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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf bestimmte 3-Pyrrol-substituierte
2-Indolinonverbindungen, die die Aktivität von Proteinkinasen („PKs") modulieren. Die
Verbindungen dieser Erfindung sind daher zur Behandlung von Krankheiten,
die mit abnormaler PK-Aktivität in Verbindung
stehen, nützlich.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen,
Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die pharmazeutische Zusammensetzungen,
die diese Verbindungen umfassen, nutzen und Verfahren zur Herstellung
dieser werden ebenso offenbart.
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Stand der Technik
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Folgendes
wird nur als Hintergrundinformation geliefert und gilt nicht als
Stand der Technik für
die vorliegende Erfindung.
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PKs
sind Enzyme, die die Phosphorylierung von Hydroxygruppen an Tyrosin-,
Serin- und Threoninresten von Proteinen katalysieren. Die Folgen
dieser anscheinend einfachen Aktivität sind folgenschwer; Zellwachstum,
-differenzierung und -proliferation, d. h., im Grunde alle Aspekte
des Zellebens, hängen
auf die eine oder andere Weise von der PK-Aktivität ab. Ferner
ist die abnormale PK-Aktivität
mit zahlreichen Störungen
in Verbindung gebracht worden, von im Prinzip nicht lebensbedrohlichen
Krankheiten wie Psoriasis bis zu extrem virulenten Krankheiten wie
Glioblastom (Gehirnkrebs).
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Die
PKs können
praktischerweise in zwei Klassen unterteilt werden, die Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) und
die Serin-Threonin-Kinasen (STKs).
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Einer
der wesentlichsten Aspekte der PTK-Aktivität ist ihre Beteiligung an Wachstumsfaktorrezeptoren.
Wachstumsfaktorrezeptoren sind Zelloberflächenproteine. Gebunden durch
einen Wachstumsfaktorliganden, werden Wachstumsfaktorrezeptoren
in eine aktive Form umgewandelt, die mit Proteinen auf der inneren Oberfläche einer
Zellmembran interagiert. Dies führt
zur Phosphorylierung an Tyrosinresten des Rezeptors und anderen
Proteinen und zur Bildung von Komplexen mit einer Vielzahl zytoplasmischer
Signalmoleküle
innerhalb der Zelle, die wiederum zahlreiche zelluläre Antworten
wie Zellteilung (Proliferation), Zelldifferenzierung, Zellwachstum,
Expression metabolischer Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung
usw. bewirken. Für
eine vollständigere
Erörterung,
siehe Schlessinger und Ullrich, Neuron, 9: 303–391 (1992), aufgenommen durch
Verweis, einschließlich
der hierin vollständig
dargelegten Zeichnungen.
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Wachstumsfaktorrezeptoren
mit PTK-Aktivität
sind als Rezeptor-Tyrosin-Kinasen („RTKs") bekannt. Sie umfassen eine große Familie
von Transmembranrezeptoren mit diverser biologischer Aktivität. Bisher
sind mindestens neunzehn (19) unterschiedliche Unterfamilien von
RTKs identifiziert worden. Ein Beispiel dieser ist die Unterfamilie
der „HER"-RTKs, die den EGFR
(Epithel-Wachstumsfaktorrezeptor), den HER2, den HER3 und den HER4
umfassen. Diese RTKs bestehen aus einer extrazellulären glycosylierten
Ligandenbindungsdomäne,
einer Transmembrandomäne
und einer intrazellulären
zytoplasmischen katalytischen Domäne, die Tyrosinreste an Proteinen
phosphorylieren können.
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Eine
andere RTK-Unterfamilie besteht aus einem Insulinrezeptor (IR),
einem Insulin-like Wachstumsfaktor I-Rezeptor (IGF-1R) und einem
Insulinrezeptor-verwandten Rezeptor (IRR). IR und IGF-1R interagieren unter
Bildung eines Heterotetramers aus zwei vollständig extrazellulären, glycosylierten α-Untereinheiten
und zwei β-Untereinheiten,
die die Zellmembran kreuzen und die die Tyrosinkinasedomäne enthalten,
mit Insulin, IGF-I und IGF-II.
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Eine
dritte RTK-Unterfamilie wird als die Gruppe der aus Blutplättchen abgeleiteten
Wachstumsfaktorrezeptoren („PDGFR") bezeichnet, die
PDGFRα,
PDGFRβ,
CSFIR, c-kit und c-fms umfaßt.
Diese Rezeptoren bestehen aus glycosylierten extrazellulären Domänen, bestehend
aus einer variablen Anzahl an Immunoglobin-artigen Schleifen, und
einer intrazellulären
Domäne,
worin die Tyrosinkinasedomäne
durch nicht verwandte Aminosäuresequenzen
unterbrochen ist.
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Eine
andere Gruppe, die aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu der PDGFR-Unterfamilie
manchmal der letzteren Gruppe zugeordnet wird, ist die Fetale-Leber-Kinase-Rezeptor-Unterfamilie
(„flk"). Es wird angenommen, daß diese
Gruppe aus dem Kinase-Insert-Domain-Receptor-Fetal-Liver-Kinase-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1R,
flk-4 und fms-like Tyrosinkinase 1 (flt-1) besteht.
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Ein
weiterer Vertreter der Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptor-Familie
ist die Untergruppe der Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptoren („FGF"-Rezeptoren). Diese
Gruppe besteht aus vier Rezeptoren, FGFR1–4, und sieben Liganden, FGF1–7. Obgleich
noch nicht ausreichend definiert, scheinen die Rezeptoren aus einer
glycosylierten extrazellulären
Domäne,
enthaltend eine variable Anzahl an Immunoglobin-artigen Schleifen,
und einer intrazellulären
Domäne,
in der die Tyrosinkinasesequenz durch Regionen nicht verwandter
Aminosäuresequenzen
unterbrochen ist, zu bestehen.
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Ein
noch anderer Vertreter der Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptor-Familie
ist die Untergruppe der vaskulären
Endothel-Wachstumsfaktorrezeptoren („VEGF"-Rezeptoren). VEGF ist ein dimeres Glycoprotein ähnlich PDGF,
hat jedoch andere biologische Funktionen und Targetzellspezifitäten in-vivo.
Genauer gesagt wird angenommen, daß VEGF derzeit eine wichtige
Rolle bei der Vaskulogenese und Angiogenese spielt.
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Eine
vollständigere
Auflistung der bekannten RTK-Unterfamilien wird in Plowman et. al.,
DN&P, 7 (6): 334–339 (1994),
durch Verweis aufgenommen, einschließlich der hierin vollständig dargelegten
Zeichnungen, beschrieben.
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Neben
RTKs existiert eine Familie gänzlich
intrazellulärer
PTKs, die so genannten „Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen" oder „zellulären Tyrosinkinasen". Die letztere Bezeichnung,
abgekürzt „CTK", wird hierin verwendet.
CTKs enthalten keine extrazellulären
und Transmembrandomänen.
Bisher sind über
24 CTKs in 11 Unterfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes,
Fps, Fak, Jak und Ack) identifiziert worden. Die Src-Unterfamilie scheint
bisher die größte Gruppe
von CTKs zu sein und umfaßt
Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Für eine genauere
Erörterung
der CTKs siehe Bolen, Oncogene, 8: 2025–2031 (1993), hierin durch
Verweis aufgenommen, einschließlich
der hierin vollständig
dargelegten Zeichnungen.
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Die
Serin/Threoninkinasen, STKs, wie CTKs, sind überwiegend intrazellulär, obgleich
es einige Rezeptorkinasen vom STK-Typ gibt. STKs sind die verbreitetsten
Zytosol-Kinasen; d. h., Kinasen, die ihre Funktion in einem anderen
Teil des Zytoplasmas als den zytoplasmischen Organellen und dem
Zytoskelett ausüben.
Das Zytosol ist die Region innerhalb der Zelle, in der der größte Teil
der intermediären
metabolischen und biosynthetischen Aktivität der Zelle stattfindet; beispielsweise
werden Proteine im Zytosol auf Ribosomen synthetisiert.
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RTKs,
CTKs und STKs sind alle in zahlreiche pathogene Zustände verwickelt
gewesen, die bezeichnenderweise Krebs einschließen. Andere pathogene Zustände, die
mit PTKs in Verbindung gebracht worden sind, umfassen ohne Einschränkung Psoriasis,
Leberzirrhose, Diabetes, Angiogenese, Restenose, Augenerkrankungen,
Rheumatoidarthritis und andere Entzündungskrankheiten, immunologische
Störungen,
wie die Autoimmunkrankheit, kardiovaskuläre Krankheiten wie Atherosklerose
und eine Vielzahl an Nierenkrankheiten.
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Im
Hinblick auf Krebs beziehen sich zwei der Haupthypothesen, die die übermäßige Zellproliferation, die
die Tumorentwicklung fördert,
weiter erklären,
auf Funktionen, die bekanntermaßen
PK-reguliert sind. Das heißt,
es ist angedeutet worden, daß das
maligne Zellwachstum aus einem Zusammenbruch der Mechanismen, die
die Zellteilung und/oder -differenzierung kontrollieren, resultiert.
Es ist gezeigt worden, daß Proteinprodukte
aus einer Vielzahl von Protoonkogenen in die Signaltransduktionswege
involviert sind, die das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung
regulieren. Diese Proteinprodukte aus Protoonkogenen umfassen die oben
erörterten
extrazellulären
Wachstumsfaktoren, Transmembran-Wachstumsfaktor-PTK-Rezeptoren (RTKs),
Zytoplasma-PTKs (CTKs) und Zytosol-STKs.
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Im
Hinblick auf die scheinbare Verknüpfung zwischen PK-bezogenen
zellulären
Aktivitäten
und einer breiten Vielzahl menschlicher Erkrankungen, ist es keine Überraschung,
daß große Bemühungen in
einem Ansatz zur Identifizierung von Wegen zur Modulation der PK-Aktivität unternommen
worden sind. Einige dieser Bemühungen
umfaßten
biomimetische Ansätze
unter Verwendung großer
Moleküle,
basierend auf denen, die in die tatsächlichen zellulären Prozesse
involviert sind (z. B. mutante Liganden (US-Anmeldg. Nr. 4,966,849); lösliche Rezeptoren
und Antikörper
(Anmeldg. Nr. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sci., 90:
10705–09
(1994), Kim, et. al., Nature, 362: 841–844 (1993)); RNA-Liganden
(Jelinek, et. al., Biochemistry, 33: 10450–56); Takano, et. al., Mol.
Bio. Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et. al., Exp. Cell Res. 199:
56–62
(1992); Wright, et. al., J. Cellular Phys., 152: 44857) und Tyrosinkinaseinhibitoren
(WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US-Pat. Nr.
5,330,992; Mariani, et. al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).
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Des
weiteren sind Versuche unternommen worden, kleine Moleküle, die
als PK-Inhibitoren agieren, zu identifizieren. Beispielsweise sind
bis-monocylische, bicyclische und heterocyclische Arylverbindungen
(PCT WO 92/20642), Vinylenazaindolderivate (PCT WO 94/14808) und
1-Cyclopropyl-4-pyridylchinolone (US-Pat. Nr. 5,330,992) als Tyrosikinaseinhibitoren
beschrieben worden. Styrylverbindungen (US-Pat. Nr. 5,217,999), Styryl-substituierte
Pyridylverbindungen (US-Pat. Nr. 5,302,606), Chinazolinderivate
(EP-Anmeldg. Nr. 0 566 266 A1), Selenindole und Selenide (PCT WO
94/03427), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660)
und Benzylphosphonsäureverbindungn
(PCT WO 91/15495) sind alle als PTK-Inhibitoren beschrieben worden,
die bei der Behandlung von Krebs nützlich sind.
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Auf
Indolinonderivate und ihre vorgesehene Verwendung wird in den folgenden
Veröffentlichungen
Bezug genommen: US-Patent 5,886,020; internationale Patentanmeldungen
WO 98/50356, WO 99/61422 und WO 00/38519 (veröffentlicht am 6. Juli 2000);
J. Med. Chem. 1998, 41, 2588–2603.
Auf Oxindolderivate und ihre vorgesehene Verwendung wird in den
folgenden Veröffentlichungen
Bezug genommen: WO 00/35908 (veröffentlicht
am 22. Juni 2000). Auf Formulierungen für pharmazeutische Mittel, die
als freie Säuren
oder freie Basen ionisierbar sind, wird in der folgenden Veröffentlichung
Bezug genommen: WO 01/37820 (veröffentlicht
am 31. Mai 2001).
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf bestimmte 3-Pyrrol-substituierte 2-Indolinonverbindungen
gerichtet, die PK-modulierende Fähigkeit
aufweisen und daher bei der Behandlung von Störungen, die mit abnormaler PK-Aktivität in Verbindung
stehen, nützlich
sind.
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Demgemäß bezieht
sich die vorliegende Erfindung in einem Aspekt auf ein 3-Pyrrolsubstituiertes
2-Indolinon der Formel (I):
worin:
R
1 aus
Wasserstoff, (C
1-C
4)-Alkyl,
-(CH
2)
rR
1 6 und -C(O)NR
8R
9 ausgewählt ist;
R
2 aus Wasserstoff, Halogen, Aryl und -S(O)
2NR
13R
14 ausgewählt ist;
R
3 aus Wasserstoff, (C
1-C
4)-Alkyl, (C
1-C
4)-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R
1 5 ausgewählt ist;
R
4 Wasserstoff ist;
R
5 aus
Wasserstoff und (C
1-C
4)-Alkyl
ausgewählt
ist;
R
6 -C(O)R
10 ist;
R
7 aus Wasserstoff, (C
1-C
4)-Alkyl und Aryl ausgewählt ist;
R
8 und
R
9 unabhängig
aus Wasserstoff, Alkyl und Aryl ausgewählt sind;
R
10 -N(R
11)(CH
2)
nR
12 ist, worin n 1, 2 oder 3 ist, R
11 Wasserstoff ist und R
12 aus
Hydroxy, (C
1-C
4)-Alkoxy, -C(O)R
15, Heteroaryl und -NR
13R
14 ausgewählt
ist;
R
13 und R
14 unabhängig aus
der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C
1-C
4)-Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Heteroaryl,
ausgewählt
sind; oder
R
13 und R
14 unter
Bildung einer Heterocyclogruppe verbunden sein können;
R
15 aus
der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C
1-C
4)-Alkoxy und Aryloxy, ausgewählt ist;
R
16 aus Hydroxy und -C(O)R
15 ausgewählt ist;
und
r 2 oder 3 ist;
oder ein pharmazeutisch akzeptables
Salz davon.
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In
einem zweiten Aspekt ist diese Erfindung auf eine pharmazeutische
Zusammensetzung gerichtet, die eine oder mehrere Verbindungen der
Formel (I) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und einen
pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff
umfaßt.
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In
einem dritten Aspekt ist diese Erfindung auf die Verwendung einer
Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen
Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
einer mit Proteinkinase in Verbindung stehenden Störung in
einem Organismus, insbesondere bei Menschen, gerichtet. Solche Störungen umfassen
beispielsweise und ohne Einschränkung
Krebs, Diabetes, Leberzirrhose, kardiovaskuläre Krankheiten wie Atherosklerose,
Angiogenenese, immunologische Krankheiten wie die Autoimmunkrankheit
und Lebererkrankungen.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Definitionen
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Sofern
nicht anders angegeben haben die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Ausdrücke die
nachstehend angegebenen Bedeutungen:
„Alkyl" bezieht sich auf einen gesättigten
aliphatischen Kohlenwasserstoffrest, der geradkettige und verzweigtkettige
Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfaßt. Beispiele für Alkylgruppen
umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl oder
tert-Butyl und dergleichen. Die Alkylgruppe ist unsubstituiert.
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„Cycloalkyl" bezieht sich auf
einen 3- bis 8gliedrigen monocyclischen vollständig aus Kohlenstoff bestehenden
Ring, einen kondensierten bicyclischen 5gliedrigen/6gliedrigen oder
6gliedrigen/6gliedrigen vollständig
aus Kohlenstoff bestehenden Ring oder eine multicycli sche kondensierte
Ringgruppe (unter einem „kondensierten" Ringsystem ist zu
verstehen, daß jeder
Ring in dem System ein nachbarständiges
Paar Kohlenstoffatome mit jedem anderen Ring in dem System teilt),
in der ein oder mehrere Ringe eine oder mehrere Doppelbindungen
enthalten kann/können,
einer der Ringe jedoch ein komplett konjugiertes pi-Elektronensystem
aufweist.
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Beispiele
für Cycloalkylgruppen
sind ohne Einschränkung
Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Cyclohexadien,
Adamantan, Cycloheptan, Cycloheptatrien und dergleichen. Die Cycloalkylgruppe
ist unsubstituiert.
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„Aryl" bezieht sich auf
vollständig
aus Kohlenstoff bestehende monocyclische oder ringkondensierte polycyclische
Gruppen (d. h., Ringe, die nachbarständige Kohlenstoffatompaare
teilen) mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen mit einem komplett konjugierten
pi-Elektronensystem. Beispiele für
Arylgruppen sind ohne Einschränkung
Phenyl, Naphthalenyl und Anthracenyl. Die Arylgruppe kann substituiert
oder unsubstituiert sein. Sofern substituiert, ist die Arylgruppe
mit ein oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Trihalogenalkyl,
Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Dialkylamino, Carboxy
oder N-Sulfonamido, substituiert.
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„Heteroaryl" bezieht sich auf
eine Gruppe monocyclischer oder kondensierter Ringe (d. h., Ringe,
die nachbarständige
Atompaare teilen) mit 5 bis 12 Ringatomen, die ein, zwei oder drei
Ringheteroatome, ausgewählt
aus N, O oder S, enthalten, wobei die verbleibenden Ringatome C
sind, und überdies
ein komplett konjugiertes pi-Elektronensystem aufweisen. Beispiele
für unsubstituierte
Heteroarylgruppen sind ohne Einschränkung Pyrrol, Furan, Thiophen,
Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin,
Isochinolin, Purin und Carbazol. Die Heteroarylgruppe kann substituiert
oder unsubstituiert sein. Sofern substituiert, ist die Heteroarylgruppe
gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus
Halogen, Alkyl, Trihalogenalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido,
Mono- oder Dialkylamino, Carboxy oder N-Sulfonamido, substituiert.
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Unter „Heterocyclus" ist ein gesättigter
cyclischer Rest mit 3 bis 8 Ringatomen zu verstehen, worin ein oder
zwei Ringatome Heteroatome, ausgewählt aus N, O oder S(O)n (worin n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), sind,
wobei die verbleibenden Ringatome C sind, worin ein oder zwei C-Atome
gegebenenfalls durch eine Carbonylgruppe ersetzt sein können. Genauer
gesagt umfaßt
der Ausdruck Heterocyclyl Tetrahydropyranyl, 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan,
Piperidino, N-Methylpiperidin-3-yl, Piperazino, N-Methylpyrrolidin-3-yl,
3-Pyrrolidino, Morpholino, Thiomorpholino, Thiomorpholino-1-oxid,
Thiomorpholino-1,1-dioxid, 4-Ethyloxycarbonylpiperazino, 3-Oxopiperazino,
2-Imidazolidon, 2-Pyrrolidinon, 2-Oxohomopiperazino, Tetrahydropyrimidin-2-on
und deren Derivate, sind aber nicht darauf beschränkt. Die
Heterocyclusgruppe ist gegebenenfalls substituiert mit einem oder
zwei Substituenten, unabhängig
ausgewählt
aus Halogen, Alkyl, Alkyl, substituiert mit Carboxy, oder Ester,
Hydroxy, Mono- oder Dialkylamino.
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„Hydroxy" bezieht sich auf
eine -OH-Gruppe.
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„Alkoxy" bezieht sich sowohl
auf eine -O-(unsubstituiertes Alkyl)- als auch eine -O-(unsubstituiertes Cycloalkyl)-Gruppe.
Repräsentative
Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Methoxy, Ethoxy, Propoxy,
Butoxy, Cyclopropyloxy, Cyclobutyloxy, Cyclopentyloxy, Cyclohexyloxy
und dergleichen.
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„Aryloxy" bezieht sich sowohl
auf eine -O-Aryl- als auch eine -O-Heteroarylgruppe, wie hierin
definiert. Repräsentative
Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phenoxy, Pyridinyloxy,
Furanyloxy, Thienyloxy, Pyrimidinyloxy, Pyrazinyloxy und dergleichen,
und deren Derivate.
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„Mercapto" bezieht sich auf
eine -SH-Gruppe.
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„Ester" bezieht sich auf
eine -C(O)O-R"-Gruppe,
worin R" aus der
Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus Alkyl, Trihalogenmethyl, Cycloalkyl, gegebenenfalls
substituiertem Aryl, gegebenenfalls substituiertem Heteroaryl (gebunden
durch einen Ringkohlenstoff).
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„Halogen-"gruppe bezieht sich
auf Fluor, Chlor, Brom oder Iod, bevorzugt Fluor oder Chlor.
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„Trihalogenmethyl-"gruppe bezieht sich
auf eine -CX3-Gruppe, worin X eine Halogengruppe
ist, wie hierin definiert.
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„Cyano" bezieht sich auf
eine -CN-Gruppe.
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„N-Sulfonamido" bezieht sich auf
eine -NR18S(O)2R19-Gruppe, wobei R18 und
R19 wie hierin definiert sind.
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„N-Amido" bezieht sich auf
eine R19C(O)NR19-Gruppe,
wobei R1 8 und R19 wie hierin definiert sind.
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R18 und R19 sind unabhängig aus
Wasserstoff und Alkyl ausgewählt.
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Die
Ausdrücke „ 2-Indolinon", „Indolin-2-on" und „ 2-Oxindol" werden hierin austauschbar
in bezug auf ein Molekül
mit der folgenden chemischen Struktur verwendet:
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Der
Ausdruck „Pyrrol" bezieht sich auf
ein Molekül
mit der folgenden chemischen Struktur:
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Die
Ausdrücke „Pyrrol-substituiertes
2-Indolinon" und „ 3-Pyrrolidinyl-2-indolinon" werden hierin austauschbar
in bezug auf eine chemische Verbindung mit der in Formel (I) gezeigten
allgemeinen Struktur verwendet.
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Verbindungen,
die dieselbe molekulare Formel haben, sich aber im Wesen und der
Bindungsfolge ihrer Atome oder der Anordnung ihrer Atome im Raum
unterscheiden, werden „Isomere" genannt. Isomere,
die sich in bezug auf die Anordnung ihrer Atome im Raum unterscheiden,
werden „Stereoisomere" genannt. Stereoisomere,
die keine Spiegelbilder voneinander sind, werden „Diastereomere" genannt und die,
die keine deckungsgleichen Spiegelbilder voneinander sind, werden „Enantiomere" genannt. Hat eine
Verbindung ein asymmetrisches Zentrum, ist sie beispielsweise an
vier unterschiedliche Gruppen gebunden, ist ein Paar von Enantiomeren
möglich.
Ein Enantiomer kann durch die absolute Konfiguration seines asymmetrischen
Zentrums gekennzeichnet sein, und wird durch die R- und S-Sequenzregeln
von Cahn und Prelog oder durch die Art und Weise, in der das Molekül die Ebene
von polarisiertem Licht dreht, beschrieben und als rechtsdrehend oder
linksdrehend (d. h., als (+)- bzw. (–)-Isomere) bezeichnet. Eine chirale Verbindung
kann entweder als ein einzelnes Enantiomer oder als ein Gemisch
davon vorliegen. Ein Gemisch, enthaltend gleiche Anteile der Enantiomere,
wird „racemisches
Gemisch" genannt.
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Die
Verbindungen dieser Erfindung können
ein oder mehrere asymmetrische Zentren besitzen; solche Verbindungen
können
daher als einzelne (R)- oder (S)-Stereoisomere oder als Gemische
davon hergestellt werden. Sofern nicht anders angegeben, soll die
Beschreibung oder Namensgebung einer bestimmten Verbindung in der
Beschreibung und den Ansprüchen
sowohl einzelne Enantiomere und Gemische, racemisch oder anderweitig,
davon umfassen. Die Verfahren zur Bestimmung der Stereochemie und
der Trennung von Stereoisomeren sind in der Technik allgemein bekannt
(siehe Erörterung
in Kapitel 4 von „Advanced
Organic Chemistry",
4. Aufl., J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
das Phänomen
von Tautomerie und struktureller Isomerie zeigen. Beispielsweise
können
die hierin beschriebenen Verbindungen eine E- oder Z-Konfiguration über die Doppelbindung,
die die 2-Indolinoneinheit mit der Pyrroleinheit verbindet, annehmen,
oder sie können
ein Gemisch aus E und Z sein. Diese Erfindung umfaßt jede
tautomere oder strukturell isomere Form und Gemische davon, die
die Fähigkeit
besitzt, RTK-, CTK- und/oder STK-Aktivität zu modulieren, und ist nicht
auf eine tautomere oder strukturell isomere Form beschränkt.
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Eine „pharmazeutische
Zusammensetzung" bezieht
sich auf ein Gemisch aus einer oder mehreren der hierin beschriebenen
Verbindungen oder physiologisch/pharmazeutisch akzeptabler Salze
oder Prodrugs davon, mit anderen chemischen Komponenten wie physiologisch/pharmazeutisch
akzeptablen Trägern
und Bindemitteln. Der Zweck einer pharmazeutischen Zusammensetzung
ist es, die Verabreichung einer Verbindung an einen Organismus zu
erleichtern.
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Die
Verbindung der Formel (I) kann auch als ein Prodrug dienen. Ein „Prodrug" bezieht sich auf
ein Mittel, das in-vivo in das Stammarzneimittel umgewandelt wird.
Prodrugs sind oftmals nützlich,
da sie in einigen Situationen leichter zu verabreichen sind als
das Stammarzneimittel. Sie können
zum Beispiel durch orale Verabreichung bioverfügbar sein, was das Stammarzneimittel
andererseits nicht ist. Das Prodrug kann gegenüber dem Stammarzneimittel in
pharmazeutischen Zusammensetzungen auch besser löslich sein. Ein Beispiel eines
Prodrugs wäre
ohne Einschränkung
eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, die als ein Ester (das „Prodrug") verabreicht wird,
um die Übermittlung
durch eine Zellmembran zu erleichtern, wo Wasserlöslichkeit für die Mobilität schädlich ist,
dann aber in der Zelle metabolisch in eine Carbonsäure, die
aktive Komponente, hydrolysiert wird, wo die Wasserlöslichkeit
von Vorteil ist.
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Ein
weiteres Beispiel für
ein Prodrug kann ein kurzes Polypeptid sein, zum Beispiel, ohne
Einschränkung
darauf, ein Polypeptid aus 2–10
Aminosäuren,
gebunden mittels einer terminalen Aminogruppe an eine Carboxygruppe
einer Verbindung dieser Erfindung, worin das Polypeptid in-vivo
hydrolysiert oder metabolisiert wird, um so das aktive Molekül freizusetzen.
Die Prodrugs einer Verbindung der Formel (I) liegen im Umfang dieser
Erfindung.
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Überdies
wird in Betracht gezogen, daß eine
Verbindung der Formel (I) durch Enzyme im Körper des Organismus wie dem
des Menschen unter Erzeugung eines Metaboliten, der die Aktivität der Proteinkinasen modulieren
kann, metabolisiert wird. Solche Metabolite liegen im Umfang der
vorliegenden Erfindung.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich ein „physiologisch/pharmazeutisch
akzeptabler Träger" auf einen Träger oder
ein Verdünnungsmittel,
der/das keine signifikante Irritation für einen Organismus hervorruft
und die biologische Aktivität
und Eigenschaften der verabreichten Verbindung nicht aufhebt.
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Ein „pharmazeutisch
akzeptables Bindemittel" bezieht
sich auf eine inerte Substanz, die einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur weiteren Erleichterung der Verabreichung einer Verbindung zugegeben wird.
Beispiele für
Bindemittel umfassen ohne Einschränkung darauf Calciumcarbonat,
Calciumphosphat, verschiedene Zucker und Arten von Stärke, Cellulosederivate,
Gelatine, pflanzliche Öle
und Polyethylenglycole.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich „pharmazeutisch
akzeptables Salz" auf
die Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der
Stammverbindung erhalten. Solche Salze umfassen:
- (i)
Säureadditionssalz,
erhalten durch die Umsetzung der freien Base der Stammverbindung
mit anorganischen Säuren
wie Salzsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Salpetersäure,
Phosphorsäure,
Schwefelsäure
und Perchlorsäure
und dergleichen, oder mit organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, (D)-
oder (L)-Äpfelsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure oder
Malonsäure
und dergleichen, bevorzugt Salzsäure
oder (L)-Äpfelsäure wie
das L-Malatsalz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid;
oder
- (ii) Salze, gebildet, wenn ein saures Proton in der Stammverbindung
entweder durch ein Metallion, z. B. ein Alkalimetallion, ein Erdalkalimetallion
oder ein Aluminiumion, ersetzt wird, oder mit einer organischen
Base wie Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Tromethamin,
N-Methylglucamin und dergleichen koordiniert.
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„PK" bezieht sich auf
Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen (RTKs), Nicht-Rezeptor- oder „zelluläre" Tyrosinkinasen (CTKs)
und Serin-Threoninkinasen (STKs).
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„Verfahren" bezieht sich auf
Weisen, Mittel, Techniken und Vorgänge zur Erfüllung einer gegebenen Aufgabe,
einschließlich,
aber ohne Einschränkung
auf die Weisen, Mittel, Techniken und Vorgänge die entweder bekannt sind
oder ohne weiteres aus bekannten Weisen, Mitteln, Techniken und
Vorgängen
und Verfahren von praktizierenden Chemikern, Pharmazeutikern, Biologen,
Biochemikern und Medizinern entwickelt werden können.
