JP2009533446A - uPARに対して向けられる標的化結合剤および該結合剤の使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
[0001]本出願は、35U.S.C.§119のもとに、2006年4月10日出願の米国仮出願第60/790,642号に優先権を請求し、該出願は、その全体が本明細書に援用される。
[0002]本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)に対する標的化結合剤およびこうした剤の使用に関する。より具体的には、本発明は、uPARに対して向けられる完全ヒト・モノクローナル抗体に関する。記載する結合剤は、uPARの活性および/または過剰産生と関連する疾患の診断法として、そして該疾患の治療に有用である。
[0003]ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR、CD87)、GenBank寄託番号NP_002650は、55〜60kDaの非常にグリコシル化された313残基ポリペプチドであり、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)−アンカーによって、細胞膜の外葉に連結されている。該タンパク質は、3つの非常に相同なドメイン、DI、DIIおよびDIIIにフォールディングされる(Huaiら, Science 311: 656−659 2006)。uPARのN末端は、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子(uPA)結合部位(DI)を提供する(Gardsvollら, J Biol Chem 274: 37995−38003 1999)。証拠によって、ドメイン3中の残基が、リガンド結合部位の組み立てに関与し、そしてドメイン2および3がドメイン1へのuPA結合のアフィニティーを増加させることが示唆されている(Liangら, J Biol Chem 276: 28946−28953 2001)。C末端ドメイン(DIII)はプロセシングされて、残基ser282、gly283、ala284を含むグリコホスファチジルイノシトール(GPI)−アンカーが付加される。DIおよびDIIの間のリンカー領域中(Hoyer−Hansenら, Eur J Biochem 243: 21−26 1997; Andolfoら, Thromb Hemost 88: 298−306 2002)、ならびにC末端ドメイン内の残基(Beaufortら, J Immunol 172: 5450−549 2004)のタンパク質分解的切断の結果、DIIおよびDIIIを含む膜係留型、ならびにDI−DIIIまたはDII−DIIIを含むuPARの可溶性型(suPAR)の両方が存在する。糖脂質アンカーの切断はまた、細胞表面からuPARを遊離させうる(Wilhelmら, J Cell Physiol 180: 225−235 1999)。DIを取り込んだ可溶性uPARは、ウロキナーゼに結合する能力を保持する(Higaziら, J Biol Chem 270: 17375−17380 1995)。
[0011]本発明の態様は、uPARに特異的に結合し、そしてそれによってプラスミノーゲン活性化および特定のマトリックス−メタロプロテアーゼの活性化を阻害する、完全ヒト標的化結合剤に関する。標的化結合剤はまた、腫瘍細胞接着および/または浸潤、ならびに/あるいは細胞性転移も阻害する。さらに、標的化結合剤は、腫瘍増殖を減少させるのに有用である。これが達成可能な機構には、uPAのその受容体uPARへの結合を阻害するか、uPAR/uPA限局性uPA酵素活性を阻害するか、インテグリンまたはビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質との相互作用を抑止して、それによってuPARの有効濃度を減少させることのいずれかを含むことも可能であり、そしてこれらに限定されない。
[0067]さらに別の態様は、細胞接着および/または浸潤関連疾患などの疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗uPAR抗体の使用である。1つの態様において、細胞接着および/または浸潤関連疾患には、癌腫、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、結腸直腸、食道、甲状腺、膵臓、前立腺および膀胱の癌が含まれる。別の態様において、細胞接着および/または浸潤関連疾患には、限定されるわけではないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞(肝臓)癌、肉腫、頭部および頸部癌、中皮腫、胆道(胆管)癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および神経膠芽腫が含まれる。
[0069]本発明のさらに別の態様は、非新生物疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗uPAR抗体の使用である。本発明のさらに別の態様は、限定されるわけではないが、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー性結膜炎を含む、炎症性、または過剰増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における、本発明の標的化結合剤または抗uPAR抗体の使用である。
[0079]本発明の態様は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)に結合する標的化結合剤に関する。いくつかの態様において、結合剤はuPARに結合し、そしてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)のその受容体uPARへの結合を阻害する。1つの態様において、標的化結合剤はモノクローナル抗体またはその結合性断片である。
i)uPAR;または
ii)uPA/uPAR複合体
、あるいはこれらの組み合わせに結合してもよい。1つの態様において、アンタゴニストは、in vitroおよびin vivoでuPARの生物学的活性に拮抗することが可能である。アンタゴニストは、本明細書記載の抗体、例えば、完全ヒト・モノクローナル抗体2.19.2(ATCC寄託番号PTA−7474)、2.6.1(ATCC寄託番号PTA−7475)および4.18.1(ATCC寄託番号PTA−7476)から選択可能である。
[0088]1つの態様において、標的化結合剤は、1ナノモル濃度(nM)未満のKdでuPARに結合する。標的化結合剤は、500ピコモル濃度(pM)未満のKdで結合してもよい。標的化結合剤は、400ピコモル濃度(pM)未満のKdで結合してもよい。標的化結合剤は、300ピコモル濃度(pM)未満のKdで結合してもよい。別の態様において、標的化結合剤は、200pM未満のKdで結合する。
[0093]さらに、本発明の1つの態様は、標的化結合剤を産生する方法、または核酸分子を発現させて標的化結合剤を産生する条件下で、宿主細胞を培養した後、標的化結合剤を回収することによる、本発明の方法である。本発明の1つの態様は、核酸分子を発現させて抗体を産生する条件下で、宿主細胞を培養した後、抗体を回収することによって、本発明の抗体を産生する方法である。
