Predložený vynález sa týka určitých 3-pyrolom substituovaných 2-indolinónov, ktoré modulujú aktivitu proteínkináz („PK“). Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú preto účinné pri ošetrení porúch spojených s abnormálnou aktivitou PK. Ďalej sa predložený vynález týka farmaceutických prípravkov zahrnujúcich tieto zlúčeniny, spôsobov ošetrenia ochorení pomocou farmaceutických prípravkov zahrnujúcich tieto zlúčeniny a spôsobov ich prípravy.
Doterajší stav techniky
Nasledujúci opis má iba informatívny charakter a nekladie si za cieľ byť známym stavom techniky predloženého vynálezu.
PK sú enzýmy, ktoré katalyzujú fosforyláciu hydroxyskupín na tyrozínových, serínových a treonínových zvyškoch proteínov. Dôsledky tejto zdanlivo jednoduchej aktivity sú ohromné; bunkový rast, diferenciácia a proliferácia, t. j. prakticky všetky aspekty života bunky tým či oným spôsobom závisia od aktivity PK. Okrem toho abnormálna aktivita PK súvisí z množstvom porúch siahajúcich od relatívne život neohrozujúcich ochorení, ako je psoriáza, až po extrémne virulentné ochorenia, ako je glioblastóm (rakovina mozgu).
PK je možné výhodne rozdeliť do dvoch skupín, na proteínové tyrozínkinázy (PTK) a serín-treonínkinázy (STK).
Jedným z hlavných aspektov aktivity PTK je ich účasť na receptoroch rastového faktora. Receptory rastového faktora sú proteíny bunkového povrchu. Pokiaľ sa na ne naviaže ligand rastového faktora, prechádzajú receptory rastového faktora na aktívnu formu, ktorá interaguje s proteínmi na vnútornom povrchu bunkovej membrány. To vedie k fosforylácii na tyrozínových zvyškoch receptora a ďalších proteínoch a k tvorbe komplexov s rôznymi cytoplazmatickými signálnymi molekulami vnútri bunky, ktoré potom ovplyvňujú veľký počet bunkových odpovedí, ako je bunkové delenie (proliferácia), bunková diferenciácia, bunkový rast, expresia metabolických efektov do extracclulárneho mikroprostredia atď. Kvôli detailnejším informáciám pozri Schlessinger and Ullrich, Neurón, 9:303 - 391 (1992), na ktorých práci je tu odkazované, vrátane všetkých obrázkov, ako by úplne boli uvedené tu.
Receptory rastového faktora s aktivitou PTK sú známe ako receptorové tyrozínkinázy („RTK“). Zahrnujú veľkú rodinu transmembránových receptorov s rozličnými biologickými aktivitami. Doteraz bolo identifikovaných aspoň 19 rôznych podskupín RTK. Príklad týchto RTK zahrnuje podskupinu označovanú ako „HER“ RTK, ktorá zahrnuje EGFR (receptor epiteliálneho rastového faktora), HER2, HER3 a HER4. Tieto RTK pozostávajú z extracelulárnej glykozylovanej väzbovej domény ligandu, transmembránovej domény a intracelulámej cytoplazmatickej katalytickej domény, ktorá môže fosforylovať tyrozínové zvyšky na proteínoch.
Ďalšia podrodina RTK pozostáva z receptora inzulínu (IR), receptora inzulínového typu rastového faktora I (IGF-1R) a príbuzného receptora receptora inzulínu (IR). IR a IGF-1F interagujú s inzulínom, IGF-I a IGF-II za vzniku heterotetrameru dvoch úplne extracelulárne glykozylovaných a podjednotiek a dvoch β podjednotiek, ktoré pretínajú bunkovú membránu a obsahujú tyrozínkinázovú doménu.
Tretia podrodina RTK sa označuje ako skupina receptorov rastového faktora odvodeného od doštičiek („PDGF“), ktorá zahrnuje PDGFRa, PDGFRfl, CSFIR, c-kit a c-fms. Tieto receptory pozostávajú z glykozylovaných extracelulámych domén zložených z rôzneho počtu slučiek imunoglobulínového typu a intraceluláme domény, kde tyrozínkinázová doména je prerušená nepribuznými aminokyselinovými sekvenciami.
Ďalšou skupinou, ktorá v dôsledku svojej podobnosti s podrodinou PDGFR je niekedy zahmovaná do naposledy uvedenej skupiny, je podrodina receptorov fetálnej pečeňovej kinázy („flk“). Predpokladá sa, že túto skupinu tvorí receptor obsahujúci doménu kinázového inzertu pre fetálnu pečeňovú kinázu-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-lR, flk-4 a tyrozínkinázu 1 typu fms (fit-1).
Ďalším členom rodiny tyrozínkmázového receptora rastového faktora je podskupina receptorov fibroblastového rastového faktora („FGF“). Táto skupina pozostáva zo štyroch receptorov, FGFR1-4, a siedmich ligandov, FGF1-7. Aj keď nie sú ešte plne definované, je možné povedať, že sa receptory skladajú z glykozylovanej extracelulárnej domény obsahujúcej rôzny počet slučiek imunoglobulínového typu, a intracelulámej domény, v ktorej je tyrozínkinázová sekvencia prerušená oblasťami nepríbuzných aminokyselinových sekvencií.
Ešte ďalším členom podskupiny tyrozínkinázového receptora rastového faktora je podskupina receptora rastového faktora vaskulámych endotelových buniek („VEGF“). VEGF je dimémy glykoproteín podobný PDGF, ale má iné biologické funkcie a cieľovo bunkovú špecifitu in vivo. Konkrétne sa v súčasnej dobe predpokladá, že má dôležitú úlohu pri vaskulogenéze a angiogenéze.
Úplný zoznam známych podrodín RTK je opísaný v Plowman et al., DN&P, 7(6): 334 - 339 (1994), na ktorých prácu je tu odkazované, vrátane ktorýchkoľvek obrázkov, ako by úplne boli uvedené tu.
Okrem RTK tiež existuje rodina úplne intracelulárnych PTK označovaná nereceptorové tyrozínkinázy („non-receptor tyrosin kinases“) alebo tiež „bunkové tyrozínkinázy“. Ďalej bude v opise používaná skratka tohto druhého označenia, t. j. CTK. CTK neobsahujú extraceluláme a transmembránové domény. Do súčasnosti bolo identifikovaných 24 jednotlivých CTK zahrnujúcich (11) podrodín (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Ako a Ack). Podrodina Src je v súčasnosti tvorená najväčším počtom CTK a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr a Yrk. Podrobnejšiu diskusiu CTK poskytuje Bohlen, 1993, Oncogene 8: 2025 - 2031, na ktorých prácu je tu odkazované, vrátane ktorýchkoľvek obrázkov, ako by úplne bolo uvedené tu.
Serín/treonínkinázy, STK, typu STK, sú prevažne intraceluláme, aj keď existuje niekoľko receptorových kináz typu STK. STK sú najčastejšie cytozolové kinázy, t. j. kinázy, ktoré vykonávajú svoju funkciu v inej časti cytoplazmy než sa nachádzajú cytoplazmatické organely a cytoskelet. Cytozól je oblasť v bunke, v ktorej sa vyskytuje veľké množstvo bunkovej intermediámej metabolickej a biosyntetickej aktivity, napr. syntéza proteínov na ribozómoch prebieha v cytozóle.
Zistilo sa, že mnohé RTK, CTK a STK sa podieľajú na mnohých patogénnych stavoch hostiteľa, vrátane, výrazne, na rakovine. Ďalšie patogénne stavy súvisiace s PTK zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, psoriázu, hepatickú cirhózu, diabetes, angiogenézu, restenózu, očné ochorenie, reumatoidnú artritídu a ďalšie zápalové poruchy, imunologické poruchy, napr. autoimunitná choroba, kardiovaskulárne ochorenie, napr. ateroskleróza a rôzne renálne poruchy.
Čo sa týka rakoviny, uvádzajú sa dve hlavné zdokonalené hypotézy, ktoré vysvetľujú nadmernú bunkovú proliferáciu, ktorá riadi vznik nádoru súvisiaceho s funkciami, o ktorých je známe, že sú regulované PK. Predpokladá sa, že malígny bunkový rast je výsledkom poruchy mechanizmu, ktorá riadi bunkové delenie a/alebo diferenciáciu. Zistilo sa, že proteínové produkty mnohých pretoonkogénov sa podieľajú na transdukčných dráhach signálu, ktoré regulujú bunkový rast a diferenciáciu. Tieto proteínové produkty pretoonkogénov zahrnujú extraceluláme rastové faktory, transmembránové receptory rastového faktora PTK (RTK), cytoplazmatické PTK (CTK) a cytozolové STK, všetko je opisované.
Vzhľadom na zrejmý vzťah medzi bunkovými aktivitami súvisiacimi s PK a širokou škálou ľudských porúch, nie je prekvapením, že je vynakladané veľké úsilie identifikovať spôsoby modulácie aktivity PK. Niektoré z týchto zámerov tiež zahrnovali biomimetické postupy využívajúce veľké molekuly na identifikáciu PD podieľajúcich sa na konkrétnych bunkových procesoch (napr. mutantných ligandov, U.S. patentová prihláška č. 4,966,849), rozpustných receptoroch a protilátkach (prihláška č. WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Naťl. Acad. Sci 90: 10705 - 09; Kim et al., 1993, Náture 362: 841 - 844), RNA ligandov (Jellinek, et al, Biochemistry 33: 1045056; Takano, et al, 1993, Mol. Bio. Celí 4: 358A; Kinsella, et al. 1992, Exp. Celí Res. 199: 56 - 62; Wright, et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448 - 57) a inhibítoroch tyrozínkináz (WO 94/14808; U.S. patent č. 5,330,992; Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35: 2268).
Okrem uvedeného boli v poslednej dobe vykonané pokusy identifikovať malé molekuly, ktoré pôsobia ako inhibítory PK. Napríklad bismonocyklické, bicyklické alebo heterocyklické arylové zlúčeniny (PCT WO 92/20642) a vinylén-azaindolové deriváty (PCT WO 94/14808) a l-cyklopropyl-4-pyridyl-chinolóny (U.S. č. 5,330,992) sa všeobecne opisujú ako tyrozínkinázové inhibítory. Styrylové zlúčeniny (U.S. patent č. 5,217,999), styrylsubstituované pyridylové zlúčeniny (U.S. patent č. 5,302,606), niektoré chinazolínové deriváty (EP č. 0 566 266 Al), selenoindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylické zlúčeniny (PCT WO 92/21660) a zlúčeniny benzylfosfónovej kyseliny (PCT WO 91/15495) sa opisujú ako zlúčeniny na použitie ako inhibítory PTK na použitie pri liečbe rakoviny.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka určitých 3-pyrolom substituovaných 2-indolinónových zlúčenín, ktoré majú PK modulačnú schopnosť, a teda sú použiteľné pri ošetrení porúch súvisiacich s abnormálnou aktivitou PK.
V rámci jedného aspektu sa teda predložený vynález týka 3-pyrolom substituovaných 2-indolinónov všeobecného vzorca (I):
kde substituent R1 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, (CrC4)alkylovej skupiny, skupiny -(CH2)rR16 a -C(O)NR8R9;
substituent R2 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, halogénu, arylovej skupiny a -S(O)2NR13R14;
substituent R3 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, (CrC4)alkylovej skupiny, (CrC4)alkoxyskupiny, arylovej skupiny, heteroarylovej skupiny a skupiny -C(O)R15;
substituent R4 je atóm vodíka;
substituent R5 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a (CrC4)alkylovej skupiny; substituent R6 je -C(O)R10;
substituent R7 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, (CrC4)alkylovej a arylovej skupiny; substituenty R8 a R9 sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylovej skupiny a arylovej skupiny;
substituent R10 je -N(R11)(CH2)nR12, kde n je 1, 2 alebo 3, R11 je atóm vodíka a R12 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z hydroxyskupiny, (CrC4)alkoxyskupiny, -C(O)R15, heteroarylovej skupiny a -NRI3R14, substituenty R13 a R14 sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, (C1-C4)alkylovej skupiny, cykloalkylovej, arylovej a heteroarylovej skupiny; alebo substituenty R13 a R14 môžu byť spojené dohromady za vzniku heterocyklickej skupiny;
substituent R15 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, hydroxyskupiny, (Ci-C4)alkoxyskupiny a aryloxyskupiny;
substituent R16 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z hydroxyskupiny a -C(O)R15; a r je 2 alebo 3;
alebo ich farmaceutický prijateľných solí.
Indolinónové deriváty a ich zamýšľané použitie sa opisujú v nasledujúcich dokumentoch: patent US 5,886,020, medzinárodné patentové prihlášky WO 98/50356, WO 99/61422 a WO 00/38519 (zverejnené 06.07.2000), J. Med. Chem. 1998, 41, 2588-2603. Oxindolové deriváty a ich zamýšľané použitie sa opisujú v nasledujúcom dokumente: WO 00/35908 (zverejnené 22.06.2000). Formulácie farmaceutických prostriedkov ionizovateľných ako voľné kyseliny alebo voľné zásady sa opisujú v nasledujúcom dokumente: WO 01/37820 (zverejnené 31.05.2001).
Druhý aspekt predloženého vynálezu sa týka farmaceutického prípravku obsahujúceho jednu alebo viac zlúčenín všeobecného vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ a farmaceutický prijateľný excipient.
Tretí aspekt predloženého vynálezu sa týka použitia zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľnej soli na prípravu liečiva na liečenie ochorení sprostredkovaných proteínkinázou, v organizme, obzvlášť u ľudí. Takéto ochorenia zahrnujú, ale neobmedzujú sa na ne, napríklad rakovinu, diabetes, hepatickú cirhózu, kardiovaskulárne ochorenie, napr. aterosklerózu, angiogenézu, imunologické ochorenie, napr. autoimunitné ochorenie, a renálne ochorenie.
Detailný opis vynálezu
Definícia
Pokiaľ nie je uvedené inak, majú nasledujúce termíny používané pri opise a v patentových nárokoch tento význam:
Termín „alkylová skupina“ sa vzťahuje na nasýtený alifatický uhľovodíkový radikál zahrnujúci skupiny s lineárnym alebo rozvetveným reťazcom majúci 1 až 20 atómov uhlíka (zakaždým, keď je uvedené číselné rozmedzie, napr. „1 - 20“, znamená to, že skupina, v tomto prípade alkylová skupina, môže obsahovať 1 atóm uhlíka, 2 atómy uhlíka, 3 atómy uhlíka atď. až 20 atómov uhlíka vrátane). Alkylové skupiny s 1 až 4 atómami uhlíka sú označené nižšie alkylové skupiny. Pokiaľ uvedené nižšie alkylové skupiny nemajú substituenty, potom sú označované ako nesubstituované nižšie alkylové skupiny. Výhodnejšie je alkylová skupina, alkylová skupina strednej veľkosti s 1 až 10 atómami uhlíka, napr. metyl, etyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, izo-butyl, terc-butyl, pentyl atď. Najvýhodnejšie má nižšia alkylová skupina 1 až 4 atómy uhlíka, napr. metyl, etyl, propyl, 2-propyl, «-butyl, izo-butyl alebo terc-butyl atď. Alkylová skupina je nesubstituovaná.
Termín „cykloalkylová skupina“ sa vzťahuje na 3 až 8-členný čisto uhlíkový monocyklický kruh, čisto uhlíkový 5/6-členný alebo 6/6-členný kondenzovaný bicyklický kruh alebo multicyklický kondenzovaný kruh („kondenzovaný“ kruhový systém znamená, že každý kruh v systému zdieľa dvojicu susedných atómov uhlíka s iným kruhom v systému), kde jeden alebo viacero kruhov môže obsahovať jednu alebo viac dvojných väzieb, ale žiadny z kruhov nemá kompletne konjugovaný π elektrónový systém.
Príklady, ale neobmedzujúce, cykloalkylových skupín zahrnujú cyklopropán, cyklobután, cyklopentán, cyklopentén, cyklohexán, cyklohexadién, adamantán, cykloheptán, cykloheptatrién a pod. Cykloalkylová skupina je nesubstituovaná.
Termín „arylová skupina“ sa vzťahuje na čisto uhlíkaté monocyklické alebo kondenzované polycyklické (t. j. kruhy, ktoré zdieľajú susedné páry atómov uhlíka) skupiny majúce 1 až 12 atómov uhlíka s kompletne konjugovaným π elektrónovým systémom. Príklady arylových skupín, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, zahrnujú fenyl, naftalenyl a antracenyl. Arylová skupina môže byť substituovaná alebo nesubstituovaná. Pokiaľ je arylová skupina substituovaná, je substituovaná jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými z halogénu, alkylu, trihalogénalkylu, hydroxy skupiny, merkapto skupiny, kyano skupiny, N-amido skupiny, mono alebo dialkylamino skupiny, karboxy skupiny alebo N-sulfónamido skupiny.
Termín „heteroarylová skupina“ sa vzťahuje na monocyklickú alebo kondenzovanú kruhovú (t. j. kruhy, ktoré spoločne zdieľajú susediace páry atómov uhlíka) skupinu majúcu 5 až 12 atómov v kruhu a obsahujúcu jeden, dva alebo tri heteroatómy v kruhu vybrané z N, O alebo S a zvyšné atómy v kruhu sú C a navyše majúcu kompletne konjugovaný π elektrónový systém. Príklady nesubstituovaných heteroarylových skupín zahrnujú, ale nie je to na ne obmedzené, pyrol, furán, tiofén, imidazol, oxazol, tiazol, pyrazol, pyridín, pyrimidin, chinolín, izochinolín, purín a karbazol. Heteroarylové skupiny môžu byť substituované alebo nesubstituované. Pokiaľ sú substituované, potom sú substituované jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými z halogénu, alkylu, trihalogénalkylu, hydroxy skupiny, merkapto skupiny, kyano skupiny, N-amido skupiny, mono alebo dialkylamino skupiny, karboxy skupiny alebo N-sulfónamido skupiny.
Termín „heterocyklus“ znamená nasýtený cyklický radikál majúci 3 až 8 atómov v kruhu, kde jeden alebo dva atómy v kruhu sú heteroatómy vybrané z N, O alebo S(O)n (kde n je celé číslo od 0 do 2), zvyšné atómy v kruhu sú C, kde jeden alebo dva atómy uhlíka môžu byť prípadne nahradené karbonylovou skupinou. Podrobnejšie termín heterocyklyl zahrnuje, ale nie je to nijako limitované, tetrahydropyranyl, 2,2-dimetyl-l,3-dioxolán, piperidinoskupinu, A-metylpiperidín-3-yí, piperazínoskupinu, A-metylpyrolidín-3-yl, 3-pyrolidinoskupinu, morfolinoskupinu, tiomorfolinoskupinu, tiomorfolino-l-oxid, tiomorfolino-1,1-dioxid, 4-etyloxykarbonylpiperazinoskupina, 3-oxopiperazinoskupinu, 2-imidazolidón, 2-pyrolidinón, 2-oxohomopiperazinoskupinu, tetrahydropyrimidín-2-ón a ich deriváty. Heterocyklylová skupina je prípadne substituovaná jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými z halogénu, alkylu, alkylu substituovaného karboxyskupinou, esterom, hydroxyskupinou, mono alebo dialkylaminoskupinou.
Termín „hydroxyskupina“ sa vzťahuje na skupinu -OH.
Termín „alkoxyskupina“ sa vzťahuje na skupinu -O- (nesubstituovaná alkylová skupina) a -O- (nesubstituovaná cykloalkylová skupina). Reprezentatívne príklady zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, napr. metoxyskupinu, etoxyskupinu, propoxyskupinu, butoxyskupinu, cyklopropyloxyskupinu, cyklobutyloxyskupinu, cyklopentyloxyskupinu, cyklohexyloxyskupinu atď.
Termín „aryloxyskupina“ sa vzťahuje na -O-arylovú skupinu a -O-heteroarylovú skupinu definovanú v predloženom vynáleze. Reprezentatívne príklady zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, fenoxyskupinu, pyridinyloxyskupinu, furanyloxyskupinu, tienyloxyskupinu, pyrimidinyloxyskupinu, pyrazinyloxyskupinu atď. a ich deriváty.
Termín „merkaptoskupina“ sa vzťahuje na skupinu -SH.
Termín „ester“ sa vzťahuje na skupinu -C(O)O-R, kde substituent R je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z alkylu, trihalogénmetylu, cykloalkylu, prípadne substituovaného arylu, prípadne substituovaného heteroarylu (väzba cez atóm uhlíka v kruhu).
Termín „halogén“ sa vzťahuje na fluór, chlór, bróm alebo jód, výhodne fluór alebo chlór.
Termín „trihalogénmetyl“ sa vzťahuje na skupinu -CX3, kde X je halogén definovaný v predloženom vynáleze.
Termín „kyanoskupina“ sa vzťahuje na skupinu -C=N.
Termín ,ýV-sulfónamidoskupina“ sa vzťahuje na skupinu -NR18S(O)2R19, kde substituent R18 a R19 sú definované v predloženom vynáleze.
Termín „/V-amidoskupina“ sa vzťahuje na skupinu R18C(O)NR19-, kde substituenty R18 a R19 sú definované v predloženom vynáleze.
R18 a R19 sú nezávisle vybrané z vodíka a alkylu.
Termín „2-indolinón“, „indolin-2-ón“ a „2-oxindol“ sú použiteľné zameniteľným spôsobom a vzťahujú sa na molekulu majúcu chemickú štruktúru
Termín „pyrol“ sa vzťahuje na molekulu majúcu chemickú štruktúru:
Termíny „pyrolom substituovaný 2-indolinón“ a „3-pyrolidenyl-2-indolinón“ sú tu zameniteľné a vzťahujú sa na chemickú zlúčeninu majúcu všeobecnú štruktúru zobrazenú všeobecným vzorcom (I).
Zlúčeniny, ktoré majú rovnaký molekulový vzorec, ale sú odlišné v charaktere a sekvencii väzieb svojich atómov alebo usporiadaní svojich atómov v priestore, sa nazývajú „izoméry“. Izoméry, ktoré sú rozdielne v usporiadaní svojich atómov v priestore, sa nazývajú „stereoizoméry“. Stereoizoméry, ktoré nie sú zrkadlovým obrazom jeden druhého, sa nazývajú „diastereoizoméry“, a tie ktoré sú jeden druhému nekryjúcim sa zrkadlovým obrazom, sa nazývajú „enantioméry“. Pokiaľ sa v molekule zlúčeniny nachádza asymetrické centrum, napr. k tomuto centru sú pripojené štyri rozdielne skupiny, môže táto molekula existovať v dvoch enantiomérnych formách. Enantiomér môže byť charakterizovaný absolútnou konfiguráciou svojho asymetrického centra a je opísaný Cahnovým-Prelogovým pravidlom ako R a S alebo podľa toho, akým spôsobom molekula stáča rovinu polarizovaného svetla (označenie ako pravotočivá alebo ľavotočivá, (+)-izomér, resp. (-)-izomér). Chirálna zlúčenina môže existovať buď ako jednotlivý enantiomér, alebo ako zmes enantiomérov. Zmes obsahujúca rovnaké množstvo enantiomérov je nazývaná „racemická zmes“.
Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu môžu mať jedno alebo viac asymetrických centier, preto môžu byť takéto zlúčeniny pripravené ako jednotlivé (R)- a (S)- stereoizoméry alebo ako ich zmesi. Pokiaľ nie je uvedené inak, potom opis alebo označenie jednotlivých zlúčenín v opisnej časti a patentových nárokoch bude zahrnovať oba enantioméry a ich zmesi, racemické alebo iné. Spôsoby stanovenia stereochémie a separácie stereoizomérov sú štandardne dobre známe (pozri podrobnejšia diskusia v kapitole 4 of „Advanced Organic Chemistry“, 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) môžu mať tautomériu a štruktúrnu izomériu. Napríklad zlúčeniny opisované tu môžu byť označené ako E alebo Z konfigurácie na dvojnej väzbe spojujúcej 2-indolinónovú časť s pyrolovou časťou alebo môžu byť zmes E a Z konfigurácie. Predložený vynález zahrnuje akúkoľvek tautomérnu alebo štruktúrnu izomému formu a ich zmesi, ktoré majú schopnosť modulácie aktivity RTK, CTK a/alebo STK, a nie je nijako obmedzený na akúkoľvek tautomému alebo štruktúrnu izomému formu.
Termín „farmaceutický prípravok“ sa vzťahuje na zmes jednej alebo viacerých tu opisovaných zlúčenín alebo ich fyziologicky/farmaceuticky prijateľnej soli alebo proliečiva spoločne s ďalšími chemickými komponentmi, napr. fyziologicky/farmaceuticky prijateľnými nosičmi a excipientmi. Účel farmaceutického prípravku je uľahčiť podanie zlúčeniny do organizmu.
Zlúčenina všeobecného vzorca (I) môže tiež účinkovať ako proliečivo. Termín „proliečivo“ sa vzťahuje na látku, ktorá sa in vivo premieňa na vlastné liečivo. Proliečivá sú často výhodné, pretože v niektorých prípadoch môžu byť ľahšie podávané než vlastné liečivo. Môžu byť napr. biologicky dostupné perorálnym podaním, zatiaľ čo vlastné liečivo nie. Vo farmaceutických prípravkoch môže mať proliečivo tiež zlepšenú rozpustnosť než vlastné liečivo. Príkladom, ale bez obmedzenia, proliečiva by bola zlúčenina podľa predloženého vynálezu, ktorá je podávaná ako ester („proliečivo“) na uľahčenie prenosu cez bunkovú membránu, kde rozpustnosť vo vode je na škodu mobilite, ale potom je metabolický hydrolyzovaná na karboxylovú kyselinu, vlastnou účinnou zlúčeninou, ledva je vnútri bunky, kde je rozpustnosť vo vode výhodná.
Ďalším príkladom proliečiva môže byť krátky polypeptid, napríklad, bez obmedzenia, polypeptid s 2 - 10 aminokyselinami, viazaný cez terminálnu aminoskupinu ku karboxyskupine zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, kde polypeptid je hydrolyzovaný alebo metabolizovaný in vivo na uvoľnenie aktívnej molekuly. Proliečivá zlúčeniny podľa predloženého vynálezu (I) spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.
Navyše sa uvažuje, že zlúčenina všeobecného vzorca (I) by bola metabolizovaná enzýmami v organizme, napr. ľudskom, na metabolit, ktorý môže modulovať aktivitu proteínkináz. Tieto metabolity spadajú tiež do rozsahu predloženého vynálezu.
Termín „fyziologicky/farmaceuticky prijateľný nosič“ sa vzťahuje na nosič alebo riedidlo, ktoré nespôsobuje významné podráždenie organizmu a nenarušuje biologickú aktivitu a vlastnosti podávanej zlúčeniny.
Termín „farmaceutický prijateľný excipient“ sa vzťahuje na inertnú látku pridávanú do farmaceutického prípravku na ďalšie uľahčenie podania zlúčeniny. Príklady excipientov, bez obmedzenia, zahrnujú uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rôzne cukry a typy škrobov, deriváty celulózy, želatínu, rastlinné oleje a polyetylénglykoly.
Termín „farmaceutický prijateľná soľ“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na tie soli, ktoré si uchovávajú biologickú účinnosť a vlastnosti materskej zlúčeniny. Tieto soli zahrnujú:
(1) adičné soli s kyselinou, ktoré sú pripravené reakciou voľnej bázy materskej zlúčeniny s anorganickými kyselinami, napr. s chlorovodíkovou kyselinou, bromovodíkovou kyselinou, dusičnou kyselinou, fosforečnou kyselinou, kyselinou sírovou, kyselinou chloristou atď., alebo s organickými kyselinami, napr. s octovou kyselinou, šťaveľovou kyselinou, (D) alebo (L) jablčnou kyselinou, maleínovou kyselinou, metánsulfónovou kyselinou, etánsulfónovou kyselinou, p-toluénsulfónovou kyselinou, salicylovou kyselinou, vínnou kyselinou, citrónovou kyselinou, jantárovou kyselinou alebo malónovou kyselinou atď., výhodne kyselinou chlorovodíkovou alebo (L)-jablčnou kyselinou, napr. ako L-malátová soľ (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny; alebo (2) soli pripravené buď nahradením kyslého protónu prítomného v materskej zlúčenine iónom kovu, napr. ión alkalického kovu, ión alkalických zemín alebo hlinitý ión; alebo koordináciou s organickou bázou, napr. etanolamínom, dietanolamínom, trietanolamínom, trimetanolamínom, Λ'-metylglukamínom atď.
Termín „PK“ sa vzťahuje na receptorovú proteínovú tyrozínkinázu (RTK), nereceptorovú alebo „bunkovú“ tyrozínkinázu (CTK) a serín-treonínkinázy (STK).
Termín „spôsob“ sa vzťahuje na spôsoby, prostriedky, techniky a procedúry na dosiahnutie uvedeného zámeru, vrátane, ale nie je to nijako limitované, spôsobov, prostriedkov, techník a procedúr buď známych, alebo ľahko vyvinuteľných zo známych spôsobov, prostriedkov, techník a procedúr odborníkmi v chemických, farmaceutických, biologických, biochemických a lekárskych odboroch.
Termín „modulácia“ alebo „modulujúci“ sa vzťahuje na zmenu katalytickej aktivity RTK, CTK a STK. Konkrétne sa modulácia vzťahuje na aktiváciu katalytickej aktivity RTK, CTK a STK, výhodne aktiváciu alebo inhibíciu katalytickej aktivity RTK, CTK a STK, v závislosti od koncentrácie zlúčeniny alebo soli, ktoré sú RTK, CTK alebo STK vystavené alebo, výhodnejšie, inhibícii katalytickej aktivity, RTK, CTK a STK.
Termín „katalytická aktivita“ sa vzťahuje na mieru fosforylácie tyrozínu za vplyvu, priameho či nepriameho, RTK a/alebo CTK alebo fosforylácie serínu a treonínu za vplyvu, priameho či nepriameho, STK.
Termín „uvedenie do kontaktu“ sa vzťahuje na uvedenie zlúčeniny podľa predloženého vynálezu a cieľovej PK do kontaktu takým spôsobom, aby zlúčenina mohla ovplyvniť katalytickú aktivitu PK, buď priamo, t. j. interakciou so samotnou kinázou, alebo nepriamo, t. j. interakciou s ďalšou molekulou, od ktorej je katalytická aktivita kinázy závislá. Takéto „uvedenie do kontaktu“ môže byť dosiahnuté „in vitro“, t. j. v skúmavke, petriho miske atď. V skúmavke môže uvedenie do kontaktu zahrnovať iba zlúčeniny a PK podľa výberu alebo môže zahrnovať celé bunky. Bunky môžu byť tiež udržiavané alebo pestované v miskách na kultiváciu buniek a uvedené do kontaktu so zlúčeninou v tomto prostredí. V tejto súvislosti môže byť schopnosť jednotlivej zlúčeniny ovplyvňovať poruchy súvisiace s PK, t. j. hodnota IC50 zlúčeniny, definovaná nižšie, stanovená pred použitím zlúčenín in vivo s komplexnejšími živými organizmami. Pre bunky mimo organizmus existuje mnoho spôsobov, a sú dobre známe odbornej verejnosti, vrátane toho, ako uviesť zlúčeniny do kontaktu, vrátane, ale nie je to nijako limitované, priamej bunkovej mikroinjekcie a mnoho techník s transmembránovým nosičom.
Termín „in vitro “ sa vzťahuje na spôsoby vykonávané v umelom prostredí, napríklad, ale nie je to nijako limitované, v skúmavke alebo kultivačnom médiu.
Termín „in vivo “ sa vzťahuje na spôsoby vykonávané v živom organizme, napríklad, ale nie je to nijako limitované, v myšom, králičom alebo v organizme potkanov.
Termíny „porucha súvisiaca s PK“, „porucha riadená PK“ a „abnormálna aktivita PK“ sa všetky vzťahujú na stav charakterizovaný neprimeranou, t. j. zníženou alebo väčšinou zvýšenou katalytickou aktivitou PK, kde jednotlivé PK môžu byť RTK, CTK alebo STK. Neprimeraná katalytická aktivita môže vznikať ako výsledok buď: (1) expresie PK v bunkách, ktoré normálne neexprimujú PK, (2) zvýšenej expresie PK, ktorá vedie k nežiaducej bunkovej proliferácii, diferenciácii a/alebo rastu, alebo (3) zníženej expresie PK, ktorá vedie k nežiaducim redukciám v bunkovej proliferácii, diferenciácii a/alebo rastu. Nadmerná aktivita PK poukazuje na buď amplifikáciu génu kódujúceho konkrétne PK, alebo produkciu hladiny aktivity PK, ktorá môže korelovať s bunkovou proliferáciou, diferenciáciou a/alebo rastovou poruchou (t. j. zvyšovaním hladiny PK sa zvyšuje sila jedného alebo viacerých symptómov bunkovej poruchy). Znížená aktivita samozrejme znamená opak, t. j. sila jedného alebo viacerých symptómov bunkovej poruchy sa zvyšuje so znižujúcou sa hladinou aktivity PK.
Termín „ošetrenie“ sa vzťahuje na spôsob zmiernenia alebo odstránenia bunkovej poruchy sprostredkovanej PK a'alebo ich sprievodných symptómov. Konkrétne, čo sa týka rakoviny, znamenajú tieto jednoduché termíny, že dĺžka života pacienta ovplyvnená rakovinou bude predĺžená, alebo že jeden alebo viac symptómov ochorení bude redukovaný.
Termín „organizmus“ sa vzťahuje na živú entitu pozostávajúcu aspoň z jednej bunky. Živý organizmus môže byť tak jednoduchý ako napr. jednoduchá eukariotická bunka alebo tak komplexný ako cicavec, vrátane ľudí.
Termín „terapeuticky účinné množstvo“ sa vzťahuje na také množstvo podávanej zlúčeniny, ktoré zmierňuje jeden alebo viac symptómov ošetrovanej poruchy. Čo sa týka rakoviny, tak terapeuticky účinné množstvo sa vzťahuje na množstvo, ktoré má nasledujúci účinok:
(1) znižuje veľkosť nádoru;
(2) inhibuje (t. j. spomaľuje do určitej miery, výhodne zastavuje) metastázy nádoru;
(3) inhibuje (t. j. spomaľuje do určitej miery, výhodne zastavuje) rast nádoru a/alebo (4) zmierňuje do určitej miery (alebo výhodne eliminuje) jeden alebo viac symptómov súvisiacich s rakovinou.
Termín „monitorovanie“ znamená sledovanie alebo detekciu účinku po uvedení zlúčeniny do kontaktu s bunkou exprimujúcou konkrétne PK. Pozorovaný či detegovaný účinok môže byť zmena bunkového fenotypu, katalytickej aktivity PK alebo zmena interakcie PK s prirodzeným väzbovým partnerom. Techniky pozorovania alebo detekcie takých účinkov sú známe v odbore.
Citovaný účinok je vybraný zo zmeny alebo absencie zmeny bunkového fenotypu, zmeny alebo absencie zmeny katalytickej aktivity uvedenej proteínkinázy alebo zmeny alebo absencie zmeny interakcie uvedenej proteínkinázy s prirodzeným väzbovým partnerom v konečnom aspekte predloženého vynálezu.