-
„Modulierung" oder „Modulieren" bezieht sich auf
die Veränderung
der katalytischen Aktivität
von RTKs, CTKs und STKs. Insbesondere bezieht sich modulieren auf
die Aktivierung der katalytischen Aktivität von RTKs, CTKs und STKs,
bevorzugt die Aktivierung oder Inhibierung der katalytischen Aktivität von RTKs,
CTKs und STKs, in Abhängigkeit
der Konzentration der Verbindung oder des Salzes, denen die RTK,
CTK oder STK ausgesetzt ist oder stärker bevorzugt die Inhibierung
der katalytischen Aktivität
von RTKs, CTKs und STKs.
-
„Katalytische
Aktivität" bezieht sich auf
die Phosphorylierungsrate von Tyrosin unter dem direkten oder indirekten
Einfluß von
RTKs und/oder CTKs oder die Phosphorylierung von Serin und Threonin
unter dem direkten oder indirekten Einfluß von von STKs.
-
„Kontaktierung" bezieht sich auf
das Inkontaktbringen einer Verbindung dieser Erfindung und einer Ziel-PK
auf eine Art und Weise, daß die
Verbindung die katalytische Aktivität der PK, entweder direkt,
d. h., durch die Interaktion mit der Kinase selbst, oder indirekt,
d. h., durch die Interaktion mit einem anderen Molekül, von dem
die katalytische Aktivität
der Kinase abhängt,
beeinflussen kann. Eine solche „Kontaktierung" kann „in-vitro", d. h., in einem
Teströhrchen,
einer Petrischale oder dergleichen bewirkt werden. In einem Teströhrchen kann
die Kontaktierung auch nur eine Verbindung und eine in Frage kommende
PK oder ganze Zellen umfassen. Zellen können auch in Zellkulturschalen
gehalten und herangezogen werden und mit einer Verbindung in dieser
Umgebung kontaktiert werden. In diesem Zusammenhang kann die Fähigkeit
einer bestimmten Verbindung, eine PK-bezogene Störung zu beeinflussen, das heißt, der
IC50 der Verbindung, nachstehend definiert,
bestimmt werden, bevor eine Verwendung der Verbindungen in-vivo
mit komplexeren lebenden Organismen ausprobiert wird. Für Zellen
außerhalb
des Organismus existieren mehrere Verfahren, die einem Fachmann
allgemein bekannt sind, mit denen die PKs mit den Verbindungen in
Kontakt gebracht werden können, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf direkte Zellmikroinjektion und zahlreiche Transmembranträgertechniken.
-
„In-vitro" bezieht sich auf
Verfahren, die in einer künstlichen
Umgebung durchgeführt
werden, wie beispielsweise in einem Teströhrchen oder einem Kulturmedium,
sind aber nicht darauf beschränkt.
-
„In-vivo" bezieht sich auf
Verfahren, die in einem lebenden Organismus durchgeführt werden,
wie einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen, sind aber nicht
darauf beschränkt.
-
„PK-bezogene
Störung", „PK-gesteuerte
Störung" und „abnormale
PK-Aktivität" beziehen sich alle
auf einen Zustand, der durch unangemessene, d. h., katalytische
PK-Unteraktivität
oder üblicher
PK-Überaktivität gekennzeichnet
ist, wobei die betreffende PK eine RTK, CTK oder STK sein kann.
Eine unangemessene katalytische Aktivität kann im Ergebnis entweder:
(1) PK-Expression in Zellen, die normalerweise keine PKs exprimieren,
(2) gesteigerte PK- Expression,
die zu unerwünschter
Zellproliferation, -differenzierung und/oder -wachstum führt, oder
(3) verringerte PK-Expression, die zu unerwünschten Verringerungen der
Zellproliferation, -differenzierung und/oder -wachstum führt, entstehen. Überaktivität einer
PK bezieht sich entweder auf die Amplifizierung des Gens, das eine
bestimmte PK kodiert, oder die Erzeugung eines Niveaus an PK-Aktivität, das mit
einer Zellproliferations-, -differenzierungs- und/oder -wachstumsstörung korreliert
(das heißt,
wenn das Niveau der PK steigt, verstärkt sich die Schwere eines
oder mehrerer der Symptome der zellulären Störung). Unteraktivität ist natürlich das
Gegenteil, wobei die Schwere von einem oder mehreren Symptomen einer
zellulären
Störung
steigt, wenn das Niveau der PK-Aktivität sinkt.
-
„Behandelt", „Behandeln" und „Behandlung" beziehen sich auf
Verfahren zur Linderung oder Aufhebung einer PK-vermittelten zellulären Störung und/oder
ihrer Begleitsymptome. Insbesondere in bezug auf Krebs bedeuten
diese Ausdrücke
einfach nur, daß die
Lebenserwartung eines von Krebs befallenen Individuums steigen wird,
oder daß ein
oder mehrere Symptome dieser Krankheit verringert werden.
-
„Organismus" bezieht sich auf
irgendein Lebewesen, das mindestens aus einer Zelle besteht. Ein
lebender Organismus kann zum Beispiel so einfach wie eine einzelne
eukariotische Zelle oder so komplex wie ein Säuger, einschließlich eines
Menschen, sein.
-
„Therapeutisch
wirksame Menge" bezieht
sich auf die Menge der zu verabreichenden Verbindung, die zu einem
gewissen Ausmaß ein
oder mehrere Symptome der zu behandelnden Störung lindert. Bezogen auf die
Behandlung von Krebs bezieht sich eine therapeutisch wirksame Menge
auf die Menge, die folgendermaßen
wirkt:
- (1) die Größe des Tumors verringert;
- (2) Tumormetastasen inhibiert (das heißt, diese in einem gewissen
Ausmaß verlangsamt,
bevorzugt stoppt);
- (3) das Tumorwachstum in einem gewissen Ausmaß inhibiert
(das heißt,
dies in einem gewissen Ausmaß verlangsamt,
bevorzugt stoppt) und/oder,
- (4) ein oder mehrere Symptome, die mit Krebs in Verbindung stehen,
zu einem gewissen Ausmaß lindert (oder
bevorzugt eliminiert).
-
„Überwachung" bedeutet die Beobachtung
oder den Nachweis der Wirkung der Kontaktierung einer Verbindung
mit einer Zelle, die eine bestimmte PK exprimiert. Die beobachtete
oder detektierte Wirkung kann eine Veränderung des Zellphenotyps,
der katalytischen Aktivität
einer PK oder eine Veränderdung
der Interaktion einer PK mit einem natürlichen Bindungspartner sein.
Techniken zur Beobachtung oder Detektion solcher Wirkungen sind
in der Technik allgemein bekannt.
-
Die
angesprochene Wirkung ist ausgewählt
aus einer Veränderung
oder keiner Veränderung
des Zellphenotyps, einer Veränderung
oder keiner Veränderung
der katalytischen Aktivität
der Proteinkinase oder einer Veränderung
oder keiner Veränderung
der Interaktion der Proteinkinase mit einem natürlichen Bindungspartner in
einem letzten Aspekt dieser Erfindung.
-
„Zellphenotyp" bezieht sich auf
die äußerliche
Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes oder die biologische
Funktion der Zelle oder des Gewebes. Beispiele für einen Zellphenotyp sind Zellgröße, Zellwachstum,
Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zellüberleben, Apoptose und Nährstoffaufnahme
und Verwendung, jedoch ohne Beschränkung darauf. Solche phenotypischen
Merkmale sind durch in der Technik allgemein bekannte Techniken
meßbar.
-
„Natürlicher
Bindungspartner" bezieht
sich auf ein Polypeptid, das an eine bestimmte PK in einer Zelle bindet.
Natürliche
Bindungspartner können
eine Rolle bei der Verbreitung eines Signals in einem PK-vermittelten
Signaltransduktionsprozeß spielen.
Eine Veränderung
der Interaktion des natürlichen
Bindungspartners mit der PK kann sich selbst als eine höhere oder
geringere Konzentration des PK/Natürlicher Bindungspartner-Komplexes
und infolgedessen, in einer beobachtbare Veränderung der Fähigkeit
der PK, die Signaltransduktion zu vermitteln, manifestieren.
-
Repräsentative
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in der nachstehenden
Tabelle I gezeigt.
-
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-
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-
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Die
Nummern der Verbindungen entsprechen den Nummern der Beispiele im
Beispielabschnitt. Daß heißt, die
Synthese von Verbindung 1 in Tabelle 1 wird in Beispiel 1 beschrieben.
Die in Tabelle 1 dargestellten Verbindungen sind nur beispielhaft
und sollen den Umfang dieser Erfindung in keinster Weise einschränken.
-
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Während die
breiteste Definition in der Zusammenfassung der Erfindung dargelegt
wird, sind bestimmte Verbindungen der Formel (I), die nachstehend
dargelegt werden, bevorzugt.
- (1) Eine bevorzugte
Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin R1,
R3 und R4 Wasserstoff
sind.
- (2) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel
(I) ist die, worin R1, R2 und
R4 Wasserstoff sind.
- (3) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel
(I) ist die, worin R1, R2 und
R3 Wasserstoff sind.
- (4) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel
(I) ist die, worin R2, R3 und
R4 Wasserstoff sind.
- (5) Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel
(I) ist die, worin R1, R2,
R3 und R4 Wasserstoff
sind.
- (6) Eine weitere, noch stärker
bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, worin:
R1 Wasserstoff, Alkyl, -C(O)NR8R9, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl,
insbesondere Wasserstoff, ist;
R2 Wasserstoff,
Chlor, Brom, Fluor, Phenyl, Dimethylaminosulfonyl, 3-Chlorphenylaminosulfonyl,
Aminosulfonyl, Methylaminosulfonyl, Phenylaminosulfonyl, Pyridin-3-yl-aminosulfonyl,
Dimethylaminosulfonyl, Isopropylamino-sulfonyl, vorzugsweise Wasserstoff,
Fluor oder Brom, ist;
R3 Wasserstoff,
Methoxy, Carboxy, Phenyl, Pyridin-3-yl, 3,4-Dichlorphenyl, 4-n-Butylphenyl,
3-Isopropylphenyl, vorzugsweise Wasserstoff oder Phenyl, ist; und
R4 Wasserstoff ist.
- In der obigen bevorzugten Gruppe (6) ist eine stärker bevorzugte
Gruppe von Verbindungen die, worin:
R5 Wasserstoff,
Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl oder n-Butyl, vorzugsweise
Wasserstoff oder Methyl, ist; und
R7 Wasserstoff,
Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, vorzugsweise
Methyl, Wasserstoff oder Phenyl, ist.
- (7) Eine weitere gegenwärtig
bevorzugte Ausführungsform
dieser Erfindung ist eine Verbindung mit einer Struktur, wie oben
beschrieben, worin R13 und R14 unabhängig aus
der Gruppe ausgewählt
sind, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Heteroaryl und, kombiniert,
-(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2O(CH2)2- oder -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
-
NUTZEN
-
Die
PKs, deren katalytische Aktivität
von den Verbindungen dieser Erfindung moduliert wird, umfassen Protein-Tyrosinkinasen,
von denen es zwei Arten gibt, Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) und
zelluläre
Tyrosinkinasen (CTKs), und Serin-Threoninkinasen (STKs). Die RTK-vermittelte
Signaltransduktion wird durch die extrazelluläre Interaktion mit einem spezifischen
Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von der Rezeptordimerisierung,
vorübergehender
Stimulierung der intrinsischen Protein-Tyrosinkinase-Aktivität und Phosphorylierung.
Dadurch werden Bindungsstellen für
intrazelluläre
Signaltransduktionsmoleküle
erzeugt, die zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum zytoplasmischer
Signalmoleküle
führen,
die die entsprechende Zellantwort erleichtern (z. B. Zellteilung,
metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung usw.). Siehe,
Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 303–391.
-
Es
ist gezeigt worden, daß Tyrosinphosphorylierungsstellen
auf Wachstumsfaktorrezeptoren als hochaffine Bindungsstellen für SH2-Domänen (src-Homologie)
von Signalmolekülen
fungieren. Fantl et. al., 1992, Cell 69: 413–423, Songyang et. al., 1994,
Mol. Cell. Biol. 14: 2777–2785,
Songyang et. al., 1993, Cell 72: 767–778, und Koch et. al., 1991,
Science 252: 668–678.
Mehrere intrazelluläre
Substratproteine, die mit RTKs assoziieren, sind identifiziert worden.
Diese können
in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: (1) Substrate, die eine
katalytische Domäne
aufweisen, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt,
die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren.
Songyang et al., 1993, Cell 72: 767–778. Die Spezifität der Interaktionen
zwischen Rezeptoren und SH2-Domänen
ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste, die den phosphorylierten
Tyrosinrest unverzüglich
umgeben, bestimmt. Differenzen in den Bindungsaffinitäten zwischen
SH2-Domänen
und den Aminosäuresequenzen,
die die Phosphotyrosinreste auf bestimmten Rezeptoren umgeben, stimmen
mit den beobachteten Differenzen in ihren Substratphosphorylierungsprofilen überein.
Songyang et. al., 1993, Cell 72: 767–778. Die Beobachtungen lassen
darauf schließen,
daß die Funktion
jeder RTK nicht nur durch ihr Expressionsmuster und die Ligandenverfügbarkeit,
sondern auch durch die Anordnung der nachgeordneten Signaltransduktionswege,
die von einem bestimmten Rezeptor aktiviert werden, bestimmt wird.
Daher liefert die Phosphorylierung einen wichtigen Regulierungsschritt,
der die Selektivität
von Signalwegen, die von speziellen Wachstumsfaktorrezeptoren sowie
Differenzierungsfaktorrezeptoren rekrutiert werden, bestimmt.
-
STKs,
die überwiegend
zytosolisch sind, beeinflussen die interne Biochemie der Zelle,
oftmals als eine nachgeordnete Antwort auf ein PTK-Ereignis. STKs
sind am Signalgebungsprozeß beteiligt
gewesen, der die DNA-Synthese und die anschließend Mitose initiiert, was
zur Zellproliferation führt.
-
Daher
führt die
PK-Signaltransduktion, abgesehen von anderen Reaktionen, zur Zellproliferation,
-differenzierung, -wachstum und -metabolismus. Abnormale Zellproliferation
kann zu einer Vielzahl von Störungen
und Krankheiten führen,
einschließlich
der Entwicklung von Neoplasie wie Karzinom, Sarkom, Glioblastom und
Hämangiom,
Störungen
wie Leukämie,
Psoriasis, Arteriosklerose, Arthritis und diabetischer Retinopathie, und
anderen Störungen,
die mit unkontrollierter Angiogenese und/oder Vaskulogenese in Verbindung
stehen.
-
Zur
Praktizierung der vorliegenden Erfindung ist ein genaues Verständnis des
Mechanismus, durch den die Verbindungen dieser Erfindung PKs inhibieren,
nicht erforderlich. Ohne sich jedoch hierdurch an einen bestimmten
Mechanismus oder eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird angenommen,
daß die
Verbindungen mit den Aminosäuren
in der katalytischen Region der PKs interagieren. PKs besitzen typischerweise eine
bilobäre
Struktur, in der ATP scheinbar an den Spalt zwischen den beiden
Lobi einer Region, wo die Aminosäuren
unter PKs konserviert sind, binden. Es wird angenommen, daß Inhibitoren
der PKs durch nicht-kovalente
Interaktionen wie Wasserstoffbindung, Van-der-Waals-Kräfte und
ionische Interaktionen in derselben gemeinsamen Region, in der das
vorgenannte ATP an die PKs bindet, binden. Genauer gesagt glaubt
man, daß die
2-Indolinonkomponente der Verbindungen dieser Erfindung in dem gemeinsamen
Raum, der normalerweise vom Adeninring von ATP eingenommen wird,
bindet. Die Spezifität
eines bestimmten Moleküls
für eine
bestimmte PK kann dann als ein Ergebnis zusätzlicher Interaktionen zwischen
den verschiedenen Substituenten an dem 2-Indolinonkern und den Aminosäuredomänen, die
für bestimmte
PKs spezifisch sind, hervorgehen. Daher können unterschiedliche Indolinonsubstituenten
an der bevorzugten Bindung an bestimmte PKs beteiligt sein. Die
Fähigkeit
zur Auswahl von Verbindungen, die an unterschiedlichen ATP-(oder
anderen Nukleotid-)Bindungsstellen aktiv sind, macht die Verbindungen
dieser Erfindung zur Targetierung irgendeines Proteins mit einer
solchen Stelle nützlich.
Die hierin offenbarten Verbindungen sind daher in In-vitro-Assays
für solche
Proteine von Nutzen, und zeigen zudem in-vivo therapeutische Wirkungen
durch die Interaktion mit solchen Proteinen.
-
Überdies
liefern die Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen therapeutischen
Ansatz zur Behandlung vieler Arten fester Tumore, einschließlich, aber
ohne Beschränkung
auf Karzinome, Sarkome, einschließlich Kaposi-Sarkom, Erythroblastom,
Glioblastom, Meningiom, Astrozytom, Melanom und Myoblastom. Die
Behandlung oder Vorbeugung von nicht solidem Tumorkrebs wie Leukämie werden
von dieser Erfindung ebenso erfaßt. Indikationen können Gehirnkrebs,
Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, Darmkrebs,
Blutkrebs, Lungenkrebs und Knochenkrebs umfassen, sind aber nicht
darauf beschränkt.
-
Weitere
Beispiele für
Arten von Störungen,
die mit einer unangemessenen PK-Aktivität verbunden sind, bei denen
die hierin beschriebenen Verbindungen nützlicherweise zur Verhinde rung,
Behandlung und Untersuchung verwendet werden können, sind Zellproliferationsstörungen,
fibrotische Störungen
und metabolische Störungen,
sind aber nicht darauf beschränkt.
-
Zellproliferative
Störungen,
die durch die vorliegende Erfindung verhindert, behandelt oder weiter
untersucht werden können,
umfassen Krebs, proliferative Störungen
der Blutgefäße und proliferative
Störungen von
Mesangiumzellen.
-
Proliferative
Störungen
der Blutgefäße beziehen
sich auf Störungen,
die mit abnormaler Vaskulogenese (Blutgefäßbildung) und Angiogenese (Verbreitung
der Blutgefäße) verbunden
sind. Während
Vaskulogenese und Angiogenese wichtige Rollen in einer Vielzahl
normaler physiologischer Prozesse wie der Embryoentwicklung, Gelbkörperbildung,
Wundheilung und Organregeneration spielen, spielen sie auch eine
Schlüsselrolle
bei der Krebsentwicklung, wo sie zur Bildung neuer Kapillaren führen, die
zur Lebenderhaltung eines Tumors notwendig sind. Andere Beispiele
für proliferative
Störungen
der Blutgefäße umfassen
Arthritis, wo neue Kapillarblutgefäße in das Gelenkt eindringen
und den Knorpel zerstören,
und Augenerkrankungen wie diabetische Retinopathie, wo neue Kapillaren
in der Retina in den Glaskörper
eindringen, bluten und zur Erblindung führen.
-
Zwei
strukturell verwandte RTKs binden nachgewiesenermaßen VEGF
mit einer hohen Affinität:
der fms-like Tyrosin 1-Rezeptor (fit-1) (Shibuya et. al., 1990,
Oncogene, 5: 519–524;
De Vries et. al., 1992, Science, 255: 989–991) und der KDR/FLK-1-Rezeptor,
auch bekannt als VEGF-R2. Es ist berichtet worden, daß der vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor
(VEGF) ein Endothelzellen-spezifisches Mitogen mit In-vitro-Endothelzellwachstums-fördernder
Aktivität
ist. Ferrara & Henzel,
1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851–858; Vaisman et. al., 1990,
J. Biol. Chem., 265: 19461–19566.
Die in US-Anmeldung Ser.-Nr. 08/193,829, 08/038,596 und 07/975,750
gelieferten Informationen lassen eindeutig darauf schließen, daß VEGF nicht
nur für
die Endothelzellproliferation verantwortlich ist, sondern auch der
Hauptregulator normaler und pathologischer Angiogenese ist. Siehe
allgemein Klagsburn & Soker,
1993, Current Biology, 3 (10) 699–702; Houck, et. al., 1992,
J. Biol. Chem., 267: 26031–26037.
-
Normale
Vaskulogenese und Angiogenese spielen wichtige Rollen in einer Vielzahl
physiologischer Prozesse wie der Embryoentwicklung, der Wundheilung,
der Organregeneration und weiblicher Reproduktionsprozesse wie der
Follikelentwicklung im Gelbkörper
während
der Ovulation und dem Plazentawachstum nach einer Schwangerschaft.
Folkman & Shing,
1992, J. Biological Chem., 267 (16): 10931–34. Unkontrollierte Vaskulogenese
und/oder Angiogenese ist mit Krankheiten wie Diabetes sowie mit
malignen soliden Tumoren, die für
ihr Wachstum auf Vaskularisation angewiesen sind, in Verbindung
gebracht worden. Klagsburn & Soker, 1993,
Current Biology, 3 (10): 699–702;
Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82: 4–6; Weidner, et. al., 1991, New
Engl. J. Med., 324: 1–5.
-
Die
mutmaßliche
Rolle von VEGF bei der Endothelzellproliferation und -migration
während
Angiogenese und Vaskulogenese kennzeichnet eine wichtige Rolle für den KDR/FLK-1-Rezeptor in diesen
Prozessen. Krankheiten wie Diabetes mellitus (Folkman, 198, in XI.
Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et. al., Hrsg.),
S. 583–596,
Leuven University Press, Leuven) und Arthritis, sowie malignes Tumorwachstum können aus
unkontrollierter Angiogenese resultieren. Siehe z. B. Folkman, 1971,
N. Engl. J. Med., 285: 1182–1186.
Die Rezeptoren, an die VEGF spezifisch bindet, sind ein wichtiges
und bedeutendes therapeutisches Ziel für die Regulierung und Modulierung
von Vaskulogenese und/oder Angiogenese und einer Vielzahl von schweren
Krankheiten, die abnormales zelluläres Wachstum, das durch diese
Prozesse verursacht wird, umfassen. Plowman, et. al., 1994, DN&P, 7 (6): 334–339. Insbesondere
die hochspezifische Rolle des KDR/FLK-1-Rezeptors bei der Neovaskularisation
macht ihn zu einem Wahlziel therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Krebs
und anderen Krankheiten, die die unkontrollierte Bildung von Blutgefäßen umfassen.
-
Daher
liefert die vorliegende Erfindung Verbindungen, die die Tyrosinkinasesignaltransduktion,
einschließlich
der KDR/FLK-1-Rezeptorsignaltransduktion, zur Inhibierung oder Förderung
der Angiogenese und/oder Vaskulogenese regulieren und/oder modulieren
können,
das heißt,
Verbindungen, die das Signal, transduziert durch KDR/FLK-1, bei
der Aktivierung durch Liganden wie VEGF inhibieren, verhindern oder
mit diesem interferieren. Obgleich davon ausgegangen wird, daß die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung auf einen Rezeptor oder eine andere Komponente
entlang des Tyrosinkinasesignaltransduktionsweges einwirken, können sie
auch direkt auf die Tumorzellen, die aus einer unkontrollierten
Angiogenese resultieren, wirken.
-
Obgleich
sich die Nomenklatur der Mensch- und Maus-Pendants des generischen „flk-I"-Rezeptors unterscheidet, sind sie in
vielen Gesichtspunkten austauschbar. Der Mausrezeptor, Flk-1, und
sein menschliches Pendant, KDR, teilen sich eine Sequenzhomologie
von 93,4 innerhalb der intrazellulären Domäne. Dem ähnlich bindet Maus-FLK-I humanes
VEGF mit derselben Affinität
wie Maus-VEGF und wird dementsprechend durch den Liganden, der aus
einer der beiden Spezies stammt, aktiviert. Millauer et. al., 1993,
Cell, 72: 835–846;
Quinn et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7533–7537. FLK-1
assoziiert auch mit menschlichen RTK-Substraten und Tyrosin phosphoryliert
diese danach (z. B. PLC-γ oder
p85), wenn sie in 293-Zellen coexprimiert werden (humane embryonale
Nierenfibroblasten).
-
Modelle,
die sich auf den FLK-1-Rezeptor verlassen, sind daher direkt zum
Verständnis
des KDR-Rezeptors anwendbar. Beispielsweise ist die Verwendung des
Maus-FLK-1-Rezeptors in Verfahren, die Verbindungen identifizieren,
die den Maus-Signaltransduktionsweg regulieren, direkt für die Identifikation
von Verbindungen, die zur Regulierung des humanen Signaltransduktionsweges
verwendet werden, das heißt,
die Aktivität
in Verbindung mit dem KDR-Rezeptor
regulieren, anwendbar. Daher können
chemische Verbindungen, die als In-vitro-Inhibitoren von KDR/FLK-1 identifiziert
worden sind, in geeigneten In-vivo-Modellen bestätigt werden. Es ist demonstriert
worden, daß sowohl
In-vivo-Maus- als auch -Ratten-Tiermodelle zur Überprüfung des klinischen Potentials
von Mitteln, die auf den KDR/FLK-1-induzierten Signaltransduktionsweg wirken, überaus wertvoll
sind.
-
Daher
liefert die vorliegende Erfindung Verbindungen, die Vaskulogenese
und/oder Angiogenese regulieren, modulieren und/oder inhibieren,
indem sie die enzymatische Aktivität des KDR/FLK-1-Rezeptors beeinflussen
und mit dem von KDR/FLK-1 transduzierten Signal interferieren. Daher
liefert die vorliegende Erfindung einen therapeutischen Ansatz zur
Behandlung vieler Arten solider Tumore, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Glioblastom, Melanom und Kaposi-Sarkom und Eierstock-, Lungen-,
Brust-, Prostata-, Pankreas-, Darm- und Epidermoidkarzinom. Überdies
lassen die Daten darauf schließen,
daß die
Verabreichung von Verbindungen, die den KDR/Flk-1-vermittelten Signaltransduktionsweg
inhibieren, auch bei der Behandlung von Hämangiom, Restenose und diabetischer
Retinopathie genutzt werden kann.
-
Ferner
bezieht sich diese Erfindung auf die Inhibierung von Vaskulogenese
und Angiogenese durch andere Rezeptor-vermittelte Wege, einschließlich des
Weges, der den flt-1-Rezeptor umfaßt.
-
Rezeptor-Tyrosinkinase-vermittelte
Signaltransduktion wird durch die extrazelluläre Interaktion mit einem speziellen
Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von Rezeptordimerisierung,
vorübergehender
Stimulierung der intrinsischen Protein-Tyrosinkinase-Aktivität und Autophosphorylierung.
Dabei werden Bindungsstellen für
intrazelluläre
Signaltransduktionsmoleküle
erzeugt, die zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum zytoplasmischer
Signalmoleküle
führen,
die die entsprechende Zellantwort erleichtern (z. B. Zellteilung,
metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung usw.). Siehe
Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron, 9: 1–20.
-
Die
enge Homologie der intrazellulären
Regionen von KDR/FLK-1 mit der des PDGF-β-Rezeptors (50,3 % Homologie) und/oder
des verwandten flt-1-Rezeptors kennzeichnet die Induktion überlappender
Signaltransduktionswege. Beispielsweise ist für den PDGF-β-Rezeptor gezeigt worden, daß Mitglieder
der src-Familie (Twamley et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90: 7696–7700),
Phosphatidylinositol-3'-kinase
(Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 981–990), Phospholipase cγ (Kashishian & Cooper, 1993,
Mol. Cell. Biol., 4: 49–51),
ras-GTPase-Aktivierungsprotein, (Kashishian et. al., 1992, EMBO
J., 11: 1373–1382),
PTP-ID/syp (Kazlauskas et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
10 90: 6939–6943),
Grb2 (Arvidsson et. al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 6715–6726) und
die Adapter-Moleküle
Shc und Nck (Nishimura et. al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 6889–6896) an
Regionen binden, die unterschiedliche Autophosphorylierungsstellen
umfassen. Siehe allgemein Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor
Res., 5: 37–54.
Daher ist es wahrscheinlich, das Signaltransduktionswege, die durch
KDR/FLK-1 aktiviert werden, den ras-Weg (Rozakis et. al., 1992,
Nature, 360: 689–692),
die PI-3'-Kinase,
die src-vermittelten und die plcγ-vermittelten
Wege umfassen. Jeder dieser Wege kann eine kritische Rolle bei der
angiogenen und/oder vaskulogenen Wirkung von KDR/FLK-1 in Endothelzellen
spielen. Demzufolge bezieht sich ein weiterer Aspekt dieser Erfindung
auf die Verwendung der hierin beschriebenen organischen Verbindungen
zur Modulierung von Angiogenese und Vaskulogenese, wenn solche Prozesse
durch diese Wege kontrolliert werden.
-
Andererseits
sind auch Störungen,
die mit der Schrumpfung, Konzentration oder dem Verschluß von Blutgefäßen in Verbindung
stehen, wie Restenose, einbezogen und können durch die Verfahren dieser
Erfindung behandelt oder verhindert werden.
-
Fibrotische
Störungen
beziehen sich auf die abnormale Bildung extrazellulärer Matrizes.
Beispiele für fibrotische
Störungen
umfassen Leberzirrhose und Mesangiumzellproliferationsstörungen.
Leberzirrhose ist durch den Anstieg extrazellulärer Matrixbestandteile gekennzeichnet,
der zur Bildung eines Leberschadens führt. Eine erhöhte extrazellulärer Matrix,
die zu einem Leberschaden führt,
kann auch durch eine Virusinfektion wie Hepatitis hervorgerufen
werden. Lipozyten scheinen eine Hauptrolle bei Leberzirrhose zu
spielen. Andere fibrotische Störungen
umfassen Atherosklerose.