配列表
[0111]本発明の態様には、表1に以下に列挙する特定の抗uPAR抗体が含まれる。この表は、対応する重鎖および軽鎖遺伝子の可変ドメインの配列番号とともに、各抗uPAR抗体の同定番号を報告する。各抗体は、2つの小数点で区切られた3つの数字を含む同定番号を与えられている。
[0112]別に定義しない限り、本明細書に用いる科学的用語および技術的用語は、一般の当業者に通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションと関連して利用する用語、およびこれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。
[0115]アンタゴニストは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、RNA干渉(RNAi)、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、あるいはこれらの断片またはこれらのコンジュゲートもしくは融合タンパク質であってもよい。RNAiの概説には、Milhavet O, Gary DS, Mattson MP.(Pharmacol Rev. 2003 Dec;55(4):629−48. 概説)を参照されたく、そしてアンチセンスの概説には、Opalinska JB, Gewirtz AM.(Sci STKE. 2003 Oct 28;2003(206):pe47.)を参照されたい。
[0118]用語「uPAR」は、分子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体を指す。
[0143]uPARポリペプチドに関する「活性である」または「活性」は、天然uPARポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するuPARポリペプチドの部分を指す。「生物学的」は、本明細書で用いた際、天然uPARポリペプチドの活性から生じる生物学的機能を指す。好ましいuPAR生物学的活性には、例えば、uPARが誘導する細胞接着および浸潤が含まれる。
[0145]酵素、パパインでの抗体の消化は、「Fab」断片としても知られる、2つの同一の抗原結合性断片、および抗原結合活性を持たないが、結晶化する能力を有する「Fc」断片を生じる。酵素、ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の2つのアームが連結されたままであり、そして2つの抗原結合部位を含む、F(ab’)2断片を生じる。F(ab’)2断片は、抗原を架橋する能力を有する。
[0147]「Fab」は、本明細書で用いた際、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のCH1ドメインを含む抗体断片を指す。
[0149]用語「mAb」は、モノクローナル抗体を指す。
ヒト抗体および抗体のヒト化
[0155]ヒト抗体は、ネズミまたはラットの可変および/または定常領域を所持する抗体に付随する問題のいくつかを回避する。こうしたネズミまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の迅速なクリアランスを導く可能性もあるし、あるいは患者によって抗体に対する免疫応答が生成されるのを導く可能性もある。ネズミまたはラット由来抗体の利用を回避するため、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物または動物内に、機能するヒト抗体遺伝子座を導入することによって、完全ヒト抗体を生成してもよい。
[0161]本明細書記載の抗体は、以下に記載するように、XenoMouse(登録商標)技術の利用を通じて調製された。その結果、こうしたマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生可能であり、そしてネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生は欠損している。これを達成するために利用される技術は、本明細書の背景セクションに開示する特許、出願、および参考文献に開示される。しかし、特に、マウスおよび該マウス由来の抗体のトランスジェニック産生の好ましい態様が、米国特許出願第08/759,620号、1996年12月3日出願、ならびに国際特許出願第WO 98/24893号、1998年6月11日公表、および第WO 00/76310号、2000年12月21日公表に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。その開示が本明細書に援用される、Mendezら Nature Genetics 15:146−156(1997)もまた参照されたい。
[0171]本発明の態様には、疾患に対する治療として有用な抗uPAR抗体の無菌薬学的配合物が含まれる。こうした配合物は、uPAのその受容体uPARへの結合を阻害し、それによって、例えば、血清または組織uPARが異常に上昇している病的状態を有効に治療するであろう。抗uPAR抗体は、好ましくは、uPAを強力に阻害し、そして好ましくは、ヒトにおける低頻度の投薬を可能にする、適切な作用期間を有する。作用期間延長は、皮下または筋内注射などの別の非経口投与経路による、より頻繁でなく、そしてより好適な投薬スケジュールを可能にするであろう。
[0183]本発明にしたがって、そしてuPARに関する、本明細書で産生し、そして性質決定する抗体の活性に基づいて、抗体部分より勝る他の療法様式の設計を容易にする。こうした様式には、限定されるわけではないが、進化した抗体療法剤、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、および放射標識療法、単一ドメイン抗体、抗体断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、FvまたはDab、ペプチド療法剤の生成、新規足場中のuPAR結合ドメイン、遺伝子治療、特にイントラボディ、アンチセンス療法、および小分子が含まれる。
[0187]本明細書において定義する抗腫瘍治療を、単一療法として適用してもよいし、または抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、慣用的な手術または放射線療法または化学療法を伴ってもよい。こうした化学療法には、1以上の以下のカテゴリーの抗腫瘍剤が含まれてもよい:
(i)内科的腫瘍学で用いられるような、他の抗増殖/抗新生物薬剤およびその併用、例えばアルキル化剤(例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド(temozolamide)およびニトロソ尿素);代謝拮抗剤(例えば、ゲムシタビン、ならびに5−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジンなどの抗葉酸剤、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素);抗腫瘍抗生物質(例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−C、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン);抗有糸分裂剤(例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤);およびトポイソメラーゼ阻害剤(例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン);
