分間として３０サイクル行い、最後に７２
℃７分間にて反応を止めた。

【００５３】一方、ｐＧＨ―Ｅ５９をＢｇｌII（宝酒
造）にて切断後、アガロースゲル電気泳動により、約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を分離、GENE C
LEAN II（ＢＩＯ１０１社製）を用い回収した。この約
４．６ｋｂｐのＢｇｌII―ＢｇｌII断片を宝酒造のプロ
トコールにそってBacterial Alkaline Phosphatase（宝
酒造）を用い、５′末端の脱リン酸化反応を行った。

【００５４】脱リン酸化した約４．６ｋｂｐのＢｇｌII
―ＢｇｌII断片と、ＰＣＲ法にて増幅した約１１５ｂｐ
のＢｇｌII―ＢｇｌII断片をligation kit（宝酒造）を
用いてligation反応を行った後、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１コンピテントセル（宝酒造）に導入し、アンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地上で培養し、目的の融合蛋白発現プ
ラスミドを含む形質転換体（ＨＢ／ＧＨ―Ｔ５８）を得
た。形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出、ＱＩＡＧ
ＥＮ（ＢＩＯ１０１社製）にて精製し、ヒト成長ホルモ
ン断片ポリペプチドとスロンビン切断配列遺伝子をもつ
（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩポリペプチドの融合
蛋白発現プラスミドｐＧＨ―Ｔ５８を取得した（図
６）。

【００５５】塩基配列は、プラスミドＤＮＡを鋳型にし
て、合成ＤＮＡをプライマーとし、Dye Terminetor kit
（日立）を用いて、日立製蛍光式自動ＤＮＡシーケンサ
ーＳＱ３０００にて直接確認した。

【００５６】（４）融合蛋白遺伝子の発現（３）で得られた融合蛋白遺伝子発現プラスミドｐＧＨ
―Ｔ５８を含有する大腸菌ＨＢ１０１株を、０．２５％
グルコース、３mg／mlイースト抽出物（ＤＩＦＣＯ社
製）２０mg／mlのカザミノ酸（ＤＩＦＣＯ社製）を含む
改変型Ｍ９培地（１％（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄―０．３％
Ｋ₂ＳＯ₄―０．３％ＮａＣｌ）をオートクレーブ滅菌
した後に、ＭｇＳＯ₄およびＣａＣｌ₂を最終濃度が１
ｍＭとなるように無菌的に加えた培養液５００mlに接種
し、一晩培養した。

【００５７】この一晩培養液を、前記と同様の培養液１
０リットルに対し、ＯＤ６６０が０．２となるように加
え、３７℃でジャー・ファーメンター培養を行った。Ｏ
Ｄ６６０が２０となった時に、３―β―インドールアク
リル酸を最終濃度が１５０μｇ／mlとなるように培養液
中に添加し、さらに３７℃で４時間培養を続けた。その
後、遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、０．５Ｍト
リス・バッファー（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【００５８】洗浄後の菌体を、リゾチーム（菌体湿重量
の１／２００）およびＥＤＴＡ・３Ｎａ（菌体湿重量の
１／２０）を含む０．５Ｍトリス・バッファーに懸濁さ
せ、超音波発生装置（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、CELL DISRU
PTOR 900）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離し、目
的とする融合蛋白を沈殿部分に封入体（inclusion bod
y）として得た。