Termín „bunkový fenotyp“ sa vzťahuje na vonkajší prejav bunky alebo tkaniva, alebo biologickej funkcie bunky alebo tkaniva. Príklady bunkového fenotypu zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, veľkosť bunky, jej rast, proliferáciu, diferenciáciu, prežitie, apoptózu a nutričný príjem a použitie. Tieto fenotypové charakteristiky sú merateľné technikami známych v odbore.
Termín „prirodzený väzbový partner“ sa vzťahuje na polypeptid, ktorý sa viaže na konkrétne PK v bunke. Prirodzení väzboví partneri môžu hrať dôležitú úlohu pri propagácii signálu pri procesoch signálnej transdukcie sprostredkovanej PK. Samotná zmena interakcie prirodzeného väzbového partnera s PK sa môže prejavovať ako zvýšená alebo znížená koncentrácia komplexu PK/prirodzeného väzbového partnera a v dôsledku toho ako pozorovateľná zmena schopnosti PK sprostredkovávať signálnu transdukciu.
Názorné zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú uvedené v tabuľke I.
Tabuľka 1
Príklad |
štruktúra |
Názov |
37 |
Λ |
(3-dietylamino-propyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2izopropyl-4-fenyl-lZZ-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
38 |
Q o _/-fQ |
(3-pyrolidín-l-yl-propyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2izopropyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
39 |
X
X |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxol,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2izopropyl-4-fenyl-l/f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
40 |
Xr°·
H |
[3-(4-metylpiperazín-l -yl)propyl]-amid 5-(5bróm-2-οχο-1,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-2-izopropyl-4-fenyl-17/-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
42 |
H |
(2-pyrolidín-I -y 1-etyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2metyl-4-fenyl-líf-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
44 |
|
(2-dimetylamino-etyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2metyl-4-fenyl-l 77-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
47 |
H |
(3-dietylamino-propyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2metyl-4-fenyl-1 fŕ-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
48 |
O M
\_/-N |
(2-dimetylamino-etyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmety 1)-2,4dimetyl- l/f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
49 |
|
(2-dimetylamino-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5(2-oxo-6-fenyl-l ,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-1 /Z-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
50 |
Y- |
(2-dimetylamino-etyl)-anaid 5-(5-chlór-2-
oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4dimetyl-l/f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
51 |
° H |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxol,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4dimetyl-12/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
52 |
o M
H |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-
oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-
dimetyl-l/f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
53 |
0 N
y>R |
(3-imidazol-l-yl-propyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4dimetyl-17f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
56 |
H |
(2-dietylamino-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
57 |
|
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-
(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
58 |
o M \>K
H |
(3-imidazol-l-yl-propyl)-amid 2,4-dimetyl-
5-(2-oxo-5-fenyl-1,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
59 |
Q H
\_Λί |
(2-dietylamino-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2οχο-6-fenyl-l ,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
60 |
O M |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-
(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-17T-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
61 |
. H
\ Z'H |
(3-imidazol-l-yl-propyl)-amid 2,4-dimetyl-5(2-oxo-6-fenyl-l ,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)- 177-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
62 |
Cl |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-[6-(3,5dichlórfenyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
63 |
0 N7
N |
(2-dietylamino-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2oxo-6-pyridín-3-yl-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
64 |
o O |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-
(2-oxo-6-pyridín-3-yl-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
65 |
\_An '
N |
(3-dimetylamino-propyl)-amid 2,4-dimetyl-
5-(2-oxo-6-pyridín-3-yl-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-1 H-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
66 |
Q
\~Λν ‘
%/
H |
(3-dimetylamino-propyl)-amid 2,4-dimetyl5-(2-oxo-5-fenyl-l ,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-! /7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
67 |
O-OqCÍ'V
H |
(3-dietylamino-propyl)-amid 2,4-dimetyl-5(2-oxo-5-fenyl-1,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-177-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
68 |
7'- |
(3-dietylamino-propyl)-amid 2,4-dimetyl-5(2-oxo-6-fenyl-1,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
70 |
«Αν |
(3-dietylamino-propyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo- 1,2-dihy dro-indol-3 -ylidénmety 1)-2,4dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
71 |
-AA |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxol,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4diizopropyl- l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
72 |
ä |
(3-dietylamino-propyl)-ainid 5-(5-bróm-2-
oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4diizopropyl-177-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
73 |
<ΛΚ
BrOc|p1'ľ>V'0 |
(3-pyrolidin- l-yl-propyl)-amid 5-(5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4diizopropyl-l/í-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
74 |
|
(pyridin-4-ylmetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-
1,2-dihy dro-indol-3-y lidénmetyl)-2,4dimetyl-1 Jf-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
75 |
o £> |
(2-pyrolidín-l-yI-etyl)-amid 5-(6-(4butylfenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lZZ-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
77 |
o P |
(2-pyrolidín-l -y 1-etyl)-amid 5-(6-(4etylfenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
79 |
0 |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(6-(3-
izopropylfenyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
80 |
<A o N~r
H |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo1,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4dimetyl-líf-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
81 |
Γ o N-/
OH M |
3-[4-(2-dietylamino-etylkarbamoyl)-3,5dimetyl-l//-pyrol-2-ylmetylen]-2-oxo-2,3dihydro-l#-indol-6-karboxylová kyselina |
82 |
o O
O rV°* W“0 |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(5dimetylsulfamoyl-2-oxo-l ,2-dihydro-indol3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lZ/-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
83 |
s
v |
(2-pyrolidín- l-yl-etyl)-amid 5-(5-(3chlórfenylsulfamoyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
84 |
o
o __Λ7 |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5[2-oxo-5-(pyridín-3-ylsulfamoyl)-l,2dihydro-indol-3-ylidénmetyl]- l/ŕ-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
85 |
|
3-[3,5-dimetyl-4-(4-metylpiperazín-lkarbonyl)-12/-pyrol-2-ylmetylén]-4-(2hydroxyetyl)-1,3-dihydro-indol-2-ón |
86 |
y°- |
fenyl-amid 3-(3,5-dimetyl-4-(4metylpiperazín-l-karbonyl)-l//-pyrol-2ylmetylén]-2-oxo-2,3-dihydro-l H-indol-5sulfónovej kyseliny |
87 |
r, o K-í |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5dimetylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl- lH-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
88 |
% O
& >ZN v° rV° xxl· |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-(3chlórfenylsulfamoyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
116 |
Q . O*-/ |
etylester {[4-metyl-5-(4-metyl-5metylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)- l//-pyrol-3-karbonyl]-amino}octovej kyseliny |
117 |
|
etylester {[4-metyl-5-(5-metylsulfamoyl-2-
oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmety 1)-1//- |
pyrol-3-karbonyl]-amino}-octovej ! |
cyseliny |
118 |
vRR |
{[4-metyl-5-(5-metylsuIfamoyl-2-oxo-l ,2dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-l//-pyrol-3karbonyl]-amino}-octová kyselina |
119 |
|
metyl-amid 3-[3-metyl-4-(piperidín-l karbonyl)-1 /f-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3dihydro-l//-indol-5-sulfónovej kyseliny |
126 |
✓'“•CH.
M>CvXfJ/XZ ^CH1
CH‘
í JZ >=o
H |
(2-dietylamino-etyl)-amid 2,4dimetyl-5-[2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-yIidénmetyl]-l//-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
381 [M
+ 1] |
127 |
/-CH»
0 N
-- ^CH,
UXK>=0 |
(2-dietylamino-etyl)-amid 5-[5chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-1/7pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
415 [M
+ i) |
128 |
H |
(2-pyrolidín-l-etyl)-amid 2,4-
dimetyl-5-[2-oxo-l,2-dihydroindoI-(3Z)-ylidénmetyl]- 1/7-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
379 [M
+ 1] |
129 |
yk—θ
fy^*hC?” CHi
H |
(2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-[5fluór-2-οχο-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl- 1Hpyrol-3-karboxylovej kyseliny |
397 [M
+ U |
130 |
χίϋ
H |
(2-pyrolidín- l-yl-etyl)-amid 5-[5chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
413 [M
+ i] |
131 |
CM,
1 M c Q *__zN_CH>
rvCo c‘ |
(2-dimetylamino-etyl)-amid 2,4dimetyI-5-[2-oxo-1,2-dihy droindol-(3Z)-ylidénmetyl]-l/7-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
353 [M
+ 1] |
133 |
0 N í
JrL
«X? CHj
Ύ T>=o |
(2-acetylamino-etyI)-amid 5-[5chlór-2-oxo-l ,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-karboxylovej kyseliny |
399 [M
- G |
134 |
o 8
HA Λν Ϊ C~Ĺ H V+rO CH’
11 |
(2-acetylamino-etyl)-amid 5-[5fluór-2-oxo-l ,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lŕŕpyrol-3-karboxylovej kyseliny |
383 [M
- G |
135 |
H ru 0 n CH,
ΗΟ-Ν~
Γ ^j ~CH
Ο-a h
f T >=°
X |
(2-acetylamino-etyl)-amid 2,4dimetyl-5-[2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidénmetyl]-l ZT-pyrol3-karboxylovej kyseliny |
365 [M
- i] |
136 |
d~L
V-X CH·· ll I >a |
[3-(2-oxotetra-pyrimidín-l-yl)propyl]-amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-177-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
500 [M + G
502 [M + H |
137 |
0
0 ^Λ«
« CH·
It I )=° |
[3-(2-oxo-tetrahydro-pyrimidín-l propyl]-amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-177-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
454 [M
- G |
138 |
0 t-f H trcH>
TľL.
H |
[3-(2-oxo-tetrahydro-pyrimidín-l propyl]-amid 5-[5-fIuór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]Z^-dimetyl-l/f-pyrol-Skarboxylovej kyseliny |
438 [M
- i] |
139 |
O
s
.U ιό· (30-°
H |
[3-(2-oxo-tetrahydro-pyrimidín-l propyl]-amid 2,4-dimetyl-5-[2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
422 [M
+ 1] |
141 |
O
d O N-^Z
h,c KN'~^'
H, O
Xó-“ X- |
trifluóracetát-4-[2-({5-[5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/ípyrol-3-karbonyl}-amino)-etyl]-2oxo-piperazín- 1-ium |
486 [M
+ Π
488 [M
+ G |
|
|
|
+ U |
143 |
r™
0
*'C^ |
[2-(2-oxo-imidazolidín-l-yl)-etyl]amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-l/ŕ-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
470 [M
- U
472 [M
- i] |
144 |
r'NH
MC ?
AA-N 0
N
B í >=O |
[2-(2-oxo-imidazolidín-l -yl)-etyl]amid 5-[5-chlór-2-oxo-l ,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-1 ZZ-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
428 [M
+ 1] |
145 |
f''' NH
0 N-Z
0
FY>/ireN
1[ X A=° |
[2-(2-oxo-imidazolidín-l -yl)-etyl]amid 5-[5-fluór-2-oxo- 1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-lff-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
412 [M
+ 1] |
146 |
ΓΝη
Χ'~Μ” ap“1 |
[2-(2-oxo-imidazolidín-l-yl)-etyl]amid 2,4-dimetyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
392 [M
- U |
148 |
A
X'V“ °
ι-γν/Γ“·
(Z. >“9
H |
etylester {4-[2-({5-[5-bróm-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l Hpyrol-3-karbonyl}-amino)-etyl]piperazín-l-yl}-octovej kyseliny |
558 [M + U
560 [M
+ 1] |
149 |
A
r-'vo’ 0 N j o
yJ-B
n fí N^CH.
O> |
etylester {4-[2-({5-[5-chlór-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-karbonyl}-amino)-etyl]piperazín-l-yl}-octovej kyseliny |
514 [M
+ 1] |
150 |
ma
ť' fyo
O N j n
ýfi'
k |
etylester {4-[2-({5-[5-fluór-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//pyrol-3-karbonyl}-amino)-etyIJpiperazín-1-yl]-octovej kyseliny |
498 [M
+ Π |
154 |
*ν%/ΐΓ*
I X>° |
[3-(2-oxo-azepan-1 -y 1)-propy 1]amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-1 JZ-pyrol-3 karboxylovej kyseliny |
511 [M
- Π
513 [M
- U |
155 |
v-r-b
T X |
[3-(2-oxo-azepan-l-yl)-propyl]amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-l/7’-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
469 [M
+ U |
156 |
«J-r^b
vr<r
H |
[3-(2-oxo-azepan-l-yl)-propyl]amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-12/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
453 [M +1] |
157 |
Xzb
zyCll·0'
fi 1 >=0 |
[3-(2-oxo-azepan-l-yl)-propyl]amid 2,4-dimetyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
435 [M + 1] |
159 |
H ru 0 *kzCH5
vr ť
ΒγΆ^-< H CH> i
W° ί |
(2-acetylamino-etyl)-amid 5-[5bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
443 [M
- H
445 [M
- U |
160 |
d
0 N^Z
vr
rcM> T T >° r, JL·
O-B f^OH |
Trifluóracetát-4-[2-({5-[5-fluór-2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lŕ/pyrol-3-karbonyl}-amino)-etyl]-2oxo-piperazín-l-ium; |
426 [M
+1] |
161 |
. á
CQ“ |
trifluóracetát-4-[2-({2,4-dimetyl-5[2-oxo- 1,2-dihydro-indol-(3 Z)ylidénmetyl]-l//-pyrol-3karbonyl)-amino)-etyl]-2-oxopiperazín-l-ium; |
408 [M + i] |
168 |
0 o H-Y
A
U>° |
trifluóracetát-4-[2-({5-[5-chlór-2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7pyrol-3-karbonyl}-amino)-etyl]-2oxo-piperazín-l-ium; |
440 [M
-1] |
168 |
0 <%ΧΗ’ n,C.JkN^A /1 H r J M θ’
( Σ >=0
H |
[2-(4-metyl-piperazín-1 -y 1) - ety 1 ] amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-lfl-pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
424 [M -1] |
169 |
0 <VCM·
ΗΓνΑΆ
JTÍ ”
< N CH. a^y^J H lI^° \^N
H |
[2-(4-metyl-piperazín-l-yl)-etyl]amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
440 [M
- Π |
170 |
0 (^n-cm·
H.C, /h^N^
Ä k H θ+ '
H |
[2-(4-metyl-piperazín-1 - y l)-etyl ] amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyIJ2,4-dimetyl-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
484 [M -1]
486 [M -i] |
171 |
o r*'CH’
Ά=~'^ oA
H |
[2-(4-metyl-piperazín-l-yl)-etyl]amid 2,4-dimetyl-5-[5-bróm-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
406 [M
- Π |
172 |
CH»
° lA
/K* ’
ZN CH,
___ fí H ‘
f :í>o AA
H |
[2-(3,5-dimetyl-piperazín-1 -yl)etyl]-amid 2,4-dimetyl-5-[2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
422 [M
+ 1] |
173 |
A*
0 Γ Nrt
A-A^A^
F _ / B “*>
IT>° |
[2<(3,5-dimetyl“piperazín-l -yl)etyl]-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetylj2,4-dimetyl-177-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
438 [M
-1] |
174 |
C
Vy/,-.
X X H
“Yy/J cm’
H |
CH, AlW Ά |
[2-(3,5-dimetyl-piperazín-l-yl]etyl]-amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-l J/-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
456 [M
+ 1] |
175 |
Xc
K |
CH, /hh Ά, |
[2-(3,5-dimetyl-piperazín-l-yl)etyl]-amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-l ŕf-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
498 [M
-1]
500 [M
- U |
176 |
0 z
AT'“’
í T >0
O-N
H |
,-~Ά |
[3-(4-metyl-piperazín-l-yI)propyl]-amid 2,4-dimetyl-5-[2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-177-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
422 [M
+ 1] |
177 |
0
H'CJL
JkH
/ fi CH>
TX^=° |
λα Z <yN-CH, |
[3-(4-metyl-piperazín-l-yl)propyl]-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
438 [M
- i] |
178 |
0
M“
3Ύ H íf CH> tí ^^Γ\_
II f >=o
. H |
<zn-ch, |
[3-(4-metyl-piperazín-l-yl)propyl]-amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyI-l//-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
454 [M
-1] |
179 |
-tíR
H |
V^n-Ch, |
[3-(4-metyl-piperazín-l-yl)propyl]-amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-1 //-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
498 [M
- Π
500 [M -1] |
184 |
5».
0 r'N'^r0
0
H
CM’
| J/—o |
(3-pyrolidín-l-yl-2-ón)-amid 5-[5chlór-2-οχο-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-177pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
480 [M
+ 1] |
185 |
P
o ΧΉ
1/ V K CH.
T £>=C CF.CO.H
H |
trifluóracetát-4-[2-({5-[5-chlór-2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/fpyrol-3-karbonyl}-amino)-etyl]-2oxo-piperazín-1 -ium; |
440 [M
- U |
186 |
fl 0
# N CH. H
1 Γ >o
H |
(3-pyrolidín-l-yl-2-ón)-amid 5-[5chlór-2-oxo-l ,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
|
187 |
CH1
T i>o V-n
H |
(3-pyrolidín-l-yl-2-ón)-amid 5-[5fluór-2-oxo-l ,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/fpyrol-3-karboxylovej kyseliny |
188 |
-w“»—ď
Αν CH,
H
f i >=o |
(3-pyrolidín-l-yl-2-ón)-amid 5-[2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l 77pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
189 |
» Ol
εΟδθζ? CH’
10--/=0 ΟΡ,ΟΟ,Η |
(2-pyridín-2-yl-etyl)-amid 5-[5chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-17fpyroI-3-karboxylovej kyseliny |
190 |
O8'“^ /Ach,
F W°H cfícoím
H |
Trifluóroctová soľ (2-pyridín-2-yletyl)-amidu 5-[5-fluór-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-17Z-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
191 |
H C X jOi
>ô N
/ k CM<
CA-n 0 CIH
H |
hydrochlorid (2-pyridín-2-yl-etyl)amidu 5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
192 |
HC I O
M,>ô N
Ovi ch‘ UO CF,COZH
H |
Trifluóroctová soľ (2-pyridiπ-2-yletyl)-amidu 5-[5-bróm-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]2,4-dimetyl-177-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
193 |
F ď N CH-
rVv H
H |
(2-etylamino-etyl)-amid 5-[5-fluór2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-177pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
194 |
Q NH,
1 T
ČAJI |
(2-amino-etyl)-amid 5-[5-íluór-2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//'pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
201 |
a“·
H |
(karboxymetyl)-amid 5-[5-fluór-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//pyrol-3-karboxylovej kyseliny |
204 |
o P
BW
H |
trifluóracetát (3-pyrolidín-1-y 1-2ón-propyl)-amidu 5-[5-bróm-2oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidénmetyl]-lZf-pyrol-3karboxylovej kyseliny |
Čísla zlúčenín zodpovedajú číslam príkladov v príkladoch uskutočnení vynálezu, t. j. syntéza zlúčeniny 1 v tabuľke 1 je opísaná v príklade 1. Zlúčeniny uvedené v tabuľke 1 majú iba ilustrativny charakter a nemajú nijako limitovať akýmkoľvek spôsobom rozsah predloženého vynálezu.
Výhodné uskutočnenia
Zatiaľ čo najširšia definícia bola podaná v podstate vynálezu, výhodné sú určité uvedené zlúčeniny všeobecného vzorca (I).
(1) Výhodná skupina zlúčenín všeobecného vzorca (I) je taká, kde substituenty R1, R3 a R4 sú atóm vodíka.
(2) Ďalšia výhodná skupina zlúčenín všeobecného vzorca (I) je taká, kde substituenty R1, R2 a R4 sú atóm vodíka.
(3) Ďalšia výhodná skupina zlúčenín všeobecného vzorca (I) je taká, kde substituenty R1, R2 a R3 sú atóm vodíka.
(4) Ďalšia výhodná skupina zlúčenín všeobecného vzorca (I) je taká, kde substituenty R2, R3 a R4 sú atóm vodíka.
(5) Ďalšia výhodná skupina zlúčenín všeobecného vzorca (I) je taká, kde substituenty R1, R2, R3 a R4 sú atóm vodíka.
(6) Ešte ďalšia výhodná skupina zlúčenín všeobecného vzorca (I) je taká, kde substituent R1 je vodík, alkyl, -C(O)NR8R9, výhodne vodík alebo metyl, najmä vodík;
substituent R2 je vodík, chlór, bróm, fluór, fenyl, dimetylaminosulfonyl, 3-chlórfenylaminosulfonyl, aminosulfonyl, metylaminosulfonyl, fenylaminosulfonyl, pyridm-3-yl-aminosulfonyl, dimetylaminosulfonyl, izopropylaminosulfonyl, výhodne vodík, fluór alebo bróm;
substituent R3 je vodík, metoxy, karboxy skupina, fenyl, pyridín-3-yl, 3,4-dichlórfenyl, 4-n-butylfenyl, 3-izopropylfenyl, výhodne vodík alebo fenyl; a substituent R4 je vodík.
V rámci výhodnej skupiny (6) je výhodnejšia skupina zlúčenín, kde:
substituent R5 je vodík, metyl, etyl, izopropyl, terc-butyl, izobutyl alebo n-butyl, výhodne vodík alebo metyl; a substituent R7 je vodík, metyl, etyl, izopropyl, n-, izo- alebo terc-butyl, fenyl, výhodne metyl, vodík alebo fenyl.
(7) Ešte ďalším výhodným uskutočnením podľa tohto vynálezu je zlúčenina, ktorá má opísanú štruktúru, v ktorej R13 a R14 sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, heteroarylu a, v kombinácii, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2),O(CH2)2- alebo -(CH2)2N(CH3)CH2)2-.
Detailný opis
PK, ktorých katalytická účinnosť je modulovaná zlúčeninami podľa predloženého vynálezu, zahrnujú tyrozínkinázy, ktoré môžu byť rozdelené na dva typy, receptorové tyrozínkinázy (RTK) a vedú k vytvoreniu komplexov so spektrom cytoplazmatických signálnych molekúl, ktoré uľahčujú adekvátnu bunkovú odpoveď (napríklad bunkové delenie, metabolické účinky na extraceluláme mikroprostredie), pozri Schlessinger a Ullrich, 1992, Neurón 9: 303 - 391.
Dokázalo sa, že fosforylačné miesta tyrozinu na receptoroch rastového faktora fungujú ako vysoko afinitne väzbové miesta pre domény SH2 (src homológia) na signálnych molekulách. Fanti et al, 1992, Celí 69: 413 - 423; Songyang et al, 1994, Mol. Celí. Biol. 14: 2777 - 2785; Songyang et al, 1993, Celí 72: 767 - 778; a Koch et al, 1991, Science 252: 668 - 678. Identifikovalo sa niekoľko intracelulárnych substrátových proteínov, ktoré sa asociujú s receptorovými tyrozínkinázami (RTK). Môžu byť rozdelené do dvoch hlavných skupín: (1) substráty, ktoré majú katalytickú doménu a (2) substráty, ktoré takú doménu nemajú, ale slúžia ako adaptéry a asociujú sa s katalytický aktívnymi molekulami (Songyang et al, 1993, Celí 72: 767 - 778). Špecificita interakcií medzi receptormi a doménami SH2 ich substrátov je určovaná aminokyselinovými zvyškami, bezprostredne obklopujúcimi fosforylovaný tyrozínový zvyšok. Rozdiely vo väzbových afinitách medzi SH2 doménami a aminokyselinovými sekvenciami obklopujúcimi fosfotyrozínové zvyšky na konkrétnych receptoroch korelujú s pozorovanými rozdielmi v ich substrátových fosforylačných profiloch (Songyang et al, 1993, Celí 72: 767 - 778). Z pozorovaní vyplýva, že funkcia každej receptorovej tyrozínkinázy je určovaná nielen profilom jej expresie a dostupnosťou ligandov, ale aj radom „downstreamových“ transdukčných dráh signálu, ktoré sú aktivované konkrétnym receptorom. Fosforylácia teda poskytuje významný regulačný stupeň, ktorý určuje selektivitu signálnych dráh vyvolávaných konkrétnymi receptormi rastového faktora, ako aj receptory diferenciačného faktora.
STK, primáme cytozolové, ovplyvňujú vnútornú biochémiu bunky často ako zavádzaciu odpoveď na výskyt PTK. STK sa podieľajú na signálnom procese, ktorý iniciuje syntézu DNA a následnú mitózu, ktorá vedie k bunkovej proliferácii.
PK signálna transdukcia má teda za následok, medzi ďalšími odpoveďami, bunkovú proliferáciu, diferenciáciu, rast a metabolizmus. Abnormálna bunková proliferácia môže viesť k širokému spektru porúch a ochorení, vrátane vývoja neoplázie, napr. karcinómu, sarkómu, glioblastómu a hemangiómu, porúch, napr. leukémie, psoriázy, artériosklerózy, artritídy a diabetickej retinopatie a ďalších porúch súvisiacich s nekontrolovanou angiogenézou a/alebo vaskulogenézou.
Presné pochopenie mechanizmu, ktorým zlúčeniny podľa predloženého vynálezu inhibujú PK, nie je treba poznať na využívanie predloženého vynálezu. Ale predpokladá sa, aj keď to neznamená obmedzenie na určitý konkrétny mechanizmus alebo teóriu, že tieto zlúčeniny interagujú s aminokyselinami v katalytickej oblasti PK. PK majú typicky bilobátovú štruktúru, kde ATP sa zrejme viaže v štrbine medzi dvoma lalokmi v oblasti, v ktorej sú aminokyseliny medzi PK konzervatívne. Ďalej sa predpokladá, že inhibítory PK sa viažu nekovalentnými interakciami, napr. vodíkovou väzbou, van der Waalsovými silami a iónovými interakciami v rovnakej všeobecnej oblasti, ako sa spomínaný ATP viaže na PK. Konkrétnejšie sa dá povedať, že 2-indolinónová zložka zlúčenín podľa predloženého vynálezu sa viaže vo všeobecnej medzere normálne obsadenej adenínovým kruhom ATP. Špecifickosť konkrétnej molekuly pre príslušné PK môže potom vznikať ako výsledok ďalších interakcií medzi rôznymi substituentmi na 2-indolinónovom jadre a aminokyselinovými doménami špecifickými proti konkrétnym PK. Rôzne substituenty indolinónu teda môžu prispievať k preferenčnej väzbe na konkrétne PK. Možnosť výberu zlúčeniny, ktorá bude aktívna v rôznych väzbových miestach ATP (alebo iného nukleotidu), umožňuje, že zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú použiteľné na zacielenie akéhokoľvek proteínu na také miesto. Zlúčeniny uvedené v predloženom vynáleze teda sú použiteľné pri in vitro testoch s týmito proteínmi a tiež majú in vivo terapeutické účinky vplyvom interakcií s takými proteínmi.
Ďalej poskytujú zlúčeniny podľa predloženého vynálezu terapeutický spôsob ošetrenia rôznych druhov pevných nádorov, vrátane, ale nie je to na ne, karcinómov, sarkómov, vrátane Kaposiho sarkómu, erytroblastómu, glioblastómu, meningiómu, astrocytómu, melanómu a myoblastómu. Ošetrenie alebo prevencia nepevných nádorov, napr. leukémia, tiež spadá do predloženého vynálezu. Indikácie môžu zahrnovať, ale bez obmedzenia, rakoviny mozgu, rakoviny močového mechúra, ovariálne rakoviny, rakoviny žalúdku, rakoviny pankreasu, rakoviny hrubého čreva, rakoviny krvi, rakoviny pľúc a rakoviny kostí.
Ďalšie príklady typov porúch súvisiacich s neprimeranou aktivitou PK, kde môžu byť zlúčeniny podľa predloženého vynálezu použiteľné pri prevencii, ošetrení a štúdiu, zahrnujú, ale bez obmedzenia, bunkové proliferatívne poruchy, fibrotické poruchy a metabolické poruchy.
Bunkové proliferatívne poruchy, pri ktorých je možná prevencia, ošetrenie alebo ďalšia štúdia podľa predloženého vynálezu, zahrnujú rakovinu, proliferatívne poruchy krvných ciev a proliferatívne poruchy mezangiálnych buniek.
Proliferatívne poruchy krvných ciev sa týkajú porúch súvisiacich s abnormálnou vaskulogenézou (tvorba krvných ciev) a angiogenézou (šírenie krvných ciev). Zatiaľ čo vaskulogenéza a angiogenéza majú dôležitú úlohu pri rôznych normálnych fyziologických procesoch, napr. vývoji embrya, tvorby žltého telieska, hojení rán a regenerácie orgánu, môžu tieto poruchy hrať kľúčovú úlohu pri vývoji rakoviny, a tým viesť k tvorbe nových kapilár potrebných na udržanie aktivity nádoru. Ďalšie príklady proliferatívnych porúch krvných ciev zahrnujú artritídu, kde nové kapilárne krvné cievy napádajú kĺby a ničia chrupavku, a očné ochorenie ako napr. diabetickú retinopatiu, kde nové kapiláry na sietnici napádajú sklovec, spôsobujú krvácanie a slepotu.
Zistilo sa, že dve štruktúrne príbuzné RTK viažu VEGF s vysokou afinitou: receptor tyrozínu 1 typu fms (fit-1) (Shibuya et al., Oncogene 5: 519 -524,1990; DeVrics et al. Science 255; 989 - 991,1992) a receptor KDR/FLK-1 tiež známy ako VEGF-R2. Publikovalo sa, že rastový faktor vaskulárnych endotelových buniek je špecifický mitogén endoteliálnych buniek s in vitro promotomou aktivitou k rastu endoteliálnych buniek. Ferara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851 - 858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 19461 - 19566. Údaje uvedené v prihláške vynálezu U.S. č. 08/193,829, 08/038,596 a 07/975,750, dôrazne poukazujú na to, že VEGF nie je zodpovedný iba za proliferáciu endoteliálnych buniek, ale tiež za prvotnú reguláciu normálnych a patologických angiogenézií. Všeobecne pozri Klagsbum & Soker, 1993, Curent Biology, 3(10) 699 - 702; Houck, et al, 1992, J. Biol. Chem., 267:26031 -26037.
Normálna vaskulogenéza a angiogenéza hrá dôležitú úlohu pri rôznych fyziologických procesoch, napr. embryonálnom vývoji, hojení rán, regenerácii orgánu a ženských reproduktívnych procesoch, napr. vývoji folikúl v žltom teliesku počas ovulácie a rastu placenty počas tehotenstva. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16): 1093 1 - 34. Nekontrolovateľná vaskulogenéza a/alebo angiogenéza býva spojená s ochoreniami, napr. s cukrovkou, ako aj s malígnymi pevnými nádormi, ktoré sú od vaskularizácie závislé z hľadiska rastu. Klagsbum & Soker, 1993, Curent Biology, 3(10) 699 - 702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer. Inst., 82: 4 - 6; Weidner, et al, 1991, NewEnglJ. Med., 324: 1 - 5.
Predpokladaná úloha VEGF pri proliferácii a migrácii endoteliálnych buniek počas angiogenézy a vaskulogenézy indikuje dôležitú úlohu receptora KDR/FLK-1 pri týchto procesoch. Ochorenie, napr. diabetes mellitus (Folkman, 198, in Xlth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al, eds.), pp. 583 - 596. Lcuven University Press, Leuven) a artritída, ako aj rast malígneho nádoru, môžu vyplývať z nekontrolovateľnej angiogenézy. Pozri napr. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182 - 1186. Receptory, na ktoré sa VEGF špecificky viažu, sú dôležité a účinné ciele regulácie a modulácie vaskulogenézy a/alebo angiogenézy a rôznych závažných ochorení, ktoré zahrnujú abnormálny bunkových rast spôsobený týmito procesmi. Plowman, et al, 1994, DN&P, 7(6):334 - 339. Detailnejšie hrá receptor pre KDR/FLK-1 vysoko špecifickú úlohu pri neovaskularizácii vytvárajúci vybraný cieľ pre terapeutické prístupy k ošetreniu rakoviny a ďalších ochorení zahrnujúcich nekontrolovateľnú tvorbu krvných ciev.
Predložený vynález teda poskytuje zlúčeniny schopné regulácie a/alebo modulácie tyrozínkinázovej transdukcie signálu, vrátane transdukcie signálu receptora KDR/FLK-1 na účely inhibície alebo podpory angiogenézy a/alebo vaskulogenézy, t. j. zlúčeniny inhibujú, zabraňujú alebo interferujú so signálom transdukovaným KDR/FLK-1 za predpokladu, že je aktivovaný ligandom napr. VEGF. Aj keď sa predpokladá, že zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pôsobia na receptor alebo ďalší komponent spoločne s transdukčnou signálnou dráhou tyrozínkinázy, môžu tiež pôsobiť priamo na nádorové bunky vznikajúce v dôsledku nekontrolovateľnej angiogenézy.
Aj keď názvoslovie ľudských a myších náprotivkov generického receptora „ílk-I“ je rozdielne, v mnohých ohľadoch sú zameniteľné. Myší receptor, Flk-1, a jeho ľudský náprotivok, KDR, majú sekvenčnú homológiu z 93,4 % v intracelulámej doméne. Myši Flk-1 sa tiež viaže na ľudský receptor VEGF s rovnakou afinitou ako myšia VEGF, a teda je aktivovaný ligandom odvodeným od ktorékoľvek druhu. Millauer et al., 1993, Celí, 72: 835 - 846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7533 - 7537. FLK-1 sa tiež asociuje a následne tyrozín fosforyluje ľudské substráty RTK (napr. PLC-γ alebo p85), pokiaľ sú koexprimované v bunkách 293 (ľudské embryonálne obličkové fibroblasty).
Preto modely, ktoré sa opierajú o receptor FLK-1, sú priamo aplikovateľné na pochopenie funkcie receptora KDR. Napríklad použitie myšieho receptora FLK-1 v spôsoboch, ktoré identifikujú zlúčeniny, ktoré regulujú myšiu dráhu signálnej transdukcie, sú priamo aplikovateľné na identifikáciu zlúčenín, ktoré môžu byť používané na reguláciu ľudskej dráhy transdukcie signálu, t. j. regulujú aktivitu spojenú s receptorom KDR. Chemické zlúčeniny identifikované ako inhibítory KDR/FLK-1 in vitro teda môžu byť potvrdené na vhodných in vivo modeloch. Myšie aj potkanie in vivo zvieracie modely boli potvrdené ako excelentné spôsoby skúmania klinickej účinnosti agens pôsobiacich na KDR-FLK-1 indukovanú dráhu transdukcie signálu.
Predložený vynález teda poskytuje zlúčeniny, ktoré regulujú, modulujú a/alebo inhibujú vaskulogenézu a/alebo angiogenézu ovplyvnením enzymatickej aktivity receptora KDR/FLK-1 a interferencie so signálom transdukovaným KDR/FLK-1. Predložený vynález teda poskytuje terapeutický prístup k ošetreniu mnohých druhov pevných nádorov, vrátane, ale nie je to nijako limitované, glioblastómu, melanómu a Kaposiho sarkómu, a karcinómu vaječníku, pľúc, prsníka, prostaty, pankreasu, hrubého čreva a epidermoidného karcinómu. Navyše z dostupných údajov je možné povedať, že podanie zlúčenín, ktoré inhibujú dráhu transdukcie signálu sprostredkovanú KDR/Flk-1, môže byť tiež používané pri ošetrení hemangiómu, restenózy a diabetickej retinopatie.
Ďalej ešte sa tento vynález týka inhibície vaskulogenézy a angiogenézy ďalšími dráhami sprostredkovanými receptorom, vrátane dráhy zahrnujúcej receptor fit-1.