(ii)細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン剤(例えばタモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン)、抗アンドロゲン剤(例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン)、LHRHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト(例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン)、プロゲストゲン(例えば酢酸メゲストロール)、アロマターゼ阻害剤(例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール(vorazole)およびエキセメスタン)および5αレダクターゼの阻害剤、例えばフィナステリド;
(iii)抗浸潤剤(例えば、4−(6−クロロ−2,3−メチレンジオキシアニリノ)−7−[2−(4−メチルピペラジン−1−イル)エトキシ]−5−テトラヒドロピラン−4−イルオキシキナゾリン(AZD0530;国際特許出願WO 01/94341)およびN−(2−クロロ−6−メチルフェニル)−2−{6−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]−2−メチルピリミジン−4−イルアミノ}チアゾール−5−カルボキサミド(ダサチニブ、BMS−354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658−6661)のようなc−Srcキナーゼファミリー阻害剤、ならびにマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の他の阻害剤、またはカテプシンの阻害剤、セリンプロテアーゼ、例えばマトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼの阻害剤、ヘパラナーゼの阻害剤);
(iv)増殖因子機能の阻害剤:例えばこうした阻害剤には、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体(例えば抗erbB2抗体トラスツズマブ[ハーセプチンTM]、抗EGFR抗体パニツムマブ、抗erbB1抗体セツキシマブ[エルビタックス、C225]およびSternら Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol.54, pp11−29に開示される任意の増殖因子または増殖因子受容体)が含まれ;こうした阻害剤にはまた、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば上皮増殖因子ファミリーの阻害剤(例えばEGFRファミリー・チロシンキナーゼ阻害剤、例えばN−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−7−メトキシ−6−(3−モルホリノプロポキシ)キナゾリン−4−アミン(ゲフィチニブ、ZD1839)、N−(3−エチニルフェニル)−6,7−ビス(2−メトキシエトキシ)キナゾリン−4−アミン(エルロチニブ、OSI−774)および6−アクリルアミド−N−(3−クロロ−4−フルオロフェニル)−7−(3−モルホリノプロポキシ)−キナゾリン−4−アミン(CI 1033)、ラパチニブなどのerbB2チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、イマチニブなどの血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼの阻害剤(例えば、ファルネシル・トランスフェラーゼ阻害剤などのRas/Rafシグナル伝達阻害剤、例えばソラフェニブ(BAY43−9006))、MEKおよび/またはAKTキナーゼを通じた細胞シグナル伝達の阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、c−kit阻害剤、ablキナーゼ阻害剤、IGF受容体(インスリン様増殖因子)キナーゼ阻害剤;オーロラキナーゼ阻害剤(例えば、AZD1152、PH739358、VX−680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX−528およびAX39459)、ならびにCDK2および/またはCDK4阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が含まれる;
(v)抗血管新生剤、例えば血管内皮増殖因子の効果を阻害するもの[例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ(アバスチンTM)、ならびに4−(4−ブロモ−2−フルオロアニリノ)−6−メトキシ−7−(1−メチルピペリジン−4−イルメトキシ)キナゾリン(ZD6474; WO 01/32651の実施例2)、4−(4−フルオロ−2−メチルインドール−5−イルオキシ)−6−メトキシ−7−(3−ピロリジン−1−イルプロポキシ)キナゾリン(AZD2171; WO 00/47212内の実施例240)、バタラニブ(PTK787; WO 98/35985)およびSU11248(スニチニブ; WO 01/60814)などのVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856およびWO 98/13354に開示するものなどの化合物、ならびに他の機構によって作用する化合物(例えば、インテグリンαvβ3機能の阻害剤であるリノミド(linomide)およびアンジオスタチン];
(vi)血管損傷剤、例えばコンブレタスタチンA4、ならびに国際特許出願WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434およびWO 02/08213に開示される化合物;
(vii)アンチセンス療法、例えば抗rasアンチセンスであるISIS 2503などの上に列挙する標的に対して向けられるもの;
(viii)例えば、異常なp53、あるいは異常なBRCA1またはBRCA2などの異常な遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるものなどのGDEPT(遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法)アプローチ、および多剤耐性遺伝子治療などの化学療法または放射線療法に対する患者耐性を増加させるアプローチを含む、遺伝子治療アプローチ;ならびに