-
Mesangiumzellproliferationsstörungen beziehen
such auf Störungen,
die durch eine abnormale Proliferation von Mesangiumzellen verursacht
werden. Mesangiumproliferationsstörungen umfassen verschiedene humane
Nierenerkrankungen wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie
und maligne Nephrosklerose sowie Störungen wie thrombotische Mikroangiopathiesyndrome,
Transplantatabstoßung
und Glomerulopathien. Der RTK-PDGFR ist an der Erhaltung der Mesangiumzellproliferation
beteiligt gewesen. Floege et. al., 1993, Kidne International 43:
47S–54S.
-
Viele
Krebsarten sind Zellproliferationsstörungen und wie bereits erwähnt, sind
PKs mit Zellproliferationsstörungen
assoziiert worden. Daher ist es nicht überraschend, daß PKs wie
zum Beispiel die Vertreter der RTK-Familie, mit der Entwicklung
von Krebs in Verbindung gebracht worden sind. Einige dieser Rezeptoren wie
EGFR (Tuzi et. al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227–233, Torp et. al., 1992, APMIS
100: 713–719)
HER2/neu (Slamon et. al., 1989, Science 244: 707–712) und PDGF-R (Kumabe et.
al., 1992, Oncogene, 7: 627–633)
werden in vielen Tumoren überexprimiert
und/oder ständig
durch autokrine Schleifen aktiviert. Tatsächlich sind in den verbreitetsten
und schwersten Krebsarten diese Rezeptorüberexpressionen (Akbasak and
Suner-Akbasak et. al., 1992, J. Neurol. Sci., 111: 119–133, Dickson
et. al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249–273, Korc et. al., 1992, J.
Clin. Invest. 90: 1352–1360)
und autokrinen Schleifen (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.,
118: 1057–1070,
Korc et. al., supra, Akbasak and Suner-Akbasak et. al., supra) demonstriert
worden. Beispielsweise ist EGFR mit Plattenepithelkarzinom, Astrozytom,
Glioblastom, Hals- und Nak kenkrebs, Lungenkrebs und Blasenkrebs
assoziiert worden. HER2 ist mit Brust-, Eierstock-, Magen-, Lungen-,
Pankreas- und Blasenkrebs assoziiert worden. PDGFR ist mit Glioblastom
und Melanom sowie Lungen-, Eierstock- und Prostatakrebs assoziiert
worden. Die RTK c-met ist auch mit maligner Tumorbildung assoziiert
worden. Zum Beispiel ist c-met unter anderem mit Magen-Darm-, Thyroid-,
Pankreas-, Magen- und hepatozellulären Karzinomen und Lymphomen
assoziiert worden. Überdies
ist c-met mit Leukämie
verbunden gewesen. Die Überexpression
des c-met-Gens ist auch bei Patienten mit der Hodgkins-Krankheit
und der Burkitts-Krankheit nachgewiesen worden.
-
Der
IGF-IR ist, neben seiner Mitwirkung bei der Ernährungshilfe und Typ-II-Diabetes,
mit mehreren Krebsarten assoziiert worden. Beispielsweise war IGF-I
als ein autokriner Wachstumsstimulator in mehrere Tumorarten, z.
B. humane Brustkrebskarzinomzellen (Arteaga et. al., 1989, J. Clin.
Invest. 84: 1418–1423)
und kleine Lungentumorzellen (Macauley et. al., 1990, Cancer Res.,
50: 2511–2517),
verwickelt. Überdies
scheint IGF-I, während
er vollständig
in das normale Wachstum und die normale Differenzierung des Nervensystems involviert
ist, auch ein autokriner Stimulator humaner Gliome zu sein. Sandberg-Nordqvist
et. al., 1993, Cancer Res. 53: 2475–2478. Die Wichtigkeit von
IGF-IR und seinen Liganden für
die Zellproliferation wird ferner durch die Tatsache gestützt, daß viele
Zellarten in Kultur (Fibroblasten, Epithelzellen, Glattmuskelzellen,
T-Lymphozyten, Myeloidzellen, Chondrozyten und Osteoblasten (die
Stammzellen des Knochenmarks)) hinsichtlich des Wachstums durch
IGF-I stimuliert werden. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic
Gene Expression, 1: 301–326.
Baserga und Coppola weisen darauf hin, daß IGF-IR eine zentrale Rolle
im Transformationsmechanismus spielt und als solches ein bevorzugtes
Ziel für
therapeutische Interventionen für
ein breites Spektrum humaner Malignitäten sein könnte. Baserga, 1995, Cancer
Res., 55: 249–252,
Baserga, 1994, Cell 79: 927–930,
Coppola et. al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 4588–4595.
-
STKs
haben in vielen Krebsarten mitgewirkt, einschließlich insbesondere Brustkrebs
(Cance, et. al., Int. J. Cancer, 54: 571–77 (1993)).
-
Die
Assoziation zwischen abnormaler PK-Aktivität und Krankheit ist nicht auf
Krebs beschränkt.
Beispielsweise sind RTKs mit Krankheiten wie Psoriasis, Diabetes
mellitus, Endometriose, Angiogenese, atheromatöser Plaqueentwicklung, der
Alzheimer-Krankheit, Reste nose, der von-Hippel-Lindau-Krankheit,
epidermaler Hyperproliferation, neurodegenerativen Krankheiten,
altersbedingter Makuladegeneration und Hämangiomen assoziiert worden.
Beispielsweise hat EGFR bei kornealer und dermaler Wundheilung Indikation.
Defekte in Insulin-R und IGF-1R haben bei Diabetes mellitus Typ
II Indikation. Eine vollständigere
Korrelation zwischen speziellen RTKs und ihren therapeutischen Indikationen
ist in Plowman et. al., 1994, DN&P
7: 334–339 angegeben.
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Wie
bereits erwähnt,
sind nicht nur RTKs sondern auch CTKs einschließlich, aber nicht beschränkt auf src,
abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr und yrk (für einen Überblick
siehe Bolen et. al., 1992, FASEB J., 6: 3403–3409) in den proliferativen
und metabolischen Signaltransduktionsweg involviert, und es ist
daher zu erwarten und gezeigt worden, daß sie in viele PTK-vermittelte
Störungen,
auf die die vorliegende Erfindung gerichtet ist, involviert sind.
Beispielsweise ist gezeigt worden, daß mutiertes src (v-src) ein
Onkoprotein (pp60v-src) in Huhn ist. Überdies überträgt sein
zelluläres
Homologon, das Protoonkogen pp60c-src onkogene
Signale vieler Rezeptoren. Die Überexpression
von EGFR oder HER2/neu in Tumoren führt zur konstitutiven Aktivierung
von pp60c-src, das für maligne Zellen charakteristisch
ist, in normalen Zellen aber fehlt. Auf der anderen Seite zeigen
Mäuse,
die c-src nicht exprimieren, einen osteopetrotischen Phenotyp, der
eine Schlüsselbeteiligung
von c-src bei der Osteoklastenfunktion und eine mögliche Involvierung
in ähnliche
Störungen
anzeigt.
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Dem ähnlich ist
Zap70 an der T-Zellsignalgebung, die sich auf Autoimmunstörungen beziehen,
beteiligt gewesen.
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STKs
sind mit Entzündungen,
Autoimmunkrankheiten, Immunantworten und Hyperproliferationsstörungen wie
Restenose, Fibrose, Psoriasis, Osteoarthritis und Rheumatoidarthritis
assoziiert worden.
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PKs
sind auch an der Embryoimplantation beteiligt gewesen. Daher können die
Verbindungen dieser Erfindung ein effektives Verfahren zur Verhinderung
einer solchen Embryoimplantation liefern und so als Geburtenkontrollmittel
nützlich
sein. Weitere Störungen,
die unter Verwendung der Verbindungen dieser Erfindung behandelt
oder verhindert werden können,
sind immunologische Störungen
wie Autoimmunkrankheiten, AIDS und kardiovaskuläre Störungen wie Atherosklerose.
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Abschließend ist
anzumerken, daß derzeit
vermutet wird, daß RTKs
und CTKs in Hyperimmunstörungen
involviert sind.
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Beispiele
für die
Wirkung mehrerer exemplarischer Verbindungen dieser Erfindung auf
einige PTKs werden nachstehend in Tabelle 2 gezeigt. Die dargestellten
Verbindungen und Daten sollen den Umfang dieser Erfindung in keinster
Weise einschränken.
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Verabreichung und pharmazeutische Zusammensetzung
-
Eine
Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch akzeptables
Salz davon können als
solche an einen menschlichen Patienten verabreicht werden oder können in
pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, in denen
die vorstehenden Materialien mit geeigneten Trägern oder Bindemitteln gemischt
werden. Techniken zur Bildung und Verabreichung von Arzneimitteln
sind in „Remington's Pharmacological
Sciences", Mack
Publishing Co., Easton, PA., jüngste
Auflage, zu finden.
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Wie
hierin verwendet, beziehen sich „verabreichen" oder „Verabreichung" auf die Abgabe einer
Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch akzeptablen
Salzes davon oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine
Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz
davon dieser Erfindung enthält,
an einen Organismus zum Zwecke der Vorbeugung oder Behandlung einer
PK-bedingten Störung.
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Geeignete
Wege zur Verabreichung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung oder
intramuskuläre,
subkutane, intramedulläre,
intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intravitreale,
intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen. Die
bevorzugten Verabreichungswege sind oral und parenteral.
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Alternativ
kann man die Verbindung bevorzugt eher lokal als systemisch verabreichen,
zum Beispiel mittels Injektion der Verbindung direkt in einen soliden
Tumor, oftmals in Form einer Depot- oder nachhaltig wirkenden Formulierung.
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Ferner
kann man das Arzneimittel in einem angestrebten Arzneimittelfreisetzungssystem,
zum Beispiel in einem Liposom, beschichtet mit einem Tumor-spezifischen
Antikörper,
verabreichen. Die Liposome werden von dem Tumor selektiv targetiert
und aufgenommen.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch
in der Technik allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden,
z. B. mittels herkömmlicher
Misch-, Auflöse-,
Granulier-, Drageeherstellungs-, Pulverisier-, Emulgier-, Einkapsel-,
Kompressions- oder Lyophilisierverfahren.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung können
in einer herkömmlichen
Art und Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch
akzeptabler Träger
formuliert werden, die Trägerstoffe
und Hilfsmittel, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen
zu Präparaten,
die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern, umfassen.
Die richtige Formulierung hängt
vom ausgewählten
Verabreichungsweg ab.
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Für die Injektion
können
die Verbindungen der Erfindung zu wässerigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch
verträgliche
Puffer, wie Hank-Lösung,
Ringer-Lösung
oder physiologische Kochsalzlösungspuffer,
formuliert werden. Zur transmukosalen Verabreichung werden Eindringmedien,
die die Barriere durchdringen können,
in der Formulierung verwendet. Derartige Eindringmedien sind in
der Technik allgemein bekannt.
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Zur
oralen Verabreichung können
die Verbindungen ohne weiteres durch Vereinigen der aktiven Verbindungen
mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die in der Technik bekannt
sind, formuliert werden. Derartige Träger ermöglichen es, daß die Verbindungen
der Erfindung als Tabletten, Pillen, Pastillen, Dragees, Kapseln,
Flüssigkeiten,
Gele, Sirups, Aufschlämmungen,
Suspensionen und dergleichen zur oralen Nahrungsaufnahme durch einen
Patienten formuliert werden können.
Pharmazeutische Präparate
zur oralen Verwendung können
unter Verwendung eines festen Trägerstoffes,
gegebenenfalls Mahlen des resultierenden Gemisches und Verarbeiten
des Gemisches aus Körnchen
nach der Zugabe geeigneter anderer Hilfsmittel, wenn gewünscht, um
so Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, erzeugt werden. Geeignete
Trägerstoffe
sind im besonderen: Füllstoffe,
wie Zucker, einschließlich
Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Cellulosepräparate wie
beispielsweise Maisstärke,
Wei zenstärke,
Reisstärke,
Kartoffelstärke
und andere Materialien wie Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose,
Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder
Polyvinylpyrrolidon (PVP). Nach Bedarf können Lösungsvermittler zugegeben werden,
wie vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure. Ein
Salz wie Natriumalginat kann auch verwendet werden.
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Drageekerne
werden mit geeigneten Überzügen ausgestattet.
Für diesen
Zweck können
konzentrierte Zuckerlösungen
verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon,
Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und
geeignete organische Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemische
enthalten können.
Farbstoffe oder Pigmente können
den Tabletten- oder Drageeüberzügen zur
Identifizierung oder Charakterisierung unterschiedlicher Kombinationen
von Dosen der aktiven Verbindungen zugegeben werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die oral verwendet werden können, umfassen Eindrückkapseln
aus Gelatine sowie weiche, verschlossene Kapseln aus Gelatine und
einem Weichmacher, wie Glycerol oder Sorbitol. Die Eindrückkapseln
können
die Wirkstoffe in Beimischung mit einem Füllstoff wie Laktose, einem
Bindemittel wie Stärke
und/oder einem Schmiermittel wie Talk oder Magnesiumstearat, und
gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die
aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie Fettölen, flüssigem Paraffin
oder flüssigen
Polyethylenglycolen, gelöst
oder suspendiert sein. In diese Formulierungen können ebenfalls Stabilisatoren
gegeben werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die auch verwendet werden können, umfassen harte Gelatinekapseln.
Als ein nicht einschränkendes
Beispiel kann die orale Arzneimittelproduktformulierung der aktiven Verbindung
in Kapselform bei Dosisstärken
von 50 und 200 mg vorliegen (Formulierungscodes J-011248 AA-00 bzw.
J-011248-AA-01). Die beiden Dosisstärken werden aus denselben Körnchen erhalten,
indem verschieden große
harte Gelatinekapseln, Größe 3 für die 50-mg-Kapsel
und Größe 0 für die 200-mg-Kapseln, gefüllt werden.
Die Zusammensetzung der Formulierung kann zum Beispiel wie in Tabelle
2 angezeigt aussehen. TABELLE
2
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Die
Kapseln können
in braune Glas- oder Kunststoffflaschen verpackt werden, um die
aktive Verbindung vor Licht zu schützen. Die Behälter, die
die aktive Verbindung in Form einer Kapselformulierung enthalten,
müssen
bei kontrollierter Raumtemperatur gelagert werden (15–30 °C).
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Zur
Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung
gemäß der vorliegenden
Erfindung günstigerweise
in Form eines Aerosolsprays unter Verwendung einer unter Druck gesetzten
Packung oder eines Verneblers und eines geeigneten Treibmittels,
z. B., ohne Beschränkung
darauf, Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan
oder Kohlendioxid, geliefert. Im Falle eines unter Druck gesetzten
Aerosols kann die Dosiereinheit durch die Bereitstellung eines Ventils
zur Abgabe einer abgemessenen Menge kontrolliert werden. Kapseln
und Patronen zum Beispiel aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator
oder einem Insufflator können
so formuliert werden, daß sie
ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulvergrundlage
wie Lactose oder Stärke
enthalten.
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Die
Verbindungen können
auch zur parenteralen Verabreichung, z. B. durch Bolusinjektion
oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen
zur Injektion können
in Einheitsdosierform, z. B. in Ampullen, oder in Mehrfachdosenbehältern mit
einem zusätzlichen
Konservierungsstoff, vorliegen. Die Zusammensetzungen können Formen
wie Suspensionen, Lösungen
oder Emulsionen in öligen
oder wässerigen
Vehikeln annehmen und kön nen
Formulierungsmaterialien wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder
Dispergiermittel enthalten.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässerige
Lösungen
einer wasserlöslichen
Form, wie zum Beispiel, ohne Beschränkung darauf, ein Salz der
aktiven Verbindung. Außerdem
können
Suspensionen der aktiven Verbindungen in einem lipophilen Vehikel
hergestellt werden. Geeignete lipophile Vehikel umfassen Fettöle, wie
Sesamöl,
synthetische Fettsäureester
wie Ethyloleat und Triglyceride oder Materialien wie Liposome. Wässerige
Injektionssuspensionen können
Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie
Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls
kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren und/oder Mittel
enthalten, die die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen,
um so die Herstellung hoch konzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
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Alternativ
kann der Wirkstoff zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel,
z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung in Pulverform
vorliegen.
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Die
Verbindungen können
auch in rektale Zusammensetzungen wie Zäpfchen oder Retentionseinläufe, zum
Beispiel unter Verwendung herkömmlicher
Zäpfchengrundlagen
wie Kakaobutter oder anderen Glyceriden, formuliert werden.
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ebenso
als Depotpräparate
formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch
Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder
durch intramuskuläre
Injektion verabreicht werden. Eine Verbindung dieser Erfindung kann
für diesen
Verabreichungsweg mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise
als eine Emulsion in einem pharmakologisch akzeptablen Öl), mit
Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliches Derivat, beispielsweise,
ohne Beschränkung
darauf, als schwerlösliches
Salz, formuliert werden.
-
Ein
nicht einschränkendes
Beispiel für
einen pharmazeutischen Träger
für die
hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Hilfslösungsmittelsystem,
das Benzylalkohol, ein nicht-polares
oberflächenaktives Mittel,
ein wassermischbares organisches Polymer und eine wäs serige
Phase umfaßt,
wie das VPD-Hilfslösungsmittelsystem.
VPD ist eine Lösung
aus 3 % Gewicht/Volumen Benzylalkohol, 8 % Gewicht/Volumen des nicht-polaren
oberflächenaktiven
Mittels Polysorbat 80 und 65 % Gewicht/Volumen Polyethylenglycol
300, aufgefüllt
in absolutem Ethanol. Das VPD-Hilfslösungsmittelsystem (VPD : D5W)
besteht aus VPD, 1 : 1 mit einer 5-%-Dextrose-in-Wasser-Lösung verdünnt. Dieses
Hilfslösungsmittelsystem
löst hydrophobe
Verbindungen gut, und erzeugt bei der systemischen Verabreichung
selbst wenig Toxizität.
Natürlich
können
die Anteile eines Hilfslösungsmittelsystems
beträchtlich
variiert werden, ohne seine Löslichkeits-
und Toxizitätsmerkmale
zu zerstören.
Außerdem
kann die Identität
der Hilfslösungsmittelkomponenten
variiert werden: beispielsweise können andere nicht-polare oberflächenaktive
Mittel mit geringer Toxizität
anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden; die Fraktionsgröße von Polyethylenglycol
kann verändert
werden; andere bioverträgliche
Polymere können
Polyethylenglycol ersetzen, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon;
und Dextrose kann durch andere Zucker oder Polysaccharide ersetzt
werden.
-
Alternativ
können
andere Abgabesysteme für
hydrophobe pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposome
und Emulsionen sind allgemein bekannte Beispiele für Abgabevehikel
oder -träger
für hydrophobe
Arzneimittel. Überdies
können
auch bestimmte organische Lösungsmittel,
wie Dimethylsulfoxid, eingesetzt werden, obgleich dies oftmals mit
höherer
Toxizität
verbunden ist.
-
Außerdem können die
Verbindungen unter Verwendung eines nachhaltig wirkenden Systems,
wie semipermeablen Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, enthaltend
das Therapeutikum, zugeführt
werden. Verschiedene Materialien mit verzögerter Freisetzung sind etabliert
worden und dem Fachmann allgemein bekannt. Kapseln mit verzögerter Freisetzung
können
in Abhängigkeit
ihrer chemischen Natur die Verbindungen in wenigen Wochen bis zu
100 Tagen freisetzen. In Abhängigkeit
der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des Therapeutikums
können
zusätzliche
Strategien zur Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen hierin können auch geeignete Fest- oder
Gelphasen-Träger
oder -trägerstoffe
umfassen. Beispiele für
derartige Träger
oder Trägerstoffe
umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker,
Stärken,
Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie Polyethylenglycole.
-
Viele
der PK-modulierenden Verbindungen der Erfindung können als
physiologisch akzeptable Salze bereitgestellt werden, indem die
beanspruchte Verbindung die negativ oder positiv geladene Spezies
bildet. Beispiele für
Salze, in denen die Verbindung die positiv geladene Einheit bildet,
umfassen ohne Einschränkung Quartärammonium
(hierin woanders definiert), Salze wie das Hydrochlorid, Sulfat,
Carbonat, Lactat, Tartrat, Malat, Maleat, Succinat, worin das Stickstoffatom
der Quartärammoniumgruppe
ein Stickstoff der ausgewählten
Verbindung dieser Erfindung ist, das mit der geeigneten Säure umgesetzt
wurde. Salze, in denen eine Verbindung dieser Erfindung die negativ
geladene Spezies bildet, umfassen ohne Einschränkung Natrium-, Kalium-, Calcium-
und Magnesiumsalze, gebildet durch die Umsetzung einer Carbonsäuregruppe
in der Verbindung mit einer geeigneten Base (z. B. Natriumhydroxid
(NaOH), Kaliumhydroxid (KOH), Calciumhydroxid (Ca(OH)2)
usw.).
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, in denen die Wirkstoffe
in einer Menge enthalten sind, die ausreicht, um den vorgesehenen
Zweck, zum Beispiel die Modulierung der PK-Aktivität oder die Behandlung oder
Vorbeugung einer PK-bedingten Störung,
zu erreichen.
-
Genauer
gesagt ist unter einer therapeutisch wirksamen Menge eine Menge
der Verbindung zu verstehen, die wirksam Symptome der Krankheit
verhindert, lindert oder aufhebt oder das Überleben des behandelten Individuums
verlängert.
-
Die
Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge gehört zu den
allgemeinen Fähigkeiten
eines Fachmanns, insbesondere im Lichte der hierin gelieferten ausführlichen
Offenbarung.
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Für jede Verbindung,
die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch
wirksame Menge oder Dosis zu Beginn aus Zellkulturassays festgelegt
werden. Dann kann die Dosierung zur Verwendung in Tiermodellen formuliert
werden, um so einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erhalten, der
den IC50, bestimmt in der Zellkultur (d.
h., die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibierung
der PK-Aktivität
erreicht) umfaßt.
Diese Informationen können
dann dazu verwendet werden, nützliche
Dosen für
Menschen genauer zu bestimmen.
-
Die
Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit der hierin beschriebenen Verbindungen
kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder
Versuchstieren, z. B. durch Bestimmung des IC50 und LD50 (die beide
anderswo hierin erörtert
werden) für
die jeweilige Verbindung, bestimmt werden. Die aus diesen Zellkulturassays
und Tierstudien erhaltenen Daten können zur Formulierung eines
Dosierbereiches zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Diese
Dosierung kann in Abhängigkeit
der eingesetzten Dosierform und des genutzten Verabreichungsweges
variieren. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die
Dosierung können
durch den jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustandes
des Patienten gewählt
werden. (Siehe z. B. Fingl, et. al., 1975, in „The Pharmacological Basis
of Therapeutics",
K. 1, S. 1).
-
Dosiermenge
und -intervall können
individuell eingestellt werden, um Plasmakonzentrationen der aktiven
Spezies bereitzustellen, die zur Aufrechterhaltung der Kinase-modulierenden
Wirkungen ausreichen. Diese Plasmakonzentrationen werden als minimale
Wirkkonzentrationen (MECs) bezeichnet. Die MEC wird für jede Verbindung
variieren, kann jedoch aus In-vitro-Daten
ermittelt werden, z. B. kann die Konzentration, die zur Erlangung
einer 50- bis 90%igen Inhibierung einer Kinase erforderlich ist,
unter Verwendung der hierin beschriebenen Assays festgelegt werden.
Dosierungen, die zur Erlangung der MEC erforderlich sind, werden
von den jeweiligen Merkmalen und dem Verabreichungsweg abhängen. HPLC-Assays oder Bioassays
können
zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen verwendet werden.
-
Unter
Verwendung des MEC-Wertes können
auch die Dosierintervalle bestimmt werden. Die Verbindungen sollten
unter Verwendung eines Regimes verabreicht werden, das Plasmakonzentrationen
für 10–90 % der
Zeit, bevorzugt zwischen 30 und 90 % und am stärksten bevorzugt zwischen 50
und 90 % über
der MEC hält.
-
Derzeit
können
therapeutisch wirksame Mengen der Verbindungen der Formel (I) im
Bereich von ungefähr
25 mg/m2 bis 1500 mg/m2 pro
Tag; bevorzugt etwa 3 mg/m2/Tag liegen.
Noch stärker
bevorzugt sind 50 mg/m2/Tag bis 400 mg/Tag.
-
Im
Falle der lokalen Verabreichung oder selektiven Aufnahme steht die
wirksame lokale Konzentration des Arzneimittels nicht mit der Plasmakonzentration
in Verbindung, und es können
andere in der Technik bekannte Verfahren zur Bestimmung der korrekten
Dosiermenge und -intervalls eingesetzt werden.
-
Die
Menge einer verabreichten Zusammensetzung wird natürlich von
dem zu behandelnden Individuum, der Schwere der Krankheit, der Art
und Weise der Verabreichung, den Anordnungen des behandelnden Arztes
usw. abhängen.
-
Die
Zusammensetzungen können
nach Bedarf in einer Packung oder einer Spendevorrichtung, wie einem
von der FDA genehmigten Kit, vorliegen, die eine oder mehrere Einheitsdosierformen
enthalten können, die
den Wirkstoff enthalten. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder
Kunststoffolie umfassen, wie eine Blisterpackung. Der Packung oder
Spendervorrichtung können
Anweisungen hinsichtlich der Verabreichung beiliegen. Der Packung
oder Spendervorrichtung kann ebenso eine mit dem Behälter verbundene
Mitteilung in einer von einer Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung
oder den Verkauf von Pharmazeutika regelt, vorgeschriebenen Form,
beiliegen, wobei dieser Mitteilung die Genehmigung für die Form
der Zusammensetzungen oder die Verabreichung an Mensch oder Tiere
durch die Behörde
zu entnehmen ist. Eine solche Mitteilung kann zum Beispiel aus der
von der US Food and Drug Administration zur Verschreibung von Arzneimitteln
genehmigten Etikettierung oder einer genehmigten Produkteinlage
bestehen. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung,
formuliert in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger, umfassen,
können
auch zur Behandlung eines indizierten Umstandes hergestellt, in
einem geeigneten Behälter
plaziert und markiert werden. Geeignete Umstände auf dem Etikett können die
Behandlung eines Tumors, die Inhibierung von Angiogenese, die Behandlung
von Fibrose, Diabetes und dergleichen umfassen.
-
Ein
Aspekt dieser Erfindung ist auch, daß eine hierin beschriebene
Verbindung oder ihr Salz oder ihr Prodrug mit anderen chemotherapeutischen
Mitteln zur Behandlung der oben erörterten Krankheiten und Störungen kombiniert
werden kann. Beispielsweise kann eine Verbindung, ein Salz oder
ein Prodrug dieser Erfindung mit Alkylierungsmitteln wie Fluoruracil
(5-FU), allein oder zusätzlich
in Kombination mit Leukovorin; oder anderen Alkylierungsmitteln,
wie anderen Pyrimidinanaloga, wie UFT, Capecitabin, Gemcitabin und
Cytarabin, Alkylsulfonaten, z. B. Busulfan (das bei der Behandlung
chronischer Granulozytenleukämie
verwendet wird), Improsulfan und Piposulfan; Aziridinen, z. B. Benzodepa,
Carboquon, Me turedepa und Uredepa; Ethyleniminen und Methylmelaminen,
z. B. Altretamin, Triethylenmelamin, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid
und Trimethylolmelamin; und den Stickstoffsenfgasen, z. B. Chlorambucil
(das bei der Behandlung chronischer Lymphozytenleukämie, primärer Makroglobulinämie und
Nicht-Hodgkin's-Lymphom
verwendet wird), Cyclophosphamid (das bei der Behandlung der Hodgkin's-Krankheit, multiplem
Myelom, Neuroblastom, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Wilm's-Tumor und Rhabdomyosarkom
verwendet wird), Estramustin, Ifosfamid, Novembrichin, Prednimustin
und Uramustin (das bei der Behandlung primärer Thrombozytose, Nicht-Hodgkin's-Lymphom, der Hodgkin's-Krankheit und Eierstockkrebs
verwendet wird); und Triazin, z. B. Dacarbazin (das bei der Behandlung
von Weichgewebesarkom verwendet wird), kombiniert werden.
-
Eine
Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung kann auch
in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Antimetabolitmitteln,
wie Folsäureanaloga,
z. B. Methotrexat (das bei der Behandlung akuter Lymphozytenleukämie, Choriokarzinom,
Mycosis fungiodes, Brustkrebs, Kopf- und Halskrebs und osteogenem
Sarkom verwendet wird) und Pteropterin; und Purinanaloga wie Mercaptopurin
und Thioguanin, die bei der Behandlung akuter Granulozyten-, akuter
Lymphozyten- und chronischer Granulozytenleukämie Anwendung finden, sind
aber nicht darauf beschränkt.
-
Es
wird in Betracht gezogen, daß eine
Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung auch in Kombination
mit chemotherapeutischen Mitteln auf der Basis von Naturprodukten
wie Vincaalkaloiden, z. B. Vinblastin (das bei der Behandlung von
Brust- und Hodenkrebs verwendet wird), Vincristin und Vindesin;
Epipodophylotoxinen, z. B. Etoposid und Teniposid, die beide bei
der Behandlung von Hodenkrebs und dem Kaposi-Sarkom nützlich sind;
antibiotischen chemotherapeutischen Mitteln, z. B. Daunorubicin,
Doxorubicin, Epirubicin, Mitomycin (die zur Behandlung von Magen-,
Zervix-, Darm-, Brust, Blasen- und Pankreaskrebs verwendet werden),
Dactinomycin, Temozolomid, Plicamycin, Bleomycin (die bei der Behandlung
von Haut-, Ösophagus-
und Urogenitaltraktkrebs verwendet werden); und enzymatischen chemotherapeutischen
Mitteln wie L-Asparaginase verwendet werden kann.