Transdukcia signálu sprostredkovaná receptorovou tyrozínkinázou sa pritom začína extracelulámou interakciou so špecifickým rastovým faktorom (ligandom), po ktorej typicky nasleduje dimerizácia receptora, tranzitná stimulácia vnútornej aktivity proteínovej tyrozínkinázy a autofosforylácie. Vytvoria sa tak väzbové miesta pre molekuly intracelulámej signálnej transdukcie a vedú k vytvoreniu komplexov so spektrom cytoplazmatických signálnych molekúl, ktoré uľahčujú adekvátnu bunkovú odpoveď (napríklad bunkové delenie, diferenciácia, metabolické efekty, zmeny extracelulárneho mikroprostredia), pozri Schlessinger a Ullrich, 1992, Neurón 9: 1-20.
Blízka homológia intracelulámych oblastí KDR/FLK-1 s receptorom PDGF-β (50,3 % homológie) a/alebo príbuzným receptorom flk-1 ukazuje na indukciu dráhy transdukcie signálu. Napríklad bolo pre receptor PDGF-bb publikované, že členovia rodiny src (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7696 - 7700), fosfatidylinozitol-3'-kináza (Hu et al., 1992, Mol. Celí. Biol, 12 : 981 - 990), fosfolipáza cyy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Celí. Biol., 4 : 49 - 51), ras-GTPázu-aktivujúci proteín, (Kashishian et al., 1992, EMBOJ., 11: 1373 - 1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90: 6939 - 6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Celí. Biol., 14: 6715 - 6726) a adaptérové molekuly Shc a Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Celí. Biol., 13: 6889 - 6896) sa viažu na oblasti zahrnujúce rôzne autofosforylačné miesta. Všeobecnejšie pozri Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37 - 54. Teda pravdepodobne dráhy transdukcie signálu aktivované KDR/FLK-1 zahrnujú dráhu ras (Rozakis et al., 1992, Náture, 360: 689 - 692), PI-3'-kinázu, dráhy sprostredkované src a plcy. Každá z týchto dráh môže hrať kruciálnu úlohu pri angiogénnom a/alebo vaskulogénnom účinku KDR/FLK-1 v endoteliálnych bunkách. Teda sa ďalší aspekt predloženého vynálezu týka použitia tu opísaných organických zlúčenín na moduláciu angiogenézy a vaskulogenézy, pretože tieto procesy sú riadené týmito dráhami.
Naopak sú zahrnuté aj poruchy súvisiace so zmrštením, kontrakciou alebo zavieraním krvných ciev, ako je restenóza, a môžu byť ošetrované alebo môže byť im zabránené spôsobmi podľa predloženého vynálezu.
Fibrotické poruchy sa týkajú abnormálnej tvorby extracelulámych matríc. Príklady fibrotických porúch zahrnujú hepatickú cirhózu a proliferatívne poruchy mesangiálnych buniek. Hepatická cirhóza je charakterizovaná prírastkom konstituentov extracelulárnej matrice, čo vedie k tvorbe hepatických jaziev. Zväčšená extraceluláma matrica majúca za následok hepatické jazvy môže byť tiež spôsobená vírusovou infekciou, napr. hepatitídou. Zdá sa, že pri hepatickej cirhóze hrajú hlavnú úlohu lipocyty. Ďalšie implikované fibrotické poruchy zahrnujú aterosklerózu.
Proliferatívne poruchy mesangiálnych buniek sa vzťahujú k poruchám spôsobeným abnormálnou proliferáciou mesangiálnych buniek. Mesangiálne proliferatívne poruchy zahrnujú rôzne ľudské renálne ochorenia, napr. glomerulonefritídu, diabetickú nefŕopatiu a malígnu nefrosklerózu, ako aj poruchy ako trombotické mikroangiopatické syndrómy, odhojovanie transplantátu a glomerulopatiu. RTK PDGFR sa podieľajú na udržaní proliferácie mesangiálnych buniek. Floge et al, 1993, Kidney International 43:47S - 54S.
Mnoho druhov rakovín zahrnuje poruchy proliferácie buniek a, ako je uvedené, súvisí PK s bunkovými proliferatívnymi poruchami. Teda nie je prekvapujúce, že PK, napr. členovia rodiny RTK, súvisia so vznikom rakoviny. Niektoré z týchto receptorov, ako EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100 : 713 - 719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707 - 712) aPDGF-R (Kumabe et al, 1992, Oncogene, 7: 627 - 633) sú pri mnohých nádoroch exprimované v nadmernom množstve a/alebo perzistentne aktivované autokrínnymi slučkami. Pri najbežnejších a najvážnejších rakovinách bola totiž zistená nadmerná expresia týchto receptorov (Akbasak and Suner-Akbasak et al, 1992, J. Neurol. Sci., 111: 119 - 133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249 - 273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352 - 1360) a autokrínnej slučky (Lee and Donoghue, 1992, J. Celí. Biol, 118: 1057 - 1070, Korc et al, supra, Akbasak and Suner-Akbasak et al, supra). Napríklad EGFR súvisí s karcinómom skvamóznych buniek, astrocytomom, glioblastómom, rakovinou hlavy a krku, rakovinou pľúc a rakovinou močového mechúra. HER2 súvisí s rakovinou prsníka, ovariálnou rakovinou, rakovinou žalúdku, rakovinou pľúc, rakovinou slinivky a močového mechúra. PDGFR súvisí s glioblastómom a melanómom, ako aj rakovinou pľúc, ovariálnou rakovinou a rakovinou prostaty. RTK c-met tiež súvisí s tvorbou malígneho nádoru. Napríklad c-met súvisí, medzi inými rakovinami, tiež s kolorektálnymi, tyreoidálnymi, pankreatickými, gastrickými a hepatocelulárnymi karcinómami a lymfómami. Navyše c-met je spojený tiež s leukémiou. Expresia génu c-met vo veľkom množstve bola tiež zistená u pacientov s Hodgkinsovou a Burkittsovou chorobou.
IGF-IR, okrem toho, že sa podieľa na nutričnej podpore a cukrovke 2. typu, súvisí tiež s niekoľkými typmi rakovín. Napríklad IGF-I sa tiež podieľa ako autokrínny rastový stimulátor na niekoľkých typoch ná dorov, napr. karcinómu buniek pri ľudskej rakovine prsníka (Arteaga et al, 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418 1423) a malobunkového nádoru pľúc (Macauley et al, 1990, Cancer Res., 50: 251 1 - 2517). IGF-I, zatiaľ čo sa celkovo podieľa na normálnom raste a diferenciácii nervového systému, predpokladá sa, že je autokrínnym stimulátorom ľudského gliómu. Sandberg-Nordqvist et al, 1993, Cancer Res. 53: 2475 - 2478. Význam IGF-IR a jeho ligandov pri proliferácii buniek je ďalej podporený faktom, že mnoho typov buniek v kultúre (fibroblasty, epiteliálne bunky, bunky hladkého svalstva, T-lymfocyty, myeloidné bunky, chondrocyty a osteoblasty (kmeňové bunky kostnej drene)) sú stimulované k rastu práve IGF-I. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1: 301 - 326. Baserga a Coppola sa domnievajú, že IGF-IR hrá najdôležitejšiu úlohu pri mechanizme transformácie a sám osebe by mohol byť preferovaným cieľom pre terapeutické intervencie širokého spektra ľudských zhubných bujnení. Baserga, 1995, Cancer Res., 55: 249 - 252, Baserga, 1994, Celí 79: 927 - 930, Coppola et al, 1994, Mol. Celí. Biol, 14: 4588 - 4595.
STK sa podieľajú na mnohých typoch rakoviny, vrátane, a to najmä, rakoviny prsníka (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54: 571 - 77 (1993)).
Vzťah medzi abnormálnou aktivitou PK a ochorením nie je obmedzený len na rakovinu. Napríklad RTK súvisí s ochoreniami, napr. psoriázou, diabetes mellitus, endometriózou, angiogenézou, vznikom ateromatózneho plaku, Alzheimerovou chorobou, restenózou, von Hippelovým-Lindauovým ochorením, epidermálnou hyperproliferáciou, neurodegeneratívnymi ochoreniami, makulárnou degeneráciou spojenou s vekom a hemangiómami. Napríklad EGFR bol zistený pri komeálnom a dermálnom hojení rán. Nedostatky v inzulín-R a IGF-IR sú indikované pri diabetes mellitus 2. typu. Plnejšiu koreláciu medzi špecifickými RTK a ich terapeutickými indikáciami je možné nájsť v Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334 - 339.
Ako je uvedené, nielen RTK, ale aj CTK, vrátane, ale nie je to nijako limitované, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr a yrk (Bolen et al., 1992, FASEB J., 6: 3403 - 3409) sa podieľajú na proliferatívnej a metabolickej dráhe transdukcie signálu, a je možné teda očakávať, a bolo to tiež tak uvedené, že sa podieľajú na mnohých poruchách sprostredkovaných PTK, na ktoré je predložený vynález, zameraný. Napríklad sa zistilo, že mutovaný src (v-src) je onkoproteín (pp60v src) pri kurčatách. Navyše jeho bunkový homológ, protoonkogén pp60c'src prenáša onkogénne signály mnohých receptorov. Nadmerná expresia EGFR alebo HER2/neu pri nádoroch vedie k konštitutívnej aktivácii pp60c src, čo je charakteristické pre malígne bunky, ale pre normálne bunky nie (úplne chýba). Na druhú stranu myši s nedostatkom expresie c-src majú osteopetrotický fenotyp, indikujúci kľúčový podiel c-src na funkciu osteoklastov a možnú účasť na príbuzných poruchách.
Podobne sa Zap70 podieľa na signalizácii T-buniek, ktoré sa podieľajú na autoimunitných poruchách.
STK súvisí so zápalom, autoimunitnou poruchou, imunoodpoveďami a hyperproliferatívnymi poruchami, ako je restenóza, fibróza, psoriáza, osteoartritída a reumatoidná artritída.
PK sa tiež podieľajú na uhniezdení embrya. Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu teda môžu poskytovať účinný spôsob prevencie takého uhniezdenia embrya, a teda byť použiteľné ako ochranný prostriedok proti počatiu. Ďalšie poruchy, ktoré môžu byť ošetrované alebo im môže byť zamedzené zlúčeninami podľa predloženého vynálezu, zahrnujú imunologické poruchy, napr. autoimunitné choroby, napr. autoimunitné ochorenie, AIDS a kardiovaskulárne poruchy, napr. ateroskleróza.
Konečne v súčasnej dobe existuje podozrenie, že RTK i CTK sa podieľajú na hyperimunitných poruchách.
Príklady účinkov mnohých názorných zlúčenín podľa predloženého vynálezu na niekoľko PTK je uvedené v tabuľke 2. Prezentované zlúčeniny a údaje nemajú nijako limitovať rozsah vynálezu.
Dávky a farmaceutický prípravok
Zlúčenina podľa predloženého vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľná soľ môžu byť samy osebe podávané ľudským pacientom alebo môžu byť podávané vo farmaceutických prípravkoch, v ktorých sú uvedené látky zmiešané s vhodnými nosičmi alebo excipientom(mi). Techniky prípravy a podanie liečiv môžu byť nájdené v „Remington's Pharmacological Scicnces,“ Mack Publishing Co., Easton, PA., posledné vydanie.
Termín „podanie“, ako je používaný v predloženom vynáleze, sa vzťahuje na podanie zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, alebo farmaceutického prípravku obsahujúceho zlúčeninu všeobecného vzorca (I), alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ podľa predloženého vynálezu do organizmu na účely prevencie alebo ošetrenia porúch súvisiacich s PK.
Vhodné spôsoby podania zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, perorálne, rektálne, transmukózne alebo intestinálne podanie, alebo intramuskuláme, subkutánne, intrameduláme, intratekálne, priame intraventrikulárne, intravenózne, intravitreálne, intraperitoneálne, intranazálne alebo intraokuláme injekcie. Výhodnými spôsobmi podania sú perorálne a parenterálne.
Alebo je možné podávať zlúčeninu skôr miestnym než systémovým spôsobom, napr. injekciou zlúčeniny priamo do miesta nádoru, často v depotnej alebo trvalo uvoľňujúcej sa formulácii.
Ďalej je možné liečivo podávať ako systém cieľovo špecifického podania, napr. v lipozóme potiahnutom protilátkou špecifickou na určitý nádor. Lipozómy budú zamerané a vychytávané nádorom.
Farmaceutické prípravky podľa predloženého vynálezu môžu byť vyrábané štandardným spôsobom, napr. štandardným miešaním, rozpustením, granuláciou, prípravou dražé, rozdrobovaním, emulgáciou, enkapsuláciou, zachytávaním alebo lyofilizáciou.
Farmaceutické prípravky na použitie podľa predloženého vynálezu tak môžu byť pripravené štandardným spôsobom s použitím jedného alebo viacerých fyziologicky prijateľných nosičov obsahujúcich excipienty a pomocné látky, ktoré uľahčujú spracovanie aktívnych zlúčenín do preparátov, ktoré môžu byť používané farmaceutickým spôsobom. Vlastná príprava je závislá od vybraného spôsobu podania.
Pre injekcie môžu byť zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pripravené vo vodných roztokoch, výhodne vo fyziologicky kompatibilných pufroch, napr. Hanksov roztok, Ringerov roztok alebo pufry na báze fyziologického roztoku. Na transmukózne podanie sú vo formulácii používané tiež penetrátory, ktoré sú vhodné na prekonanie danej bariéry. Tieto penetrátory sú všeobecne známe.
Na perorálne podanie môžu byť zlúčeniny ľahko pripravené spojením aktívnych zlúčenín so štandardnými farmaceutický prijateľnými nosičmi. Tieto nosiče umožňujú pripraviť zlúčeniny podľa predloženého vynálezu vo forme tabliet, pilúl, dražé, kapsúl, roztokov, gélov, sirupov, kašovitých zmesí, suspenzií atď., na perorálne požitie lieku pacientom, ktorý má byť ošetrovaný. Farmaceutické preparáty na perorálne použitie môžu byť pripravené spojením aktívnej zlúčeniny s pevným excipientom, prípadne rozomletím výslednej zmesi, a po pridaní vhodných pomocných látok, pokiaľ je treba, spracovaním zmesi granúl, čím je možné získať tablety alebo dražé. Vhodné excipienty sú najmä plnivá, napr. cukry, vrátane laktózy, sacharózy, manitolu alebo sorbitolu; celulózovej prípravky, napr. kukuričný škrob, pšeničný škrob, ryžový škrob, zemiakový škrob a ďalšie látky, napr. želatína, tragant, metyl-celulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, sodná soľ karboxymetylcelulózy a/alebo polyvinylpyrolidón (PVP). Pokiaľ je treba, môžu byť pridané prostriedky zaisťujúce rozpad tablety po požití, napr. zosietený polyvinylpyrolidón, agar alebo kyselina algínová, alebo ich soli, napr. alginát sodný.
Jadra dražé sú vybavené vhodnými povrchovými vrstvami. Na tento účel môžu byť používané koncentrované roztoky cukrov, ktoré môžu prípadne obsahovať arabskú gumu, mastenec, polyvinylpyrolidón, karbopólový gél, polyetylénglykol a/alebo oxid titaničitý, roztoky šelaku a vhodné organické rozpúšťadla alebo zmesi rozpúšťadiel. Organické farbivá alebo pigmenty môžu byť pridané do tabliet alebo poťahových vrstiev dražé na identifikáciu alebo charakterizáciu rozdielnych kombinácií dávok aktívnej zlúčeniny.
Farmaceutické preparáty, ktoré môžu byť používané perorálne, zahrnujú kapsuly typu „push-fit“ vyrobené zo želatíny, ako aj mäkké, uzavreté kapsuly vyrobené zo želatíny a zmäkčovadla, ako je glycerol alebo sorbitol. Kapsuly typu „push-fit“ môžu obsahovať aktívne zložky v prímesi s fillermi, napr. laktózou, spojivami, napr. škrobmi, a/alebo lubrikantmi, napr. mastenec alebo stearát horečnatý, a prípadne stabilizátormi. V mäkkých kapsuliach môžu byť aktívne zlúčeniny rozpustené alebo suspendované vo vhodných roztokoch, napr. mastných olejoch, minerálnom oleji alebo tekutých polyetylénglykoloch. Navyše môžu byť pridávané stabilizátory.
Farmaceutické prípravky, ktoré môžu byť tiež používané, zahrnujú pevné želatínové kapsuly. Nijako nelimitujúcim príkladom môže byť uvedená formulácia aktívnej zlúčeniny vo forme perorálneho liečiva ako dve rôzne silné dávky 50 a 200 mg (kódy formulácie J-011248-AA-00 a J-011248-AA-01). Tieto dve rôzne silné dávky sú pripravené z rovnakých granúl naplnením do tuhých želatínových kapsúl rôznych veľkostí 3 pre 50 mg a veľkostí 0 pre 200 mg kapsuly. Skladba formulácie môže byť napr. podľa tabuľky 2.
Tabuľka 2
komponent názov/kvalita |
kone.
v granulácii (% hmôt./hmôt.) |
množstvo v 50 mg kapsule (mg) |
množstvo v 200 mg kapsule (mg) |
kód formulácie |
J-01 1248-AA |
J-011248-AA-00 |
J-01 1248-AA-01 |
aktívna zlúčenina NF |
65,0 |
50,0 |
200,0 |
Manitol NF |
23,5 |
18,1 |
72,4 |
kroskarmelóza sodná
NF |
6,0 |
4,6 |
18,4 |
Povidone K 30 NF |
5,0 |
3,8 |
15,2 |
stearát horečnatý NF |
0,5 |
0,38 |
1,52 |
kapsule, švédska žltá N F |
|
veľkosť 3 |
veľkosť 0 |
Kapsuly môžu byť balené do fľašiek z hnedého skla alebo plastu na účely ochrany aktívnej zlúčeniny proti svetlu. Nádobky obsahujúce formuláciu aktívnej zlúčeniny vo forme kapsúl musia byť skladované pri kontrolovanej teplote (15 až 30 °C).
Na podanie inhalácie sú zlúčeniny podľa predloženého vynálezu štandardne podávané vo forme aerosólového spreja v aerosólovom balení alebo v rozprašovači a s vhodným propelentom, napr. bez obmedzenia, dichlórdifluórmetánom, trichlórfluórmetánom, dichlórtetrafluóretánom alebo oxidom uhličitým. V prípade stlačeného aerosólu môže byť na dávkovanie využitý ventil, ktorý umožní uvoľnenie presného množstva látky. Kapsuly a patróny, napr. zo želatíny, na použitie v inhalačnom prístroji alebo insuflátory môžu byť pripravené spôsobom, pri ktorom je spojená prášková zmes zlúčeniny a vhodná prášková báza, napr. laktóza alebo škrob.
Zlúčeniny môžu byť pripravené na parenterálne podanie injekciou, napr. injekciou bolusu alebo kontinuálnou infúziou. Formulácie pre injekcie môžu byť v jednotkových dávkovacích formách, napr. v ampulách alebo v obaloch na viac dávok, s pridanou konzervačnou látkou. Prípravky môžu byť tiež vo formách suspenzie, roztokov alebo emulzií v olejových alebo vodných nosičoch a môžu obsahovať pomocné agens, napr. suspendačné, stabilizačné a/alebo dispergačné prostriedky.
Farmaceutické formulácie na parenterálne podanie zahrnujú vodné roztoky aktívnych zlúčenín vo forme, ktorá je rozpustná vo vode. Ďalej môžu byť suspenzie aktívnych zlúčenín pripravené ako príslušné olejovité injekčné suspenzie. Vhodné lipofilné nosiče zahrnujú mastné oleje, napr. sezamový olej, estery syntetických mastných kyselín, napr. etyl-oleát alebo triglyceridy, alebo látky ako lipozómy. Vodné injekčné suspenzie môžu obsahovať látky, ktoré zvyšujú viskozitu suspenzie, napr. sodná soľ karboxymetyl-celulózy, sorbitol alebo dextrán. Prípadne suspenzie môžu tiež obsahovať vhodné stabilizátory a/alebo agens, ktoré zvyšujú rozpustnosť zlúčenín, čim umožňujú pripraviť vysoko koncentrované roztoky.
Alternatívne môže byť aktívna zložka vo forme prášku určeného na spojenie s vhodným nosičom pred použitím, napr. so sterilnou apyrogénnou vodou.
Zlúčeniny môžu byť tiež pripravené ako rektálne prípravky, napr. čapíky alebo retenčné klyzmy, pomocou napr. štandardných čapíkových báz, ako je kakaové maslo alebo iné glyceridy.
Okrem uvedených formulácií môžu byť tiež pripravené zlúčeniny vo forme depotných preparátov. Tieto formulácie s dlhou dobou účinku môžu byť podávané implantáciou (napr. subkutánne alebo intramuskulárne podanie alebo intramuskulárne injekcie). Týmto spôsobom môžu byť pripravené zlúčeniny s vhodnými polymémymi alebo hydrofóbnymi materiálmi (napr. v emulzii s farmaceutický prijateľným olejom) alebo iónexmi alebo ako zle rozpustné deriváty, napr. zle rozpustné soli.
Príkladom, ale neobmedzujúcim, farmaceutického nosiča pre hydrofóbne zlúčeniny podľa predloženého vynálezu je systém spolurozpúšťadiel obsahujúci benzylalkohol, nepolámy surfaktant, organický polymér miešateľný s vodou a vodnou fázou, napr. spolurozpúšťadlový systém VPD. VPD je roztok 3 % obj. benzylalkoholu, 8 % obj. nepolámeho surfaktantu Polysorbát 80 a 65 % obj. polyetylénglykolu 300, doplnený na konečný objem absolútnym etanolom. Systém spolurozpúšťadiel VPD (VPD : 5W) pozostáva z VPD zriedeného 1 : 15 % dextrózou vo vodnom roztoku. Tento systém spolurozpúšťadiel dobre rozpúšťa hydrofóbne zlúčeniny a sám má po systémovom podaní nízku toxicitu. Prirodzene môžu byť podiely systému spolurozpúšťadiel značne menené, ale tak, aby sa zachovali charakteristické rysy jeho rozpustnosti a toxicity. Jednotlivé zložky systému spolurozpúšťadiel môžu byť menené: napr. miesto polysorbátu 80 môžu byť používané ďalšie nepoláme surfaktanty s nízkou toxicitou; veľkosť častíc polyetylénglykolu môže byť rôzna; polyetylénglykol môže byť nahradený ďalšími biokompatibilnými polymérmi, napr. polyvinylpyrolidónom; a ďalšie cukry alebo polysacharidy môžu nahradiť dextrózu.
Alebo môže byť použitý iný dávkový systém pre hydrofóbne farmaceutické zlúčeniny. Pre hydrofóbne liečivá sú štandardnými príkladmi prenášačov a nosičov využívaných pri tomto spôsobe lipozómy a emulzie. Navyše môžu byť používané určité organické rozpúšťadlá, napr. dimetylsulfoxid, ale často za cenu väčšej toxicity.
Navyše zlúčeniny môžu byť podávané systémom trvalého, t. j. postupného uvoľňovania, napr. semipermeabilnými matricami pevných hydrofóbnych polymérov obsahujúcich terapeutické činidlo. V odbore sú zavedené a odborníkom známe rôzne materiály na postupné uvoľňovanie. Kapsuly s postupným uvoľňovaním môžu v závislosti od svojho chemického charakteru uvoľňovať zlúčeniny počas niekoľkých týždňov až viac než 100 dní. V závislosti od chemického charakteru a biologickej stability terapeutického reagens môžu byť používané ďalšie stratégie stabilizácie proteínu.
Farmaceutické prípravky tiež môžu obsahovať vhodné nosiče alebo excipienty v pevnej alebo gélovej fáze. Príklady takých nosičov alebo excipientov zahrnujú, ale nie je to na ne obmedzené, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rôzne cukry, škroby, deriváty celulózy, želatínu a polyméry, napr. polyetylénglykoly.
Mnoho zlúčenín podľa predloženého vynálezu modulujúcich PK môže byť vo forme fyziologicky prijateľných solí, kde nárokovaná zlúčenina môže tvoriť negatívne alebo pozitívne nabitú zložku. Príklady solí, v ktorých zlúčenina vytvára pozitívne nabitú časť, zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, kvartéme amónne soli (definované tu na inom mieste), napr. hydrochlorid, sulfát, uhličitan, laktát, tartrát, malát, maleát, sukci nát, kde atóm dusíka kvartémej amónnej skupiny je dusík vybranej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, ktorý zreagoval s príslušnou kyselinou. Soli, v ktorých zlúčenina podľa predloženého vynálezu vytvára negatívne nabitú časť, zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, vápenaté a horečnaté soli vytvorené reakciou skupiny karboxylovej kyseliny v zlúčenine s príslušnou bázou (ako je hydroxid sodný (NaOH), hydroxid draselný (KOH), hydroxid vápenatý (Ca(OH)2) atd’.).
Farmaceutické prípravky vhodné na použitie v predloženom vynáleze zahrnujú prípravky, v ktorých sú aktívne zložky obsiahnuté v množstve, ktoré je dostatočné na dosiahnutie zamýšľaného zámeru, napr. modulácia aktivity PK alebo ošetrenie, alebo prevencia porúch spojených s PK.
Konkrétnejšie, terapeuticky účinné množstvo znamená množstvo zlúčeniny, ktoré je účinné pri prevencii, zmiernení alebo zlepšení symptómov ochorení alebo pri predĺžení prežívania subjektu, ktorý je ošetrovaný.
Stanovenie terapeuticky účinného množstva môže vykonať pracovník skúsený v odbore, najmä na základe tu uvedených informácií.
Pre akúkoľvek zlúčeninu používanú v spôsobe podľa predloženého vynálezu môže byť terapeuticky účinná dávka najprv stanovená podľa testov na bunkových kultúrach. Potom môže byť dávka testovaná na bunkových a zvieracích modeloch na získame rozmedzia obehovej koncentrácie, ktoré zahrnuje IC50 stanovenú podľa testov na bunkových kultúrach (t. j. koncentrácia testovanej zlúčeniny, ktorá je potrebná na dosiahnutie 50 % inhibície aktivity danej PK). Tieto informácie môžu byť používané u ľudských subjektov na presnejšie stanovenie účinných dávok.
Toxicita a terapeutická účinnosť tu opísaných zlúčenín môže byť stanovená štandardnými farmaceutickými postupmi na bunkových kultúrach alebo experimentálnych zvieratách, napr. stanovením IC50 a LD50 (obe sú diskutované v inej časti textu) pre danú zlúčeninu. Dáta získané z testov na bunkových kultúrach a štúdiách na zvieratách môžu byť použité na stanovenie rozpätia dávky pre použitie u ľudí. Dávkovanie môže byť v tomto rozmedzí rôzne v závislosti od používanej dávkovej formy a spôsobu podania. Presná formulácia, spôsob podania a dávkovania môžu byť vybrané jednotlivým lekárom v závislosti od stavu pacienta (pozri Fingl et al., 1975, v „Pharmacological Basis of Therapeutics“, Ch. 1 pl).
Množstvo a interval dávky môžu byť upravené individuálne na získanie plazmových koncentrácií účinnej látky, ktoré stačia na udržanie modulačných účinkov kinázy. Tieto plazmové koncentrácie sa označujú ako minimálne účinné koncentrácie (MEC). Hodnota MEC bude pre každú zlúčeninu iná, ale môže byť stanovená z in vitro dát; napr. koncentrácia potrebná na dosiahnutie 50 až 90 % inhibície kinázy môže byť stanovená s použitím tu opísaných testov. Dávky potrebné na dosiahnutie MEC budú závisieť od individuálnych charakteristík a spôsobu podania. Na stanovenie plazmových koncentrácií môže byť používaná HPLC alebo bioanalýza.
Intervaly medzi dávkami môžu byť tiež stanovené pomocou hodnoty MEC. Zlúčeniny by mali byť podávané podľa režimu, ktorým sa udržujú plazmové hladiny nad hodnotou MEC v priebehu 10-90 % času, výhodne medzi 30 - 90 % a najvýhodnejšie 50 - 90 %.
V súčasnosti sa pohybujú terapeuticky účinné množstvá zlúčenín všeobecného vzorca (I) v rozmedzí približne od 25 mg/m2 do 1 500 mg/m2 denne; výhodne asi 3 mg/m2 denne. Výhodnejšie od 50 mg/qd do 400 mg/qd.
V prípadoch lokálneho podania alebo selektívnej absorpcie nemôže účinná miestna koncentrácia liečiva zodpovedať plazmovej koncentrácii a ďalším štandardným spôsobom používaným na stanovenie presného množstva dávky a intervalu.
Množstvo podávaného prípravku bude samozrejme závisieť od ošetrovaného subjektu, závažnosti jeho stavu, spôsobu podania, posúdenia ošetrujúceho lekára atď.
Prípravky, pokiaľ je treba, môžu byť vo forme balenia alebo zásobníku, ako je kit schválený FDA, ktorý môže obsahovať jednu alebo viac jednotkových dávkovacích foriem obsahujúcich aktívnu zložku. Balenie môže napr. obsahovať kovovú alebo plastovú fóliu, napr. mäkké priehľadné balenie. Balenie alebo zásobník môže byť distribuovaný spoločne s návodom na podanie. K baleniu alebo zásobníku môže byť pripojené upozornenie súvisiace s obsahom vo forme predpísaného orgánom štátnej správy regulujúcim výrobu, použitie alebo predaj farmaceutických prostriedkov, ktorým sa schvaľuje forma alebo zloženie prípravkov pre ľudské alebo veterinárne aplikácie. Upozornením tohto typu môže byť napríklad nálepka schválená U.S. Food and Drug Administration pre lieky na predpis alebo schválený príbalový leták. Tiež môžu byť pripravené prípravky obsahujúce zlúčeninu podľa vynálezu formulované v kompatibilnom farmaceutickom nosiči umiestnené vo vhodnej nádobke a označené pre ošetrenie indikovaného stavu. Vhodné indikované stavy uvedené na nálepke môžu zahrnovať ošetrenie nádoru, inhibíciu angiogenézy, ošetrenie fibrózy, cukrovky atď.
Ďalší aspekt predloženého vynálezu zahrnuje to, že zlúčenina podľa predloženého vynálezu alebo jej soľ, alebo proliečivo môže byť kombinovaná s ďalšími chemoterapeutikami na ošetrenie uvedených ochorení a porúch. Napríklad môže byť zlúčenina, soľ alebo proliečivo podľa predloženého vynálezu, kombinovaná s alkylačnými činidlami, ako je fluorouracil (5-FU) samotný alebo v ďalšej kombinácii s leukovorínom; alebo ďalšie alkylačné činidla, napríklad, ale nie je to nijako limitované, iné pyrimidínové analógy, napr. UFT, capecitabin, gemcitabin a cytarabin, alkylsulfonáty, napr. busulfán (používaný pri ošetrení chronickej granulo cytovej leukémie), improsulfán a piposulfán; aziridíny, napr. benzodepa, karboquón, meturedepa a uredepa; etylénimíny a metylmelamíny, napr. altretamin, trietylénmelamín, trietylénfosforamid, trietyléntiofosforamid a trimetylolmelamín; a dusíkaté nosiče, napr. chlórambucil (používaný pri ošetrení chronickej lymfocytámej leukémie, primárnej makroglobulinémie a nehodgkinovho lymfómu), cyklofosfamid (používaný pri ošetrení Hodgkinovej choroby, mnoho početného myelómu, neuroblastómu, rakoviny prsníka, ovariálnej rakoviny, rakoviny pľúc, Wilmovho nádoru a rabdomyosarkómu), estramustín, ifosfamid, novembrichín, prednimustín a uracilovej horčice (používanej pri ošetrení primárnej trombocytózy, nehodgkinovho lymfómu, Hodgkinovej choroby a ovariálnej rakoviny); a triazíny, napr. dakarbazín (používaný pri ošetrení sarkómu mäkkého tkaniva).
Zlúčenina, soľ alebo proliečivo podľa predloženého vynálezu môže byť tiež používané v kombinácii s ďalšími antimetabolitovými chemoterapeutikami, napríklad, ale nie je to nijako limitované, analóg kyseliny listovej skupiny, napr. metotrexát (používaný pri ošetrení akútnej lymfocytámej leukémie, choriokarcinómu, mycosis fungiodes rakoviny prsníka, rakoviny hlavy a krku a osteogénneho sarkómu) a pteropterín; a purínový analog, napr. merkaptopurín a tioguanín, ktorý našiel použitie pri ošetrení akútnej granulocytámej, akútnej lymfocytámej a chronickej granulocytámej leukémie.
Tiež sa uvažuje, že zlúčenina, soľ alebo proliečivo podľa predloženého vynálezu môže byť tiež používané v kombinácii s chemoterapeutikami na prírodnej bázy napríklad, ale nie jc to nijako limitované, vinkové alkaloidy, napr. vinblastín (používaný pri ošetrení rakoviny prsníka a rakoviny prostaty), vinkristín a vindezín; epipodofylotoxíny, napríklad etopozid a tenipozid, obe sú použiteľné pri ošetrení rakoviny prostaty a Kaposiho sarkómu; antibiotické chemoterapeutiká, napríklad daunorubicín, doxorubicin, epirubicín, mitomycin (používaný na ošetrenie rakoviny žalúdka, krčka, hrubého čreva, prsníka, močového mechúra a pankreasu), daktinomycín, temozolomid, plikamycin, bleomycin (používaný pri ošetrení rakoviny kože, pažeráka a genitourinámeho traktu); a enzymatické chemoterapeutiká, napr. L-asparagináza.
Okrem uvedených môžu byť tiež zlúčeniny, soli alebo proliečivá podľa predloženého vynálezu používané v kombinácii s koordinačnými komplexami na báze platiny (cisplatina atď.); substituovanými močovinami, napr. hydroxymočovina; deriváty metylhydrazínu, napr. prokarbazín; adrenokortikálnymi supresívami, napr. mitotan, aminoglutetimid; a hormóny a antagonisty hormónov, napr. adrenokortikosteriody (napr. prednizón), progestíny (napr. kapronát hydroxyprogesterónu); estrogény (napr. diétylstilbesterol); antiestrogény, napr. tamoxifen; androgény, napr. propionát testosterónu; a inhibítory aromatáz, napr. anastrozol.
Tiež sa predpokladá, že kombinácia zlúčeniny podľa predloženého vynálezu bude účinná v kombinácii s mitoxantrónom alebo paclitaxelom na ošetrenie pevných nádorov alebo leukémií, napríklad, ale nie je to nijako limitované, akútnej myeloidnej leukémie (nelymfocytámy).
Všeobecný syntetický postup
Na prípravu zlúčenín podľa predloženého vynálezu je možné použiť tieto všeobecné metódy:
Príslušne substituovaný 2-oxoindol (1 ekviv.), príslušne substituovaný aldehyd (1,2 ekviv.) a báza (0,1 ekviv.) sa zmiešajú v rozpúšťadle (1-2 ml/mmol 2-oxoindolu) a zmes sa potom zahrieva počas asi 2 až asi 12 hodín. Po ochladení sa vzniknutý precipitát filtruje, premyje studeným etanolom alebo éterom a suší za vákua, čím sa získa produkt v pevnej forme. Pokiaľ nevznikne precipitát, reakčná zmes sa koncentruje a zvyšok sa trituruje zmesou dichlórmetánu a éteru, výsledná pevná látka sa zhromaždí filtráciou a suší. Produkt môže byť prípadne ďalej čistený chromatografiou.