(ix)例えば、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるex−vivoおよびin−vivoアプローチ、例えばインターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクション、T細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインでトランスフェクションした樹状細胞などのトランスフェクションした免疫細胞を用いたアプローチ、サイトカインでトランスフェクションした腫瘍細胞株を用いたアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチを含む、免疫療法アプローチ。
[0190]治療の個々の構成要素を同時に、連続してまたは別個に投与することによって、こうした共同の治療を達成してもよい。こうした併用産物は、本明細書において上述する投薬量範囲内の本発明の化合物またはその薬学的に許容されうる塩、および認可された投薬量範囲内の他の薬学的活性剤を使用する。
実施例1
免疫および力価決定
免疫
[0192]それぞれ、可溶性uPAR(組換えヒトuPAR/His6、カタログ番号807−UK−100、R&D Systems, Inc.)および細胞結合uPAR(細胞表面にヒトuPARを発現しているB300.19トランスフェクタント)を用いて、免疫を行った。B300.19トランスフェクタントを生成するため、pcDNA3発現ベクター内にヒト全長uPAR cDNAを挿入した。エレクトロポレーションを介して、B300.19細胞を一過性にトランスフェクションした。蛍光活性化細胞分取(FACS)分析によって、細胞表面上のヒトuPARの発現が免疫に適したレベルであることを確認した。その開示が本明細書に援用される米国特許出願第08/759,620号、1996年12月3日出願、および国際特許出願第WO 98/24893号、1998年6月11日公表、および第WO 00/76310号、2000年12月21日公表に開示される方法にしたがって、XenoMouseTMにおける免疫のため、作戦1では、10μg/マウスの可溶性タンパク質を、そして作戦2では、1x107細胞/マウスのB300.19トランスフェクション細胞を用いた。免疫プログラムを表2に要約する。
[0193]ヒトuPARに対する抗体の力価をFACSによって試験した。免疫プログラム終了時、実施例2に記載するように、エレクトロポレーションによって、マウス骨髄腫細胞、ならびに免疫したマウスの脾臓およびリンパ節から単離したリンパ球を用いて、融合を実行した。
実施例2
リンパ球回収、B細胞単離、融合およびハイブリドーマの生成
[0194]免疫したマウスを頸椎脱臼によって屠殺し、そして流入領域リンパ節を採取し、そして各コホートからプールした。DMEM中ですりつぶすことによって、リンパ系細胞を解離させて、組織から細胞を遊離させ、そして細胞をDMEM中に懸濁した。細胞を計数し、そして1億個のリンパ球あたり0.9mlのDMEMを細胞ペレットに添加して、細胞を穏やかにしかし完全に再懸濁した。1億個の細胞あたり、100μlのCD90+磁気ビーズを用いて、磁気ビーズと細胞を4℃で15分間インキュベーションすることによって、細胞を標識した。最大108陽性細胞(または最大2x109総細胞)を含有する磁気標識細胞懸濁物をLS+カラム上に装填し、そしてカラムをDMEMで洗浄した。総流出物をCD90陰性分画(これらの細胞の大部分は、B細胞であると期待された)として収集した。
[0197]調節条件:電圧:50V、時間:50秒。
[0198]電圧:3000V、時間:30μ秒で膜破壊
[0199]融合後保持時間:3秒
[0200]ECF後、細胞懸濁物を、無菌条件下で、融合チャンバーから注意深く除去し、そしてL−グルタミン、pen/strep、OPI(オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシ・インスリン)(すべてSigma)およびIL−6(Boehringer Mannheim)を補充した、同体積のハイブリドーマ培地(DMEM、JRH Biosciences)、15%FBS(Hyclone)を含有する無菌試験管内に移した。細胞を37℃で15〜30分間インキュベーションし、そして次いで、400xg(1000rpm)で5分間遠心分離した。小体積のハイブリドーマ選択培地(0.5xHA(Sigma、カタログ番号A9666)を補充したハイブリドーマ培地)中に細胞を穏やかに再懸濁し、そして96ウェルプレートあたり、総数5x106 B細胞およびウェルあたり200μlの最終プレーティングに基づいて、さらなるハイブリドーマ選択培地を用いて、体積を適切に調整した。細胞を穏やかに混合し、そして96ウェルプレート内にピペッティングし、そして増殖を可能にした。第7日または第10日、培地の半分を除去し、そして細胞にハイブリドーマ選択培地を再供給した。
細胞に結合したhu−uPARへの結合
[0202]蛍光測定微量体積アッセイ技術(FMAT)を用いて、ヒトuPARを発現するようにトランスフェクションしたネズミ・プレB細胞株B300.19(ATCC)、および対照としてのB300.19親細胞を用いて、細胞に結合したuPARへの抗体の結合を試験した。アッセイに、5,000細胞/ウェルを使用した。マウス抗ヒトuPAR mAb(R&E Systems、MAB807)を陽性対照試薬として用い、一方、G2 KLH上清(1:10)を陰性対照試薬として用いた。400ng/mlのヤギ抗ヒトIgG Cy5コンジュゲート(マウス抗体対照には、ヤギ抗マウスIgG Cy5コンジュゲート)を用いて、結合した抗体を検出した。それぞれ、5μg/mlおよび2.5μg/mlのヤギ抗ヒトκ−PEまたはヤギ抗ヒトγ−Cy5コンジュゲート(どちらもJackson Immune Researchから購入した)の両方を用いて、結合した抗体を検出することによって、FACS分析によって陽性株を確認した。染色された各色素に関して、陽性および陰性細胞の間の幾何平均値の比を表にした。1.95より高い比をヒットと見なした。各融合由来のヒトγおよびκ特異的ヒットの数を表3に列挙する。
競合的結合
[0203]このアッセイにおいて、FACS分析によって、抗体が、細胞に結合したuPARへのヒトuPAの結合を阻害する能力を試験した。簡潔には、ネズミ線維芽細胞L929細胞(ATCC)をトランスフェクションして、ヒトuPARを発現させた。99%生存率のトランスフェクタントを、1:2希釈の上清と、4℃で一晩インキュベーションした。洗浄後、細胞を500ng/ml FITC標識tc−uPA(Molecular Systemsから購入)と1時間インキュベーションした。ビオチンとコンジュゲート化されたウサギ抗FITC(2.5μg/ml、Molecular Probesから購入)を用いて、結合したFITC−uPAを検出した。シグナルを増幅するため、三次検出試薬、ストレプトアビジン(strapavidin)−Cy5コンジュゲート(SA−Cy5、2.5μg/ml、Jackson Immune Researchから購入)を使用した。モノクローナル抗ヒトuPAR抗体MAB807(R&D Systems、受容体−リガンド結合を中和)を陽性対照試薬として用いた。
非ヒト霊長類に対する交差反応性
