JPH11240897A

JPH11240897A - ウロキナーゼレセプター活性のペプチドインヒビター

Info

Publication number: JPH11240897A
Application number: JP10328556A
Authority: JP
Inventors: Steven Rosenberg; ローゼンバーグスチーブン; Michael V Doyle; ブイ．ドイルマイケル
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 1999-09-07
Also published as: CA2163741A1; ATE182336T1; AU682877B2; JPH08510742A; US5656726A; DE69419623D1; NO954722D0; EP0745092A1; DE69419623T2; AU6954294A; NO954722L; KR960702846A; WO1994028014A2; WO1994028014A3; FI955720A0; NZ267291A; US5679782A; FI955720A; EP0745092B1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レ
セプターのペプチドリガンド、およびそれを調製する方
法を提供する。【解決手段】配列番号１〜２５のペプチドまたはその
活性アナログまたはその活性部分。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞生物学および
タンパク質発現の分野に関する。さらに詳細には、本発
明はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプタ
ーのペプチドリガンド、およびそれを調製する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化
因子（ｕＰＡ）は、マルチドメインセリンプロテアーゼ
であり、触媒的「Ｂ」鎖（アミノ酸１４４−４１１）、
ならびに成長因子様ドメイン（４−４３）およびクリン
グル（アミノ酸４７−１３５）からなるアミノ末端フラ
グメント（「ＡＴＦ」、アミノ酸１−１４３）を有す
る。ｕＰＡクリングルは、ヘパリンを結合するが、フィ
ブリン、リシン、またはアミノヘキサン酸は結合しない
と思われる。成長因子様ドメインは、上皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）の構造に類似性を有し、従って、「ＥＧＦ様」ド
メインとも称する。単一鎖のプロ−ｕＰＡは、プラスミ
ンにより活性化され、この鎖を開裂して二本鎖の活性形
態とし、これはジスルフィド結合により一緒に結合され
ている。

【０００３】ｕＰＡは、その特異的な細胞表面レセプタ
ー（ｕＰＡＲ）に結合する。結合相互作用は、ＥＧＦ様
ドメインにより見かけ上仲介される（Ｓ．Ａ．Ｒａｂ
ｂａｎｉら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９９２）
２６７：１４１５１−５６）。プロ−ｕＰＡの活性ｕＰ
Ａへの開裂は、プロ−ｕＰＡおよびプラスミノーゲンが
レセプター結合する場合、促進される。従って、プラス
ミンがプロ−ｕＰＡを活性化し、順次、このことがプラ
スミノーゲンを開裂することによりさらに多くのプラス
ミンを活性化する。大過剰のプロテアーゼインヒビター
が、α₂抗プラスミンであるＰＡＩ−１およびＰＡＩ−
２を含む血漿中に見出されるので、このポジティブなフ
ィードバックサイクルは、見かけ上は、細胞表面上のレ
セプターに基づくタンパク質分解に限定される。

【０００４】プラスミンは、フィブリノーゲン、フィブ
ロネクチン、およびチモーゲンのような細胞外タンパク
質を活性化または分解し得る。このため、プラスミノー
ゲン活性化因子は、細胞外タンパク質分解、フィブリン
血餅溶解、組織改造作用、発達的な細胞移動、炎症、お
よび転移を調節し得る。従って、ｕＰＡインヒビターお
よびｕＰＡレセプターアンタゴニストの開発に大きな興
味がある。Ｅ．Ａｐｐｅｌｌａら、ＪＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ（１９８７）２６２：４４３７−４０は、レ
セプター結合活性が、ＥＧＦ様ドメインに局在するこ
と、および１２−３２残基が結合に重要と思われること
を決定した。主要ドメイン（ｕＰＡ_12-32）単独では、
４０ｎＭの親和性（完全なＡＴＦより約１００倍少な
い）でｕＰＡＲを結合した。

【０００５】Ｓ．Ａ．Ｒａｂｂａｎｉら（前出）は、
ＥＧＦ様ドメインがＴｈｒ１８でフコシル化（ｆｕｃｏ
ｓｙｌａｔｅ）されることを開示し、そしてフコシル化
ＥＧＦ様ドメイン（ｕＰＡ_4-43、プロ−ｕＰＡからの開
裂により生産される）が骨肉腫細胞株ＳａＯＳ−２の細
胞分裂を促進することを報告した。対照的には、非フコ
シル化ＥＧＦ様ドメインは、フコシル化ＥＧＦ様ドメイ
ンに等しい親和性でｕＰＡＲを結合したが、細胞分裂促
進活性を示さなかった。非フコシル化ＥＧＦ様ドメイン
は、ｕＰＡＲへの結合に対してフコシル化ＥＧＦ様ドメ
インと競合し、そして観察した細胞分裂促進活性を減少
した。フコシル化または非フコシル化ＥＧＦ様ドメイン
のいずれも、Ｕ９３７線維芽細胞で細胞分裂促進をしな
かった。

【０００６】以前に、「エピトープライブラリー」は、
ランダムペプチドをコードする合成ＤＮＡを繊維状ファ
ージベクターにクローニングすることにより作製され得
ることが示唆された（ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔ
ｈ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：３０５）。コード
されたペプチドはｐＩＩＩの機能を有意に妨害せずにｐ
ＩＩＩの部分になると考えられるので、合成ＤＮＡはコ
ートタンパク質遺伝子ＩＩＩにクローニングされること
が提案された。ｐＩＩＩのアミノ末端側半分が、Ｅ．
ｃｏｌｉへのファージ感染の間、Ｆ線毛に結合すること
は公知である。それらの細胞表面上でランダムペプチド
を運び、そしてｐＩＩＩの部分として発現するこのよう
なファージは、抗体（特に、ライブラリーからのファー
ジの精製に影響する抗体を用いて）により認識されたエ
ピトープを同定する方法を提供し得ることが示唆され
た。Ｄｅｖｌｉｎ，ＰＣＴＷＯ９１／１８９８０
（本明細書中に参考として援用された）は、繊維状ファ
ージ上に提示されるランダムペプチド配列からなるライ
ブラリーを生成する方法を記載した。ライブラリーは、
特定の生物活性を有するペプチドの同定および選択を含
む多くの目的のために用いられ得る。分子を結合するリ
ガンドの１例は、可溶性または不溶性の細胞性レセプタ
ー（すなわち、膜結合レセプター）であり得るが、酵素
を含む、需要のある結合活性を有する実質的にいかなる
分子にも及び得る。類似したライブラリーの記載は、Ｄ
ｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１９８１８に見出される。本発
明は、生物活性ペプチドまたは化合物を決定するため
に、このようなライブラリー（およびペプチドの他のラ
イブラリー）をスクリーニングする方法を提供する。Ｋ
ａｎｇら、ＷＯ９２／１８６１９は、ｐＶＩＩＩ遺伝子
に挿入することにより調製されたファージライブラリー
を開示した。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウロキナー
ゼプラスミノーゲン活性化因子レセプターのペプチドリ
ガンド、およびそれを調製する方法を提供することを目
的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面は、
以下からなる群から選択されるペプチドまたはその活性
アナログまたはその活性部分である：ＡＥＰＭＰＨＳＬ
ＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号１），ＡＥＷＨＰＧＬＳ
ＦＧＳＹＬＷＳＫＴ（配列番号２），ＡＥＨＴＹＳＳＬ
ＷＤＴＹＳＰＬＡＦ（配列番号３），ＡＥＳＳＬＷＴＲ
ＹＡＷＰＳＭＰＳＹ（配列番号４），ＡＥＬＤＬＷＭＲ
ＨＹＰＬＳＦＳＮＲ（配列番号５），ＡＥＷＳＦＹＮＬ
ＨＬＰＥＰＱＴＩＦ（配列番号６），ＡＥＴＬＦＭＤＬ
ＷＨＤＫＨＩＬＬＴ（配列番号７），ＡＥＰＬＤＬＷＳ
ＬＹＳＬＰＰＬＡＭ（配列番号８），ＡＥＳＬＰＴＬＴ
ＳＩＬＷＧＫＥＳＶ（配列番号９），ＡＥＳＱＴＧＴＬ
ＮＴＬＦＷＮＴＬＲ（配列番号１０），ＡＥＳＳＬＷＲ
ＩＦＳＰＳＡＬＭＭＳ（配列番号１１），ＡＥＰＡＬＬ
ＮＷＳＦＦＦＮＰＧＬＨ（配列番号１２），ＡＥＡＷＦ
ＬＳＮＴＭＫＡＬＳＡＲＬ（配列番号１３），ＡＥＰＴ
ＬＷＱＬＹＱＦＰＬＲＬＳＧ（配列番号１４），ＡＥＩ
ＳＦＳＥＬＭＷＬＲＳＴＰＡＦ（配列番号１５），ＡＥ
ＷＩＴＳＳＰＰＬＴＱＹＬＷＧＦ（配列番号１６），Ａ
ＥＭＨＲＳＬＷＥＷＹＶＰＮＱＳＡ（配列番号１７），
ＡＥＩＫＴＤＥＫＭＧＬＷＤＬＹＳＭ（配列番号１
８），ＡＥＩＬＮＦＰＬＷＨＥＰＬＷＳＴＥ（配列番号
１９），ＡＥＬＳＥＡＤＬＷＩＴＷＦＧＭＧＳ（配列番
号２０），ＡＥＳＶＱＹＳＫＬＷＫＰＮＴＴＬＡ（配列
番号２１），ＡＥＰＬＳＬＹＱＫＫＴＬＲＨＦＡＮ（配
列番号２２），ＡＥＬＰＲＴＮＰＶＴＡＶＫＮＰＳＦ
（配列番号２３），ＡＥＱＬＮＲＳＩＰＤＬＱＦＳＭＦ
Ｎ（配列番号２４），およびＡＥＳＨＩＫＳＬＬＤＳＳ
ＴＷＦＬＰ（配列番号２５）。

