发明内容
本发明目的之一在于公开一类具有蛋白激酶选择性抑制活性和同时具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的萘酰胺衍生物;
本发明目的之二在于公开这一类所述的化合物的制备方法;
本发明目的之三在于公开这一类所述的化合物作为治疗与蛋白激酶活性异常以及组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病方面的临床应用。
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)蛋白在调控体内的基因表达方面起着关键作用,它改变转录因子到染色体组DNA的可达性。尤其是HDAC去除组蛋白中乙酰化赖氨酸残基的乙酰基,从而导致核小体重构(Grunstein,M.,1997,Nature,389:349-352)。由于HDAC蛋白在基因表达中起着关键作用,所以它们与许多细胞功能密切相关,包括细胞周期调控、细胞增殖、分化、基因程序化表达和癌症发生(Ruijter,A-J-M.,2003,Biochem.J.,370:737-749;Grignani,F.,1998,Nature,391:815-818;Lin,R-J.,1998,391:811-814;Marks,P-A.,2001,Nature ReviewsCancer,1:194)。由组蛋白去乙酰化酶误调所致的异常去乙酰化与许多临床疾病密切相关,如鲁-泰(Rubinstein-Taybi)二氏综合征、脆性X染色体综合症、神经退化性疾病、心血管与代谢疾病、类风湿、白血病和其它各种癌症(Langley B et al.,2005,Current Drug Targets-CNS &Neurological Disorders,4:41-50)。试验表明,HDAC抑制剂能够抑制人类及动物体内的肿瘤的生长,包括肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤等(Dokmanovic,M.,2005,J.CellBiochenm.,96:293-304)。
依据序列同源性,哺乳动物的HDACs可以分为三类。第一类由酵母Rpd3-类蛋白组成(HDAC 1,2,3,8和11)。第二类由酵母HDA1-类蛋白组成(HDAC 4,5,6,7,9和10)。第三类由酵母SIR2-类蛋白组成(SIRT 1,2,3,4,5,6和7)。
HDAC1的活性和细胞增殖(癌症的标志)相关。哺乳动物细胞通过siRNA降低HDAC1表达,具有抗增殖性(Glaser,K-B.,2003,Biochem.Biophys.Res.Comm.,310:529-536)。HDAC1基因敲除鼠是胚胎致死的,其结果导致干细胞生长速度的改变(Lagger,G.,2002,EMBO J.,21:2672-2681)。HDAC1过度表达的老鼠细胞显示G2和M期延长及生长速度降低(Bartl.S.,1997,Mol.Cell Biol.,17:5033-5043)。因此,试验数据表明,HDAC1与细胞周期调控及细胞增殖密切相关。
HDAC2调控许多胎心肌蛋白异构体的表达。HDAC2缺乏或是通过化学方法抑制组蛋白去乙酰化酶可以阻止胚胎基因的再表达,减少心室肥大。抗肥大和肌醇多磷酸盐-5-磷酸酶f(Inpp5f)编码基因表达增加有关,这种增加导致胸腺瘤滤过性病毒的原癌基因(Akt)和3-磷酸肌醇-依赖的蛋白激酶-1失活,激活了糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)。相反,HDAC2转基因鼠心室肥大增加,这与失活的Gsk3β有关。通过化学方法抑制活化的Gsk3β使得HDAC2-缺乏的成人对心室肥大的刺激变得敏感。这些结果表明,在心脏中HDAC2是HDAC抑制剂的一个重要的分子靶标。HDAC2和Gsk3β都是调控通路的组成部分,这为治疗心室肥大和心力衰竭提供了极具吸引力的治疗靶标(Trivedi,C-M.,2007,Nat.Med,.13:324-331)。
HDAC3在正常小肠的增殖隐窝细胞中表达最多。在结肠癌细胞系中HDAC3表达沉默导致细胞生长抑制、细胞存活降低和细胞凋亡增加。沉默HDAC2表达可以观察到类似的效果,而对于HDAC1,效果则没有那么显著。HDAC3基因沉默也选择性的引起碱性磷酸酯酶的表达(结肠细胞成熟的标志)。HDAC3的过度表达抑制基础转录及丁酸酯诱导的P21转录,而沉默HDAC3则刺激P21基因启动子的活性和表达。这些发现表明HDAC3是在人体结肠癌中进行下调的基因,是结肠细胞成熟和P21表达的一种新型的调节剂(Wilson,A-J.,2006,J.Biol.Chem.,281:13548-13558)。
HDAC6是HDAC家族的一个亚型,它脱去α-微管蛋白的乙酰基,增加细胞运动性。在九组口腔鳞状细胞癌(OSCC)的细胞系和正常的口腔角化细胞(NOKs)上运用定量实时逆转录聚合酶链反应和Western Blots技术分析,与NOKs相比,HDAC6 mRNA和蛋白表达水平在所有的癌细胞中都升高了。通过免疫荧光法分析,在OSCC细胞系的细胞质中检测到了HDAC6蛋白。和OSCC细胞系相似,在早期的人体OSCC肿瘤中HDAC6上调明显,mRNA达74%,蛋白达51%。通过对临床变量的分析,人们发现临床肿瘤的发展阶段和HDAC6的表达状态相关。分析表明,HDAC6的表达水平在肿瘤早期(I和II期)和晚期(III和IV期)存在显著差异(P=0.014)。这些结果表明HDAC6的表达可能和肿瘤的恶性程度有关,这也为设计新的治疗方法提供了线索(Sakuma,T.,2006,Int.J.Oncol.,29:117-124)。
HDAC使功能染色体表观基因沉默是许多病理过程的主要机制之一。其中,功能相关基因被HDAC抑制或重调,导致在终末分化、成熟和生长控制中表型缺失,并且丧失组织功能。例如,肿瘤抑制基因经常在癌症的发展过程中被沉默,HDAC抑制剂能够诱导这些肿瘤抑制基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长和分化(Glaros S et al.,2007,Oncogene June 4 Epub aheadof print;Mai,A,et al.,2007,Int J.Biochem Cell Bio.,April 4,Epub ahead of print;Vincent A.et al.,2007,Oncogene,April 30,Epub ahead of print;our unpublished results)。结构基因(如与Friedreich’s运动失调相关的FXN基因和与脊柱肌肉萎缩相关的SMN基因)的抑制可以被HDAC抑制剂逆转,使得FXN和SMN基因重新表达,并恢复组织功能(Herman D et al.,2006,Nature Chemical Biology,2(10):551-8;Avila AM et al.,2007,J Clinic Investigation,117(3)659-71;de Bore J,2006,Tissue Eng.12(10):2927-37)。HDAC抑制剂在染色体6p21-22重调HDAC“热点”程序,诱导整个MHC II家族基因表达,进一步延伸了免疫识别和免疫响应的表观基因调控(Gialitakis M et al.,2007,Nucleic Acids Res.,34(1);765-72)。
目前已经确定了几类HDAC抑制剂,包括:1)短链脂肪酸,如丁酸和苯丁酸;2)有机羟肟酸,如suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA)和trichostatin A(TSA);3)含有2-胺基-8-氧-9,10-环氧癸酰基(AOE)的环四肽,如trapoxin和HC-toxin;4)不含2-氨基-8-氧-9,10-环氧癸酰基的环四肽,如apicidin和FK228;5)苯酰胺类,如MS-275(欧洲专利EP0847992A1,美国专利2002/0103192A1,世界专利02/26696A1,世界专利01/70675A2,世界专利01/18171A2)。尽管HDAC是一个极具前景的药物靶标,但目前Merck公司研制的SAHA仅仅局限于对皮肤T细胞淋巴瘤的治疗,而对实体瘤疗效并不明显。因此,有必要继续研制新的化合物,使其具有更强的HDAC抑制活性、更强的抗癌活性、更好的HDAC亚型选择性和更低的毒性。
靶向治疗一直为抗癌药物研发人员所推崇。人们希望设计药物,它既能准确的到达肿瘤细胞的某个特定靶标并杀死肿瘤细胞,同时又对正常细胞又没有伤害。然而,肿瘤细胞能够运用多种生物引发器和通路来进行生长和传播。在一个靶点对肿瘤细胞进行打击,它们会沿着新的生长通路重组和重新部署。由此人们发展了组合靶向治疗,并正在成为癌症治疗的新范例。几个多靶点激酶抑制剂现正在研发中,其中Sorafenib和Sutent已经在美国获得批准上市。Sorafenib(Bayer公司开发)是第一个同时以RAF/MEK/ERK通路(与细胞增殖有关)和VEGFR2/PDGFRβ级联信号通路(与血管生成有关)为靶点的药物,该药在2005年12月获得批准用于治疗晚期肾癌。尽管这些靶向治疗药物在治疗一些实体瘤时是有效的,但是在治疗其它实体瘤时,疗效并不理想且具有毒副作用。
本发明所述的化合物,结合了RTK抑制剂的抗血管生成和抗增殖活性以及HDAC抑制剂的所具有的诱导分化、免疫调节、阻碍细胞周期、促使细胞凋亡的活性,旨在对实体瘤具有更好的疗效,同时克服市售的RTK抑制剂的毒副作用,如高血压、QT间期延长、甲状腺退化、皮疹和皮肤变色、疼痛等。
本发明所述的化合物,其化学结构如通式(I)所示:
其中,
Z为CH或N;
R1、R2和R3分别为氢、卤素、烷基、烷氧基或三氟甲基;
R4为
X为苯环或吡啶环;
R5为一个或多个取代基,选自氢、卤素、烷基、烷氧基或三氟甲基;