[0205]カニクイザル由来のuPARをクローニングし、そしてCHOK1細胞表面上で発現させた。このアッセイにおいて、FACS分析によって、細胞に結合したカニクイザルuPARへの抗体の結合(親細胞を陰性対照とする)を試験した。ネズミ抗ヒトuPAR抗体MAB807(R&D Systems)を陽性対照試薬として使用した。簡潔には、99%生存率のCHOK1/cyno−uPARトランスフェクタントを、1:2希釈の上清と、4℃でインキュベーションした。どちらもJackson Immune Researchから購入した、ヤギ抗ヒトγ鎖Cy5コンジュゲート(5μg/ml)および抗ヒトκ鎖PEコンジュゲート(2.5μg/ml)両方を用いて、結合したヒト抗体を検出した。染色された各色素に関して、陽性および陰性細胞の間の幾何平均値の比を見いだした。1.95より高い比をヒットと見なした。uPA/uPAR結合に阻害活性を示した株(中和剤)のみをこのアッセイに供した。表5に要約するように、試験した102株のうち90が、CHOK1細胞表面上に発現されるcyno−uPARに結合する能力を示した。以下の実施例12に示すように、30の候補をクローニングし、そして精製した後、カニクイザルuPARに対する交差反応性が確認された。
動力学的アッセイ
高抗原(HA)定量化(ELISA)
[0206]以下に記載する限定抗原定量化アッセイと比較して、より多量のuPARで、ELISAプレートをコーティングした(4.2μg/ml)。抗体(Ab)を含有する試料を、uPARでコーティングしたELISAプレート上で力価決定し、そして一晩インキュベーションして、適切な平衡までAb結合を可能にした。試料中のAbの力価決定は、1:200〜1:19,531の希釈範囲を含んだ。既知の濃度のuPAR特異的抗体の標準曲線を用いて、アッセイの直線範囲を定義した。直線範囲内のデータを用いて、各力価決定試料中のuPAR特異的Abの相対的濃度を得た。高uPAR濃度および一晩インキュベーションは、Abアフィニティーの効果を限定し、各試料中に存在するuPAR特異的Abの相対量の定量化を可能にした。
[0207]以下に記載する高抗原定量化アッセイと比較して、より少量のuPARで、ELISAプレートをコーティングした(320、160、80、40および20ng/ml)。抗体(Ab)(1:25希釈)の1つの濃度を含有する試料を一晩インキュベーションして、Ab結合が平衡に近づくのを可能にした。低抗原濃度は、抗体濃度の効果を限定し、相対的アフィニティーに基づいた、抗体のランキングを可能にした。
特異性研究
[0209]uPARに最も近い相同体は、ヒトLy6eである(約36%類似性)。この研究では、Ly6eに交差反応したすべての抗体を同定し、そして排除した。
実施例8
プラスミノーゲン活性化アッセイ
[0214]uPARを発現することが知られるヒト組織細胞(histocytic)リンパ腫細胞株U937(ATCC)をこのアッセイに使用した。細胞表面uPARに結合した際、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(scuPA)は活性化されてuPAになることが可能であり、そしてプラスミノーゲンをプラスミンに切断することが可能である。後者は、D−Val−Leu−Lys 7−アミド−4−メチルクマリン(VLK−AMC、Sigmaカタログ番号V3138)を切断して、そして蛍光AMC色素を放出する。したがって、アッセイ系中の蛍光単位の強度は、細胞表面uPARに結合したuPAの量の指標となる。uPARに対する中和mAbは、scuPAの結合を阻害し、そしてしたがって、蛍光を抑制すると期待された。
接着アッセイ
[0218]96ウェル・マイクロタイタープレートを、リン酸ナトリウム(pH9)中、ビトロネクチン(5μg/ml)で、4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを3%BSAで、室温で少なくとも1時間ブロッキングした。2.5mlの50mMグリシン−HClおよび100mM NaCl(pH3.0)を用いて、U937細胞を氷上で3分間、酸ストリッピングした。次いで、0.5mlの500mM HEPESおよび100mM NaCl(pH7.0)によって、酸性細胞懸濁物を中和した。
実施例10
浸潤アッセイ
[0224]MatrigelTM(BD Bioscienceカタログ番号356237、ロット番号007024−7.7mg/ml)を4℃の冷蔵庫中、氷上で一晩、解凍した。孔サイズ8μmのBD 24ウェルTranswellプレート中の各ウェルに、80μlのゲルを添加し、そして細胞接着前に、37℃で90分間インキュベーションした。細胞解離溶液(Sigma)を用いて、DMEM(0.2%FCS)培地中、1x105細胞/mlで、HT−1080細胞を再懸濁した。100μl(1x104細胞)の細胞懸濁物を無菌エッペンドルフ試験管にアリコットし、そしてときどき混合しながら、0.1、1.0、および10μg/mlの最終濃度のmAbと、37℃で1時間プレインキュベーションした。未処理対照試料もまた、ときどき混合しながら、37℃で1時間プレインキュベーションした。
低および高解像度BIACORETMを用いたアフィニティーの決定
低解像度Biacore TM
[0227]低解像度BiacoreTM試験のため、アフィニティー決定に関して、31のハイブリドーマ細胞株産物またはハイブリドーマ上清のセレクションを試験した。ルーチンのアミンカップリングを用いて、CM5 BiacoreTMチップ上の高密度ヤギ抗ヒト抗体表面を調製した。100μg/ml BSAを含有するHBS−P泳動緩衝液(10mM HEPES[pH7.4]、150nM NaCl、0.005%サーファクタントP20)中、すべてのmAbをおよそ6μg/mlに希釈した。10μl/分で30秒間の接触時間を用い、その後、mAbベースラインの安定化のため、100μl/分の流速で5分間の洗浄を行って、各mAbを別個のフローセル上で捕捉した。次に、hu−uPAR(R&D Systems、ロットALH01402A)を、全表面に312nM(23℃)で90秒間注入した後、5分間解離させた(100μl/分の流速)。4分間のhu−uPAR注入(312nM、50μl/分の流速)で、4つのmAbを再分析した。泳動緩衝液中ですべての抗原試料を調製した。全捕捉/注入サイクル後に、146mMリン酸(pH1.5)を15秒間1回パルス処理して、表面を再生した。
[0229]CLAMP(David G. MyszkaおよびThomas Morton(1998)“CLAMP(c): a biosensor kinetic data analysis program,” TIBS 23, 149−150)を用いて、1:1相互作用モデルにデータを広範囲で適合させて、結合動力学を決定した。データを適合させる際に、物質移動係数を用いた。動力学分析結果を表7aに列挙する。分析中に用いたmAb上清もまた示す。高アフィニティーから低アフィニティーにmAbをランキングする。
[0231]大部分のmAbが1:1モデルに非常によく適合したことを考慮すると、株産物低解像度BiacoreTMから得たアフィニティーランキングは、信頼性があると考えられた。3つのクローニングおよび精製mAbの高解像度BiacoreTMを用いたKd決定を、別個の実験で行った。
マウスおよびサルuPARに対する交差反応性
[0234]マウス交差反応性を決定するため、過剰な可溶性マウスuPARを用いた競合アッセイにおいて、U937細胞表面上に発現されたヒトuPARへのmAb結合を検出した。アッセイ中、uPARを発現している細胞にmAbを曝露する前に、過剰量の組換えマウスuPARをmAbとプレインキュベーションした。mAbがマウスuPARと交差反応する場合、プレインキュベーションはmAbをマスキングし、したがって、mAbはヒトuPARに結合しないであろう。
