JP3779728B2 - 組織因子活性インヒビターの産生 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質の産生方法に関し、さらに詳細には組織因子活性インヒビター(TFPI)、および組織因子活性インヒビター２(TFPI-2)、およびそれらの変異体の酵母細胞内での産生、ならびに酵母細胞内からのこのようなポリペプチドの単離に関する。
組織因子活性インヒビター(TFPI)は、少なくとも２つの方法で凝固カスケードを阻害する：第VIIa因子/組織因子複合体の形成を阻害する方法、および第Xa因子の活性部位に結合することによる方法である。TFPIの１次配列（これはcDNA配列から推測した）は、３つのクニッツ型酵素インヒビタードメインを含むことが示されている。これらのドメインの第１は、第VIIa因子/組織因子複合体の阻害に必要とされる。第２のクニッツ型ドメインは、第Xa因子の阻害のために必要とされる。第３のクニッツ型ドメインの機能は知られていない。TFPIの酵素活性は知られておらず、そして化学量論的な方法（すなわち、１つのTFPIクニッツ型ドメインが１つのプロテアーゼ分子活性部位に結合する）でそのプロテアーゼ標的を阻害すると考えられている。TFPIのカルボキシ末端は、ヘパリン結合およびリン脂質との相互作用により、細胞表面局在化の役割を有すると考えられている。TFPIはまた、リポタンパク質関連凝固インヒビター(LACI)、組織因子インヒビター(TFI)、および外因性経路インヒビター(EPI)としても知られている。
成熟TFPIは、負帯電性アミノ末端および正帯電性カルボキシ末端を有する276個の長さのアミノ酸である。TFPIは、18個のシステイン残基を含有し、そして正しく折り畳まれた場合、９個のジスルフィド架橋を形成する。一次配列はまた、３つのAsn-X-Ser/Thr N-結合グリコシル化コンセンサス部位、および145位，195位、および256位に位置するアスパラギン残基を含有する。成熟TFPIの炭水化物成分は、タンパク質の質量の約30％である。しかし、タンパク質分解マッピングからのデータおよびマススペクトルデータは、炭水化物部分が不均一であることを示す。TFPIはまた、タンパク質の２位のセリン残基で、種々の程度にリン酸化されることが見出されている。リン酸化はTFPI機能に影響しないようである。
TFPIは、致死的なEscherichia coli(E. coli)敗血症ショックのヒヒモデルにおいて、死亡を防ぐことが示されている。Creaseyら、J. Clin. Invest. 91:2850-2860(1993)。致死量のE. Coliの注入直後に、６mg/kg体重でTFPIを投与すると、５匹のコントロール動物についての平均生存時間（39.9時間）と比較して、全５匹のTFPI-処置動物は生存し、そして生活の質が有意に改善された。TFPIの投与はまた、E coli敗血症標的器官（腎臓、副腎、および肺を含む）において通常観察される凝固応答の有意な減弱、細胞傷害の種々の評価の有意な低下および病因の有意な減少が生じる。
その凝血阻害特性により、TFPIはまた、微少血管の手術における凝血の際の血栓症を防ぐために用いられ得る。例えば、米国特許第5,276,015号は、微少血管の吻合の血栓形成を減少させる方法（ここでは、TFPIは、微少血管の再構築と同時に、微少血管の吻合部位に投与される）におけるTFPIの使用を開示する。
近年、TFPIとの高度な構造の同一性を有する他のタンパク質が同定されている。Sprecherら、Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:3353-3357(1994)。このタンパク質（TFPI-2と呼ぶ）の推定２次構造は、３つのクニッツ型ドメイン、９個のシステイン-システイン結合、および酸性アミノ末端、および塩基性カルボキシ末端テールを有するTFPIと実質的に同一である。TFPI-2の３つのクニッツ型ドメインは、それぞれTFPIのクニッツ型ドメイン１、２、および３と、43％、35％、および53％の一次配列の同一性を示す。組換えTFPI-2は、第VIIa因子/組織因子のアミド分解活性を強く示す。対照的に、TFPI-2は、第Xa因子アミド分解活性が弱いインヒビターである。
TFPIは、ヒト血漿およびヒト組織培養細胞（HepG2、Chang肝臓、およびSK肝腫瘍細胞を含む）から単離されている。組換えTFPIは、マウスC127細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびヒトSK肝腫瘍細胞中で発現されている。マウスC127細胞由来の組換えTFPIは、動物モデルにおいて、組織因子により誘導される凝固を阻害することが示されている。しかし、多くの場合、哺乳類細胞において産生されるTFPIは、タンパク質分解切断により分解される。タンパク質はほとんどの場合、アルギニン（83位および199位）で切断される。
組換えTFPIの非グリコシル化形態もまた、米国特許第5,212,091号に開示されているように、Escherichia coli(E. coli)細胞から産生され、そして単離される。TFPIのこの形態は、ウシ第Xa因子の阻害、およびヒト組織因子により誘導される血漿中の凝固の阻害に活性であることが示されている。いくつかのアッセイにおいては、E. coli産生TFPIは、SK肝腫瘍細胞由来のTFPIよりも活性であることが示されている。しかし、E. coli細胞中で産生されるTFPIは、多くの場合、タンパク質の不均一性を増加させる方法で改変される。これらの改変としては、タンパク質分解性分解、カルバミル化、およびN-末端改変が挙げられる。TFPIの異なる形態はまた、E. coliリボソームによる不適切な内部翻訳開始から生じることが見出され得る。
酵母細胞培養培地からのTFPIの精製方法は、例えば、Petersenら、J. Biol. Chem. 18:13344-13351(1993)に開示されている。これらの場合、組換えTFPIは酵母細胞から分泌される。このようなプロトコールで回収されるTFPIはまた、多くの場合、不均一である。これは、おそらく、タンパク質分解性分解および種々のグリコシル化のためである。このため、当該技術分野においては、真正(authentic)（すなわち、正しいN-末端アミノ酸配列を有する）であり、完全長であり、そして均一である成熟TFPIを産生する必要性が存在する。
発明の要旨
本発明は、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質（TFPI、TFPI-2を含む）、ならびにその変異タンパク質を産生する方法、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質の産生に適切な条件下で、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む複製可能なクローニングビヒクルで形質転換した酵母細胞をインキュベートする工程（ここで、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質は、酵母細胞中に残存する）、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質を含有する形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程、および不溶性画分中に含有される第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質を単離する工程を包含する方法に関する。第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質をコードするDNAは、インフレームで第２のヌクレオチド配列の直後に続き、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は共に融合ペプチドをコードする。融合ペプチドは、酵母細胞中で切断され、真正第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質を産生し得る。第２のヌクレオチド配列は、ユビキチンをコードし得る。酵母細胞は、Saccharomyces属、特にSaccharomyces cerevisiae由来であり得、そしてVH6、AB122、およびJSC310からなる群から選択される遺伝子型を有し得る。
本発明はまた、本発明の方法により産生される第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質に関する。第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質がTFPIの変異タンパク質である場合、TFPIの変異タンパク質は、クニッツ型ドメイン１のP1-反応部位にアルギニンを有し得る。
【図面の簡単な説明】
図1Aおよび1Bは、本発明の方法によって産生されるTFPIの活性を示す。
図２は、TFPIタンパク質をコードするDNA配列を含む複製可能なクローニングビヒクル（pLACI 4.1と命名する）の概略図を示す。
図３は、本発明の方法で真正１次配列を含むTFPIを産生するために用いられるユビキチンTFPI融合タンパク質をコードする配列（配列番号１）を示す。
図４は、最初の精製の後の酵母細胞中の不溶性画分に含有されるTFPIのクマシー染色PAGEゲルを示す。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する用語「第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質」は、第VIIa因子/TF複合体に結合して、それにより、この複合体の機能を阻害することができ、さらに、第Xa因子に結合して、それにより、その機能を阻害することができるタンパク質を意味する。完全長の成熟TFPI、TFPI-2およびそれらの変異タンパク質は、この用語に包含される。好ましくは、この因子VIIa/TF/Xa結合タンパクは、TFPIである。
今回、酵母内における第VIIa因子/TF/Xa因子結合タンパク、具体的には、TFPI（ここで、このTFPIは分泌されないが、不溶性の画分でこの細胞内に保持される）を生成することにより、真性で（すなわち、正しいN-末端アミノ酸配列を有する）完全長の同種TFPIが回収されることを見出した。本明細書中で使用される用語「TFPI」は、GirardらのNature、338、518〜520(1989年)に記述のように、276アミノ酸ポリペプチドを意味する。本明細書中で使用される用語「TFPI-2」は、SprecherらのProc. Nat. Acad. Sci. USA 91：3353〜3357(1994年)に記述のように、213アミノ酸ポリペプチドを意味する。
第VIIa因子/TF/Xa因子結合タンパクを生成するために本発明で使用できる酵母発現系は、当業者に周知である。このような発現系は、最低限、酵母RNAポリメラーゼを結合できかつコード配列(例えば、TFPIまたはTFPI-2をコードするDNA)のmRNAへの下流側(5'〜3')への転写を開始できるDNA配列である酵母プロモーターを必要とする。このプロモーターは、ここでは、通常、このコード配列の5'末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位(「TATAボックス」)および転写開始部位を含有する。酵母プロモーターは、ここではまた、上流アクチベーター配列(UAS)と呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、もし存在するなら、通常、この転写開始領域と比べて、その構造遺伝子から遠位(すなわち、さらに上流)にある。このUSAはまた、発現の調節を支配する。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それにより、望ましいように、転写が増大または低減される。