Báza môže byť organická alebo anorganická báza. Ak je používaná organická báza, potom je ňou výhodne dusíkatá báza. Príklady organickej dusíkatej bázy zahrnujú, ale bez obmedzenia, diizopropylamín, trime tylamin, trietylamín, anilín, pyridín, l,8-diazabicyklo[5,4,l]undek-7-én, pyrolidín a piperidín.
Príklady anorganických báz zahrnujú, ale bez obmedzenia, amoniak, hydroxidy alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, fosforečnany, uhličitany, hydrogenuhličitany, hydrogensírany a amidy. Alkalické kovy zahrnujú lítium, sodík a draslík, zatiaľ čo alkalické zeminy zahrnujú vápnik, horčík a báryum.
Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu, za predpokladu, že rozpúšťadlo je protické, napr. voda alebo alkohol, je báza anorganická báza alkalického kovu alebo alkalickej zeminy, výhodne hydroxid alkalického kovu alebo alkalickej zeminy.
Odbornej verejnosti, a to na základe všeobecných princípov organickej syntézy a doterajšieho opisu, nebude robiť ťažkosti zvoliť pre príslušnú reakciu najvhodnejšiu bázu.
Rozpúšťadlo, v ktorom reakcia prebieha, môže byť buď protické, alebo aprotické, výhodne protické.
Termín „protické rozpúšťadlo“ sa vzťahuje na rozpúšťadlo, ktoré má atóm(y) vodíka kovalentne viazaný k atómom kyslíka alebo dusíka, čo robí vodíkové atómy značne kyslými, a tým schopnými podieľať sa solutom na vodíkových väzbách. Príklady protických rozpúšťadiel zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, vodu a alkoholy.
Termín „aprotické rozpúšťadlo“ sa vzťahuje na rozpúšťadlo, ktoré môže byť poláme i nepoláme, ale neobsahuje kyslé vodíky, a teda nie je schopné podieľať sa solutom na vodíkových väzbách. Príklady nepolárnych aprotických rozpúšťadiel zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, pentán, hexán, benzén, toluén, mety lénchlorid a tetrachlórmetán. Príklady polárnych aprotických rozpúšťadiel zahrnujú chloroform, tetrahydrofurán, dimetylsulfoxid a dimetylformamid.
Vo výhodnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu je rozpúšťadlo protické, výhodne voda alebo alkohol, napr. etanol.
Reakcia je vykonávaná pri teplotách, ktoré sú vyššie než izbová teplota. Teplota sa všeobecne pohybuje od asi 30 °C do asi 150 °C, výhodne od asi 80 °C do asi 100 °C, najvýhodnejšie od asi 75 °C do asi 85 °C, čo je asi teplota varu etanolu. Termín „asi“ znamená, že teplota sa výhodne pohybuje v rozmedzí 10 stupňov Celzia uvedenej teploty, najvýhodnejšie v rozmedzí 2 stupňov Celzia uvedenej teploty. Teda napríklad „asi 75 °C“ znamená 75 °C ± 10 °C, výhodne 75 °C ± 5 °C a najvýhodnejšie 75 °C ± 2 °C.
2-Oxoindoly a aldehydy môžu byť ľahko syntetizované štandardnými chemickými spôsobmi. Z textu by malo byť odbornej verejnosti zrozumiteľné, že zlúčeniny podľa predloženého vynálezu je možne pripraviť aj inými syntetickými spôsobmi a nasledujúce príklady slúžia ako návrh spôsobu prípravy, ktorý nemá byť nijako limitujúci.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce prípravy a príklady sú tu na ľahšie pochopenie predloženého vynálezu a nemajú nijako limitovať rozsah vynálezu, ale iba ho ilustrovať a reprezentovať.
Syntetické príklady
Spôsob A: Formylácia pyrolov
POC13 (1,1 ekviv.) sa pridá po kvapkách do dimetylformamidu (3 ekviv.) pri teplote -10 °C, potom sa pridá príslušný pyrol rozpustený v dimetylformamide. Po miešaní počas dvoch hodín sa reakčná zmes zriedi H2O a alkalizuje na pH 11 s 10N KOH. Vzniknutý precipitát sa spojí filtráciou, premyje vodou a suší vo vákuovej sušiarni, čím sa získa požadovaný aldehyd.
Spôsob B: Saponifikácia esterov pyrolkarboxylovej kyseliny
Zmes esteru pyrolkarboxylovej kyseliny a KOH (2-4 ekviv.) v EtOH sa refluxuje, dokiaľ reakcia neskončí (podľa TLC). Ochladená reakčná zmes sa okyslí na pH 3 IN HCI. Vzniknutý precipitát sa spojí filtráciou, premyje vodou a suší vo vákuovej sušiarni, čím sa získa pyrolkarboxylová kyselina.
Spôsob C: Amidácia
Do miešaného roztoku pyrolkarboxylovej kyseliny rozpustenej v dimetylformamide (0,3 M) sa pridá 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (1,2 ekviv.), 1-hydroxybenzotriazol (1,2 ekviv.) a trietylamín (2 ekviv.). Pridá sa príslušný amín (1 ekviv.) a reakcia sa mieša do tej doby, dokiaľ nedobehne, a sleduje sa na TLC. Potom sa do reakčnej zmesi pridá etylacetát a roztok sa premyje nasýteným roztokom NaHCO3 a soľankou (s dodatočnou soľou), suší nad bezvodým MgSO4 a koncentruje, čím sa získa požadovaný amid.
Spôsob D: Kondenzácia aldehydov a oxindolov obsahujúcich substituenty karboxylovej kyseliny
Zmes oxindolu (1 ekviv.), 1 ekviv. aldehydu a 1 - 3 ekviv. piperidínu (alebo pyrolidínu) v etanole (0,4 M) sa mieša pri teplote 90 - 100 °C do tej doby, dokiaľ reakcia nedobehne, a sleduje sa na TLC. Zmes sa potom koncentruje a zvyšok sa okyslí 2N HCI. Vzniknutý precipitát sa premyje vodou a etanolom a suší vo vákuovej sušiarni, čím sa získa produkt.
Spôsob E: Kondenzácia aldehydov a oxindolov neobsahujúcich substituenty karboxylovej kyseliny
Zmes oxindolu (1 ekviv.), 1 ekviv. aldehydu a 1 - 3 ekviv. piperidínu (alebo pyrolidínu) v etanole (0,4 M) sa mieša pri teplote 90 - 100 °C do tej doby, dokiaľ reakcia nedobehne, a sleduje na TLC. Zmes sa potom ochladí na izbovú teplotu a vzniknutý pevný podiel sa spojí vákuovou filtráciou, premyje etanolom a suší, čím sa získa produkt. Pokiaľ sa po ochladení reakčnej zmesi nevytvorí precipitát, zmes sa koncentruje a čistí stĺpcovou chromatografiou.
C. Príklady syntéz oxindolov
Nasledujúce príklady syntézy reprezentatívnych oxindolov nemajú nijako limitovať rozsah predloženého vynálezu. Na základe nasledujúceho opisu budú odbornej verejnosti jasné alternatívne spôsoby prípravy uvedených oxindolov, ako aj ďalších oxindolov používaných na prípravu zlúčenín podľa predloženého vynálezu. Tieto syntézy a oxindoly spadajú takisto do rozsahu a charakteru tohto vynálezu.
5-Amino-2-oxindol
5-Nitro-2-oxindol (6,3 g) sa hydrogenuje v metanole nad 10 % paládiom na aktívnom uhlí, čím sa získa 3,0 g (60 % výťažok) požadovanej zlúčeniny vo forme pevnej bielej látky.
5-Bróm-2-oxindol
2-Oxindol (1,3 g) v 20 ml acetónitrilu sa ochladí na teplotu -10 °C a do reakčnej zmesi sa za intenzívneho miešania pomaly pridajú 2,0 g A-brómsukcínimidu. Reakčná zmes sa mieša počas 1 hodiny pri teplote -10 °C a 2 hodiny pri teplote 0 °C. Precipitát sa spojí, premyje vodou a suší, čím sa získa 1,9 g (90 % výťažok) požadovanej zlúčeniny.
4- Metyl-2-oxindol
Dietyloxalát (30 ml) v 20 ml suchého éteru sa pridá za stáleho miešania do 19 g etoxidu draselného suspendovaného v 50 ml suchého éteru. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli a pomaly sa pridá 20 ml 3-nitro-oxylénu v 20 ml suchého éteru. Hustá tmavá červená zmes sa zahrieva pri refluxe počas 0,5-hodiny, koncentruje na tmavočervenú pevnú látku a nechá reagovať s 10 % roztokom hydroxidu sodného, dokiaľ sa nerozpustí takmer všetok pevný podiel. Tmavočervená zmes sa nechá reagovať s 30 % peroxidom vodíka, dokiaľ sa červená farba zmesi nezmení na žltú. Alternatívne sa zmes nechá reagovať s 10 % roztokom hydroxidu sodného a 30 % peroxidom vodíka, dokiaľ tmavočervená farba roztoku nezmizne. Pevný podiel sa odfiltruje a filtrát okyslí 6N kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný precipitát sa spojí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší za vákua, čím sa získa 9,8 g (45 % výťažok) 2-metyl-6-nitrofenyloctovej kyseliny vo forme belavej pevnej látky. Pevný podiel sa hydrogenuje v metanole nad 10 % paládiom na aktívnom uhlí, čím sa získa 9,04 g požadovanej zlúčeniny vo forme bielej pevnej látky.
7-Bróm-5-chlór-2-oxindol
5-Chlór-2-oxindol (16,8 g) a 19,6 g Λ'-brómsukcínimidu sa suspenduje v 140 ml acetónitrilu a refluxuje počas 3 hodín. Po 2 hodinách refluxu bol na TLC (silikagél, etylacetát) vidieť 5-chlór-2-oxindol alebo N-brómsukcínimíd (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) a druhý produkt (Rf 0,9), ktorých podiely sa nezmenili ani po ďalšej hodine pri refluxe. Zmes sa ochladí na teplotu 10 °C, precipitát sa spojí vákuovou filtráciou, premyje 25 ml etanolu a suší počas 20 minút v nálevke, čím sa získa 14,1 g vlhkého produktu (56 % výťažok). Pevný podiel sa suspenduje v 200 ml denaturovaného etanolu a kašovitá zmes sa mieša a refluxuje počas 10 minút. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli na teplotu 10 °C. Pevný produkt sa spojí vákuovou filtráciou, premyje 25 ml etanolu a suší za vákua pri teplote 40 °C, čím sa získa 12,7 g (51 % výťažok) 7-bróm-5-chlór-2-oxindolu.
5- Fluór-2-oxindol
5-Fluórisatín (8,2 g) sa rozpustí v 50 ml hydrátu hydrazínu a refluxuje počas 1,0 hodiny. Reakčná zmes sa naleje do ľadovej vody. Precipitát sa potom filtruje, premyje vodou a suší vo vákuovej sušiarni, čím sa získa požadovaná zlúčenina.
5-Nitro-2-oxindol
2-Oxindol (6,5 g) sa rozpustí v 25 ml koncentrovanej kyseliny sírovej a zmes sa udržuje pri teplote -10 až -15 °C, zatiaľ čo sa po kvapkách pridáva 2,1 ml dymovej kyseliny dusičnej. Po pridaní kyseliny dusičnej sa reakčná zmes mieša pri teplote 0 °C počas 0,5-hodiny a naleje do ľadovej vody. Precipitát sa spojí filtráciou, premyje vodou a kryštalizuje z 50 % kyseliny octovej. Kryštalický produkt sa potom filtruje, premyje vodou a suší za vákua, čím sa získa 6,3 g (70 %) 5-nitro-2-oxindolu.
- Aminosulfonyl-2-oxindol
Do 100 ml banky naplnenej 27 ml chlórsulfónovej kyseliny sa pomaly pridá 13,3 g 2-oxindolu. Reakčná teplota sa počas pridávania udržuje pod 30 °C. Po pridaní sa reakčná zmes mieša pri izbovej teplote počas 1,5-hodiny, zahrieva pri teplote 68 °C počas 1 hodiny, ochladí a naleje do vody. Precipitát sa premyje vodou a suší vo vákuovej sušiarni, čím sa získa 11,0 g 5-chlór-sulfonyl-2-oxindolu (50 % výťažok), ktorý sa ďalej používa bez čistenia.
5-Chlórsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) sa pridá do 10 ml hydroxidu amónneho v 10 ml etanolu a mieša pri izbovej teplote cez noc. Zmes sa koncentruje a pevný podiel sa spojí vákuovou filtráciou, čím sa získa 0,4 g (20 % výťažok) požadovanej zlúčeniny vo forme belavej pevnej látky.
5-Izopropylaminosulfonyl-2-oxindol
Do 100 ml banky naplnenej 27 ml chlórsulfónovej kyseliny sa pomaly pridá 13,3 g 2-oxindolu. Reakčná teplota sa počas pridávania udržuje pod 30 °C. Po pridaní sa reakčná zmes mieša pri izbovej teplote počas 1,5-hodiny, zahrieva pri teplote 68 °C počas 1 hodiny, ochladí a naleje do vody. Precipitát sa premyje vodou a suší vo vákuovej sušiarni, čím sa získa 11,0 g 5-chlór-sulfonyl-2-oxindolu (50 % výťažok), ktorý sa ďalej používa bez čistenia.
Suspenzia 3 g 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu, 11,5 g izopropylamínu a 1,2 ml pyridínu v 50 ml dichlórmetáne sa mieša pri izbovej teplote počas 4 hodín, počas ktorých sa vytvorí pevný podiel, ktorý sa spojí vákuovou filtráciou, kašovitá zmes sa premyje horúcim etanolom, ochladí, spojí vákuovou filtráciou a suší za vákua pri teplote 40 °C cez noc, čím sa získa 1,5 g (45 %) 5-izopropylaminosulfonyl-2-oxindolu.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,69 (s, br, 1H, NH) δ 7, 63 (dd, J = 2 a 8 Hz, 1H) δ 7, 59 (d, J = 2 Hz, 1H) δ 7,32 (d, J = 7 Hz, 1H, NH-SOr) δ 6, 93 (d, J = 8 Hz, 1H) δ 3, 57 (s, 2H) δ 3, 14-3,23 (m, 1H, CH(CH3)2 δ 0,94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2 x CH3).
5-Fenylaminosulfonyl-2-oxindol
Suspenzia 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu (1,62 g, 7 mmol), anilínu (0,782 ml, 8, 4 mmol) a pyridínu (1 ml) v dichlórmetáne (20 ml) sa mieša pri izbovej teplote počas 4 hodín. Reakčná zmes sa zriedi etylacetátom (300 ml) a okysli IN kyselinou chlorovodíkovou (16 ml). Organická vrstva sa premyje hydrogenuhličitan sodným a soľankou, suší a koncentruje. Zvyšok sa premyje etanolom (3 ml) a potom chromatografuje na stĺpci silikagélu v zmesi metanolu a dichlórmetánu (1:9) ako v mobilnej fáze, čím sa získa 5-fenylaminosulfonyl-2-oxindol.
*H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8, 4 Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).
Pyridin-3-ylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfónovej kyseliny
Roztok 5-chlórsufonyl-2-oxindolu (3 g) a 3-aminopyridinu (1,46 g) v pyridíne (15 ml) sa mieša pri izbovej teplote cez noc, kedy sa objaví hnedá pevná látka. Pevný podiel sa filtruje, premyje etanolom a suší za vákua, čim sa získa 1,4 g (38 %) pyridin-3-ylamidu 2-oxo-2,3-dihydro-l/7-indol-5-sulfónovej kyseliny. ’H NMR (360 MHz, DMSO-df,) δ 10,74 (s, 1H, NH), 8,39 (s, 1H, SO2NH), 8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8, 23 (m, 1H), 7,59-7, 62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).
MS m/z (APCI+) 290,2.
5- Fenyloxindol
5-Bróm-2-oxindol (5 g, 23,5 mmol) sa za stáleho miešania prileje a za malého záhrevu rozpustí v 110 ml toluéne a 110 ml etanolu. Pridá sa tetrakis(trifenylfosfín)paládium (1,9 g 1,6 mmol), potom 40 ml (80 mmol) 2M vodného uhličitanu sodného. Do tejto zmesi sa pridá benzén-boritá kyselina (3,7 g, 30,6 mmol) a zmes sa zahrieva pri teplote olejového kúpeľa 100 °C počas 12 hodín. Reakčná zmes sa ochladí, zriedi etylacetátom (500 ml), premyje nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (200 ml), vodou (200 ml), IN HC1 (200 ml) a soľankou (200 ml). Organická vrstva sa suší nad síranom horečnatým a koncentruje, čím sa získa hnedá pevná látka. Trituráciou dichlórmetánom sa získa 3,8 g (77 %) 5-fenyl-2-oxindolu ako hnedej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 a 7,2 Hz, 1H), 7,5 až 7,35 (m, 5H), 7, 29 (m, 1H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
MS m/z 209 [M] + .
Podobným spôsobom môžu byť pripravené nasledujúce oxindoly:
6- (3,5-Dichlórfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón ’H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).
MS-EI m/z 277/279 [M]+.
6-(4-Butylfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón 'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3H), 7,17 (dd, J = 1,5 a 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2Hz, CH2CH3), 1,57 (m, 2H, CH2), 1,32 (m, 2H, CH2), 0,9 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3).
6-(5-Izopropyl-2-metoxyfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón ‘H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10, 29 (br s, 1H, NH), 7,16 7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 281 [M] +
6-(4-Etylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-ón 'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J - 1,6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/z 237 [M] + .
6-(3 -Izopropylfenyl)-1,3 -dihydro-indol-2-ón 'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10, 37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7, 35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH3)2), 1, 24 (d, J = 6, 8 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 251 [M] +.
6-(2,4-Dimetoxyfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón 'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10, 28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 2,4 & 8,5 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,74 (s, 3H, OCH3), 345 (s, 2H, CHO).
MS-EI m/z 269 [M] + .
6-Pyridin-3 -yl-1,3 -dihydro-indol-2-ón ‘H NMR (360 MHz, DMSO-dó) δ 10, 51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J = 1,8 a 5,7 Hz, 1H), 8 (m, 1H) 7,45 (dd, J = 5,7 a 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
MS m/z 210 [M] + .
(3-Chlór-4-etoxyfenyl)-amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-4-karboxylová kyselina
Do roztoku 4-karboxy-2-oxindolu (200 mg 1,13 mmol) a 3-chlór-4-metoxyfenylamínu (178 mg, 1,13 mmol) v dimetylformamide (15 ml) pri izbovej teplote sa pridá benzotriazol-l-yloxytris(dimetylamino)fosfónium-hexafluórfosfát (BOP činidlo, 997 mg 2, 26 mmol), potom 4-dimetylaminopyridín (206 mg, 1,69 mmol), zmes sa mieša pri izbovej teplote počas 72 hodín. Reakcia sa potom zriedi etylacetátom (300 ml), premyje nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (100 ml), vodou, 2N kyselinou chlorovodíkovou (100 ml), vodou (3 x 200 ml) a soľankou. Potom sa suší nad síranom horečnatým a koncentruje. Zvyšok sa trituruje etylacetátom, čím sa získa (3-chlór-4-metoxy-fenyl)-amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-4-karboxylovej kyseliny vo forme ružovej pevnej látky.
‘H NMR (360 MHz, DMSO-de) δ 10,50 (s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J = 2,5 Hz, 1H), 7,62 (dd, J = 2,5 & 9 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,13 (d. J, = 9 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (s, 2H, CH2).
MS-EI m/z 316 [M]+.
4-Karboxy-2-oxindol
Roztok trimetylsilyldiazometánu v hexáne (2 M) sa pridáva po kvapkách do roztoku 2,01 g 2-chlór-3-karboxynitrobenzénu v 20 ml metanolu pri izbovej teplote, dokiaľ sa neprestane uvoľňovať plyn. Na zhášanie prebytku trimetylsilyldiazometánu sa pridá kyselina octová a zvyšok sa suší v sušiarni cez noc. Získaný 2-chlór-3-metoxykarbonylenitrobenzén je dostatočne čistý do nasledujúcej reakcie.
Dimetyl-malonát (6,0 ml) sa pridá do ľadovej studenej suspenzie 2,1 g hydridu sodného v 15 ml DMSO. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 100 °C počas 1 hodiny, potom sa ochladí na izbovú teplotu a po častiach sa pridá 2-chlór-3-metoxykarbonylenitrobenzén (2,15 g) a zmes sa zahrieva pri teplote 100 °C počas 1,5-hodiny. Reakčná zmes sa potom ochladí na izbovú teplotu, naleje do ľadovej vody, okyslí na pH = 5 a extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa premyje soľankou, suší nad bezvodým síranom sodným a koncentruje, čim sa získajú 3,0 g dimetyl-2-metoxykarbonyl-6-nitrofenylmalonátu.
Dimetyl-2-metoxykarbonyl-6-nitrofenylmalonát (3, 0 g) sa refluxuje v 50 ml 6N kyseliny chlorovodíkovej cez noc. Zmes sa koncentruje do sucha, pridá sa 20 ml etanolu a 1,1 g chloridu cínatého a zmes sa refluxuje počas 2 hodín. Zmes sa filtruje cez Celit, koncentruje a chromatografuje na stĺpci silikagélu v zmesi etylacetátu, hexánu a octovej kyseliny ako mobilnej fázy, čím sa získa 0,65 g (37 %) 4-karboxy-2-oxindolu ako bielej pevnej látky.
‘H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J = 8Hz, 1H), 7,39 (t, J = 8Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).
D. Syntéza pyrolom substituovaných 2-indolinónov
Príklad 37 (3-Dietylaminopropyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2-izopropyl-4-fenyl-l/í-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Zmes 2-aminoacetofenón-hydrochloridu (1 ekviv.), etyl-izobutyrylacetátu (1,2 ekviv.) a octanu sodného (2,4 ekviv.) v H2O sa mieša pri teplote 100 °C počas 18 hodín a potom ochladí na izbovú teplotu, vodná vrstva sa oddekantuje a olej sa rozpustí v etylacetáte, premyje vodou a soľankou a suší, čím sa získa (93 %) etylester 2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny vo forme červeno hnedého oleja.
‘H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,02 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/z 257 [M+J.
Tento pyrol sa formyluje podľa spôsobu A, čím sa získa (41 %) etylester 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l/Y-pyrol-3-karboxylovej kyseliny ako červenkastá pevná látka.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/z 285 [M+],
Ester pyrolkarboxylovej kyseliny sa hydrolyzuje podľa spôsobu B, čím sa získa (57 %) 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l/Y-pyrol-3-karboxylovej kyseliny vo forme béžovej pevnej látky.
’H NMR, (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 257 [M+J.
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (120 mg, 0,31 mmol) sa kondenzuje s (3-dietylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2-izopropyl-4-f’enyl-l//-pyrol-3-karboxylove] kyseliny (pripravený podľa spôsobu C), čím sa získa 120 mg (71 %) zlúčeniny.
’H NMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH) 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONCH,) 7,30 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (dd, J = 1,8 & 7,8 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2), 2,34 (q, J = 7, 1 Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J - 6, 9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J = 7, 1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 565, 1 [M++1J.
Príklad 38 (3-Pyrolidín-l-yl-propyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2-izopropyl-4-fenyl-lZ/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-(5-Bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylová kyselina (127 mg 0,28 mmol) sa kondenzuje s 3-pyrolidín-l-yl-propylamínom (43 mg 0,336 mmol), čim sa získa 140 mg (66 %) zlúčeniny.
’H NMR (300 MHz, DMSO-dä) δ 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 211), 6,84 (d, J = = 8,1 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2), 2,30 (m, 4H, 2 x CH2), 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,62 (m, 4H, 2 x CH2), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH,), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 560 a 562 [M”-l a M++l],
Príklad 39 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (57 g 0,27 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (120 mg), čím sa získa 78 mg (53 %) požadovanej zlúčeniny ako žltá pevná látka.
’H NMR (300 MHz, DMSO-d«) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3) 2 & CH2, 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH3)2) 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2.
MS-EI m/z 548 a 550 [M+-l a M+ f l].
Príklad 40 [3-(4-Metylpiperazín-l-yl)propyl]-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2-izopropyl-4-fenyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (53 mg 0,25 mmol) sa kondenzuje s [3-(4-metylpiperazín-l-yl)propyl]-amidom 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (300 mg), čím sa získa 65 mg požadovanej zlúčeniny.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H).6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2), 2,24 (m, 8H, 4xCH2), 2,11 (m, 5H, CH2 & CH3)
1,42 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 589 a 591 [M+-l a M++l],
Príklad 42 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2-metyI-4-fenyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (44 mg 0,21 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2-metyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (70 mg, pripravený rovnakým spôsobom ako izopropylový analóg), čím sa získa 0,03 g (27 %) zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
’H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J = 1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinyl), 7,09 (m, 1H, CONCH,), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3 x NCH2), 1,59 (m, 4H, 2 x CH2).
MS-EI m/z 518 a 520 [M+-l a M++l]
Príklad 44 (2-Dimetylaminoetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l ,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2-metyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (46 mg 0,22 mmol) sa kondenzuje s (2-dimetylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2-metyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (65 mg), Čím sa získa 60 mg (55 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (m, 1H, CONCH2), 6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2H, 3 x NCH2), 2,02 (s, 6H, 2 x NCH3).
MS m/z 493 a 494, 8 [M+ a M++2],
Príklad 47 (3-Dietylaminopropyl)-amid 5-(5-brórn-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmctyl)-2-metyl-4-fenyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,47 g 2,2 mmol) sa kondenzuje s (3-dietylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2-metyl-4-fenyl-l/Y-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,75 g), čím sa získa 0,11 g (42 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d^ δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,38 (q, J = 7,1 Hz, 4H, 2 x NCH2CH3), 2,26 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 6H, 2 x NCH2CH3). MS-EI m/z 535, 0 a 537 [M+ a M++2j.
Príklad 48 (2-Dimetylaminoetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Zmes terc-buty 1-3-oxobutyrátu a dusičnanu sodného (1 ekviv.) v octovej kyseline sa mieša pri izbovej teplote, čím sa získa /erc-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrát.
Etyl-3-oxobutyrát (1 ekviv.), zinkový prach (3,8 ekviv.) a surový Zerc-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrát v octovej kyseline sa mieša pri teplote 60 °C počas 1 hodiny. Reakčná zmes sa naleje do H2O a filtrát sa spojí, čím sa získa (65 %) 2-ŕerc-butyloxykarbonyl-3,5-dimetyl-4-etoxykarbonylpyrol.
Zmes 2-terc-butyioxykarbonyl-3,5-dimetyl-4-etoxykarbonylpyrolu a tri-etylortoformiátu (1,5 ekviv.) v trifluóroctovej kyseline sa mieša pri teplote 15 °C počas 1 hodiny. Reakcia sa koncentruje a zvyšok čistí, čím sa získa (64 %) 2,4-dimetyl-3-etoxykarbonyl-5-formylpyrol vo forme žltých ihličiek.
2,4-Dimetyl-3-etoxykarbonyl-5-formylpyrol sa hydrolyzuje podľa spôsobu B, čím sa získa (90 %) 5-formyl-2.4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylová kyselina.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br s, 2H, NH a CO2H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, C13), 2,40 (s, 3H, CH3).
MS m/z 267 [M+],
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,17 g 0,8 mmol) sa kondenzuje s (2-dimetylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-177-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,2 g, pripravený podľa spôsobu C) podľa spôsobu B, čím sa získa 0,3 g (83 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 9,07 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4),
7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1H, CONCH2), 7,24 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = = 8,4 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CHj)2).
MS-EI m/z 430 a 432 [M+-l a M++1J.
Príklad 49 (2-Dimetylaminoetyl)-amid 2,4-dimctyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,17 g 0,8 mmol) sa kondenzuje s (2-dimetylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l/Z-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,2 g), čím sa získa 0,13 g (36 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (br, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H,), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 1,6 & 7,9 Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,8 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/z 428 [M+],
Príklad 50 (2-Dimetylaminoetyl)-amid 5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dirnetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Chlór-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,1 g 0,6 mmol) sa kondenzuje s (2-dimetylaminoetyl)-amidom 5-fornivl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovcj kyseliny (0,15 g), čím sa získa 0,22 g (90 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
‘H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 7,96 (d, J = 2, 0 Hz, 1H, H-4),
7.75 (s, 1H, H-vinyl), 7,50 (t, J - 5,5 Hz, 1H, CONCH2)7,12 (dd, J = 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6)6,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2)2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3)2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/z 386 [M4].
Príklad 51 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l/f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,17 g 0,8 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,2 g), čím sa získa 0,09 g (26 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d,,) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H-4),
7.76 (s, 1H, H-vinyl), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, III, CONCH2), 7,24 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = = 8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 x NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2 xNCH2CH3),
MS-EI m/z 458 a 460 [M+-l a M++l],
Príklad 52 (2-Pyrolidm-l-yl-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (0, 09 g 0,4 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0, 1 g), čím sa získa 0,14 g (81 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
‘H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-4),
7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONCH2), 7,24 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J = = 8,5 Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH2), 2,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, pod DMSO), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,66-1, 69 (m, 4H, 2 x CH2).
MS-EI m/z 456 a 458 [M+-l a M++l).
Príklad 53 (3-Imidazol-l-yl-propyl)-amid 5-(5-brórn-2-oxo-1.2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimctyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,09 g 0,4 mmol) sa kondenzuje s (3-imidazol-l-yl-propyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,1 g), čím sa získa 0,1 g (59 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
‘H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4),
7,77 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J = 8, 4 Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/z 467 a 469 [M+-l a M++l],
Príklad 56 (2-Dietylaminoetyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (80 mg 0,4 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,1 g) podľa spôsobu B, čím sa získa 79 mg (46 %) požadovanej zlúčeniny.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 x NCH2), 2,44 (s, 6H, 2 x CH3), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6H, 2 x NCH2CH3). MS-EI m/z 456 [M+J.
Príklad 57 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)- l/Z-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,04 g 0,2 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,04 g), čím sa získa požadovaná zlúčenina vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
*H NMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, J = 6,3 Hz, 1H, CONCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2 x NCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2), 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, pod DMSO), 2,43 (s, 6H, 2 x CH3), 1,66 (m, 4H, 2 x CII2).
MS-EI m/z 454 [M+J.
Príklad 58 (3-Imidazol-l-yl-propyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylídénmetyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5- Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (8 mg 0,04 mmol) sa kondenzuje s (3-imidazol-l-yl-propyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (10 mg), čím sa získa 10 mg (59 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (br, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q, J = 6,5 Hz, 2H, CONCH2), 2,44 (s, 6H, 2 x CH3), 93 (m, 2H, CH2CH2 CH,). MS-EI m/z 465 [M+].
Príklad 59 (2-Dietylaminoetyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-fcnyl-l,2-dihydro-indol-3-yIidénmetyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6- Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,08 g 0,4 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,1 g), čím sa získa 65 mg (38 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
‘H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 x NCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2 x NCH2CH3). MS-EI m/z 456 [M*].
Príklad 60 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-lÁí-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-Fenyl-l,3-díhydro-mdol-2-ón (30 mg 0,15 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lŕ/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (40 mg), čim sa získa 5,9 mg (8,5 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7, 8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3 x NCH2), 2,55 (t, J - 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 x CH2),
MS-EI m/z 454 [M+],
Príklad 61 (3-Imidazol-l-yl-propyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-I//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (8 mg 0,04 mmol) sa kondenzuje s (3-imidazol-l-yl-propyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (10 mg), čím sa získa 7,3 mg (43 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J - 8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J = 1,4 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NCH2 CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2).
MS-EI m/z 465 [M+],
Príklad 62 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-[6-(3,5-dichlórfenyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-(3,5-Dichlórfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón (64 mg 0,23 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (60 mg), čím sa získa 53 mg (44 %) požadovanej zlúčeniny vo forme svetlohnedej pevnej látky.
‘H NMR (360 MHz, DMSO-d(1) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H) 7,55 (m, 1H, CONCH2), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58 (m, 6H, 3 x NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 6,8 Hz, 6H, 3 x NCH2CH3), MS m/z 526, 9 [M++l].
Príklad 63 (2-Dietylaminoetyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-pyridín-3-yl-l,2-dihydro-mdol-3-ylidénmetyl)-lH-pyrol-3-karboxylovcj kyseliny
6-Pyridín-3-yl-l,3-dihydro-indol-2-ón (40 mg 0,19 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (50 mg), čím sa získa 29 mg (33 %) požadovanej zlúčeniny vo forme svetlooranžovej pevnej látky.
*H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d, J = = 5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinyl), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J = = 7,5 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,55 (m, 3 x NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, 2 x NCH2CH3).
MS-EI m/z 457 [M+J.
Príklad 64 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-pyridín-3-yl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-Pyridín-3-yl-l,3-dihydro-indol-2-ón (60 mg 0,28 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidin-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (75 mg), čím sa získa 90 mg (71 %) požadovanej zlúčeniny vo forme svetlooranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-dfi) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 8,54 (dd, J = 1,5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinyl), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H, 3 x NCH2),
2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 x CH2).
MS-EI m/z 455 [M+],
Príklad 65 (3-Dimetylaminopropyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-pyrídín-3-yl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-Pyridín-3-yl-l,3-dihydro-indol-2-ón (42 mg 0,2 mmol) sa kondenzuje s (3-dimetylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (50 mg), čím sa získa 67 mg (75 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto hnedej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinyl), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J - 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2), 2,14 (s, 6H, 2 x NCH3), 1,64 (m, 2H, CHO).
MS-EI m/z 443 [M+],
Príklad 66 (3-Dimetylaminopropyl)-amid 2,4-dimctyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (67 mg 0,32 mmol) sa kondenzuje s (3-dimetylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (81 mg), čím sa získa 40 mg (28 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
lH NMR (360 MHz, DMSO-dó) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2 x x CH3), 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2 x NCH3), 1,63 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/z 442 [M4].
Príklad 67 (3-Dietylaminopropyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5- Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (1,5 g 7,16 mmol) sa kondenzuje s (3-dietylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (2 g), čím sa získa 1,3 g (40 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d,,) δ 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 a 8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J = 5,3 Hz, 1H, CONCH2), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONCH2), 2,5 (m, 12H, 3 x NCH, a 2 x x CH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 470 [M+],
Príklad 68 (3-Dietylaminopropyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6- Fenyl-l,3-dihydro-indol-2-ón (1,5 g 7,16 mmol) sa kondenzuje s (3-dietylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (2 g), čím sa získa 1,9 g (57 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) ô 13,58 (s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3 x NCH2 a 2 x CH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 470 [M+],
Príklad 70 (3-Dietylaminopropyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l/V-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,5 g, 2,36 mmol) sa kondenzuje s (3-di-etylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-177-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (0,51 g), čim sa získa 0,84 g požadovanej zlúčeniny vo forme červeno-oranžovej pevnej látky.