カニクイザル・アフィニティー
[0240]KinExA(登録商標)法を用いて、いくつかの抗体の動力学的測定を評価した。この方法は、平衡時の正式なアフィニティー測定の、溶液に基づく測定を伴う。R&D Systemsから購入した組換えヒトuPAR(アミノ酸1〜303)を、NHS−Sepharoseビーズにカップリングした。1M Tris中の10mg/ml BSAで、ビーズ上の残った活性基をブロッキングし、そして製造者に推奨されるように、ブロッキング溶液中に保存した。ヒトuPARとカップリングしているビーズが固相として働く、自動化フローイムノアッセイ系KinExA 3000を用いて、KinExA実験を実行した。
内在化アッセイ
[0243]U937細胞を用いたuPAR内在化を誘導する能力に関して、実施例8由来の8つのmAbを試験した。100,000細胞を含有する細胞懸濁物を、2つ組で、V底プレートの各ウェル内にピペッティングした。2つのV底プレートを用意し、一方は抗体複合体での内在化の間、37℃で維持し、そしてもう一方は4℃でインキュベーションした。8つのuPAR mAbの各々を、5μg/mlで、氷上でU937細胞と15分間インキュベーションした。氷上でのインキュベーションは、一次mAbの内在化を防止するために必要であった。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で洗浄した。続いて、冷FACS緩衝液中、5μg/mlのalexa647標識ヤギ抗ヒトF(ab)(Invitrogenカタログ番号A21249)100μl中、細胞を氷上で15分間インキュベーションした。これによって、いかなる内在化も許さずに、結合したuPAR mAbにヤギFABが結合することが可能になった。氷上で15分間インキュベーションした後、1つのプレートを氷上に維持し、一方、他方のプレートを37℃で1時間インキュベーションした。
[0246][(37ストリップ−4ストリップ)/(4ストリップなし−4ストリップ)]x100
[0247]式中、「37ストリップ」は、TCEPを用いた、37℃での幾何平均であり;
「4ストリップ」は、TCEPを用いた、氷上での幾何平均であり;
「4ストリップなし」は、TCEPを用いない、氷上での幾何平均である(表10を参照されたい)。
表11. 15のuPAR mAbのin vitro性質決定アッセイ結果の要約
実施例15
uPAR抗体の構造分析
[0250]抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列決定して、DNA配列を決定した。各ガンマおよびカッパ鎖の組み合わせに関して、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含めて、配列表に、抗uPAR抗体の完全配列情報を提供する。可変重鎖配列を分析して、VHファミリー、D領域配列およびJ領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳して、一次アミノ酸配列を決定し、そして生殖系列VH、DおよびJ領域配列に比較して、体細胞超変異を評価した。
[0255]特定の抗体が、アミノ酸レベルで、それぞれの生殖系列配列と異なる場合、抗体配列を生殖系列配列に突然変異させ直してもよいこともまた認識すべきである。こうした訂正突然変異は、標準的分子生物学的技術を用いて、1つ、2つ、3つまたはそれより多い位で、あるいは突然変異位のいずれかの組み合わせで、生じてもよい。限定されない例として、表19は、mAb 4.18.1の軽鎖配列(配列番号52)が、FR1領域中のSerからPheの突然変異(突然変異1)、FR1領域中のValからMetの突然変異(突然変異2)、FR2領域中のLysからThrの突然変異(突然変異3)、FR3領域中のIleからPheの突然変異(突然変異4)、およびFR3領域中のSerからIleの突然変異(突然変異5)を通じて、対応する生殖系列配列(配列番号66)と異なることを示す。したがって、mAb 4.18.1の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異1を変化させて、突然変異1の部位で生殖系列配列を得てもよい。さらに、mAb 4.18.1の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異2または突然変異3を変化させて、突然変異2または突然変異3の部位で生殖系列配列を得てもよい。さらに、mAb 4.18.1の軽鎖をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列を修飾して、突然変異1および突然変異2の両方、または2以上の突然変異の任意の他の組み合わせを変化させて、これらの特定の部位で生殖系列配列を得てもよい。以下の表12〜17は、mAb 2.19.2、2.6.1および4.18.1に関して、生殖系列からのこうした変動の位置を例示する。各列は、太字で示した位置の生殖系列および非生殖系列残基のユニークな組み合わせを表す。
uPAR結合エピトープの同定
[0256]抗uPAR抗体がマウスuPARと交差反応するのに失敗したため、本発明者らは、いくつかのマウスuPAR−ヒトuPARキメラタンパク質を生成して、抗体結合に関与するドメインを同定した。各々、C末端Hisタグを含む、ネズミD1/ヒトD2D3;ネズミD1/ヒトD2/ネズミD3;およびヒトD1D2/ネズミD3uPARを含むキメラ・ヒト−ネズミuPARを、HEK293T細胞中、分泌タンパク質として発現した。培養上清のウェスタンブロッティングによって、2.6.1、2.19.2、および4.18.1の結合部位を決定し;抗His mAbを用いた検出によって、適切な組換えタンパク質が発現されていることを立証した。2.19.2の結合エピトープはドメインIに存在し、そして2.6.1は、主に、ドメインII/III内のエピトープと相互作用し、そして4.18.1はドメインII中のエピトープと相互作用する(図6を参照されたい)。
表20.エピトープ・ビニングに用いたヌクレオチドおよびアミノ酸配列
in vivoでの腫瘍増殖および転移の阻害
[0258]安定してGFP(MDA MB231−GFP細胞)を発現しているMDA MB231細胞を培養中で増殖させて、そして85%集密で採取した。総数5x105の腫瘍細胞を生理食塩水/20%MatrigelTM中で、雌Balb/c nu/nuマウスの乳房脂肪体内に接種した。移植3日後、マウスに以下を投与した:対照の非特異的アイソタイプ一致IgG4;ドキソルビシンRx、5mg/kg i.p.、週1回、2週間;対照または抗ヒトuPAR mAb 0.5mg/マウスi.p.、実験期間中、週1回。キャリパーを用いて、週1回、腫瘍増殖を測定し、そして公式(axb2/2)、式中、a−長径の長さであり、b−垂直小径の幅である、にしたがって腫瘍体積を計算した(図7)。未治療対照腫瘍増殖(図7には示さない)は、IgG4アイソタイプ対照に比較して、有意には異ならなかった。
[0261]図7〜9に立証するように、抗uPAR抗体は、原発腫瘍増殖を阻害し、そして離れた臓器への転移発生を有意に阻害した。原発腫瘍の免疫組織化学検査は、増殖マーカーKi67に対する効果をまったく示さなかったが、対照に比較して、pMAPKおよびpFAKのレベルの一貫した阻害があった。予期せぬことに、CD31染色もまた、染色強度のある程度の減少を示したが、ネズミuPARとの抗体交差反応性が存在せず、機構は、局所腫瘍関連uPA活性の結果としての、間接的なものであると仮定しなければならない。