包括其游离形式、盐的形式、对映异构体、非对映异构体或水合物。较优地,所述化合物如式(I)所示,其中,
Z为CH;
R1、R2和R3分别为氢、卤素、烷基、烷氧基或三氟甲基;
R4为
X为苯环或吡啶环;
R5为一个或多个取代基,选自氢、卤素、烷基、烷氧基或三氟甲基。再优地,所述化合物如式(I)所示,其中,
Z为CH;
R1、R2和R3分别为氢或烷氧基;
R4为
X为苯环或吡啶环;
R5为一个或多个取代基,选自氢、卤素、烷基、烷氧基或三氟甲基。更优地,所述化合物如式(I)所示,其中,
Z为CH;
R1、R2分别为氢或甲氧基;
R3为H;
R4为
X为苯环或吡啶环;
R5为一个或多个取代基,选自氢、卤素、烷基、烷氧基或三氟甲基。最优地,Z为CH;
R1、R2分别为氢或甲氧基;
R3为H;
R4为
X为苯环或吡啶环;
R5为H或F。
本发明所述的“卤素”,为氟、氯、溴、碘;
本发明所述的“烷基”,包括直链、支链或环状烷基,如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、特丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等;
本发明所述的“烷氧基”,是指烷基与氧原子相连所形成的基团,其中,氧原子具有自由成键能力,如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、异丙氧基、特丁氧基、环丙氧基、环己基氧基等;
本发明所述的化合物的制备方法如下:
将化合物(II)与化合物(III)进行缩合反应得到目标化合物(I)。该缩合反应以肽缩合剂为催化剂,如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC),N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC),N,N’-碳酰二咪唑(CDI)等。反应温度为0~80℃,反应时间为4~72小时。反应所用溶剂为常用溶剂,如苯、甲苯、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺等。必要时,也可以加入碱如氢氧化钠、三乙胺或吡啶。
化合物(II)可以通过如下方法制备:
将市售的6-羟基萘酸、碳酸铯和具有指定取代基的4-氯喹啉(IV)于DMSO溶剂中加热得到萘酸(II)。反应温度为130~140℃,反应时间为3~24小时。
化合物(III)可直接购得或通过如下方法制备:
将市售的化合物(V)与化合物(VI)进行缩合反应得到化合物(VII)。该缩合反应以肽缩合剂为催化剂,如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC),N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC),N,N’-碳酰二咪唑(CDI)等。反应温度为0~60℃,反应时间为2~72小时。反应所用溶剂为常用溶剂,如苯、甲苯、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺等。必要时,也可以加入碱如氢氧化钠、三乙胺或吡啶。
将化合物(VII)溶于甲醇,以5%钯碳为催化剂,催化氢化得到化合物(IIIa)。该反应在室温进行。必要时,可在反应体系中加入酸,如硫酸。
通式(I)所述的化合物可以采用常见的分离方法进行纯化,如萃取、重结晶、柱层析等。
通式(I)所述的化合物同时具有蛋白激酶抑制活性和组蛋白去乙酰化酶抑制活性,可以用于治疗与蛋白激酶活性异常以及组蛋白去乙酰化酶活性异常相关的疾病,尤其对血癌和实体瘤具有优异疗效。
通式(I)所述的化合物被加工成常用的药用制剂,如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂、膏剂。该制剂含有作为活性组分的通式(I)的化合物,以及药用载体、辅料或稀释剂。该制剂中通常含有0.5~70%的活性成分,较佳含量为1~20%。
本发明所说的药用载体、辅料或稀释剂,包括《药用赋形剂手册》(美国药学协会,1986年10月)或化学工业出版社出版的《药用辅料手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients,原著第四版)所列的载体填料,但并不局限于这些载体填料。
本发明所述的通式(I)化合物,在临床上可以通过口服或注射方式对哺乳动物(包括人)进行用药,其中尤以口服方式最佳。用药剂量为每日0.0001~200mg/kg体重,较佳用药剂量为每日0.01~100mg/kg体重,最佳用药剂量为每日0.1~50mg/kg体重,同时,最佳剂量视个体而定,通常开始时剂量较小,然后逐渐增加用量。
本发明所述的代表性化合物如表1所示。化合物编号与实施例部分中的“实施例编号”相一致,即表1中化合物1的合成在“实施例1”中得到描述,表1中化合物44的合成在“实施例44”中得到描述。
表1本发明代表性化合物
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容,但本发明的保护范围并不仅仅局限于这些实例。本发明所述的百分比除特别注明外,均为重量百分比。说明书中所描述的数值范围,如计量单位、反应条件、化合物物理状态或百分比,均是为了提供明白无误的书面参考。本领域熟练技术人员在实践本专利时,使用在此范围之外或有别于单个数值的温度、浓度、数量、碳原子数等,仍然可以得到预期的结果。
实施例1
6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸的制备
将6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)溶于38mL DMSO,然后加入碳酸铯(7.5g,22.9mmol)和4-氯-6,7-二甲氧基-喹唑啉(2.05g,9.14mmol)。该反应液在140℃下加热3小时。反应结束后冷却至室温。加入40mL水稀释。用2N盐酸中和至pH=6.5。将析出的固体过滤、水洗、干燥。用甲醇重结晶得棕色固体6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(1.68g,产率59%)。LC-MS(m/z)377(M+1)。
实施例2
6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸的制备
以6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)和4-氯-7-甲氧基喹啉(1.77g,9.14mmol)为原料,按照实施例1中的类似步骤制得棕色固体6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(1.73g,产率66%)。LC-MS(m/z)346(M+1)。
实施例3
6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸的制备
以6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)和4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(2.04g,9.14mmol)为原料,按照实施例1中的类似步骤制得棕色固体6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(1.95g,产率68%)。LC-MS(m/z)376(M+1)。
实施例4
6-(喹啉-4-氧)-1-萘酸的制备
以6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)和4-氯喹啉(1.49g,9.14mmol)为原料,按照实施例1中的类似步骤制得棕色固体6-(喹啉-4-氧)-1-萘酸(1.24g,产率52%)。LC-MS(m/z)316(M+1)。
实施例5
6-(8-甲基喹啉-4-氧)-1-萘酸的制备
以6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)和4-氯-8-甲基喹啉(1.62g,9.14mmol)为原料,按照实施例1中的类似步骤制得棕色固体6-(8-甲基喹啉-4-氧)-1-萘酸(1.25g,产率55%)。LC-MS(m/z)330(M+1)。
实施例6
6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酸的制备
以6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)和4,7-二氯喹啉(1.81g,9.14mmol)为原料,按照实施例1中的类似步骤制得棕色固体6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酸(1.57g,产率59%)。LC-MS(m/z)350(M+1)。
实施例7
6-(8-(三氟甲基)喹啉-4-氧)-1-萘酸的制备
以6-羟基-1-萘酸(1.43g,7.6mmol)和4-氯-8-(三氟甲基)喹啉(2.12g,9.14mmol)为原料,按照实施例1中的类似步骤制得棕色固体6-(8-(三氟甲基)喹啉-4-氧)-1-萘酸(1.43g,产率49%)。LC-MS(m/z)384(M+1)。
实施例8
4-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺的制备