酵母は、活性の代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、この代謝経路の酵素をコードする配列は、本発明の目的上、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(EPO公報第284044号)、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ(PyK)(EPO公報第329203号)が包含される。この酵母PHO5遺伝子は、酸性ホスファターゼをコードし、MyanoharaらのProc. Nat. Acad. Sci. USA 80：１(1983)に記述されているが、また、本発明に有用なプロモーター配列を提供する。
さらに、天然に生じない合成プロモーターもまた、本明細書に記載の酵母プロモーターとして機能する。例えば、ある酵母プロモーターのUAS配列は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域と結合し得、ハイブリッドプロモーターを作り出す。このようなハイブリッドプロモーターの例には、米国特許第4,876,197号および第4,880,734号に記述のように、このGAP転写活性化領域と結合したADH調節配列が包含され、これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている。ハイブリッドプロモーターの他の例には、EPO公報第164556号に記述のように、ADH2、GAL4、GAL10またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターであって、解糖酵素遺伝子(例えば、GAPまたはPyK)の転写活性化領域と組み合わせたものが包含される。さらに、酵母プロモーターには、天然に生じる非酵母由来のプロモーターであって、酵母RNAポリメラーゼと結合し転写を開始する能力を有するものが挙げられ得る。このようなプロモーターの例には、以下の参考文献に記述のものが包含される：
酵母発現系における融合タンパクの生成は、本発明の目的上、好ましい。さらに具体的には、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするDNA配列は、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質のコード配列の5'末端に融合される。発現すると、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、この酵母またはヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)遺伝子は、このTFPI遺伝子の5'末端にて結合し得、得られる融合タンパクは、酵母内で発現した。この２つのアミノ酸配列の接合部におけるDNA配列は、切断可能な部位をコードしてもしなくても良い。例えば、EPO公報第196 056号を参照せよ。好ましくは、この部位は切断可能である。好ましい融合タンパク質は、ユビキチン-TFPI融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、プロセシング酵素のための部位を保持するユビキチン配列を用いて作成される。この部位により、ユビキチン特異的なプロセシングプロテアーゼが、この所望のポリペプチド由来のユビキチンを切断することが可能になる。従って、この方法を通じて、真性(authentic)アミノ末端を有する成熟第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質が、酵母細胞内で産生され得、そして酵母細胞内から単離され得る。ユビキチンタンパク質融合技術の使用は、Barrら、RECOMBINANT SYSTEMS IN PROTEIN EXPRESSION(Elsevier Science Publishers B.V.、1991)、37〜46頁で概説されている。
通常、酵母により認識される転写終止配列は、その翻訳終止コドンに対して3'に位置する調節領域であり、このプロモーターと共に、このコード配列に隣接する。これらの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写を指示する。遺伝子に由来の酵母認識終止配列(例えば、α−因子および解糖酵素をコードするもの)は、ここで使用され得る。
通常、上記成分は、プロモーター、必要に応じてリーダー、配列をコードする第VIIa因子/TF/Xa因子結合タンパク、および転写終止配列を含有し、発現構築物に組み立てられる。本明細書に記載の発現構築物は、レプリコン、例えば、宿主(例えば、酵母または細菌)において安定に維持され得る染色体外のエレメント(例えば、プラスミド)において維持され得る。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、それゆえ、例えば、発現のために酵母において、そしてクローニングおよび増幅のために原核細胞宿主において、それを維持することが可能になる。本明細書において有用なこのような酵母細菌シャトルベクターの例には、以下が包含される：Botsteinら、(1979)Gene8:17-24に記載のYEp24；Brakeら、(1984)Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:4642-4646に記載のpCl/1；およびStinchcombら、(1982)J. Mol. Biol. 158:157に記載のYRp17。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約200の範囲、通常、約10〜約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択され得る。例えば、Brakeら(上記)を参照せよ。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、このベクターが組み込むことを可能にする酵母染色体と相同な少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、この発現構築物に隣接する２つの相同配列を含有する。組み込みは、ベクター中および酵母染色体中の相同DNA間の組換えにより生じると思われる。Orr-Weaverら、Methods. Enzymol.、101：228〜245(1983)に記載されているように、組み込みベクターは、このベクター内に包含するための適切な相同配列を選択することにより、酵母中の特定の遺伝子座に方向づけられ得る。１またはそれ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく、産生される組換えタンパク質のレベルに影響を及ぼす。Rineら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：6750(1983)。ベクターに含有される染色体配列は、ベクター中の単一セグメントとして生じ得るか(このベクター全体の組み込みが起こる)、またはこの染色体中の隣接セグメントと相同でそして、このベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントとして生じ得るか(その結果、この発現構築物だけの安定な組み込みが起こり得る)、いずれかであり得る。
通常、染色体外および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーには、酵母宿主において発現し得る生合成遺伝子(例えば、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1およびALG7)、およびG418耐性遺伝子が挙げられ得る。これらは、酵母細胞において、それぞれ、ツニカマイシンおよびG418に対する耐性を与える。さらに、適切な選択マーカーはまた、毒性化合物(例えば、金属)の存在下にて、酵母に増殖する能力を提供し得る。例えば、CUP1が存在することにより、銅イオンの存在下での酵母の増殖が可能となる(Buttら、Microbiol、Rev. 51：351(1987)に記載されている)。
あるいは、上記成分は、一緒に集めて形質転換ベクターに組立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、選択マーカーから構成され、このマーカーは、上記のように、レプリコン中で維持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである。
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンかまたは組み込みベクターのいずれかであるが、形質転換のために、多くの酵母に対して開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母に対して開発されている：
酵母細胞を形質転換するために本明細書中で使用され得る形質転換手順には、以下に記述されるようにエレクトロポレーションが挙げられる：
他の手順には、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオン処理した無傷細胞の形質転換が挙げられる。このような手順は、例えば、以下に記述されている：
TFPIまたはTFPI-2の変異タンパク質もまた、本発明の方法に従って、調製できる。この定義の範囲内に入る変異タンパク質には、以下が挙げられる：(a)分子のコンフォメーションを実質的に変えない１個〜５個の保存的アミノ酸置換を有するTFPIまたはTFPI-2変異タンパク質；(b)N-結合グリコシル化の３つの部位の１以上を除去するアミノ酸置換を有するTFPIまたはTFPI-2変異タンパク質；(c)TFPIの残基をTFPI-2の対応する残基に変える１個〜５個のアミノ酸置換を有するTFPI変異タンパク質；(d)TFPI-2の残基をTFPIの対応する残基に変える１個〜５個のアミノ酸置換を有するTFPI-2変異タンパク質；(e)１以上のクニッツ型ドメインにて、P1反応性部位にアミノ酸置換を有するTFPIまたはTFPI-2変異タンパク質；および(f)１以上のクニッツ型ドメインにて、P1反応性部位の５個のアミノ酸内の位置にアミノ酸置換を有するTFPIまたはTFPI-2変異タンパク質。好ましい実施態様では、TFPIの第一のクニッツ型ドメイン[配列番号１]のP1反応性部位のリジン残基は、アルギニンで置き換えられる。この変異タンパク質は、以下の配列を有する：
同様に、この変異タンパク質は、TFPI-2変異タンパク質(ここで、TFPI-2の第二のクニッツ型のドメインのP1反応性部位内のグルタメート残基は、アルギニンで置き換えられている)でもあり得る。TFPIおよびTFPI-2の変異タンパク質(ここで、N-結合糖鎖形成に対する１個またはそれ以上のコンセンサス部位は、このような認識を防止するように変性されている)の生成および単離もまた、本発明の方法の範囲内に入る。TFPIは、３個のこのようなコンセンサス配列を有し、この配列は、例えば、このコンセンサス部位のセリンまたはスレオニンをアラニンに置き換えることにより、変性してもよい。同様に、TFPI-2の変異タンパク質(ここで、成熟TFPI-2の96位置のセリン残基および/または成熟TFPI-2の150位置のスレオニン残基は、アラニンで置換されている)もまた、調製し得る。TFPIまたはTFPI-2の配列に比べて保存アミノ酸置換を含有する変異タンパク質は、本発明に従って、生成し単離し得る。最終的に、TFPIの変異タンパク質(ここで、このTFPI配列に通常見出されるアミノ酸は、一定部位に対するTFPI-2の対応アミノ酸で置換されている)およびTFPI-2の変異タンパク質(ここで、このTFPI配列に通常見出されるアミノ酸は、一定部位に対するTFPIの対応アミノ酸で置換されている)の生成および単離は、本発明の範囲内に入る。