免疫組織化学
[0262]凍結細胞ペレットおよび正常ヒト組織マイクロアレイ(TriStar Technology Group)に対して、IgG4アイソタイプ対照抗体と一緒に、2.6.1、2.19.2および4.18.1の結合プロフィールを評価した。American Diagnostica Inc.のマウス抗uPAR(カタログ番号3936、ロット番号041223)が、研究における陽性対照Abであった。0〜3+のスケール(±はっきりしない染色;1+弱い染色;2+中程度の染色;3+強い染色)を用いて、目によって、染色強度を概算した。PC3ヒト前立腺癌由来の凍結細胞ペレットおよびU937ヒト組織細胞リンパ腫U937細胞ペレットを陽性対照として用い、そして膜および細胞質染色の両方を観察した(表21を参照されたい)。陰性対照抗体でバックグラウンド染色が観察された場合、染色がバックグラウンドより強く、そして/またはバックグラウンドから区別可能である場合のみ、または染色が、陰性対照抗体で染色されない試験組織内の細胞中にある場合のみ、陽性染色と報告した(以下の表23を参照されたい)。
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
[0265]膵臓癌と診断されたヒト癌患者群を、治療群にランダム化する。各患者群を、本明細書記載のmAb 2.6.1、2.19.2または4.18.1の毎週静脈内注射で治療する。各患者に、5mg/kg/週〜15mg/kg/週の範囲の抗体の有効量を4〜8ヶ月間、投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを与える。
ヒト患者における腫瘍細胞増殖の阻害
[0267]甲状腺癌と診断されたヒト癌患者群を、治療群にランダム化する。各患者群を、本明細書記載のmAb 2.6.1、2.19.2または4.18.1の静脈内注射で、3週間ごとに、治療する。各患者に、5mg/kg/週〜15mg/kg/週の範囲の抗体の有効量を4〜8ヶ月間、およびゲムシタビンの有効療法用量を投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを与える。治療措置中および措置後、定期的に、磁気共鳴画像法(MRI)によって腫瘍負荷を評価する。mAb 2.6.1、2.19.2または4.18.1での3週間の抗体治療およびゲムシタビン治療を受けた患者が、抗体およびゲムシタビン治療を受けなかった患者に比較して、腫瘍サイズの有意な減少、進行までの遅延、または生存延長を示すことが見いだされる。何人かの治療患者では、腫瘍はもはや検出不能である。対照的に、対照群においては、腫瘍サイズは、増加するか、または実質的に同じままである。
ヒト患者における腫瘍転移の阻害
[0268]非小細胞肺癌と診断されたヒト癌患者群を、治療群にランダム化する。標準的化学療法措置に加えて、各患者群を、本明細書記載のmAb 2.6.1、2.19.2または4.18.1の静脈内注射で、毎週、治療する。各患者に、5mg/kg/週〜15mg/kg/週の範囲の抗体の有効量を2〜8ヶ月間、投薬する。対照群には、標準的な化学療法措置のみを与える。
ヒト患者におけるエストロゲン受容体陽性乳癌の治療
[0270]成人女性が、エストロゲン受容体陽性乳癌と診断される。患者を、mAb 2.19.2および抗ホルモン剤の静脈内注射で、2〜8ヶ月の期間に渡って2週間ごとに治療する。その結果、患者は、進行がない生存の延長を経験する。
ヒト患者におけるHER2陽性乳癌の治療
[0271]成人女性が、HER2陽性乳癌と診断される。患者を、mAb 2.19.2および抗her2剤の静脈内注射で、2〜8ヶ月の期間に渡って毎週治療する。その結果、患者は、腫瘍サイズの有意な減少を経験する。
ヒト患者におけるEGFR発現性肺癌の治療
[0272]成人男性が、EGFR発現性肺癌と診断される。患者を、mAb 2.19.2および受容体チロシンキナーゼ阻害剤の静脈内注射で、2〜8ヶ月の期間に渡って毎週治療する。その結果、患者は、進行までの時間の有意な遅延を経験する。
ヒト患者における関節炎の治療
[0273]成人女性が、重度の関節炎と診断される。患者を、mAb 2.19.2の静脈内注射で、3週間の期間に渡って2週間ごとに治療する。その結果、患者は、関節炎症状の有意な減少を経験する。
ヒト患者におけるアテローム性動脈硬化症の治療
[0274]成人男性が、アテローム性動脈硬化症と診断される。患者を、mAb 4.18.1の静脈内注射で、1年間の期間に渡って1週間おきに治療する。その結果、患者は、狭心症などのアテローム性動脈硬化症の症状の減少を経験する。
[0275]特許、特許出願、論文、教科書等を含む、本明細書に引用するすべての参考文献、および該文献に引用される参考文献は、すでにそうでない度合いまで、その全体が本明細書に援用される。
[0276]前述の記載した明細書は、当業者が本発明を実施可能となるのに十分であると見なされる。前述の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳述し、そして発明者らが意図する最適の様式を記載する。しかし、前述の記述がテキスト中でいかに詳細であるかに関わらず、本発明を多くの方式で実施してもよく、そして本発明は付随する請求項およびその任意の同等物にしたがって解釈されるべきであることが認識されるであろう。
Claims (63)
- ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)に特異的に結合し、そしてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)のuPARへの結合を阻害する、単離された標的化結合剤。
- U937細胞に対するプラスミノーゲン活性化を90%より多く阻害する、請求項1の標的化結合剤。
- 0.08μg/ml未満のIC50で、U937細胞に対するプラスミノーゲン活性化を阻害する、請求項1の標的化結合剤。
- uPARが仲介する、2μg/mlの濃度のビトロネクチンへのU937細胞の細胞接着の80%より多くを阻害する、請求項1の標的化結合剤。
- 10μg/mlの濃度のMatrigelTMへの細胞浸潤の90%より多くを阻害する、請求項1の標的化結合剤。
- 哺乳動物における腫瘍増殖および転移を阻害する、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
- 500ピコモル濃度(pM)未満のKdでuPARに結合する、請求項1〜6のいずれか一項の標的化結合剤。
- 400ピコモル濃度(pM)未満のKdでuPARに結合する、請求項1〜6のいずれか一項の標的化結合剤。
- 300ピコモル濃度(pM)未満のKdでuPARに結合する、請求項1〜6のいずれか一項の標的化結合剤。
- 200ピコモル濃度(pM)未満のKdでuPARに結合する、請求項1〜6のいずれか一項の標的化結合剤。
- モノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
- 表1に示すようなモノクローナル抗体のいずれか1つである、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