将4-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)溶于8ml DMF中,然后加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(768mg,4mmol)、1-羟基苯并三唑(324mg,2.4mmol)、三乙胺(808mg,8mmol)和邻苯二胺(432mg,4mmol)。混合物在室温下搅拌20小时。然后用400ml盐水稀释。真空抽滤收集固体。固体用水洗涤。真空干燥得灰色固体N-(2-氨基苯基)-4-氰基苯酰胺(364mg,产率77%)。LC-MS(m/z)238(M+1)。
将N-(2-氨基苯基)-4-氰基苯酰胺(237mg,1mmol)溶于40mL甲醇中,然后加入硫酸(196mg,1mmol)和5%钯碳(0.20g)。混合物通氢气搅拌直至反应完成。反应液经硅藻土过滤,滤液用1N NaOH溶液(2ml)中和。过滤。滤液真空浓缩得灰色固体4-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(232mg,产率96%)。LC-MS(m/z)242(M+1)。
实施例9
4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-氟苯基)苯酰胺的制备
以4-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)和4-氟邻苯二胺(302mg,2.4mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得棕色固体4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-氟苯基)苯酰胺(186mg,产率72%)。LC-MS(m/z)260(M+1)。
实施例10
4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)苯酰胺的制备
以4-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)和4-甲基邻苯二胺(293mg,2.4mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得灰色固体4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)苯酰胺(173mg,产率68%)。LC-MS(m/z)256(M+1)。
实施例11
4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-甲氧基苯基)苯酰胺的制备
以4-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)和4-甲氧基邻苯二胺(331mg,2.4mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得灰色固体4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-甲氧基苯基)苯酰胺(192mg,产率71%)。LC-MS(m/z)272(M+1)。
实施例12
4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-三氟甲基苯基)苯酰胺的制备
以4-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)和4-三氟甲基邻苯二胺(422mg,2.4mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得灰色固体4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-三氟甲基苯基)苯酰胺(195mg,产率63%)。LC-MS(m/z)310(M+1)。
实施例13
3-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺的制备
以3-氰基苯甲酸(294mg,2mmol)和邻苯二胺(432mg,4mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得灰色固体3-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(140mg,产率58%)。LC-MS(m/z)242(M+1)。
实施例14
6-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)烟酰胺的制备
以6-氰基烟酸(296mg,2mmol)和邻苯二胺(864mg,8mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得灰色固体6-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)烟酰胺(157mg,产率65%)。LC-MS(m/z)243(M+1)。
实施例15
6-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-氟苯基)烟酰胺的制备
以6-氰基烟酸(296mg,2mmol)和4-氟邻苯二胺(302mg,2.4mmol)为原料,按照实施例8中的类似步骤制得灰色固体6-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-氟苯基)烟酰胺(135mg,产率52%)。LC-MS(m/z)261(M+1)。
实施例16
N-(2-氨基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
将6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)溶于4mL DMF中,然后加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(38.4mg,0.2mmol)、1-羟基苯并三唑(16.2mg,0.12mmol)、三乙胺(40.4mg,0.4mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)。混合物在室温下搅拌20小时。然后用200ml盐水稀释。真空抽滤收集固体。固体用水洗涤。真空干燥得褐色固体N-(2-氨基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(39.1mg,产率84%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.01(s,6H,2×OCH3),4.97(s,2H,benzene-NH2),6.65(t,J=7.2Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=7.0Hz,1H,Ar-H),7.00(t,J=7.1Hz,1H,Ar-H),7.38(d,J=7.1Hz,1H,Ar-H),7.42(s,1H,Ar-H),7.60(dd,J=2.4 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.64-7.68(m,2H,Ar-H),7.87(d,J=6.7Hz,1H,Ar-H),7.97(d,J=2.3Hz,1H,Ar-H),8.09(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.38(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),9.85(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)467(M+1)。
实施例17
N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-氟邻苯二胺(15.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(43.1mg,产率89%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.01(s,6H,2×OCH3),5.28(s,2H,benzene-NH2),6.41(td,J=2.6 and 8.5Hz,1H,Ar-H),6.59(dd,J=2.6 and 11.2Hz,1H,Ar-H),7.35(td,J=1.8 and 7.5Hz,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),7.59(dd,J=2.2 and 8.4Hz,1H,Ar-H),7.63-7.67(m,2H,Ar-H),7.89(d,J=6.9Hz,1H,Ar-H),7.96(d,J=1.9Hz,1H,Ar-H),8.08(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.38(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),9.77(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)485(M+1)。
实施例18