【０００９】本発明の１つの局面は、以下からなる群か
ら選択される配列またはその活性部分を含むタンパク質
である：ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番
号１），ＡＥＷＨＰＧＬＳＦＧＳＹＬＷＳＫＴ（配列番
号２），ＡＥＨＴＹＳＳＬＷＤＴＹＳＰＬＡＦ（配列番
号３），ＡＥＳＳＬＷＴＲＹＡＷＰＳＭＰＳＹ（配列番
号４），ＡＥＬＤＬＷＭＲＨＹＰＬＳＦＳＮＲ（配列番
号５），ＡＥＷＳＦＹＮＬＨＬＰＥＰＱＴＩＦ（配列番
号６），ＡＥＴＬＦＭＤＬＷＨＤＫＨＩＬＬＴ（配列番
号７），ＡＥＰＬＤＬＷＳＬＹＳＬＰＰＬＡＭ（配列番
号８），ＡＥＳＬＰＴＬＴＳＩＬＷＧＫＥＳＶ（配列番
号９），ＡＥＳＱＴＧＴＬＮＴＬＦＷＮＴＬＲ（配列番
号１０），ＡＥＳＳＬＷＲＩＦＳＰＳＡＬＭＭＳ（配列
番号１１），ＡＥＰＡＬＬＮＷＳＦＦＦＮＰＧＬＨ（配
列番号１２），ＡＥＡＷＦＬＳＮＴＭＫＡＬＳＡＲＬ
（配列番号１３），ＡＥＰＴＬＷＱＬＹＱＦＰＬＲＬＳ
Ｇ（配列番号１４），ＡＥＩＳＦＳＥＬＭＷＬＲＳＴＰ
ＡＦ（配列番号１５），ＡＥＷＩＴＳＳＰＰＬＴＱＹＬ
ＷＧＦ（配列番号１６），ＡＥＭＨＲＳＬＷＥＷＹＶＰ
ＮＱＳＡ（配列番号１７），ＡＥＩＫＴＤＥＫＭＧＬＷ
ＤＬＹＳＭ（配列番号１８），ＡＥＩＬＮＦＰＬＷＨＥ
ＰＬＷＳＴＥ（配列番号１９），ＡＥＬＳＥＡＤＬＷＩ
ＴＷＦＧＭＧＳ（配列番号２０），ＡＥＳＶＱＹＳＫＬ
ＷＫＰＮＴＴＬＡ（配列番号２１），ＡＥＰＬＳＬＹＱ
ＫＫＴＬＲＨＦＡＮ（配列番号２２），ＡＥＬＰＲＴＮ
ＰＶＴＡＶＫＮＰＳＦ（配列番号２３），ＡＥＱＬＮＲ
ＳＩＰＤＬＱＦＳＭＦＮ（配列番号２４），およびＡＥ
ＳＨＩＫＳＬＬＤＳＳＴＷＦＬＰ（配列番号２５）。

【００１０】本発明の１つの局面は、以下からなる群か
ら選択されるペプチドをコードする配列またはその活性
アナログまたはその活性部分を含むオリゴヌクレオチド
である：ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番
号１），ＡＥＷＨＰＧＬＳＦＧＳＹＬＷＳＫＴ（配列番
号２），ＡＥＨＴＹＳＳＬＷＤＴＹＳＰＬＡＦ（配列番
号３），ＡＥＳＳＬＷＴＲＹＡＷＰＳＭＰＳＹ（配列番
号４），ＡＥＬＤＬＷＭＲＨＹＰＬＳＦＳＮＲ（配列番
号５），ＡＥＷＳＦＹＮＬＨＬＰＥＰＱＴＩＦ（配列番
号６），ＡＥＴＬＦＭＤＬＷＨＤＫＨＩＬＬＴ（配列番
号７），ＡＥＰＬＤＬＷＳＬＹＳＬＰＰＬＡＭ（配列番
号８），ＡＥＳＬＰＴＬＴＳＩＬＷＧＫＥＳＶ（配列番
号９），ＡＥＳＱＴＧＴＬＮＴＬＦＷＮＴＬＲ（配列番
号１０），ＡＥＳＳＬＷＲＩＦＳＰＳＡＬＭＭＳ（配列
番号１１），ＡＥＰＡＬＬＮＷＳＦＦＦＮＰＧＬＨ（配
列番号１２），ＡＥＡＷＦＬＳＮＴＭＫＡＬＳＡＲＬ
（配列番号１３），ＡＥＰＴＬＷＱＬＹＱＦＰＬＲＬＳ
Ｇ（配列番号１４），ＡＥＩＳＦＳＥＬＭＷＬＲＳＴＰ
ＡＦ（配列番号１５），ＡＥＷＩＴＳＳＰＰＬＴＱＹＬ
ＷＧＦ（配列番号１６），ＡＥＭＨＲＳＬＷＥＷＹＶＰ
ＮＱＳＡ（配列番号１７），ＡＥＩＫＴＤＥＫＭＧＬＷ
ＤＬＹＳＭ（配列番号１８），ＡＥＩＬＮＦＰＬＷＨＥ
ＰＬＷＳＴＥ（配列番号１９），ＡＥＬＳＥＡＤＬＷＩ
ＴＷＦＧＭＧＳ（配列番号２０），ＡＥＳＶＱＹＳＫＬ
ＷＫＰＮＴＴＬＡ（配列番号２１），ＡＥＰＬＳＬＹＱ
ＫＫＴＬＲＨＦＡＮ（配列番号２２），ＡＥＬＰＲＴＮ
ＰＶＴＡＶＫＮＰＳＦ（配列番号２３），ＡＥＱＬＮＲ
ＳＩＰＤＬＱＦＳＭＦＮ（配列番号２４），およびＡＥ
ＳＨＩＫＳＬＬＤＳＳＴＷＦＬＰ（配列番号２５）。

【００１１】本発明の１つの局面は、ｈｕＰＡ仲介障害
を処置するために有用な組成物であり、この組成物は以
下を有する：薬学的に受容可能な賦形剤、および以下か
らなる群から選択される有効量のペプチドまたはそのそ
の活性アナログまたはその活性部分：ＡＥＰＭＰＨＳＬ
ＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号１），ＡＥＷＨＰＧＬＳ
ＦＧＳＹＬＷＳＫＴ（配列番号２），ＡＥＨＴＹＳＳＬ
ＷＤＴＹＳＰＬＡＦ（配列番号３），ＡＥＳＳＬＷＴＲ
ＹＡＷＰＳＭＰＳＹ（配列番号４），ＡＥＬＤＬＷＭＲ
ＨＹＰＬＳＦＳＮＲ（配列番号５），ＡＥＷＳＦＹＮＬ
ＨＬＰＥＰＱＴＩＦ（配列番号６），ＡＥＴＬＦＭＤＬ
ＷＨＤＫＨＩＬＬＴ（配列番号７），ＡＥＰＬＤＬＷＳ
ＬＹＳＬＰＰＬＡＭ（配列番号８），ＡＥＳＬＰＴＬＴ
ＳＩＬＷＧＫＥＳＶ（配列番号９），ＡＥＳＱＴＧＴＬ
ＮＴＬＦＷＮＴＬＲ（配列番号１０），ＡＥＳＳＬＷＲ
ＩＦＳＰＳＡＬＭＭＳ（配列番号１１），ＡＥＰＡＬＬ
ＮＷＳＦＦＦＮＰＧＬＨ（配列番号１２），ＡＥＡＷＦ
ＬＳＮＴＭＫＡＬＳＡＲＬ（配列番号１３），ＡＥＰＴ
ＬＷＱＬＹＱＦＰＬＲＬＳＧ（配列番号１４），ＡＥＩ
ＳＦＳＥＬＭＷＬＲＳＴＰＡＦ（配列番号１５），ＡＥ
ＷＩＴＳＳＰＰＬＴＱＹＬＷＧＦ（配列番号１６），Ａ
ＥＭＨＲＳＬＷＥＷＹＶＰＮＱＳＡ（配列番号１７），
ＡＥＩＫＴＤＥＫＭＧＬＷＤＬＹＳＭ（配列番号１
８），ＡＥＩＬＮＦＰＬＷＨＥＰＬＷＳＴＥ（配列番号
１９），ＡＥＬＳＥＡＤＬＷＩＴＷＦＧＭＧＳ（配列番
号２０），ＡＥＳＶＱＹＳＫＬＷＫＰＮＴＴＬＡ（配列
番号２１），ＡＥＰＬＳＬＹＱＫＫＴＬＲＨＦＡＮ（配
列番号２２），ＡＥＬＰＲＴＮＰＶＴＡＶＫＮＰＳＦ
（配列番号２３），ＡＥＱＬＮＲＳＩＰＤＬＱＦＳＭＦ
Ｎ（配列番号２４），およびＡＥＳＨＩＫＳＬＬＤＳＳ
ＴＷＦＬＰ（配列番号２５）。

【００１２】本発明の１つの実施態様において、上記の
記ｈｕＰＡ仲介障害が、転移、不適切な脈管形成、およ
び慢性炎症からなる群から選択される、上記の組成物が
提供される。

【００１３】本発明の１つの実施態様において、上記の
ｈｕＰＡ仲介障害が、カポージ肉腫、糖尿病網膜症、お
よびリウマチ様関節炎からなる群から選択される、上記
の組成物が提供される。

【００１４】本発明の１つの実施態様において、上記の
組成物が点眼により投与される、上記の組成物が提供さ
れる。

【００１５】本発明の１つの局面は、本明細書中に開示
されたポリペプチド、およびそのアナログのセットであ
り、それは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
レセプターに結合し、そしてウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子のレセプター結合活性を阻害する。

【００１６】本発明の他の局面は、本発明のペプチドま
たはそのアナログの有効量を投与することにより、癌お
よび転移のようなウロキナーゼ調節障害を処置する方法
である。

【００１７】本発明の他の局面は、ウロキナーゼ調節障
害の処置に適切な組成物であり、薬学的に受容可能な賦
形剤と組み合わせて、本発明のペプチドまたはそのアナ
ログの有効量を含有する。

【００１８】

【発明の実施の形態】Ａ．定義用語「ｈｕＰＡ」は、特にヒトウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲン活性化因子を意味する。「ＥＧＦ様ドメイン」
は、ｈｕＰＡ分子の部分であり、そのレセプター（ｕＰ
ＡＲ）へのｈｕＰＡ結合を仲介する原因となる。ＥＧＦ
様ドメインは、時々、成長因子様ドメイン（「ＧＦ
Ｄ」）と呼ばれ、ｈｕＰＡの最初の４８残基内に位置す
る。主要残基（結合活性に必須）は１２−３２位に位置
しているが、主要残基のみを含むペプチドは、有用なレ
セプターアンタゴニストとして供するに十分に高い結合
親和性を示さない。