-
Außerdem können eine
Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung auch in Kombination mit
den Platinkoordinationskomplexen (Cisplatin usw.); substituierten
Harnstoffen wie Hydroxyharnstoff Methylhydrazinderivaten, z. B.
Procarbazin; adrenokortikalen Hemmstoffen, z. B. Mitotan, Aminoglutethimid;
und Hormon und Hormonantagonisten wie den Adrenokortikosteroiden
(z. B. Prednison), Progestinen (z. B. Hydroxyprogesteroncaproat); Östrogenen
(z. B. Diethylstilbesterol); Antiöstrogenen wie Tamoxifen; Androgenen,
z. B. Testosteronpropionat; und Aromataseinhibitoren wie Anastrozol
verwendet werden.
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Schließlich wird
ebenso in Betracht gezogen, daß die
Kombination einer Verbindung dieser Erfindung in Kombination mit
Mitoxantron oder Paclitaxel zur Behandlung von soliden Tumorkrebsarten
oder Leukämie wie
akuter myelogener (Nicht-Lymphozyten-) Leukämie wirksam sein wird.
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Allgemeines Syntheseverfahren
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Die
folgende allgemeine Verfahrensweise kann zur Herstellung der Verbindungen
dieser Erfindung eingesetzt werden:
Das geeignet substituierte
2-Oxindol (1 Äqu.),
der geeignet substituierte Aldehyd (1,2 Äqu.) und eine Base (0,1 Äqu.) werden
in einem Lösungsmittel
(1–2 ml/mmol
2-Oxindol) gemischt und das Gemisch wird dann für etwa 2 bis etwa 12 Stunden
erwärmt.
Nach dem Abkühlen
wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit kaltem Ethanol
oder Ether gewaschen und vakuumgetrocknet, wodurch das feste Produkt
erhalten wird. Bildet sich kein Niederschlag, wird das Reaktionsgemisch
konzentriert und der Rest wird mit Dichlormethan/Ether verrieben,
der resultierende Feststoff wird durch Filtration gesammelt und
dann getrocknet. Das Produkt kann durch Chromatographie gegebenenfalls
weiter gereinigt werden.
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Die
Base kann eine organische oder eine anorganische Base sein. Wird
eine organische Base verwendet, ist diese bevorzugt eine Stickstoffbase.
Beispiele für
organische Stickstoffbasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Diisopropylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Anilin, Pyridin, 1,8-Diazabicyclo[5.4.1]undec-7-en,
Pyrrolidin und Piperidin.
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Beispiele
für anorganische
Basen sind ohne Einschränkung
Ammoniak, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxide, Phosphate,
Carbonate, Bicarbonate, Bisulfate und Amide. Die Alkalimetalle umfassen
Lithium, Natrium und Kalium, während
die Erdalkalimetalle Calcium, Magnesium und Barium umfassen.
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In
einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Base, wenn das Lösungsmittel ein protisches
Lösungsmittel
wie Wasser oder Alkohol ist, eine anorganische Alkalimetall- oder
Erdalkalimetallbase, bevorzugt ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxid.
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Einem
Fachmann wird, basierend auf allgemeinen Prinzipien der organischen
Synthese und den Offenbarungen hierin, klar sein, welche die für die in
Betracht gezogene Reaktion geeignetste Base sein wird.
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Das
Lösungsmittel,
in dem die Reaktion durchgeführt
wird, kann ein protisches oder ein aprotisches Lösungsmittel sein, bevorzugt
ist es ein protisches Lösungsmittel.
Ein „protisches
Lösungsmittel" ist ein Lösungsmittel,
das Wasserstoffatome aufweist, die kovalent an Sauerstoff- oder
Stickstoffatome gebunden sind, die die Wasserstoffatome merklich
sauer und daher mit einem gelösten
Stoff durch Wasserstoffbindung „teilbar" machen. Beispiele für protische Lösungsmittel
umfassen ohne Einschränkung
Wasser und Alkohole.
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Ein „aprotisches
Lösungsmittel" kann polar oder
nicht-polar sein, enthält
in beiden Fällen
jedoch keine sauren Wasserstoffe und ist daher nicht zur Wasserstoffbindung
mit gelösten
Stoffen fähig.
Beispiele für nicht-polare
aprotische Lösungsmittel
sind ohne Einschränkung
Pentan, Hexan, Benzol, Toluol, Methylenchlorid und Kohlenstofftetrachlorid.
Beispiele für
polare aprotische Lösungsmittel
sind Chloroform, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
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In
einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung ist das Lösungsmittel
ein protisches Lösungsmittel,
bevorzugt Wasser oder ein Alkohol wie Ethanol.
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Die
Reaktion wird bei Temperaturen über
Raumtemperatur durchgeführt.
Die Temperatur beträgt
im allgemeinen etwa 30 °C
bis etwa 150 °C,
bevorzugt etwa 80 °C
bis etwa 100 °C,
am stärksten
bevorzugt etwa 75 °C
bis etwa 85 °C,
was über
dem Siedepunkt von Ethanol liegt. Unter „etwa" ist zu verstehen, daß der Temperaturbereich
bevorzugt innerhalb von 10 °C
der angezeigten Temperatur, stärker
bevorzugt innerhalb von 5 °C
der angezeigten Temperatur und am stärksten bevorzugt innerhalb
von 2 °C
der angezeigten Temperatur, liegt. Daher ist zum Beispiel unter „etwa 75 °C" 75 °C ± 10 °C, bevorzugt
75 °C ± 5 °C und stärksten bevorzugt 75 °C ± 2 °C, zu verstehen.
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2-Oxindole
und Aldehyde können
ohne weiteres unter Verwendung von Techniken, die in der Chemie allgemein
bekannt sind, synthetisiert werden. Ein Fachmann wird erkennen,
daß andere
Synthesewege zur Bildung der Verbindungen der Erfindung zugänglich sind
und das folgendes als Beispiel und nicht zur Einschränkung angeboten
wird.
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BEISPIELE
-
Die
folgenden Herstellungen und Beispiele werden angegeben, damit ein
Fachmann die vorliegende Erfindung besser verstehen und durchführen kann.
Sie sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken, sondern
diese lediglich veranschaulichen und darstellen.
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Synthesebeispiele
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Verfahren A: Formylierung von Pyrrolen
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POCl3 (1,1 Äquiv.)
wurde tropfenweise zu Dimethylformamid (3 Äquiv.) bei –10 °C zugegeben, gefolgt von der
Zugabe des geeigneten in Dimethylformamid gelösten Pyrrols. Nach dem Rühren für zwei Stunden wurde
das Reaktionsgemisch mit H2O verdünnt und
auf pH 11 mit 10 N KOH basisch gemacht. Der gebildete Niederschlag
wurde durch Filtration gesammelt, mit H2O
gewaschen und im Vakuumofen getrocknet, wodurch der gewünschte Aldehyd
erhalten wurde.
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Verfahren B: Verseifung von Pyrrolcarbonsäureestern
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Ein
Gemisch aus einem Pyrrolcarbonsäureester
und KOH (2 bis 4 Äquiv.)
in EtOH wurde unter Rückfluß erhitzt,
bis Dünnschichtchromatographie
(DC) die Beendigung der Reaktion anzeigte. Das abgekühlte Reaktionsgemisch
wurde auf pH 3 mit 1 N HCl angesäuert.
Der gebildet Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit
H2O gewaschen und im Vakuumofen getrocknet,
wodurch die gewünschte
Pyrrolcarbonsäure
erhalten wurde.
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Verfahren C: Amidierung
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Zu
einer gerührten
Lösung
aus einer Pyrrolcarbonsäure,
gelöst
in Dimethylformamid, (0,3 M) wurden 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid
(1,2 Äquiv.),
1-Hydroxybenzotriazol (1,2 Äquiv.)
und Triethylamin (2 Äquiv.)
zugegeben. Das entsprechende Amin wurde zugegeben (1 Äquiv.) und
die Reaktion gerührt,
bis DC die Beendigung der Reaktion angab. Ethylacetat wurde dann
zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und die Lösung wurde mit gesättigtem
NaHCO3 und Salzlösung (mit extra Salz) gewaschen, über wasserfreiem MgSO4 getrocknet und konzentriert, wodurch das
gewünschte
Amid erhalten wurde.
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Verfahren D: Kondensation von Aldehyden
und Oxindolen, die Carbonsäuresubstituenten
enthalten
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Ein
Gemisch aus dem Oxindol (1 Äquivalent),
1 Äquivalent
des Aldehyds und 1–3 Äquivalenten
Piperidin (oder Pyrrolidin) in Ethanol (0,4 M) wurde bei 90–100 °C gerührt, bis
DC die Beendigung der Reaktion angab. Das Gemisch wurde dann konzentriert
und der Rest mit 2N HCl angesäuert.
Der gebildete Niederschlag wurde mit H2O
und EtOH gewaschen und dann im Vakuumofen getrocknet, wodurch das
Produkt erhalten wurde.
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Verfahren E: Kondensation von Aldehyden
und Oxindolen, die keine Carbonsäuresubstituenten
enthalten
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Ein
Gemisch aus dem Oxindol (1 Äquivalent),
1 Äquivalent
des Aldehyds und 1–3 Äquivalenten
Piperidin (oder Pyrrolidin) in Ethanol (0,4 M) wurde bei 90–100 °C gerührt, bis
DC die Beendigung der Reaktion angab. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur
abgekühlt,
und der gebildete Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt,
mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch das Produkt erhalten
wurde. Bildet sich beim Abkühlen
des Reaktionsgemisches kein Niederschlag, wird das Gemisch konzentriert
und durch Säulenchromatographie
gereinigt.
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C. Beispiele von Oxindolsynthesen
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Die
folgenden Beispiele der Synthese repräsentativer Oxindole sollen
den Umfang der Erfindung in keinster Weise einschränken. Alternative
Wege zu den gezeigten Oxindolen sowie anderen Oxindolen, die für die Herstellung
der Verbindungen dieser Erfindung nützlich sind, werden einem Fachmann,
basierend auf den folgenden Offenbarungen, offensichtlich. Solche
Synthesen und Oxindole liegen im Umfang und Sinn dieser Erfindung.
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5-Amino-2-oxindol
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5-Nitro-2-oxindol
(6,3 g) wurde in Methanol über
10 % Palladium auf Kohlenstoff hydriert, wodurch 3,0 g (60 % Ausbeute)
der Titelverbindung als weißer
Feststoff erhalten wurden.
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5-Brom-2-oxindol
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2-Oxindol
(1,3 g) in 20 ml Acetonitril wurde auf –10 °C abgekühlt und 2,0 g N-Bromsuccinimid
wurden langsam unter Rühren
zugegeben. Die Reaktion wurde für
1 Stunde bei –10 °C und 2 Stunden
bei 0 °C
gerührt. Der
Niederschlag wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet,
wodurch 1,9 g (90 % Ausbeute) der Titelverbindung erhalten wurden.
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4-Methyl-2-oxindol
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Diethyloxalat
(30 ml) in 20 ml trocknem Ether wurde unter Rühren zu 19 g Kaliumethoxid,
suspendiert in 50 ml trockenem Ether, zugegeben. Das Gemisch wurde
in einem Eisbad abgekühlt
und 20 ml 3-Nitro-o-xylol in 20 ml trockenem Ether wurden langsam
zugegeben. Das dicke dunkelrote Gemisch wurde unter Rückfluß für 0,5 h
erhitzt, zu einem dunkelroten Feststoff konzentriert und mit 10%igem
Natriumhydroxid behandelt, bis fast der gesamte Feststoff gelöst war.
Das dunkelrote Gemisch wurde mit 30%igem Wasserstoffperoxid behandelt,
bis die Rotfärbung
zu gelb wechselte. Das Gemisch wurde abwechselnd mit 10%igem Natriumhydroxid
und 30%igem Wasserstoffperoxid behandelt, bis keine dunkelrote Farbe
mehr vorlag. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Filtrat mit
6N Salzsäure
angesäuert.
Der resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt,
mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 9,8 g
(45 % Ausbeute) 2-Methyl-6-nitrophenylessigsäure als gebrochen weißer Feststoff
erhalten wurden. Der Feststoff wurde in Methanol über l 0
% Palladium auf Kohlenstoff hydriert, wodurch 9,04 g der Titelverbindung
als weißer
Feststoff erhalten wurden.
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7-Brom-5-chlor-2-oxindol
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5-Chlor-2-oxindol
(16,8 g) und 19,6 g N-Bromsuccinimid wurden in 140 ml Acetonitril
suspendiert und unter Rückfluß für 3 Stunden
erhitzt. Dünnschichtchromatographie
(Siliciumdioxid, Ethylacetat) bei 2 Stunden Rückfluß zeigte 5-Chlor-2-oxindol
oder N-Bromsuccinimid (Rf 0,8), Produkt (Rf 0,85) und ein zweites
Produkt (Rf 0,9), deren Anteile sich nach einer weiteren Stunde
Rückfluß nicht
veränderten.
Das Gemisch wurde auf 10 °C
abgekühlt,
der Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit 25
ml Ethanol gewaschen und für
20 Minuten im Trichter trocken gesaugt, wodurch 14,1 g nasses Produkt
(56 % Ausbeute) erhalten wurden. Der Feststoff wurde in 200 ml denaturiertem
Ethanol suspendiert und die Aufschlämmung wurde unter Rühren und
Erhitzen unter Rückfluß für 10 Minuten
gewaschen. Das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 10 °C abgekühlt. Das
feste Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit 25 ml
Ethanol gewaschen und unter Vakuum bei 40 °C getrocknet, wodurch 12,7 g
(51 % Ausbeute) 7-Brom-5-chlor-2-oxindol erhalten wurden.
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5-Fluor-2-oxindol
-
5-Fluorisatin
(8,2 g) wurde in 50 ml Hydrazinhydrat gelöst und unter Rückfluß für 1,0 h
erhitzt. Die Reaktionsgemische wurden dann in Eiswasser gegossen.
Der Niederschlag wurde dann filtriert, mit Wasser gewaschen und
im Vakuumofen getrocknet, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
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5-Nitro-2-oxindol
-
2-Oxindol
(6,5 g) wurde in 25 ml konzentrierter Schwefelsäure verdünnt und das Gemisch bei –10 bis –15 °C gehalten,
während
2,1 ml rauchende Salpetersäure
tropfenweise zugegeben wurden. Nach der Zugabe der Salpetersäure wurde
das Reaktionsgemisch bei 0 °C
für 0,5
h gerührt
und in Eiswasser gegossen. Der Niederschlag wurde durch Filtration
gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus 50%iger Essigsäure kristallisiert.
Das kristalline Produkt wurde dann filtriert, mit Wasser gewaschen
und unter Vakuum getrocknet, wodurch 6,3 g (70 %) 5-Nitro-2-oxindol
erhalten wurden.
-
5-Aminosulfonyl-2-oxindol
-
Zu
einem 100-ml-Kolben, beschickt mit 27 ml Chlorsulfonsäure, wurden
langsam 13,3 g 2-Oxindol zugegeben. Die Reaktionstemperatur wurde
während
der Zugabe unter 30 °C
gehalten. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur
für 1,5
h gerührt,
auf 68 °C
für 1 h
erhitzt, abgekühlt
und in Wasser gegossen. Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen
und in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch 11,0 g 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol
(50 % Ausbeute) erhalten wurden, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
-
5-Chlorsulfonyl-2-oxindol
(2,1 g) wurde zu 10 ml Ammoniumhydroxid in 10 ml Ethanol zugegeben
und bei Raumtemperatur über
Nacht gerührt.
Das Gemisch wurde konzentriert und der Feststoff durch Vakuumfiltration
gesammelt, wodurch 0,4 g (20 % Ausbeute) der Titelverbindung als
gebrochen weißer
Feststoff erhalten wurden.
-
5-Isopropylaminosulfonyl-2-oxindol
-
Zu
einem 100-ml-Kolben, beschickt mit 27 ml Chlorsulfonsäure, wurden
langsam 13,3 g 2-Oxindol zugegeben. Die Reaktionstemperatur wurde
während
der Zugabe unter 30 °C
gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden
gerührt,
auf 68 °C
für 1 Stunde
erhitzt, abgekühlt
und in Wasser gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde filtriert,
mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch
11,0 g (50 %) 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol erhalten wurden, das ohne
weitere Reinigung verwendet wurde.
-
Eine
Suspension aus 3 g 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol, 1,15 g Isopropylamin
und 1,2 ml Pyridin in 50 ml Dichlormethan wurde bei Raumtemperatur
für 4 Stunden
gerührt,
wobei sich während
dieser Zeit ein weißer Feststoff
bildete. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit
heißem
Ethanol durch Aufschlämmung
gewaschen, abgekühlt,
durch Vakuumfiltration gesammelt und unter Vakuum bei 40 °C über Nacht
getrocknet, wodurch 1,5 g (45 %) 5-Isopropylaminosulfonyl-2-oxindol
erhalten wurden.
1HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,69 (s,
br, 1H, NH), 7,63 (dd, J = 2 und 8 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,32
(d, J = 7 Hz, 1H, NH-SO2-), 6,93 (d, J =
8 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23
(m, 1H, CH-(CH3)2),
0,94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2 × CH3).
-
5-Phenylaminosulfonyl-2-oxindol
-
Eine
Suspension aus 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol (1,62 g, 7 mmol), Anilin
(0,782 ml, 8,4 mmol) und Pyridin (1 ml) in Dichlormethan (20 ml)
wurde bei Raumtemperatur für
4 Stunden gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt und
mit 1N Salzsäure
(16 ml) angesäuert.
Die organische Schicht wurde mit Natriumbicarbonat und Salzlösung gewaschen,
getrocknet und konzentrieit. Der Rest wurde mit Ethanol (3 ml) gewaschen
und dann auf Kieselgel unter Elution mit Methanol/Dichlormethan
1 : 9 chromatographiert, wodurch 5-Phenylaminosulfonyl-2-oxindol
erhalten wurde.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,71 (s,
br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22
(m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz,
1H), 3,52 (s, 2H).
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurepyridin-3-ylamid
-
Eine
Lösung
aus 5-Chlorsufonyl-2-oxindol (3 g) und 3-Aminopyridin (1,46 g) in
Pyridin (15 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei
zu dieser Zeit ein brauner Feststoff vorlag. Der Feststoff wurde filtriert,
mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,4 g
(38 %) 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurepyridin-3-ylamid erhalten
wurden.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,74 (s,
1H, NH), 10,39 (s, 1H, SO2NH), 8,27-8,28
(d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H),
7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71
(d, 1H), 3,54 (s, 2H).
-
MS
m/z (APCI+) 290,2.
-
5-Phenyloxindol
-
5-Brom-2-oxindol
(5 g, 23,5 mmol) wurde in 110 ml Toluol und 110 ml Ethanol unter
Rühren
und ein wenig Wärme
gelöst.
Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (1,9 g, 1,6 mmol) wurde
zugegeben, gefolgt von 40 ml (80 mmol) 2M wässerigem Natriumcarbonat. Zu
diesem Gemisch wurde Benzolboronsäure (3,7 g, 30,6 mmol) zugegeben
und das Gemisch wurde in einem 100-°C-Ölbad für 12 Stunden erhitzt. Die Reaktion
wurde abgekühlt,
mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt,
mit gesättigtem
Natriumbicarbonat (200 ml), Wasser (200 ml), 1N HCl (200 ml) und
Salzlösung
(200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat
getrocknet und konzentriert, wodurch ein brauner Feststoff erhalten
wurde. Das Verreiben mit Dichlormethan ergab 3,8 g (77 %) 5-Phenyl-2-oxindol
als gelb-braunen Feststoff.
1H NMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 10,4
(br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 und 7,2 Hz, 1H), 7,5 bis 7,35
(m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
MS m/z 209 [M+].
-
In
der gleichen Art und Weise können
die folgenden Oxindole hergestellt werden:
-
6-(3,5-Dichlorphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,46 (br,
1H, NH), 7,64 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d,
J = 1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).
- MS-EI m/z 277/279 [M]+.
-
6-(4-Butylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (s,
1H, NH), 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3H), 7,17
(dd, J = 1,5 und 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,48 (s,
2H, CH2CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2H, CH2CH3), 1,57 (m, 2H,
CH2), 1,32 (m, 2H, CH2),
0,9 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3).
-
6-(5-Isopropyl-2-methoxyphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,29 (br
s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J = 97-7,01 (m, 2H), 6,89
(d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H,2,4 Hz, 1H), 6, OCH3),
3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19 (d, J
= 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).
- MS-EI m/z 281 [M]+.
-
6-(4-Ethylphenyl)-1,3-diliydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ1H, 10,39
(br s, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H),
7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,6 Hz,
1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J = 7,6
Hz, 2H, CH2CH3),
1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH2CH3).
- MS-EI m/z 237 [M]+.
-
6-(3-Isopropylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,37 (br
s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H),
7,01 (d, 7 = 1,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO),
2,95 (m, 1H, CH(CH3)2),
1,24 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).
- MS-EI m/z 251 [M]+.
-
6-(2,4-Dimethoxyphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (br
s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 1,6 Hz,
1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 2,4 & 8,5 Hz, H), 3,79
(s, 3H,1 OCH3H,), 3,74 (s, 3 OCH3), 3,45 (s, 2H, CH2CO).
- MS-EI m/z 269 [M]+.
-
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on
-
- 1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,51 (s,
1H, NH), 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J = 1,8 und 5,7 Hz,
1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J = 5,7 und 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H),
7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
- MS m/z 210 [M]+.
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-4-carbonsäure(3-chlor-4-ethoxyphenyl)-amid
-
Zu
einer Lösung
aus 4-Carboxy-2-oxindol (200 mg, 1,13 mmol) und 3-Chlor-4-methoxyphenylamin (178
mg, 1,13 mmol) in Dimethylformamid (15 ml) bei Raumtemperatur wurde
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat
(BOP-Reagens, 997 mg, 2,26 mmol), gefolgt von 4-Dimethylaminopyridin
(206 mg, 1,69 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur
für 72
Stunden gerührt. Die
Reaktion wurde dann mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt, mit
gesättigtem
Natriumbicarbonat (100 ml), Wasser, 2N Salzsäure (100 ml), Wasser (3 × 200 ml)
und Salzlösung
gewaschen. Es wurde dann über
Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rest wurde mit
Ethylacetat verrieben, wodurch 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-4-carbonsäure(3-chlor-4-methoxyphenyl)-amid
als pinkfarbener Feststoff erhalten wurde.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 10,50
(s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J = 2,5 Hz, 1H),
7,62 (dd, J = 2,5 & 9
Hz, 1H), 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,13
(d, J = 9 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (s, 2H, CH2).
MS-EI
m/z 316 [M]+.
-
4-Carboxy-2-oxindol
-
Eine
Lösung
aus Trimethylsilyldiazomethan in Hexan (2 M) wurde tropfenweise
zu einer Lösung
aus 2,01 g 2-Chlor-3-carboxynitrobenzol in 20 ml Methanol bei Raumtemperatur
zugegeben bis keine weitere Gasentwicklung auftrat. Essigsäure wurde
dann zugegeben, um das überschüssige Trimethylsilyldiazomethan
zu quenchen. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum eingedampft
und der Rest wurde in einem Ofen über Nacht getrocknet. Das erhaltene
2-Chlor-3-methoxycarbonylnitrobenzol war rein genug für die folgende
Reaktion.
-
Dimethylmalonat
(6,0 ml) wurde zu einer eiskalten Suspension aus 2,1 g Natriumhydrid
in 15 ml DMSO zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100 °C für 1 Stunde
gerührt
und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 2-Chlor-3-methoxycarbonylnitrobenzol
(2,15 g) wurde in einem Teil zugegeben und das Gemisch wurde auf
100 °C für 1,5 Stunden
erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, in Eiswasser
gegossen, auf pH 5 angesäuert
und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wodurch 3,0 g des Dimethyl-2-methoxycarbonyl-6-nitrophenyl-malonats
erhalten wurden.
-
Dimethyl-2-methoxycarbonyl-6-nitrophenylmalonat
(3,0 g) wurde in 50 ml 6N Salzsäure über Nacht unter
Rückfluß erhitzt.
Das Gemisch wurde zur Trockne konzentriert, 20 ml Ethanol und 1,1
g Zinn(II)chlorid wurden zugegeben und das Gemisch wurde unter Rückfluß für 2 Stunden
erhitzt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert, konzentriert
und auf Kieselgel unter Verwendung von Ethylacetat : Hexan : Essigsäure als
Elutionsmittel chromatographiert, wodurch 0,65 g (37 %) 4-Carboxy-2-oxindol
als weißer
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 12,96
(s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J = 8 Hz, 1H),
7,39 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).
-
D. Synthese von Pyrrol-substituierten
2-Indolinonen.
-
Beispiel 1
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
-
Ein
Gemisch aus 2-Aminoacetophenonhydrochlorid (1 Äquiv.), Ethylisobutyrylacetat
(1,2 Äquiv.)
und Natriumacetat (2,4 Äquiv.)
in H2O wurde bei 100 °C für 18 Stunden gerührt und
dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die wäßrige Schicht
wurde abdekantiert und das Öl
wurde in Ethylacetat gelöst.
Es wurde dann mit Wasser und Salzlösung gewaschen und dann getrocknet,
wodurch (93 %) 2-Isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
als rotbraunes Öl
erhalten wurde.
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s,
br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,02 (q,
J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3),
3,65 (m, 1H, CH(CH3)2),
1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/z 257 [M+].
-
Das
obige Pyrrol wurde unter Verwendung von Verfahren A formyliert,
wodurch (41 %) 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
als rötlicher
Feststoff erhalten wurde.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 12,35
(s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J = 7,1
Hz, 2H, OCH2CH3),
3,74 (m, 1H, CH(CH3)2),
1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/z 285 [M+].
-
Der
Pyrrolcarbonsäureester
wurde unter Verwendung von Verfahren B hydrolysiert, wodurch (57
%) 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure als
beigefarbener Feststoff erhalten wurde.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 12,28
(s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35
(s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2),
1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 257 [M+].
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(120 mg, 0,31 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
(hergestellt durch Verfahren C) kondensiert, wodurch 120 mg (71
%) der Titelverbindung erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23
(s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH2), 7,30 (s, 1H, H-Vinyl), 7,26 (dd, J =
1,8 & 7,8 Hz,
1H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2),
2,34 (q, J = 7,1 Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J
= 6,9 Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J
= 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 565,1 [M+ +
1].
-
Beispiel 2
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-4-1H-pyr-3-carbonsäure(3-pyrrolidin-1-ylpropyl)amid
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (127
mg, 0,28 mmol) wurde mit 3-Pyrrolidin-1-yl-propylamin (43 mg, 0,336
mmol) kondensiert, wodurch 140 mg (66 %) der Titelverbindung erhalten
wurden.
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,40 (s,
br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J =
8,1 Hz, 1H), 3,36 (in, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2),
2,30 (m, 4H, 2 × CH2), 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2),
1,62 (m, 4H, 2 × CH2), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2),
1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 560 und 562 [M+ – 1
und M+ + 1].
-
Beispiel 3
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(57 g, 0,27 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(120 mg) kondensiert, wodurch 78 mg (53 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten erhalten.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23
(s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28
(m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d,
J = 7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2),
2,28-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3)2 & CH2), 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI
m/z 548 und 550 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 4
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[3-(4-methylpiperazin-1-yl)propyl]amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(53 mg, 0,25 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-isopropyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[3-(4-methylpiperazin-1-yl)propyl]amid
(300 mg) kondensiert, wodurch 65 mg der Titelverbindung erhalten
wurden.
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,22 (s,
br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d,
J = 8,7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2),
2,24 (m, 8H, 4 × CH2), 2,11 (m, 5H, CH2 & CH3),
1,42 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 7,2 Hz,
6H, CH(CH3)2).
MS-EI
m/z 589 und 591 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 5
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(44 mg, 0,21 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(70 mg, hergestellt in gleicher Weise wie das obige Isopropylanalogon)
kondensiert, wodurch 0,03 g (27 %) der Titelverbindung als gelber
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 13,87
(s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26
(dd, J = 1,8 & 8,1
Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-Vinyl), 7,09 (m, 1H, CONHCH2),
6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48
(m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3 × NCH2), 1,59 (m, 4H, 2 × CH2).
MS-EI
m/z 518 und 520 [M+ – 1 und M+ +
1]
-
Beispiel 6
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(46 mg, 0,22 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid
(65 mg) kondensiert, wodurch 60 mg (55 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,86
(s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41
(m, 4H), 7,26 (dd, J = 2,2 & 8,3
Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-Vinyl), 7,04 (m, 1H, CONHCH2),
6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2),
2,48 (m, CH3), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2H,
3 × NCH2), 2,02 (s, 6H, 2 × NCH3).
MS
m/z 493 und 494,8 [M+ und M+ +
2].
-
Beispiel 7
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(0,47 g, 2,2 mmol) wurde mit 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
(0,75 g) kondensiert, wodurch 0,11 g (42 %) der Titelverbindung als
orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,86
(s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28
(m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2),
2,45 (s, 3H, CH3), 2,38 (q, J = 7,1 Hz,
4H, 2 × NCH2CH3), 2,26 (t, J
= 6,9 Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 6H, 2 × NCH2CH3).
MS-EI
m/z 535,0 und 537 [M+ und M+ +
2].
-
Beispiel 8
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethly-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-dimethylaminoethyl)amid
-
Ein
Gemisch aus tert-Butyl-3-oxobutyrat und Natriumnitrit (1 Äquiv.) in
Essigsäure
wurde bei Raumtemperatur gerührt,
wodurch tert-Butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrat erhalten wurde.