N-(2-氨基-4-甲基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-甲基邻苯二胺(14.6mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-甲基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(39.4mg,产率82%)。1H NMR(DMSO-d6)(isomer ratio 0.77/0.23)δ2.21(s,1H,Ar-CH3),4.01(s,6H,2×OCH3),4.77(s,0.23×2H,benzene-NH2),4.89(s,0.77×2H,benzene-NH2),6.46(d,J=7.6Hz,0.77×1H,Ar-H),6.64(s,0.77×1H,Ar-H),6.73(d,J=7.9Hz,0.23×1H,Ar-H),6.81(s,0.23×1H,Ar-H),7.24(d,J=8.1Hz,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),7.58-7.66(m,3H,Ar-H),7.85(d,J=6.7Hz,1H,Ar-H),7.97(s,1H,Ar-H),8.08(d,J=7.9Hz,1H,Ar-H),8.38(d,J=9.0Hz,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),9.77(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)481(M+1).
实施例19
N-(2-氨基-4-甲氧基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-甲氧基邻苯二胺(16.5mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-甲氧基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(43.2mg,产率87%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.70(s,3H,-OCH3),4.01(s,6H,2×OCH3),5.00(s,2H,benzene-NH2),6.23(dd,J=2.6and 8.6Hz,1H,Ar-H),6.40(d,J=2.6Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=8.6Hz,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),7.59(dd,J=2.2 and 9.1Hz,1H,Ar-H),7.62-7.66(m,2H,Ar-H),7.86(d,J=6.9Hz,1H,Ar-H),7.96(d,J=2.0Hz,1H,Ar-H),8.07(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.38(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),9.70(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)497(M+1)。
实施例20
N-(2-氨基-4-氯苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-氯邻苯二胺(17.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-氯苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(42.9mg,产率83%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.01(s,6H,2×OCH3),5.31(s,2H,benzene-NH2),6.65(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),6.86(d,J=1.9Hz,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),7.58-7.67(m,4H,Ar-H),7.89(d,J=6.8Hz,1H,Ar-H),8.01(s,1H,Ar-H),8.09(d,J=8.1Hz,1H,Ar-H),8.37(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.55(s,1H,Ar-H),9.84(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)501(M+1)。
实施例21
N-(2-氨基-4-溴苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-溴邻苯二胺(22.4mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-溴苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(42.0mg,产率77%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.01(s,6H,2×OCH3),5.31(s,2H,benzene-NH2),6.77(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),7.01(s,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),7.58-7.65(m,5H,Ar-H),7.89(d,J=7.0Hz,1H,Ar-H),8.00(s,1H,Ar-H),8.14(d,J=10.2Hz,1H,Ar-H),8.37(d,J=9.1Hz,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),9.84(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)545(M+1)。
实施例22
N-(2-氨基-4-三氟甲基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-三氟甲基邻苯二胺(21.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-三氟甲基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(42.3mg,产率79%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.01(s,6H,2×OCH3),5.72(s,2H,benzene-NH2),6.92(d,J=8.5Hz,1H,Ar-H),7.42(s,1H,Ar-H),7.59-7.65(m,3H,Ar-H),7.90-7.96(m,2H,Ar-H),7.98(s,1H,Ar-H),8.10(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),8.17(d,J=7.3Hz,1H,Ar-H),8.39(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),9.90(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)535(M+1)。
实施例23
N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(28.9mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(43.1mg,产率72%)。LC-MS(m/z)600(M+1)。
实施例24
N-(4-((2-氨基-4-氟苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-氟苯基)苯酰胺(31.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基-4-氟苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(46.3mg,产率75%)。LC-MS(m/z)618(M+1)。
实施例25
N-(2-氨基苯基)-6-((2-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和6-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)烟酰胺(29.0mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-((2-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺(41.4mg,产率69%)。LC-MS(m/z)601(M+1)。
实施例26
N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-((2-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和6-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-氟苯基)烟酰胺(31.2mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-((2-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺(43.3mg,产率77%)。LC-MS(m/z)619(M+1)。
实施例27