変異タンパク質は、当業者に公知の方法を用いて、TFPIまたはTFPI-2をコードする組換えクローニングビヒクルの配列の適切な変異誘発により調製され得る。変異誘発技術には、部位特異的変異誘発が挙げられるが、それに限定されない。部位特異的変異誘発は、当該分野で公知の多くの方法を用いて行い得る。これらの技術は、例えば、Smith、Annual Review of Genetics、19：423(1985)に記載され、この技術のいくつかの改良法は、Methods in Enzymology、154、Ｅ部、WuおよびGrossman編(1987)、17、18、19および20章に記載されている。部位特異的変異誘発は、Gapped Duplexの部位特異的突然変異誘発法を用いても実施し得る。この一般的な手順は、Kramerらにより、上記のMethods in Enzymologyの17章に記述されている。核酸配列PCR技術（オーバーラップPCRを包含する）において点変異を作製する他の技術は、PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS、Innis、Gelfand、SninskyおよびWhite編(Academic Press、1990)に記載されている。
調剤および投与
本発明の方法により調製されたLACIは、敗血症性ショックの治療および予防に治療上効果的な濃度で投与され得る。この目的を遂げるために、好ましくは、本発明の方法により調製されたLACIは静脈内へ投与される。この投与を遂げる方法は当業者に公知である。
患者への投与前、調剤は本発明の方法により調製されたLACIに添加され得る。液体調剤が用いられ得る。例えば、これらの調剤としては、油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、塩類、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が挙げられ得る。調剤に用いられ得る炭化水素としては、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンのような糖類または糖アルコールが挙げられる。糖類またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合溶液を含み得る。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは-OH基を有するＣ4〜Ｃ8の炭化水素と定義され、そしてガラクチトール（galactitol）、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖または糖アルコールは、単独でまた組み合わせて用いられ得る。糖類または糖アルコールが水性調製物中で可溶である限りは、用いられる量に固定された制限はない。好ましくは、糖類または糖アルコール濃度は1.0w/v％と7.0w/v％との間であり、より好ましくは2.0と6.0w/v％との間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（Ｌ）体のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む；しかし、他のアミノ酸も加えられ得る。好適なポリマーは、平均分子量2,000と3,000との間のポリビニルピロリドン（PVP）、または平均分子量3,000と5,000との間のポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液のpH変化を最小にする組成の緩衝液を用いることもまた好ましい。ほとんどの任意の生理緩衝液が用いられ得るが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好ましい。最も好ましいのは、クエン酸緩衝液である。さらに、硫酸の使用は調剤の調製には避けるべきである。好ましくは、濃度は0.01〜0.3Ｍである。調剤に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第270,799号および同第268,110号に示される。
加えて、本発明の方法により調製されたLACIは、例えば、循環半減期を延長させるために、ポリマーを共有結合することで化学修飾され得る。好適なポリマー、およびペプチドにポリマーを結合させる方法は米国特許第4,766,106号、同第4,179,337号、同第4,495,285号、および同第4,609,546号に示され、これらは全てそのまま本明細書中で参考として援用される。好適なポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）である。PEGは室温で水に可溶であり、そして一般式：Ｒ(Ｏ-ＣＨ2-ＣＨ2)nＯ-Ｒ（ここでＲは水素、またはアルキル基またはアルカノール基のような保護基であり得る）を有する。好ましくは、保護基は１個と８個との間の炭素を有し、より好ましくは保護基はメチル基である。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１と1,000との間、より好ましくは２と500との間である。好ましくは、PEGは1000と40,000との間の平均分子量を有し、より好ましくは2000と20,000との間であり、最も好ましくは3,000と12,000との間である。好ましくは、PEGは少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、より好ましくはそれは１個の末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は好ましく活性化されて、インヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし、反応基のタイプおよび量は共有結合PEG/LACIを形成させるために変えられ得ることが理解される。
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた本発明において有用である。ポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（POG）などが挙げられる。POGが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、モノ、ジ、トリグリセリドにおいて、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在する同様の骨格だからである。それゆえ、この分枝鎖は必ずしも体内で外来子としてみなされない。POGはPEGと同様の範囲の好適な分子量を有する。POGの構造はKnaufら、1988, J. Bio. Chem. 263:15064-15070中に示され、そしてPOG／タンパク質接合体の説明が米国特許第4,766,106号に見出される。これらは両方ともそのまま本明細書中で参考として援用される。
液体薬学的組成物の調製後、それは分解の防止および無菌保存のために、好ましくは凍結乾燥される。液体組成物の凍結乾燥法は当業者に公知である。使用直前に、組成物は添加成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、リンゲル溶液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成によって、好ましくは、組成物は、当業者に公知の方法を用いて被験体に投与される。
感染個体への投与
本発明の方法により調製されたLACIは敗血症または敗血症性ショックの哺乳動物を治療するのに有用である。一般に、状態は、高熱（＞38.5℃）または低体温（＞35.5℃）、低血圧、頻呼吸（＞20呼吸／分）、頻拍（＞100拍／分）、白血球増加症（＞15,000細胞／mm3）、および血小板減少症（＜100,000血小板／mm3）により特徴付けられる。好ましくは、本発明の方法により調製されたLACIは、以下のように被験体が敗血症であると疑われれば直ちに投与される；フィブリノーゲンの20％を上回る降下（drop）またはフィブリン分裂産物の出現の提示、被験体の体温の上昇、および敗血症性ショックに関連する白血球増加症および低血圧の診断。上述の場合、静脈内投与が好ましい。一般的に、本発明の方法により調製されたLACIは１μg/kgと20mg/kgとの間の用量で、より好ましくは20μg/kgと10mg/kgとの間の用量で、最も好ましくは１mg/kgと７mg/kgとの間の用量で与えられる。好ましくは、ボーラス投与として与えられ、ボーラス投与後４〜６時間循環レベルを10〜20倍まで増加させる。継続的な注入もまたボーラス投与後に用いられ得る。そうであれば、本発明の方法により調製されたLACIは、５μg/kg/分と20μg/kg/分との間の用量で、より好ましくは７μg/kg/分と15μg/kg/分との間の用量で注入され得る。
本発明の方法により調製されたLACIは、敗血症性ショックの治療に効果的である他の薬剤と組み合わせて与えられ得る。例えば、以下のものが本発明の方法により調製されたLACIと組み合わせて投与され得る：根元的な細菌感染を治療し得る抗生物質；細菌細胞壁成分に対するモノクローナル抗体；敗血症経路に関与するサイトカイン（腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン-１、γ-インターフェロン、およびインターロイキン-８を含むがこれらに制限されない）と複合体を形成し得るモノクローナル抗体および可溶性レセプター；および一般に、敗血症経路中のサイトカインまたは補体タンパク質と相互作用し得、それらの効果を減少させ、かつ敗血症または敗血症性ショックを減衰させる任意の薬剤またはタンパク質。
本発明に有用な抗生物質は一般的な部類の内の以下を含む：βラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合におけるアミノ糖類（アミノグリコシド）、大環状ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサミド（napthacenecarboxamide）の多環式誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系大環状物（ポリエン）、スルファニルアミド（sulfanylarnides）由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５-ニトロ-２-フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、および他多数。他の抗生物質および上記の特定の抗生物質のさらなる改良体は、Encyclopedia of Chemical Technology、３版、Kirk-Othymer（編）、２巻、782〜1036頁（1978）および３巻、１〜78頁、Zinsser、MicroBiology、17版、W. Joklikら（編）235〜277頁（1980）、またはDorland's Illustrated Medical Dictionary、27版、W.B. Saunders Company（1988）中に見出され得る。
本発明の方法により調製されたLACIと組み合わせられ得る他の薬剤としては、敗血症経路に関与するサイトカインに対するモノクローナル抗体（PCT US90/07411に示されるような、IL-6またはM-CSFに対するモノクローナル抗体）；米国特許第4,603,106に示されるような、TNFに対するモノクローナル抗体；PCT US90/03266およびPCT US93/06120に示されるような、TNFプロホルモン産生細胞からの成熟TNFプロホルモンを切断するタンパク質のインヒビター；PCT US91/02460に示されるような、IL-１のアンタゴニスト；PCT US90/00321に示されるような、アクチビンのようなIL-６サイトカイン作用のインヒビター；およびIL-１のような種々のサイトカインのレセプターに基づくインヒビターが挙げられる。補体タンパク質に対する抗体または補体タンパク質の小分子インヒビターもまた用いられ得る。