【００１９】「本発明のペプチド」および「ｈｕＰＡＲ
アンタゴニストペプチド」は、以下の配列の１つを有す
る：ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号
１），ＡＥＷＨＰＧＬＳＦＧＳＹＬＷＳＫＴ（配列番号
２），ＡＥＨＴＹＳＳＬＷＤＴＹＳＰＬＡＦ（配列番号
３），ＡＥＳＳＬＷＴＲＹＡＷＰＳＭＰＳＹ（配列番号
４），ＡＥＬＤＬＷＭＲＨＹＰＬＳＦＳＮＲ（配列番号
５），ＡＥＷＳＦＹＮＬＨＬＰＥＰＱＴＩＦ（配列番号
６），ＡＥＴＬＦＭＤＬＷＨＤＫＨＩＬＬＴ（配列番号
７），ＡＥＰＬＤＬＷＳＬＹＳＬＰＰＬＡＭ（配列番号
８），ＡＥＳＬＰＴＬＴＳＩＬＷＧＫＥＳＶ（配列番号
９），ＡＥＳＱＴＧＴＬＮＴＬＦＷＮＴＬＲ（配列番号
１０），ＡＥＳＳＬＷＲＩＦＳＰＳＡＬＭＭＳ（配列番
号１１），ＡＥＰＡＬＬＮＷＳＦＦＦＮＰＧＬＨ（配列
番号１２），ＡＥＡＷＦＬＳＮＴＭＫＡＬＳＡＲＬ（配
列番号１３），ＡＥＰＴＬＷＱＬＹＱＦＰＬＲＬＳＧ
（配列番号１４），ＡＥＩＳＦＳＥＬＭＷＬＲＳＴＰＡ
Ｆ（配列番号１５），ＡＥＷＩＴＳＳＰＰＬＴＱＹＬＷ
ＧＦ（配列番号１６），ＡＥＭＨＲＳＬＷＥＷＹＶＰＮ
ＱＳＡ（配列番号１７），ＡＥＩＫＴＤＥＫＭＧＬＷＤ
ＬＹＳＭ（配列番号１８），ＡＥＩＬＮＦＰＬＷＨＥＰ
ＬＷＳＴＥ（配列番号１９），ＡＥＬＳＥＡＤＬＷＩＴ
ＷＦＧＭＧＳ（配列番号２０），ＡＥＳＶＱＹＳＫＬＷ
ＫＰＮＴＴＬＡ（配列番号２１），ＡＥＰＬＳＬＹＱＫ
ＫＴＬＲＨＦＡＮ（配列番号２２），ＡＥＬＰＲＴＮＰ
ＶＴＡＶＫＮＰＳＦ（配列番号２３），ＡＥＱＬＮＲＳ
ＩＰＤＬＱＦＳＭＦＮ（配列番号２４），およびＡＥＳ
ＨＩＫＳＬＬＤＳＳＴＷＦＬＰ（配列番号２５）。

【００２０】用語「活性アナログ」は、本発明のペプチ
ドの１つまたはその活性部分の配列とは１〜７個のアミ
ノ酸が異なるポリペプチドを意味するが、まだなおｈｕ
ＰＡＲに対して５μＭ以下のＫ_dを示す。この相違は、
好ましくは保存的アミノ酸置換であり、ここではアミノ
酸は類似の特性の別の天然に存在するアミノ酸と置換さ
れる。例えば、以下の置換は、「保存的」と考える：Ｇ
ｌｙ→Ａｌａ；Ｖａｌ→Ｉｌｅ→Ｌｅｕ；Ａｓｐ→Ｇｌ
ｕ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ；およびＰｈｅ→
Ｔｒｐ→Ｔｙｒ。非保存的変化は、一般に、上記アミノ
酸の１つが、異なったグループのアミノ酸と置換するこ
とであり（例えば、ＧｌｕをＡｓｎに置換する）、もし
くは上記アミノ酸のいずれかをＣｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉ
ｓ、またはＰｒｏで置換することである。本発明のペプ
チドの「活性部分」は、ｈｕＰＡレセプター結合活性を
示すペプチドであり、そして本発明のペプチドの１つに
由来する少なくとも６個の連続アミノ酸、好ましくは少
なくとも８個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも９
つのアミノ酸であって、１７個未満のアミノ酸と一致す
る配列を含むペプチドである。本発明のｈｕＰＡＲアン
タゴニストペプチドは、ｈｕＰＡタンパク質の他の部分
に由来するペプチドを実質的には含まない。例えば、ｈ
ｕＰＡＲアンタゴニスト組成物は、２０重量％未満のｈ
ｕＰＡのＢドメイン（乾燥重量、賦形剤なし）、好まし
くは１０重量％未満のｈｕＰＡ−Ｂ、さらに好ましくは
５重量％未満のｈｕＰＡ−Ｂ、最も好ましくは検出不能
な量を含む。

【００２１】用語「融合タンパク質」は、以下の形態の
タンパク質を意味する：Ｘ₁−（ペプチド）_n−Ｘ₂ ここで、Ｘ₁およびＸ₂の少なくとも１つは、タンパク質
またはポリペプチドであり、（ペプチド）は、本発明の
ペプチド、もしくはその活性アナログまたは活性部分で
あり、そしてｎは、１から１００までの整数である。Ｘ
₁およびＸ₂は、同一または異なり得、そして同一のタン
パク質の部分であり得る（例えば、ペプチドは、別のタ
ンパク質の一次配列内の中間の位置で挿入され得る）。
Ｘ₁およびＸ₂は、ペプチド／融合タンパク質の発現を改
良するために、精製を促進するために、および／または
生物学的活性を提供するために選択され得る。本発明の
ペプチドは、同一または異なり得、そしてペプチドスペ
ーサーにより分離され得る（例えば、細胞表面上でｈｕ
ＰＡＲを架橋し得る融合タンパク質の調製が所望される
場合）。あるいは、ペプチドをタンパク質分解開裂部位
により分離し、融合タンパク質の個々の活性ペプチドへ
の開裂を容易にし得る。