【００５９】（５）融合蛋白のシステイン残基のスルホ
化とスルホ化融合蛋白のトロンビンによる切断反応（４）で得られた融合蛋白２５ｇを０．５Ｍトリス・バ
ッファー（ｐＨ８．０）２００mlに懸濁させた後、尿素
２４０ｇを加え可溶化させ、次いで終濃度が０．７Ｍと
なるように亜硫酸ナトリウム（和光純薬）を加えて４５
℃で２０分間反応させた。さらに終濃度０．１Ｍとなる
ように４―チオン酸ナトリウム（シグマ社）を加えて、
４５℃で２０分間反応させた。１０ｍＭトリス・バッフ
ァー（ｐＨ８．０）を加え、反応溶液を１リットルとし
た後、この容量が２００mlになるまで限外濾過（富士フ
ィルター；ＦＩＬＴＲＯＮ）を行う操作を５回繰り返し
た。このようにして、得られたスルホ化融合蛋白溶液
（限外濾過膜を通過しなかった部分）に対し、３０００
Ｕのウシスロンビン（持田製薬）を加え、３７℃で３時
間反応させた。次いで、限外濾過により、３００Ｋフィ
ルターを通過した溶液に含まれる（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩスルホ化誘導体を、逆相ＨＰＬＣ（ＶＹ
ＤＡＣ社；Protein Ｃ４）で精製し、凍結乾燥した。得
られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩスルホ化誘導
体のＮ末端アミノ酸配列を、プロテイン・シーケンサー
（Applied Biosystems４７７Ａ）により決定した。

【００６０】（６）（Ａｒｇ58―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ
スルホ化誘導体の活性分子へのRefolding （ジスルフィ
ド化反応）（５）で得られた（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩス
ルホ化誘導体１ｇを５リットルのRefolding 緩衝液
（０．０５ＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．３
ｍＭ酸化型グルタチオン、１．５ｍＭ還元型グルタチオ
ン）に溶解させ、４℃で２日間反応させ、次いで反応液
をS-Sepharose （ファルマシア製）イオン交換クロマト
グラフィーに付し、その溶出パターンを図７に示す。
０．３ＭＮａＣｌで溶出する目的の画分を、逆相ＨＰ
ＬＣ（ＶＹＤＡＣ，Protein Ｃ４）でさらに精製した
後、凍結乾燥し、活性型（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬ
ＰＩを得た。

【００６１】かくして得られた活性型（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌ
ａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩは、ヒトエラスターゼ、トリプシン、
キモトリプシン、ブタエラスターゼ、カテプシンＧに対
する阻害活性（ＩＣ₅₀値（Ｍ））として、各々１．２×
１０^-8、２．０×１０^-6、６．８×１０^-9、２．３×１
０^-5、８．０×１０^-9という値を示した。

【００６２】なお、阻害活性の測定法はＷＯ８９／６２
３９号明細書に記載されているものに準じた。

【００６３】

【実施例１】（１）気道反応性の検討モルモット（２００〜３００ｇ：ハートレー系雄性）を
ウレタン（２ｇ／kg，ｉ．ｐ．）にて麻酔後、気管切開
し、食道バルーンを送入し、小動物用従量式レスピレー
ターにて人工換気した。一回換気量は１ml／１００ｇ、
換気回数は６０回／分とした。肺内外圧差（Ｐｔｐ）は
食道バルーンで測定した胸腔内圧と気管内圧の差として
求め、気流速度（Ｖ）は熱式のニューモタコグラフ（Fl
eisch no.5）で求め、Ｖを電気的に積分して一回換気量
（ＶＴ）を求めた。Ｐｔｐ，ＶとＶＴを記録し、肺抵抗
（ＲＬ）を計算により求めた。気管支収縮物質として、
５―ヒドロキシトリプタミン（５―ＨＴ：Sigma 社）を
用い、カニュレイションした頸静脈から０、２、４、
８、１６μｇ／kgの５―ＨＴを１ml／kgの生理食塩水と
ともに３分間隔で３秒間かけて注入し、それぞれの投与
量における Peak ＲＬを求め、縦軸に％ＲＬ change 、
横軸に５―ＨＴ dose をとり、ドーズレスポンスカーブ
を作成した。