N-(3-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和3-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(28.9mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(3-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(48.5mg,产率81%)。LC-MS(m/z)600(M+1)。
实施例28
N-(4-((2-氨基-4-甲基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-甲基苯基)苯酰胺(30.6mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基-4-甲基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(52.7mg,产率86%)。LC-MS(m/z)614(M+1)。
实施例29
N-(4-((2-氨基-4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-甲氧基苯基)苯酰胺(32.5mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基-4-甲氧基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(51.6mg,产率82%)。LC-MS(m/z)630(M+1)。
实施例30
N-(4-((2-氨基-4-三氟甲基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酸(37.6mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基-4-三氟甲基苯基)苯酰胺(37.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基4-三氟甲基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氧)-1-萘酰胺(46.7mg,产率70%)。LC-MS(m/z)668(M+1)。
实施例31
N-(2-氨基苯基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(34.5mg,0.1mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(39.6mg,产率91%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.95(s,3H,-OCH3),4.97(s,2H,benzene-NH2),6.60(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),6.64(t,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=7.8Hz,1H,Ar-H),6.99(t,J=7.4Hz,1H,Ar-H),7.31(dd,J=2.5 and 9.1Hz,1H,Ar-H),7.38(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.45(d,J=2.4Hz,1H,Ar-H),7.57(dd,J=2.4 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.65(t,J=7.8Hz,1H,Ar-H),7.87-7.88(m,2H,Ar-H),8.07(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.25(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.43(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.65(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.84(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)436(M+1)。
实施例32
N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(34.5mg,0.1mmol)和4-氟邻苯二胺(15.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(33.1mg,产率73%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.95(s,3H,-OCH3),5.27(s,2H,benzene-NH2),6.41(td,J=2.5 and 8.4Hz,1H,Ar-H),6.57-6.61(m,2H,Ar-H),7.30-7.36(m,2H,Ar-H),7.45(d,J=2.2Hz,1H,Ar-H),7.56(dd,J=2.2 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.65(t,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.87-7.91(m,2H,Ar-H),8.07(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),8.24(d,J=9.1Hz,1H,Ar-H),8.43(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.65(d,J=5.1Hz,1H,Ar-H),9.75(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)454(M+1)。
实施例33
N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(34.5mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(28.9mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)-苄基)-6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(48.3mg,产率85%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.95(s,3H,-OCH3),4.64(d,J=5.6Hz,2H,-CH2),4.87(s,2H,benzene-NH2),6.58-6.62(m,2H,Ar-H),6.78(dd,J=1.2 and 7.8Hz,1H,Ar-H),6.97(td,J=1.4 and 8.1Hz,1H,Ar-H),7.18(d,J=7.0Hz,1H,Ar-H),7.31(dd,J=2.5 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.44(d,J=2.4Hz,1H,Ar-H),7.53-7.56(m,3H,Ar-H),7.62(t,J=8.0Hz,1H,Ar-H),7.72(d,J=6.1Hz,1H,Ar-H),7.86(d,J=2.5Hz,1H,Ar-H),7.98-8.06(m,3H,Ar-H),8.24(d,J=9.1Hz,1H,Ar-H),8.39(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.64(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.21(t,J=6.0Hz,1H,-CONH),9.61(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)569(M+1)。
实施例34
N-(2-氨基苯基)-6-((2-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺的制备
以6-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(34.5mg,0.1mmol)和6-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)烟酰胺(29.0mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-((2-(7-甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺(46.6mg,产率82%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.95(s,3H,-OCH3),4.74(s,2H,-CH2),4.95(s,2H,benzene-NH2),6.60(m,2H,Ar-H),6.79(s,1H,Ar-H),6.98(s,1H,Ar-H),7.17(s,1H,Ar-H),7.31(d,J=8.6Hz,1H,Ar-H),7.44(s,1H,Ar-H),7.58-7.63(m,3H,Ar-H),7.77(s,1H,Ar-H),7.87(s,1H,Ar-H),8.05(d,J=5.6Hz,1H,Ar-H),8.24(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.47(d,J=7.5Hz,1H,Ar-H),9.13(s,1H,Ar-H),9.25(s,1H,-CONH),9.77(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)570(M+1)。