’H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, ArH), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, J = 1,8 a 8,3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J = 7,8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2 x NCH2), 3,2 (m, 2H, CONCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2 a 2 x CH3), 2,4 (s, 6H, 2 x CH3), 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J = = 7,1 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 472 a 474 [M+-l a M++l],
Príklad 71 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-diizopropyl-l/ŕ-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (100 mg 0,47 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-diizopropyl-l/f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (150 mg), čím sa získa 0,15 g (62 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
’H NMR (300 MHz, DMSO-dč) δ 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J = 1,3 a 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH a NHCH2), 2,5 (br m, 6H, 3 x NCH2), 1,28 (d, J = 6, 9 Hz, 6H, 2 x CH3), 1,23 (d, J = 6, 6 Hz, 6H, 2 x CH3), 0,96 (m, 6H, 2 x CH2CH3).
MS-EI m/z 514 a 516 [M+-l a M++l].
Príklad 72 (3-Dietylaminopropyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-diizopropyl-177-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (90 mg 0,42 mmol) sa kondenzuje s (3-dietylaminopropyl)-amidom 5-formyl-2,4-diizopropyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (140 mg), čím sa získa 54 mg (25 %) požadovanej zlúčeniny vo forme červeno-hnedej pevnej látky.
*H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, IH, NH), 10,96 (s, IH, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, IH, H-vinyl), 7,23 (dd, J = 1,7 a 8, 1 Hz, IH, ArH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, IH, ArH), 3,5 (m, IH, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, IH, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 x NCH2), 1,7 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2 x CH3), 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6H, 2 x CH3), 1,06 (m, 6H, 2 x CH2CH3).
MS-EI m/z 528 a 530 [M+-l a M++l],
Príklad 73 (3-Pyrolidin-l-yl-propyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-diizopropyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (130 mg 0,6 mmol) sa kondenzuje s (3-pyrolidín-l-yl-propyl)-amidom 5-formyl-2,4-diizopropyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (150 mg 0,45 mmol), čím sa získa 36 mg (15 %) požadovanej zlúčeniny vo forme hnedo-oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, IH, NH), 10,97 (s, IH, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, IH, H-vinyl), 7,23 (dd, J = 1,6 a 7,6 Hz, IH, ArH), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, IH, ArH), 3,5 (m, IH, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, IH, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 x NCH2), 1,7 (br m, 6H, 3 x NCH2CH2), 1,28 (d, J = 5,6 Hz, 6H, 2 x CH3), 1,24 (d, J = 5,7 Hz, 6H, 2 x CH3).
MS-EI m/z 526 a 528 [M+-l a M++l],
Príklad 74 (Pyridín-4-ylmetyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Bróm-l,3-dihydro-indol-2-ón (170 mg 0,8 mmol) sa kondenzuje s (pyridín-4-ylmetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (200 mg), čím sa získa 14 mg (4 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
‘H NMR (300 MHz,'DMSO-d6) δ 13,67 (s, IH, NH), 11,01 (s, br, IH, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, J = 6,0 Hz, IH, CONCH2), 8,11 (d, J = 1,9 Hz, IH), 7,78 (s, IH, H-vinyl), 7,31 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, I = 1,9 & 8,1 Hz, IH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, IH), 4,45 (d, I = 6,0 Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2 x x CH3).
MS-EI, m/z 450 a 452 [M+-l a M++l],
Príklad 75 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-[6-(4-butylfenyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5- [6-(4-Butylfenyl)]-l,3-dihydro-indol-2-ón (50 mg 0,19 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (50 mg), čím sa získa 74 mg (76 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'II NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, IH, NH), 10,93 (s, br, IH, NH), 7,82 (d, I = 7,9 Hz, IH), 7,63 (s, IH, H-vinyl), 7,54 (d, I = 7,9 Hz, 2H), 7,46 (m, IH, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, IH), 3,30 (m-, 2H, CH2), 2,52-2,63 (m, 4H, 2 x CH2), 2,49 (m, 4H, 2 x CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2 x x CH2), 1,58 (m, 2H, CH2), 1,34 (m, 2H, CH2), 0,91 (t, J = 7, 2 Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/z 510 [M+].
Príklad 77 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-[6-(4-etylfenyl)-2-oxo-l,2-dihydro-mdol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6- (4-Etylfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón (45 mg 0,19 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (50 mg), čím sa získa 60 mg (65 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, IH, NH), 10,96 (s, br, IH, NH), 7,83 (d, J = 8, 4 Hz, IH), 7,64 (s, IH, H-vinyl), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J = 1 Hz, IH), 3,31 (m, 2H, CH2), 2,63 (m, 2H, CH2CH3), 2,55 (m, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2 x CH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 x x CH2), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/z 482 [M*].
Príklad 79 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-[6-(3-izopropylfenyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/Z-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
6-(3-Izopropylfenyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón (48 mg 0,19 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (50 mg), čím sa získa 59 mg (63 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H, H-vinyl), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H, CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2), 2,50 (m, 4H, 2 x CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 4H, 2 x CH2), 1,27 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-E1 m/z 496 [M+j.
Príklad 80 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-ll/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Fluór-l,3-dihydro-indol-2-ón (0,54 g 3,8 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lW-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, čím sa získa 0,83 g (55 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-zelenej pevnej látky.
‘H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9, 4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinyl), 7,37 (t, 1H, CONHCH,CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3 x CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 398 [M+j.
Príklad 80 (alternatívna syntéza) (2-Dietylamino-etyl)-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Hydrát hydrazínu (55 %, 3000 ml) a 5-fluórisatín (300 g) sa zahrievajú pri teplote 100 °C. V priebehu 120 minút sa za stáleho miešania pridáva po častiach (100 g) ďalší 5-fluórisatín (500 g), zmes sa zahrieva pri teplote 110 °C a mieša počas 4 hodín, ochladí na izbovú teplom a pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou, čím sa získa surový hydrazid (2-amino-5-fluór-fenyl)-octovej kyseliny (748 g), hydrazid sa suspenduje vo vode (700 ml) a pH zmesi sa upraví na < pH 3 pomocou 12 N kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa mieša počas 12 hodín pri izbovej teplote, pevný podiel sa spojí vákuovou filtráciou a premyje (2 x) vodou, produkt sa suší za vákua, čim sa získa 5-fluór-l,3-dihydro-mdol-2-ón (600 g, 73 % výťažok) vo forme hnedého prášku. 'H-NMR (dimetyl-sulfoxid-d6) δ 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3H, aromatické), 10,35 (s, 1H, NH).
MS m/z 152 [M+l],
2-íerc-Butylester 4-etylesteru 3,5-dimetyl-lrí'-pyrol-2,4-dikarboxylovcj kyseliny (2 600 g) a etanol (7 800 ml) sa intenzívne miešajú, zatiaľ čo sa pomaly pridáva 10 N kyselina chlorovodíková (3 650 ml), teplota sa zvýši z 25 °C na 35 °C, čím sa začne uvoľňovať plyn. Zmes sa ohreje na teplotu 54 °C a mieša za ďalšieho zahrievania počas jednej hodiny na teplotu 67 °C. Zmes sa ochladí na teplotu 5 °C a za stáleho miešania sa pomaly pridáva 32 1 vody. Pevná látka sa spojí vákuovou filtráciou a premyje (3 x ) vodou, pevná látka sa suší na vzduchu na konštantnú hmotnosť, čím sa získa etylester 2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovcj kyseliny (1 418 g, 87 % výťažok) vo forme ružovkastej pevnej látky.
'H-NMR (dimetylsulfoxid-d6) δ 2,10, 2,35 (2 x s, 2 x 3H, 2 x CH3), 4,13 (q, 2H, CH2), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH).
MS m/z 167 [M+l].
Dimetylformamid (322 g) a dichlórmetán (3700 ml) sa ochladia v ľadovom kúpeli na teplotu 4 °C a za stáleho miešania sa pridá oxychlorid fosforečný (684 g). Pevný etylester 2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (670 g) sa pomaly pridáva v alikvotných podieloch v priebehu 15 minút. Maximálna teplota sa pohybuje okolo 18 °C. Zmes sa zahrieva pri refluxe počas jednej hodiny, ochladí na teplotu 10 °C v ľadovom kúpeli a naraz sa za intenzívneho stáleho miešania pridá 1,6 1 ľadovej vody. Teplota sa zvýši na 15 °C. Za intenzívneho stáleho miešania sa pridá 10 N kyselina chlorovodíková (1,6 1). Teplota sa zvýši na 22 °C. Zmes sa nechá stáť počas 30 minút a vrstvy sa nechajú separovať, pričom maximum teploty je 40 °C. Vodná vrstva sa upraví na pH 12-13 pomocou 10 N hydroxidu draselného (3,8 1) tak, aby teplota počas pridávania nepresiahla 55 °C.
Po pridaní sa zmes ochladí na teplotu 10 °C a mieša počas 1 hodiny, pevná látka sa spojí vákuovou filtráciou a premyje (4x) vodou, čím sa získa etylester 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (778 g, 100 % výťažok) vo forme žltej pevnej látky.
'H-NMR (DMSO-d6) δ 1,25 (t, 3H, CH3), 2,44, 2,48 (2 x s, 2 x 3H, 2 x CH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH).
MS m/z 195 [M+l],
Etylester 5-formyl-2,4-dimetyl-l+/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (806 g), hydroxid draselný (548 g), voda (2 400 ml) a metanol (300 ml) sa refluxujú počas 2 hodín za stáleho miešania a ochladia na teplotu 8 °C. Zmes sa extrahuje (2 x ) dichlórmetánom, vodná vrstva sa upraví na pH 4 pomocou 1 000 ml 10 N kyseliny chlorovodíkovej, pričom teplota sa udržuje pod 15 °C. Kvôli miešania sa pridá voda a pevná látka sa spojí vákuovou filtráciou, premyje (3 x ) vodou a suší za vákua pri teplote 50 °C, čím sa získa 5-formyl-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylová (645 g, 93,5 % výťažok) kyselina vo forme žltej pevnej látky. 'H NMR (DMSO-d6) δ 2,40, 2,43 (2 x s, 2 x 3H, 2 x CH3), 2,57 (s, 1ΙΊ, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH+COOH). MS m/z 168 [M+l],
5-Formyl-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxvlová kyselina (1 204 g) a 6 020 ml dimetylformamidu sa mieša pri izbovej teplote, zatiaľ čo sa pridáva hydrochlorid l-(3-dimetyl-aminopropyl-3-etylkarbodiimidu (2 071 g), hydroxybenzotriazol (1 460 g), trietylamín (2 016 ml) a dietyletyléndiamín (1 215 ml). Zmes sa mieša počas 20 hodín pri izbovej teplote, zriedi 3 000 ml vody, 2 000 ml soľanky a 3 000 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pH sa upraví na > 10 pomocou 10 N hydroxidu sodného. Zmes sa zakaždým extrahuje (2 x ) 5 000 ml s 10 % metanolom v dichlórmetáne a spojené extrakty sa sušia nad bezvodým síranom horečnatým a zahusťujú na rotačnej odparke do sucha. Zmes sa zriedi 1 950 ml toluénu a znovu zahusťuje do sucha na rotačnej odparke. Zvyšok sa trituruje zmesou hexánov a dietyléteru (4 000 ml) (3 : 1), pevný podiel sa spojí vákuovou filtráciou, premyje (2 x ) 400 ml etylacetátu a suší za vákua pri teplote 34 °C počas 21 hodín, čím sa získa (2-dietylamino-etyl)-amid 5-fbrmyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (819 g, 43 % výťažok) vo forme svetlohnedej pevnej látky.
'H NMR (dimetylsulfoxid-d6) δ 0,96 (t, 6H, 2 x CH3)2,31-2,38 (2 x s, 2 x CH3), 2,51 (m, 6H 3 x CH,), 3,28 (m, 2H, CH2), 7,34 (m, 1H, amidNH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11, 86 (s, 1H, pyrol NH).
MS m/z 266 [M+l].
(2-Dietylaminoetyl)-amid 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (809 g), 5-fluór-l,3-dihydro-indol-2-ón (438 g), etanol (8 000 ml) a pyrolidín (13 ml) sa zahrievajú pri teplote 78 °C počas 3 hodín. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou a premyjú etanolom. Pevné látky sa miešajú s etanolom (5 900 ml) pri teplote 72 °C počas 30 minút, ochladia na izbovú teplotu, pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou, premyjú etanolom a sušia za vákua pri teplote 54 °C počas 130 hodín, čím sa získa (2-dietylamino-etyl)-amid 5-[5-tluór-2-oxo-1.2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (1 013 g, 88 % výťažok) vo forme oranžovej pevnej látky.
'H-NMR (dimetylsulfoxid-d6) δ 0,98 (t, 6H, 2 x CH3), 2,43,2,44 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,50 (m, 6H, 3 x CH2), 3,28 (q, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5H, aromatické, vinyl, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pyrol NH).
MS m/z 397 [M-l],
Príklad 81
3-[4-(2-Dietylaminoetylkarbamoyl)-3,5-dimetyl-l/ŕ-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3-dihydro-17f-indol-6-karboxylová kyselina
2-Oxo-2,3-dihydro-17/-indol-6-karboxylová kyselina (80 mg 0,45 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetylj-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, čím sa získa 210 mg (92 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
’H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, 111), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,57 (dd, J = 1,5 & 8,0 Hz, 1H), 7,40-7, 42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,88 (m, Hpiperidin), 2,54 (m, 6H, 3 x CH2),
2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-pipendin), 0,97 (t, J = 6,98 Hz, 6H, N(CH2CH3)2). MS m/z 424 [M+].
Príklad 82 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-dimetylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Dimetylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l/7-indol-5-sulfónovej kyseliny (90 mg 0,38 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-di-metyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (100 mg), čím sa získa 100 mg (54 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
’H NMR (360 MHz, DMSO-dJ δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-vinyl), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H, N(CH3)2), 2,56 (t, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2 x CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 x CH2).
MS-EI m/z 485 [M+],
Príklad 83 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-[5-(3-chlórfenylsulfamoyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetvl-l+/-pyrol-3-karboxylovcj kyseliny (3-Chlórfenyl)-amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfónovej kyseliny (120 mg, 0,38 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (100 mg), čím sa získa 150 mg (69 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žlto-oranžovej pevnej látky.
’H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 10,30 (br s, III, NH), 8,26 (d, 111), 7,79 (s, 1H, H-vinyl), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH2), 2,57 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2 x CH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2 x CH2).
MS m/z 568 [M+j.
Príklad 84 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-[2-oxo-5-(pyridín-3-ylsulfamoyl)-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl]-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Pyridín-3-ylamid 2-oxo-2.3-dihydro-l//-indol-5-sulfónová kyselina (110 mg 38 mmol) sa kondenzuje s (2-pyrolidín-1-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyro 1-3-karboxylovej kyseliny (100 mg), čím sa získa 150 mg (74 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-dg) δ 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,56 (t, J = 7,06 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2 x CH2), 2,43 (s, 6H, 2 x CH3), 1,68 (m, 4H, 2 x CH2).
MS m/z 535 [M+J.
Príklad 85
3-[3,5-Dimetyl-4-(4-metylpiperazín-l-karbonyl)-l//-pyrol-2-ylmetylén]-4-(2-hydroxyetyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón
4-(2-Hydroxyetyl)-l,3-dihydro-indol-2-ón (71 mg 0,4 mmol) sa kondenzuje s 3,5-dimetyl-4-(4-metyl-piperazín-l-karbonyl)-177-pyrol-2-karbaldehydom, čím sa získa 90 mg (55 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
‘H NMR (300 MHz, DMSO-dó) δ 14, 25 (s, 1H, NH), 10,88 (s, 1H, NH), 7,57 (s, 1H, H-vinyl), 7,03 (m, 1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H, OH), 3,70 (m, 2H, CH2), 3,04 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 4H, 2 x CH2), 2,28 (br s, 7H), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,18 (s, 3H, CH3).
MS m/z (+ve) 4, 09, 3 [M+],
Príklad 86
Fenylamid 3-[3,5-dimetyl-4-(4-metylpiperazín-l-karbonyl)-Lŕ/-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3-dihydro-l/7-indol-5-sulfónovej kyseliny
Fenylamid 2-oxo-2,3-dihydro-L/7-indol-5-sulfónovej kyseliny (110 mg 0,4 mmol) sa kondenzuje s 3,5-dimetyl-4-(4-metylpiperazín-l-karbonyl)-l//-pyrol-2-karbaldehyd (100 mg), čím sa získa 50 mg (24 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,52 (s, 1H, NH), 11,26 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,50 (dd, J = 1,6 & 8,3 Hz, 1H), 7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H, 2 x CH2), 2,28 (m, 10H, 2 x CH3 & 2 x CH2), 2,18 (s, 3H, CH3).
MS-EI m/z 519 [M+J.
Príklad 87 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-(5-dirnetylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dirnetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Dimetylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfónovej kyseliny (90 mg 0,38 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetylj-amidom 5-formyl-2,4-dimctyl-1/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (100 mg), čím sa získa 80 mg (43 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-vinyl), 7,49 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,60 (s, 6H, N(CH3),), 2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2 x CH3 & N(CH2CH3)2 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 487 [M+],
Príklad 88 (2-Dietylaminoetyl)-amid 5-[5-(3-chlórfenylsulfamoyl)-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (3-Chlór-fenyl)-amid 2-oxo-2,3-dihydro-l/7-indol-5-sulfónovej kyseliny (120 mg 3,8 mmol) sa kondenzuje s (2-dietylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dinietyl-I//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (100 mg), čím sa získa 80 mg (37 %) požadovanej zlúčeniny vo forme žltej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13, 55 (s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J = 1,87 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinyl), 7,52 (dd, J = 1,87 & 8,3 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,22 (t, J = = 8,02 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 2 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,48-2,57 (m, 6H, 3 x x CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 0,44 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7, 0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 570,1 [M+],
Príklad 116
Etylester {[4-mctyl-5-(4-metyl-5-metylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-17/-pyrol-3-karbonyl]-amino}-octovej kyseliny
Etylester 4-metyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (pozri D.O. Cheng, T. L. Bowman a E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) sa formyluje podľa spôsobu A, hydrolyzuje podľa spôsobu B, potom amiduje (spôsob C), čím sa získa etylester [(5-formyl-4-metyl-lH-pyrol-3-karbonyl)-amino]-octovej kyseliny.
4-Metyl-5-metylaminosulfonyl-2-oxindol (50 mg 0,21 mmol) sa kondenzuje s etylesterom [(5-formyl-4-metyl-LH-pyrol-3-karbonyl)-amino]-octovej kyseliny (100 mg 0,42 mmol) a piperidínom (0,1 ml) v etanole (2 ml), čím sa získa 50 mg (52 %) požadovanej zlúčeniny.
‘H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v, br, s, 1H, NH-CO), 8,33 (t, J = 5,8 Hz, 1H, CONCH2), 7,83 (d, J = 3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3), 6,89 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J = 5,8 Hz, 2H, GlyCH2), 2,86 (s, 3H, CH3), 2,48 (s, 3H, CH3), 2,42 (d, J = 4,71 Hz, 3H, HNCH3), 1,20 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3). MS-EI m/z 460 [M+J.
Príklad 117
Etylester {[4-metyl-5-(5-metylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénme-tyl)-l//-pyrol-3-karbonyl]-amino}-octovej kyseliny
Zmes 5-metylaminosulfonyl-2-oxindolu (0,06 g, 0,22 mmol), etylesteru [(5-formyl-4-metyl-l//-pyrol-3-karbonyl)-amino]-octovej kyseliny (0,075 g 0,27 mmol) a piperidínu (2 kvapky) v etanole (5 ml) sa zahrieva v uzavretej banke pri teplote 90 °C počas 12 hodín. Po ochladení sa precipitát spojí vákuovou filtráciou, premyje etanolom, trituruje zmesou dichlórmetánu a éteru a suší, čím sa získa 0,035 g (36 %) požadovanej zlúčeniny vo forme nažltlej hnedej pevnej látky.
'H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 11 (v, br, s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONCH2), 8,25 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-vinyl), 7,84 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,57 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H), 7,14 (br m, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH2CH, 3), 3,92 (d, J = 5,7 Hz, 2H, GlyCH2), 2,55 (s, 3H, CH3), 2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J = 6,7 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS m/z 446 [M+].
Príklad 118 {[4-Metyl-5 -(5 -metylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-yl idénmety l)-l//-pyrol-3 -karbonyl] -amino} -octová kyselina
Zmes etylesteru [(5-formy l-4-rnetyl-LH-pyrol-3-karbonyl)-amino]-octovej kyseliny (0,142 g 0,59 mmol) a IN NaOH (1,2 ml) v metanole (10 ml) sa mieša pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Reakcia sa koncentruje a zvyšok sa kondenzuje s 5-metylaminosulfonyl-2-oxindolom (0,13 g 0,48 mmol) a piperidínom (0,12 ml) v etanole (12 ml), čím sa získa 0,11 g (52 %) požadovanej zlúčeniny.
'H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ô 13,98 (br s, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 2 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (m na br, s, 2H), 6,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 4,2 Hz, 2H, CH2NH), 2,54 (s, 3H, py-rol-CII3), 2,39 (s, 3H, ArCH3).
MS m/z 417 [M-l]4.
Príklad 126 (2-Dietylamino-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Zmes l,3-dihydro-indol-2-ónu (266 mg, 2 mmol), (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-formyl-2,4-dimetyl-LH-pyro 1-3-karboxylovej kyseliny (530 mg, 2 mmol) a piperidánu (1 kvapka) v etanole sa zahrieva pri teplote 90 °C počas 2 hodín. Reakcia sa ochladí na izbovú teplotu, výsledný precipitát sa spojí vákuovou filtráciou, premyje etanolom a suší, čím sa získa 422 mg (55 %) požadovanej zlúčeniny vo forme svetložltej pevnej látky.
'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinyl), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,99 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS +ve APCI 381 [M++ 1],
Príklad 127 (2-Dietylamino-etyl)-amid 5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Zmes 5-chlór-l,3-dihydro-indol-2-ónu (335 mg, 2 mmol), (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (530 mg, 2 mmol) a piperidínu (1 kvapka) v etanole sa zahrieva pri teplote 90 °C počas 2 hodín. Reakcia sa ochladí na izbovú teplotu, výsledný precipitát sa spojí vákuovou filtráciou, premyje etanolom a suší, čím sa získa 565 mg (68 %) požadovanej zlúčeniny vo forme oranžovej pevnej látky.
‘H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H H-vinyl), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J = 2,1 & 8,4 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,4 Hz, III), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH,CH3)2)
MS ~ ve APCI 415 [M++ 1],
Príklad 128 (2-Pyrolidín-l-etyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydro-mdol-3-ylidénmetyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny l,3-Dihydro-indol-2-ón sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, čím sa získa požadovaná zlúčenina.
MS + ve APCI 379 [M* + 1].
Príklad 129 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Fluór-l,3-dihydro-indol-2-ón sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, čím sa získa požadovaná zlúčenina.
MS + ve APCI 397 [M++ 1],
Zväčšenie meradla:
5-Formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylová kyselina (61 g), 5-fluór-l,3-dihydro-indol-2-ón (79 g), etanol (300 ml) a pyrolidín (32 ml) sa refluxuje počas 4,5 hodiny. Do zmesi sa pridá octová kyselina (24 ml) a v refluxe sa pokračuje počas 30 minút. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou a premyjú (2 x) etanolom. Pevné látky sa miešajú počas 130 minút v 40 % acetóne vo vode (400 ml) obsahujúcej 12 N kyselinu chlorovodíkovú (6,5 ml). Pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou a premyjú (2 x ) 40 % acetónom vo vode. Pevné látky sa sušia za vákua, čím sa získa 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lfí-pyrol-3-karboxylová kyselina (86 g, 79 % výťažok) vo forme oranžovej pevnej látky. 111 NMR (dimetylsulfoxid-dfj 2,48, 2,50 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xm, 4H, aromatová a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H, pyrol NH), MS m/z 299 [M-l],
5-[5-Fluór-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylová kyselina (100 g) a dimetylformamid (500 ml) sa miešajú a pridá sa benzotriazol-l-yloxytris(dimetylamino)fosfóniumhexafluórfosfát (221 g), l-(2-aminoetyl)pyrolidín (45,6 g) a trietylamín (93 ml). Zmes sa mieša počas 2 hodín pri izbovej teplote, pevný produkt sa spojí vákuovou filtráciou a premyje etanolom. Pevné látky sa premývajú za miešania v etanole (500 ml) počas jednej hodiny pri teplote 64 °C a ochladia na izbovú teplotu. Pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou, premyjú etanolom a sušia za vákua, čím sa získa (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indo1-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (101,5 g, 77 % výťažok). 'H-NMR (dimetylsulfoxid-d6) δ 1,60 (m, 4H, 2 x CH2), 2,40, 2,44 (2 x s, 6H, 2 x x CH3), 2,50 (m, 4H, 2 x CH2), 2,57, 3,35 (2 x m, 4H, 2 x CH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4H, aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, pyrol NH), MS m/z 396 [M+l],
Príklad 130 (2-Pyrolidín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-Chlór-l,3-dihydro-indol-2-ón sa kondenzuje s (2-pyrolidín-l-yl-etyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-17/-pyro 1-3-karboxylovej kyseliny, čím sa získa požadovaná zlúčenina.
MS + ve APCI 413 [M++ 1],
Príklad 131 (2-Dimetylaminoetyl)-amid 2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidén-metyl)-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny l,3-Dihydro-indol-2-ón sa kondenzuje s (2-dimetylaminoetyl)-amidom 5-formyl-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, čím sa získa požadovaná zlúčenina.
‘H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H H-vinyl), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).
MS + ve APCI 353 [M+ + 1],
Príklad 193 (2-Etylamino-etyl)-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (2-Etylamino-etyl)-amid 5-formyl-2,4-dimetyl-U7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (99 g), etanol (400 ml), 5-fluór-2-oxindol (32 g) a pyrolidín (1, 5 g) sa refluxujú počas 3 hodín za stáleho miešania, zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pevné látky sa spoja vákuovou filtráciou, miešajú v etanole pri teplote 60 °C, ochladia na izbovú teplotu a spoja vákuovou filtráciou. Produkt sa suší za vákua, čím sa získa (2-etylamino-etyl)-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (75 g, 95 % výťažok).
'H-NMR (dimetylsulfoxid-d6) δ 1,03 (t, 3H, CH3), 2,42, 2,44 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70, 3,30 (2 x t, 4H, 2 x CH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5xm, 5H, aromatický, vinyl a CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, pyrol NH).
MS m/z 369 [M-l],
Príklad 190 [2-(Pyridín-l-yl)etyl]-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
5-[5-Fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (120 mg, 0,4 mmol) sa pretrepáva s EDC a podrobí HC1 (96 mg 0,5 mmol), bezvodému 1-hydroxy-benztriazolu (68 mg 0,5 mmol) a 2-(2-aminoetylpyridínu zakúpenému pri firme Aldrich v bezvodom DMF (3 ml) počas 2 - 3 dní pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa zriedi s 1 M Na-HCO3 (1,5 ml), potom 8 ml vody. Surový precipitát sa spojí filtráciou, premyje vodou, suší a čistí kryštalizáciou alebo chromatografiou, čím sa získa [2-(pyridín-l-yl)-etyl]-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny.
Príklad 189 [2-(Pyridín-l-yl)etyl]-amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-mdol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade, ale nahradí sa 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylová kyselina 5-[5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-Lŕ/-pyrol-3-karboxylovou kyselinou (127 mg), čím sa získa [2-(pyridínlyl)etyl]-amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénme-tyl]-2,4-dimetyl-12/-pyrol-3-karboxy-lovej kyseliny.
Príklad 192 [2-(Pyridín-l-yl)etyl]-amid 5-[5-hróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-l3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 190, ale nahradí sa 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylová kyselina 5-[5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovou kyselinou (145 mg), čím sa získa [2-(pyridínlyl)etyl]-amid 5-[5-bróm-2-oxo-l ,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny.
Príklad 191 [2-(Pyridín-l-yl)etyl]-amid 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 190, ale nahradí sa 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovou kyselinou (113 mg), čím sa získa [2-(pyridin-l-yl)etyl]-amid 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny. Príklady 186, 187, 188 a 204
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príkladoch 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyljpyridín l-(2-aminoetyl)pyrolidínom zakúpeným pri firme Aldrich Chemical Company, Inc., čím sa získajú požadované zlúčeniny
Príklady 143 - 146
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príkladoch 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyljpyridín l-(2-aminoetyl)imidazolin-2-ónom (pripraveným zahrievaním dimetylkarbonátu s bis(2-aminoetyljamínom (2 ekvivalenty) v uzavretej banke pri teplote 150 °C počas 30 minút. Potom sa postupuje podľa spôsobu opísaného v patente U. S. č. 2613212 (1950) udeleného Rohm & Haas Co. Surový produkt sa čistí na silikagéli v zmesi chloroformu, metanolu, vodného amoniaku (80 : 25 : 2) ako mobilnou fázou, čím sa získajú požadované zlúčeniny.
Príklady 148 - 150 a 184
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyljpyridín etylesterom 4-(2-amino-etyl)piperazín-l-octovej kyseliny (pripravený nasledujúcim spôsobom: etylester piperazín-1 -octovej kyseliny (11,22 g) sa nechá reagovať s jódacetonitrilom (5,0 ml) v prítomnosti uhličitanu draselného (6,9 g) v etylacetáte (260 ml) pri teplote 0 °C. Po pridaní jódacetonitrilu (45 min.) sa reakčná zmes následne mieša pri izbovej teplote počas 11 hodín. Reakčná zmes sa filtruje a filtráty sa odparujú. Zvyšok sa hydrogenuje v prítomnosti boridu kobaltu (pripraveného z CoCl2 a borohydridu sodného) pri izbovej teplote pri tlaku 50 psi počas 2 dní v etanole. Filtráciou, odparovaním a chromatografickou purifikáciou v zmesi chloroformu, metanolu a vodného amoniaku (80 : 25 : 2) ako mobilnej fázy sa získa požadovaný amín (3,306 g) vo forme svetložltého oleja), čím sa získajú požadované zlúčeniny.
Príklad 154 -157
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príkladoch 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyl)pyridin l-(3-aminopropyl)-azepin-2-ónom (pripraveným podľa spôsobu publikovaného v Kraft A.: J. Chem. Soc. PerkinTrans. 1,. 6, 1999, 705 - 14, okrem hydrolýzy pomocou DBU, ktorá sa vykonáva pri teplote 145 °C v prítomnosti čistého hydroxidu lítneho (1 hodina, 5 ml DBU, 2 ml vody, 420 mg hydrátu hydroxidu lítneho).
Purifikáciou surového produktu na stĺpci silikagélu v zmesi chloroformu, metanolu, vodného amoniaku (80 : 40 : 4) ako mobilnej fázy sa získa l-(3-aminopropyl)azepin-2-ón (4,973 g, 87 % výťažok)), čím sa získajú požadované zlúčeniny.
Príklady 133 - 135 a 159
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyljpyridín A-acetyl-etyléndiaminom, (pripraveným zahrievaním zmesi etylacetátu s etyléndiamínom (1,5 ekviv.) pri teplote 160 °C počas 1 hodiny v uzavretej banke a vákuovou destiláciou. Produkt sa získa v 56 % výťažku. A'-acctyl-etyléndiamin je tiež dostupný vo firme Aldrich), čím sa získajú požadované zlúčeniny.
Príklady 136-139
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyl)pyridín l-(3-aminopropyl)-tetrahydro-pyrimidm-2-ónom (pripravený rovnakým spôsobom ako l-(3-aminopropyl)-azepin-2-ón podľa spôsobu publikovaného v Kraft A.: J.Chem.Soc. Perkin-Trans. 1, 6, 1999, 705-14; l,3,4,6,7,8-hexahydro-27Apyrimido[l,2-a]pyrimidín (4,939 g), hydrát hydroxidu lítneho (918 mg) a 2 ml vody sa zahrievajú bez rozpúšťadla v uzavretej nádobe pri teplote 145 °C počas 1 hodiny. Surový produkt sa čistí na stĺpci silikagélu v zmesi chloroformu, metanolu a vodného amoniaku (80 : 40 : 44) ako mobilnej fázy, čím sa získa čistý amín (5,265 g, 94 % výťažok).
Príklady 141, 160 - 161 a 185
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príkladoch 190, 189, 191 a 192, ale nahradí sa 2-(2-aminoetyljpyridín l-(2-aminoetyl)-piperazín-2-ónom (pripraveným nasledujúcim spôsobom: čistý íerc-butyldifenylsilylchlorid (25 ml, 97,7 mmol) sa pridáva po kvapkách do roztoku DBU (19,5 ml, 130 mmol) a bis(2-aminoetyljamínu (4,32 ml, 40 mmol) v bezvodom dimetylacetamide (80 ml) pri izbovej teplote po ochladení vo vodnom kúpeli v priebehu 5 minút. Po ochladení na izbovú teplotu sa pridá etylester bromoctovej kyseliny (6,70 ml, 60 mmol). Reakčná zmes sa mieša počas 25 minút, potom sa odparuje za vysokého vákua a zvyšok sa rozpustí v metanole (200 ml). Pridá sa KHCO3 (10 g) a KF (12 g, 200 mmol) a zmes sa mieša pri teplote 60 °C počas 5 hodín. Pridá sa 10 g Na2CO3 a zmes sa mieša počas 10 minút, ochladí a filtruje, filtráty sa odparujú. Zvyšok sa extrahuje hexánmi (2 x 250 ml), látky nerozpustné v hexánoch sa rozpustia v etanole (60 ml), filtrujú a odparujú. Zvyšok sa čistí na stĺpci silikagélu v zmesi chloroformu, metanolu a vodného amoniaku (80 : 40 : 4) ako mobilnej fázy, čím sa získa čistý amín (4,245 g, 74 % výťažok), čím sa získajú požadované zlúčeniny.
Príklad 168 [2-(4-Metylpiperazín-l-yl)-etyl]-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Do miešanej žltej kalnej zmesi 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (90 mg), DMF (0, 8 ml) a TEA (0, 084 ml) v 20 ml banke sa pridá BOP činidlo (199 mg). Zmes sa v priebehu 5 minút vyčerí, do čírej zmesi sa pridá 2-(4-metylpiperazin-l-yl)etylamín1 (51 mg) a výsledný roztok sa mieša pri izbovej teplote cez noc. Žlté produkty v pevnej forme z reakčného systému vyprecipitujú. Podľa TLC (10 % metanol v metylénchloride) by sa všetka východisková látka mala konvertovať na produkt. Pevný podiel izolovaný vákuovou filtráciou sa raz premyje etanolom (1 ml), pevný podiel sa sonikuje v dietyléteri (2 ml) počas 20 minút a spojí vákuovou filtráciou. Po sušení za vákua sa získa (4-metylpiperazin-l-yl-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-py-rol3-karboxylovej kyseliny (79 mg, 62 % výťažok).
’H NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3), 2,40, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CHj), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,47 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7Hz, 1H), 6,91 (td, 2J = 2, 4, 3J = 8,8Hz, 1H), 7,43 (t, J = = 5,6Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J = 2,8, 9,6Hz, 1H) (aromatický a vinyl) 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 424, 4 (M-l).
Príklad 169 (4-Metylpiperazín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidén-metyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 168, ale nahradí sa 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylová kyselina 5-[5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovou kyselinou (95 mg 0,3 mmol), čím sa získa (4-metylpiperazín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lA'-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (76 mg, 58 %).
’H NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0,8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0Hz, 1H) (aromatické a vinyl), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 440,2 (M-l).