【００２２】「活性ぺプトイドアナログ」は、１または
それ以上のアミノ酸が非在来性のアミノ酸により置換さ
れる本発明の１つのペプチドのアナログを意味する。ペ
プトイドは、本明細書中に参考として援用されるＢａｒ
ｔｌｅｔｔら、ＰＣＴＷＯ９１／１９７３５にさらに
詳細に記載される。一般に、保存的置換が好ましい。保
存置換は、元のアミノ酸を１つまたはそれ以上のその特
徴的な特性（例えば、電荷、疎水性、ステアリン量（ｓ
ｔｅａｒｉｃｂｕｌｋ））がその本来のアミノ酸に似
ている非在来性アミノ酸と置換する。例えば、Ｖａｌを
Ｎｖａｌと置換し得る。用語「在来性アミノ酸」は、ア
ミノ酸アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギ
ン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン
（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイ
シン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニ
ン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グル
タミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレ
オニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、
およびチロシン（Ｙ）を意味する。用語「非在来性アミ
ノ酸」は、在来性アミノ酸以外のアミノ酸である。現在
の好ましい非在来性アミノ酸は以下のとおりである：Ｎｌｅ＝Ｌ−ノルロイシン；Ａａｂｕ＝ α−アミノ酪酸；Ｈｐｈｅ＝Ｌ−ホモフェニルアラニン；Ｎｖａ＝Ｌ−ノルバリン；Ｇａｂｕ＝ γ−アミノ酪酸；Ｄａｌａ＝Ｄ−アラニン；Ｄｃｙｓ＝Ｄ−システイン；Ｄａｓｐ＝Ｄ−アスパラギン酸；Ｄｇｌｕ＝Ｄ−グルタミン酸；Ｄｐｈｅ＝Ｄ−フェニルアラニン；Ｄｈｉｓ＝Ｄ−ヒスチジン；Ｄｉｌｅ＝Ｄ−イソロイシン；Ｄｌｙｓ＝Ｄ−リシン；Ｄｌｅｕ＝Ｄ−ロイシン；Ｄｍｅｔ＝Ｄ−メチオニン；Ｄａｓｎ＝Ｄ−アスパラギン；ＤＰｒｏ＝Ｄ−プロリン；Ｄｇｌｎ＝Ｄ−グルタミン；Ｄａｒｇ＝Ｄ−アルギニン；Ｄｓｅｒ＝Ｄ−セリン；Ｄｔｈｒ＝Ｄ−スレオニン；Ｄｖａｌ＝Ｄ−バリン；Ｄｔｒｐ＝Ｄ−トリプトファン；Ｄｔｙｒ＝Ｄ−チロシン；Ｄｏｒｎ＝Ｄ−オルニチン；Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸；Ｅｔｇ＝Ｌ−エチルグリシン；Ｔｂｕｇ＝Ｌ−ｔ−ブチルグリシン；Ｐｅｎ＝ペニシラミン；Ａｎａｐ＝ α−ナフチルアラニン；Ｃｈｅｘａ＝シクロヘキシルアラニン；Ｃｐｅｎ＝シクロペンチルアラニン；Ｃｐｒｏ＝アミノシクロプロパンカルボキシレー
ト；Ｎｏｒｂ＝アミノノルボルニルカルボキシレート；Ｍａｌａ＝Ｌ−α−メチルアラニン；Ｍｃｙｓ＝Ｌ−α−メチルシステイン；Ｍａｓｐ＝Ｌ−α−メチルアスパラギン酸；Ｍｇｌｕ＝Ｌ−α−メチルグルタミン酸；Ｍｐｈｅ＝Ｌ−α−メチルフェニルアラニン；Ｍｈｉｓ＝Ｌ−α−メチルヒスチジン；Ｍｉｌｅ＝Ｌ−α−メチルイソロイシン；Ｍｌｙｓ＝Ｌ−α−メチルリシン；Ｍｌｅｕ＝Ｌ−α−メチルロイシン；Ｍｍｅｔ＝Ｌ−α−メチルメチオニン；Ｍａｓｎ＝Ｌ−α−メチルアスパラギン；Ｍｐｒｏ＝Ｌ−α−メチルプロリン；Ｍｇｌｎ＝Ｌ−α−メチルグルタミン；Ｍａｒｇ＝Ｌ−α−メチルアルギニン；Ｍｓｅｒ＝Ｌ−α−メチルセリン；Ｍｔｈｒ＝Ｌ−α−メチルスレオニン；Ｍｖａｌ＝Ｌ−α−メチルバリン；Ｍｔｒｐ＝Ｌ−α−メチルトリプトファン；Ｍｔｙｒ＝Ｌ−α−メチルチロシン；Ｍｏｒｎ＝Ｌ−α−メチルオルニチン；Ｍｎｌｅ＝Ｌ−α−メチルノルロイシン；Ｍａａｂｕ＝ α−アミノ−α−メチル酪酸；Ｍｎｖａ＝Ｌ−α−メチルノルバリン；Ｍｈｐｈｅ＝Ｌ−α−メチルホモフェニルアラニ
ン；Ｍｅｔｇ＝Ｌ−α−メチルエチルグリシン；Ｍｇａｂｕ＝ α−メチル−γ−アミノ酪酸；Ｍａｉｂ＝ α−メチルアミノイソ酪酸；Ｍｔｂｕｇ＝Ｌ−α−メチル−ｔ−ブチルグリシ
ン；Ｍｐｅｎ＝ α−メチルペニシラミン；Ｍａｎａｐ＝ α−メチル−α−ナフチルアラニン；Ｍｃｈｅｘａ＝ α−メチルシクロヘキシルアラニ
ン；Ｍｃｐｅｎ＝ α−メチルシクロペンチルアラニン；Ｄｍａｌａ＝Ｄ−α−メチルアラニン；Ｄｍｏｒｎ＝Ｄ−α−メチルオルニチン；Ｄｍｃｙｓ＝Ｄ−α−メチルシステイン；Ｄｍａｓｐ＝Ｄ−α−メチルアスパラギン酸；Ｄｍｇｌｕ＝Ｄ−α−メチルグルタミン酸；Ｄｍｐｈｅ＝Ｄ−α−メチルフェニルアラニン；Ｄｍｈｉｓ＝Ｄ−α−メチルヒスチジン；Ｄｍｉｌｅ＝Ｄ−α−メチルイソロイシン；Ｄｍｌｙｓ＝Ｄ−α−メチルリシン；Ｄｍｌｅｕ＝Ｄ−α−メチルロイシン；Ｄｍｍｅｔ＝Ｄ−α−メチルメチオニン；Ｄｍａｓｎ＝Ｄ−α−メチルアスパラギン；Ｄｍｐｒｏ＝Ｄ−α−メチルプロリン；Ｄｍｇｌｎ＝Ｄ−α−メチルグルタミン；Ｄｍａｒｇ＝Ｄ−α−メチルアルギニン；Ｄｍｓｅｒ＝Ｄ−α−メチルセリン；Ｄｍｔｈｒ＝Ｄ−α−メチルスレオニン；Ｄｍｖａｌ＝Ｄ−α−メチルバリン；Ｄｍｔｒｐ＝Ｄ−α−メチルトリプトファン；Ｄｍｔｙｒ＝Ｄ−α−メチルチロシン；Ｎｍａｌａ＝Ｌ−Ｎ−メチルアラニン；Ｎｍｃｙｓ＝Ｌ−Ｎ−メチルシステイン；Ｎｍａｓｐ＝Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギン酸；Ｎｍｇｌｕ＝Ｌ−Ｎ−メチルグルタミン酸；Ｎｍｐｈｅ＝Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン；Ｎｍｈｉｓ＝Ｌ−Ｎ−メチルヒスチジン；Ｎｍｉｌｅ＝Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン；Ｎｍｌｙｓ＝Ｌ−Ｎ−メチルリシン；Ｎｍｌｅｕ＝Ｌ−Ｎ−メチルロイシン；Ｎｍｍｅｔ＝Ｌ−Ｎ−メチルメチオニン；Ｎｍａｓｎ＝Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギン；Ｎｍｃｈｅｘａ＝Ｎ−メチルシクロヘキシルアラニ
ン；Ｎｍｇｌｎ＝Ｌ−Ｎ−メチルグルタミン；Ｎｍａｒｇ＝Ｌ−Ｎ−メチルアルギニン；Ｎｍｓｅｒ＝Ｌ−Ｎ−メチルセリン；Ｎｍｔｈｒ＝Ｌ−Ｎ−メチルスレオニン；Ｎｍｖａｌ＝Ｌ−Ｎ−メチルバリン；Ｎｍｔｒｐ＝Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン；Ｎｍｔｙｒ＝Ｌ−Ｎ−メチルチロシン；Ｎｍｏｒｎ＝Ｌ−Ｎ−メチルオルニチン；Ｎｍｎｌｅ＝Ｌ−Ｎ−メチルノルロイシン；Ｎｍａａｂｕ＝Ｎ−アミノ−α−メチル酪酸；Ｎｍｎｖａ＝Ｌ−Ｎ−メチルノルバリン；Ｎｍｈｐｈｅ＝Ｌ−Ｎ−メチルホモフェニルアラニ
ン；Ｎｍｅｔｇ＝Ｌ−Ｎ−メチルエチルグリシン；Ｎｍｇａｂｕ＝Ｎ−メチル−γ−アミノ酪酸；Ｎｍｃｐｅｎ＝Ｎ−メチルシクロペンチルアラニ
ン；Ｎｍｔｂｕｇ＝Ｌ−Ｎ−メチル−ｔ−ブチルグリシ
ン；Ｎｍｐｅｎ＝Ｎ−メチルペニシラミン；Ｎｍａｎａｐ＝Ｎ−メチル−α−ナフチルアラニ
ン；Ｎｍａｉｂ＝Ｎ−メチルアミノイソ酪酸；Ｄｎｍａｌａ＝Ｄ−Ｎ−メチルアラニン；Ｄｎｍｏｒｎ＝Ｄ−Ｎ−メチルオルニチン；Ｄｎｍｃｙｓ＝Ｄ−Ｎ−メチルシステイン；Ｄｎｍａｓｐ＝Ｄ−Ｎ−メチルアスパラギン酸；Ｄｎｍｇｌｕ＝Ｄ−Ｎ−メチルグルタミン酸；Ｄｎｍｐｈｅ＝Ｄ−Ｎ−メチルフェニルアラニン；Ｄｎｍｈｉｓ＝Ｄ−Ｎ−メチルヒスチジン；Ｄｎｍｉｌｅ＝Ｄ−Ｎ−メチルイソロイシン；Ｄｎｍｌｙｓ＝Ｄ−Ｎ−メチルリシン；Ｄｎｍｌｅｕ＝Ｄ−Ｎ−メチルロイシン；Ｄｎｍｍｅｔ＝Ｄ−Ｎ−メチルメチオニン；Ｄｎｍａｓｎ＝Ｄ−Ｎ−メチルアスパラギン；Ｄｎｍｐｒｏ＝Ｄ−Ｎ−メチルプロリン；Ｄｎｍｇｌｎ＝Ｄ−Ｎ−メチルグルタミン；Ｄｎｍａｒｇ＝Ｄ−Ｎ−メチルアルギニン；Ｄｎｍｓｅｒ＝Ｄ−Ｎ−メチルセリン；Ｄｎｍｔｈｒ＝Ｄ−Ｎ−メチルスレオニン；Ｄｎｍｖａｌ＝Ｄ−Ｎ−メチルバリン；Ｄｎｍｔｒｐ＝Ｄ−Ｎ−メチルトリプトファン；Ｄｎｍｔｙｒ＝Ｄ−Ｎ−メチルチロシン；Ｎａｌａ＝Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）；Ｎａｓｐ＝Ｎ−（カルボキシメチル）グリシン；Ｎｇｌｕ＝Ｎ−（２−カルボキシエチル）グリシ
ン；Ｎｐｈｅ＝Ｎ−ベンジルグリシン；Ｎｈｈｉｓ＝Ｎ−（イミダゾリルエチル）グリシ
ン；Ｎｉｌｅ＝Ｎ−（１−メチルプロピル）グリシン；Ｎｌｙｓ＝Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン；Ｎｌｅｕ＝Ｎ−（２−メチルプロピル）グリシン；Ｎｍｅｔ＝Ｎ−（２−メチルチオエチル）グリシ
ン；Ｎｈｓｅｒ＝Ｎ−（ヒドロキシエチル）グリシン；Ｎａｓｎ＝Ｎ−（カルバミルメチル）グリシン；Ｎｇｌｎ＝Ｎ−（２−カルバミルエチル）グリシ
ン；Ｎｖａｌ＝Ｎ−（１−メチルエチル）グリシン；Ｎａｒｇ＝Ｎ−（３−グアニジノプロピル）グリシ
ン；Ｎｈｔｒｐ＝Ｎ−（３−インドリルエチル）グリシ
ン；Ｎｈｔｙｒ＝Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェネチル）グ
リシン；Ｎｔｈｒ＝Ｎ−（１−ヒドロキシエチル）グリシ
ン；Ｎｃｙｓ＝Ｎ−（チオメチル）グリシン；およびＮｏｒｎ＝Ｎ−（３−アミノプロピル）グリシン；Ｎｃｐｒｏ＝Ｎ−シクロプロピルグリシン；Ｎｃｂｕｔ＝Ｎ−シクロブチルグリシン；Ｎｃｈｅｘ＝Ｎ−シクロヘキシルグリシン；Ｎｃｈｅｐ＝Ｎ−シクロヘプチルグリシン；Ｎｃｏｃｔ＝Ｎ−シクロオクチルグリシン；Ｎｃｄｅｃ＝Ｎ−シクロデシルグリシン；Ｎｃｕｎｄ＝Ｎ−シクロウンデシルグリシン；Ｎｃｄｏｄ＝Ｎ−シクロドデシルグリシン；Ｎｂｈｍ＝Ｎ−（２，２−ジフェニルエチル）グリ
シン；Ｎｂｈｅ＝Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グ
リシン；Ｎｎｂｈｍ＝Ｎ−（Ｎ−（２，２−ジフェニルエチ
ル）カルバミルメチル）グリシン；Ｎｎｂｈｅ＝Ｎ−（Ｎ−（３，３−ジフェニルプロ
ピル）カルバミルメチル）グリシン；Ｎｂｍｃ＝１−カルボキシ−１−（２，２−ジフェ
ニルエチルアミノ）シクロプロパン；およびＮａｅｇ＝Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン。