实施例35
N-(2-氨基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(37.5mg,0.1mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(40.0mg,产率86%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.93(s,3H,-OCH3),3.95(s,3H,-OCH3),4.99(s,2H,benzene-NH2),6.56(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),6.63(t,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.81(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.98(t,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.36(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.43(s,1H,Ar-H),7.56-7.58(m,2H,Ar-H),7.65(t,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.87-7.90(m,2H,Ar-H),8.08(d,J=8.0Hz,1H,Ar-H),8.43(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.49(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.87(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)466(M+1)。
实施例36
N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(37.5mg,0.1mmol)和4-氟邻苯二胺(15.1mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基-4-氟苯基)-6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(39.1mg,产率81%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.93(s,3H,-OCH3),3.95(s,3H,-OCH3),5.31(s,2H,benzene-NH2),6.40(s,1H,Ar-H),6.55-6.59(m,2H,Ar-H),7.30(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.42(s,1H,Ar-H),7.54-7.57(m,2H,Ar-H),7.64(t,J=8.0Hz,1H,Ar-H),7.89-7.91(m,2H,Ar-H),8.07(d,J=8.0Hz,1H,Ar-H),8.42(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.49(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.79(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)484(M+1)。
实施例37
N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(37.5mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(28.9mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(49.0mg,产率82%)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.93(s,3H,-OCH3),3.95(s,3H,-OCH3),4.63(d,J=5.6Hz,2H,-CH2),4.90(s,2H,benzene-NH2),6.56-6.59(m,2H,Ar-H),6.78(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.96(t,J=8.1Hz,1H,Ar-H),7.17(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.42(s,1H,Ar-H),7.53-7.55(m,4H,Ar-H),7.62(t,J=8.0Hz,1H,Ar-H),7.71(d,J=6.8Hz,1H,Ar-H),7.87(s,1H,Ar-H),7.98-8.06(m,3H,Ar-H),8.39(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.49(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.26(t,J=6.0Hz,1H,-CONH),9.66(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)599(M+1)。
实施例38
N-(2-氨基苯基)-6-((2-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺的制备
以6-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酸(37.5mg,0.1mmol)和6-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)烟酰胺(29.0mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-((2-(6,7-二甲氧基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺)甲基)烟酰胺(47.9mg,产率80%)。1HNMR(DMSO-d6)δ3.93(s,3H,-OCH3),3.95(s,3H,-OCH3),4.73(d,J=5.6Hz,2H,-CH2),4.97(s,2H,benzene-NH2),6.57(m,2H,Ar-H),6.77(d,J=6.4Hz,1H,Ar-H),6.98(t,J=8.1Hz,1H,Ar-H),7.16(d,J=5.6Hz,1H,Ar-H),7.42(s,1H,Ar-H),7.55-7.63(m,4H,Ar-H),7.62(t,J=8.0Hz,1H,Ar-H),7.76(d,J=6.8Hz,1H,Ar-H),7.88(s,1H,Ar-H),8.06(s,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.45-8.48(m,2H,Ar-H),9.12(s,1H,Ar-H),9.30(t,J=6.0Hz,1H,-CONH),9.80(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)600(M+1)。
实施例39
N-(2-氨基苯基)-6-(喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(喹啉-4-氧)-1-萘酸(31.5mg,0.1mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-(喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(35.6mg,产率88%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.97(s,2H,benzene-NH2),6.65(t,J=7.3Hz,1H,Ar-H),6.75(d,J=5.1Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=7.8Hz,1H,Ar-H),7.00(t,J=7.1Hz,1H,Ar-H),7.38(d,J=7.5Hz,1H,Ar-H),7.59(dd,J=2.3 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.64-7.71(m,2H,Ar-H),7.83-7.92(m,3H,Ar-H),8.08(d,J=8.4Hz,2H,Ar-H),8.37(d,J=7.9Hz,1H,Ar-H),8.45(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.73(d,J=5.1Hz,1H,Ar-H),9.85(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)406(M+1)。
实施例40