-
Ethyl-3-oxobutyrat
(1 Äquiv.),
Zinkstaub (3,8 Äquiv.)
und das rohe tert-Butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrat in Essigsäure wurden
bei 60 °C
für 1 Stunde
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in H2O gegossen
und das Filtrat wurde gesammelt, wodurch (65 %) 2-tert-Butyloxycarbonyl-3,5-dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol
erhalten wurde.
-
Ein
Gemisch aus 2-tert-Butyloxycarbonyl-3,5-dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol
und Triethylorthoformiat (1,5 Äquiv.)
in Trifluoressigsäure
wurde bei 15 °C
für 1 Stunde
gerührt.
Die Reaktion wurde konzentriert und der Rest wurde gereinigt, wodurch
(64 %) 2,4-Dimethyl-3-ethoxycarbonyl-5-formylpyrrol
als gelbe Nadeln erhalten wurde.
-
2,4-Dimethyl-3-ethoxycarbonyl-5-formylpyrrol
wurde unter Verwendung von Verfahren B hydrolysiert, wodurch (90
%) 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure erhalten wurde.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br s,
2H, NH und CO2H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44
(s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).
MS
m/z 267 [M+].
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(0,17 g, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid
(0,2 g, hergestellt durch Verfahren C) unter Verwendung von Verfahren B
kondensiert, wodurch 0,3 g (83 %) der Titelverbindung als gelber
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 13,60
(s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J = 1,8 Hz, 1H,
H-4), 7,75 (s, 1H, H-Vinyl), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,4
Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,42
(s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3),
2,38 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s,
6H, N(CH3)2).
MS-EI
m/z 430 und 432 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 9
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-dimethylaminoethyl)amid
-
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(0,17 g, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid
(0,2 g) kondensiert, wodurch 0,13 g (36 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 13,59
(s, br, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1H,
H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H),
7,30 (dd, J = 1,6 & 7,9
Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3),
2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,8 Hz,
2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/z 428 [M+].
-
Beispiel 10
-
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-dimethylaminoethyl)amid
-
5-Chlor-1,3-dihydroindol-2-on
(0,1 g, 0,6 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-dimethylaminoethyl)amid
(0,15 g) kondensiert, wodurch 0,22 g (90 %) der Titelverbindung
als gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 7,96 (d, J = 2,0 Hz, 1H,
H-4), 7,75 (s, 1H, H-Vinyl), 7,50 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,12 (dd, J = 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J = 8,3
Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,42
(s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3),
2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s,
6H, N(CH3)2).
MS-EI
m/z 386 [M+].
-
Beispiel 11
-
5(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(0,17 g, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(0,2 g) kondensiert, wodurch 0,09 g (26 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1H,
H-4), 7,76 (s, 1H, H-Vinyl), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,0
Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55
(m, 6H, 3 × NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3),
2,42 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 7,2 Hz,
6H, 2 × NCH2CH3).
MS-EI
m/z 458 und 460 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 12
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(0,09 g, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(0,1 g) kondensiert, wodurch 0,14 g (81 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H,
H-4), 7,76 (s, 1H, H-Vinyl), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J = 8,5
Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH2), 2,54
(t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, unter
DMSO), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,66-1,69 (m, 4H, 2 × CH2).
MS-EI
m/z 456 und 458 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 13
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(0,09 g, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
(0,1 g) kondensiert, wodurch 0,1 g (59 %) der Titelverbindung als
orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63
(s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H,
H-4), 7,77 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20
(s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, l H, H-7),
4,02 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q,
J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3),
1,93 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/z 467 und
469 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 14
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
-
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(80 mg, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(0,1 g) unter Verwendung von Verfahren B kondensiert, wodurch 79
mg (46 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,66
(s, br, 1H, NH), 10,95 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H),
7,81 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H),
7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 × NCH2),
2,44 (s, 6H, 2 × CH3), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6H, 2 × NCH2CH3).
MS-EI
m/z 456 [M+].
-
Beispiel 15
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(0,04 g, 0,2 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(0,04 g) kondensiert, wodurch die Titelverbindung als gelb-orangefarbener
Feststoff erhalten wurde.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 13,65
(s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1H),
7,80 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, J = 6,3
Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31
(m, 1H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2 × NCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2),
2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m,
unter DMSO), 2,43 (s, 6H, 2 × CH3), 1,66 (m, 4H, 2 × CH2).
MS-EI
m/z 454 [M+].
-
Beispiel 16
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
-
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(8 mg, 0,04 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
(10 mg) kondensiert, wodurch 10 mg (59 %) der Titelverbindung als
orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67
(s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1,2 Hz, 1H),
7,81 (s, 1H, H-Vinyl), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m,
1H, CONHCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t,
J = 6,5 Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q, J = 6,5
Hz, 2H, CONHCH2), 2,44 (s, 6H, 2 × CH3), 1,93 (m, 2H, CH2CH2CH2).
MS-EI
m/z 465 [M+].
-
Beispiel 17
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
-
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(0,08 g, 0,4 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(0,1 g) kondensiert, wodurch 65 mg (38 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H),
7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d,
J = 1,2 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55
(m, 6H, 3 × NCH2), 2,44 (s, 3H, CH3),
2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz,
6H, 2 × NCH2CH3).
MS-EI
m/z 456 [M+].
-
Beispiel 18
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(30 mg, 0,15 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(40 mg) kondensiert, wodurch 5,9 mg (8,5 %) der Titelverbindung
als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99
(s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51
(m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36
(m, 2H), 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3 × NCH2), 2,55 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2),
2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 × CH2).
MS-EI
m/z 454 [M+].
-
Beispiel 19
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
-
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(8 mg, 0,04 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-imidazol-1-ylpropyl)amid
(10 mg) kondensiert, wodurch 7,3 mg (43 %) der Titelverbindung als orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 13,62
(s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H),
7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J = 1,4 & 8,2 Hz, 1H),
7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J
= 6,9 Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NCH2CH2), 2,43 (s, 3H,
CH3), 2,41 (s, 3H, CH3),
1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2).
MS-EI
m/z 465 [M+].
-
Beispiel 20
-
5-[6-(3,5-Dichlorphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
-
6-(3,5-Dichlorphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
(64 mg, 0,23 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(60 mg) kondensiert, wodurch 53 mg (44 %) der Titelverbindung als
hellbrauner Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,62
(s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71
(m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH2), 7,37 (m,
2H), 7,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58
(m, 6H, 3 × NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3),
2,42 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 6,8 Hz,
6H, 3 × NCH2CH3).
MS m/z
526,9 [M+ + 1].
-
Beispiel 21
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
-
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on
(40 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(50 mg) kondensiert, wodurch 29 mg (33 %) der Titelverbindung als
hellorangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62
(s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d,
J = 5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,70 (s,
1H, H-Vinyl), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,14
(s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,55 (m,
3 × NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3),
2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz,
6H, 2 × NCH2CH3).
MS-EI
m/z 457 [M+].
-
Beispiel 22
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-Ryrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on
(60 mg, 0,28 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(75 mg) kondensiert, wodurch 90 mg (71 %) der Titelverbindung als
hellorangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H),
8,54 (dd, J = 1,5 & 4,8
Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-Vinyl),
7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,2 Hz,
1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H,
3 × NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3),
2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 × CH2).
MS-EI m/z 455 [M+].
-
Beispiel 23
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-dimethylaminopropyl)amid
-
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydroindol-2-on
(42 mg, 0,2 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-dimethylaminopropyl)amid
(50 mg) kondensiert, wodurch 67 mg (75 %) der Titelverbindung als
gelb-brauner Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s,
br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-Vinyl),
7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H),
7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2),
2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2),
2,14 (s, 6H, 2 × NCH3), 1,64 (m, 2H, CH2).
MS-EI
m/z 443 [M+].
-
Beispiel 24
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-dimethyaminopropyl)amid
-
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(67 mg, 0,32 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-dimethylaminopropyl)amid
(81 mg) kondensiert, wodurch 40 mg (28 %) der Titelverbindung als orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 13,66
(s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H),
7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m,
1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2 × CH3), 2,27 (m, 2H, NCH2),
2,13 (s, 6H, 2 × NCH3), 1,63 (m, 2H, CH2).
MS-EI
m/z 442 [M+].
-
Beispiel 25
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-5-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-diethylaminopropyl)amid
-
5-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(1,5 g, 7,16 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
(2 g) kondensiert, wodurch 1,3 g (40 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 13,64
(s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8
(s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 und 8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J =
5,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, ArH),
7,3 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2
(m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3 × NCH2 und 2 × CH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J
= 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI
m/z 470 [M+].
-
Beispiel 26
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-diethylaminopropyl)amid
-
6-Phenyl-1,3-dihydroindol-2-on
(1,5 g, 7,16 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
(2 g) kondensiert, wodurch 1,9 g (57 %) der Titelverbindung als
orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58
(s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6
(m, 4H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d,
J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2),
2,5 (m, 12H, 3 × NCH2 und 2 × CH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J
= 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI
m/z 470 [M+].
-
Beispiel 27
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(3-diethylaminopropyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(0,5 g, 2,36 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
(0,51 g) kondensiert, wodurch 0,84 g der Titelverbindung als rot-orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 13,61
(s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, ArH), 7,
7 (m, 4H), 7,2 (dd, J = 1, 8 und 8, 3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J =
7, 8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2 × NCH2),
3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2 und 2 × CH3), 2,4 (s, 6H, 2 × CH3),
1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EI m/z 472 und 474 [M+ – 1
und M+ + 1].
-
Beispiel 28
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(100 mg, 0,47 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(150 mg) kondensiert, wodurch 0,15 g (62 %) der Titelverbindung als
gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,97
(s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84
(m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J = 1,3 und 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8
(d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH und NHCH2), 2,5 (br m, 6H, 3 × NCH2),
1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2 × CH3), 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 × CH3), 0,96 (m, 6H, 2 × CH2CH3).
MS-EI m/z 514 und 516 [M+ – 1
und M+ + 1].
-
Beispiel 29
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(90 mg, 0,42 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylaminopropyl)amid
(140 mg) kondensiert, wodurch 54 mg (25 %) der Titelverbindung als rot-brauner
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 13,98
(s, 1H, NH), 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 2H), 7,78 (s,
1H, H-Vinyl), 7,23 (dd, J = 1,7 und 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J
= 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2),
3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 × NCH2),
1,7 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2 × CH3), 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6H, 2 × CH3), 1,06 (m, 6H, 2 × CH2CH3).
MS-EI m/z 528 und 530 [M+ – 1
und M+ + 1].
-
Beispiel 30
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-pyrrolidin-1-ylpropyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(130 mg, 0,6 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-diisopropyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-pyrrolidin-1-ylpropyl)amid
(150 mg, 0,45 mmol) kondensiert, wodurch 36 mg (15 %) der Titelverbindung
als bräunlich-orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 13,98
(s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,78 (s,
1H, H-Vinyl), 7,23 (dd, J = 1,6 und 7,6 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J
= 7,6 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2),
3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 × NCH2),
1,7 (br m, 6H, 3 × NCH2CH2), 1,28 (d, J
= 5,6 Hz, 6H, 2 × CH3), 1,24 (d, J = 5,7 Hz, 6H, 2 × CH3).
MS-EI m/z 526 und 528 [M+ – 1
und M+ + 1].
-
Beispiel 31
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethl-pyrrol-3-carbonsäure-(pyridin-4-ylmethyl)amid
-
5-Brom-1,3-dihydroindol-2-on
(170 mg, 0,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(pyridin-4-ylmethyl)amid
(200 mg) kondensiert, wodurch 14 mg (4 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300MHz, DMSO-d6) δ 13,67
(s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 & 4,3 Hz, 2H),
8,23 (t, J = 6,0 Hz, 1H, CONHCH2), 8,11
(d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-Vinyl), 7,31 (d, J = 6,0 Hz,
2H), 7,25 (dd, J = 1,9 & 8,1
Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2 × CH3).
MS-EI
m/z 450 und 452 [M+ – 1 und M+ +
1].
-
Beispiel 32
-
5-[6-(4-Butylphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
5-[6-(4-Butylphenyl)]-1,3-dihydroindol-2-on
(50 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(50 mg) kondensiert, wodurch 74 mg (76 %) der Titelverbindung als
orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58
(s, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,63
(s, 1H, H-Vinyl), 7,54 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH),
7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH2),
2,52-2,63 (m, 4H, 2 × CH2), 2,49 (m, 4H, 2 × CH2),
2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2 × CH2),
1,58 (m, 2H, CH2), 1,34 (m, 2H, CH2), 0,91 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/z 510 [M+].
-
Beispiel 33
-
5-[6-(4-Ethylphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
6-(4-Ethylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
(45 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(50 mg) kondensiert, wodurch 60 mg (65 %) der Titelverbindung als
gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,59
(s, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,64
(s, 1H, H-Vinyl), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d,
J = 1 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, CH2), 2,63 (m,
2H, CH2CH3), 2,55
(m, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2 × CH2), 2,42 (s, 3H, CH3),
2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 × CH2), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/z 482 [M+].
-
Beispiel 34
-
5-[6-(3-Isopropylphenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
6-(3-Isopropylphenyl)-1,3-dihydroindol-2-on
(48 mg, 0,19 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(50 mg) kondensiert, wodurch 59 mg (63 %) der Titelverbindung als
orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63
(s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,68
(s, 1H, H-Vinyl), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H,
CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2),
2,50 (m, 4H, 2 × CH2), 2,45 (s, 3H, CH3),
2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 4H, 2 × CH2), 1,27 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI
m/z 496 [M+].
-
Beispiel 35
-
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylaminoethyl)amid
-
5-Fluor-1,3-dihydroindol-2-on
(0,54 g, 3,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
kondensiert, wodurch 0,83 g (55 %) der Titelverbindung als gelb-grüner Feststoff
erhalten wurden.
1HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s,
1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9,4 Hz, 1H),
7,69 (s, 1H, H-Vinyl), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27
(m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3 × CH2), 2,43 (s, 3H, CH3),
2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz,
6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 398 [M+].
-
Beispiel 35 (alternative Synthese)
-
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
-
Hydrazinhydrat
(55 %, 3000 ml) und 5-Fluorisatin (300 g) wurden auf 100 °C erhitzt.
Weiteres 5-Fluor-isatin (500 g) wurde in Teilen (100 g) über 120
Minuten unter Rühren
zugegeben. Das Gemisch wurde auf 110 °C erhitzt und für 4 Stunden
gerührt.
Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe durch
Vakuumfiltration gesammelt, wodurch rohes (2-Amino-5-fluor-phenyl)-essigsäurehydrazid
(748 g) erhalten wurde. Das Hydrazid wurde in Wasser (700 ml) suspendiert
und der pH des Gemisches mit 12 N Salzsäure auf < pH 3 eingestellt. Das Gemisch wurde
für 12
Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt und zweimal
mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet,
wodurch 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (600 g, 73 % Ausbeute) als
braunes Pulver erhalten wurde. 1H-NMR (Dimethylsulfoxid-d6) δ 3,46
(s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3 × m, 3H,
aromatisch), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152 [M + 1].
-
3,5-Dimethyl-1H-pyrrol-2,4-dicarbonsäure-2-tert-butylester-4-ethylester
(2600 g) und Ethanol (7800 ml) wurden kräftig gerührt, während 10 N Salzsäure (3650
ml) langsam zugegeben wurde. Die Temperatur stieg von 25 °C auf 35 °C und Gasentwicklung
begann. Das Gemisch wurde auf 54 °C
erwärmt
und unter weiterem Erhitzen für
eine Stunde gerührt,
wobei die Temperatur zu dieser Zeit 67 °C betrug. Das Gemisch wurde auf
5 °C abgekühlt und
321 Eis und Wasser wurden langsam unter Rühren zugegeben. Der Feststoff
wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen.
Der Feststoff wurde auf konstantes Gewicht luftgetrocknet, wodurch
2,4-Dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
(1418 g, 87 % Ausbeute) als pinkfarbener Feststoff erhalten wurde. 1H-NMR (Dimethylsulfoxid-d6) δ 2,10, 2,35
(2 × s,
2 × 3H,
2 × CH3), 4,13 (q, 2H, CH2),
6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167 [M + 1].
-
Dimethylformamid
(322 g) und Dichlormethan (3700 ml) wurden in einem Eisbad auf 4 °C abgekühlt, und
Phosphor(V)-oxidchlorid (684 g) wurde unter Rühren zugegeben. Fester 2,4-Dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
(670 g) wurde langsam in aliquoten Teilen über 15 Minuten zugegeben. Die
maximale erreichte Temperatur betrug 18 °C. Das Gemisch wurde unter Rückfluß für eine Stunde
erhitzt, auf 10 °C
in einem Eisbad abgekühlt,
und 1,61 Eiswasser wurden schnell unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur
stieg auf 15 °C.
10 N Salzsäure
(1,61) wurde unter kräftigem
Rühren
zugegeben. Die Temperatur stieg auf 22 °C. Das Gemisch wurde für 30 Minuten
stehen gelassen und die Schichten konnten sich trennen. Die Temperatur stieg
auf maximal 40 °C.
Die wäßrige Schicht
wurde auf pH 12–13
mit 10 N Kaliumhydroxid (3,8 l) bei einer Rate eingestellt, bei
der die Temperatur 55 °C
erreichen und bei dieser während
der Zugabe gehalten werden konnte. Nach der Beendigung der Zugabe
wurde das Gemisch auf 10 °C
abgekühlt
und für
1 Stunde gerührt. Der
Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und viermal mit
Wasser gewaschen, wodurch 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
(778 g, 100 % Ausbeute) als gelber Feststoff erhalten wurde. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 1,25 (t,
3H, CH3), 2,44, 2,48 (2 × s, 2 × 3H, 2 × CH3),
4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15
(br s, 1H, NH). MS m/z 195 [M + 1].
-
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
(806 g), Kaliumhydroxid (548 g), Wasser (2400 ml) und Methanol (300
ml) wurden unter Rückfluß unter
Rühren
für zwei
Stunden erhitzt und dann auf 8 °C
abgekühlt.
Das Gemisch wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die wäßrige Schicht
wurde auf pH 4 mit 1000 ml 10 N Salzsäure eingestellt, wobei die
Temperatur unter 15 °C
gehalten wurde. Wasser wurde zugegeben, um das Rühren zu erleichtern. Der Feststoff
wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, dreimal mit Wasser gewaschen
und unter Vakuum bei 50 °C
getrocknet, wodurch 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (645 g, 93,5 % Ausbeute)
als gelber Feststoff erhalten wurde. NMR (DMSO-d6) δ 2,40, 2,43
(2 × s, 2 × 3H, 2 × CH3), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH
+ COOH). MS m/z 168 [M + 1].
-
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (1204
g) und 6020 ml Dimethylformamid wurden bei Raumtemperatur gerührt, während 1-(3-Dimethyl-aminopropyl-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(2071 g), Hydroxybenzotriazol (1460 g), Triethylamin (2016 ml) und
Diethylethylendiamin (1215 ml) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde
für 20
Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Gemisch wurde mit 3000 ml Wasser verdünnt, 2000 ml Salzlösung und
3000 ml gesättigte
Natriumbicarbonatlösung
wurden zugegeben und der pH auf mehr als 10 mit 10 N Natriumhydroxid
eingestellt. Das Gemisch wurde zweimal mit jeweils 5000 ml 10%igem
Methanol in Dichlormethan extrahiert und die Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne rotationsverdampft. Das
Gemisch wurde mit 1950 ml Toluol verdünnt und erneut zur Trockne
rotationsverdampft. Der Rest wurde mit 3 : 1 Hexan : Diethylether
(4000 ml) verrieben. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration
gesammelt, zweimal mit 400 ml Ethylacetat gewaschen und unter Vakuum
bei 34 °C
für 21
Stunden getrocknet, wodurch 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(819 g, 43 % Ausbeute) als hellbrauner Feststoff erhalten wurde. 1H-NMR (Dimethylsulfoxid-d6) δ 0,96 (t,
6H, 2 × CH3), 2,31, 2,38 (2 × s, 2 × CH3),
2,51 (m, 6H, 3 × CH2), 3,28 (m, 2H, CH2), 7,34
(m, 1H, Amid-NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS
m/z 266 [M + 1].
-
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)-amid
(809 g), 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (438 g), Ethanol (8000 ml)
und Pyrrolidin (13 ml) wurden bei 78 °C für 3 Stunden erhitzt. Das Gemisch
wurde auf Raumtemperatur abgekühlt
und die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Ethanol
gewaschen. Die Feststoffe wurden mit Ethanol (5900 ml) bei 72 °C für 30 Minuten
gerührt.
Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Feststoffe wurden
durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und unter
Vakuum bei 54 °C
für 130
Stunden getrocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid
(1013 g, 88 % Ausbeute) als orangefarbener Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR (Dimethylsulfoxid-d6) δ 0,98 (t,
6H, 2 × CH3), 2,43, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH3),
2,50 (m, 6H, 3 × CH2), 3,28 (q, 2H, CH2),
6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5 × m, 5H, aromatisch, Vinyl,
CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 397
[M – 1].
-
Beispiel 36
-
3-[4-(2-Diethylaminoethylcarbamoyl)-3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-carbonsäure
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-carbonsäure (80
mg, 0,45 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
kondensiert, wodurch 210 mg (92 %) der Titelverbindung als gelb-orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360
MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d,
J = 8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-Vinyl), 7,57 (dd, J = 1,5 & 8,0 Hz, 1H),
7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,88
(m, H-Piperidin), 2,54 (m, 6H, 3 × CH2),
2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-Piperidin), 0,97 (t, J = 6,98
Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 424 [M+].
-
Beispiel 37
-
5-(5-Dimethylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid
(90 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(100 mg) kondensiert, wodurch 100 mg (54 %) der Titelverbindung
als gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,65
(s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-Vinyl), 7,48-7,53
(m, 2H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2),
2,61 (s, 6H, N(CH3)2),
2,56 (t, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2 × CH2), 2,45 (s, 3H, CH3),
2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2 × CH2).
MS-EI m/z 485 [M+].
-
Beispiel 38
-
5-[5-(3-Chlorphenylsulfamoyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimeth
pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)amid
(120 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(100 mg) kondensiert, wodurch 150 mg (69 %) der Titelverbindung
als gelb-orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br
s, 1H, NH), 10,30 (br s, 1H, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-Vinyl),
7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07
(m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH2),
2,57 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m,
4H, 2 × CH2), 2,44 (s, 3H, CH3),
2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2 × CH2).
MS m/z 568 [M+].
-
Beispiel 39
-
2,4-Dimethyl-5-[2-oxo-5-(pyridin-3-ylsulfamoyl)-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurepyridin-3-ylamid
(110 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-ylethyl)amid
(100 mg) kondensiert, wodurch 150 mg (74 %) der Titelverbindung
als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58
(s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H,
H-Vinyl), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d,
J = 8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,56
(t, J = 7,06 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H,
2 × CH2), 2,43 (s, 6H, 2 × CH3),
1,68 (m, 4H, 2 × CH2).
MS m/z 535 [M+].
-
Beispiel 40
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3-[3,5-Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-ylmethylen]-4-(2-hydroxyethyl)-1,3-dihydroindol-2-on
-
4-(2-Hydroxyethyl)-1,3-dihydroindol-2-on
(71 mg, 0,4 mmol) wurde mit 3,5-Dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-carbaldehyd
kondensiert, wodurch 90 mg (55 %) der Titelverbindung als orangefarbener
Feststoff erhalten wurden.
1HNMR (300
MHz, DMSO-d6) δ 14,25
(s, 1H, NH), 10,88 (s, 1H, NH), 7,57 (s, 1H, H-Vinyl), 7,03 (m,
1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H, OH), 3,70 (m, 2H, CH2), 3,04 (m, 2H, CH2),
2,48 (m, 4H, 2 × CH2), 2,28 (br s, 7H), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,18 (s, 3H, CH3).
MS
m/z (+ve) 409,3 [M+].
-
Beispiel 41
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3-[3,5-Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid
(110 mg, 0,4 mmol) wurde mit 3,5-Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-carbaldehyd
(100 mg) kondensiert, wodurch 50 mg (24 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 13,52
(s, 1H, NH), 11,26 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J =
1,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-Vinyl), 7,50 (dd, J = 1,6 & 8,3 Hz, 1H),
7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H, 2 × CH2), 2,28 (m, 10H, 2 × CH3 & 2 × CH2), 2,18 (s, 3H, CH3).
MS-EI
m/z 519 [M+].
-
Beispiel 42
-
5-(5-Dimethylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid
(90 mg, 0,38 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(100 mg) kondensiert, wodurch 80 mg (43 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(300 MHz, DMSO-d6) δ 11,30
(s, 1H, NH), 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-Vinyl), 7,49
(dd, J = 1,7 & 8,0
Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2),
7,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH2),
2,60 (s, 6H, N(CH3)2),
2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2 × CH3 & N(CH2CH3)2),
0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI
m/z 487 [M+].
-
Beispiel 43
-
5-[5-(3-Chlorphenylsulfamoyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
-
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)amid
(120 mg, 3,8 mmol) wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid
(100 mg) kondensiert, wodurch 80 mg (37 %) der Titelverbindung als
gelber Feststoff erhalten wurden.
1HNMR
(360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55
(s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J =
1,87 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-Vinyl), 7,52 (dd, J = 1,87 & 8,3 Hz, 1H),
7,42 (m, 1H, CONHCH2CH2),
7,22 (t, J = 8,02 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 2 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H),
7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,48-2,57
(m, 6H, 3 × CH2), 2,45 (s, 3H, CH3),
2,44 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz,
6H, N(CH2CH3)2).
MS m/z 570,1 [M+].
-
Beispiel 44
-
{[4-Methyl-5-(4-methyl-5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonyll-amino}-essigsäureethyl
-
4-Methyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
(lit. ref. D. O. Cheng, T. L. Bowman und E. LeGoff; J. Heterocyclic
Chem.; 1976; 13; 1145–1147)
wurde unter Verwendung von Verfahren A formyliert, unter Verwendung
von Verfahren B hydrolysiert, gefolgt von Amidierung (Verfahren
C), wodurch [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester
erhalten wurde.
-
4-Methyl-5-methylaminosulfonyl-2-oxindol
(50 mg, 0,21 mmol) wurde mit [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester
(100 mg, 0,42 mmol) und Pipe ridin (0,1 ml) in Ethanol (2 ml) kondensiert,
wodurch 50 mg (52 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
1HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v.
br. s, 1N, NH-CO), 8,33 (t, J = 5,8 Hz, 1H, CONHCH2),
7,83 (d, J = 3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-Vinyl), 7,71 (d, J = 8,5
Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3), 6,89 (d,
J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J = 5,8 Hz, 2H, GlyCH2), 2,86 (s, 3H, CH3), 2,48
(s, 3H, CH3), 2,42 (d, J = 4,71 Hz, 3H,
HNCH3), 1,20 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI
m/z 460 [M+].
-
Beispiel 45
-
{[4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidemnethyl)-1H-pyrrol-3-carbonyl]-amino}-essigsäureethylester
-
Ein
Gemisch aus 5-Methylaminosulfonyl-2-oxindol (0,06 g, 0,22 mmol),
[(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester
(0,075 g, 0,27 mmol) und Piperidin (2 Tropfen) in Ethanol (5 ml) wurde
in einem Bombenrohr bei 90 °C
für 12
Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen
wurde der Niederschlag durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol
gewaschen, mit Dichlormethan/Ether verrieben und getrocknet, wodurch
0,035 g (36 %) der Titelverbindung als gelblich-brauner Feststoff
erhalten wurden.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s,
1H, NH), 11 (v. br. s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 8,25 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H,
H-Vinyl), 7,84 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,57 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H),
7,14 (br m, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J = 8,5
Hz, 1H), 4,11 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J = 5,7 Hz, 2H, GlyCH2), 2,55 (s, 3H, CH3),
2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J = 6,7 Hz,
3H, OCH2CH3).
MS
m/z 446 [M+].
-
Beispiel 46
-
{[4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonyll-amino}-essigsäure
-
Ein
Gemisch aus [(5-Formyl-4-methyl-1H-pyrrol-3-carbonyl)-amino]-essigsäureethylester
(0,142 g, 0,59 mmol) und 1N NaOH (1,2 ml) in Methanol (10 ml) wurde
bei Raumtemperatur für
1 Stunde gerührt.
Die Reaktion wurde konzentriert und der Rest wurde mit 5-Methylaminosulfonyl-2-oxindol
(0,13 g, 0,48 mmol) und Piperidin (0,12 ml) in Ethanol (12 ml) kondensiert,
wodurch 0,11 g (52 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (br s, 1H, NH), 8,17
(s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 2 & 8,2 Hz, 1H),
7,21 (m on br s, 2H), 6,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 4,2
Hz, 2H, CH2NH), 2,54 (s, 3H, Pyrrol-CH3), 2,39 (s, 3H, ArCH3).
MS
m/z 417 [M – 1]+.
-
Beispiel 48
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid
-
Ein
Gemisch aus 1,3-Dihydro-indol-2-on (266 mg, 2 mmol), 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid
(530 mg, 2 mmol) und Piperidin (1 Tropfen) in Ethanol wurde bei
90 °C für 2 Stunden
erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, der
resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesammelt,
mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch 422 mg (55 %) der
Titelverbindung als hellgelber Feststoff erhalten wurden.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,7 (s,
1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H,
H-Vinyl), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H),
6,99 (dt, J = 1,2 & 7,6
Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H),
2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS
+ ve APCI 381 [M+ + 1].
-
Beispiel 49
-
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid
-
Ein
Gemisch aus 5-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on (335 mg, 2 mmol), 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)-amid
(530 mg, 2 mmol) und Piperidin (1 Tropfen) in Ethanol wurde bei 90 °C für 2 Stunden
erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, der
resultierende Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gesam melt,
mit Ethanol gewaschen und getrocknet, wodurch 565 mg (68 %) der
Titelverbindung als orangefarbener Feststoff erhalten wurden.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s,
1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H,
H-Vinyl), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J = 2,1 & 8,4 Hz, 1H) 6,87 (d, J = 8,4 Hz,
1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3),
2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz,
6H, N(CH2CH3)2).