【００２３】用語「発現ベクター」は、本発明のｈｕＰ
ＡＲアンタゴニストポリペプチドをコードし、そして選
択した宿主細胞でのその発現に必要な配列を提供するオ
リゴヌクレオチドを意味する。発現ベクターは、一般に
転写プロモーターおよびターミネーターを含み得るか、
または内因性プロモーターに近接した取り込みを提供し
得る。発現ベクターは、通常、複製起点および１または
それ以上の選択マーカーをさらに含むプラスミドであり
得る。しかし、発現ベクターは、二者択一的に、宿主に
感染するために設計されたウイルス組換え体または宿主
ゲノム内の好ましい部位で組み込むために設計された組
み込みベクターである。発現ベクターは、シグナルリー
ダーポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをさ
らに含み得る。「作動的に連結した」場合、ｈｕＰＡア
ンタゴニストが下流に向かって、かつシグナルリーダー
とインフレームで発現され、次いで、それは、宿主によ
る細胞外培地へのｈｕＰＡＲアンタゴニストポリペプチ
ドの分泌を提供する。現在の好ましいシグナルリーダー
は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ α因子リーダーである（特に、外来のＧｌｕ−Ａｌ
ａ配列を欠失するように改変される場合）。

【００２４】用語「転写プロモーター」は、典型的には
温度、もしくは代謝産物、インヒビター、またはインデ
ューサーの存在または非存在に基づいたＤＮＡ→ｍＲＮ
Ａ転写過程の調節を提供するオリゴヌクレオチド配列を
意味する。転写プロモーターは、調節（誘導可能／抑制
可能）され得るかまたは構成性であり得る。酵母解糖酵
素プロモーターは、異種タンパク質の転写および発現を
高レベルに操作し得、そして特に好ましい。現在の好ま
しいプロモーターは、Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎら米国
特許第４，８７６，１９７号（本明細書中に参考として
援用された）に記載されるハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡ
Ｐプロモーターであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅア
ルコールデヒドロゲナーゼＩＩの上流活性部位と組み合
わせたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを含む。

【００２５】用語「宿主」は、異種ポリペプチドの発現
に適する酵母細胞を意味する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌ
ｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａなどのような種々の適切な属がある。現在好ましい
のは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母であり、特
にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
である。

【００２６】用語「ｈｕＰＡ仲介障害」は、ｈｕＰＡの
生物学的活性により引き起こされるまたは悪化する病状
または疾患を意味する。示される最初の生物学的活性
は、プラスミノーゲン活性化である。プラスミノーゲン
活性により仲介される障害は、不適切な脈管形成（例え
ば、糖尿病網膜症、角膜脈管形成、カポージ肉腫な
ど）、腫瘍細胞による転移および侵入、および慢性炎症
（例えば、リウマチ様関節炎、気腫など）を含むが、こ
れらに限定されない。フコシル化ＡＴＦまたはＥＧＦ様
ドメインはまた、腫瘍細胞に対して細胞分裂促進性であ
り、時折、自己分泌メカニズムで自己活性化する。従っ
て、本発明のｈｕＰＡＲアンタゴニストは、ｈｕＰＡ活
性化腫瘍細胞の増殖の阻害に効果的である。

【００２７】用語「有効量」は、検出可能な治療効果を
示すに十分なｈｕＰＡＲアンタゴニストポリペプチドの
量を意味する。治療効果は、例えば、所望しない組織ま
たは悪性細胞の成長阻害、不適切な脈管形成の阻害、慢
性炎症により起こる組織損傷の限定などを含むが、これ
らに限定されない。被験者の正確な有効量は、被験者の
サイズおよび健康、処置すべき状態の性質および重篤度
などに依存し得る。従って、予め正確な有効量を本明細
書に明記することは不可能である。しかし、与えられた
状況のための有効量は、本明細書中に提供した情報に基
づく一般検査により決定され得る。

【００２８】用語「薬学的に受容可能な」は、過度な毒
性を有さずに哺乳動物に投与され得る化合物および組成
物を意味する。典型的な薬学的に受容可能な塩は、塩酸
塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸
塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息
香酸塩などのような有機酸の塩を含む。

【００２９】Ｂ．一般的な方法本発明のペプチドは、固相ペプチド合成のような標準的
な化学方法により合成され得る。あるいは、所望する場
合、ペプチドは、適切な宿主で発現され得る。融合タン
パク質の部分として調製されるペプチドは、好ましく
は、宿主細胞で発現される。現在の好ましい宿主は、酵
母であり、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａなどで
あり、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。ＭＢ２
−１株およびＡＢ１１０株が現在好ましく、ＪＳＣ３０
２株およびＪＳＣ３０８株（融合タンパク質構築物）も
同様である。

【００３０】発現ベクターは、公知の方法に従って構築
され、そして典型的には、選択宿主においてプラスミド
機能を有する。ペプチドをコードしているオリゴヌクレ
オチドは、一般に、化学的に合成され得るか、または適
切な供給源（例えば、バクテリオファージライブラリ
ー）からクローン化され得る。安定なプラスミドは、一
般に、複製起点（酵母２μｏｒｉのような）ならびに形
質転換体およびプラスミドの強制維持についてのスクリ
ーニングに使用され得る１またはそれ以上の選択マーカ
ー（抗生物質耐性のような）を必要とする。ベクター
は、選択宿主細胞で機能するプロモーター、好ましく
は、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＬ、およびＡＤＨ２のような酵母
解糖酵素プロモーター由来のプロモーターを提供する。
これらのプロモーターは、高能率であり、そして宿主細
胞重量の約１０％までの異種タンパク質の発現を起こす
ために用いられ得る。現在の好ましいプロモーターは、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターをＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ上流活
性化部位と組み合わせて含むハイブリッドＡＤＨ２／Ｇ
ＡＰプロモーターである。

【００３１】発現ベクターは、プロモーターとｈｕＰＡ
Ｒアンタゴニストポリペプチド配列との間のシグナルリ
ーダー配列を理想的に提供する。このシグナルリーダー
配列は、小胞体を介するｈｕＰＡＲアンタゴニストポリ
ペプチドの輸送および細胞から細胞外培地への輸出を提
供し、それは、容易に回収され得る。酵母で機能するこ
とが公知の多くのシグナルリーダー配列が存在する。酵
母α因子リーダーが現在好ましい（本明細書中で参考と
して援用されている米国特許第４，７５１，１８０号を
参照のこと）。

【００３２】あるいは、ベクターは、本明細書中で参考
として援用されるＳｈｕｓｔｅｒ、ＰＣＴＷＯ９２／
０１８００により記載されるように、宿主ゲノムへの組
込を提供し得る。

【００３３】酵母への形質転換は、Ａ．Ｈｉｎｎｅｎ
ら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ
（１９７８）７５：１９２９−３３、またはＨ．Ｉ
ｔｏら、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８３）１５
３：１６３−６８の方法に従って実施され得る。ＤＮＡ
が宿主細胞に取り込まれた後、ベクターは、その標的配
列に相同な１またはそれ以上の部位で、酵母ゲノムに組
み込む。制限エンドヌクレアーゼを用いて、標的配列内
でベクターを開裂することによりベクターを直線状にす
ることは、この手順が組込の能率を増加するので、現在
好ましい。

【００３４】形質転換の成功の結果、組み込まれた配列
の数は、従来の遺伝子技術により増加され得る。個々の
細胞クローンは、異なった位置で組み込まれたベクター
を有し得るので、２つの適切な株の間での遺伝的交雑の
後、胞子を形成し、そして分離物の回収により、元の両
方の親株の組み込まれた配列を有する新規な酵母株を生
じ得る。他の組込形質転換株を用いるこの方法の連続し
たサイクルが、酵母宿主株中の組込プラスミドのコピー
をさらに増加するために用いられ得る。また、標準技
術、例えば、銅イオンの濃度増加とともに細胞を処理す
ること（銅耐性に関する遺伝子が、組み込みベクター中
に含まれている）により、組み込まれた配列を増幅し得
る。

【００３５】プラスミド構築のための正確な連結は、
Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎ
ｔｅｒから得たＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４株（ＣＧＳ
Ｃ＃６１３５）、または他の適切な宿主を、連結混合物
で最初に形質転換することにより確認され得る。成功し
た形質転換体を、当該分野で理解されているとおり、ア
ンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質耐
性、もしくはプラスミド構築に依存する他のマーカーを
用いることにより選択する。次いで、形質転換体由来の
プラスミドを、Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９６９）
６２：１１５９の方法に従って調製し、必要に応じて
続いて、クロラムフェニコール増幅（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅ
ｗｅｌｌ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１
１０：６６７）を行う。単離ＤＮＡを制限マッピングに
より分析し、そして／またはＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃ
ｌＡｃｉｄｓＲｅｓ（１９８１）９：３０９にさ
らに記載されるようなＦ．Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９７７）
７４：５４６３のジデオキシ法、またはＭａｘａｍお
よびＧｉｌｂｅｒｔ、ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ（１
９８０）６５：４９９の方法により配列決定する。

【００３６】融合タンパク質は、上記の方法により調製
され得る。十分に発現されるタンパク質リーダーまたは
融合パートナをともなう融合タンパク質としてペプチド
を発現することにより、ペプチドの発現を改善し得る。
例えば、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ
ＯＤ）は、融合タンパク質リーダーとして用いる場合、
酵母で高発現される。本明細書中で参考として十分に援
用されるＣｏｕｓｅｎｓら、米国特許第４，７５１，１
８０号を参照のこと。さらに、細胞外培地に融合タンパ
ク質の直接分泌を導くために、酵母α因子リーダーのよ
うな分泌リーダーを含む。また、融合タンパク質に生物
学的活性を与える融合パートナーを用いる。例えば、ｈ
ｕＰＡＲを有する細胞を殺すために細胞障害タンパク質
を使用し得る。