N-(2-氨基苯基)-6-(8-甲基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(8-甲基喹啉-4-氧)-1-萘酸(32.9mg,0.1mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-(8-甲基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(37.7mg,产率90%)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.76(s,3H,Ar-CH3),4.97(s,2H,benzene-NH2),6.64(t,J=7.1Hz,1H,Ar-H),6.78(d,J=5.0Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=7.8Hz,1H,Ar-H),6.99(t,J=7.3Hz,1H,Ar-H),7.38(d,J=7.5Hz,1H,Ar-H),7.55-7.58(m,2H,Ar-H),7.65(t,J=7.6Hz,1H,Ar-H),7.71(d,J=7.0Hz,1H,Ar-H),7.87-7.89(m,2H,Ar-H),8.07(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.20(d,J=7.9Hz,1H,Ar-H),8.44(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.76(d,J=5.0Hz,1H,Ar-H),9.84(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)420(M+1)。
实施例41
N-(2-氨基苯基)-6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酸(35.0mg,0.1mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(33.2mg,产率83%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.97(s,2H,benzene-NH2),6.65(t,J=7.4Hz,Ar-H),6.77(d,J=5.5Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.00(t,J=7.0Hz,1H,Ar-H),7.38(d,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.60(dd,J=2.6 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.67-7.74(m,2H,Ar-H),7.89(d,J=7.4Hz,1H,Ar-H),7.94(d,J=2.4Hz,1H,Ar-H),8.09(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.13(d,J=2.1Hz,1H,Ar-H),8.41(d,J=9.0Hz,1H,Ar-H),8.46(d,J=9.6Hz,1H,Ar-H),8.76(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.85(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)440(M+1)。
实施例42
N-(2-氨基苯基)-6-(8-(三氟甲基)喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(8-三氟甲基喹啉-4-氧)-1-萘酸(39.8mg,0.1mmol)和邻苯二胺(43.2mg,0.4mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(2-氨基苯基)-6-(8-三氟甲基喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(38.3mg,产率81%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.98(s,2H,benzene-NH2),6.65(t,J=7.3Hz,1H,Ar-H),6.83(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.89(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),7.00(t,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.38(d,J=7.5Hz,1H,Ar-H),7.62(dd,J=2.4 and 9.2Hz,1H,Ar-H),7.68(t,J=7.7Hz,1H,Ar-H),7.83(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.90(d,J=7.0Hz,1H,Ar-H),7.97(d,J=2.3Hz,1H,Ar-H),8.10(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),8.29(d,J=7.1Hz,1H,Ar-H),8.47(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.70(d,J=7.8Hz,1H,Ar-H),8.87(d,J=5.2Hz,1H,Ar-H),9.86(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)474(M+1)。
实施例43
N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酸(35.0mg,0.1mmol)和4-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)苯酰胺(28.9mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(7-氯喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(42.4mg,产率74%)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.64(d,J=5.8Hz,2H,-CH2),4.87(s,2H,benzene-NH2),6.60(t,J=7.0Hz,1H,Ar-H),6.75-6.79(m,2H,Ar-H),6.97(t,J=7.5Hz,1H,Ar-H),7.18(d,J=7.7Hz,1H,Ar-H),7.53-7.59(m,3H,Ar-H),7.66(t,J=8.0Hz,1H,Ar-H),7.70-7.74(m,2H,Ar-H),7.92(d,J=2.0Hz,1H,Ar-H),7.99(d,J=7.9Hz,2H,Ar-H),8.06(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),8.13(s,1H,Ar-H),8.39-8.42(m,2H,Ar-H),8.75(d,J=5.1Hz,1H,Ar-H),9.22(t,J=5.6Hz,1H,-CONH),9.62(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)573(M+1)。
实施例44
N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(8-(三氟甲基)喹啉-4-氧)-1-萘酰胺的制备
以6-(8-三氟甲基喹啉-4-氧)-1-萘酸(38.3mg,0.1mmol)和6-(氨基甲基)-N-(2-氨基苯基)烟酰胺(29.0mg,0.12mmol)为原料,按照实施例16中的类似步骤制得棕色固体N-(4-((2-氨基苯基)氨基甲酰基)苄基)-6-(8-(三氟甲基)喹啉-4-氧)-1-萘酰胺(47.3mg,产率78%)。1HNMR(DMSO-d6)δ4.64(d,J=5.6Hz,2H,-CH2),4.87(s,2H,benzene-NH2),6.60(t,J=7.2Hz,1H,Ar-H),6.78(d,J=7.8Hz,1H,Ar-H),6.89(d,J=5.1Hz,1H,Ar-H),6.97(t,J=7.2Hz,1H,Ar-H),7.18(d,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.53-7.66(m,4H,Ar-H),7.74(d,J=6.9Hz,1H,Ar-H),7.83(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.95-8.08(m,4H,Ar-H),8.29(d,J=7.0Hz,1H,Ar-H),8.42(d,J=9.1Hz,1H,Ar-H),8.69(d,J=8.3Hz,1H,Ar-H),8.86(d,J=5.0Hz,1H,Ar-H),9.22(t,J=5.5Hz,1H,-CONH),9.61(s,1H,benzene-NH).LC-MS(m/z)607(M+1)。
实施例45 片剂的制备
处方(1000片):
化合物31: 5g
微晶纤维素: 90g
羧甲基淀粉钠: 5g
4%聚维酮K30无水乙醇溶液: 50g
滑石粉: 0.5g
制备工艺:将化合物31过100目筛,将微晶纤维素、羧甲基淀粉钠和滑石粉过80目筛,称取处方量的微晶纤维素和羧甲基淀粉钠,混合均匀,然后将化合物31与其按等量递加法混匀,加入4%聚维酮K30无水乙醇溶液适量制粒,干燥后加入处方量滑石粉混匀,压片即得。
实施例46 胶囊剂的制备
处方(1000粒):
化合物31: 5g
微晶纤维素: 55g
乳糖: 35g
羧甲基淀粉钠: 5g
硬脂酸镁: 0.5g
制备工艺:将化合物31过100目筛,将微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁过80目筛,称取处方量的微晶纤维素、乳糖和羧甲基淀粉钠,混合均匀,然后将化合物31与其按等量递加法混匀,加入处方量硬脂酸镁混匀,灌装胶囊即得。