Príklad 170 (4-Metylpiperazín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidcn-metyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 168, ale nahradí sa 5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylová kyselina 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimelyl-l/7-pyrol-3-karboxylovou kyselinou, čím sa získa (4-metylpiperazín-l-yl-etyl)-amid 5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-12/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (39 mg, 54 %) z SU011670 (54 mg 0,15 mmol).
’H NMR (DMSO-d6) δ 2,14 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4 x CH2), 3,31 (m, 2H, CH2), 6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatický a vinyl) 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 486,6 (M).
Príklad 172 (4-Metylpiperazín-l-yl-etyl)-amid 5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 168, ale nahradí sa 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylová kyselina SU014900 5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovou kyselinou, čím sa získa (4-metylpiperazin-l-yl-etyl)-amid 5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidéiunetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, SU014903 (136 mg, 84 %) z SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol).
’H-NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3), 2,39, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (t, 2H, CH2), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatické a vinyl) 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 406,6 (M-l).
Príklad 171 [2-(3,5-Dimetylpiperazín-l-yl)etyl] amid 5- [2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3 Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Do miešanej žltej kalnej zmesi 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (112,8 mg 0,4 mmol), DMF (0,5 ml) a trietylamínu (0,111 ml) v 20 ml reakčnej banke sa pridá BOP činidlo (265 mg). Zmes sa po 5 minútach vyčerí. Do čírej zmesi sa pridá 2-(2,6-dimetylpiperazín-l-yl)etylamín (68,6 mg) (pozri, Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R., Mosquera, L. Labeaga, A ., Innrarity, A. Orjals, J.Med.Chem., 1999, 42, 2870-2880) a výsledný roztok sa mieša pri izbovej teplote cez noc. Podľa TLC (10 % metanol v metylénchloride) by mala všetka východisková látka zreagovať na produkt. Reakčná zmes sa zahusťuje do sucha a čistí zrýchlenou chromatografiou (CH2C12/CH3OH=20/1-15/1), potom rekryštalizuje, čím sa získa [2-(3,5-dimetylpiperazín-l-yl)etyl)-amid 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (83 mg, 50 % výťažok).
'H NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,41a2,47 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 10 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,97 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatické a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 422,2 (M+l).
Príklad 173 [2-(3,5-Dimetylpiperazín-l-yl)etyl)-amid 5-[5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-1//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 168, čím sa získa požadovaná zlúčenina (60 mg 0,2 mmol).
'H NMR (DMSO-d6) δ 0,891, 0,907 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 1,49 (t, J = 10,4 Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2 x s. 6H, 2 x x CH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,90 (td, 2J = 2, 4, 3 J = 8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 4,6,8,4Hz. 1H) (aromatické a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 438,4 (M-l).
Príklad 174 [2-(3,5-Dimetylpiperazín-l-yl)etyl)-amid 5-[5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 171, čím sa získa požadovaná zlúčenina (31,2 mg, 34 %) z 5-[5-chlór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (63 mg 0,2 mmol).
‘H NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CHZ), 2,40, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0,8,0 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatické a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 456,2 (M+l).
Príklad 175 [2-(3,5-Dimetylpiperazín-l-yl)etyl)-amid 5-[5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovcj kyseliny
Postupuje sa podľa spôsobu uvedeného v príklade 171, čím sa získa požadovaná zlúčenina (40 mg, 40 %) z 5-[5-bróm-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidénmetyl]-2,4-dimetyl-LW-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (74 mg 0,2 mmol).
'H NMR (DMSO-d*) δ 1,15, 1,16 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH,), 2,40, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 10,4 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,4 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatické a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH).
LC-MS (m/z) 498,4 (M-l).
Biologické príklady
Nasledujúce testy sa používali na nájdenie takých zlúčenín, ktoré majú optimálny stupeň požadovanej aktivity.
Postupy testov
Nasledujúce testy môžu byť používané na stanovenie miery aktivity a účinku rôznych zlúčenín podľa predloženého vynálezu na jednu alebo viac PK. Podobné testy môžu byť navrhnuté spoločne podľa rovnakých zásad pre ktorékoľvek PK pomocou štandardných a známych techník.
Niekoľko testov opísaných v predloženom vynáleze je vykonávaných technikou ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) (Voliér, et al, 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,“ Manual of Clinical Immunology, 2d ed., Rose and Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C., 359 - 371). Všeobecný postup je nasledujúci: zlúčenina je zavedená do buniek exprimujúcich testovanú kinázu, buď prírodnú alebo rekombinantnú, počas vybraného časového intervalu, po ktorom, pokiaľ testovaná kináza je receptor, je pridaný ligand aktivujúci receptor. Bunky sa lyžujú a lyzát sa prevedie do jamiek doštičky pre ELISA techniku vopred potiahnutých špecifickou protilátkou rozpoznávajúcou substrát enzymatickej fosforylačnej reakcie. Nesubstrátové komponenty bunkového lyzátu sa obmyjú a miera fosforylácie substrátu sa deteguje protilátkou špecificky rozpoznávajúcou fosfotyrozín v porovnaní s bunkami, ktoré neprišli do kontaktu s testovanou zlúčeninou.
Tieto výhodné postupy vykonávania ELISA experimentov pre špecifické PK sú uvedené. Ale úprava týchto postupov určených na stanovenie aktivity zlúčenín proti ďalším RTK, ako aj pre CTK a STK, je odbornej verejnosti zrejmé. Ďalšie testy opísané v predloženom vynáleze merajú množstvo DNA vytvorenej v rámci odpovede na aktiváciu testovanej kinázy, ktorá je všeobecným meradlom proliferatívnej odpovede. Všeobecný spôsob tohto testuje nasledujúci: zlúčenina je zavedená do buniek exprimujúcich testovanú kinázu, buď prírodnú, alebo rekombinantnú, po vybraný časový interval, po ktorom, pokiaľ testovaná kináza je receptor, je pridaný ligand aktivujúci receptor. Po inkubácii (aspoň cez noc) sa pridá činidlo značiace DNA, napr. 5-brómdeoxy-uridín (BrdU) alebo H3-tymidín. Množstvo značenej DNA sa deteguje buď anti-BrdU protilátkou, alebo meraním rádioaktivity a je porovnávané s kontrolnými bunkami, ktoré neprišli do kontaktu s testovanou zlúčeninou.
GST-FLK-1 biologický test
Tento test analyzuje aktivitu tyrozínkinázy GST-Flkl na poly(glu, tyr) peptidoch.
Materiály a činidlá:
1. Coming doštičky ELISA s 96 jamkami (Coming Catalog No. 5805-96).
2. poly (glu, tyr) 4:1, lyofilizát (Sigma Catalog # P0275),
3. Príprava doštičiek na test potiahnutých poly (glu, tyr) (pEY): potiahnutie 2 pgjamka látkou poly (glu, tyr) (pEY) v 100 μΐ PBS, skladovanie pri izbovej teplote počas 2 hodín alebo pri teplote 4 °C cez noc. Prikrytie doštičiek kvôli odparovaniu.
4. PBS pufer: pre 1 1, zmiešanie 0,2 g KH2PO4 15 g Na2HPO4, 0,2 g KC1 a 8 g NaCl v približne 900 ml dILO. Po rozpustení všetkých činidiel sa pH upraví na 7,2 pomocou HCI. Upravenie objemu na celkový 1 1 pomocou dH2O.
5. PBST pufer: na 1 1 PBS pufra sa pridá 1,0 ml Tween-20.
6. TBB-Blokujúci pufer: pre 1 1, zmiešanie 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 ml TWEEN-20 v približne 900 ml dH2O, pH sa upraví na 7,2 pomocou HCI, pridanie 10 g BSA, miešanie na úplné rozpustenie, objem sa doplní na celkový 1 1 pomocou dH2O, filtrovanie na odstránenie pevných častíc.
7. 1 % BSA v PBS: na vytvorenie 1 x pracovného roztoku sa pridá 10 g BSA do približne 990 ml PBS pufra, miešanie na úplné rozpustenie, objem sa doplní na celkový 1 1 pomocou PBS pufra, filtrovanie na odstránenie pevných častíc.
8. 50 mM Hepes pH 7,5.
9. GST-Flklcd purifikovaný od transformácie sf9 rekombinantného bakulovírusu (SUGEN, Inc.).
10.4 % DMSO v dH,O.
11.10 mM ATP v dH2O.
12.40 mMMnCL
13. Kinázový riediaci pufer (KDB): zmiešanie 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5M NaCl, 40 μΐ 100 mM ortovanadátu sodného a 0,4 ml 5 % BSA v dH2O s 88,56 ml dH2O.
14. Polypropylénové doštičky NUNC s 96 jamkami s dnom do V, Applied Scientific Catalog # AS-72092.
15. EDTA: pridanie 14,12 g etyléndiamíntetraoctovej kyseliny (EDTA) do približne 70 ml dH2O, pridanie 10 N NaOH, dokiaľ sa EDTA nerozpustí, upravenie pH na 8,0, upravenie na celkový objem 100 ml pomocou dH2O.
16.1° protilátkový riediaci pufer: zmiešania 10 ml 5 % BSA v PBS pufre s 89,5 ml TBST.
17. Anti-fosfotyrozínová monoklonálna protilátka konjugovaná s peroxidázou z chrenu dedinského (PY99 HRP, Šanta Cruz Biotech).
18.2,2'-Azinobis (3-etylbenztiazolín-6-sulfónová kyselina (ABTS, Moss, Cat. No. ABST).
19.10 % SDS.
Postup:
1. Coming doštičky ELISA s 96 jamkami potiahnuté 2 pg polyEY peptidu v sterilnom PBS podľa kroku 3 z oddielu materiály a činidlá.
2. Odstránenie nenaviazanej tekutiny z jamiek invertujúcou doštičkou. Premytie TBST (1 x). Pretrepanie doštičky na papierovej páske na odstránenie prebytku tekutiny.
3. Do každej jamky sa pridá 100 pl 1 % BSA v PBS, inkubácia za trepania počas 1 hodiny pri izbovej teplote.
4. Opakovanie kroku 2.
5. Presýtenie jamiek 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 pl/jamka).
6. Zriedenie testovanej zlúčeniny pomocou dH2O/4 % DMSO na štvornásobnú požadovanú finálnu testovaciu koncentráciu v polypropylénových doštičkách s 96 jamkami.
7. Pridanie 25 pl zriedenej testovanej zlúčeniny do ELISA doštičky v kontrolných jamkách, zavedenie 25 pl dH2O/4 % DMSO.
8. Pridanie 25 pl 40 mM MnCl2 s 4x ATP (2 pM) do každej jamky.
9. Pridanie 25 pl 0,5M EDTA do negatívnych kontrolných jamiek.
10. Zriedenie GST-Flkl na 0,005 pg (5 ng)/jamiek pomocou KDB.
11. Pridanie 50 zriedeného enzýmu do každej jamky.
12. Inkubácia za trepania počas 15 minút pri izbovej teplote.
13. Zastavenie reakcie pridaním 50 pl 250 mM EDTA (pH 8,0).
14. Premytie 3 x TBST a pretrepanie doštičky na papierovej páske na odstránenie tekutiny.
15. Pridanie 100 pl antifosfotyrozínového HRP konjugátu na jamku, 1 : 5 000 zriedenie v protilátkovom riediacom pufre. Inkubácia za trepania počas 90 minút pri izbovej teplote.
16. Premývanie podľa kroku 14.
17. Pridanie 100 pl ABTS roztoku pri izbovej teplote do každej jamky.
18. Inkubácia za trepania počas 10 až 15 minút. Odstránenie akýchkoľvek bubliniek.
19. Zastavenie reakcie pridaním 20 pl 10 % SDS do každej jamky.
20. Meranie na prístroji Dynatech MR7000 ELISA s testovacím filtrom pri 410 nM a referenčným filtrom pri 630 nM.
PYK2 biologické testy
Tento test sa používa na meranie in vitro aktivity kinázy HA epitopom označenej pyk2 s úplnou dĺžkou (FL.pyk2-HA) pri teste ELISA technikou.
Materiály a činidlá:
1. Coming Elisa doštičky s 96 jamkami.
2. 12CA5 monoklonálna anti-HA protilátka (SUGEN, Inc.)
3. PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok Dulbecco (Gibco Catalog # 450-1300EB))
4. TBST pufer: pre 1 1, zmiešanie 8,766 g NaCI 6,057 g TRIS a 1 ml 0,1 % Triton X-100 v približne 900 ml dH2O. Upravenie pH na 7,2 a doplnenie objemu na 11.
5. Blokujúci pufer: pre 1 1, zmiešanie 100 g 10 % BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1 M NaCI a 10 ml 1 % TWEEN-20.
6. FL.pyk2-HA z sf9 bunkového lyzátu (SUGEN, Inc.).
7. 4 % DMSO v MilliQue H,O.
8. 10 mM ATP v dH2O.
9. lMMnClj.
10.1 MMgCl2.
11.1 M Ditiotreitol (DTT).
12.10X fosforylácia kinázového pufra: zmiešanie 5,0 ml 1 M Hepes (pH 7,5) 0,2 ml 1 M MnCl2 0 ml 1 M MgCl2, 1,0 ml 10 % Triton X-100 v 2,8 ml dH2O. Tesne pred použitím pridania 0,1 ml 1 M DTT.
13. NUNC propylénové doštičky s 96 jamkami s V dnom.
14.500 mM EDTA v dH2O.
15. Protilátkový riediaci pufer: pre 100 ml, 1 ml 5 % BSA/PBS a 1 ml 10 % Tween-20 v 88 ml TBS.
16. HRP-konjugovaná anti-Ptyr PY99), Šanta Cruz Biotech Cat. No. SC-7020.
17. ABTS, Moss, Cat. No. ABST-2000.
18.10% SDS.
Postup:
1. Coming ELISA doštičky s 96 jamkami potiahnuté 0,5 pg na jamku 12CA5 protilátkou anti-HA v 100 μΐ PBS. Skladovanie cez noc pri teplote 4 °C.
2. Odstránenie nenaviazanej HA protilátky z jamiek invertujúcej doštičkou. Premytie doštičiek dH2O. Pretrepanie doštičky na papierovej páske na odstránenia prebytku tekutiny.
3. Pridanie 150 μΐ blokujúceho pufra do každej jamky. Inkubácia za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote.
4. Premytie doštičiek 4x TBS-T.
5. Zriedenie lyzátu v PBS (1,5 pg lyzát/100 μΐ PBS).
6. Pridanie 100 μΐ zriedeného lyzátu do každej jamky. Pretrepávanie pri izbovej teplote počas 1 hodiny.
7. Premytie podľa kroku 4.
8. Pridanie 50 μΐ 2 X kinázového pufra do ELISA doštičky obsahujúcej zachytenú pyk2-HA.
9. Pridanie 25 μΐ 400 μΜ testovanej zlúčeniny v 4 % DMSO do každej jamky. Na kontrolné jamky použitie samotného 4 % DMSO.
10. Pridanie 25 μΐ 0,5 M EDTA do negatívnych kontrolných jamiek.
11. Pridanie 25 μΐ 20 μΜ ATP do všetkých jamiek. Inkubácia za trepania počas 10 minút.
12. Zastavenie reakcie pridaním 25 μΐ 500 mM EDTA (pH 8,0) do všetkých jamiek.
13. Premytie podľa kroku 4.
14. Pridanie 100 μΐ HRP konjugovanej anti-Ptyr zriedenej 1 : 6 000 v protilátkovom riediacom pufre do každej jamky. Inkubácia za trepania počas 1 hodiny pri izbovej teplote.
15. Premytie doštičiek 3 x s TBST a 1 x s PBS.
16. Pridanie 100 μΐ ABST roztoku do každej jamky.
17. Pokiaľ je treba zastavenie reakcie pridaním 20 μΐ 10 % SDS do každej jamky.
18. Meranie na prístroji Dynatech MR7000 ELISA s testovacím filtrom pri 410 nM a referenčným filtrom pri 630 nM.
FGFR1 biologické testy
Tento test je používaný na meranie in vitro kinázovej aktivity FGF1 -R pri ELISA teste. Materiály a činidlá:
1. Elisa doštičky Costar s 96 jamkami (Coming Catalog # 3369).
2. Poly (Glu-Tyr) (Sigma Catalog # P0275).
3. PBS (Gibko Catalog #450-1300EB)
4. 50 mM Hepes puftovací roztok.
5. Blokujúci pufer (5 % BSA/PBS).
6. Purifikovaná GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.)
7. Kinázový riediaci pufer. Zmiešanie 500 μΐ 1 M Hepes (GIBCO), 20 μΐ 5 % BSA/PBS, 10 μΐ lOOmM ortovanadátu sodného a 50 μΐ 5M NaCl.
8. lOmMATP.
9. ATP/MnCl2 fosforylačná zmes: zmiešanie 20 μΐ ATP, 400 μΐ 1 M MnCl2 a 9,56 ml dH2O.
10. NUNC polypropylénové doštičky s 96 jamkami s dnom do V (Applied Scientific Catalog # AS-72092). 11.0,5MEDTA.
12.0,05 % TBST. Pridanie 500 μΐ TWEEN do 1 litra TBS.
13. Králičie polyklonálne anti-fosfotyrozínové sérum (SUGEN, Inc.).
14. Kozí proti-králičí IgG peroxidázový konjugát (Biosource, Catalog # ALI0404).
15. ABTS roztok.
16. ABTS/H2O2 roztok.
Postup:
1. ELISA doštičky Costar s 96 jamkami potiahnuté poly(Glu, Tyr) v 100 μΐ PBS v množstve 1 pg na jamku. Skladovanie cez noc pri teplote 4 °C.
2. Premytie potiahnutých doštičiek PBS (1 x ).
3. Pridanie 150 μΐ 5 % BSA/PBS blokujúceho pufra do každej jamky. Inkubácia za trepania počas 1 hodiny pri izbovej teplote.
4. Premytie doštičiek 2 x s PBS, potom s 50mM Hepes (1 x ). Pretrepanie doštičiek na papierovej páske na odstránenie prebytku tekutiny a bubliniek.
5. Pridanie 25 μΐ 0,4 mM testovanej zlúčeniny v 4 % DMSO alebo samotnom 4 % DMSO (kontrolná) do doštičiek.
6. Zriedenie purifikovanej GST-FGFR1 v kinázovom riediacom pufre (5 ng kináza/50 μΐ KDB/jamka).
7. Pridanie 50 μΐ zriedenej kinázy do každej jamky.
8. Naštartovanie kinázovej reakcie pridaním 25 μΐ/jamka čerstvo pripraveného ATP/Mn++ (0,4 ml 1 M MnCl2, 40 μΐ 10 mM ATP, 9,56 ml dH2O), čerstvo pripravený).
9. Toto je rýchla kinázová reakcia a musí byť zastavená pomocou 25 μΐ 0,5M EDTA spôsobom, ktorý je podobný pridaniu ATP.
10. Premytie doštičiek 4 x čerstvým TBST.
11. Vytvorenie protilátkového riediaceho pufra: na 50 ml: zmiešanie 5 ml 5 % BSA, 250 μΐ 5 % mlieka a 50 μΐ 100 mM vanadátu sodného, doplnenie na konečný objem pomocou 0,05 % TBST.
12. Pridanie 100 μΐ na jamku anti-fosfotyrozín (1 : 10 000 zriedenie v ADB). Inkubácia za trepania počas 1 hodiny pri izbovej teplote.
13. Premytie podľa kroku 10.
14. Pridanie Biosource kozieho proti-králičieho IgG peroxidázového konjugátu (1 : 6 000 zriedenie v ADB) 100 μΐ na jamku. Inkubácia za trepania počas 1 hodiny pri izbovej teplote.
15. Premytie podľa kroku 10 a potom s PBS na odstránenie bubliniek a prebytku TWEEN.
16. Pridanie 100 μΐ ABTS/H2O2 roztoku do každej jamky.
17. Inkubácia za trepania počas 10 až 20 minút. Odstránenie akýchkoľvek bubliniek.
18. Meranie na prístroji Dynatech MR.7000 pre techniku elisa: testovací filter pri 410 nM, referenčný filter pri 630 nM.
EGFR biologické testy
Tento test je používaný na meranie in vitro kinázovej aktivity FGF1-R pri ELISA teste.
Materiály a činidlá:
1. ELISA doštičky Coming s 96 jamkami.
2. SUMO1 monoklonálna protilátka proti-EGFR (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST pufer.
5. Blokujúci pufer: pre 100 ml, zmiešanie 5,0 g Carnation Instant Non-fat Milk® 100 ml PBS.
6. A431 bunkový lyzát (SUGEN, Inc.).
7. TBS pufer:
8. TBS + 10 % DMSO: pre 1 1, zmiešanie 1,514 g TRIS 2,192 g NaCl a 25 ml DMSO; doplnenie na 1 liter celkového objemu pomocou dH2O.
9. ATP (Adenozín-5'-trifosfát, z konského svalu, Sigma Cat. No. A-5394), 1,0 mM roztok v dH2O. Toto činidlo by malo byť pripravené tesne pred použitím a skladované v ľade.
10. LOmMMnCh.
11. ATP/MnCl2 fosforylačná zmes: na vytvorenie 10 ml, zmiešanie 300 μΐ 1 mM ATP, 500 μΐ MnCl2 a 9,2 ml dH2O. Pripravenie tesne pred použitím a skladovanie v ľade.
12. Polypropylénové doštičky NUNC s 96 jamkami s dnom do V.
13. EDTA.
14. Králičie polyklonálne anti-fosfotyrozínové sérum (SUGEN, Inc.).
15. Kozí proti-králiči IgG peroxidázový konjugát (Biosource Cat. No. ALI0404).
16. ABTS.
17.30 % peroxid vodíka.
18,ABTS/H2O2.
19.0,2MHC1.
Postup:
1. ELISA doštičky Coming s 96 jamkami potiahnuté 0,5 pg SUMO1 v 100 pl PBS na jamku. Skladovanie cez noc pri teplote 4 °C.
2. Odstránenie nenaviazanej SUMO1 z jamiek invertujúcou doštičkou kvôli eliminácii tekutiny. Premytie 1 x dH2O. Pretrepanie doštičky na papierovom obrúsku na odstránenie prebytku tekutiny.
3. Pridanie 150 μΐ blokujúceho pufra do každej jamky. Inkubácia za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote.
4. Premytie doštičiek 3 x deionizovanou vodou, potom 1 x TBST. Pretrepanie doštičky na papierovom rúšku na odstránenie prebytku tekutiny a bubliniek.
5. Zriedenie lyzátu v PBS (7 μ g lyzát/100 μΐ PBS).
6. Pridanie 100 μΐ zriedeného lyzátu do každej jamky. Pretrepávanie pri izbovej teplote počas 1 hodiny.
7. Premytie doštičiek podľa bodu 4.
8. Pridanie 120 μΐ TBS do ELISA doštičky obsahujúcej zachytenú EGFR.
9. Zriedenie testovanej zlúčeniny 1 : 10 v TBS, zavedenie do jamiek.
10. Pridanie 13,5 μΐ zriedenej testovanej zlúčeniny do ELISA doštičky. Pridanie 13,5 μΐ TBS v 10 % DMSO do kontrolných jamiek.
11. Inkubácia za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote.
12. Pridanie 15 μΐ fosforylačnej zmesi do všetkých jamiek okrem negatívnych kontrolných jamiek. Konečný objem v jamkách by mal byť približne 150 μΐ s 3 M ATP/5 mM MnCl2 konečnej koncentrácie v každej jamke. Inkubácia za trepania počas 5 minút.
13. Zastavenie reakcie za trepania pridaním 16,5 μΐ EDTA roztoku. Pretrepávanie ďalšiu 1 minútu.
14. Premytie 4x deionizovanou vodou, 2 x s TBST.
15. Pridanie 100 μΐ anti-fosfotyrozínu (1 : 3 000 zriedenie v TBST) na jamku. Inkubácia za trepania počas 30 - 45 minút pri izbovej teplote.
16. Premytie podľa bodu 4.
17. Pridanie 100 μΐ Biosource kozieho proti-králičieho IgG peroxidázového konjugátu (1 : 2 000 zriedenie v TBST) do každej jamky. Inkubácia za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote.
18. Premytie podľa 4.
19. Pridanie 100 μΐ ABTS/H2O2 roztoku do každej jamky.
20. Inkubácia 5 až 10 minút za trepania. Odstránenie akýchkoľvek bubliniek.
21. Pokiaľ je treba, zastavenie reakcie pridaním 100 μΐ 0,2 M HCI na jamku.
22. Meranie na prístroji Dynatech MR7000 ELISA: testovací filter pri 410 nM, referenčný filter pri 630 nM.
PDGFR biologické testy
Tento test sa používa na meranie in vitro kinázovej aktivity FGF1-R pri ELISA teste.
Materiály a činidlá:
1. Elisa doštičky Coming s 96 jamkami.
2. 28D4C10 monoklonálna proti-PDGFR protilátka (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST pufer.
5. Blokujúci pufer (rovnaký ako pre EGFR biologické testy).
6. NIH 3T3 bunkový lyzát exprimujúci PDGFR-P (SUGEN, Inc.).
7. TBS pufer.
8. TBS+10% DMSO.
9. ATP.
10. MnCl2.
l.Kinázová pufrovacia zmes na fosforyláciu: pre 10 ml, zmiešanie 250 μΐ 1 M TRIS, 200 μΐ 5M NaCI, 100 μΐ 1 M MnCl2 a 50 μΐ 100 mM Triton X-100 v dostatočnom množstve dH2O na pripravenie 10 ml.
12. Polypropylénové doštičky NUNC s 96 jamkami s dnom do V.
13. EDTA.
14. Králičie polyklonálne anti-fosfotyrozínové sérum (SUGEN, Inc.).
15. Kozí proti-králičí IgG peroxidázový konjugát (Biosource Cat. No. ALI0404).
16. ABTS.
17.30 % roztok peroxidu vodíka.
18. ABTS/H2O2.
19.0,2MHCl.
Postup:
1. ELISA doštičky Coming s 96 jamkami potiahnuté 0,5 pg 28D4C10 v 100 μΐ PBS na jamku. Skladovanie cez noc pri teplote 4 °C.
2. Odstránenie nenaviazanej 28D4C10 z jamiek invertujúcou doštičkou kvôli sfarbeniu sa tekutiny. Premytie 1 x s dH2O. Pretrepanie doštičky na papierovej páske na odstránenie prebytku tekutiny.
3. Pridanie 150 μΐ blokujúceho pufŕa do každej jamky. Inkubácia počas 30 minút pri izbovej teplote za trepania.
4. Premytie doštičiek 3 x s deionizovanou vodou, potom 1 x TBST. Pretrepanie doštičky na papierovom rúšku na odstránenie prebytku tekutiny a bublinek.
5. Zriedenie lyzátu v HNTG (10 pg lyzát/100 pl HNTG).
6. Pridanie 100 pl zriedeného lyzátu do každej jamky. Pretrepávanie pri izbovej teplote počas 60 minút.
7. Premytie doštičky podľa kroku 4.
8. Pridanie 80 pl pracovnej zmesi kinázového pufra do ELISA doštičiek obsahujúcich zachytený PDGFR.
9. Zriedenie testovanej zlúčeniny 1 : 10 v TBS v polypropylénových doštičkách s 96 jamkami.
10. Pridanie 10 pl zriedenej testovanej zlúčeniny do ELISA doštičky. Pridanie 10 pl TBS + 10 % DMSO do kontrolných jamiek. Inkubácia za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote.
11. Pridanie 10 μΐ ATP priamo do všetkých jamiek okrem negatívnych kontrolných jamiek (konečný objem v jamke by mal byť približne 100 μΐ s 20 μΜ ATP v každej jamke). Inkubácia 30 minút za trepania.
12. Zastavenie reakcie pridaním 10 μΐ EDTA roztoku do každej jamky.
13. Premytie 4x deionizovanou vodou, (2 x) s TBST.
14. Pridanie 100 μΐ anti-fosfotyrozínu (1:3 000 zriedenie v TBST) na jamku. Inkubácia za trepania počas 30 - 45 minút pri izbovej teplote.
15. Premytie podľa kroku 4.
16. Pridanie 100 μΐ Biosource kozieho proti-králičieho IgG peroxidázového konjugátu (1:2 000 zriedenie v TBST) do každej jamky. Inkubácia za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote.
17. Premytie podľa kroku 4.
18. Pridanie 100 μΐ ABTS/H2O7 roztoku do každej jamky.
19. Inkubácia 10 až 30 minút za trepania. Odstránenie akýchkoľvek bubliniek.
20. Pokiaľ je treba, zastavenie reakcie pridaním 100 μΐ 0,2 M HCI na jamku.
21. Meranie na prístroji Dynatech MR7000 ELISA s testovacím filtrom pri 410 nM a referenčným filtrom pri 630 nM.
Testy s bunkovou HER-2 kinázou
Tento test je používaný na meranie aktivity HER-2 kinázy v celých bunkách pri ELISA teste.
Materiály a činidlá:
1. DMEM (GIBCO Catalog #11965-092).
2. Fetálne bovinné sérum (FBS, GIBCO Catalog #16000-044), tepelná inaktivácia vo vodnom kúpeli počas 30 minút pri teplote 56 °C.
3. Trypsin (GIBCO Catalog #25200-056).
4. L-Glutamín (GIBCO Catalog #25030-081).
5. HEPES (GIBCO Catalog #15630-080).
6. Rastové médium
Zmiešanie 500 ml DMEM, 55 ml teplom inaktivovaného FBS, 10 ml HEPES a 5,5 ml L-Glutamínu.
7. „Starve“ médium
Zmiešanie 500 ml DMEM 2,5 ml teplom inaktivovaného FBS, 10 ml HEPES a 5,5 ml L-Glutamínu.
8. PBS.
9. Mikrotitračné doštičky s 96 jamkami s plochým dnom určeným pre tkanivovú kultúru (Coming Catalog # 25860).
10.15 cm misky na tkanivovú kultúru (Coming Catalog #08757148).
11. ELISA doštičky Coming s 96 jamkami.
12. Polypropylénové doštičky NUNC s 96 jamkami s dnom do V.
13. Prenosné catridge Costar pre Transtar 96 (Costar Catalog #7610).
14. SUMO 1: monoklonálna proti-EGFR protilátka (SUGEN, Inc.).
15. TBST pufer.
16. Blokujúci pufer: 5 % Camation Instant Milk® v PBS.
17. EGF ligand: EGF-201, Shinko Američan, Japan. Suspendovaný prášok v 100 pl 10 mM HCI. Pridanie 100 pi 10 mM NaOH. Pridanie 800 pl PBS a prevedenie do Eppendorfovej banky. Skladovanie pri teplote -20 °C do tej doby, dokiaľ sa nepoužije.
18. HNTG Lyzovací pufer. Pre zásobný roztok 5X HNTG, zmiešanie 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 ml glycerolu a 100 ml Triton X-100 a dostatočné množstvo dH2O na vytvorenie 1 1 celkového roztoku.
Pre 1 x HNTG*, mix 2 ml HNTG, 100 μ 1 0,1 M Na3VO4, 250 μΐ 0,2M Na4P2O7 a 100 1 EDTA.
19. EDTA.
20. Na3VO4. Na vytvorenie zásobného roztoku sa zmieša 1,84 g Na3VO4 s 90 ml dH2O. Upravenie pH na 10. Varenie v mikrovlnnej piecke počas jednej minúty (roztok sa vyčerí). Ochladené na izbovú teplotu. Upravenie pH na 10. Opakovanie cyklu zahrievanie/chladenie, dokiaľ pH nezostane na 10.
21.200 mM Na4P2O7.
22. Králičie polyklonálne antisérum špecifické pre fosfotyrozín (proti-Ptyr protilátka, SUGEN, Inc.).
23. Afinitne purifikované antisérum, kozia proti-králičia IgG protilátka, peroxidázový konjugát (Biosource Cat # ALI0404).
24. ABTS roztok.
25.30 % roztok peroxidu vodíka.
26. ABTS/H2O2.
27.0,2 M HCI.
Postup:
1. Coming ELISA doštičky s 96 jamkami potiahnuté SUM01 v koncentrácii 1,0 pg na jamku v PBS, 100 pl finálneho objemu na jamku. Skladovanie cez noc pri teplote 4 °C.
2. V deň použitia sa odstráni poťahovací pufer a doštičky sa premyjú 3 x dH2O a raz TBST pufrom. Pokiaľ nie je stanovené inak, malo by byť premývame vykonané týmto spôsobom.
3. Pridanie 100 pl blokujúceho pufra do každej jamky. Inkubácia doštičiek za trepania počas 30 minút pri izbovej teplote. Tesne pred použitím premytia doštičiek.
4. Použitie EGFr/HER-2 chiméra/3T3-C7 bunkových línií pri tomto teste.
5. Vybrané misky majúce 80 - 90 % konfluenciu. Zbieranie buniek trypsinizáciou a centrifugáciou pri 1 000 rpm za izbovej teploty počas 5 minút.
6. Resuspendovanie buniek v „starve“ médiu a meranie s trypanovou modrou. Je vyžadovaná životnosť vyššia než 90 %. Naočkovanie buniek v smrtiacom médiu pri hustote 2 500 buniek na jamku, 90 pl na jamku, v mikrotitračnej doštičke s 96 jamkami. Inkubácia naočkovaných buniek cez noc pri teplote 37 °C pod 5 % CO2.
7. Štart s testom po dvoch dňoch od naočkovania.
8. Testované zlúčeniny sa rozpustia v 4 % DMSO. Vzorky sú potom ďalej zriedené priamo na doštičkách „starve“ médiom DMEM. Typicky bude toto zriedenie 1:10 alebo väčšie. Všetky jamky sú potom prevedené do bunkových doštičiek v ďalšom zriedení 1 : 10 (10 pl vzorky a média do 90 pl „starve“ média. Finálna koncentrácia DMSO by mala byť 1 % alebo nižšia. Môže byť tiež používané štandardné sériové zriedenie.
9. Inkubácia pod 5 % CO2 pri teplote 37 °C počas 2 hodín.
10. Pripravenie EGF ligandu zriedením zásobného roztoku EGF (16,5 pM) v horúcom DMEM na 150 nM.
11. Pripravenie čerstvého HNTG* v dostatočnom množstve pre 100 pl na jamku; skladovanie na ľade.
12. Po 2 hodinách inkubácie s testovanou zlúčeninou sa pridá pripravený EGF ligand do buniek, 50 pl na jamku, na konečnú koncentráciu 50 nM. Pozitívne kontrolné jamky obdržia rovnaké množstvo EGF. Do negatívnych kontrolných jamiek sa nepridá EGF. Inkubácia pri teplote 37 °C počas 10 minút.
13. Odstránenie testovanej zlúčeniny, EGF a DMEM. Premytie buniek 1 x PBS.
14. Prevedenie HNTG* do buniek, 100 pl na jamku. Umiestnenie do ľadu na 5 minút a medzitým odstránenie blokujúceho pufra z ELISA doštičiek a premytie.
15. Zoškrabanie buniek z doštičky mikropipetou a homogenizácia bunkového materiálu opakovaným nasávaním a dispenzáciou HNTG* lyzovacieho pufra. Prevedenie lyzátu do potiahnutej, blokovanej, premytej ELISA doštičky. Alebo na prevedenie lyzátu do doštičky použitím prevádzacieho cartridge Costar.