MS + ve APCI 415 [M+ +
1].
-
Beispiel 50
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ethyl)-amid
-
1,3-Dihydro-indol-2-on
wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-ylethyl)-amid
kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
MS
+ ve APCI 379 [M+ + 1].
-
Beispiel 51
-
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
-
5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on
wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
MS
+ ve APCI 397 [M+ + 1].
-
Verfahren im großen Maßstab:
-
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (61
g), 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (79 g), Ethanol (300 ml) und
Pyrrolidin (32 ml) wurden unter Rückfluß für 4,5 Stunden erhitzt. Essigsäure (24
ml) wurde zu dem Gemisch zugegeben und das Erhitzen unter Rückfluß wurde
für 30
Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und
die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt und zweimal mit Ethanol
gewaschen. Die Feststoffe wurden für 130 Minuten in 40 % Aceton
in Wasser (400 ml), enthaltend 12 N Salzsäure (6,5 ml), gerührt. Die
Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration gesammelt und zweimal mit
40 % Aceton in Wasser gewaschen. Die Feststoffe wurden unter Vakuum
ge trocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (86
g, 79 % Ausbeute) als orangefarbener Feststoff erhalten wurde.
1H-NMR (Dimethylsulfoxid-d6) δ 2,48, 2,50
(2 × s,
6H, 2 × CH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4 × m, 4H,
aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH),
1.3,82 (s, 1H, Pyrrol-NH). MS m/z 299 [M – 1].
-
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (100
g) und Dimethylformamid (500 ml) wurden gerührt und Benzotriazol-1-yloxytris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat
(221 g), 1-(2-Aminoethyl)pyrrolidin (45,6 g) und Triethylamin (93
ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Das feste Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und mit
Ethanol gewaschen. Die Feststoffe wurden unter Rühren in Ethanol (500 ml) für eine Stunde
bei 64 °C
durch Aufschlämmung
gewaschen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Feststoffe wurden
durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und unter
Vakuum getrocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
(101,5 g, 77 % Ausbeute) erhalten wurde. 1H-NMR
(Dimethylsulfoxid-d6) δ 1,60 (m, 4H, 2 × CH2), 2,40, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH3),
2,50 (m, 4H, 2 × CH2), 2,57, 3,35 (2 × m, 4H, 2 × CH2),
7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4 × m,
4H, aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, Pyrrol-NH).
MS m/z 396 [M + 1].
-
Beispiel 52
-
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
-
5-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on
wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amid
kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
MS
+ ve APCI 413 [M+ + 1].
-
Beispiel 53
-
2,4-Dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-di-methylaminoethyl)-amid
-
1,3-Dihydro-indol-2-on
wurde mit 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-di-methylaminoethyl)amid
kondensiert, wodurch die Titelverbindung erhalten wurde.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s,
1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-Vinyl),
7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J = 7,7
Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3),
2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz,
2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).
MS + ve APCI 353 [M+ +
1].
-
Beispiel 98
-
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-ethylamino-ethyl)-amid
-
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-ethylamino-ethyl)-amid
(99 g), Ethanol (400 ml), 5-Fluor-2-oxindol (32 g) und Pyrrolidin
(1,5 g) wurden unter Rückfluß für 3 Stunden
unter Rühren
erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und
die Feststoffe durch Vakuumfiltration gesammelt. Die Feststoffe
wurden in Ethanol bei 60 °C
gerührt,
auf Raumtemperatur abgekühlt
und durch Vakuumfiltration gesammelt. Das Produkt wurde unter Vakuum
getrocknet, wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-ethylamino-ethyl)-amid
(75 g, 95 % Ausbeute) erhalten wurde. 1H-NMR
(Dimethylsulfoxid-d6) δ 1,03 (t, 3H, CH3),
2,42, 2,44 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70,
3,30 (2 × t,
4H, 2 × CH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5 × m, 5H,
aromatisch, Vinyl und CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s,
1H, Pyrrol-NH).
MS m/z 369 [M – 1].
-
Beispiel 95
-
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]-amid
-
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (120
mg, 0,4 mmol) wurde mit EDC, HCl (96 mg, 0,5 mmol), wasserfreiem
1-Hydroxy-benzotriazol (68 mg, 0,5 mmol) und 2-(2-Aminoethylpyridin,
bezogen von Aldrich, in wasserfreiem DMF (3 ml) für 2–3 Tage
bei Raumtemperatur geschüttelt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit 1M NaHCO3 (1,5
ml), dann mit 8 ml Wasser verdünnt.
Das ausgefällte
Rohprodukt wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen,
getrocknet und durch Kristallisation oder Chromatographie gereinigt,
wodurch 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
erhalten wurde.
-
Beispiel 94
-
5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
-
Durch
die Verfahrensweise, wie im vorstehenden Beispiel beschrieben, aber
unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (127
mg) wurde 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
bereitgestellt.
-
Beispiel 97
-
5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyll-2,4-dimethvl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
-
Durch
die Verfahrensweise, wie im obigen Beispiel 95 beschrieben, aber
unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (145
mg) wurde 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
bereitgestellt.
-
Beispiel 96
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5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
-
Durch
die Verfahrensweise, wie im obigen Beispiel 95 beschrieben, aber
unter Ersetzen von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch
5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (113
mg) wurde 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(pyridin-1-yl)ethyl]amid
bereitgestellt.
-
Beispiele 91, 92, 93 und 101
-
Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch 1-(2-Aminoethyl)pyrrolidin, bezogen von Aldrich Chemical Company,
Inc., wurden die gewünschten
Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiele 62 bis 65
-
Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch 1-(2-Aminoethyl)imidazolin-2-on (hergestellt durch Erhitzen
von Dimethylcarbonat mit Bis(2-aminoethyl)amin (2 Äquivalente)
in einem verschlossenen Kolben bei 150 °C für 30 min. gemäß der in
US-Patent 2613212 (1950), von Rohm & Haas Co. beschriebenen Verfahrensweise.
Das Rohprodukt wurde auf Siliciumdioxid unter Verwendung eines Elutionsgemisches
aus Chloroform-Methanolwäßrigem Ammoniak
80 : 25 : 2 gereinigt), wurden die gewünschten Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiele 66 bis 68 und 89
-
Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch 4-(2-Aminoethyl)piperazin-1-essigsäureethylester (hergestellt
wie folgt: Piperazin-1-essigsäureethylester
(11,22 g) wurde mit Iodacetonitril (5,0 ml) in Gegenwart von Kaliumcarbonat
(6,9 g) in Ethylacetat (260 ml) bei 0 °C behandelt. Nachdem die Iodacetonitrilzugabe
beendet war (45 min), wurde das Reaktionsgemisch anschließend bei
Raumtemperatur für
11 Stunden gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und die Filtrate eingedampft.
Der Rest wurde in Gegenwart von Kobaltborid (hergestellt aus CoCl2
und Natriumborhydrid) bei Raumtemperatur bei 50 psi für 2 Tage
in Etha nol hydriert. Filtration, Eindampfen und chromatographische
Reinigung unter Verwendung eines Elutionsgemisches aus Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak
80 : 25 : 2 ergab das gewünschte
Amin (3,306 g) als hellgelbes Öl),
wurden die folgenden Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiel 69 bis 72
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Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch 1-(3-Aminopropyl)-azepin-2-on (hergestellt gemäß dem Verfahren in
Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705–14, außer, daß die Hydrolyse
von DBU bei 145 °C
rein in Gegenwart von Lithiumhydroxid durchgeführt wurde (l h, 5 ml DBU, 2
ml Wasser, 420 mg Lithiumhydroxidhydrat), wobei die Reinigung des
Rohproduktes auf Siliciumdioxid unter Verwendung eines Elutionsgemisches aus
Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak
80 : 40 : 4 1-(3-Aminopropyl)azepin-2-on (4,973 g, 87 % Ausbeute) ergab),
wurden die gewünschten
Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiele 54 bis 56 und 73
-
Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch N-Acetylethylendiamin (hergestellt durch Erhitzen eines Gemisches
aus Ethylacetat mit Ethylendiamin (1,5 Äquivalente) auf 160 °C für 1 h in
einem verschlossenen Behälter.
Die Vakuumdestillation ergab das gewünschte Produkt in 56%iger Ausbeute.
N-Acetylethylendiamin ist auch von Aldrich erhältlich), wurden die gewünschten
Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiele 57 bis 60
-
Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch 1-(3-Aminopropyl)-tetrahydro-pyrimidin-2-on (hergestellt in der gleichen Weise,
wie 1-(3-Aminopropyl)-azepin-2-on, gemäß der Verfahrensweise in Kraft
A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705–14: Kurz, 1,3,4,6,7,8-Hexahydro-2H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin
(4,939 g), Lithiumhydroxidhydrat (918 mg) und 2 ml Wasser wurden
ohne Lösungsmittel
in einem verschlossenen Behälter
auf 145 °C
für 1 h
erhitzt. Das Rohprodukt wurde auf einer Siliciumdioxidsäule in Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak
80 : 40 : 4 gereinigt, wodurch reines Amin (5,265 g, 94 % Ausbeute)
erhalten wurde.), wurden die gewünschten
Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiele 61, 74 bis 75 und 90
-
Durch
die Verfahrensweise, wie in den obigen Beispielen 95, 94, 96 und
97 beschrieben, aber unter Ersetzen von 2-(2-Aminoethyl)pyridin
durch 1-(2-Aminoethyl)-piperazin-2-on (hergestellt wie folgt: Reines tert-Butyldiphenylsilylchlorid
(25 ml, 97,7 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus DBU (19,5 ml, 130 mmol)
und Bis(2-aminoethyl)amin (4,32 ml, 40 mmol) in wasserfreiem Dimethylacetamid
(80 ml) bei Raumtemperatur unter Kühlung an einem Wasserbad innerhalb
von 5 Minuten zugegeben. Das Gemisch wurde für 5 Stunden gerührt. Bromessigsäureethylester
(6,70 ml, 60 mmol) wurde rein unter Abkühlen auf Raumtemperatur zugegeben.
Die Reaktion wurde für
25 Minuten gerührt,
dann bei hohem Vakuum eingedampft. Der Rest wurde in Methanol (200
ml) gelöst,
KHCO3 (10 g) und KF (12 g, 200 mmol) wurden
zugegeben, und das Gemisch wurde bei 60 °C für 5 Stunden gerührt. 10
g Na2CO3 wurden
zugegeben, für
10 Minuten gerührt,
abgekühlt
und filtriert. Die Filtrate wurden eingedampft. Der Rest wurde mit
Hexanen (2 × 250
ml) extrahiert. Das Hexan-unlösliche
Material wurde in Ethanol (60 ml) gelöst, filtriert und eingedampft.
Der Rest wurde auf einer Siliciumdioxidsäule in Chloroform-Methanol-wäßrigem Ammoniak
80 : 40 : 4 gereinigt, wodurch reines Amin (4,245 g, 74 % Ausbeute)
erhalten wurde), wurden die gewünschten
Verbindungen bereitgestellt.
-
Beispiel 77
-
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)-ethyl]-amid
-
Zu
einem gerührten,
gelben, trüben
Gemisch aus 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (90
mg), DMF (0,8 ml) und TEA (0,084 ml) in einem 20-ml-Reaktionsröhrchen wurde
BOP-Reagens (199 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde nach 5 min klar.
2-(4-Methylpiperazin-1-yl)ethylamin1 (51
mg) wurde zu dem klaren Gemisch zugegeben. Die resultierende Lösung wurde bei
Raumtemperatur über
Nacht gerührt.
Gelbe feste Produkte fielen aus dem Reaktionssystem aus. Dünnschichtchromatographie
(10 % Methanol in Methylenchlorid) zeigte, daß das gesamte Ausgangsmaterial
zu dem Produkt umgewandelt worden war. Der Feststoff wurde durch
Vakuumfiltration isoliert und einmal mit Ethanol (1 ml) gewaschen.
Der Feststoff wurde in Diethylether (2 ml) für 20 min mit Ultraschall behandelt
und durch Vakuumfiltration gesammelt. Nach dem Trocknen unter Vakuum
wurde 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-yliden-methyl)-2,4-dimethyl- 1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid
(79 mg, 62 % Ausbeute) erhalten.
1H
NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3),
2,40, 2,42 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 2,41 (m, 2H, CH2),
2,47 (m, 8H, 4 × CH2), 3,30 (m, 2H, CH2),
6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, l H), 6,91 (td, 2J
= 2,4, 3J 8,8 Hz, 1H), 7,43 (t, J = 5,6
Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J = 2,8, 9,6 Hz, 1H) (aromatisch
und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z)
424,4 (M – 1).
-
Beispiel 78
-
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-ylethyl)-amid
-
Der
obigen Verfahrensweise in Beispiel 77 folgend, aber unter Ersetzen
von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch
5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (95
mg, 0,3 mmol) wurde 5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-ylethyl)-amid
(76 mg, 58 %) erhalten.
1H NMR (DMSO-d6) δ 2,13
(s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2 × s, 6H,
2 × CH3), 2,42 (m, 2H, CH2),
2,48 (m, 8H, 4 × CH2), 3,30 (m, 2H, CH2),
6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t,
J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch
und Vinyl), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440,2
(M-1).
-
Beispiel 79
-
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid
-
Der
in Beispiel 77 beschriebenen Verfahrenweise folgend, aber unter
Ersetzen von 5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure durch 5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, wurde 5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid
(39 mg, 54 %) aus SU011670 (54 mg, 0,15 mmol) erhalten.
1H NMR (DMSO-d6) δ 2,14 (s,
3H, CH3), 2,41, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH3),
2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4 × CH2), 3,31 (m, 2H, CH2),
6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t,
J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch
und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 486,6
(M).
-
Beispiel 81
-
5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid
-
Der
oben in Beispiel 77 beschriebenen Verfahrensweise folgend, aber
unter Ersetzen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, SU014900,
durch 5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, wurde
5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(4-methylpiperazin-1-yl-ethyl)-amid, SU014903,
(136 mg, 84 %) aus SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol) erhalten.
1H-NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s,
3H, CH3), 2,39, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH3),
2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4 × CH2), 3,30 (t, 2H, CH2),
6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,10 (t, J =
7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J
= 7,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61
(s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-1).
-
Beispiel 80
-
5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
-
Zu
einem gerührten,
gelben, trüben
Gemisch aus 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (112,8
mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 ml) und Triethylamin (0,111 ml) in einem
20-ml-Reaktionsröhrchen
wurde BOP-Reagens (265 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde nach 5 min klar.
2-(2,6-Dimethylpiperazin-1-yl)ethylamin (68,6 mg) (siehe Tapia,
L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. habeaga, A. Innerarity,
A. Orjales, J. Med. Chem., 1999, 42, 2870–2880) wurde zu dem klaren Gemisch
zugegeben. Die resultierende Lösung
wurde bei Raumtemperatur über
Nacht gerührt.
Dünnschichtchromatographie
(10 % Methanol in Methylenchlorid) zeigte, daß das gesamte Aus gangsmaterial
zu dem Produkt umgewandelt worden war. Das Reaktionsgemisch wurde
zur Trockne eingedampft und dann durch Flashchromatographie (CH2Cl2/CH3OH
= 20/1–15/1),
gefolgt von Umkristallisation, gereinigt, wodurch 5-[2-Oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
(83 mg, 50 % Ausbeute) erhalten wurde.
1H
NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2 × s, 6H,
2 × CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2),
2,41, 2,47 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 2,50 (m, 2H, CH2),
3,03 (d, J = 10 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2),
6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,97 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,11 (t, J =
7,8 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J
= 7,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62
(s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M + 1).
-
Beispiel 82
-
5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
-
Der
oben in Beispiel 77 beschriebenen Verfahrensweise folgend, wurde
die gewünschte
Verbindung (60 mg, 0,2 mmol) erhalten.
1H
NMR (DMSO-d6) δ 0,891, 0,907 (2 × s, 6N,
2 × CH3), 1,49 (t, J = 10,4 Hz, 2H), 2,40, 2,42
(2 × s,
6H, 2 × CH3), 2,41 (m, 2H, CH2),
2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,90
(td, 2J = 2,4, 3J
= 8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd,
J = 4,6, 8,4 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH),
13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M – 1).
-
Beispiel 83
-
5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
-
Der
obigen Verfahrensweise von Beispiel 80 folgend, wurde die gewünschte Verbindung
(31,2 mg, 34 %) aus 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (63
mg, 0,2 mmol) erhalten.
1H NMR (DMSO-d6) δ 1,15,
1,16 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2),
2,40, 2,42 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 2,50 (m, 2H, CH2),
3,03 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J
= 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97
(d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH),
13,63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456,2 (M + 1).
-
Beispiel 84
-
5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-pyrrol-3-carbonsäure[2-(3,5-dimethylpiperazin-1-yl)ethyl)amid
-
Der
in Beispiel 80 beschriebenen Verfahrensweise folgend, wurde die
gewünschte
Verbindung (40 mg, 40 %) aus 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (74 mg,
0,2 mmol) erhalten.
1H NMR (DMSO-d6) δ 1,15,
1,16 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2),
2,40, 2,42 (2 × s,
6H, 2 × CH3), 2,50 (m, 2H, CH2),
3,03 (d, J = 10,4 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J
= 2,0, 8,4 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,10
(d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH),
13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M – 1).
-
Biologische Beispiele
-
Die
folgenden Assays werden eingesetzt, um die Verbindungen zu finden,
die den optimalen Grad der gewünschten
Aktivität
zeigen.
-
A. Assayverfahren.
-
Die
folgenden Assays können
zur Bestimmung des Niveaus der Aktivität und Wirkung der verschiedenen
Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere PKs
verwendet werden. Ähnliche
Assays können
in Übereinstimmung
mit denselben Linien für
jede PK unter Verwendung von Techniken, die in der Technik allgemein
bekannt sind, gestaltet werden.
-
Mehrere
der hierin beschriebenen Assays werden in einem ELISA-Format (heterologer
Enzym-Immunassay) durchgeführt
(Voller, et. al., 1980, „Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay",
Manual of Clinical Immunology, 2. Aufl., Rose und Friedman, Am.
Soc. Of Microbio logy, Washington, D. C., S. 359–371). Das allgemeine Verfahren
lautet wie folgt: eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase
entweder natürlich
oder rekombinant exprimieren, für
einen ausgewählten
Zeitraum eingeführt,
woraufhin, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, der
bekanntermaßen
den Rezeptor aktiviert, zugegeben wird. Die Zellen werden lysiert
und das Lysat wird in die Löcher
einer ELISA-Platte, die vorher mit einem spezifischen Antikörper, der
das Substrat der enzymatischen Phosphorylierungsreaktion erkennt, überzogen
wurde, überführt. Nicht-Substrat-Komponenten
des Zellysats werden abgewaschen und die Menge der Phosphorylierung
auf dem Substrat mit einem Antikörper,
der spezifisch Phosphotyrosin erkennt, detektiert und mit Kontrollzellen,
die nicht mit einer Testverbindung kontaktiert wurden, verglichen.
-
Die
derzeit bevorzugten Protokolle zur Durchführung der ELISA-Experimenten
für spezielle
PKs werden nachstehend angegeben. Die Anpassung dieser Protokolle
zur Bestimmung der Aktivität
von Verbindungen gegen andere RTKs sowie für CTKs und STKs ist einem Fachmann
allgemein bekannt. Andere der hierin beschriebenen Assays messen
die Menge an DNA, die in Reaktion auf die Aktivierung einer Testkinase
erzeugt wurde, was ein allgemeines Maß für eine proliferative Antwort
ist. Das allgemeine Verfahren für
diesen Assay lautet wie folgt: eine Verbindung wird in Zellen, die
die Testkinase entweder natürlich
oder rekombinant exprimieren, für
einen ausgewählten
Zeitraum eingeführt,
woraufhin, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, der
bekanntermaßen
den Rezeptor aktiviert, zugegeben wird. Nach der Inkubation mindestens über Nacht,
wird ein DNA-markierendes Reagens wie 5-Bromdeoxyuridin (BrdU) oder
H3-Thymidin zugegeben. Die Menge an markierter
DNA wird entweder mit einem Anti-BrdU-Antikörper oder durch Messen der
Radioaktivität detektiert
und mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung kontaktiert
wurden, verglichen.
-
GST-FLK-1-BIOASSAY
-
Dieser
Assay analysiert die Tyrosinkinaseaktivität von GST Flk1 auf Poly(glu,
tyr)peptiden.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Corning-96-Loch-ELISA-Platten (Corning Katalog-Nr.
5805-96).
- 2. Poly(glu, tyr) 4 : 1, Lyophilisat (Sigma Katalog # P0275).
- 3. Herstellung von Poly(glu, tyr)(pEY)-überzogenen Assayplatten: Überzug 2 μg/Loch von
Poly(glu, tyr)(pEY) in 100 μl
PBS, gehalten bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei 4 °C über Nacht.
Die Platten wurden zur Verhinderung der Eindampfung gut abgedeckt.
- 4. PBS-Puffer: Für
1 l werden 0,2 g KH2PO4,
1,15 g Na2HPO4,
0,2 g KCl und 8 g NaCl in ungefähr
900 ml dH2O gemischt. Nach Auflösung aller
Reagenzien wird der pH mit HCl auf 7,2 eingestellt. Das Gesamtvolumen
wird mit dH2O auf 1 l gebracht.
- 5. PBST-Puffer: Auf 1 l PBS-Puffer wurden 1,0 ml Tween 20 zugegeben.
- 6. TBB-Blockierungspuffer: Für
1 l werden 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 ml TWEEN-20 in ungefähr 900 ml dH2O gemischt. Einstellen des pH auf 7,2 mit
HCl. Zugabe von 10 g BSA, Rühren
zum Auflösen.
Das Gesamtvolumen mit dH2O auf 1 l bringen.
Filtrieren zur Entfernung partikulärer Stoffe.
- 7. 1 % BSA in PBS: Zur Herstellung einer 1x Arbeitslösung werden
10 g BSA zu ungefähr
990 ml PBS-Puffer gegeben, Rühren
zum Auflösen.
Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit PBS-Puffer, Filtrieren
zum Entfernen partikulärer
Stoffe.
- 8. 50 mM Hepes, pH 7,5.
- 9. GST-Flk1cd, gereinigt aus sf9 rekombinanter Baculovirustransformation
(SUGEN, Inc.).
- 10. 4 % DMSO in dH2O.
- 11. 10 mM ATP in dH2O.
- 12. 40 mM MnCl2
- 13. Kinase-Verdünnungspuffer
(KDB): Mischen von 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5M NaCl, 40 μl 100 mM Natriumorthovanadat
und 0,4 ml 5 % BSA in dH2O mit 88,56 ml
dH2O.
- 14. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten, Applied Scientific
Katalog # AS-72092
- 15. EDTA: Mischen von 14,12 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
zu ungefähr
70 ml dH2O. Zugabe von 10 N NaOH bis sich
EDTA auflöst.
Einstellen des pH auf 8,0. Einstellen des Gesamtvolumens auf 100
ml mit dH2O.
- 16. 10 Antikörper-Verdünnungspuffer: Mischen von 10
ml 5 % BSA in PBS-Puffer mit 89,5 ml TBST.
- 17. monoklonaler Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase
(PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).
- 18. 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS,
Moss, Kat. Nr. ABST).
- 19. 10 % SDS.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 2 μg PolyEY-Peptid in sterilem
PBS, wie in Schritt 3 aus Materialien und Reagenzien beschrieben.
- 2. Entfernen ungebundener Flüssigkeit
aus den Löchern
durch Umdrehen der Platte. Einmal Waschen mit TBST. Klopfen der
Platte auf ein Papiertuch, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- 3. Zugabe von 100 μl
1 % BSA in PBS in jedes Loch. Inkubieren unter Schütteln für eine Stunde
bei Raumtemperatur.
- 4. Wiederholen von Schritt 2.
- 5. Tränken
der Löcher
mit 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 μl/Loch).
- 6. Verdünnen
der Testverbindung mit dH2O/4 % DMSO auf
das 4fache der gewünschten
endgültigen
Assaykonzentration in 96-Loch-Polypropylenplatten.
- 7. Zugabe von 25 μl
der verdünnten
Testverbindung in die ELISA-Platte. Geben von 25 ml dH2O/4
% DMSO in die Kontrollöcher.
- 8. Zugabe von 25 μg
mM MnCl2 mit 4x ATP (2 μM) in jedes Loch.
- 9. Zugabe von 25 μl
0,5 M EDTA zu den Negativkontrollöchern.
- 10. Verdünnen
von GST-Flk1 auf 0,005 μg
(5 ng)/Loch mit KDB.
- 11. Zugabe von 50 μl
verdünntem
Enzym zu jedem Loch.
- 12. Inkubieren unter Schütteln
für 15
Minuten bei Raumtemperatur.
- 13. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 50 μl 250 mM
EDTA (pH 8,0).
- 14. Waschen 3x mit TBST und Abtupfen der Platte mit einem Papiertuch,
um überschüssige Flüssigkeit
zu entfernen.
- 15. Zugabe von 100 μl
pro Loch Anti-Phosphotyrosin-HRP-Konjugat, 1 : 5.000 Verdünnung in
Antikörper-Verdünnungspuffer.
Inkubieren unter Schütteln
für 90
min bei Raumtemperatur.
- 16. Waschen wie in Schritt 14.
- 17. Zugabe von 100 μl
ABTS-Lösung
bei Raumtemperatur zu jedem Loch.
- 18. Inkubieren unter Schütteln
für 10
bis 15 Minuten. Entfernen der Blasen.
- 19. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 20 μl 10 % SDS
zu jedem Loch.
- 20. Auslesen der Ergebnisse auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser
mit einem Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630
nm.
-
PYK2-BIOASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der In-vitro-Kinasesaktivität von HA-Epitop-markiertem
Vollängen-pyk2
(FL.pyk2-HA) in einem ELISA-Assay verwendet.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten.
- 2. 12CA5 monoklonaler Anti-HA-Antikörper (SUGEN, Inc.)
- 3. PBS (Dulbecco's
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
(Gibco Katalog # 450-1300EB))
- 4. TBST-Puffer: Für
1 l werden 8,766 g NaCl, 6,057 g TRIS und 1 ml 0,1 % Triton X-100 ährin ungef
900 ml dH2O gemischt. Einstellen des pH
auf 7,2, das Volumen wird auf 11 gebracht.
- 5. Blockierungspuffer: Für
1 l werden 100 g 10 % BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1M NaCl und
10 ml 1 % TWEEN 20 gemischt.
- 6. FL.pyk2-HA aus sf9 Zellysaten (SUGEN, Inc.).
- 7. 4 % DMSO in MilliQue H2O.
- 8. 10 mM ATP in dH2O.
- 9. 1M MnCl2.
- 10. 1M MgCl2.
- 11. 1M Dithiothreitol (DTT).
- 12. 10x Kinase-Puffer-Phosphorylierung: Mischen von 5,0 ml 1M
Hepes (pH 7,5), 0,2 ml 1M MnCl2, 1,0 ml 1
MgCl2, 1,0 ml 10 % Triton X-100 in 2,8 ml
dH2O. Kurz vor der Verwendung werden 0,1
ml 1M DTT zugegeben..
- 13. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
- 14. 500 mM EDTA in dH2O.
- 15. Antikörper-Verdünnungspuffer:
Für 100
ml, 1 ml 5 % BSA/PBS und 1 ml 10 % Tween-20 in 88 ml TBS.
- 16. HRP-konjugiertes Anti-PtyrPY99, Santa Cruz Biotech Kat.-Nr.
SC-7020.
- 17. ABTS, Moss, Kat.-Nr. ABST-2000.
- 18. 10 % SDS.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 0,5 μg 12CA5 Anti-HA-Antikörper in
100 μl PBS
pro Loch. Lagerung über
Nacht bei 4 °C.
- 2. Entfernen von nicht gebundenem HA-Antikörper aus den Löchern durch
Umdrehen der Platte. Waschen der Platte mit dH2O.
Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- 3. Zugabe von 150 μl
Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min
bei Raumtemperatur.
- 4. Waschen der Platte 4x mit TBS-T.
- 5. Verdünnen
des Lysats in PBS (1,5 μg
Lysat/100 μl
PBS).
- 6. Zugab von 100 μl
verdünntem
Lysat zu jedem Loch. Schütteln
bei Raumtemperatur für
1 h.
- 7. Waschen wie in Schritt 4.
- 8. Zugabe von 50 μl
2x Kinasepuffer zu der ELISA-Platte, die eingefangenes pyk2-HA enthält.
- 9. Zugabe von 25 μl
400 μM Testverbindung
in 4 % DMSO zu jedem Loch. Für
Kontrollöcher
wird 4 % DMSO allein verwendet.
- 10. Zugabe von 25 μl
0,5 M EDTA zu den Negativkontrollöchern.
- 11. Zugabe von 25 μl
20 μM ATP
zu allen Löchern.
Inkubieren unter Schütteln
für 10
Minuten.
- 12. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 25 μl 500 mM
EDTA (pH 8,0) zu allen Löchern.
- 13. Waschen wie in Schritt 4.
- 14. Zugabe von 100 μl
HRP-konjugiertem Anti-Ptyr, 1 : 6000 in Antikörper-Verdünnungspuffer
verdünnt,
zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
- 15. Waschen der Platte 3x mit TBST und 1x mit PBS.
- 16. Zugabe von 100 μl
ABST-Lösung
zu jedem Loch.
- 17. Nach Bedarf Stoppen der Entwicklungsreaktion durch die Zugabe
von 20 μl
10 % SDS zu jedem Loch.