实施例47 注射液的制备
处方:
化合物31: 1.00mg
药用DMSO: 0.10ml
药用乙醇: 1.00ml
制备工艺:将化合物31溶于药用DMSO,加入药用乙醇即得。
实施例48
通式(I)化合物PDGF和VEGF配体依赖性细胞增殖试验
(一)PDGF依赖性细胞增殖:
采用稳定表达人PDGFRβ的小鼠NIH-3T3成纤维工程细胞株来评价PDGF依赖的细胞增殖。PDGFR~NIH-3T3细胞以5000每孔的密度分种于96孔微孔板,24小时后换成无血清培养基培养过夜。加入待测化合物和PDGF BB(50ng/ml),继续在无血清培养基中培养72小时。细胞增殖情况根据说明用MTS方法(Promega)进行检测。在CO2培养箱37℃培养2小时,然后在ELISA酶标仪上测量490nm的吸收值。
(二)VEGF依赖性细胞增殖:
HUVEC细胞以6000每孔的密度分种于96孔微孔板,24小时后换成无血清培养基中培养2小时。加入待测化合物和VEGF 165(50ng/ml),继续在无血清培养基中培养72小时。细胞增殖情况根据说明用MTS方法(Promega)进行检测。在CO2培养箱37℃培养2小时,然后在ELISA酶标仪上测量490nm的吸收值。
实验结果见表2。
表2
实施例49
通式(I)化合物体外抑制HDAC总酶活性和
体外抑制HDAC亚型活性的试验。
一、体外HDAC总酶活性的测定:
体外HDAC总酶活性的测定是我们采用BIOMOL公司的HDAC Fluorimetric Assay/DrugDiscovery Kit对抑制剂的体外抑制活性进行测试。实验的原理如下:一种特殊的底物Fluor deLys在组蛋白去乙酰化酶(实验中采用HeLa细胞的核提取物,富含多种亚型的HDAC)的作用下会去掉一个乙酰基,暴露出游离的氨基,当加入Developer后会产生一种可诱导的荧光。这种荧光的激发波长为360nm,发射波长为460nm。底物去乙酰化越充分,诱导的荧光值就越高,在无抑制剂情况下的荧光值为对照;而当有抑制剂存在的时候,被诱导的荧光值会降低,而无酶时(相当于酶活性完全被抑制)的荧光值为空白。而一般抑制后的荧光值会介于对照和空白之间。在分析时我们将空白作为0,对照作为1进行计算,值越小则说明抑制活性越高。
1.将实验缓冲液,稀释后的trichostatinA及被测试的抑制剂加入微孔板适当的孔中。下表中列出了不同实验类型每种试剂的用量。
试剂 |
实验缓冲液 |
HeLa提取液(稀释液) |
抑制剂(5x) |
Fluor de LysTM底物(2x) |
空白 |
25μl |
0 |
0 |
25μl |
对照 |
10μl |
15ul |
0 |
25μl |
Trichostatin A |
0 |
15μl |
10ul |
25μl |
测试样品 |
0 |
15μl |
10μl |
25μl |
2.将稀释的HeLa核蛋白提取物加入那些除标记为“空白”以外的所有孔中。
3.让稀释后的Fluor de LysTM底物和微孔板中的样品平衡到25℃。
4.将稀释后的底物(25μl)加入每一个孔中并混合均匀以启动HDAC反应。
5.在室温反应30分钟,然后加入Fluor de LysTM显影剂(50μl)终止反应。将微孔板在室温(25℃)孵育10-15分钟。
6.在激发波长为369纳米,发射波长为451纳米的荧光酶标仪上读取荧光值。
二、报告基因对抑制剂HDAC亚型选择性的测定:
HDAC不同亚型可以与不同的转录因子结合,参与不同基因的表达调控中。选择合适转录因子的调控元件构建成报告基因,可以用来评估抑制剂对HDAC亚型的选择性抑制作用。在转染前一天将HeLa细胞种入96孔板使转染时密度达到50-80%的融合。在荧光素酶基因上游插入了p21-启动子调控序列的报告基因质粒分别使用FuGene6(Roche)转染试剂,根据操作说明进行转染。同时为了校正转染效率,共转染了绿色荧光蛋白(GFP)的表达质粒。在转染24小时后加入化合物或溶剂对照(DMSO)。再过24小时后收集并裂解细胞,按照操作说明使用荧光素酶(Promega)检测试剂盒对荧光素酶的量进行评估。同时进一步测定GFP的含量,对转染效率进行校正。
实验结果见表3。
表3
CS055:西达本胺,深圳微芯生物科技有限责任公司研制的HDAC抑制剂,具有优异的抗肿瘤活性,正进行临床2期试验。
实施例50
通式(I)化合物对肿瘤细胞增殖的抑制试验。
将肿瘤细胞用胰酶消化后,以3000个每孔的密度分种于96孔微孔板,在含10%FBS的完全培养基里培养24小时。加入待测化合物和溶剂对照,最终化合物浓度为100nmol/L到100μmol/L。然后在完全培养基里培养72小时。根据说明书的方法加入MTS试剂(Promega),在37℃ CO2培养箱中培养2小时,然后在ELISA酶标仪上读取490nm的吸收值。
实验结果见表4。
表4
nd*:未测定;
CS055:西达本胺,深圳微芯生物科技有限责任公司研制的HDAC抑制剂,具有优异的抗肿瘤活性,正进行临床2期试验。
实施例51
化合物31对人A549肺癌裸鼠移植性肿瘤的抑制试验
选用裸鼠,雌性,14-16g,经正常饲养观察3天如无异常,以50只常规腋下接种人A549肺癌后饲养观察,确认瘤细胞着床增殖且瘤块直径大于6mm时随机分组,8只/组,共6组,其中受试药物4个给药浓度共四组,溶剂对照一组,阳性对照药Sutent一组。即日口服给药,1次/日,共24次,化合物31的给药剂量为5、10、20和40mg/kg体重。每周2次称量动物体重及测量肿瘤体积。给药24次后次日处死动物剥取肿瘤称瘤重,按公式:[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%,计算各组肿瘤抑制率。实验结果见表5和图1。
表5
a每组8只裸鼠。b肿瘤生长抑制率。
实施例52
化合物31对人HCT-8肠癌裸鼠移植性肿瘤的抑制试验
选用裸鼠,雌性,18-20g,经正常饲养观察3天如无异常,以50只常规腋下接种人HCT-8肠癌后饲养观察,确认瘤细胞着床增殖且瘤块体积不小于100mm3时随机分组,8只/组,共6组,其中受试药物4个给药浓度共四组,溶剂对照一组,阳性对照药Sutent一组。即日口服给药,1次/日,共24次,化合物31的给药剂量为2.5、5、10和20mg/kg体重。每周2次称量动物体重及测量肿瘤体积。给药20次后次日处死动物剥取肿瘤称瘤重,按公式:[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%,计算各组肿瘤抑制率。实验结果见表6和图2。
表6
a每组8只裸鼠。b肿瘤生长抑制率。
实施例53
化合物31对人SSMC7721肝癌裸鼠移植性肿瘤的抑制试验
选用裸鼠,雌性,18-20g,经正常饲养观察3天如无异常,以50只常规腋下接种人SSMC7721肝癌后饲养观察,确认瘤细胞着床增殖且瘤块体积不小于100mm3时随机分组,8只/组,共6组,其中受试药物4个给药浓度共四组,溶剂对照一组,阳性对照药Sutent一组。即日口服给药,1次/日,共24次,化合物31的给药剂量为2.5、5、10和20mg/kg体重。每周2次称量动物体重及测量肿瘤体积。给药24次后次日处死动物剥取肿瘤称瘤重,按公式:[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%,计算各组肿瘤抑制率。实验结果见表7和图3。
表7
a每组8只裸鼠。b肿瘤生长抑制率。
实施例54
化合物33、34对人HCT-8肠癌裸鼠移植性肿瘤的抑制试验
选用裸鼠,雌性,18-20g,经正常饲养观察3天如无异常,以50只常规腋下接种人HCT-8肠癌后饲养观察,确认瘤细胞着床增殖且瘤块体积不小于100mm3时随机分组,8只/组,共6组,其中受试药物化合物33、34各2个给药浓度共四组,溶剂对照一组,阳性对照药Sutent一组。即日口服给药,1次/日,共20次。每周2次称量动物体重及测量肿瘤体积。给药20次后次日处死动物剥取肿瘤称瘤重,按公式:[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%,计算各组肿瘤抑制率。实验结果见表8和图4。
表8
a每组8只裸鼠。b肿瘤生长抑制率。
实施例55
化合物33、37对人HCT-8肠癌裸鼠移植性肿瘤的抑制试验
选用裸鼠,雌性,18-20g,经正常饲养观察3天如无异常,以50只常规腋下接种人HCT-8肠癌后饲养观察,确认瘤细胞着床增殖且瘤块体积不小于100mm3时随机分组,8只/组,共6组,其中受试药物化合物33、37各2个给药浓度共四组,溶剂对照一组,阳性对照药Sutent一组。即日口服给药,化合物33两个剂量组2次/日,间隔6小时,其余各组1次/日,共20天。每周2次称量动物体重及测量肿瘤体积。给药20天后次日处死动物剥取肿瘤称瘤重,按公式:[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%,计算各组肿瘤抑制率。实验结果见表9和图5。
表9
a每组8只裸鼠。b肿瘤生长抑制率。
实施例56
化合物33、37对人SSMC7721肝癌裸鼠移植性肿瘤的抑制试验
选用裸鼠,雌性,18-20g,经正常饲养观察3天如无异常,以50只常规腋下接种人SSMC7721肝癌后饲养观察,确认瘤细胞着床增殖且瘤块体积不小于100mm3时随机分组,8只/组,共6组,其中受试药物化合物33、37各2个给药浓度共四组,溶剂对照一组,阳性对照药Sutent一组。即日口服给药,1次/日,共30次。每周2次称量动物体重及测量肿瘤体积。给药30次后次日处死动物剥取肿瘤称瘤重,按公式:[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%,计算各组肿瘤抑制率。实验结果见表10和图6。
表10
a每组8只裸鼠。b肿瘤生长抑制率。