一般的に、本発明の方法により調製されたLACIは、損傷、外傷、内毒素、TNF、ガン、IL-１、または他の薬剤もしくは状態により引き起こされる組織因子のアップレギュレーションにより生じる疾患に有用であり得る。
本発明は以下の実施例に言及することにより例証される。この実施例は特に有益な実施態様を記載する。しかし、これら実施態様は例示であって、いかなるようにも発明を制限するものとして解釈されるものではない。
実施例
実施例１
シャトルベクターpBS24が、Barrら、EXPRESSION SYSTEMS & PROCESSES FOR rDNA PRODUCTS（American Chemical Society, 1991），51〜64頁）に記載される。pBS24UbはpBS24.1の誘導体であり、そして唯一のBam HIおよびSal I制限部位、グルコース制御可能ADH2/GAPプロモーター、および合成ユビキチン（Ub）遺伝子を側面に有する発現カセットを含む。Ub融合体の構築のために、唯一のSst II部位をUb遺伝子の３'末端に作成する。Sst II部位の存在により、ユビキチン融合ペプチドを発現するヌクレオチド配列のインフレーム挿入が可能になる。挿入は合成DNAアダプターまたはPCR法の使用に従って遂げられ得る。いずれの場合も、５'結合配列は：
であり、そして３'クローニング部位（Sal I）は終止コドンの３'末端に可能な限り近接すべきである。
PCRを、図３に示される15.4kbプラスミドpLACI 4.1におけるユビキチン／TFPI遺伝子融合の構築に用いた。TFPIをコードする核酸を、プライマーLACI4およびLACI3で標準的なPCR手順を用いて増幅させた。LACI4は成熟TFPIをコードする核酸の５'末端の10ヌクレオチドとハイブリダイズし、そしてまたSst II制限部位を伴うユビキチン配列を含む。LACI3は成熟TFPIをコードする核酸の３'末端の15ヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてまたSal I制限部位を伴う後続配列（trailing sequence）を含む。これらプライマーの配列は以下のとおりである：
増幅後、PCR産物を酵素の製造者により特定される条件を用いてSal IおよびSst IIにより消化した。次いで、消化PCR産物を上記のようにpBS24Ubにクローン化し、pLACI 4.1を生成した。
pLACI 4.1をSaccharomyces cerevisiaeの３株の形質転換を用いた：VH6（MAT α, cir°, leu-2-112,-3, ura3, FoA, pep4::His3）、AB122（MAT α, cir°, leu2, ura3-52, prb1-1112, pep4-3, prel-407）、およびJSC310（AB122と同様、+ADR1過剰発現）。VH6形質転換体は総タンパク質の約５％のレベルのTFPIを産生し、AB122形質転換体は総タンパク質の約10％のレベルのTFPIを産生し、そしてJSC310形質転換体は総タンパク質の約15％のレベルのTFPIを産生した。TFPIの安定性は、ユビキチン融合体として合成され、そしてユビキチンの除去後Ｎ末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が酵母細胞中で不安定（例えば、半減期＜３分）であることが示される先行の研究を考慮すると、いくらか意外である。Finley,「The Yeast Ubiquitin System」：The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces Gene Expression. (1992)を参照のこと。
実施例２
パートＡ
TFPIを、米国特許第5,212,091号（これは本明細書中に参考として援用される）、特に、第９〜10欄において開示される方法により、S.cerevisiae VH6細胞から精製した。不溶性画分（膜画分とも呼ぶ）を、TEN（50mM Tris.HCl pH7.8; 50mM NaCl; ５mM EDTA）中でDyno-Millガラスビーズ抽出によって調製した。この画分由来の全タンパク質の約３μgを、14%のSDS-PAGEゲルで泳動し、そしてニトロセルロースメンブレンに移した。ニトロセルロースブロットを、成熟TFPIペプチド配列の初めの15アミノ酸に対して生成されたウサギポリクローナル抗血清でプローブした。得られるブロット（図５）により、均一の完全長TFPIの有意なバンドが示される。不溶性画分へのTFPIの発現をまた、比較のクマシー染色した14%のSDS-PAGEゲル（図４を参照のこと）を用いて確認した。TFPIタンパク質をコードするDNAを含有するプラスミド、またはTFPIタンパク質をコードするDNAを含有しない同一のプラスミドを有する酵母細胞を増殖させた。約10μgの酵母全細胞溶解物または２つの培養物由来の不溶性画分を、ゲルに載せた。TFPI産生プラスミドを有する培養物から調製したレーンにおいてのみ、唯一の36kDバンドが検出された。
スルホン化およびＱ Sepharose▲Ｒ▼分画を、米国特許第5,212,091号において詳述されるように行った。単離されたTFPIの再折り畳みをまた、本質的に記載されるように行った。但し、透析は、５M尿素、0.3M NaCl，20mM Tris.HCl pH 7.8，0.04% NP40，２mM L-システイン、0.5mM EDTA中で、室温で４〜６時間、次いで４℃で一晩行い、その後、透析バッグを２M尿素、１mM L-システインに移して４℃で48時間おいた。Ｓ Sepharose▲Ｒ▼分画については、再折り畳みされたTFPIを、カラムに載せる前に２M尿素、50mM NaPO4、0.1M NaCl中で平衡化させた。洗浄緩衝液は、２M尿素、50mM NaPO4、0.25M NaClを含有し、そしてTFPIを２M尿素、50mM NaPO4、0.8M NaClを含有する緩衝液で段階溶出した。TFPIを含有する画分をプールし、そしてPBS/1.5M尿素に対して、４℃で一晩、透析した。
この方法によって再生された産物のN末端配列決定は、以下の正確な配列を与えた：
この配列は真正の成熟TFPIに、90%を越える純度で対応する。
再生された産物をまた、第Xa因子アミド分解（amidolytic）アッセイおよびプロトロンビン凝固時間アッセイ（prothrombin time clotting assay）（両方とも、Wunら、J. Biol. Chem. 265:16096（1990）に記載されている）で試験して、活性を評価した。これらのアッセイからのデータを、図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。PBS緩衝液を第Xa因子阻害アッセイにおいてコントロールとして使用し、そしてPBS緩衝液ならびに正常なヒト血清（NHS）をプロトロンビン凝固アッセイにおいてコントロールとして使用した。酵母産生のTFPIは、約20ng/mlの50%阻害濃度で、第Xa因子活性を阻害し、そしてプロトロンビン凝固アッセイでは１μg/mlの阻害濃度を示した。これらの結果は、本発明の方法によって産生されるTFPIが、生物学的に活性であることを示している。
実施例３
本発明の方法をまた、大規模（すなわち、10リットル以上のバッチ）でTFPIを産生するために使用した。酵母AB122株をpLACI4.1で形質転換し、そしてアミノ酸を含まないYeast Nitrogen Base（Difco）を含有し、87mg/LのL-アデニン、43.5mg/LのL-トリプトファン、43.5mg/LのL-ヒスチジン、43.5mg/LのL-アルギニン、43.5mg/LのL-メチオニン、65.2mg/LのL-チロシン、109mg/LのL-フェニルアラニン、65.2mg/LのL-リジン、および８%のグルコースを補充した選択培地中で増殖させた。形質転換された細胞のアリコートを、グリセロールを15%になるように添加して-70℃で貯蔵することによって保存した。pLACI4.1で形質転換したS.cerevisiaeAB122株は、1994年７月19日にATCCに寄託されており、寄託番号74291が与えられている。
10リットルの発酵槽のための接種物を、１%v/vの凍結された形質転換培養物を前段階において記載したような新鮮な選択培地に添加することによって調製した。次いで、接種物を振とうフラスコ中で24時間〜48時間増殖させた。次いで、接種物を、10リットルの発酵容器の内容物に0.5%v/v添加した。容器中の培地は、滅菌の前に以下の成分を含んだ：
タストン 154 イースト エクストラクト: 10g/L
カゼイン ペプトン: 20g/L
アンチフォーム: 0.3ml/L
クエン酸: ４mM
KH2PO4: 20mM
(NH4)2SO4: 50mM
MnSO4: 20μM
ZnSO4: 20μM
H3BO3: 100μM
CoCl2: 10μM
Na2MoO4: 10μM
CuSO4: ２μM
グリセロール: 30g/L
次いで、発酵容器の内容物をインサイチュで滅菌し、そして以下の滅菌成分を添加して培地を完全にした：
MgSO4: 20mM
FeCl3: 100μM
グルコース: 20g/L
ピロキシジンHCl: ５mg/L
チアミンHCl: 10mg/L
D-ビオチン: 0.1mg/L
Caパントテン酸: 10mg/L
ミオ-イノシトール: 400mg/L
発酵容器での細胞の増殖の間、培地を30℃の温度に維持した。NaOHまたはリン酸を必要に応じて添加することによって、pH6.0を維持した。600r.p.mで振とうを開始し、そして必要に応じて増加させて、D.O＞30%を維持した。通気は１vvm空気であった。接種の15時間後に開始し、滅菌グルコース（25%w/v）と滅菌グリセロール（6.8%w/v）の混合液を発酵槽に0.1ml/分/Lの速度で添加した。39時間で、この混合液の添加速度を0.05ml/分/Lに減少させた。培養を96時間後に終結させた。TFPI（１mg/ml）のピーク発現は、接種後72時間までに生じた。
上述の議論および実施例は、本発明を例証するのみであり、当業者には、本発明が他の方法で行われ得ること、そして本発明は請求の範囲を参照することによってのみ規定されることが理解される。さらに、前述の明細書において引用される全ての参考文献、特許、および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：インニス，マイケル エイ．
クリシー，アルバ エイ．
(ii)発明の名称：組織因子活性インヒビターの産生
(iii)配列の数：７
(iv)連絡住所：
(A)名称：カイロン コーポレイション
(B)番地：4560 ホートン ストリート
(C)市：エミリービル
(D)州：カリフォルニア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：94608
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース ♯1.0，バージョン ♯1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：US
(B)出願日：1994年８月５日
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：サベレイド，ポール ビー．
(B)登録番号：36,914
(C)照会／記録番号：0991.001
(ix)電話回線情報：
(A)電話：510-601-2585
(B)テレファックス：510-655-3542
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：1065塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..1056