- 18. Auslesen der Platte auf einem ELISA-Leser mit einem Testfilter
bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.
-
FGFR1-BIOASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der In-vitro-Kinaseaktivität von FGF1-R
in einem ELISA-Assay
verwendet.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Costar-96-Loch-Elisa-Platten (Corning Katalog
# 3369).
- 2. Poly(Glu-Tyr) (Sigma Katalog # PO275).
- 3. PBS (Gibco Katalog # 450-1300EB)
- 4. 50 mM Hepes-Puffer-Lösung.
- 5. Blockierungspuffer (5 % BSA/PBS).
- 6. Gereinigtes GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.)
- 7. Kinase-Verdünnungspuffer.
Mischen von 500 μl
1M Hepes (GIBCO), 20 μl
5 % BSA/PBS, 10 μl
100 mM Natriumorthovanadat und 50 μl 5M NaCl.
- 8. 10 mM ATP
- 9. ATP/MnCl2 Phosphorylierungsmischung:
Mischen von 20 μl
ATP, 400 μl
1M MnCl2 und 9,56 ml dH2O.
- 10. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten (Applied Scientific
Katalog # AS-72092).
- 11. 0,5M EDTA.
- 12. 0,05 % TBST Zugabe von 500 μl TWEEN zu 1 Liter TBS.
- 13. Polyklonales Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Serum (SUGEN,
Inc.).
- 14. Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Biosource,
Katalog # ALI0404).
- 15. ABTS-Lösung.
- 16. ABTS/H2O2-Lösung.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der Costar-96-Loch-ELISA-Platten mit 1 μg Poly(Glu, Tyr) in 100 μl PBS pro
Loch. Lagerung bei 4 °C über Nacht.
- 2. Waschen der überzogenen
Platten einmal mit PBS.
- 3. Zugabe von 150 μl
5 % BSA/PBS-Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 1 h bei
Raumtemperatur.
- 4. Waschen der Platte 2x mit PBS, dann einmal mit 50 mM Hepes.
Klopfen der Platten auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
- 5. Zugabe von 25 μl
0,4 mM Testverbindung in 4 % DMSO oder 4 % DMSO allein (Kontrollen)
zu der Platte.
- 6. Verdünnen
von gereinigtem GST-FGFR1 in Kinase-Verdünnungspuffer (5 ng Kinase/50 μl KDB/Loch).
- 7. Zugabe von 50 μl
der verdünnten
Kinase zu jedem Loch.
- 8. Starten der Kinasereaktion durch die Zugabe von 25 μl/Loch frisch
hergestelltem ATP/Mn++ (0,4 ml 1M MnCl2,
40 μATP,l
10 mM 9,56 ml dH2O, frisch hergestellt).
- 9. Dies ist eine schnelle Kinasereaktion und muß mit 25 μl 0,5 M EDTA ähnlich wie
bei der Zugabe von ATP gestoppt werden.
- 10. Waschen der Platte 4x mit frischem TBST.
- 11. Auffüllen
von Antikörper-Verdünnungspuffer:
pro 50 ml: Mischen von 5 ml 5 % BSA, 250 μl 5 % Milch und 50 μl 100 mM
Natriumvanadat, mit 0,05 % TBST auf Endvolumen bringen.
- 12. Zugabe von 100 μl
pro Loch Anti-Phosphotyrosin (1 : 10000 Verdünnung in ADB). Inkubieren unter Schütteln für 1 h bei
Raumtemperatur.
- 13. Waschen wie in Schritt 10.
- 14. Zugabe von 100 μl
pro Loch Biosource Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat
(1 : 6000 Verdünnung
in ADB). Inkubieren unter Schütteln
für 1 h
Raumtemperatur.
- 15. Waschen wie in Schritt 10 und dann mit PBS, um Blasen und überschüssiges TWEEN
zu entfernen.
- 16. Zugabe von 100 μl
ABTS/H2O2-Lösung zu
jedem Loch.
- 17. Inkubieren unter Schütteln
für 10
bis 20 Minuten. Entfernen der Blasen.
- 18. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000-Elisa-Leser: Testfilter
bei 410 nm, Referenzfilter bei 630 nm.
-
EGFR-BIOASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der In-vitro-Kinaseaktivität von FGF1-R
in einem ELISA-Assay
verwendet.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten.
- 2. SUMO1 monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
- 3. PBS
- 4. TBST-Puffer
- 5. Blockierungspuffer: Für
100 ml werden 5,0 g Carnation Instant Non-fat Milk® mit
100 ml PBS gemischt.
- 6. A431 Zellysat (SUGEN, Inc.).
- 7. TBS-Puffer:
- 8. TBS + 10 % DMSO: Für
1 l mischen von 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCl und 25 ml DMSO; bringen
mit dH2O auf 1 l Gesamtvolumen.
- 9. ATP (Adenosin-5'-triphosphat,
aus Pferdemuskel, Sigma Kat. Nr. A-5394), 1,0 mM Lösung in
dH2O. Dieses Reagens sollte unmittelbar
vor der Verwendung aufgefüllt
und auf Eis gehalten werden.
- 10. 1,0 mM MnCl2.
- 11. ATP/MnCl2300 Phosphorylierungsgemisch:
zur Herstellung von 10 ml werden μl
1 mM ATP, 500 μl MnCl2 und 9,2 ml dH2O
gemischt. Kurz vor der Verwendung herstellen und auf Eis halten.
- 12. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
- 13. EDTA.
- 14. Polyklonales Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Serum (SUGEN,
Inc.).
- 15. Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Biosource
Kat. Nr. ALI0404).
- 16. ABTS.
- 17. 30%iges Wasserstoffperoxid.
- 18. ABTS/H2O2.
- 19. 0,2 M HCl.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 0,5 μg SUMO1 in 100 μl PBS pro
Loch, Lagerung über
Nacht bei 4 °C.
- 2. Entfernen von nicht gebundenem SUMO1 aus den Löchern durch
Umdrehen der Platte, um Flüssigkeit zu
entfernen. Waschen 1x mit dH2O. Klopfen
der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- 3. Zugabe von 150 μl
Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min
bei Raumtemperatur.
- 4. Waschen der Platte 3x mit deionisiertem Wasser, dann einmal
mit TBST. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit
und Blasen zu entfernen.
- 5. Verdünnung
des Lysats in PBS (7 μg
Lysat/100 μl
PBS).
- 6. Zugabe von 100 μl
des verdünnten
Lysats zu jedem Loch. Schütteln
bei Raumtemperatur für
l. h.
- 7. Waschen der Platten wie in 4 oben.
- 8. Geben von 120 μl
TBS in die ELISA-Platte, die eingefangenen EGFR enthält.
- 9. Verdünnung
der Testverbindung 1 : 10 in TBS, geben in ein Loch.
- 10. Zugabe von 13,5 μl
der verdünnten
Testverbindung in die ELISA-Platte. In die Kontrolllöcher werden 13,5 μl TBS in
10 % DMSO gegeben.
- 11. Inkubieren unter Schütteln
für 30
Minuten bei Raumtemperatur.
- 12. Zugabe von 15 μl
des Phosphorylierungsgemisches zu allen Löchern, außer zu dem Negativkontrolloch.
Das endgültige
Lochvolumen sollte ungefähr
150 μl betragen,
wobei die Endkonzentration in jedem Loch 3M ATP/5 mM MnCl2 beträgt.
Inkubieren unter Schütteln
für 5 Minuten.
- 13. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 16,5 μl EDTA-Lösung unter
Schütteln.
Schütteln
für eine weitere
Minute.
- 14. Waschen 4x mit deionisiertem Wasser, 2x mit TBST.
- 15. Zugabe von 100 μl
Anti-Phosphotyrosin (1 : 3000 Verdünnung in TBST) pro Loch. Inkubieren
unter Schütteln
für 30–45 Minuten
bei Raumtemperatur.
- 16. Waschen wie in 4 oben.
- 17. Zugabe der 100 μl
Biosource Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 2000
Verdünnung
in TBST) zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
- 18. Waschen wie in 4 oben.
- 19. Zugabe von 100 μl
ABTS/H2O2-Lösung zu
jedem Loch.
- 20. Inkubieren für
5 bis 10 Minuten unter Schütteln.
Entfernen der Blasen.
- 21. Nach Bedarf Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl
pro Loch.
- 22. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser: Testfilter
bei 410 nm, Referenzfilter bei 630 nm.
-
PDGFR-BIOASSAY
-
Dieser
Assay wird für
die In-vitro-Kinaseaktivität
von FGF1-R in einem ELISA-Assay verwendet.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten
- 2. 28D4C10, monoklonaler Anti-PDGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
- 3. PBS.
- 4. TBST-Puffer.
- 5. Blockierungspuffer (der gleiche wie im EGFR-Bioassay).
- 6. PDGFR-β,
das NIH 3T3-Zellysat (SUGEN, Inc.) exprimiert.
- 7. TBS-Puffer.
- 8. TBS + 10 % DMSO.
- 9. ATP.
- 10. MnCl2.
- 11. Kinasepuffer-Phosphorylierungsgemisch: Für 10 ml werden 250 μl 1M TRIS,
200 μl 5M
NaCl, l 00 μl
1M MnCl2 und 50 μl 100 mM Triton X-100 in ausreichend
dH2O gemischt, um 10 ml zu erhalten.
- 12. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
- 13. EDTA.
- 14. Polyklonales Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Serum (SUGEN,
Inc.).
- 15. Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Biosource
Kat. Nr. ALI0404).
- 16. ABTS.
- 17. Wasserstoffperoxid, 30%ige Lösung.
- 18. ABTS/H2O2.
- 19. 0,2 M HCl.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit 0,5 μg 28D4C10 in 100 μl PBS pro
Loch, Lagerung über
Nacht bei 4 °C.
- 2. Entfernen von nicht gebundenem 28D4C10 aus den Löchern durch
Umdrehen der Platte, um Flüssigkeit zu
entfernen. Waschen 1x mit dH2O. Klopfen
der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- 3. Zugabe von 150 μl
Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur
unter Schütteln.
- 4. Waschen der Platte 3x mit deionisiertem Wasser, dann einmal
mit TBST. Klopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit
und Blasen zu entfernen.
- 5. Verdünnten
des Lysats in HNTG (10 μg
Lysat/100 μl
HNTG).
- 6. Zugabe von 100 μl
des verdünnten
Lysats zu jedem Loch. Schütteln
bei Raumtemperatur für
60 min.
- 7. Waschen der Platten, wie in Schritt 4 beschrieben.
- 8. Zugabe von 80 μl
Arbeits-Kinasepuffergemisch in die ELISA-Platte, die eingefangenes
PDGFR enthält.
- 9. Verdünnen
der Testverbindung 1 : 10 in TBS in 96-Loch-Polypropylenplatten.
- 10. Zugabe von 10 μl
der verdünnten
Testverbindung in die ELISA-Platte. In die Kontrollöcher werden
10 μl TBS
+ 10 % DMSO gegeben. Inkubieren unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- 11. Direkte Zugabe von 10 μl
ATP zu allen Löcher,
außer
zu dem Negativkontrolloch (endgültiges
Lochvolumen sollte ungefähr
100 μl betragen,
wobei in jedem Loch 20 pM ATP vorliegen). Inkubieren für 30 Minuten
unter Schütteln.
- 12. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 10 μl EDTA-Lösung zu
jedem Loch.
- 13. Waschen 4x mit deionisiertem Wasser, zweimal mit TBST.
- 14. Zugabe von 100 μl
Anti-Phosphotyrosin (1 : 3000 Verdünnung in TBST) pro Loch. Inkubieren
unter Schütteln
für 30–45 min
bei Raumtemperatur.
- 15. Waschen wie in Schritt 4.
- 16. Zugabe von 100 μl
Biosource Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 2000
Verdünnung
in TBST) in jedes Loch. Inkubieren unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
- 17. Waschen wie in Schritt 4.
- 18. Zugabe von 100 μl
ABTS/H2O2-Lösung zu
jedem Loch.
- 19. Inkubieren für
10 bis 30 Minuten unter Schütteln.
Entfernen der Blasen.
- 20. Nach Bedarf Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 1.00 μl 0,2 M HCl
pro Loch.
- 21. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser mit einem
Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.
-
ZELLULÄRER
HER-2-KINASEASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der HER-2-Kinaseaktivität in ganzen Zellen im ELISA-Format verwendet.
-
Materialien und Reagengzien:
-
- 1. DMEM (GIBCO Katalog # 11965-092).
- 2. Fetales Rinderserum (FBS, GIBCO Katalog # 16000-044), wärmeinaktiviert
in einem Wasserbad für
30 min bei 56 °C.
- 3. Trypsin (GIBCO Katalog # 25200-056).
- 4. L-Glutamin (GIBCO Katalog # 25030-081)
- 5. HEPES (GIBCO Katalog # 15630-080).
- 6. Wachstumsmedien.
Mischen von 500 ml DMEM, 55 ml wärmeinaktiviertem
FBS, 10 ml HEPES und 5,5 ml L-Glutamin.
- 7. Hungermedien.
Mischen von 500 ml DMEM, 2,5 ml wärmeinaktiviertem
FBS, 10 ml HEPES und 5,5 ml L-Glutamin.
- 8. PBS.
- 9. Flachboden-96-Loch-Gewebekultur-Mikrotiterplatten (Corning
Katalog # 25860).
- 10. 15-cm-Gewebekulturschalen (Corning Katalog # 08757148).
- 11. Corning-96-Loch-ELISA-Platten.
- 12. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
- 13. Costar Transfer Cartridges für den Transtar 96 (Costar Katalog
# 7610).
- 14. SUMO 1: monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
- 15. TBST-Puffer.
- 16. Blockierungspuffer: 5 % Carnation Instant Milk® in
PBS.
- 17. EGF-Ligand: EGF-201, Shinko American, Japan.
Suspendieren
des Pulvers in 100 μl
10 mM HCl. Zugabe von 100 μl
10 mM NaOH. Zugabe von 800 μl
PBS und Überführen in
ein Eppendorf-Röhrchen,
Lagerung bei –20 °C bis zur
Verwendung.
- 18. HNTG-Lysepuffer
Für
das Ausgangsmaterial 5 × HNTG
werden 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 ml Glycerol und 100 ml Triton
X-100 und ausreichend dH2O gemischt, um
1 l Gesamtlösung
zu erhalten. Für
1 × HNTG*
werden 2 ml HNTG, 100 μl
0,1 M Na3VO4, 250 μl 0,2 M Na4P2O7 und
100 μl EDTA
gemischt.
- 19. EDTA.
- 20. Na3VO4.
Für die
Ausgangslösung
werden 1,84 g Na3VO4 mit
90 ml dH2O gemischt. Einstellen des pH auf
10. Kochen in einer Mikrowelle für
eine Minute (die Lösung
wird klar). Abkühlen
auf Raumtemperatur. Einstellen des pH auf 10. Wiederholen des Erwärmungs-/Abkühlkreislaufes,
bis der pH bei 10 stehen bleibt.
- 21. 200 mM Na4P2O7.
- 22. Polyklonales Kaninchenantiserum, das für Phosphotyrosin spezifisch
ist (Anti-Ptyr-Antikörper, SUGEN, Inc.).
- 23. Affinitätsgereinigtes
Antiserum, Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, Peroxidase-Konjugat (Biosource Kat.-#
ALI0404).
- 24. ABTS-Lösung.
- 25. 30%ige Wasserstoffperoxid-Lösung.
- 26. ABTS/H2O2.
- 27. 0,2 M HCl.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der Corning-96-Loch-ELISA-Platten mit SUMO1 mit 1,0 μg pro Loch
in PBS, 100 μl
Endvolumen/Loch. Lagerung über
Nacht bei 4 °C.
- 2. Am Tag der Verwendung wird der Überzugspuffer entfernt und
die Platte dreimal mit dH2O und einmal mit
TBST-Puffer gewaschen. Alle Wäschen
in diesem Assay sollten auf diese Art und Weise vorgenommen werden,
sofern nicht speziell etwas anderes angegeben ist.
- 3. Zugabe von 100 μl
Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren der Platte unter Schütteln für 30 min bei
Raumtemperatur. Kurz vor der Verwendung, Waschen der Platte.
- 4. Verwendung der EGFr/HER-2-Chimäre/3T3-C7-Zellinie für diesen
Assay.
- 5. Auswahl von Schalen mit 80–90 % Konfluenz. Sammeln von
Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugieren mit 1000 U/min bei
Raumtemperatur für
5 min.
- 6. Resuspendieren der Zellen in Hungermedium und Zählen mit
Tryptanblau. Es ist eine Lebensfähigkeit von über 90 %
erforderlich. Impfen von Zellen in Hungermedium bei einer 90Dichte
von 2.500 Zellen pro Loch, μikrotiterplatte.l
pro Loch, in einer 96-Loch-M Inkubieren der geimpften Zellen über Nacht
bei 37 °C unter
5 % CO2.
- 7. Starten des Assays zwei Tage nach dem Impfen.
- 8. Die Testverbindungen werden in 4 % DMSO gelöst. Die
Proben werden dann direkt auf den Platten mit Hunger-DMEM weiter
verdünnt.
Typischerweise wird diese Verdünnung
1 : 10 oder größer sein.
Alle Löcher werden
dann auf die Zellplatte bei einer weiteren 1 : 10-Verdünnung (10 μ90l Probe
und Medien in μl
Hungermedium) überführt. Die
endgültige
DMSO-Konzentration sollte 1 % oder weniger betragen. Eine serielle Standardverdünnung kann
auch verwendet werden.
- 9. Inkubieren unter 5 % CO2 bei 37 °C für 2 Stunden.
- 10. Vorbereiten des EGF-Liganden durch Verdünnen des Stamm-EGF (16,5 μM) in warmem
DMEM auf 150 nM.
- 11. Vorbereiten von frischem HNTG*, das für 1 μl pro Loch ausreicht; auf Eis
geben.
- 12. Nach 2stüngier
Inkubation mit der Testverbindung, Zugabe des vorbereiteten EGF-Liganden zu den Zellen,
50 μl pro
Loch, für
eine Endkonzentration von 50 nM. Positivkontrollöcher erhalten die gleiche Menge an
EGF. Negativkontrollen erhalten kein EGF. Inkubieren bei 37 °C für l 0 min.
- 13. Entfernen von Testverbindung, EGF und DMEM. Waschen der
Zellen einmal mit PBS.
- 14. Überführen von
HNTG* zu den Zellen, 100 μl
pro Loch. Planieren auf Eis für
5 Minuten. Währendessen Entfernen
des Blockierungspuffers aus der ELISA-Platte und Waschen.
- 15. Kratzen der Zellen aus der Platte mit einem Mikropipettor
und Homogenisieren des Zellmaterials durch wiederholtes Ansaugen
und Dispensieren des HNTG*-Lysepuffers. Überführen des Lysats in eine überzogene,
blockierte, gewaschene ELISA-Platte. Oder Verwendung einer Costar-Transferpatrone
zum Überführen des
Lysats in die Platte.
- 16. Inkubieren unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
eine Stunde.
- 17. Entfernen des Lysats, Waschen. Überführen von frisch verdünntem Anti-Ptyr-Antikörper (1
: 3000 in TBST) zu der ELISA-Platte, 100 μl pro Loch.
- 18. Inkubieren unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
30 min.
- 19. Entfernen des Anti-Ptyr-Antikörpers, Waschen. Überführen des
frisch verdünnten
BIOSOURCE-Antikörpers
zu der ELISA-Platte (1 : 8000 in TBST, 100 μl pro Loch).
- 20. Inkubieren unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
30 min.
- 21. Entfernen des BIOSOURCE-Antikörpers, Waschen. Überführen der
frisch vorbereiteten ABTS/H2O2-Lösung zu
der ELISA-Platte, 100 μl
pro Loch.
- 22. Inkubieren unter Schütteln
für 5–10 Minuten.
Entfernen der Blasen.
- 23. Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl
pro Loch.
- 24. Ausleseassay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Leser mit einem
Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.
-
CDK2/CYCLIN-A-ASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der In-vitro-Serin/Threonin-Kinase-Aktivität von humanem
cdk2/Cyclin-A in einem Scintillation-Proximity-Assay (SPA) verwendet.
-
Materialien und Reagenzien
-
- 1. Wallac-96-Loch-Polyethylenterephthalat (flexi)-Platten
(Wallac Katalog # 1450-401).
- 2. Amersham Redivue [γ33P] ATP (Amersham Katalog # AH 9968).
- 3. Amersham Streptavidin-überzogene
Polyvinyltoluol-SPA-Kügelchen
(Amersham Katalog # RPNQ0007). Die Kügelchen sollten in PBS ohne
Magnesium oder Calcium mit 20 mg/ml rekonstituiert werden.
- 4. Aktivierter cdk2/Cyclin-A-Enzymkomplex, gereinigt aus Sf9-Zellen
(SUGEN, Inc.).
- 5. Biotinyliertes Peptidsubstrat (Debtid). Das Peptid Biotin-X-PKTPKKAKKL
wird in dH2O bei einer Konzentration von
5 mg/ml gelöst.
- 6. Peptid/ATP-Gemisch: Für
10 ml werden 9,979 ml dH2O, 0,00125 ml „kaltes" ATP, 0,010 ml Debtid
und 0,010 ml γ33P-ATP gemischt. Die Endkonzentration pro
Loch wird 0,5 μM „kaltes" ATP, 0,1 μg Debtid
und 0,2 μCi γ33P-ATP
betragen.
- 7. Kinasepuffer: Für
10 ml werden 8,85 ml dH2O, 0,625 ml TRIS
(pH 7,4), 0,25 ml 1M MgCl2, 0,25 ml 10 % NP40
und 0,025 ml 1M DTT gemischt, frisch zugeben kurz vor der Verwendung.
- 8. 10 mM ATP in dH2O.
- 9. 1M Tris, pH eingestellt auf 7,4 mit HCl.
- 10. 1M MgCl2.
- 11. 1M DTT.
- 12. PBS (Gibco Katalog # 14190-144).
- 13. 0,5 M EDTA.
- 14. Stopplösung:
Für 10
ml werden 9,25 ml PBS, 0,005 ml 100 mM ATP, 0,1 ml 0,5 M undEDTA,
0,1 ml 10 % Triton X-100 1,25 ml von 20 mg/ml SPA-Kügelchen
gemischt.
-
Verfahren:
-
- 1. Vorbereiten von Lösungen aus den Testverbindungen
bei dem 5fachen der gewünschten
Endkonzentration in 5 % DMSO. Zugabe von 10 μl zu jedem Loch. Für Negativkontrollen
werden 10 μl
5 % DMSO allein in den Löchern
verwendet.
- 2. Verdünnen
von 5 μl
der cdk2/Cyclin-A-Lösung
mit 2,1 ml 2x Kinasepuffer.
- 3. Zugabe von 20 μl
Enzym zu jedem Loch.
- 4. Zugabe von 10 μl
0,5 M EDTA zu den Negativkontrollöchern.
- 5. Zum Starten der Kinasereaktion werden 20 μl Peptid/ATP-Gemisch in jedes
Loch gegeben. Inkubieren für
1 h ohne Schütteln.
- 6. Zugabe von 200 μl
Stopplösung
zu jedem Loch.
- 7. Halten für
mindestens 10 min.
- 8. Schleudern der Platte bei ungefähr 2300 U/min für 3–5 min.
- 9. Zählen
der Platte unter Verwendung von Trilux oder einem ähnlichen
Lesegerät.
-
MET-TRANSPHOSPHORYLIERUNGSASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der Phosphotyrosinkonzentrationen auf einem
Poly(glutaminsäure
: Tyrosin (4 : 1))-Substrat als Mittel zur Identifizierung von Agonisten/Antagonisten
der Met-Transphosphorylierung des Substrats verwendet.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten, Corning Katalog
# 25805-96.
- 2. Poly(glu, tyr) 4 : 1, Sigma, Kat.-Nr. P 0275.
- 3. PBS, Gibco Katalog # 450-1300EB.
- 4. 50 mM HEPES.
- 5. Blockierungspuffer: Auflösen
von 25 g Rinderserumalbumin, Sigma Kat. Nr. A-7888, in 500 ml PBS,
Filtrieren durch einen 4-μm-Filter.
- 6. Gereinigtes GST-Fusionsprotein, enthaltend die Met-Kinasedomäne, Sugen,
Inc.
- 7. TBST-Puffer.
- 8. 10%iges wässeriges
(MillQue H2O) DMSO.
- 9. 10 mM wässeriges
(dH2O) Adenosin-5'-triphosphat, Sigma Kat.-Nr. A-5394.
- 10. 2x Kinase-Verdünnungspuffer:
Für 100
ml werden 10 ml 1M HEPES bei pH 7,5 mit 0,10,4 ml 5 % BSA/PBS, 0,2
ml M Natriumorthovanadat und 1 ml 5M Natriumchlorid in 88,4 ml dH2O gemischt.
- 11. 4x ATP-Reaktionsgemisch: Für 10 ml werden 0,4 ml 1M Manganchlorid
und 0,02 ml 0,1 M ATP in 9,56 ml dH2O gemischt.
- 12. 4x Negativkontrollgemisch: Für 10 ml werden 0,4 ml 1 M Manganchlorid
in 9,6 ml dH2O gemischt.
- 13. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten, Applied Scientific
Katalog # S-72092.
- 14. 500 mM EDTA.
- 15. Antikörper-Verdünnungspuffer:
Für 100
ml werden 10 ml 5 % BSA/PBS, 0,5 ml 5 % Carnation Instant Milk® in
PBS und 0,1 ml 0,1 M Natriumorthovanadat in 88,4 ml TBST gemischt.
- 16. Polyklonaler Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Sugen,
Inc.
- 17. Ziege-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugierter
Antikörper,
Biosource, Inc. 9,2118. ABTS-Lösung:
Für 1 l
werden 1 g Zitronensäure,
35,49 g Na2HPO4 und
500 mg ABTS mit ausreichend dH2O gemischt,
um einen Liter zu erhalten.
- 19. ABTS/H2O2:
Mischen von 15 ml ABST-Lösung
mit 2 μl
H2O2 fünf Minuten
vor der Verwendung.
- 20. 0,2 M HCl.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der ELISA-Platten mit 2 μg
Poly(Glu-Tyr) in 100 μl
PBS, Lagerung über
Nacht bei 4 °C.
- 2. Blockieren der Platte mit 150 μl von 5 % BSA/PBS für 60 min.
- 3. Waschen der Platte zweimal mit PBS, einmal mit 50 mM Hepes-Puffer,
pH 7,4.
- 4. Zugabe von 50 μl
der verdünnten
Kinase zu allen Löchern.
(Die gereinigte Kinase wird mit Kinaseverdünnungspuffer verdünnt. Die
Endkonzentration sollte 10 ng/Loch betragen.)
- 5. Zugabe von 25 μl
der Testverbindung (in 4 % DMSO) oder DMSO allein (4 % in dH2O) für
Kontrollen in die Platte.
- 6. Inkubieren des Kinase/Verbindungs-Gemisches für 15 Minuten.
- 7. Zugabe von 25 μl
40 mM MnCl2 zu den Negativkontrollöchern.
- 8. Zugabe von 25 μl
ATP/MnCl2-Gemisch zu allen anderen Löchern (außer den
Negativkontrollen). Inkubieren für
5 min.
- 9. Zugabe von 25 μl
500 mM EDTA, um die Reaktion zu stoppen.
- 10. Waschen der Platte 3x mit TBST.
- 11. Zugabe von 100 μl
polyklonalem Kaninchen-Anti-Ptyr, verdünnt 1 : 10.000 in Antikörper-Verdünnungspuffer,
zu jedem Loch. Inkubieren unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
- 12. Waschen der Platte 3x mit TBST.
- 13. Verdünnen
von Biosource HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-Antikörper 1 :
6.000 in Antikörper-Verdünnungspuffer.
Zugabe von 100 μl
pro Loch und Inkubieren bei Raumtemperatur unter Schütteln für eine Stunde.
- 14. Waschen der Platte 1x mit PBS.
- 15. Zugabe von 100 μl
ABTS/H2O2-Lösung zu
jedem Loch.
- 16. Nach Bedarf Stoppen der Entwicklung der Reaktion durch die
Zugabe von 100 μl
0,2 M HCl pro Loch.
- 17. Auslesen der Platte auf einem Dynatech MR7000-ELISA-Lesegerät mit dem
Testfilter bei 410 nm und dem Referenzfilter bei 630 nm.
-
IGF-1-TRANSPHOSPHORYLIERUNGSASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Messung der Phosphotyrosinkonzentration in Poly(glutaminsäure Tyrosin)
(4 : 1) zur Identifizierung von Agonisten/Antagonisten der gst-IGF-1-Transphosphorylierung
eines Substrats verwendet.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Corning-96-Loch-Elisa-Platten.
- 2. Poly(Glu-tyr) (4 : 1), Sigma Kat.-Nr. P 0275.
- 3. PBS, Gibco Katalog # 450-1300EB.
- 4. 50 mM HEPES.
- 5. TBB-Blockierungspuffer: Für
1 l werden 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g Natriumchlorid
und 10 ml 1 % TWEEN-20 gemischt.
- 6. Gereinigtes GST-Fusionsprotein, enthaltend die IGF-1-Kinasedomäne (Sugen,
Inc.).
- 7. TBST-Puffer: Für
1 l werden 6,057 g Tris, 8,766 g Natriumchlorid und 0,5 ml TWEEN-20
mit ausreichend dH2O gemischt, um 1 l zu
erhalten.
- 8. 4 % DMSO in Milli-Q H2O.
- 9. 10 mM ATP in dH2O.