【００６４】（２）（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ
及び（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの気道反応に及
ぼす作用モルモットを対照群と（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰ
Ｉ（参考例で得られたもの）及び（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩ投与群に分け、はじめに（１）に従っ
て、ＲＬを測定し、５―ＨＴに対するドーズレスポンス
カーブを作成した。その３０分後にリン酸緩衝生理食塩
水又は（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩあるいは（Ｓ
ｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩを１ml／kg静脈内投与
し、その直後、あるいは５分後に生理食塩水に溶解した
ヒトエラスターゼ（ＨＮＥ）（ヒト喀痰由来エラスター
ゼ；エラスチン社）２５０μｇ／mlを３分間吸入させ
た。１０分間レスピレーターにて人工換気を行なった
後、自発呼吸下、背臥位にて２０分間放置した。再び、
ＲＬにおける５―ＨＴに対する反応性を測定し、ＨＮＥ
吸入前後での初期抵抗を２倍に増加させる５―ＨＴの投
与量を算出し、気道反応性を比較した。

【００６５】（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩの投与
量は１０mg／kg、１０mg／kg×２、（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ
¹⁰⁷）ＳＬＰＩの投与量は２０mg／kgとした。

【００６６】結果を表１及び表２に示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】

【表２】

【００６９】表１からエラスターゼが気道閉塞を誘起す
ること、ならびに表２からエラスターゼが気道過敏性を
成立させ、そして（Ａｒｇ⁵⁸―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ及
び（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩは表１からエラス
ターゼが惹起する気道閉塞を改善すること、ならびに表
２から、好中球が関与するエラスターゼの気道過敏性亢
進作用を抑制することが判る。したがって、（Ａｒｇ⁵⁸
―Ａｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩ及び（Ｓｅｒ¹―Ａｌａ¹⁰⁷）
ＳＬＰＩはこの好中球、ひいてはエラスターゼが関与す
る呼吸器疾患に伴う気道閉塞及び気道過敏性亢進の抑制
により慢性閉塞性肺疾患等の気道閉塞性の改善剤として
有効であることが判る。

【００７０】

【配列表】

【００７１】配列番号：１配列の長さ：４９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu 1 5 10 15 Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu 20 25 30 Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys 35 40 45 Ala 49

【００７２】配列番号：２配列の長さ：５０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met 1 5 10 15 Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp 20 25 30 Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala 50

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１（１）において用いたスロンビン切断
配列遺伝子を含むＤＮＡフラグメント（，）を表わ
す。

【図２】参考例１（１）における融合蛋白発現プラスミ
ドｐＧＨ―Ｔ５９の構築を表わす。

【図３】参考例１（２）において用いた合成ＤＮＡフラ
グメント（，，）を表わす。

【図４】参考例１（２）におけるｐＧＨ―Ｅ５９の構築
を表わす。

【図５】参考例１（３）において用いた合成ＤＮＡフラ
グメント（，，）を現す。

【図６】参考例１（３）におけるｐＧＨ―Ｔ５８の構築
を表わす。

【図７】参考例１（６）における活性型（Ａｒｇ⁵⁸―Ａ
ｌａ¹⁰⁷）ＳＬＰＩのS-Sepharose イオン交換クロマト
グラフィーによる溶出パターンを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効成分として配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチド、又はそれらと生物学
的に同等のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有す
る気道閉塞症の改善剤。
【請求項２】有効成分が、配列番号：１で表わされる
ポリペプチドである請求項１記載の改善剤。
【請求項３】有効成分が、配列番号：２で表わされる
ポリペプチドである請求項１記載の改善剤。
【請求項４】気道閉塞症が、白血球が喀痰及び／又は
気管支肺胞洗浄液中に増加する呼吸器疾患に伴う気道閉
塞症である請求項１〜３のいずれか１項に記載の改善
剤。
【請求項５】気道閉塞症が、好中球又は好酸球由来の
プロテアーゼによる気道閉塞症である請求項１〜３のい
ずれか１項に記載の改善剤。
【請求項６】気道閉塞症が、気道過敏性亢進に基づく
急性又は慢性閉塞性肺疾患である請求項５記載の改善
剤。
【請求項７】慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎、肺
気腫、びまん性汎細気管支炎、又は喘息である請求項６
記載の改善剤。