【００３７】ｈｕＰＡＲアンタゴニストポリペプチド、
活性部分、活性アナログ、活性ペプトイドアナログ、そ
して融合タンパク質（まとめて「アンタゴニスト」）
は、当該分野で公知の方法により活性についてアッセイ
され得る。例えば、活性部分、活性アナログ、および活
性ペプトイドアナログは、Ｈ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎら、
米国特許第４，７０８，８７１号の方法に従うことより
便利におよび効率的にスクリーニングされ得る。Ｇｅｙ
ｓｅｎは、各ピン上の独特のオリゴペプチドを用いて、
ピンの固相配置に結合した任意の選択タンパク質由来の
１セットのオーバーラップしているオリゴペプチド（例
えば、ａａ₁−ａａ₇、ａａ₂−ａａ₈、ａａ ₃−ａａ₉な
ど）を合成する方法を記載した。ピンを９６ウエルのマ
イクロタイタープレートの形式に適合するように配置
し、例えば、標識リガンドへの結合について、全てのピ
ンを同時にアッセイし得るようにする。この方法を用い
て、任意の選択アンタゴニストにおいて提示されるあら
ゆる可能なサブセットの連続する在来性および／または
非在来性アミノ酸のリガンドに対する結合親和性を容易
に決定し得る。細胞表面レセプター結合について、ネイ
ティブｈｕＰＡに対するアンタゴニストの競合をアッセ
イし得る。レセプターについての競合は、ｈｕＰＡ生物
学的活性の阻害と相関する。適切な腫瘍細胞株（例え
ば、当該分野で記載される骨肉腫細胞株ＳａＯＳ−２
株）での抗細胞分裂促進活性について、ｈｕＰＡＲアン
タゴニストをアッセイし得る。細胞分裂促進活性の阻害
は、アンタゴニストで処理した骨肉腫細胞での³Ｈ−Ｔ
の取り込みをコントロールに対して比較することにより
決定され得る。また、適切な腫瘍細胞株（例えば、ＨＯ
Ｃ−１およびＨＣＴ１１６（Ｗ．Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅ
ら、ＣａｎｃｅｒＣｏｍｍ（１９９０）２：１７
３−７９；Ｈ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｒｉｔ
ＪＣａｎｃｅｒ（１９９３）６７：５３７−４
４））での抗侵入活性についてｈｕＰＡＲアンタゴニス
トをアッセイし得る。

【００３８】ｈｕＰＡＲアンタゴニストは、経口的、局
所的、または非経口的手段により投与され、これは、皮
下および筋肉内注射、持続放出性デポ（ｓｕｓｔａｉｎ
ｅｄｒｅｌｅａｓｅｄｅｐｏｔ）の移植、静脈内注
射、鼻腔内投与などを含む。腫瘍を処置するために用い
る場合、例えば、大部分の腫瘍を除去する手術の間、ｈ
ｕＰＡＲアンタゴニストペプチドを直接的にその部位に
適用することは有益であり得る。従って、ｈｕＰＡＲア
ンタゴニストは、ｈｕＰＡＲアンタゴニストを薬学的に
受容可能な賦形剤と組合せて含む薬学的組成物として投
与され得る。このような組成物は、水溶液、乳液、クリ
ーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであ
り得る。適切な賦形剤は、水、生理食塩水、リンガー溶
液、デキストロース溶液、およびエタノール溶液、グル
コース溶液、スクロース溶液、デキストラン溶液、マン
ノース溶液、マンニトール溶液、ソルビトール溶液、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液、リン酸溶液、酢
酸溶液、ゼラチン溶液、コラーゲン溶液、Ｃａｒｂｏｐ
ｏｌ（登録商標）溶液、植物油溶液などを含む。適切な
保存剤、安定剤、抗酸化剤、抗菌剤、および緩衝化剤、
例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、
テトラサイクリンなどをさらに含み得る。処方に有用な
クリーム基剤または軟膏基剤は、ラノリン、Ｓｉｌｖａ
ｄｅｎｅ（登録商標）（Ｍａｒｉｏｎ）、Ａｑｕａｐｈ
ｏｒ（登録商標）（ＤｕｋｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）などを含み得る。他の局所的処方は、エアゾール、
包帯、および他の創傷包帯を含む。あるいは、ｈｕＰＡ
Ｒアンタゴニストを適切なポリマーマトリックスまたは
膜中に取り込みまたはカプセル化し得、局所的に処理さ
れるべき部位の近くに植え込むのに適切な持続放出性送
達デバイスを提供することである。他のデバイスは、Ａ
ｌｚｅｔ（登録商標）ミニポンプのような留置カテーテ
ルおよびデバイスを含む。眼用調製物は、Ｓｏｒｂｉ−
ｃａｒｅ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）、Ｎｅｏｄ
ｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒ
ｐ＆Ｄｏｈｍｅ）、Ｌａｃｒｉｌｕｂｅ（登録商
標）などのような市販されているビヒクルを用いて処方
され得、または本明細書中で参考として援用される米国
特許第５，１２４，１５５号に記載の局所的調製物を使
用し得る。さらに、固形形態で、特に凍結乾燥粉末で、
ｈｕＰＡＲアンタゴニストを提供し得る。凍結乾燥製剤
は、典型的には、安定剤および増量剤、例えば、ヒト血
清アルブミン、スクロース、マンニトールなどを含む。
薬学的に受容可能な賦形剤の全体的な考察は、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ

【００３９】Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂ．
Ｃｏ．）において入手可能である。

【００４０】任意の特定の障害を処置するために必要な
ｈｕＰＡＲアンタゴニストの量は、勿論、障害の性質お
よび重篤さ、被験者の年齢および状態、および当業者に
より容易に決定される他の要因に依存して変化し得る。
適切な投与量は、以下の実施例に示す方法により当業者
により決定され得る。一般的な規準として、静脈内また
は皮下に投与する約０．１０ｍｇ／Ｋｇ〜約５００ｍｇ
／ＫｇのｈｕＰＡＲアンタゴニストが、慢性炎症の組織
損傷を阻害するのに効果的である。角膜脈管形成を処置
するために、ｈｕＰＡＲアンタゴニストを、約０．０１
ｍｇ／Ｋｇ〜約５０ｍｇ／Ｋｇの濃度でゲルまたはマト
リックスに局所的に投与し得る。

【００４１】Ｃ．実施例以下に示す実施例を、当業者のさらなる指針として提供
し得、いかなるようにも本発明を限定するようには構成
されない。

【００４２】

【実施例】実施例１（ランダムペプチドをコードする
オリゴヌクレオチド）以下の構造を有するオリゴヌクレオチドを、Ｄｅｖｌｉ
ｎ、ＷＯ９１／１８９８０に記載のように、当該分野で
公知の方法を用いて合成し、そして精製した：５’ ＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧＡ
Ａ（ＮＮＳ）₁₅ＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣ
３’（配列番号２６）；５’ ＧＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧ
（ｉｉｉ）₁₅ＴＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧ
ＡＡＡＧＧＴＡＣ３’（配列番号２７）。

【００４３】（ＮＮＳ）₁₅の合成の間、等量のデオキシ
ヌクレオチドＡ、Ｃ、およびＴ、ならびに約３０％より
多いＧからなる混合物をＮのために用い、そして等量の
ＣおよびＧの混合物をＳのために用いた。デオキシイノ
シン（ｉ）を、４つの塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）の
それぞれと塩基対をなす能力のために用いた（Ｊ．Ｆ．
Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
（１９８８）２４：５３）。あるいは、他の塩基ア
ナログを、Ｊ．Ｈａｂｅｎｅｒら、ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９８８）８５：１
７３５に記載のように用い得る。

【００４４】ランダムペプチド配列をコードする上記の
ヌクレオチド配列は、アラニンおよびグルタミン酸残基
をコードするヌクレオチド配列である。これらのアミノ
酸は、Ｍ１３の野生型成熟遺伝子ＩＩＩ（ｇｅｎｅＩ
ＩＩ）タンパク質の最初の２つのアミノ末端残基に相当
するために含まれ、そして下記のように生産される融合
タンパク質の生産を促進し得る。

【００４５】直ぐ下記のランダムペプチド配列は、６つ
のプロリン残基をコードするヌクレオチド配列である。
従って、オリゴヌクレオチドは、以下のアミノ酸配列を
コードする：Ｈ₂Ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ₁₅−Ｐｒｏ₆（配列番号
２８）。

【００４６】Ｘａａは、ランダムＤＮＡ配列によりコー
ドされたアミノ酸を示す。下記のように、オリゴヌクレ
オチドをＭ１３の誘導体にクローニングし、上記のアミ
ノ酸配列を有し、そしてプロリン残基を続く成熟融合タ
ンパク質、完全野生型成熟遺伝子ＩＩＩを生産した。

【００４７】実施例２（プラスミドＭ１３ＬＰ６７の
構築）プラスミドＭ１３ＬＰ６７を用いて、ランダムペプチド
／遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質構築物を発現した。Ｍ１
３ＬＰ６７は、図１および２に示すように、Ｍ１３ｍｐ
１９由来であった。

【００４８】簡単に言えば、Ｍ１３ｍｐ１９を２つの様
式で変化させた。第１の変化は、マーカー遺伝子である
β−ラクタマーゼをビリオンのポリリンカー領域に挿入
することであった。これは、プラスミドｐＡｃ５からＰ
ＣＲ増幅により遺伝子を得ることであった。ｐＡｃ５テ
ンプレートにアニールしたオリゴヌクレオチドプライマ
ーは、以下の配列を有する：５’ ＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＡＴ
ＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧ３’（配列番号２９）５’ ＧＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＡＡ
ＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣ３’（配列番号３
０）。

【００４９】β−ラクタマーゼの増幅コピーを制限酵素
ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そして改変Ｍ１
３ｍｐ１９の複製形態をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで
切断した。所望のフラグメントをゲル電気泳動により精
製し、連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α株（ＢＲ
Ｌ）に形質転換した。挿入物を有するファージで形質転
換したＥ．ｃｏｌｉをアンピシリンプレート上で選択
した。こうして作成したファージをＪＤ３２と命名し
た。

【００５０】ファージのプラスミド形態ｐＪＤ３２（Ｍ
１３ｍｐ１９Ａｍｐ^r）を変異誘発し、２つの制限部位
ＥａｇＩおよびＫｐｎＩを、遺伝子ＩＩＩへこの領域に
コードされたアミノ酸を変化させずに導入した。この制
限部位を、Ｍ．Ｉｎｎｉｓら、「ＰＣＲＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ−ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎ
ｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９０）、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載のように、
標準的なＰＣＲインビトロ変異誘発技術を用いて導入し
た。

【００５１】ＫｐｎＩ部位を、１６１１位で配列ＴＧＴ
ＴＣＣからＧＧＴＡＣＣに変換することにより構築し
た。変異誘発を行うために用いる２つのオリゴヌクレオ
チドは、以下の配列を有する：ＬＰ１５９：ＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡ
ＧＴＣ（配列番号３１）ＬＰ１６２：ＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣ
ＴＡＡＡＧＧＡ（配列番号３２）。

【００５２】ＥａｇＩ制限部位を構築するために、ｐＪ
Ｄ３２の１６３１位の配列ＣＣＧＣＴＧを以下の２つの
オリゴヌクレオチドを用いてＣＧＧＣＣＧに変化させ
た：ＬＰ１６０：ＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡ
ＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴ（配列番
号３３）ＬＰ１６１：ＡＡＡＧＣＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴ
ＴＴＡＣＣＧ（配列番号３４）。