- モノクローナル抗体2.19.2(ATCC寄託番号PTA−7474)である、請求項12の標的化結合剤。
- モノクローナル抗体2.6.1(ATCC寄託番号PTA−7475)である、請求項12の標的化結合剤。
- モノクローナル抗体4.18.1(ATCC寄託番号PTA−7476)である、請求項12の標的化結合剤。
- ATCC寄託番号PTA−7474、ATCC寄託番号PTA−7475およびATCC寄託番号PTA−7476より選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、標的化結合剤。
- 請求項12〜16のいずれか一項のモノクローナル抗体から誘導可能である、標的化結合剤。
- 完全ヒト・モノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤。
- 完全ヒト・モノクローナル抗体の結合性断片である、請求項1〜17のいずれか一項の標的化結合剤。
- Fab、Fab’、F(ab’)2、FvおよびDabからなる群より選択される、請求項19の標的化結合剤。
- 配列番号26の配列を有するポリペプチドを含む、請求項1の標的化結合剤。
- 配列番号26が、表15の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか1つを有する、請求項21の標的化結合剤。
- 配列番号28の配列を有するポリペプチドを含む、請求項1の標的化結合剤。
- 配列番号28が、表14の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか1つを有する、請求項23の標的化結合剤。
- 配列番号30の配列を有するポリペプチドを含む、請求項1の標的化結合剤。
- 配列番号30が、表13の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか1つを有する、請求項25の標的化結合剤。
- 配列番号32の配列を有するポリペプチドを含む、請求項1の標的化結合剤。
- 配列番号32が、表12の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか1つを有する、請求項27の標的化結合剤。
- 配列番号50の配列を有するポリペプチドを含む、請求項1の標的化結合剤。
- 配列番号50が、表17の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか1つを有する、請求項29の標的化結合剤。
- 配列番号52の配列を有するポリペプチドを含む、請求項1の標的化結合剤。
- 配列番号52が、表16の各行によって示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか1つを有する、請求項31の標的化結合剤。
- uPARへの結合に関して、請求項1〜17の標的化結合剤のいずれか1つと交差競合する、標的化結合剤。
- 請求項1〜17の標的化結合剤のいずれか1つと同じ、uPAR上のエピトープに結合する、標的化結合剤。
- a)表18または表19に示すようなCDR1、CDR2またはCDR3配列のいずれか1つ;
b)表18に示すようなCDR1、CDR2およびCDR3配列;
c)表19に示すようなCDR1、CDR2およびCDR3配列;または
d)表18に示すようなCDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに表19に示すようなCDR1、CDR2およびCDR3配列
を含むアミノ配列を含む、標的化結合剤。 - 抗体である、請求項21〜35のいずれか一項記載の標的化結合剤。
- 完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項36記載の標的化結合剤。
- 完全ヒト・モノクローナル抗体の結合性断片である、請求項37記載の標的化結合剤。
- 先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤をコードする、核酸分子。
- 請求項39の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項40のベクターを含む、宿主細胞。
- 動物において、悪性腫瘍を治療する方法であって:
悪性腫瘍の治療が必要な動物を選択し;そして
先行する請求項のいずれか一項の標的化結合剤の療法的有効用量を前記動物に投与する
工程を含む、前記方法。 - 前記動物がヒトである、請求項42の方法。
- 前記標的化結合剤が請求項13〜16の標的化結合剤のいずれか1つである、請求項42の方法。
- 前記悪性腫瘍が:黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞(肝臓)癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭部および頸部癌、中皮腫、肉腫、胆道(胆管)癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、ならびに類表皮癌からなる群より選択される、請求項42〜44の方法。
- uPARが誘導する疾患関連細胞接着および/または浸潤を治療する方法であって:
疾患関連細胞接着および/または浸潤の治療が必要な動物を選択し;そして
請求項1〜38のいずれか一項の標的化結合剤の療法的有効用量を前記動物に投与する
工程を含む、前記方法。 - 前記動物がヒトである、請求項46の方法。
- 前記標的化結合剤が完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項46の方法。
- 前記疾患関連細胞接着および/または浸潤が腫瘍転移である、請求項46〜48の方法。
- 前記標的化結合剤が請求項13〜16の標的化結合剤のいずれか1つより選択される、請求項46の方法。
- 非新生物疾患を治療する方法であって:
非新生物疾患の治療が必要な動物を選択し;そして
請求項1〜38のいずれか一項の標的化結合剤の療法的有効用量を前記動物に投与する
工程を含む、前記方法。 - 前記動物がヒトである、請求項51の方法。
- 前記標的化結合剤が完全ヒト・モノクローナル抗体である、請求項51の方法。
- 前記標的化結合剤が請求項13〜16の標的化結合剤のいずれか1つより選択される、請求項51の方法。
- 非新生物疾患が、関節炎、アテローム性動脈硬化症およびアレルギー性結膜炎からなる群より選択される、請求項51〜54のいずれか一項の方法。
- 請求項1〜38のいずれか一項の標的化結合剤または該剤の結合性断片、および療法剤を含む、コンジュゲート。
- 療法剤が毒素である、請求項56のコンジュゲート。
- 療法剤が放射性同位体である、請求項56のコンジュゲート。
- 療法剤が薬学的組成物である、請求項56のコンジュゲート。
- 悪性腫瘍の治療用の薬剤の調製における、請求項1〜38のいずれかの標的化結合剤の使用。
- uPARが誘導する細胞接着および/または浸潤の治療用の薬剤の調製における、請求項1〜38のいずれかの標的化結合剤の使用。
- 非新生物疾患の治療用の薬剤の調製における、請求項1〜38のいずれかの標的化結合剤の使用。
- 薬学的に許容されうるキャリアーと混合された、請求項1〜38のいずれかの標的化結合剤。
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