(xi)配列：配列番号１：
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：352アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２：
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：276アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号３：
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)種類：/desc=「プライマー」
(xi)配列：配列番号４：
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：23塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)種類：/desc=「プライマー」
(xi)配列：配列番号５：
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：24塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)種類：/desc=「プライマー」
(xi)配列：配列番号６：
(2)配列番号７の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：18アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号７：
本発明は、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質の産生方法に関し、さらに詳細には組織因子活性インヒビター(TFPI)、および組織因子活性インヒビター２(TFPI-2)、およびそれらの変異体の酵母細胞内での産生、ならびに酵母細胞内からのこのようなポリペプチドの単離に関する。
組織因子活性インヒビター(TFPI)は、少なくとも２つの方法で凝固カスケードを阻害する：第VIIa因子/組織因子複合体の形成を阻害する方法、および第Xa因子の活性部位に結合することによる方法である。TFPIの１次配列（これはcDNA配列から推測した）は、３つのクニッツ型酵素インヒビタードメインを含むことが示されている。これらのドメインの第１は、第VIIa因子/組織因子複合体の阻害に必要とされる。第２のクニッツ型ドメインは、第Xa因子の阻害のために必要とされる。第３のクニッツ型ドメインの機能は知られていない。TFPIの酵素活性は知られておらず、そして化学量論的な方法（すなわち、１つのTFPIクニッツ型ドメインが１つのプロテアーゼ分子活性部位に結合する）でそのプロテアーゼ標的を阻害すると考えられている。TFPIのカルボキシ末端は、ヘパリン結合およびリン脂質との相互作用により、細胞表面局在化の役割を有すると考えられている。TFPIはまた、リポタンパク質関連凝固インヒビター(LACI)、組織因子インヒビター(TFI)、および外因性経路インヒビター(EPI)としても知られている。
成熟TFPIは、負帯電性アミノ末端および正帯電性カルボキシ末端を有する276個の長さのアミノ酸である。TFPIは、18個のシステイン残基を含有し、そして正しく折り畳まれた場合、９個のジスルフィド架橋を形成する。一次配列はまた、３つのAsn-X-Ser/Thr N-結合グリコシル化コンセンサス部位、および145位，195位、および256位に位置するアスパラギン残基を含有する。成熟TFPIの炭水化物成分は、タンパク質の質量の約30％である。しかし、タンパク質分解マッピングからのデータおよびマススペクトルデータは、炭水化物部分が不均一であることを示す。TFPIはまた、タンパク質の２位のセリン残基で、種々の程度にリン酸化されることが見出されている。リン酸化はTFPI機能に影響しないようである。
TFPIは、致死的なEscherichia coli(E. coli)敗血症ショックのヒヒモデルにおいて、死亡を防ぐことが示されている。Creaseyら、J. Clin. Invest. 91:2850-2860(1993)。致死量のE. Coliの注入直後に、６mg/kg体重でTFPIを投与すると、５匹のコントロール動物についての平均生存時間（39.9時間）と比較して、全５匹のTFPI-処置動物は生存し、そして生活の質が有意に改善された。TFPIの投与はまた、E coli敗血症標的器官（腎臓、副腎、および肺を含む）において通常観察される凝固応答の有意な減弱、細胞傷害の種々の評価の有意な低下および病因の有意な減少が生じる。
その凝血阻害特性により、TFPIはまた、微少血管の手術における凝血の際の血栓症を防ぐために用いられ得る。例えば、米国特許第5,276,015号は、微少血管の吻合の血栓形成を減少させる方法（ここでは、TFPIは、微少血管の再構築と同時に、微少血管の吻合部位に投与される）におけるTFPIの使用を開示する。
近年、TFPIとの高度な構造の同一性を有する他のタンパク質が同定されている。Sprecherら、Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:3353-3357(1994)。このタンパク質（TFPI-2と呼ぶ）の推定２次構造は、３つのクニッツ型ドメイン、９個のシステイン-システイン結合、および酸性アミノ末端、および塩基性カルボキシ末端テールを有するTFPIと実質的に同一である。TFPI-2の３つのクニッツ型ドメインは、それぞれTFPIのクニッツ型ドメイン１、２、および３と、43％、35％、および53％の一次配列の同一性を示す。組換えTFPI-2は、第VIIa因子/組織因子のアミド分解活性を強く示す。対照的に、TFPI-2は、第Xa因子アミド分解活性が弱いインヒビターである。
TFPIは、ヒト血漿およびヒト組織培養細胞（HepG2、Chang肝臓、およびSK肝腫瘍細胞を含む）から単離されている。組換えTFPIは、マウスC127細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびヒトSK肝腫瘍細胞中で発現されている。マウスC127細胞由来の組換えTFPIは、動物モデルにおいて、組織因子により誘導される凝固を阻害することが示されている。しかし、多くの場合、哺乳類細胞において産生されるTFPIは、タンパク質分解切断により分解される。タンパク質はほとんどの場合、アルギニン（83位および199位）で切断される。
組換えTFPIの非グリコシル化形態もまた、米国特許第5,212,091号に開示されているように、Escherichia coli(E. coli)細胞から産生され、そして単離される。TFPIのこの形態は、ウシ第Xa因子の阻害、およびヒト組織因子により誘導される血漿中の凝固の阻害に活性であることが示されている。いくつかのアッセイにおいては、E. coli産生TFPIは、SK肝腫瘍細胞由来のTFPIよりも活性であることが示されている。しかし、E. coli細胞中で産生されるTFPIは、多くの場合、タンパク質の不均一性を増加させる方法で改変される。これらの改変としては、タンパク質分解性分解、カルバミル化、およびN-末端改変が挙げられる。TFPIの異なる形態はまた、E. coliリボソームによる不適切な内部翻訳開始から生じることが見出され得る。
酵母細胞培養培地からのTFPIの精製方法は、例えば、Petersenら、J. Biol. Chem. 18:13344-13351(1993)に開示されている。これらの場合、組換えTFPIは酵母細胞から分泌される。このようなプロトコールで回収されるTFPIはまた、多くの場合、不均一である。これは、おそらく、タンパク質分解性分解および種々のグリコシル化のためである。このため、当該技術分野においては、真正(authentic)（すなわち、正しいN-末端アミノ酸配列を有する）であり、完全長であり、そして均一である成熟TFPIを産生する必要性が存在する。
発明の要旨
本発明は、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質（TFPI、TFPI-2を含む）、ならびにその変異タンパク質を産生する方法、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質の産生に適切な条件下で、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む複製可能なクローニングビヒクルで形質転換した酵母細胞をインキュベートする工程（ここで、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質は、酵母細胞中に残存する）、第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質を含有する形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程、および不溶性画分中に含有される第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質を単離する工程を包含する方法に関する。第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質をコードするDNAは、インフレームで第２のヌクレオチド配列の直後に続き、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は共に融合ペプチドをコードする。融合ペプチドは、酵母細胞中で切断され、真正第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質を産生し得る。第２のヌクレオチド配列は、ユビキチンをコードし得る。酵母細胞は、Saccharomyces属、特にSaccharomyces cerevisiae由来であり得、そしてVH6、AB122、およびJSC310からなる群から選択される遺伝子型を有し得る。
本発明はまた、本発明の方法により産生される第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質に関する。第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質がTFPIの変異タンパク質である場合、TFPIの変異タンパク質は、クニッツ型ドメイン１のP1-反応部位にアルギニンを有し得る。
【図面の簡単な説明】
図1Aおよび1Bは、本発明の方法によって産生されるTFPIの活性を示す。
図２は、TFPIタンパク質をコードするDNA配列を含む複製可能なクローニングビヒクル（pLACI 4.1と命名する）の概略図を示す。
図３は、本発明の方法で真正１次配列を含むTFPIを産生するために用いられるユビキチンTFPI融合タンパク質をコードする配列（配列番号１）を示す。
図４は、最初の精製の後の酵母細胞中の不溶性画分に含有されるTFPIのクマシー染色PAGEゲルを示す。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する用語「第VIIa因子/TF/第Xa因子結合タンパク質」は、第VIIa因子/TF複合体に結合して、それにより、この複合体の機能を阻害することができ、さらに、第Xa因子に結合して、それにより、その機能を阻害することができるタンパク質を意味する。完全長の成熟TFPI、TFPI-2およびそれらの変異タンパク質は、この用語に包含される。好ましくは、この因子VIIa/TF/Xa結合タンパクは、TFPIである。