【００５３】さらに詳細には、プライマーＬＰ１５９お
よびＬＰ１６２、ならびにＬＰ１６０およびＬＰ１６１
を用いて得たＰＣＲ産物を、それぞれ、ＢｓｐＨＩおよ
びＫｐｎＩ、ならびにＫｐｎＩおよびＡｌｗＮＩで切断
した。これらを、Ｔ４リガーゼで、予めＢｓｐＨＩおよ
びＡｌｗＮＩで切断したＭ１３ｍｐ１９に連結し、Ｍ１
３ｍｐＬＰ６６を生成した。このベクターは、所望のＥ
ａｇＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むが、アンピシリン
耐性遺伝子β−ラクタマーゼを欠損している。従って、
ベクターＭ１３ｍｐＬＰ６７は、ＥａｇＩおよびＫｐｎ
Ｉ制限部位およびβ−ラクタマーゼを含み、ＸｂａＩお
よびＥｃｏＲＩでのベクターの切断によりｐＪＤ３２か
らβ−ラクタマーゼ配列を除去することにより作成され
た。次いで、β−ラクタマーゼ遺伝子をＸｂａＩおよび
ＥｃｏＲＩで予め切断したＭ１３ｍｐＬＰ６６のポリリ
ンカー領域に挿入した。続いてのＴ４リガーゼでの連結
により、Ｍ１３ｍｐＬＰ６７を作成し、それは、ランダ
ムペプチドライブラリーを生じるために用いた。図１お
よび２は、Ｍ１３ｍｐＬＰ６７の構築を図解する。

【００５４】実施例３（ランダムペプチドをコードする
ファージの作成）ランダムペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を有する
ファージの作成のために、Ｍ１３ＬＰ６７をＥａｇＩお
よびＫｐｎＩで切断し、そして上記の実施例１に記載の
ように作成したオリゴヌクレオチドに連結した。連結混
合物は、４５ｎｇ／μＬの切断Ｍ１３ＬＰ６７ＤＮ
Ａ、モル濃度が５倍過剰なオリゴヌクレオチド、３．６
Ｕ／μＬのＴ４リガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ）、２５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．８、１
０ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭＤＴＴ、０．４ｍＭＡ
ＴＰ、および０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡからなるもので
あった。連結混合物に添加する前に、個々のオリゴヌク
レオチドを合わせ、そして９５℃まで５分間加熱し、そ
して続いて、１５μＬのアリコートで室温まで冷却し
た。次に、連結混合物を室温で４時間、続いて１５℃で
一晩インキュベートした。次いで、この混合物を下記の
ように、Ｅ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションし
た。

【００５５】Ｍ１３ＬＰ６７のＤＮＡを、本質的にＷ．
Ｄｏｗｅｒら、ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（１９
８８）１６：６１２７に記載のように調製したＨ２４
９細胞にエレクトロポレーションした。Ｈ２４９細胞
は、ＭＭ２９４のｒｅｃＡ、ｓｕｐ°、Ｆ’ｋａｎ^R誘
導体である。簡単に言えば、４×１０⁹のＨ２４９細胞
および１μｇのＭ１３ＬＰ６７のＤＮＡを１ｍＭＨＥ
ＰＥＳからなる８５μＬの低伝導性溶液中に合わせる。
細胞／Ｍ１３ＬＰ６７ＤＮＡ混合物を、ＢＴＸエレク
トロポレーション装置（ＢＴＸＣｏｒｐ．）の冷却し
た０．５６ｍｍの間隔の電極に置き、そして５６０ボル
トの５ミリ秒パルスにかけた。

【００５６】エレクトロポレーション直後に、細胞を電
極部品から取り出し、新鮮なＨ２４９菌叢細胞と混合
し、そして４００ｃｍ²プレートにつき約２×１０⁵プラ
ークの濃度でプレートした。翌日、各プレート由来のフ
ァージを３０ｍＬの新鮮な培養液で溶出し、ＰＥＧ沈澱
し、２０％グリセロール中に再懸濁し、そして−７０℃
で冷凍保存した。約２．８×１０⁷のプラークを回収
し、そして数百回分析し、ランダムペプチド配列を有す
る近似値を決定した。ランダムペプチド配列をコードす
る領域でＤＮＡを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応
を用いて、約５０−９０％のファージが、遺伝子ＩＩＩ
の５’末端に６９塩基対の挿入物を含むことが決定され
た。これは、ランダムペプチド配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドの存在を確認した。ＰＣＲ反応を、標準技
術および以下のオリゴヌクレオチドを用いて行った：５’ ＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧ
３’（配列番号３５）５’ ＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣ
Ｇ３’（配列番号３６）。

【００５７】反応を４０サイクル行い、その後、生成物
を２％アガロースゲルで電気泳動し分離した。この結果
に基づき、２．８×１０⁷のプラーク由来のファージ
が、約２×１０⁷の異なるランダムアミノ酸配列をコー
ドすることが算出された。

【００５８】実施例４（ｈｕＰＡＲのためのパニング）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター
（ｕＰＡＲ）に親和性を有するペプチドを以下のように
同定した：１．）上記のように調製した１５マーファージ（２．５
×１０¹⁰）を、２％脱脂乳を有するＧｒａｃｅ培地中で
全長ｈｕＰＡＲ（「ｆｌｕＰＡＲ」、感染２日後）を発
現する１０６のＳｆ９細胞と、室温にて６０分間一緒に
インキュベートすることにより、選択した。結合ファー
ジを６Ｍ尿素（ｐＨ２．２）で溶出し、ｐＨを２ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌの添加により中和し、そしてアッセイし
た。結合ファージの収量は、０．００１３％（３．３×
１０⁵ｐｆｕ）であった。ファージを、プラークとして
固体寒天プレート上で増幅し、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩
水で溶出し、そしてポリエチレングリコールで沈澱し
た。２．）ラウンド１から生じるファージを、ｆｌｕＰＡＲ
でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞上で、感染２日後
に、２％脱脂乳および１０ｍＭＨＥＰＥＳを有するＤ
ＭＥＭ中の２×１０⁵のＣＯＳ細胞上の３．１×１０¹¹
のファージを用いて再選択した。ファージを、ラウンド
１で記載したように結合し、溶出し、アッセイし、そし
て増幅した。結合ファージの収量は、０．０３９％
（１．２×１０⁸ｐｆｕ）であった。３．）ラウンド２で選択したファージを、ラウンド１
（１０６Ｓｆ９細胞上の２．８×１０¹⁰ファージ）に記
載するように、ｆｌｕＰＡＲ（感染２日後）を発現する
Ｓｆ９細胞上で再選択した。このラウンドからの結合フ
ァージの収率は、５．４０％（１．５×１０⁹ｐｆｕ）
であり、結合ファージ中の実質的な強化を示している。
尿素溶出物由来のサンプルファージをクローニングし、
そしてそれらのＤＮＡを単離し、そして配列決定した。
結合を、ｆｌｕＰＡＲを発現するＳｆ９細胞およびサブ
スタンスＰレセプター（「ＳＰＲ」、コントロールとし
て）を発現するＳｆ９細胞に対してアッセイした。結果
は、以下のとおりである。

【００５９】

【表１】

【００６０】４．）２５のファージによりコードされた
ペプチドを、次いで、Ｂｏｃ化学を用いてＡｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ４３０Ａペプ
チド合成機で固相ペプチド化学により合成するか、また
は可溶性ペプチドとしてＣｈｉｒｏｎＭｉｍｏｔｏｐ
ｅｓ，Ｌｔｄ．から入手した。全てのペプチドは、Ａ
ｌａ−Ｇｌｕジペプチドをアミノ末端に含み、そしてカ
ルボキシ末端でアミド化されていた。

【００６１】バキュロウイルス由来の組換えヒトウロキ
ナーゼレセプターを、マウスＬ−細胞について先に記載
される（Ｍａｓｕｃｃｉら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ
（１９９１）２６６：８６５５）ように、短縮型の可
溶性分子として発現させた。精製レセプターを、ＮＨＳ
−ビオチンでビオチン化し、そしてストレプトアビジン
でコートした９６ウエルプレート上で、ＰＢＳ／０．１
％ＢＳＡ中に１μｇ／ｍＬで固定した。ヒトｕＰＡＡ
ＴＦ（残基１−１３５、Ｍ．Ｓｈｕｍａｎ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏから入手）を、Ｉｏｄｏｇｅｎ方
法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてヨウ素化し、トレーサーと
して使用した。１２５Ｉ−ＡＴＦを１００−５００ｐＭ
で、１ｎＭから１０μＭまでペプチド量を増加しなが
ら、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で２００μＬの全容量
で室温で２時間、３回インキュベートした。次いで、プ
レートを、ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄し、そして残存結
合放射能を測定した。

【００６２】

【表２】

【００６３】実施例５（ｈｕＰＡアンタゴニストの製
剤）化学療法で用いるのに適切なｈｕＰＡアンタゴニスト製
剤は、以下のように調製される。

【００６４】Ａ）注入可能な製剤：ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号１）２５．０ｍｇＮａ₂ＨＰＯ₄（０．５Ｍ）０．５ｍＬマンニトール（２５％）２．５ｍＬラウリル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｌａｕｒｅａｔｅ）（１％）２．５ｍＬｐＨ７．５ＰＢＳ適量２０．０ｍＬ。

【００６５】この製剤を、本明細書中で参考として援用
される米国特許第４，８１６，４４０号に示される手順
に従い調製する。製剤を非経口注入により処置されるべ
き部位に投与する。製剤はまた、一般的に結膜に直接点
眼する投与に適しており、またはエアゾールとして鼻腔
内投与に適している。あるいは、濃縮製剤（例えば、リ
ン酸緩衝化生理食塩水を２ｍＬまで減少する）は、Ａｌ
ｚｅｔ（登録商標）ミニポンプ、および処置すべき部位
に移植したミニポンプを満たすために用いられ得る。

【００６６】Ｂ）眼用調製物：ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号１）１．０ｍｇフィブロネクチン６９．０ｍｇアルブミン３７．５ｍｇ水適量３．０ｍＬＨＣｌ（０．０１Ｍ）適量ｐＨ４．０。