16. Inkubácia, za trepania, pri izbovej teplote počas 1 hodiny.
17. Odstránenie lyzátu, premytie, prevedenie čerstvo zriedenej anti-Ptyr protilátky (1:3 000 v TBST) do ELISA doštičiek, 100 pl na jamku.
18. Inkubácia, za trepania, pri izbovej teplote, počas 30 minút.
19. Odstránenie anti-Ptyr protilátky, premytie, prevedenie čerstvo zriedenej BIOSOURCE protilátky do ELISA doštičky (1 : 8 000 v TBST, 100 pl na jamku).
20. Inkubácia, za trepania, pri izbovej teplote počas 30 minút.
21. Odstránenie BIOSOURCE protilátky, premytie, prevedenie čerstvo pripraveného ABTS/H2O2 roztoku do ELISA doštičky, 100 pl na jamku.
22. Inkubácia, za trepania, počas 5-10 minút, odstránenie akýchkoľvek bublinek.
23. Zastavenie reakcie pridaním 100 pl 0,2M HC1 na jamku.
24. Meranie na prístroji Dynatech MR7000 ELISA s testovacím filtrom nastaveným na 410 nM a referenčným filtrom na 630 nM.
Testy cdk2/cyklín A
Tento test je používaný na meranie in vitro aktivity scrín/'treonínkinázy ľudskej cdk2/cyklín A pri „Scintillation Proximity Assay“ (SPA).
Materiály a činidlá:
1. Polyetylénové tereftalátové (flexi) doštičky Wallac s 96 jamkami (Wallac Catalog # 1450 - 401).
2. Amersham Redivue [yy33P] ATP (Amersham catalog #AH 9968).
3. Polyvinyltoluénové SPA guľôčky potiahnuté Amersham streptavidínom (Amersham catalog #RPNQ0007), guľôčky by mali byť reaktivované v PBS bez horčíka alebo vápnika pri 20 mg/ml.
4. Aktivovaný cdk2/cyklín A enzýmový komplex purifikovaný od Sf9 buniek (SUGEN, Inc.).
5. Biotinylovaný peptidový substrát (Debtide). Peptid biotín-X-PKTPKKAKKL sa rozpustí v dH2O pri koncentrácii 5 mg/ml.
6. Peptid/ATP zmes: pre 10 ml, zmiešanie 9,979 ml dH2O, 0,00125 ml „studeného“ ATP, 0,010 ml Debtide a 0,010 ml γ33Ρ ATP. Medzná koncentrácia na jamku bude 0,5 M „studeného“ ATP 0, 1 pg Debtide a 0,2 pCi y33P ATP.
7. Kinázový pufer: pre 10 ml, zmiešanie 8,85 ml dH2O 0,625 ml TRIS (pH 7,4) 0,25 ml 1 M MgCl2 0,25 ml 10 % NP40 a 0,025 ml 1 M DTT. Pridanie čerstvého množstva tesne pred použitím.
8. lOmM ATP vdH2O.
9. 1 M Tris, upravenie pH na 7,4 s HCI.
10.1 MMgCl2.
11.1 M DTT.
12. PBS (Gibko Catalog # 14190-144).
13.0,5 M EDTA.
14.Zastavovací roztok: pre 10 ml, zmiešanie 9,25 ml PBS 0,005 ml 100 mM ATP 0, 1 ml 0,5 M EDTA 0,1 ml 10 % Triton X 100 a 1,25 ml 20 mg/ml SPA guľôčok.
Postup:
1. Pripravenie roztokov testovaných zlúčenín v 5 x požadovaných konečných koncentrácií v 5 % DMSO. Pridanie 10 μΐ do každej jamky. Na negatívnu kontrolu použitie samotného 10 μΐ 5 % DMSO v jamkách.
2. Zriedenie 5 μΐ roztoku cdk2/cyklín A s 2,1 ml 2 x kinázovým pufrom.
3. Pridanie 20 μΐ enzýmu do každej jamky.
4. Pridanie 10 μΐ 0,5 M EDTA do negatívnych kontrolných jamiek.
5. Na naštartovanie kinázovej reakcie sa pridá 20 μΐ zmesi peptid/ATP do každej jamky. Inkubácia počas 1 hodiny bez trepania.
6. Pridanie 200 μΐ zastavovacieho roztoku do každej jamky.
7. Ponechanie v pokoji počas aspoň 10 minút.
8. Centrifugácia doštičiek približne pri 2 300 rpm počas 3-5 minút.
9. Meranie pomocou Triluxu alebo podobného prístroja.
Test transfosforylácie MET
Tento test sa používa na meranie hladín fosfotyrozinu na poly(glutámová kyselina : tyrozín (4:1)) substrátu ako spôsobu identifikácie agonistov/antagonistov met transfosforylácie substrátu.
Materiály a činidlá:
1. Coming Elisa doštičky s 96 jamkami, Coming Catalog # 25805-96.
2. Poly (glu, tyr) 4:1, Sigma, Cat. No.; P 0275.
3. PBS, Gibco Catalog #450-1300EB
4. 50 mM HEPES
5. Blokujúci pufer: rozpustenie 25 g hovädzieho sérumalbumínu, Sigma Cat. No. A-7888, v 500 ml PBS, filtrovanie cez 4 um filter.
6. Purifikovanie GST fuzneho proteínu obsahujúceho Met kinázovú doménu, Sugen, Inc.
7. TBST pufer.
8. 10 % vodný (MilliQue H,O) DMSO.
9. 10 mM vodný (dH2O) adenozín-5'-trifosfát, Sigma Cat. No. A-5394.
10.2 x kinázový riediaci pufer: pre 100 ml, zmiešanie 10 ml 1 M HEPES pri pH 7,5 s 0,4 ml 5 % BSA/PBS 0, 2 ml 0,1 M ortovanadátu sodného a 1 ml 5M chloridu sodného v 88,4 ml dH2O.
11.4 X ATP reakčná zmes: pre 10 ml, zmiešanie 0,4 ml 1 M chloridu manganatého a 0,02 ml 0,1 M ATP v 9,56 ml dH2O.
12.4 X negatívna kontrolná zmes: pre 10 ml, zmiešanie 0,4 ml 1 M chloridu manganatého v 9,6 ml dH2O.
13. Polypropylénové doštičky NUNC s 96 jamkami s dnom do V, Applied Scientific Catalog # S-72092.
14. 500 mM EDTA.
15. Protilátkový riediaci pufer: pre 100 ml, zmiešanie 10 ml 5 % BSA/PBS 0, 5 ml 5 % Camation Instant Milk® v PBS a 0,1 ml 0,1 M ortovanadátu sodného v 88,4 ml TBST.
16. Králičia polyklonálna antofosfotyrozínová protilátka, Sugen, Inc.
17. Kozia proti-králičia protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou, Biosource, Inc.
18. ABTS roztok: pre 1 1, zmiešanie 19,21 g kyseliny citrónovej, 35,49 g Na2HPO4 a 500 mg ABTS s dostatočným množstvom dH2O na vytvorenie 1 1.
19. ABTS/H2O2: zmiešanie 15 ml ABST roztoku s 2 μΐ H2O2 päť minút pred použitím.
20.0,2 M HCI.
Postup:
1. ELISA doštičky potiahnuté 2 pg Poly (Glu-Tyr) v 100 μΐ PBS. Skladovanie cez noc pri teplote 4 °C.
2. Blokovanie doštičiek s 150 μΐ 5 % BSA/PBS počas 60 minút.
3. Premytie doštičiek (2 x) s PBS, 1 x s 50 mM Hepes pufrom pH 7,4.
4. Pridanie 50 μΐ zriedenej kinázy do všetkých jamiek. (Purifikovaná kináza sa zriedi s kinázovým riediacim pufrom. Finálna koncentrácia by mala byť 10 ng/jamku.
5. Pridanie 25 μΐ testovanej zlúčeniny (v 4 % DMSO) alebo samotnom DMSO (4 % v dH2O) na kontrolu doštičiek.
6. Inkubácia kinázy/zlúčeniny zmesi počas 15 minút.
7. Pridanie 25 μΐ 40 mM MnCl2 do negatívnych kontrolných jamiek.
8. Pridanie 25 μΐ ATP/MnCl2 zmesi do všetkých ďalších jamiek (okrem negatívnej kontroly). Inkubácia počas 5 minút.
9. Pridanie 25 μΐ 500 mM EDTA na zastavenie reakcie.
10. Premytie doštičiek 3 x TBST.
11. Pridanie 100 μΐ králičej polyklonálnej anti-Ptyr zriedenej 1:10 000 v protilátkovom riediacom pufŕe do každej jamky. Inkubácia, za trepania, pri izbovej teplote počas jednej hodiny.
12. Premytie doštičiek 3 x TBST.
13. Zriedenie Biosource HRP konjugovanej anti-králičej protilátky 1 : 6 000 v protilátkovom riediacom pufre. Pridanie 100 μΐ na jamku a inkubácia pri izbovej teplote, za trepania, počas jednej hodiny.
14. Premytie doštičiek 1 x s PBS.
15. Pridanie 100 μΐ ABTS/H2O2 roztoku do každej jamky.
16. Pokiaľ je treba, zastavenie reakcie pridaním 100 μΐ 0,2 M HC1 na jamku.
17. Meranie doštičiek na prístroji Dynatech MR7000 s testovacím filtrom pri 410 nM a referenčným filtrom pri 630 nM.
IGF-1 transfoforylačný test
Tento test sa používa na meranie hladiny fosfotyrozínu v poly (glutámovej kyseline : tyrozíne) (4:1) kvôli identifikácii agonistov a/alebo antagonistov gst-IGF-1 transfosforylácie substrátu.
Materiály a činidlá:
1. Coming Elisa doštičky s 96 jamkami.
2. Poly (Glu-ty r) (4 : 1), Sigma Cat. No. P 0275.
3. PBS, Gibko Catalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES
5. TBB blokujúci pufer: pre 1 1, zmiešanie 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g chloridu sodného a 10 ml 1 % TWEEN-20.
6. Purifikovaný GST fuzny proteín obsahujúci IGF-1 kinázovú doménu (Sugen, Inc.)
7. TBST pufer: pre 1 1, zmiešanie 6,057 g Tris 6,766 g chloridu sodného a 0,5 ml TWEEN-20 s dostatočným množstvom dH2O na vytvorenie 1 litra.
8. 4 % DMSO v Milli-Q H2O.
9. 10 mM ATP v dH2O.
10.2 X kinázový riediaci pufer: pre 100 ml, zmiešanie 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5) 0,4 ml 5 % BSA v dH2O 0,2 ml 0,1 M ortovanadátu sodného a 1 ml 5 M chloridu sodného s dostatočným množstvom dH2O na vytvorenie 100 ml.
11.4 X ATP reakčná zmes: pre 10 ml, zmiešanie 0,4 ml 1 M MnCl2 a 0,008 ml 0,01 M ATP a 9,56 ml dH2O.
12.4 X negatívna kontrolná zmes: zmiešanie 0,4 ml 1 M chloridu manganatého v 9,60 ml dH2O.
13. Polypropylénové doštičky NUNC s 96 jamkami s dnom do V.
14.500 mM EDTA v dH2O.
15. Protilátkový riediaci pufer: pre 100 ml, zmiešanie 10 ml 5 % BSA v PBS 0, 5 ml 5 % Camation Instant Non-fat Milk v PBS a 0,1 ml 0,1 M ortovanadátu sodného v 88,4 ml TBST.
16. Králičia polyklonálna antifosfotyrozínová protilátka, Sugen, Inc.
17. Kozia proti-králičia HRP konjugovaná protilátka, Biosource.
18. ABTS roztok.
20. ABTS/H2O2: zmiešanie 15 ml ABTS s 2 μΐ H2O2 5 minút pred použitím.
21.0,2 M HC1 vdH2O.
Postup:
1. ELISA doštičky potiahnuté 2,0 pg/jamku Poly (Glu, Tyr) 4 : 1 (Sigma P0275) v 100 μΐ PBS. Skladovanie doštičky cez noc pri teplote 4 °C.
2. Premytie doštičky 1 x s PBS.
3. Pridanie 100 μΐ TBB blokujúceho pufra do každej jamky. Inkubácia doštičky počas 1 hodiny za trepania pri izbovej teplote.
4. Premytie doštičiek 1 x PBS, potom (2 x) s 50 mM Hepes pufra pH 7,5.
5. Pridanie 25 μΐ testovanej zlúčeniny v 4 % DMSO (pripravenej zriedením zásobného roztoku 10 mM testovanej zlúčeniny v 100 % DMSO s dH2O) do doštičky.
6. Pridanie 10,0 ng gst-IGF-1 kinázy v 50 μΐ kinázovom riediacom pufre) do všetkých jamiek.
7. Naštartovanie kinázovej reakcie pridaním 25 μΐ 4 X ATP reakčnej zmesi do všetkých jamiek na testovanie a na pozitívnu kontrolu. Pridanie 25 μΐ 4 X negatívnej kontrolnej zmesi do všetkých jamiek k negatívnej kontrole. Inkubácia počas 10 minút za trepania pri izbovej teplote.
8. Pridanie 25 μΐ 0,5 M EDTA (pH 8,0) do všetkých jamiek.
9. Premytie doštičiek 4 x s TBST pufrom.
10. Pridanie králičieho polyklonálneho anti-fosfotyrozínového antiséra v zriedení 1 : 10 000 v 100 μΐ protilátkovom riediacom pufre do všetkých jamiek. Inkubácia, za trepania, pri izbovej teplote počas 1 hodiny.
11. Premytie doštičiek podľa kroku 9.
12. Pridanie 100 μΐ Biosource proti-králičej HRP v zriedení 1 : 10 000 v protilátkovom riediacom pufre do všetkých jamiek. Inkubácia, za trepania, pri izbovej teplote počas 1 hodiny.
13. Premytie doštičiek podľa kroku 9, následne jedno premytie s PBS na zníženie bubliniek a prebytku Tween-20.
14. Vyvolanie pridaním 100 μΐ na jamku ABTS/H2O2 do každej jamky.
15. Po asi 5 minútach meranie na prístroji na meranie ELISA doštičiek s testovacím filtrom pri 410 nm a referenčným filtrom pri 630 nm.
Testy inkorporácie BrdU
Pri nasledujúcich testoch sa využíva buniek upravených na expresiu vybraného receptora a následné stanovenie účinku vybranej zlúčeniny na aktivitu DNA syntézy indukovanej ligandom stanovením inkorporácie BrdU do DNA.
Nasledujúce materiály, činidlá a postup sú všeobecným spôsobom pri každom nasledujúcom teste inkorporácie BrdU.
Zmeny v špecifických testoch sú uvedené.
Materiály a činidlá:
1. Príslušný ligand.
2. Príslušné upravené bunky.
3. BrdU značiace činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4) (Boehringer Man-nheim, Germany).
4. FixDenat: fixačný roztok (hotový na použitie) (Boehringer Man-nheim, Germany).
5. Anti-BrdU-POD: myšia monoklonálna protilátka konjugovaná s peroxidázou (Boehringer Mannheim, Germany).
6. TMB substrátový roztok: tetrametylbenzidín (TMB, Boehringer Mannheim, Germany).
7. PBS premývací roztok: 1 x PBS, pH 7,4.
8. Albumín, hovädzí (BSA), frakcia V prášková (Sigma Chemical Co., USA).
Všeobecný postup:
1. Bunky sa naočkujú v množstve 8 000 buniek na jamku v 10 % CS, 2 mM Gin v DMEM na doštičku s 96 jamkami. Bunky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v 5 % CO2.
2. Po 24 hodinách sa bunky premyjú s PBS a potom sú vystavené prostrediu bez séra zavedením do média neobsahujúceho sérum (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) počas 24 hodín.
3. Tretí deň sa príslušný ligand a testovaná zlúčenina naraz pridajú do buniek. Do negatívnych kontrolných jamiek sa pridá DMEM bez séra iba s 0,1 % BSA; k pozitívnym kontrolným bunkám sa pridá ligand bez testovanej zlúčeniny. Testované zlúčeniny sa pripravia v DMEM bez séra s ligandom v doštičke s 96 jamkami a sériovo sa zriedia na 7 testovacích koncentrácií.
4. Po 18 hodinách aktivácie ligandu sa zriedené BrdU značiace činidlo (1 : 100 v DMEM 0, 1 % BSA) a bunky inkubujú s BrdU (finálna koncentrácia =10 pM) počas 1,5-hodiny.
5. Po inkubácii so značiacim činidlom sa médium odstráni dekantáciou a poklepaním prevrátenej doštičky na papierovej utierke. Pridá sa roztok FixDenatu (50 μΐ na jamku) a doštičky sa inkubujú pri izbovej teplote počas 45 minút na doštičkovom trepači.
6. Roztok FixDenatu sa riadne odstráni dekantáciou a poklepaním prevrátenej doštičky na papierovej utierke. Pridá sa mlieko (5 % dehydrované mlieko v PBS, 200 μΐ na jamku) ako blokovací roztok a doštička sa inkubuje počas 30 minút pri izbovej teplote na doštičkovom trepači.
7. Blokovací roztok sa odstráni dekantáciou a jamky sa premyjú 1 x s PBS. Pridá sa anti-BrdU-POD roztok (1 : 200 zriedenie v PBS, 1 % BSA) (50 μΐ na jamku) a doštičky sa inkubujú počas 90 minút pri izbovej teplote na doštičkovom trepači.
8. Protilátkový konjugát sa riadne odstráni dekantáciou a premývaním jamiek 5 x s PBS a doštička sa suší invertovaním a poklepaním na papierovej utierke.
9. Pridá sa TMB substrátový roztok (100 μΐ na jamku) a inkubuje sa počas 20 minút pri izbovej teplote na doštičkovom trepači, dokiaľ sa nevyvinie sfarbenie, ktoré je dostatočné na fotometrickú detekciu.
10. Absorbancia vzoriek sa meria pri 410 nm (v móde „duálne vlnové dĺžky“ s filtrom pri 490 nm ako referenčnou vlnovou dĺžkou) na prístroji Dynatech na meranie ELISA doštičiek.
Testy inkorporácie BrdU indukovanej EGF
Materiály a činidlá:
1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japonsko).
2. 3T3/EGFRc7.
Testy inkorporácie BrdU riadené Her-2 a indukované EGF
Materiály a činidlá:
1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japonsko).
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr s Her-2 kinázovou doménou).
Testy inkorporácie BrdU riadené JIer-4 a indukované EGF
Materiály a činidlá:
1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japonsko).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr s Her-4 kinázovou doménou).
Testy inkorporácie BrdU indukovanej PDGF
Materiály a činidlá:
1. Ľudské PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Nemecko).
2. 3T3/EGFRc7.
Testy inkorporácie BrdU indukovanej FGF
Materiály a činidlá:
1. Ľudská FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).
2. 3T3c7/EGFr
Testy inkorporácie BrdU indukovanej IGF1
Materiály a činidlá:
1. Ľudská rekombinantná (G511, Promega Corp., USA)
2. 3T3/IGFlr.
Testy inkorporácie BrdU indukovanej inzulínom
Materiály a činidlá:
1. Inzulín, kryštalický, hovädzí, zinok (13007, Gibco BRL, USA).
2. 3T3/H25.
Testy inkorporácie BrdU indukovanej HGF
Materiály a činidlá:
1. Rekombinantná ľudská HGF (Cat. No. 249-HG, R & D Systems, Inc. USA).
2. BxPC-3 bunky (ATCC CRL-1687).
Postup:
1. Bunky sa naočkujú v množstve 9 000 buniek na jamku v RPMI 10 % FBS na doštičku s 96 jamkami. Bunky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v 5 % CO2.
2. Po 24 hodinách sa bunky premyjú s PBS a následne sú podrobené bez sérového prostredia v 100 μΐ média bez séra (RPMI s 0,1 % BSA) počas 24 hodín.
3. Tretí deň sa k bunkám pridá 25 μΐ obsahujúcich ligand (pripravený v koncentrácii 1 μ/ml v RPMI s 0,1 % BSA; finálna koncentrácia HGF je 200 ng/ml) a testované zlúčeniny. Do negatívnych kontrolných jamiek sa pridá 25 μΐ RPMI iba s 0,1 % BSA bez séra; k pozitívnym kontrolným bunkám sa pridá ligand (HGF), ale bez testovanej zlúčeniny. Testované zlúčeniny sa pripravia v 5 svojich finálnych koncentráciách v RPMI s ligandom bez séra v doštičke s 96 jamkami a sériovo zriedi na 7 testovacích koncentrácií. Typicky je najvyššia finálna koncentrácia testovanej zlúčeniny 100 μΜ a sú používané 1 : 3 zriedenia (t. j. rozmedzie finálnej koncentrácie testovanej zlúčeniny je 0,137 - 100 μΜ).
4. Po 18 hodinách aktivácie ligandu sa do každej jamky pridá 12,5 μΐ zriedeného BrdU značiaceho činidla (1 : 100 v RPMI, 0,1 % BSA) a bunky sú inkubované s BrdU (finálna koncentrácia je 10 μΜ) počas 1 hodiny.
5. Rovnaké ako vo všeobecnom postupe.
6. Rovnaké ako vo všeobecnom postupe.
7. Blokovací roztok sa odstráni dekantáciou a jamky sa premyjú raz s PBS. Pridá sa anti-BrdU-POD (1 : 100 zriedenie v PBS, 1 % BSA) (100 μΐ na jamku) a doštička sa inkubuje počas 90 minút pri izbovej teplote na doštičkovom trepači.
8. Rovnaké ako vo všeobecnom postupe.
9. Rovnaké ako vo všeobecnom postupe.
10. Rovnaké ako vo všeobecnom postupe.
Testy s HUV-EC-C
Tento test sa používa na meranie aktivity zlúčenín proti PDGF-R, FGF-R, VEGF aFGF alebo Flk-1/KDR, pričom všetky sú prirodzene exprimované bunkami HUV-EC.
Deň 0
1. Premytie a trypsinizácia HUV-EC-C buniek (ľudské endoteliálne bunky pupočníkovej žily (Američan Type Culture Collection catalogue no. 1730 CRL)). Premytie fyziologickým roztokom pufŕovaným fosfátom Dulbecco (D-PBS, zakúpený v Gibco BRL, catalogue no. 14190-029) dvakrát pri asi 1 ml na 10 cm2 banky s tkanivovou kultúrou. Trypsinizácia s 0,05 % trypsín-EDTA v neenzymatickom bunkovom disociačnom roztoku (Sigma Chemical Company, catalogue no. C-1544). 0,05 % trypsin sa pripraví zriedením 0,25 % trypsínu na 1 mM EDTA (Gibco, catalogue no. 25200-049) v bunkovom disociačnom roztoku. Trypsinizácia s asi 1 ml na 25 - 30 cm2 banky s tkanivovou kultúrou počas asi 5 minút pri teplote 37 °C. Po uvoľnení buniek z banky sa pridá ekvivalentný objem testovacieho média a prevedie sa do 50 ml sterilnej centrifugačnej skúmavky (Fisher Scientific, catalogue no. 05-539-6).
2. Premytie buniek s asi 35 ml testovacieho média v 50 ml sterilnej centrifugačnej skúmavky pridaním testovacieho média, centrifúgácia počas 10 minút pri približne 200 x g, ašpirácia supematantu a resuspendácie s 35 ml D-PBS. Opakuje sa premytie (2 x ) s D-PBS, resuspendácia buniek v asi 1 ml testovacieho média na 15 cm2 banky s tkanivovou kultúrou. Testovacie médium pozostáva z F12K média (Gibco BRL, catalogue no. 21127-014) a 0,5 % záhrevom inaktivovaného fetálneho hovädzieho séra. Počítanie buniek pomocou Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) a pridanie testovacieho média do buniek za vzniku koncentrácie 0,8-1,0 x 105 buniek na ml.
3. Pridanie buniek do doštičiek s plochým dnom s 96 jamkami pri koncentrácii 100 pl na jamku alebo 0,8-1,0 x 104 buniek na jamku, inkubácia približne 24 hodín pri teplote 37 °C, 5 % CO2.
Deň 1
1. Pripravenie dvojnásobných titrácií testovanej zlúčeniny v separovaných doštičkách s 96 jamkami, všeobecne 50 μΜ až do 0 μΜ. Použitie rovnakého testovacieho média, ako je uvedené v dni 0, krok 2. Titrácie sa vykonajú pridaním 90 μΐ na jamku testovanej zlúčeniny pri koncentrácii 200 μΜ (4 X finálna koncentrácia v jamke) na vrch jamky príslušného stĺpca doštičky. Keďže zásobná testovacia zlúčenina je obvykle 20 mM v DMSO, obsahuje 200 μΜ koncentrácie liečiva 2 % DMSO.
Ako riediaci roztok pre titrácie testovanej zlúčeniny na účely zriedenia testovanej zlúčeniny, a zároveň udržania konštantnej koncentrácie DMSO, sa používa zriedenie až 2 % DMSO v testovacom médiu (F12K + + 0,5 % fetálneho hovädzieho séra). Pridanie tohto riediaceho roztoku do zvyšných jamiek v stĺpci pri koncentrácii 60 μί na jamku. Odoberanie 60 μί zo 120 μί 200 uM zriedenej testovanej zlúčeniny v najvyššej jamke stĺpca a zmiešanie so 60 μί v druhej jamke stĺpca. Odohranie 60 μί z tejto jamky a zmiešanie so 60 μί v tretej jamke stĺpca a tak ďalej, dokiaľ nie sú kompletné dvojnásobné titrácie. Keď je predposledná jamka zmiešaná, odoberie sa 60 μί zo 120 μί v tejto jamke a odstráni sa. V poslednej jamke sa nechá 60 μΐ riediaceho roztoku DMSO a média ako kontrola obsahujúca netestovanú zlúčeninu. Pripravenie 9 stĺpcov titrovanej testovanej zlúčeniny v dostatočnom množstve pre strojnásobenie jamiek, kde každá obsahuje: (1) VEGF (zakúpené v Pero Tech Inc., catalogue no- 100-200, (2) rastový faktor endoteliálnych buniek (ECGF) (tiež známy ako kyslý fibroblastový rastový faktor alebo aFGF) (zakúpený u Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600) alebo (3) ľudská PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Germany) a kontrolu testovacieho média. ECGF sa pripraví so sodnou soľou heparínu.
2. Prevedenie 50 μί na jamku zriedenej testovanej zlúčeniny do testovacích doštičiek s 96 jamkami obsahujúcimi 0,8 - 1,0 x 104 buniek v 100 μί na jamku HUV-EC-C buniek zo dňa 0 a inkubácia približne 2 hodiny pri teplote 37 °C, 5 % CO2.
3. Vykonané trikrát, pridanie 50 μί na jamku 80 μί na ml VEGF, 20 ng na ml ECGF alebo kontrolného média ku každej testovanej zlúčenine, ako pri testovaných zlúčeninách sú koncentrácia rastového faktora 4 X požadovanej finálnej koncentrácie. Použitie testovacieho média zo dňa 0, kroku 2, na pripravenie koncentrácii rastových faktorov. Inkubácia približne 24 hodín pri teplote 37 °C, 5 % CO2. Každá jamka bude obsahovať 50 μί zriedenej testovanej zlúčeniny, 50 μί rastového faktora alebo média a 100 μί buniek, ktoré sú v celko vom množstve 200 μΐ na jamku. Teda 4X koncentrácia testovanej zlúčeniny a rastových faktorov sa zriedi na 1 X a pridajú sa do jamiek.
Deň 2
1. Pridá sa 3H-tymidín (Amersham, catalogue no. TRK-686) pri 1 uCi na jamku (10 μΐ na jamku 100 pCi na ml roztoku pripraveného v RPMI médiu +10% záhrevom inaktivovanc fetálne hovädzie sérum) a inkubácia približne 24 hodín pri teplote 37 °C, 5 % CO2. RPMI sa zakúpi u Gibco BRL, catalogue no. 11875-051.
Deň 3
1. Vymrazenie doštičiek cez noc pri teplote -20 °C.
Deň 4
Rozmrazenie doštičiek a ich odber pomocou harvesteru na 96 jamkové doštičky (Tomtec Harvester ®) na filtračné plachetky (Wallac, catalogue no. 1205-401), meranie na tekutom scintilačnom počítači Wallas Βει 5 taplate™.
V tabuľke 3 sú uvedené výsledky biologického testovania niektorých exemplárnych zlúčenín podľa predloženého vynálezu. Výsledky sú vyjadrené v hodnotách IC50, mikromoláma (μΜ) koncentrácia testovanej zlúčeniny, ktorá spôsobuje 50 % zmenu aktivity cieľových PKT v porovnaní s aktivitou PTK kontrolnej skupiny, ktorej nebola podávaná testovaná zlúčenina. Presnejšie uvedené výsledky indikujú koncentráciu testo20 vanej zlúčeniny potrebnej na 50 % redukciu aktivity cieľovej PTK. Biologické testy, ktoré boli alebo môžu byť používané na stanovenie zlúčenín, sú opísané detailnejšie neskôr.
Tabuľka 3
Príklad |
bio flkGST IC50 (μΜ) |
bio FGFR1 XC50 (μΜ) |
bio PDGF IC50 (MM) |
bio EGF IC50 (M«) |
bunky E GF IC50 (MM) |
Her2 kináza
IC50
(MM) |
cdk2spa C5O (μΜ) |
bio pyk2 IC50 (μΜ) |
37 |
0,22 |
|
3,06 |
10,78 |
9,04 |
i, 4 |
|
|
3a |
4.17 |
|
3,06 |
6,04 |
8,97 |
2,16 |
|
|
39 |
3,38 |
|
4,69 |
3,67 |
14, 54 |
3,53 |
|
|
40 |
4,5 |
|
7,9 |
6,52 |
|
6,27 |
|
|
42 |
0,1 |
|
0,12 |
11,95 |
74,55 |
20,43 |
|
|
44 |
<0,05 |
|
0,02 |
20,73 |
67,4 6 |
6,99 |
|
|
47 |
0,08 |
1,56 |
0,06 |
11,42 |
41,54 |
8,4 |
>20 |
1,05 |
48 |
0.006 |
0,3 |
<0,78 |
17,68 |
21,58 |
7,93 |
|
0,09 |
49 |
|
|
<0,78 |
>100 |
43,86 |
>100 |
|
|
50 |
|
|
<0,78 |
>100 |
20.34 |
>100 |
|
|
ol |
0,006 |
1,66 |
0.01 |
i?,: |
21, 61 |
23,24 |
16,69 |
0,35 |
52 |
0,08 |
1,26 |
<0,78 |
12,53 |
>100 |
>100 |
10,66 |
0,45 |
53 |
|
|
<0,78 |
>100 |
>100 |
>100 |
|
|
se |
2,32 . |
|
3,19 |
>100 |
10,03 |
7,11 |
|
|
57 |
0,06 i |
|
7,90 |
>100 |
9,97 |
6, 94 |
|
|
58 |
|
|
21,14 |
>1.00 |
>100 |
>100 |
|
|
59 |
|
|
<0.78 |
>100 |
>100 |
>100 |
|
|
50 |
|
|
<0,78 |
>100 |
>100 |
>100 |
|
|
SI |
|
|
<0,70 |
>100 |
>100 |
>100 ! |
|
|
62 |
8,00 |
|
3.32 |
>100 |
>100 i |
>100 |
|
|
63 |
0,21 |
t
1
1 |
<0,70 |
8,59 |
>100 i |
>100 |
|
|
64 ( |
C. 55 |
|
<C. 78 j |
|
>103 |
>1.70 |
|
|
65 i |
0,37 |
|
<0,05 |
>100 |
74 ,36 |
15,97 |
|
|
66 j |
<0.05 |
|
|
>100 |
11,84 |
2,76 |
|
|
67 1 |
C, 39 j |
|
24, 77 |
31,33 ' |
19,79 |
2, 56 |
i |
|
69 |
1.18 j |
0 ,03 |
>100 |
23,52 |
34.13 |
|
|
70 |
0,09 |
1,50 |
0.0030 |
10,57 |
6, ‘12 |
7,99 |
12,62 |
a, 63 |
71 |
1S. 21 |
|
22,5 |
>100 |
|
9,91 |
|
|
72 |
6,06 |
|
i 10,54 |
>100 |
39,94 |
9.65 |
|
|
73 |
5,95 |
|
14,12 |
>100- |
39,5 |
8,59 |
|
|
74 |
1,2 |
|
0,09 |
46,75 |
|
>100 |
|
|
75 |
2,7 |
|
61,55 |
>100 |
>10<] i |
|
? ? |
0,49 |
|
25,01 |
>100 |
|
>100 |
|
|
?í) |
1,49 |
|
>100 |
27,39 |
|
>100 |
|
|
80 |
0,13 |
4,29 |
0,001 |
>100 |
|
50,19 |
17,19 |
C· ,28 |
81. |
C, 21 |
|
0,lfl |
>100 |
|
>100 |
|
|
82 |
2.03 |
7.69 |
6,SS |
>100 |
|
>100 |
|
0.31 |
33 |
0,34 |
0,41 |
9,46 |
2.18 |
|
86,9 |
|
0 ,003 |
84 |
1,38 |
|
12.51 |
67.2 |
|
5,86 |
|
0,006 |
85 |
0,2 |
0,8 |
2,59 |
>100 |
|
3,76 |
|
|
86 |
1,45 |
1,3 |
19, 6 |
41,8 |
|
>100 |
|
3,58 |
87 |
3,27 |
7.56 j |
6.46 |
>100 |
|
9,1 |
|
0.17 |
se |
0,35 |
1,13 | |
8,06 |
2 ,36 |
|
>100 |
|
0,09 |
116. |
>20 |
|
>100 |
>100 |
|
>100 |
<0,0005 |
|
117 |
0,91 |
|
12,9 |
>100 |
|
>100 |
0,006 |
|
L18 |
1,93 |
|
1,2 |
>100 |
|
>100 |
0,002 |
|
119 |
1,3B |
|
61,63 |
>100 |
|
>100 |
<0,0005 |
|
In vivo zvieracie modely
Zvieracie modely xenoimplantátu
Schopnosť ľudských nádorov rásť ako xenoimplantáty v atymickej myši (napr. Balb/c, nu/nu) poskytuje užitočný in vivo model na štúdium biologických odpovedi na terapie ľudských nádorov. Od prvej úspešnej xenotransplantácie ľudských nádorov do atymickej myši, (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Patol. Microbial. Scand. 77: 758 - 760), bolo transplantovaných mnoho rôznych bunkových línií ľudského nádoru (napr. mamáme, pľúcne, genitourináme, gastrointestinálne, hlavy a krku, glioblastóm, kostné a malígne melanómy) a úspešne rástli pri nahých myšiach. Nasledujúce testy môžu byť používané na stanovenie hladiny aktivity, špecifícity a účinku rôznych zlúčenín podľa predloženého vynálezu. Na stanovenie zlúčenín sú použiteľné tri všeobecné typy testov: bunkové/katalytické, bunkové/biologické a in vivo. Zmyslom bunkových/katalytický testov je stanoviť vplyv zlúčeniny na schopnosť TK k fosforylácii tyrozínových zvyškov na známom substráte v bunke. Zmyslom bunkových/biologických testov je stanoviť vplyv zlúčeniny na biologickú odpoveď stimulovanú TK v bunke. Zmyslom in vivo testov je stanoviť účinok zlúčeniny vo zvieracom modeli na príslušnú poruchu, napr. rakoviny.