今回、酵母内における第VIIa因子/TF/Xa因子結合タンパク、具体的には、TFPI（ここで、このTFPIは分泌されないが、不溶性の画分でこの細胞内に保持される）を生成することにより、真性で（すなわち、正しいN-末端アミノ酸配列を有する）完全長の同種TFPIが回収されることを見出した。本明細書中で使用される用語「TFPI」は、GirardらのNature、338、518〜520(1989年)に記述のように、276アミノ酸ポリペプチドを意味する。本明細書中で使用される用語「TFPI-2」は、SprecherらのProc. Nat. Acad. Sci. USA 91：3353〜3357(1994年)に記述のように、213アミノ酸ポリペプチドを意味する。
第VIIa因子/TF/Xa因子結合タンパクを生成するために本発明で使用できる酵母発現系は、当業者に周知である。このような発現系は、最低限、酵母RNAポリメラーゼを結合できかつコード配列(例えば、TFPIまたはTFPI-2をコードするDNA)のmRNAへの下流側(5'〜3')への転写を開始できるDNA配列である酵母プロモーターを必要とする。このプロモーターは、ここでは、通常、このコード配列の5'末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位(「TATAボックス」)および転写開始部位を含有する。酵母プロモーターは、ここではまた、上流アクチベーター配列(UAS)と呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、もし存在するなら、通常、この転写開始領域と比べて、その構造遺伝子から遠位(すなわち、さらに上流)にある。このUSAはまた、発現の調節を支配する。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それにより、望ましいように、転写が増大または低減される。
酵母は、活性の代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、この代謝経路の酵素をコードする配列は、本発明の目的上、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(EPO公報第284044号)、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ(PyK)(EPO公報第329203号)が包含される。この酵母PHO5遺伝子は、酸性ホスファターゼをコードし、MyanoharaらのProc. Nat. Acad. Sci. USA 80：１(1983)に記述されているが、また、本発明に有用なプロモーター配列を提供する。
さらに、天然に生じない合成プロモーターもまた、本明細書に記載の酵母プロモーターとして機能する。例えば、ある酵母プロモーターのUAS配列は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域と結合し得、ハイブリッドプロモーターを作り出す。このようなハイブリッドプロモーターの例には、米国特許第4,876,197号および第4,880,734号に記述のように、このGAP転写活性化領域と結合したADH調節配列が包含され、これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている。ハイブリッドプロモーターの他の例には、EPO公報第164556号に記述のように、ADH2、GAL4、GAL10またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターであって、解糖酵素遺伝子(例えば、GAPまたはPyK)の転写活性化領域と組み合わせたものが包含される。さらに、酵母プロモーターには、天然に生じる非酵母由来のプロモーターであって、酵母RNAポリメラーゼと結合し転写を開始する能力を有するものが挙げられ得る。このようなプロモーターの例には、以下の参考文献に記述のものが包含される：
通常、酵母により認識される転写終止配列は、その翻訳終止コドンに対して3'に位置する調節領域であり、このプロモーターと共に、このコード配列に隣接する。これらの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写を指示する。遺伝子に由来の酵母認識終止配列(例えば、α−因子および解糖酵素をコードするもの)は、ここで使用され得る。
通常、上記成分は、プロモーター、必要に応じてリーダー、配列をコードする第VIIa因子/TF/Xa因子結合タンパク、および転写終止配列を含有し、発現構築物に組み立てられる。本明細書に記載の発現構築物は、レプリコン、例えば、宿主(例えば、酵母または細菌)において安定に維持され得る染色体外のエレメント(例えば、プラスミド)において維持され得る。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、それゆえ、例えば、発現のために酵母において、そしてクローニングおよび増幅のために原核細胞宿主において、それを維持することが可能になる。本明細書において有用なこのような酵母細菌シャトルベクターの例には、以下が包含される：Botsteinら、(1979)Gene8:17-24に記載のYEp24；Brakeら、(1984)Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:4642-4646に記載のpCl/1；およびStinchcombら、(1982)J. Mol. Biol. 158:157に記載のYRp17。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約200の範囲、通常、約10〜約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択され得る。例えば、Brakeら(上記)を参照せよ。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、このベクターが組み込むことを可能にする酵母染色体と相同な少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、この発現構築物に隣接する２つの相同配列を含有する。組み込みは、ベクター中および酵母染色体中の相同DNA間の組換えにより生じると思われる。Orr-Weaverら、Methods. Enzymol.、101：228〜245(1983)に記載されているように、組み込みベクターは、このベクター内に包含するための適切な相同配列を選択することにより、酵母中の特定の遺伝子座に方向づけられ得る。１またはそれ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく、産生される組換えタンパク質のレベルに影響を及ぼす。Rineら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：6750(1983)。ベクターに含有される染色体配列は、ベクター中の単一セグメントとして生じ得るか(このベクター全体の組み込みが起こる)、またはこの染色体中の隣接セグメントと相同でそして、このベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントとして生じ得るか(その結果、この発現構築物だけの安定な組み込みが起こり得る)、いずれかであり得る。
通常、染色体外および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーには、酵母宿主において発現し得る生合成遺伝子(例えば、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1およびALG7)、およびG418耐性遺伝子が挙げられ得る。これらは、酵母細胞において、それぞれ、ツニカマイシンおよびG418に対する耐性を与える。さらに、適切な選択マーカーはまた、毒性化合物(例えば、金属)の存在下にて、酵母に増殖する能力を提供し得る。例えば、CUP1が存在することにより、銅イオンの存在下での酵母の増殖が可能となる(Buttら、Microbiol、Rev. 51：351(1987)に記載されている)。
あるいは、上記成分は、一緒に集めて形質転換ベクターに組立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、選択マーカーから構成され、このマーカーは、上記のように、レプリコン中で維持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである。
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンかまたは組み込みベクターのいずれかであるが、形質転換のために、多くの酵母に対して開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母に対して開発されている：
変異タンパク質は、当業者に公知の方法を用いて、TFPIまたはTFPI-2をコードする組換えクローニングビヒクルの配列の適切な変異誘発により調製され得る。変異誘発技術には、部位特異的変異誘発が挙げられるが、それに限定されない。部位特異的変異誘発は、当該分野で公知の多くの方法を用いて行い得る。これらの技術は、例えば、Smith、Annual Review of Genetics、19：423(1985)に記載され、この技術のいくつかの改良法は、Methods in Enzymology、154、Ｅ部、WuおよびGrossman編(1987)、17、18、19および20章に記載されている。部位特異的変異誘発は、Gapped Duplexの部位特異的突然変異誘発法を用いても実施し得る。この一般的な手順は、Kramerらにより、上記のMethods in Enzymologyの17章に記述されている。核酸配列PCR技術（オーバーラップPCRを包含する）において点変異を作製する他の技術は、PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS、Innis、Gelfand、SninskyおよびWhite編(Academic Press、1990)に記載されている。
調剤および投与
本発明の方法により調製されたLACIは、敗血症性ショックの治療および予防に治療上効果的な濃度で投与され得る。この目的を遂げるために、好ましくは、本発明の方法により調製されたLACIは静脈内へ投与される。この投与を遂げる方法は当業者に公知である。
患者への投与前、調剤は本発明の方法により調製されたLACIに添加され得る。液体調剤が用いられ得る。例えば、これらの調剤としては、油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、塩類、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が挙げられ得る。調剤に用いられ得る炭化水素としては、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンのような糖類または糖アルコールが挙げられる。糖類またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合溶液を含み得る。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは-OH基を有するＣ4〜Ｃ8の炭化水素と定義され、そしてガラクチトール（galactitol）、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖または糖アルコールは、単独でまた組み合わせて用いられ得る。糖類または糖アルコールが水性調製物中で可溶である限りは、用いられる量に固定された制限はない。好ましくは、糖類または糖アルコール濃度は1.0w/v％と7.0w/v％との間であり、より好ましくは2.0と6.0w/v％との間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（Ｌ）体のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む；しかし、他のアミノ酸も加えられ得る。好適なポリマーは、平均分子量2,000と3,000との間のポリビニルピロリドン（PVP）、または平均分子量3,000と5,000との間のポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液のpH変化を最小にする組成の緩衝液を用いることもまた好ましい。ほとんどの任意の生理緩衝液が用いられ得るが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好ましい。最も好ましいのは、クエン酸緩衝液である。さらに、硫酸の使用は調剤の調製には避けるべきである。好ましくは、濃度は0.01〜0.3Ｍである。調剤に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第270,799号および同第268,110号に示される。