【００６７】この剤形を、本明細書中で参考として援用
される米国特許第５，１２４，１５５号に示される手順
に従い調製する。フィブロネクチンおよびアルブミンを
３．０ｍＬ溶液を形成するために、水に溶解し、そして
ＨＣｌを添加して４．０のｐＨとし、フィブロネクチン
を凝集沈澱させた。凝集沈澱物（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎ
ｔ）を濾過し、そしてペプチドと合わせた。次いで、混
合液をコンタクトレンズ型に入れ、そしてコンタクトレ
ンズの形状で角膜「シールド」を形成するために、型を
３０分間閉じた。シールドは、一定期間の間ペプチドを
放出し、そして眼科手術後、角膜組織の血管形成誘導を
防ぐために有用である。

【００６８】本発明は、特定の実施態様について記載さ
れる。しかし、この出願は、上記の特許請求の範囲の意
図および範囲から逸脱することなく当業者に行われ得る
それらの変化および置換を含むことが意図される。

【００６９】

【発明の効果】本発明によって、ウロキナーゼプラスミ
ノーゲン活性化因子レセプターに結合し、そしてウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のレセプター結合
活性を阻害するポリペプチド、およびそのアナログのセ
ットが得られた。

【００７０】

【配列表】

配列番号：１配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Tyr 1 5 10 15 Thr

【００７１】配列番号：２配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Trp His Pro Gly Leu Ser Phe Gly Ser Tyr Leu Trp Ser Lys 1 5 10 15 Thr

【００７２】配列番号：３配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu His Thr Tyr Ser Ser Leu Trp Asp Thr Tyr Ser Pro Leu Ala 1 5 10 15 Phe

【００７３】配列番号：４配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ser Ser Leu Trp Thr Arg Tyr Ala Trp Pro Ser Met Pro Ser 1 5 10 15 Tyr

【００７４】配列番号：５配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Leu Asp Leu Trp Met Arg His Tyr Pro Leu Ser Phe Ser Asn 1 5 10 15 Arg

【００７５】配列番号：６配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Trp Ser Phe Tyr Asn Leu His Leu Pro Glu Pro Gln Thr Ile 1 5 10 15 Phe

【００７６】配列番号：７配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Thr Leu Phe Met Asp Leu Trp His Asp Lys His Ile Leu Leu 1 5 10 15 Thr

【００７７】配列番号：８配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Pro Leu Asp Leu Trp Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Pro Leu Ala 1 5 10 15 Met

【００７８】配列番号：９配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ser Leu Pro Thr Leu Thr Ser Ile Leu Trp Gly Lys Glu Ser 1 5 10 15 Val

【００７９】配列番号：10 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ser Gln Thr Gly Thr Leu Asn Thr Leu Phe Trp Asn Thr Leu 1 5 10 15 Arg

【００８０】配列番号：11 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ser Ser Leu Trp Arg Ile Phe Ser Pro Ser Ala Leu Met Met 1 5 10 15 Ser

【００８１】配列番号：12 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Pro Ala Leu Leu Asn Trp Ser Phe Phe Phe Asn Pro Gly Leu 1 5 10 15 His

【００８２】配列番号：13 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ala Trp Phe Leu Ser Asn Thr Met Lys Ala Leu Ser Ala Arg 1 5 10 15 Leu

【００８３】配列番号：14 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Pro Thr Leu Trp Gln Leu Tyr Gln Phe Pro Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Gly

【００８４】配列番号：15 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ile Ser Phe Ser Glu Leu Met Trp Leu Arg Ser Thr Pro Ala 1 5 10 15 Phe

【００８５】配列番号：16 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Trp Ile Thr Ser Ser Pro Pro Leu Thr Gln Tyr Leu Trp Gly 1 5 10 15 Phe

【００８６】配列番号：17 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Met His Arg Ser Leu Trp Glu Trp Tyr Val Pro Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala

【００８７】配列番号：18 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ile Lys Thr Asp Glu Lys Met Gly Leu Trp Asp Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Met

【００８８】配列番号：19 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ile Leu Asn Phe Pro Leu Trp His Glu Pro Leu Trp Ser Thr 1 5 10 15 Glu

【００８９】配列番号：20 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Leu Ser Glu Ala Asp Leu Trp Ile Thr Trp Phe Gly Met Gly 1 5 10 15 Ser

【００９０】配列番号：21 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ser Val Gln Tyr Ser Lys Leu Trp Lys Pro Asn Thr Thr Leu 1 5 10 15 Ala

【００９１】配列番号：22 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Pro Leu Ser Leu Tyr Gln Lys Lys Thr Leu Arg His Phe Ala 1 5 10 15 Asn

【００９２】配列番号：23 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Leu Pro Arg Thr Asn Pro Val Thr Ala Val Lys Asn Pro Ser 1 5 10 15 Phe

【００９３】配列番号：24 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Gln Leu Asn Arg Ser Ile Pro Asp Leu Gln Phe Ser Met Phe 1 5 10 15 Asn

【００９４】配列番号：25 配列の特色：長さ：17アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列： Ala Glu Ser His Ile Lys Ser Leu Leu Asp Ser Ser Thr Trp Phe Leu 1 5 10 15 Pro

【００９５】配列番号：26 配列の特色：85塩基対長さ：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： CTTTCTATTC TCACTCCGCT GAANNSNNSN NSNNSNNSNN SNNSNNSNNS NNSNNSNNSN 60 NSNNSNNSCC GCCTCCACCT CCACC 85

【００９６】配列番号：27 配列の特色：93塩基対長さ：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列の特徴：特徴を表わす記号：miscfeature 存在位置：22..66 特徴を決定した方法：実験による他の情報： /機能＝「ランダムハイブリダイゼーショ
ン」 /証拠＝実験による /一般的な名前＝「イノシン」 /標識＝イノシン配列： GGCCGGTGGA GGTGGAGGCG Giiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiii 60 iiiiiiTTCA GCGGAGTGAG AATAGAAAGG TAC 93

【００９７】配列番号：28 配列の特色：長さ：23アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO 配列の特徴：特徴を表わす記号：Region 存在位置：3..17 他の情報： /機能＝ランダマー /記＝「ランダムアミノ酸配列」配列： Ala Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Pro Pro Pro Pro Pro Pro 20

【００９８】配列番号：29 配列の特色：長さ：36塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： GCTGCCCGAG AGATCTGTAT ATATGAGTAA ACTTGG 36

【００９９】配列番号：30 配列の特色：長さ：36塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： GCAGGCTCGG GAATTCGGGA AATGTGCGCG GAACCC 36

【０１００】配列番号：31 配列の特色：長さ：21塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： AAACTTCCTC ATGAAAAAGT C 21

【０１０１】配列番号：32 配列の特色：長さ：25塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： AGAATAGAAA GGTACCACTA AAGGA 25

【０１０２】配列番号：33 配列の特色：長さ：39塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： TTTAGTGGTA CCTTTCTATT CTCACTCGGC CGAAACTGT 39

【０１０３】配列番号：34 配列の特色：長さ：24塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： AAAGCGCAGT CTCTGAATTT ACCG 24

【０１０４】配列番号：35 配列の特色：長さ：22塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： TCGAAAGCAA GCTGATAAAC CG 22

【０１０５】配列番号：36 配列の特色：長さ：23塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO 配列： ACAGACAGCC CTCATAGTTA GCG 23

【０１０６】配列番号：37 配列の特色：長さ：22アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドハイポセティカル：NO フラグメント型：Ｎ末端配列： Ala Glu Cys Leu Asn Gly Gly Thr Ala Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser 1 5 10 15 Asn Ile His Trp Cys Asn 20

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６２９Ａ６１Ｋ 31/00 ６２９Ａ６３５６３５ 38/00 37/02 38/55 37/64 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下からなる群から選択されるペプチド
またはその活性アナログまたはその活性部分：ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ（配列番号１），ＡＥＷＨＰＧＬＳＦＧＳＹＬＷＳＫＴ（配列番号２），ＡＥＨＴＹＳＳＬＷＤＴＹＳＰＬＡＦ（配列番号３），ＡＥＳＳＬＷＴＲＹＡＷＰＳＭＰＳＹ（配列番号４），ＡＥＬＤＬＷＭＲＨＹＰＬＳＦＳＮＲ（配列番号５），ＡＥＷＳＦＹＮＬＨＬＰＥＰＱＴＩＦ（配列番号６），ＡＥＴＬＦＭＤＬＷＨＤＫＨＩＬＬＴ（配列番号７），ＡＥＰＬＤＬＷＳＬＹＳＬＰＰＬＡＭ（配列番号８），ＡＥＳＬＰＴＬＴＳＩＬＷＧＫＥＳＶ（配列番号９），ＡＥＳＱＴＧＴＬＮＴＬＦＷＮＴＬＲ（配列番号１
０），ＡＥＳＳＬＷＲＩＦＳＰＳＡＬＭＭＳ（配列番号１
１），ＡＥＰＡＬＬＮＷＳＦＦＦＮＰＧＬＨ（配列番号１
２），ＡＥＡＷＦＬＳＮＴＭＫＡＬＳＡＲＬ（配列番号１
３），ＡＥＰＴＬＷＱＬＹＱＦＰＬＲＬＳＧ（配列番号１
４），ＡＥＩＳＦＳＥＬＭＷＬＲＳＴＰＡＦ（配列番号１
５），ＡＥＷＩＴＳＳＰＰＬＴＱＹＬＷＧＦ（配列番号１
６），ＡＥＭＨＲＳＬＷＥＷＹＶＰＮＱＳＡ（配列番号１
７），ＡＥＩＫＴＤＥＫＭＧＬＷＤＬＹＳＭ（配列番号１
８），ＡＥＩＬＮＦＰＬＷＨＥＰＬＷＳＴＥ（配列番号１
９），ＡＥＬＳＥＡＤＬＷＩＴＷＦＧＭＧＳ（配列番号２
０），ＡＥＳＶＱＹＳＫＬＷＫＰＮＴＴＬＡ（配列番号２
１），ＡＥＰＬＳＬＹＱＫＫＴＬＲＨＦＡＮ（配列番号２
２），ＡＥＬＰＲＴＮＰＶＴＡＶＫＮＰＳＦ（配列番号２
３），ＡＥＱＬＮＲＳＩＰＤＬＱＦＳＭＦＮ（配列番号２
４），およびＡＥＳＨＩＫＳＬＬＤＳＳＴＷＦＬＰ（配列番号２
５）。