Vhodné bunkové línie pre subkutánne xenoimplantátové experimenty zahrnujú C6 bunky (glióm, ATCC # CCL 107), A375 bunky (melanóm, ATCC # CRL 1619), A431 bunky (epidermoidný karcinóm, ATCC # CRL 1555), Calu 6 bunky (pľúcne, ATCC # HTB 56), PC3 bunky (prostaty, ATCC # CRL 1435), SCOV3TP5 bunky a NIH 3T3 fibroblasty geneticky upravené k nadmernej expresii EGFR, PDGFR, IGF-IR alebo ktorejkoľvek inej testovanej kinázy. Nasledujúci postup môže byť používaný na vykonanie xenoimplantátových experimentov:
Samičie atymické myši (BALB/c, nu/nu) sa zakúpia v Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Všetky zvieratá boli chované v čistote v mikroizolačných klietkach s Alpha-dri podostieľkou. Bolo im poskytnuté sterilné žrádlo pre hlodavce a voda podľa potreby.
Bunkové línie boli pestované v príslušnom médiu (napr. MEM, DMEM, Ham's F10 alebo Ham's F12 plus 5 % - 10 % fetálne hovädzie sérum (FBS) a 2 mM glutamin (GLN)). Všetky bunkové kultivačné médiá, glutamín a fetálne hovädzie sérum boli zakúpené vo firme Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), pokiaľ nie je uvedené inak. Všetky bunky boli kultivované v prostredí s vlhkosťou 90 - 95 % a 5 - 10 % CO2 pri tep lote 37 °C. Všetky bunkové línie boli rutinne subkultivované dvakrát týždne a boli negatívne na mykoplazmu, čo bolo stanovené metódou Mycotect (Gibco).
Bunky boli zbierané pri alebo takmer pri konfluency s 0,05 % Trypsín-EDTA a peletované pri 450 x g počas 10 minút. Pelety boli resuspendované v sterilnom PBS alebo médiu (bez FBS) na príslušnú koncentráciu a bunky boli implantované do zadného boku myši (8 - 10 myši na skupinu, 2 - 10 x 106 buniek na zviera). Rast nádoru bol meraný počas 3 až 6 týždňov pomocou venierových kaliperov. Objemy nádorov boli vypočítané ako dĺžka x šírka x výška, pokiaľ nie je uvedené inak. Hodnoty P boli vypočítané pomocou Študentovho t-testu. Testované zlúčeniny v 50 - 100 pl excipientu (DMSO alebo VPD:D5W) môžu byť podané IP injekciou v rôznych koncentráciách všeobecne počínajúc dňom jeden po implantácii.
Model invázie nádoru
Bol vyvinutý nasledujúci model invázie nádoru a môže byť používaný na stanovenie terapeutickej hodnoty a účinnosti zlúčenín majúcich selektívnu inhibíciu receptora KDR/FLK-1.
Postup
Ako experimentálne zvieratá boli používané osem týždňov staré nahé myši (samice) (Simonsen Inc.). Implantácia nádorových buniek môže byť vykonaná pri odťahu s laminámym prúdom. Pri anestézii bol koktail z látky Xylazín/Ketamín (100 mg na kg ketamínu a 5 mg na kg Xylazínu) podávaný intraperitoneálne. Bola vykonaná incízia vedená stredom k odhaleniu dutiny brušnej (približne 1,5 cm dĺžky) na injektovanie 107 nádorových buniek v objeme 100 μΐ média. Bunky boli mjektované buď do duodenálneho laloku pankreasu alebo pod serózu hrubého čreva. Peritoneum a svaly boli zašité 6-0 hodvábnym kontinuálnym stehom a koža bola stiahnutá pomocou svoriek. Zvieratá boli denne sledované.
Analýza
Po 2 - 6 týždňoch v závislosti od makroskopických pozorovaní zvierat boli myši usmrtené a lokálne metastázy nádoru do rôznych orgánov (pľúca, pečeň, mozog, žalúdok, slezina, srdce, svaly) boli excidované a analyzované (meranie veľkosti nádoru, stupne invázie, imunochémie, stanovenie hybridizácie in situ atď.)
C-kit test
Tento test sa používa na detekciu miery fosforylácie c-kit tyrozínu
M07E (ľudská akútna myeloidná leukémia) bunky boli sérom starované („starved“) cez noc v 0,1 % séru. Bunky boli ďalej pred stimuláciou ligandom vopred ošetrené zlúčeninou (súbežne so sérovou starváciou), stimulované 250 ng na ml rh-SCF počas 15 minút. Po stimulácii boli bunky lyzované a imunoprecipitované protilátkou anti-c-kit. Hladiny fosfotyrozínu a proteínu boli stanovené technikou Westem blotting.
Test MTT proliferácie
Bunky M07E boli starvované sérom a vopred ošetrené zlúčeninou podľa spôsobu uvedeného pre fosforylačné experimenty. Bunky boli nanášané v množstve 4 X 105 buniek na jamku do misky s 96 jamkami v 100 μΐ RPMI + 10 % séru. Bol pridaný rh-SCF (100 ng na ml) a doštička bola inkubovaná počas 48 hodín. Po 48 hodinách sa pridalo 10 μΐ 5 mg na ml MTT [3-(4,5-dimetytiazol-2-yl)-2,5-difenyltetTazolium-bromid) a počas 4 hodín sa nechala prebiehať inkubácia. Pridal sa kyslý izopropanol (100 μΐ z 0,04N HCI v izopropanole) a bola meraná optická hustota pri vlnovej dĺžke 550 nm.
Apoptózový test
Bunky M07E sa inkubovali +/- SCF a +/- zlúčenina v 10 % FBS s rh-GM-CSF (10 ng na ml) a rh-IL-3 (10 ng na ml). Vzorky sa testovali v 24 a 48 hodinách. Na meranie aktivovanej kaspázy-3 sa vzorky premývali s PBS a permeabilizovali s ľadovo studeným 70 % etanolom. Bunky sa potom zafarbili s Pekonjugovanou polyklonálnou králičou anti-aktívnou kaspázou-3 a analyzovali FACS. Na meranie štiepanej PARP sa vzorky lyžovali a analyzovali technikou western blotting s protilátkou anti-PARP.
Dodatočné testy
Dodatočné testy, ktorc môžu byť používané na stanovenie zlúčenín podľa predloženého vynálezu zahrnujú, ale nie je to nijako limitované, bio-flk-1 test, EGF receptor-HER2 chiméricky receptorový test na celých bunkách, bio-src test, bio-lck test a test merajúci funkciu fosforylácie raf. Postupy vykonávania jednotlivých testov môžu byť nájdené v U. S. Application Ser. No. 09/099,842, tuje uvedené ako odkaz, vrátane ktorýchkoľvek obrázkov.
Meranie bunkovej toxicity
Terapeutické zlúčeniny by mali byť účinnejšie pri inhibícii aktivity receptorovej tyrozínkinázy než pri prejavoch cytotoxického účinku. Meranie účinnosti a bunkovej toxicity zlúčeniny môže byť vykonávané sta novením terapeutického indexu, t. j. IC5o/LD5o. Hodnota IC50, dávka, ktorou sa dosiahne 50 % inhibícia, môže byť meraná štandardnými technikami, napr. opísanými v predloženom vynáleze. Hodnota LD50, t. j. dávka, ktorá vedie k 50 % toxicite, môže byť tiež meraná štandardnými technikami (Mossman, 1983, J. Immunol. Metoch, 65: 55-63), meranie množstva uvoľneného LDH (Korzeniewski a Callwaert, 1983, J. Immunol. Metods, 64: 313, Decker a Lohmann-Mattes, 1988, J. Immunol. Metods, 115: 61) alebo meranie letálnej dávky na zvieracích modeloch. Zlúčeniny s veľkým terapeutickým indexom sú výhodné. Terapeutický index by mal byť väčší než 2, výhodne aspoň 10, výhodnejšie aspoň 50.
B. Príklad výsledkov z bunkových testov s použitím (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l ,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny.
Na potvrdenie účinnosti (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) detekovaného pri biochemických testoch (vide infra) bola vyhodnocovaná jeho schopnosť inhibovať ligand-dependentnej fosforylácie RTK pri testoch na bunkách pomocou NIH-3T3 myších buniek upravených na nadmernú expresiu Flk-1 alebo ľudských PDGFRp. (2-Dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l/7-pyro 1-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhiboval VEGF-dependentnú fosforyláciu Flk-1 tyrozínu s hodnotou IC50 približne 0,03 μΜ. Táto hodnota je podobná 0,009 μΜ Ki hodnote stanovenej pre inhibiciu Flk-1 (2-dietylamino-etyl)-amidom 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl -l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) determinovanej pri biochemických testoch, čo indikuje, že (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l Z/-pyro 1-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) sa ľahko penetruje do buniek. V súlade s biochemickými údajmi (vide infra) indikujúcimi, že (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-LH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) mal porovnateľnú aktivitu proti Flk-1 a PDGFR, bolo tiež zistené, že inhibuje PDGF-dependentnú fosforyláciu receptora v bunkách s hodnotou IC50 približne 0,03 μΜ. Schopnosť (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimety 1 -l/ŕ-pyro 1 -3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhibovať c-kit, úzko príbuznej s RTK, ktorá viaže faktor kmeňových buniek (SDF), bola stanovená použitím MO7E buniek, ktoré exprimujú tento receptor. V týchto bunkách (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmctyl)-2,4-dimctyl-l/7-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhiboval SCF-dependentný c-kit fosforyláciou s hodnotou 1C5O 0,01 - 0,1 μΜ. Táto zlúčenina tiež inhibovala SCF-stimulovanú c-kit fosforyláciu pri akútnej myeloidnej leukémii (AML) blastov izolovaných z periférnej krvi pacientov.
Okrem testovania schopnosti (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) na inhibiciu ligand-dependentnej fosforylácie receptora v bunkách bol tiež pozorovaný vplyv na ligand-dependentnú proliferatívnu odpoveď buniek in vitro (pozri tabuľka 4). Pri týchto štúdiách boli bunky cez noc uvedené do stavu pokoja sérom a indukované k DNA syntéze po pridaní príslušného mitogénneho ligandu. Ako je uvedené v tabuľke 4, (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-17f-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhiboval PDGF-indukovanú proliferáciu NIH-3T3 buniek exprimujúcich nadmerné množstvo PDGFRbb alebo PDGFRaa s hodnotou IC50 0,031 a 0,069 μΜ a SCF-indukovanú proliferáciu MO7E buniek s hodnotou IC50 0,007 μΜ.
Tabuľka 4
|
biochemické |
bunkovéIC50 |
receptor |
Kí’ (μΜ) |
fosforylácia receptora (μΜ) |
ligand-dependentná proliferácia (μΜ) |
Flk-1/KDR |
0,009 |
0,032 |
0,0043 |
PDGFRa |
0,008 |
OJ) 34 |
0,03i4 |
PDGFRP |
ND |
ND |
ÔJ695 |
FGFR |
0,83 |
ND |
0,7J |
c-kit |
ND |
0,01 - 0,1 |
0,0076 |
ND = nebolo stanovené 1 stanovené pomocou rekombinantného enzýmu 2 stanovené pomocou NIH-3T3 buniek exprimujúcich Flk-1 bez prísunu séra 3 stanovené pomocou HUVEC bez prísunu séra 4 stanovené pomocou NIH-3T3 buniek exprimujúcich PDGFRD bez prísunu séra 3 stanovené pomocou NIH-3T3 buniek exprimujúcich PDGFR: I bez prísunu séra 6 stanovené pomocou MO7E buniek bez prísunu séra
Ako vyplýva z tabuľky 4, existuje všeobecná zhoda medzi biochemickou a bunkovou aktivitou (2-dietylamino-etylj-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80), čo podporuje záver, že táto zlúčenina prekračuje bunkové membrány. Ďalej je možné vyvodiť, že bunkové odpovede sú výsledkom aktivity zlúčeniny 80 proti naznačenému cieľu. Naproti tomu, pri testovaní v prítomnosti kompletného rastového média in vitro, boli treba podstatne vyššie koncentrácie (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) (> 10 μΜ) na inhibíciu rastu rôznych ľudských nádorových buniek (pozri tabuľka 5). To ukazuje, že zlúčenina priamo neinhibovala rast týchto buniek v koncentráciách nutných na inhibíciu fosforylácie receptora závislej od ligandu a proliferácie buniek.
Tabuľka 5
bunková línia |
pôvod |
IC50 (μΜ) |
LD50 (μΜ) |
HT29 |
karcinóm hrubého čreva |
10 |
22 |
A549 |
pľúcny karcinóm |
9,5 |
22 |
NCI-H460 |
NSC pľúcny karcinóm |
8,9 |
20 |
SF767T |
glióm |
7,9 |
14 |
A431 |
epidermoidný karcinóm |
6,0 |
18 |
Výsledky uvedené v tabuľke 5 boli získané inkubáciou buniek počas 48 hodín v kompletnom rastovom médiu v prítomnosti sériových zriedení (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny. Na konci rastovej periódy bolo stanovené relatívne množstvo buniek. Hodnoty IC50 boli vypočítané ako koncentrácia zlúčeniny, ktorá inhibovala rast buniek z 50 % vzhľadom na neošetrované bunky. Hodnoty LD50 boli vypočítané ako koncentrácie na zlúčeninu, ktorá spôsobí 50 % zníženie počtu buniek vzhľadom na východiskový stav experimentu.
Relevantnej ši test na báze buniek, v ktorom sa vyhodnocuje antiangiogénna schopnosť (2-dietylaminoetyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80), zahrnuje in vitro test mitogenézy použitím ľudských endoteliálnych buniek pupočníkovej žily (HUVEC) ako modelového systému pre proliferáciu endoteliálnych buniek rozhodujúcu pre angiogénny proces. Pri tomto teste je mitogénna odpoveď, meraná ako prírastok DNA syntézy, indukovaná v HUVEC bez prísunu séra po pridaní VEGF alebo FGF. V týchto bunkách (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhiboval VEGF- a FGF-indukovanú mitogénnu odpoveď od dávky závislým spôsobom s hodnotami IC50 0,004 μΜ, resp. 0,7 μΜ, za predpokladu, že zlúčenina bola prítomná v priebehu 48 hodinového testu.
Uvedené výsledky boli získané s použitím HUVEC bez prísunu séra, ktoré boli inkubované s mitogénnymi koncentráciami VEGF (100 ng/ml) alebo FGF (30 ng/ml) v prítomnosti sériových zriedení (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-mdol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l/Tpy-rol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) počas 24 hodín. Mitogénna odpoveď počas nasledujúcich 24 hodín v prítomnosti ligandu a inhibítora bola kvantifikovaná meraním DNA syntézy na báze inkorporácie brómdeoxyuridínu do bunkovej DNA.
V oddelených experimentoch inhibovala zlúčenina 80 VEGF-dependentnú fosforyláciu ERK 1/2 (p42/44MAP kinázy), prvotný downstreamový cieľ Flk-1/KDR, od dávky závislým spôsobom. Tiež sa zistilo, že v tomto systéme je inhibičná aktivita zlúčeniny 80 dlhodobá; inhibuje VEGF-dependentnú fosforyláciu ERK 1/2 aj 48 hodín po odstránení (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) z média a po krátkej expozícii (2 hodiny) proti mikromolárnym koncentráciám zlúčeniny.
Zistilo sa, že VEGF je dôležitý faktor prežitia pre endoteliálne bunky. Keďže (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidén-metyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhibuje VEGF-dependentnú mitogénnu odpoveď HUVEC, bol skúmaný účinok zlúčeniny na prežitie
HUVEC. V týchto experimentoch bolo používané štiepenie substrátu kaspázy 3 poly-ADP-ribozyl polymerázy (PARP) ako indikácia apoptózy. HUVEC kultivované za bez sérových podmienok počas 24 hodín mali výraznú mieru štiepenia PARP, čo bolo detekované akumuláciou štiepenia 23 kDa PARP fragementu. Tomu bolo do veľkej miery zabránené pridaním VEGF do bunkového média, a tým sa v tomto teste ukázalo, žc VEGF pôsobí ako faktor prežitia. Zistilo sa, že (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimctyl-l//-pyrol-3-karboxylovcj kyseliny (zlúčenina 80) inhibuje KDR signalizáciu. Teda (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl- 1H-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhibuje VEGF-sprostredkované prežitie HUVEC od dávky závislým spôsobom. Tieto údaje teda indikujú, že zlúčenina 80 indukuje apoptózu v endoteliálnych bunkách v kultúre v prítomnosti VEGF.
C. In vivo štúdie účinnosti
i. Účinnosť proti stabilizovaným nádorovým xenoimplantátom ln vivo účinnosť (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) bola študovaná na subkutánnych (SC) modeloch xenoimplantátu použitím ľudských nádorových buniek implantovaných do oblasti zadnej časti boku atymickej myši. Po implantácii sa pred započatím perorálneho ošetrovania zlúčeninou nádory nechali stabilizovať na veľkosť 100 - 550 cm3.
Denné perorálne podanie zlúčeniny 80 spôsobovalo od dávky závislú inhibíciu rastu A431 nádoru, za predpokladu, že ošetrenie sa začalo po náraste nádorov do veľkosti 400 mm. Bola pozorovaná štatisticky významná (P < 0,05) inhibícia rastu nádoru pri dávkach 40 mg na kg denne (74 % inhibícia) a 80 mg na kg denne (84 % inhibícia) (pozri tabuľka 6). V predchádzajúcich experimentoch nebola vyššia (160 mg na kg denne) dávka zlúčeniny účinnejšia proti stabilizovaným nádorom A431 než dávka 80 mg na kg denne. Navyše myši ošetrované dávkou 160 mg zlúčeniny na kg denne strácali telesnú váhu, čo indikuje, že vyššia dávka nebola tiež tolerovaná. Podobné výsledky boli získané pri experimente, v ktorom boli nádory A431 ponechané narásť iba do veľkosti 100 mm3 (pozri tabuľka 5). Pri tomto druhom experimente bola pozorovaná kompletná regresia nádorov pri šiestich z ôsmich zvierat ošetrovaných dávkou 80 mg na kg denne počas 21 dní. Pri týchto šiestich zvieratách nebol pozorovaný nový nárast nádorov počas 110 dni pozorovania po skončení ošetrenia. Pri dvoch zvieratách, v ktorých nádory znovu narástli do veľkej veľkosti (2 000 - 3 000 mm3), nádory ustúpili ako reakcia na druhé kolo ošetrenia zlúčeninou 80. Dôležité je, že vo všetkých experimentoch, pri ktorých sa testovala účinnosť zlúčenín, bola dávka (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyiOl-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) v množstve 80 mg na kg denne dobre znášaná, aj keď bola podávaná kontinuálne počas viac než 100 dní.
Tabuľka 6
počiatočný objem nádoru |
zlúčenina1 (mg/kg denne) |
% inhibícia (denná) |
Hodnota P |
400 |
80 |
84 (36) |
0,00) |
40 |
74 (36) |
0,003 |
20 |
51 (36) |
0,130 |
100 |
80 |
93 (40) |
0,002 |
40 |
75 (40) |
0,015 |
10 |
61 (40) |
0,059 |
zlúčenina 80
Výsledky v tabuľke 6 boli získané s bunkami A43 1 (0,5 x 106 buniek na myš), ktoré boli implantované SC do oblasti zadného boku atymickej myši. Denné perorálne podanie (2-dietylamino-etyl)-amidu 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) v nosiči na báze Cremophore alebo kontrolného nosiča sa začalo v čase, kedy nádory dosiahli indikovaného priemerného objemu. Nádory boli merané vemierovými kaliperami a objem nádoru bol spočítaný ako dĺžka x šírka x výška. Hodnoty P boli vypočítané porovnaním veľkosti nádorov pri zvieratách, ktoré boli ošetrované zlúčeninou 80 (n = 8), s tými zvieratami, ktoré boli ošetrované nosičom (n = 16), v posledný deň experimentu pomocou dvojstranného Študentovho t-testu.
Účinnosť zlúčeniny 80 proti etablovaným ľudským nádorom rôzneho pôvodu bola stanovená pomocou Colo205 (karcinóm hrubého čreva), SF763T (glióm) a NCI-H460 (nemalobunkový pľúcny karcinóm) xenoimplantátov (pozri tabuľka 7). Tieto experimenty boli vykonávané s (2-dietylamino-etyl)-amidom 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-17/-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) po5 dávaným peorálne v množstve 80 mg na kg denne; dávka, ktorá bola účinná a dobre tolerovaná.
Tabuľka 7
|
typ nádoru |
Počiatočný objem nádoru |
% inhibície (denne) |
Hodnota P |
A4311 |
epidertnoidný |
100 |
93 (40) |
0,002 |
A4311 |
epidermoidný |
400 |
84 (36) |
0,001 |
Colo205 |
hrubého čreva |
370 |
77 (54) |
0,028 |
NCI-H460 |
pľúcny |
300 |
61 (54) |
0,003 |
SF763T |
glióm |
550 |
53 (30) |
0,001 |
1 údaje získané z experimentu uvedeného v tabuľke 5 |
V spomínaných experimentoch, len čo nádory dosiahli indikovanej veľkosti, bola zlúčenina 80 podávaná raz denne v množstve 80 mg na kg v nosiči na báze Cremophoru. Percentuálna inhibícia v porovnaní s kontrolnou skupinou ošetrovanou nosičom bola vypočítaná na konci experimentov. Hodnoty P boli vypočítané porovnaním veľkosti nádorov pri zvieratách, ktoré boli ošetrované zlúčeninou, s tými zvieratami, ktoré boli 15 ošetrované nosičom, pomocou dvojstranného Študentovho t-testu.
Aj keď (2-dietylamino-etyl)-amid 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (zlúčenina 80) inhiboval rast všetkých typov nádoru uvedených v tabuľke 7, bol pozorovaný rozdiel v odpovediach rôznych modelov xenoimplantátu. Konkrétne rast NC1H460 a SF763T nádorov bol zastavený alebo vo veľkej miere spomalený, keďže nádory Colo205, ako napríklad nádory 20 A431, ustúpili po ošetrení (2-dietyl-amino-etyl)-amidom 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-l//-pyrol-3-karboxylovej kyseliny.
Kvôli stanoveniu molekulárnej bázy rozdielov v odpovedi pri modeloch xenoimplantátu boli študované nádory. Boli vyhodnocované nádory SF763T, ktoré boli pri molekulárnej hladine menej responzívne na ošetrenie (2-dietylamino-etyl)-amidom 5-(5-fluór-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol25 -3-karboxylovej kyseliny, pomocou imunohistologických techník na stanovenie účinku ošetrenia zlúčeninou.
Tieto štúdie boli pôvodne vykonávané na tomto type nádoru, pretože nádory SF763T sú vysoko vaskularizované mikrocievami, ktoré silne exprimujú endoteliálny bunkový marker CD31, a sú teda veľmi vhodné pre štúdie hustoty nádorových mikrociev (MVD). Imunohistologické stanovenie nádorov SF763T ukazuje, že nádory z ošetrovaných zvierat mali zníženú MVD v porovnaní s kontrolnými skupinami ošetrovanými nosi30 čom, čo je v súlade s antiangiogénnym mechanizmom účinku zlúčeniny 80; MVD bola 24,2 ±4,1 pri zvieratách ošetrovaných zlúčeninou 80, v porovnaní s 39,3 ± 5,7 pri tých, ktoré boli ošetrované len nosičom. Ako sa predpokladá na základe zastavenia sprievodného rastu nádoru, vyložená inhibícia proliferácie nádorových buniek bola evidentná pri nádoroch, ktoré boli ošetrované zlúčeninou 80. Tieto nádory mali polovičný mitotický index nádorov, ktoré boli ošetrované nosičom (údaje nie sú uvedené). Účinok zlúčeniny 80 na MVD a 35 proliferáciu nádorových buniek indikuje, že zlúčeniny majú výrazné antiangiogénne a protinádorové účinky, aj za podmienok, pri ktorých nádory neustupujú.
Schopnosť zlúčeniny 80 inhibovať fosforyláciu PDGFR a následnú signalizáciu in vivo bola tiež vyhodnocovaná na nádoroch SF763T, ktoré exprimujú vysoké hladiny PDGFRp. Ošetrením SF763T nádorov zlúčeninou 80 dochádzalo k silnej inhibícii. Silne sa inhibovala fosforylácia PDGFRp tyrozínu v etablovaných 40 SF763T nádoroch. Zlúčenina 80 tiež znižovala hladiny fosforylovanej (aktivovanej) fosfolipázy C gamma (PLC-γ), okamžitý downstreamový indikátor aktivácie PDGFR. Tieto údaje demonštrujú, že perorálne podanie zlúčeniny 80 spôsobuje priamy účinok na cieľovú aktivitu (PDGFR) v nádoroch in vivo.
Na základe dôkazu, že schopnosť zlúčeniny 80 inhibovať VEGF-dependentnú signalizáciu v HUVEC in vitro je dlhodobá (vide supra), účinnosť zlúčeniny bola stanovená po nečastom podaní zlúčeniny do modelu 45 Colo205 nádoru. Ako je uvedené v tabuľke 8, bolo 80 mg na kg (91 % inhibícia) a 40 mg na kg (84 % inhibícia) účinných, za predpokladu, že dávka bola podávaná denne, niekoľkokrát týždne. Na rozdiel od vyšších dávok zlúčeniny 80 (160 mg na kg), ktoré inhibovali (52 % inhibícia) rast etablovaných nádorov Colo205 pri podaní 2 x týždne, z čoho je možné usudzovať, že táto zlúčenina môže byť účinná pri nefrekventovanom podaní vo vyšších dávkach. Malo by byť uvedené, že dávkovacie režimy môžu byť stanovené odbornou verej50 nosťou bez náležitého skúšania.
Tabuľka 8
dávka (mg/kg) |
frekvencia |
inhibícia
% |
hodnota P |
160 |
2 x týždne |
52 |
0,085 |
|
1 x týždne |
17 |
NS |
80 |
denne |
91 |
0,039 |
|
2 x týždne |
19 |
NS |
|
1 x týždne |
0 |
NS |
40 |
denne |
84 |
0,028 |
|
2 x týždne |
36 |
NS |
NS: nevýznamná hodnota (P > 0,05 )
Výsledky z tabuľky 8 boli získané z buniek Colo205 (0,5 x 106 buniek na myš), ktoré boli implantované SC do oblasti zadného boku atymickej myši. Perorálne podanie zlúčeniny 80 podľa indikovaného režimu sa začalo v čase, kedy nádory dosiahli objem 400 mm3. Nádory boli merané vemierovými kaliperami a objem nádoru bol vypočítaný ako dĺžka x šírka x výška produktu. Hodnoty P boli vypočítané porovnaním veľkosti nádorov pri zvieratách, ktoré boli ošetrované zlúčeninou 80, so zvieratami, ktoré boli ošetrované nosičom, v posledný deň experimentu pomocou dvojstranného Študentovho t-testu.
ii. Účinnosť zlúčeniny 80 na modeli diseminovaného ochorenia
Okrem podpory trvalého rastu pevných primárnych nádorov je angiogenéza tiež esenciálna zložka podporujúca vznik diseminovaného ochorenia v dôsledku metastázy z primárneho nádoru. Účinok zlúčeniny 80 na vznik diseminovaného ochorenia bol skúmaný na modeli kolonizácie pľúcneho melanómu B16-F1 myši. Pri tomto modeli kolonizujú B16-F1 bunky inokulované intravenózne via chvostovú žilu atymickej myši pľúca a vytvárajú nádory. Ako je uvedené v tabuľke 8, podľa vyhodnotenia merania celkovej hmotnosti pľúc účinne znižuje perorálne podanie zlúčeniny 80 v množstve 80 mg na kg denne hmotnosť BI6-F1 buniek v pľúcach. Tieto údaje naznačujú, že zlúčenina 80 môže inhibovať diseminované ochorenie in vivo.
Tabuľka 9
|
hmotnosť pľúc
(g) ... |
% inhibície |
hodnota P |
nosič |
0,83 ± 0,07 |
- |
- |
zlúčenina1 |
0,41 ± 0,04 |
50 |
< 0,001 |
1 zlúčenina 80 |
Výsledky z tabuľky 9 boli získané z atymickej myši, ktorá bola inokulovaná B16-F1 nádorovými bunkami (5 x 105 buniek na myš). Myši boli ošetrené denne perorálnou dávkou zlúčeniny 80 v množstve 80 mg na kg denne (n = 10) alebo nosičom (n = 18) počas 24 dní po inokulácii nádoru. Na konci doby ošetrovania boli myši usmrtené a ich pľúca boli izolované a zvážené. Percentuálna inhibícia bola vypočítaná porovnaním hmotnosti pľúc pri zvieratách, ktoré boli ošetrované zlúčeninou 80, so zvieratami, ktoré boli ošetrované iba nosičom. Hodnoty P boli stanovené pomocou dvojstranného Študentovho t-testu.
D. Príklady biologickej aktivity
Príklady in vivo účinnosti zlúčenín podľa predloženého vynálezu sú uvedené v tabuľke 2.
Záver
Pri štúdiách zameraných na výskum farmakokinetických charakteristík zlúčenín z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu, bolo dokázané, že perorálne podanie jednotlivej dávky uvedených zlúčenín vedie k vysokej biologickej dostupnosti pri myšiach. Dobrá perorálna biologická dostupnosť a lineárna far makokinetika ukazujú, že zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu majú priaznivé farmakokinetické charakteristiky.
Navyše zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu sú účinnými inhibítormi aktivity tyrozínkinázy z delenej kinázovej domény RTK Flk-1/KDR a PDGFR, ktoré sa podieľajú na angiogenéze, a RTK c-kit, receptora pre faktor kmeňových buniek (SCF), ktorý sa podieľa na určitých hematologických rakovinách. Vo vysokých koncentráciách zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu tiež inhibujú aktivitu tyrozínkinázy FGFR-1, tretej RTK podieľajúcej sa na angiogenéze. V súlade s ich biochemickou aktivitou inhibujú zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu ligand-dependentnú fosforyláciu tyrozinu cieľových RTK a in vitro mitogénnu odpoveď ľudských endoteliálnych buniek pupočníkovej žily (HUVEC) stimulovanej VEGF alebo FGF, PDGFR-exprimujúcich N1H-3T3 buniek stimulovaných PDGF, a M07E buniek akútnej myeloidnej leukémie stimulovaných SCF. Naproti tomu zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu priamo neinhibujú proliferáciu nádorových buniek v kompletnom rastovom médiu okrem koncentrácií vyšších o 2 až 3 rády než sú koncentrácie nutné k inhibícii ligand-dependentných mitogénnych odpovedí. Pri štúdiách xenoimplantátu na myšiach inhibovali zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu rast etablovaných ľudských nádorov rôzneho pôvodu spôsobom závislým od dávky a v koncentráciách, ktoré boli dobre znášané aj po predĺžení dávkovania (> 100 dní). Pri dávke 80 mg na kg denne indukovali zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu regresiu veľkých etablovaných A431 a Colo205 nádorov a spôsobovali značnú inhibiciu rastu alebo stagnáciu SF763T a NCI-H460 nádorov. Pri myšiach majúcich SF763T nádory spôsobovali zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu redukcie hustoty mikrociev, fosforyláciu PDGFR v nádoroch a mitotický index v nádorových bunkách. Pri tejto dávke tiež zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu inhibovali pľúcnu kolonizáciu nádorovými buniek B16-F1 v modeli metastázy nádoru. Štúdie režimov ukázali, že zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu sú najúčinnejšie, pokiaľ sú podávané denne. Priamy dôkaz antiangiogénnej aktivity zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu bol vykonaný na SF763T nádoroch, v ktorých bola hustota mikrociev redukovaná. Priamy dôkaz, že zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu inhibovali fosforyláciu PDGFR a signalizáciu in vivo, bol tiež vykonaný na SF763T nádoroch.
Keď sa všetko spojí, podporujú tieto údaje názor, že perorálne podávané zlúčeniny z výhodných uskutočnení podľa predloženého vynálezu sú antiangiogénne prostriedky na ošetrenie rakovín, vrátane pevných nádorov a hematologických zhubných bujnení, v ktorých angiogenéza a/alebo signalizácia cez c-kit sú dôležité z hľadiska patológie ochorenia.
Je zrejmé, že zlúčeniny, postupy a farmaceutické prípravky podľa predloženého vynálezu sú účinné pri modulácii aktivity PK, a teda sa predpokladá ich účinnosť ako terapeutických prostriedkov pri poruchách súvisiacich s RTK, CTK a STK.
Odborník tiež ľahko ocení, že predkladaný vynález je dobre uspôsobený na uskutočňovanie opísaných aspektov a dosahovanie uvedených cieľov a výhod, rovnako ako tých, ktoré sú mu inherentne vlastné. Molekulárne komplexy a tu opisované metódy, postupy, terapie, molekuly a konkrétne zlúčeniny predstavujú výhodné uskutočnenia a sú iba príklady, ktoré nijako neobmedzujú rozsah vynálezu. Odborníkovi sú zrejmé ich obmeny a ďalšie použitie, ktoré sú zahrnuté v predmete vynálezu, ako je definovaný pripojenými patentovými nárokmi.
Odborníkovi je tiež zrejmé, že je možné vykonávať rôzne náhrady a modifikácie predkladaného vynálezu, bez toho, aby sa prekročil rozsah a myšlienka vynálezu.
Všetky patenty a publikácie spomínané v texte sú ukazovateľom úrovne odborníkov, ktorých sa vynález týka. Všetky patenty, publikácie sú tu zahrnuté formou odkazu, ako by bolo pre každú jednotlivú publikáciu konkrétne a jednotlivo uvedené, že je tu zahrnutá ako odkaz.
Vynález, tu ilustratívne opísaný, môže byť výhodne vykonávaný za absencie akéhokoľvek prvku alebo prvkov, alebo obmedzení, ktoré tu nie sú konkrétne uvedené. Tak napríklad v každom prípade tu môže byť ktorýkoľvek z výrazov „zahrnujúci“, „pozostávajúci v podstate z“ a „pozostávajúci z“ nahradený ktorýmkoľvek zo zvyšných dvoch. Termíny a výrazy, ktoré tu boli použité, sú používané ako výrazy opisné a nie obmedzujúce a pri ich použití neexistuje vylúčenie akýchkoľvek ekvivalentov uvedených a opísaných znakov alebo ich častí, ale potvrdzuje sa, že v rozsahu nárokovaného vynálezu sú možné rôzne modifikácie. Je teda nutné zdôrazniť, že aj keď je vynález opísaný konkrétne pomocou výhodných uskutočnení a voliteľných znakov, môže sa odborník uchýliť k modifikáciám a variáciám tu uvedených konceptov a tieto modifikácie a variácie sa považujú za spadajúce do rozsahu vynálezu, definovaného pripojenými patentovými nárokmi.
Tam, kde sú znaky alebo predmety vynálezu opisované pomocou Markushových definícií, je navyše odborníkovi zrejmé, že vynález je tým tiež definovaný pomocou každého jednotlivého člena alebo podskupiny takej Markushovej skupiny. Napríklad ak je význam symbolu X definovaný ako vybraný zo skupiny pozostávajúcej z brómu, chlóru a jódu, sú tým plne opísané nárokmi pre X znamenajúce bróm aj nárokmi pre X znamenajúce chlór.
Ďalšie uskutočnenia spadajú do rozsahu pripojených patentových nárokov.