加えて、本発明の方法により調製されたLACIは、例えば、循環半減期を延長させるために、ポリマーを共有結合することで化学修飾され得る。好適なポリマー、およびペプチドにポリマーを結合させる方法は米国特許第4,766,106号、同第4,179,337号、同第4,495,285号、および同第4,609,546号に示され、これらは全てそのまま本明細書中で参考として援用される。好適なポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）である。PEGは室温で水に可溶であり、そして一般式：Ｒ(Ｏ-ＣＨ2-ＣＨ2)nＯ-Ｒ（ここでＲは水素、またはアルキル基またはアルカノール基のような保護基であり得る）を有する。好ましくは、保護基は１個と８個との間の炭素を有し、より好ましくは保護基はメチル基である。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１と1,000との間、より好ましくは２と500との間である。好ましくは、PEGは1000と40,000との間の平均分子量を有し、より好ましくは2000と20,000との間であり、最も好ましくは3,000と12,000との間である。好ましくは、PEGは少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、より好ましくはそれは１個の末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は好ましく活性化されて、インヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし、反応基のタイプおよび量は共有結合PEG/LACIを形成させるために変えられ得ることが理解される。
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた本発明において有用である。ポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（POG）などが挙げられる。POGが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、モノ、ジ、トリグリセリドにおいて、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在する同様の骨格だからである。それゆえ、この分枝鎖は必ずしも体内で外来子としてみなされない。POGはPEGと同様の範囲の好適な分子量を有する。POGの構造はKnaufら、1988, J. Bio. Chem. 263:15064-15070中に示され、そしてPOG／タンパク質接合体の説明が米国特許第4,766,106号に見出される。これらは両方ともそのまま本明細書中で参考として援用される。
液体薬学的組成物の調製後、それは分解の防止および無菌保存のために、好ましくは凍結乾燥される。液体組成物の凍結乾燥法は当業者に公知である。使用直前に、組成物は添加成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、リンゲル溶液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成によって、好ましくは、組成物は、当業者に公知の方法を用いて被験体に投与される。
感染個体への投与
本発明の方法により調製されたLACIは敗血症または敗血症性ショックの哺乳動物を治療するのに有用である。一般に、状態は、高熱（＞38.5℃）または低体温（＞35.5℃）、低血圧、頻呼吸（＞20呼吸／分）、頻拍（＞100拍／分）、白血球増加症（＞15,000細胞／mm3）、および血小板減少症（＜100,000血小板／mm3）により特徴付けられる。好ましくは、本発明の方法により調製されたLACIは、以下のように被験体が敗血症であると疑われれば直ちに投与される；フィブリノーゲンの20％を上回る降下（drop）またはフィブリン分裂産物の出現の提示、被験体の体温の上昇、および敗血症性ショックに関連する白血球増加症および低血圧の診断。上述の場合、静脈内投与が好ましい。一般的に、本発明の方法により調製されたLACIは１μg/kgと20mg/kgとの間の用量で、より好ましくは20μg/kgと10mg/kgとの間の用量で、最も好ましくは１mg/kgと７mg/kgとの間の用量で与えられる。好ましくは、ボーラス投与として与えられ、ボーラス投与後４〜６時間循環レベルを10〜20倍まで増加させる。継続的な注入もまたボーラス投与後に用いられ得る。そうであれば、本発明の方法により調製されたLACIは、５μg/kg/分と20μg/kg/分との間の用量で、より好ましくは７μg/kg/分と15μg/kg/分との間の用量で注入され得る。
本発明の方法により調製されたLACIは、敗血症性ショックの治療に効果的である他の薬剤と組み合わせて与えられ得る。例えば、以下のものが本発明の方法により調製されたLACIと組み合わせて投与され得る：根元的な細菌感染を治療し得る抗生物質；細菌細胞壁成分に対するモノクローナル抗体；敗血症経路に関与するサイトカイン（腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン-１、γ-インターフェロン、およびインターロイキン-８を含むがこれらに制限されない）と複合体を形成し得るモノクローナル抗体および可溶性レセプター；および一般に、敗血症経路中のサイトカインまたは補体タンパク質と相互作用し得、それらの効果を減少させ、かつ敗血症または敗血症性ショックを減衰させる任意の薬剤またはタンパク質。
本発明に有用な抗生物質は一般的な部類の内の以下を含む：βラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合におけるアミノ糖類（アミノグリコシド）、大環状ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサミド（napthacenecarboxamide）の多環式誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系大環状物（ポリエン）、スルファニルアミド（sulfanylarnides）由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５-ニトロ-２-フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、および他多数。他の抗生物質および上記の特定の抗生物質のさらなる改良体は、Encyclopedia of Chemical Technology、３版、Kirk-Othymer（編）、２巻、782〜1036頁（1978）および３巻、１〜78頁、Zinsser、MicroBiology、17版、W. Joklikら（編）235〜277頁（1980）、またはDorland's Illustrated Medical Dictionary、27版、W.B. Saunders Company（1988）中に見出され得る。
本発明の方法により調製されたLACIと組み合わせられ得る他の薬剤としては、敗血症経路に関与するサイトカインに対するモノクローナル抗体（PCT US90/07411に示されるような、IL-6またはM-CSFに対するモノクローナル抗体）；米国特許第4,603,106に示されるような、TNFに対するモノクローナル抗体；PCT US90/03266およびPCT US93/06120に示されるような、TNFプロホルモン産生細胞からの成熟TNFプロホルモンを切断するタンパク質のインヒビター；PCT US91/02460に示されるような、IL-１のアンタゴニスト；PCT US90/00321に示されるような、アクチビンのようなIL-６サイトカイン作用のインヒビター；およびIL-１のような種々のサイトカインのレセプターに基づくインヒビターが挙げられる。補体タンパク質に対する抗体または補体タンパク質の小分子インヒビターもまた用いられ得る。
一般的に、本発明の方法により調製されたLACIは、損傷、外傷、内毒素、TNF、ガン、IL-１、または他の薬剤もしくは状態により引き起こされる組織因子のアップレギュレーションにより生じる疾患に有用であり得る。
本発明は以下の実施例に言及することにより例証される。この実施例は特に有益な実施態様を記載する。しかし、これら実施態様は例示であって、いかなるようにも発明を制限するものとして解釈されるものではない。
実施例
実施例１
シャトルベクターpBS24が、Barrら、EXPRESSION SYSTEMS & PROCESSES FOR rDNA PRODUCTS（American Chemical Society, 1991），51〜64頁）に記載される。pBS24UbはpBS24.1の誘導体であり、そして唯一のBam HIおよびSal I制限部位、グルコース制御可能ADH2/GAPプロモーター、および合成ユビキチン（Ub）遺伝子を側面に有する発現カセットを含む。Ub融合体の構築のために、唯一のSst II部位をUb遺伝子の３'末端に作成する。Sst II部位の存在により、ユビキチン融合ペプチドを発現するヌクレオチド配列のインフレーム挿入が可能になる。挿入は合成DNAアダプターまたはPCR法の使用に従って遂げられ得る。いずれの場合も、５'結合配列は：
PCRを、図３に示される15.4kbプラスミドpLACI 4.1におけるユビキチン／TFPI遺伝子融合の構築に用いた。TFPIをコードする核酸を、プライマーLACI4およびLACI3で標準的なPCR手順を用いて増幅させた。LACI4は成熟TFPIをコードする核酸の５'末端の10ヌクレオチドとハイブリダイズし、そしてまたSst II制限部位を伴うユビキチン配列を含む。LACI3は成熟TFPIをコードする核酸の３'末端の15ヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてまたSal I制限部位を伴う後続配列（trailing sequence）を含む。これらプライマーの配列は以下のとおりである：
pLACI 4.1をSaccharomyces cerevisiaeの３株の形質転換を用いた：VH6（MAT α, cir°, leu-2-112,-3, ura3, FoA, pep4::His3）、AB122（MAT α, cir°, leu2, ura3-52, prb1-1112, pep4-3, prel-407）、およびJSC310（AB122と同様、+ADR1過剰発現）。VH6形質転換体は総タンパク質の約５％のレベルのTFPIを産生し、AB122形質転換体は総タンパク質の約10％のレベルのTFPIを産生し、そしてJSC310形質転換体は総タンパク質の約15％のレベルのTFPIを産生した。TFPIの安定性は、ユビキチン融合体として合成され、そしてユビキチンの除去後Ｎ末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が酵母細胞中で不安定（例えば、半減期＜３分）であることが示される先行の研究を考慮すると、いくらか意外である。Finley,「The Yeast Ubiquitin System」：The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces Gene Expression. (1992)を参照のこと。
実施例２
パートＡ
TFPIを、米国特許第5,212,091号（これは本明細書中に参考として援用される）、特に、第９〜10欄において開示される方法により、S.cerevisiae VH6細胞から精製した。不溶性画分（膜画分とも呼ぶ）を、TEN（50mM Tris.HCl pH7.8; 50mM NaCl; ５mM EDTA）中でDyno-Millガラスビーズ抽出によって調製した。この画分由来の全タンパク質の約３μgを、14%のSDS-PAGEゲルで泳動し、そしてニトロセルロースメンブレンに移した。ニトロセルロースブロットを、成熟TFPIペプチド配列の初めの15アミノ酸に対して生成されたウサギポリクローナル抗血清でプローブした。得られるブロット（図５）により、均一の完全長TFPIの有意なバンドが示される。不溶性画分へのTFPIの発現をまた、比較のクマシー染色した14%のSDS-PAGEゲル（図４を参照のこと）を用いて確認した。TFPIタンパク質をコードするDNAを含有するプラスミド、またはTFPIタンパク質をコードするDNAを含有しない同一のプラスミドを有する酵母細胞を増殖させた。約10μgの酵母全細胞溶解物または２つの培養物由来の不溶性画分を、ゲルに載せた。TFPI産生プラスミドを有する培養物から調製したレーンにおいてのみ、唯一の36kDバンドが検出された。
スルホン化およびＱ Sepharose▲Ｒ▼分画を、米国特許第5,212,091号において詳述されるように行った。単離されたTFPIの再折り畳みをまた、本質的に記載されるように行った。但し、透析は、５M尿素、0.3M NaCl，20mM Tris.HCl pH 7.8，0.04% NP40，２mM L-システイン、0.5mM EDTA中で、室温で４〜６時間、次いで４℃で一晩行い、その後、透析バッグを２M尿素、１mM L-システインに移して４℃で48時間おいた。Ｓ Sepharose▲Ｒ▼分画については、再折り畳みされたTFPIを、カラムに載せる前に２M尿素、50mM NaPO4、0.1M NaCl中で平衡化させた。洗浄緩衝液は、２M尿素、50mM NaPO4、0.25M NaClを含有し、そしてTFPIを２M尿素、50mM NaPO4、0.8M NaClを含有する緩衝液で段階溶出した。TFPIを含有する画分をプールし、そしてPBS/1.5M尿素に対して、４℃で一晩、透析した。
この方法によって再生された産物のN末端配列決定は、以下の正確な配列を与えた：
再生された産物をまた、第Xa因子アミド分解（amidolytic）アッセイおよびプロトロンビン凝固時間アッセイ（prothrombin time clotting assay）（両方とも、Wunら、J. Biol. Chem. 265:16096（1990）に記載されている）で試験して、活性を評価した。これらのアッセイからのデータを、図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。PBS緩衝液を第Xa因子阻害アッセイにおいてコントロールとして使用し、そしてPBS緩衝液ならびに正常なヒト血清（NHS）をプロトロンビン凝固アッセイにおいてコントロールとして使用した。酵母産生のTFPIは、約20ng/mlの50%阻害濃度で、第Xa因子活性を阻害し、そしてプロトロンビン凝固アッセイでは１μg/mlの阻害濃度を示した。これらの結果は、本発明の方法によって産生されるTFPIが、生物学的に活性であることを示している。
実施例３
本発明の方法をまた、大規模（すなわち、10リットル以上のバッチ）でTFPIを産生するために使用した。酵母AB122株をpLACI4.1で形質転換し、そしてアミノ酸を含まないYeast Nitrogen Base（Difco）を含有し、87mg/LのL-アデニン、43.5mg/LのL-トリプトファン、43.5mg/LのL-ヒスチジン、43.5mg/LのL-アルギニン、43.5mg/LのL-メチオニン、65.2mg/LのL-チロシン、109mg/LのL-フェニルアラニン、65.2mg/LのL-リジン、および８%のグルコースを補充した選択培地中で増殖させた。形質転換された細胞のアリコートを、グリセロールを15%になるように添加して-70℃で貯蔵することによって保存した。pLACI4.1で形質転換したS.cerevisiaeAB122株は、1994年７月19日にATCCに寄託されており、寄託番号74291が与えられている。
10リットルの発酵槽のための接種物を、１%v/vの凍結された形質転換培養物を前段階において記載したような新鮮な選択培地に添加することによって調製した。次いで、接種物を振とうフラスコ中で24時間〜48時間増殖させた。次いで、接種物を、10リットルの発酵容器の内容物に0.5%v/v添加した。容器中の培地は、滅菌の前に以下の成分を含んだ：
タストン 154 イースト エクストラクト: 10g/L
カゼイン ペプトン: 20g/L
アンチフォーム: 0.3ml/L
クエン酸: ４mM
KH2PO4: 20mM
(NH4)2SO4: 50mM
MnSO4: 20μM
ZnSO4: 20μM
H3BO3: 100μM
CoCl2: 10μM
Na2MoO4: 10μM
CuSO4: ２μM
グリセロール: 30g/L
次いで、発酵容器の内容物をインサイチュで滅菌し、そして以下の滅菌成分を添加して培地を完全にした：
MgSO4: 20mM
FeCl3: 100μM
グルコース: 20g/L
ピロキシジンHCl: ５mg/L
チアミンHCl: 10mg/L
D-ビオチン: 0.1mg/L
Caパントテン酸: 10mg/L
ミオ-イノシトール: 400mg/L
発酵容器での細胞の増殖の間、培地を30℃の温度に維持した。NaOHまたはリン酸を必要に応じて添加することによって、pH6.0を維持した。600r.p.mで振とうを開始し、そして必要に応じて増加させて、D.O＞30%を維持した。通気は１vvm空気であった。接種の15時間後に開始し、滅菌グルコース（25%w/v）と滅菌グリセロール（6.8%w/v）の混合液を発酵槽に0.1ml/分/Lの速度で添加した。39時間で、この混合液の添加速度を0.05ml/分/Lに減少させた。培養を96時間後に終結させた。TFPI（１mg/ml）のピーク発現は、接種後72時間までに生じた。
上述の議論および実施例は、本発明を例証するのみであり、当業者には、本発明が他の方法で行われ得ること、そして本発明は請求の範囲を参照することによってのみ規定されることが理解される。さらに、前述の明細書において引用される全ての参考文献、特許、および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：インニス，マイケル エイ．
クリシー，アルバ エイ．
(ii)発明の名称：組織因子活性インヒビターの産生
(iii)配列の数：７
(iv)連絡住所：
(A)名称：カイロン コーポレイション
(B)番地：4560 ホートン ストリート
(C)市：エミリービル
(D)州：カリフォルニア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：94608
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース ♯1.0，バージョン ♯1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：US
(B)出願日：1994年８月５日
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：サベレイド，ポール ビー．
(B)登録番号：36,914
(C)照会／記録番号：0991.001
(ix)電話回線情報：
(A)電話：510-601-2585
(B)テレファックス：510-655-3542
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：1065塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(iii)ハイポセティカル：NO
(iv)アンチセンス：NO
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：1..1056
(xi)配列：配列番号１：
(i)配列の特色：
(A)長さ：352アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２：
(i)配列の特色：
(A)長さ：276アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号３：
(i)配列の特色：
(A)長さ：９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)種類：/desc=「プライマー」
(xi)配列：配列番号４：
(i)配列の特色：
(A)長さ：23塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)種類：/desc=「プライマー」
(xi)配列：配列番号５：
(i)配列の特色：
(A)長さ：24塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸
(A)種類：/desc=「プライマー」
(xi)配列：配列番号６：
(i)配列の特色：
(A)長さ：18アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号７：
Claims (5)
- 第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質を産生する方法であって、
(a)複製可能なクローニングビヒクルで形質転換された酵母細胞を、該第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質の産生に好適な条件下でインキュベートする工程であって、該複製可能なクローン化ビヒクルが、該第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質が、該酵母細胞内で保持される、工程；
(b)該第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質を含む該形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程；
(c)該不溶性画分の第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質を単離する工程
を包含し、
該第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質は、配列番号3を含むTFPIである、方法。 - 前記第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質をコードするDNAが、インフレームで第２のヌクレオチド配列のすぐ後に位置し、前記第１および該第２のヌクレオチド配列が、一緒になって融合ペプチドをコードし、該融合ペプチドが、前記酵母細胞内で切断され、真正の第VIIa/TF/Xa因子結合タンパク質を産生し得る、請求項１に記載の方法。
- 前記第２のヌクレオチド配列がユビキチンをコードする、請求項２に記載の方法。
- 前記酵母細胞がSaccharomyces属である、請求項１に記載の方法。
- 前記酵母細胞がSaccharomyces cerevisiae種であり、VH6、AB122、およびJSC310からなる群から選択される遺伝子型を有する、請求項４に記載の方法。
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