- 10. 2x Kinase-Verdünnungspuffer:
Für 100
ml werden 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 5 % BSA in dH20,1O, 0,2 ml M Natriumorthovanadat und 1
ml 5 M Natriumchlorid mit ausreichend dH2O
gemischt, um 100 ml zu erhalten.
- 11. 4x ATP-Reaktionsgemisch: Für 10 ml werden 0,4 ml 1 M MnCl20,01 und 0,008 ml M ATP und 9,56 ml dH2O gemischt.
- 12. 4x Negativkontrollgemisch: Mischen von 0,4 ml 1 M Manganchlorid
in 9,60 ml dH2O.
- 13. NUNC-96-Loch-V-Boden-Polypropylenplatten.
- 14. 500 mM EDTA in dH2O.
- 15. Antikörper-Verdünnungspuffer:
Für 100
ml werden 10 ml 5 % BSA in PBS, 0,5 ml 5 Carnation Instant Non-fat
Milk® in
PBS und 0,1 ml 0,1 M Natriumorthovanadat in 88,4 ml TBST gemischt.
- 16. Polyklonaler Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Sugen,
Inc.
- 17. Ziege-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierter Antikörper, Biosource.
- 18. ABTS-Lösung.
- 20. ABTS/H2O2:
Mischen von 15 ml ABTS mit 2 μl
H2O2 5 Minuten vor
der Verwendung.
- 21. 0,2 M HCl in dH2O.
-
Verfahren:
-
- 1. Überziehen
der ELISA-Platte mit 2,0 μg/Loch
Poly(Glu, Tyr) 4 : 1 (Sigma P0275) in 100 μl PBS. Lagerung der Platte über Nacht
bei 4 °C.
- 2. Veraschen der Platte einmal mit PBS.
- 3. Zugabe von 100 μl
TBB-Blockierungspuffer zu jedem Loch. Inkubieren der Platte für 1 Stunde
unter Schütteln
bei Raumtemperatur.
- 4. Waschen der Platte einmal mit PBS, dann zweimal mit 50 mM
Hepes-Puffer, pH 7,5.
- 5. Zugabe von 25 μl
der Testverbindung in 4 % DMSO (erhalten durch Verdünnen einer
Stammlösung
aus 10 mM Testverbindung in 100 % DMSO mit dH2O)
zu der Platte.
- 6. Zugabe von 10,0 ng gst-IGF-1-Kinase in 50 μl Kinase-Verdünnungspuffer
zu allen Löchern.
- 7. Starten der Kinasereaktion durch Zugabe von 25 μl 4x ATP-Reaktionsgemisch
zu allen Testlöchern
und Positivkontrollöchern.
Zugabe von 25 μl
4x Negativkontrollgemisch zu allen Negativkontrollöchern. Inkubieren
für 10
Minuten unter Schütteln
bei Raumtemperatur.
- 8. Zugabe von 25 μl
0,5M EDTA (pH 8,0) zu allen Löchern.
- 9. Waschen der Platte 4x mit TBST-Puffer.
- 10. Zugabe von polyklonalen Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antisera
bei einer Verdünnung
von 1 : 10.000 in 100 μl
Antikörper-Verdünnungspuffer
zu allen Löchern.
Inkubieren unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
eine Stunde.
- 11. Waschen der Platte wie in Schritt 9.
- 12. Zugabe von 100 μl
Biosource Anti-Kaninchen-HRP bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 in Antikörper-Verdünnungspuffer
zu allen Löchern.
Inkubieren unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
eine Stunde.
- 13. Waschen der Platte wie in Schritt 9, gefolgt von einer Wäsche mit
PBS, um Blasen und überschüssiges Tween-20
zu reduzieren.
- 14. Entwickeln durch die Zugabe von 100 μl/Loch ABTS/H2O2 zu jedem Loch.
- 15. Nach etwa 5 Minuten, Auslesen auf einem ELISA-Lesegerät mit dem
Testfilter bei 410 nm und dem Referenzfilter bei 630 nm.
-
BRDU-EINFÜHRUNGS-ASSAYS
-
Die
folgenden Assays nutzen Zellen, die so konstruiert wurden, daß sie einen
ausgewählten
Rezeptor exprimieren, und bewerten dann die Wirkung einer in Frage
stehenden Verbindung hinsichtlich der Aktivität der Liganden-induzierten
DNA-Synthese durch die Bestimmung der BrdU-Einführung in die DNA.
-
Die
folgenden Materialien, Reagenzien und Verfahren gelten allgemein
für die
folgenden BrdU-Einführungsassays.
Variationen in speziellen Assays sind nicht angegeben.
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Der entsprechende Ligand.
- 2. Die entsprechend konstruierten Zellen.
- 3. BrdU-Markierungsreagens: 10 mM, in PBS (pH 7,4) (Boehringer
Mannheim, Deutschland).
- 4. FixDenat: Fixierlösung
(gebrauchsfertig) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
- 5. Anti-BrdU-POD: monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase
(Boehringer Mannheim, Deutschland).
- 6. TMB-Substratlösung:
Tetramethylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Deutschland).
- 7. PBS-Waschlösung:
1X PBS, pH 7,4.
- 8. Albumin, Rind (BSA), Fraktion V Pulver (Sigma Chemical Co.,
USA).
-
Allgemeines Verfahren:
-
- 1. Zellen werden mit 8000 Zellen/Loch in 10
% CS, 2 mM Gln in DMEM, in eine 96-Loch-Platte geimpft. Die Zellen werden über Nacht
bei 37 °C
in 5 % CO2 inkubiert.
- 2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann
in serumfreiem Medium (0 % CS DMEM mit 0,1 % BSA) 24 Stunden serum-abgereichert.
- 3. An Tag 3 werden der entsprechende Ligand und die Testverbindung
gleichzeitig zu den Zellen gegeben. Die Negativkontrollöcher erhalten
nur serumfreies DMEM mit 0,1 % BSA; die positiven Kontrollzellen
erhalten den Liganden, aber nicht die Testverbindung. Die Testverbindungen
werden in serumfreiem DMEM mit Ligand in einer 96-Loch-Platte hergestellt
und seriell für
7 Testkonzentrationen verdünnt.
- 4. Nach 18 Stunden der Ligandenaktivierung wird das verdünnte BrdU-Markierungsreagens
(1 : 100 in DMEM, 0,1 % BSA) zugegeben und die Zellen werden mit
BrdU (Endkonzentration = 10 μM)
1,5 Stunden inkubiert.
- 5. Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagens wird das Medium
durch Dekantieren und Klopfen der umgedrehten Platte auf ein Papiertuch
entfernt. FixDenat-Lösung
wird zugegeben (50 μl/Loch)
und die Platten werden bei Raumtemperatur 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
- 6. Die FixDenat-Lösung
wird gründlich
durch Dekantieren und Klopfen der umgedrehten Platte auf ein Papiertuch
entfernt. Milch wird zugegeben (5 % dehydratisierte Milch in PBS,
200 μl/Loch)
als Blockierlösung und
die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
- 7. Die Blockierlösung
wird durch Dekantieren entfernt und die Löcher einmal mit PBS gewaschen.
Anti-BrdU-POD-Lösung
(1 : 200 Verdünnung
in PBS, 1 % BSA) wird zugegeben (50 μl/Loch) und die Platte 90 Minuten
bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
- 8. Das Antikörperkonjugat
wird durch Dekantieren und Spülen
der Löcher
5x mit PBS gründlich
entfernt und die Platte durch Umdrehen und Klopfen auf ein Papiertuch
getrocknet.
- 9. TMB-Substratlösung
wird Zugegeben (100 μl/Loch)
und 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert,
bis die Farbentwicklung für
die photometrische Detektion ausreicht.
- 10. Das Absorptionsvermögen
der Proben wird bei 410 nm (im „Doppelwellenlängen"-Modus mit einem Filter, der bei 490
nm liest, als Referenzwellenlänge)
auf einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät gemessen.
-
EGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Maus-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
- 2. 3T3/EGFRc7.
-
EGF-induzierter Her-2-gesteuerter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Maus-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
- 2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr mit einer Her-2-Kinasedomäne).
-
EGF-induzierter Her-4-gesteuerter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Maus-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
- 2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr mit einer Her-4-Kinasedomäne).
-
PDGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Humanes PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Deutschland).
- 2. 3T3/EGFRc7.
-
FGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Humanes FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).
- 2. 3T3c7/EGFr
-
IGFI-induzierter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Human, rekombinant (G511, Promega Corp.,
USA)
- 2. 3T3/IGF1r.
-
Insulin-induzierter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Insulin, kristallin, Rind, Zink (13007,
Gibco BRL, USA).
- 2. 3T3/H25.
-
HGF-induzierter BrdU-Einführungsassay
-
Materialien und Reagenzien:
-
- 1. Rekombinantes humanes HGF (Kat.-Nr. 249-HG,
R & D Systems,
Inc. USA).
- 2. BxPC-3-Zellen (ATCC CRL-1687).
-
Verfahren:
-
- 1. Zellen werden mit 9000 Zellen/Loch in RPMI
10 % FBS in eine 96-Loch-Platte geimpft. 37Die Zellen werden über Nacht
bei °C in
5 % CO2 inkubiert.
- 2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann
in 100 μl
serumfreiem Medium (RPMI mit 0,1 % BSA) 24 Stunden serum-abgereichert.
- 3. An Tag 3 werden 25 μl,
enthaltend Ligand (hergestellt mit 1 μg/ml in RPMI mit 0,1 % BSA;
HGF-Endkonz. 200 ng/ml) und Testverbindungen, zu den Zellen gegeben.
Die Negativkontrollöcher
erhalten nur 25 μl
serumfreies RPMI mit 0,1 % BSA; die positiven Kontrollzellen erhalten
den Liganden (HGF) aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen
werden auf das 5fache ihrer Endkonzentration in serumfreiem RPMI
mit Ligand in einer 96-Loch-Platte
präpariert
und seriell verdünnt,
wodurch 7 Testkonzentrationen erhalten wurden. Typischerweise beträgt die höchste Endkonzentration
der Testverbindung 100 μM
und es werden Verdünnungen
von 1 : 3 verwendet (d. h. der endgültige Testverbindungskonzentrationsbereich
beträgt 0,137–100 μM).
- 4. Nach 18 Stunden der Ligandenaktivierung werden 12,5 μl des verdünnten BrdU-Markierungsreagens
(1 : 100 in RPMI, 0,1 % BSA) zu jedem Loch zugegeben und die Zellen
werden mit BrdU (Endkonzentration 10 μM) für 1 Stunde inkubiert.
- 5. Gleich wie allgemeines Verfahren.
- 6. Gleich wie allgemeines Verfahren.
- 7. Die Blockierlösung
wird durch Dekantieren entfernt und die Löcher einmal mit PBS gewaschen.
Anti-BrdU-POD-Lösung
(1 : 100 Verdünnung
in PBS, 1 % BSA) wird zugegeben (100 μl/Loch) und die Platte 90 Minuten
bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
- 8. Gleich wie allgemeines Verfahren.
- 9. Gleich wie allgemeines Verfahren.
- 10. Gleich wie allgemeines Verfahren.
-
HUV-EC-C-Assays
-
Dieser
Assay wird zur Messung der Aktivität der Verbindungen gegen PDGF-R,
FGF-R, VEGF, aFGF oder Flk-1/KDR, von denen alle natürlich von
HUV-EC-Zellen exprimiert werden, verwendet.
-
Tag 0
-
- 1. Waschen und Trypsinisieren der HUV-EC-C-Zellen
(humane Endothelzellen aus der Nabelvene), (American Type Culture
Collection, Katalog-Nr. 1730 CRL). Waschen mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(D-PBS, erhalten von Gibco BRL, Katalog-Nr. 14190-029) zweimal bei
etwa 1 ml/10 cm2 eines Gewebekulturkolbens.
Trypsinisierung mit 0,05 % Trypsin-EDTA in nicht-enzymatischer Zelldissoziationslösung (Sigma
Chemical Company, Katalog-Nr. C-1544). Das 0,05%ige Trypsin wird
durch die Verdünnung von
0,25 % Trypsin/1 mM EDTA (Gibco, Katalog-Nr. 25200-049) in der Zelldissoziationslösung hergestellt. Trypsinisierung
mit etwa 1 ml/25–30
cm2 eines Gewebekulturkolbens für etwa 5
Minuten bei 37 °C.
Nachdem die Zellen von dem Kolben abgelöst waren, wurde ein gleiches
Volumen an Assaymedium zugegeben und in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt (Fisher
Scientific, Katalog-Nr. 05-539-6).
- 2. Waschen der Zellen mit etwa 35 ml Assaymedium in dem sterilen
50-ml-Zentrifugenröhrchen
durch die Zugabe des Assaymediums, Zentrifugieren für 10 Minuten
bei ungefähr
200x g, Absaugen des Überstandes
und erneut Suspendieren mit 35 ml D-PBS. Zweimal erneut mit D-PBS
waschen, die Zellen in etwa 1 ml Assaymedium/15 cm2 Gewebekulturkolben
wieder suspendieren. Das Assaymedium bestehen aus F12K-Medium (Gibco
BRL, Katalog-Nr.
21127-014) und 0,5 % wärmeinaktiviertem
fetalem Rinderserum. Zählen
der Zellen mit einem CoulterCounter® (Coulter
Electronics, Inc.) und Zugabe von Assaymedium zu den Zellen, um
so eine Konzentration von 0,8–1,0 × 105 Zellen/ml zu erhalten.
- 3. Zugabe der Zellen zu Flachboden-96-Loch-Platten bei 100 ml/Loch
oder 0,8–1,0
x 104 Zellen/Loch, inkubieren ∼24 h bei
37 °C, 5
% CO2
-
Tag 1
-
- 1. Auffüllen
zweifacher Testverbindungstitrationen in separaten 96-Loch-Platten,
im allgemeinen von 50 μM herunter
auf 0 μM.
Verwendung desselben Assaymediums wie in Tag 0, 90Schritt 2 oben
angegeben. Die Titrationen werden durch die Zugabe von μl/Loch der
Testverbindung bei 200 M (4x der Lochendkonzentration) in das obere
Loch einer bestimmten Bodensäule
hergestellt. Da die Stammtestverbindung üblicherweise 20 mM in DMSO
ist, enthält
die 200 μM
Arzneimittelkonzentration 2 % DMSO.
-
Ein
Verdünnungsmittel,
aufgefüllt
auf 2 % DMSO in Assaymedium (F12K + 0,5 % fetales Rinderserum),
wird als Verdünnungsmittel
für die
Testverbindungstitrationen verwendet, um die Testverbindung zu verdünnen, die
DMSO-Konzentration jedoch konstant zu halten. Zugabe dieses Verdünnungsmittels
zu den verbleibenden Löchern
in der Säule
bei 60 μl/Loch.
Entnahme von 60 μl
von den 120 μl
der 200-μM-Testverbindungsverdünnung im
oberen Loch der Säule
und Mischen mit 60 μl
im zweiten Loch der Säule.
Entnahme von 60 μl
aus diesem Loch und Mischen mit 60 μl im dritten Loch der Säule, und
so weiter, bis die Zweifach-Titrationen komplett sind. Wenn das
dem letzten am nächstgelegene
Loch gemischt wird, Entnahme von 60 μl von den 120 μl in diesem
Loch und verwerfen dieser. Das letzte Loch verbleibt mit 60 μl DMSO/Medien-Verdünnungsmitel
als Kontrolle ohne Testverbindung. Bilden von 9 Säulen der
titrierten Testverbindung, ausreichend für Dreifach-Löcher, jeweils
für: (1)
VEGF (erhalten von Pepro Tech Inc., Katalog-Nr. 100–200), (2)
Endothelzell-Wachstumsfaktor
(ECGF) (auch bekannt als saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, oder
aFGF) (erhalten von Boehringer Mannheim Biochemica, Katalog-Nr.
1439 600), oder (3) humanes PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim,
Deutschland) und Assaymedienkontrolle. ECGF ist ein Präparat mit
Natriumheparin.
- 2. Überführen von 50 μl/Loch der
Testverbindungsverdünnungen
in 96-Loch-Assayplatten, enthaltend 0,8–1,0 × 104 Zellen/100 μl/Loch der
HUV-EC-C-Zellen von Tag 0 und inkubieren ∼2 h bei 37 °C, 5 % CO2.
- 3. Dreimal wurden 50 μl/Loch
80 μg/ml
VEGF, 20 ng/ml ECGF oder Medienkontrolle zu jeder Testverbindung
gegeben. Was die Testverbindungen angeht, betrugen die Wachstumsfaktorkonzentrationen
4x der gewünschten
Endkonzentration. Verwendung der Assaymedien von Tag 0, Schritt
2, zur Bildung der Konzentrationen an Wachstumsfaktoren. Inkubieren
für ungefähr 24 Stunden
bei 37 °C,
5 % CO2. Jedes Loch wird 50 μl Testverbindungsverdünnung, 50 μl Wachstumsfaktor
oder Medien und 100 μl
Zellen aufweisen, wobei man auf 200 μl/Loch insgesamt kommt. Daher
werden 4x-Konzentrationen der Testverbindung und Wachstumsfaktoren
1x, wenn alles in die Löcher
gegeben worden ist.
-
TAG 2
-
- 1. Zugabe von 3H-Thymidin
(Amersham, Katalog-Nr. TRK-686) bei 1 μCi/Loch (10 μl/Loch einer 100 μCi/ml Lösung, gebildet
in RPMI-Medien + 10 % wärmeinaktiviertes
fetales Rin derserum) und inkubieren –24 h bei 37 °C, 5 % CO2. RPMI ist von Gibco BRL, Katalog-Nr. 11875-051
erhältlich.
-
TAG 3
-
- 1. Einfrieren der Platten über Nacht bei –20 °C.
-
TAG 4
-
Tauen
der Platten und Ernten mit einer Erntemaschine für 96-Loch-Platten (Tomtec Harvester
96°) auf Filtermatten
(Wallac, Katalog-Nr. 1205-401), Auslesen der Zählungen auf einem Wallac-BetaplateTM-Flüssigkeitsszintillationszähler.
-
Tabelle
3 zeigt die Ergebnisse der biologischen Tests einiger exemplarischer
Verbindungen dieser Erfindung. Die Ergebnisse sind hinsichtlich
des IC
50, der mikromolaren (μM) Konzentration
der getesteten Verbindung, die eine 50%ige Veränderung der Aktivität der Ziel-PTK
im Vergleich zur Aktivität
der PTK in einer Kontrolle, der keine Testverbindung zugegeben worden
ist, hervorruft, angegeben. Speziell zeigen die Ergebnisse die Konzentration
einer Testverbindung, die erforderlich ist, um eine 50%ige Verringerung
der Aktivität der
Ziel-PTK hervorzurufen.
Bioassays, die zur Bewertung der Verbindungen verwendet worden sind
oder verwendet werden, werden nachstehend ausführlich beschrieben. TABELLE
3
-
IN-VIVO-TIERMODELLE
-
Xenograft-Tiermodelle
-
Die
Fähigkeit
menschlicher Tumore, als Xenografts in athymischen Mäusen zu
wachsen (z. B. Balb/c, nu/nu), liefert ein nützliches In-vivo-Modell für die Studie
der biologischen Reaktion auf Therapien gegen menschliche Tumore.
Seit der ersten erfolgreichen Xenotransplantation menschlicher Tumore
in athymische Mäuse
(Rygaard und Povlsen, 1969, Ac ta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758–760), sind
viele verschiedene menschliche Tumorzellinien (z. B. Brust-, Lungen,
Urogenital-, Gastrointestinal-, Kopf- und Hals-, Glioblastom-, Knochen-
und maligner Melanome) transplantiert und erfolgreich in Nacktmäusen herangezogen
worden. Die folgenden Assays können
zur Bestimmung des Niveaus der Aktivität, Spezifität und Wirkung der verschiedenen
Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zur Bewertung
der Verbindungen sind drei allgemeine Assays nützlich: zellulär/katalytisch,
zellulär/biologisch
und in-vivo. Ziel der zellulären/katalytischen Assays
ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung auf die Fähigkeit
einer TK, Tyrosine auf einem bekannten Substrat in einer Zelle zu
phosphorylieren. Das Ziel der zellulären/biolagischen Assays ist
die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung auf die biologische
Antwort, die von einer TK in einer Zelle stimuliert wird. Das Ziel
der In-vivo-Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung
in einem Tiermodell mit einer besonderen Erkrankung wie Krebs.
-
Geeignete
Zellinien für
subkutane Xenograftexperimente umfassen C6-Zellen (Gliom, ATCC#
CCL 107), A375-Zellen (Melanom, ATCC# CRL 1619), A431-Zellen (Epidermoidkarzinom,
ATCC# CRL 1555), Calu 6-Zellen (Lunge, ATCC# HTB 56), PC3-Zelle
(Prostata, ATCC# CRL 1435), SKOV3TP5-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten,
die genetisch so konstruiert wurden, daß sie EGFR, PDGFR, IGF-1R oder
irgendeine andere Testkinase überexprimieren.
Das folgende Protokoll kann zur Durchführung der Xenograftexperimente
verwendet werden:.
Weibliche athymische Mäuse (BALB/c, nu/nu) sind von
Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) erhältlich. Alle Tiere werden unter
Reinraumbedingungen in Mikroisolator-Käfigen mit Alpha-dri-Einstreu
gehalten. Sie erhalten steriles Nagerfutter und Wasser nach Bedarf.
-
Zellinien
werden in einem geeigneten Medium (beispielsweise MEM, DMEM, Ham's F10 oder Ham's F12 plus 5 %–10 % fetales
Rinderserum (FBS) und 2 mM Glutamin (GLN)) herangezogen. Zellkulturmedien, Glutamin
und fetales Rinderserum sind von Gibco Life Technologies (Grand
Island, NY) zu erwerben, sofern nicht speziell etwas anderes angegeben
ist. Alle Zellen werden in feuchter Atmosphäre von 90–95 % Luft und 5–10 % CO2 bei 37 °C
herangezogen. Alle Zellinien werden routinemäßig zweimal pro Woche subkultiviert,
und sind hinsichtlich Mycoplasma negativ, wie durch das Mycotect-Verfahren
(Gibco) bestimmt.
-
Die
Zellen werden bei oder nahe der Konfluenz mit 0,05 % Trypsin-EDTA
geerntet und bei 450 × g
10 min pelletiert. Die Pellets werden in sterilem PBS oder Medien
(ohne FBS) auf eine bestimmte Konzentration resuspendiert und die
Zellen werden in die Hinterflanke der Mäuse implantiert (8–10 Mäuse pro
Gruppe, 2–10 × 106 Zellen/Tier). Das Tumorwachstum wird über 3 bis
6 Wochen unter Verwendung von Meßschiebern gemessen. Die Tumorvolumen
werden als ein Produkt von Länge × Breite × Höhe berechnet,
sofern nicht etwas anderes angegeben ist. Die P-Werte werden unter
Verwendung des Student-Tests berechnet. Die Testverbindungen in
50–100 μl Trägerstoff
(DMSO oder VPD : DSW) können
durch IP-Injektion
in verschiedenen Konzentrationen, im allgemeinen ausgehend von Tag
1 nach der Implantation verabreicht werden.
-
TUMORINVASIONSMODELL
-
Das
folgende Tumorinvasionsmodell ist zur Bewertung des therapeutischen
Wertes und der Wirksamkeit der Verbindungen, die als den KDR/FLK-1-Rezeptor
selektiv inhibierend identifiziert wurden, entwickelt und verwendet
worden.
-
Verfahren
-
8
Wochen alte Nacktmäuse
(weiblich) (Simonsen Inc.) werden als Versuchstiere verwendet. Die
Implantation der Tumorzellen kann in einer Laminarbox durchgeführt werden.
Für die
Anästhesie
wird ein Xylazin/Ketamin-Cocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg
Xylazin) intraperitoneal verabreicht. Es wird ein Medianschnitt
vorgenommen, um die Bauchhöhle
freizulegen (ungefähr
1,5 cm lang), um 107 Tumorzellen in einem Volumen
von 100 μl
Medium injizieren zu können.
Die Zellen werden entweder in den Duodenallappen der Pankreas oder
unter die Serosa des Darms injiziert. Das Bauchfell und die Muskeln
werden mit einem 6-0 kontinuierlichen Seidenfaden verschlossen und
die Haut wird unter Verwendung von Wundkammern verschlossen. Die
Tiere werden täglich
beobachtet.
-
Analyse
-
In
Abhängigkeit
der Gesamtbeobachtungen der Tiere, werden die Mäuse nach 2–6 Wochen getötet, und
die lokalen Tumormetastasen an verschiedenen Organen (Lunge, Leber,
Gehirn, Bauch, Milz, Herz, Muskel) werden exzidiert und analysiert
(Messung der Tumorgröße, des
Grades der Invasion, der Immunchemie, In-situ-Hybridisierungsbestimmung
usw.).
-
C-KIT-ASSAY
-
Dieser
Assay wird zur Detektion des Niveaus der c-kit-Tyrosinphosphorylierung
verwendet. MO7E-Zellen (humane akute Myeloidleukämie) wurden über Nacht
in 0,1 % Serum serumabgereichert. Die Zellen wurden vor der Ligandenstimulation
mit der Verbindung (konkurrierend mit Serumabreicherung) vorbehandelt.
Die Zellen wurden mit 250 ng/ml rh-SCF 15 Minuten stimuliert. Nach
der Stimulation wurden die Zellen lysiert und mit einem Antic-kit-Antikörper immunopräzipitiert.
Die Phosphotyrosin- und Proteinkonzentrationen wurden durch Western-Blot
bestimmt.
-
MTT-PROLIFERATIONSASSAY
-
MO7E-Zellen
wurden serum-abgereichert und mit der Verbindung, wie für die Phosphorylierungsexperimente
beschrieben, vorbehandelt. Die Zellen wurden bei 4 × 105 Zellen/Loch in einer 96-Loch-Schale in 100 μl RPMI +
10 % Serum plattiert. rh-SCF (100 ng/ml) wurde zugegeben und die
Platte wurde 48 Stunden inkubiert. Nach 48 Stunden wurden 10 μl von 5 mg/ml
MTT [3-(4,5-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)
zugegeben und es wurde 4 Stunden inkubiert. Saures Isopropanol (100
ml von 0,04 N HCl in Isopropanol) wurde zugegeben und die optische
Dichte wurde bei einer Wellenlänge
von 550 nm gemessen.
-
APOPTOSEASSAY
-
MO7E-Zellen
wurden +/–SCF
und +/–Verbindung
in 10 % FBS mit rh-GM-CSF (10 ng/ml) und rh-IL-3 (10 ng/ml) inkubiert.
Die Proben wurden nach 24 und 48 Stunden analysiert. Zur Messung
der aktivierten Caspase-3 wurden die Proben mit PBS gewaschen und
mit eiskaltem 70%igem Ethanol permeabilisiert. Die Zellen wurden
dann mit PE-konjugierter polyklonaler Kaninchen-Anti-aktive Caspase-3
gefärbt
und durch FACS analysiert. Zur Messung der gespaltenen PARP wurden
die Proben lysiert und durch Western-Blot mit einem Anti-PARP-Antikörper analysiert.
-
Zusätzliche Assays
-
Zusätzliche
Assays, die zur Bewertung der Verbindungen dieser Erfindung verwendet
werden können, umfassen
ohne Einschränkung
einen Bio-flk-1-Assay, einen EGF-Rezeptor-HER2-Chimärenrezeptor-Assay
in ganzen Zellen, einen Bio-src-Assay, einen Bio-lck-Assay und einen
Assay, der die Phosphorylierungsfunktion von raf mißt. Die
Protokolle für
jeden dieser Assays sind in der US-Anmeldung Ser.-Nr. 09/099,842,
die einschließlich
aller Zeichnungen hierin durch Verweis aufgenommen ist, zu finden.
-
Messung der Zelltoxizität
-
Therapeutische
Verbindungen sollten stärker
die Rezeptor-Tyrosin-Kinaseaktivität inhibieren als eine zytotoxische
Wirkung zeigen. Ein Maß der
Wirksamkeit und Zelltoxizität
einer Verbindung kann durch die Bestimmung des therapeutischen Index,
d. h. IC50/LD50 erhalten
werden. Der IC5 0,
die Dosis, die zum Erhalt einer 50%igen Inhibierung erforderlich
ist, kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie den hierin
beschriebenen, gemessen werden. Der LD50,
die Dosierung, die zu einer 50%igen Toxizität führt, kann auch durch Standardtechniken
(Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55–63), durch die Messung der
Menge an freigesetztem LDH (Korzeniewski und Callewaert, 1983, J.
Immunol. Methods, 64: 313, Decker und Lohmann-Matthes, 1988, J.
Immunol. Methods, 115: 61) oder durch die Messung der Lethaldosis
in Tiermodellen gemessen werden. Verbindungen mit einem großen therapeutischen
Index sind bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer sein
als 2, bevorzugt mindestens 10, stärker bevorzugt mindestens 50.
-
B. Beispiel für Ergebnisse eines zellulären Assays
unter Verwendung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-vlidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylaminoethyl)amid.
-
Zur
Bestätigung
der Potenz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35), detektiert in biochemischen Assays (vide infra),
wurde die Fähigkeit
der Verbindung, die Ligandenabhängige
RTK-Phosphorylierung zu inhibieren, in Zell-basierenden Assays unter
Verwendung von NIH-3T3-Mauszellen, die so konstruiert wurden, daß sie Flk-1
oder humanes PDGFRβ überexprimieren,
bewertet. 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) inhibierte die VEGF-abhängige Flk-1-Tyrosin-Phosphorylierung
mit einem IC50-Wert von ungefähr 0,03 μM. Dieser
Wert ähnelt
dem 0,009-μM-Ki-Wert,
der für
die Inhibierung von Flk-1 durch 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35), bestimmt in biochemischen Assays, bestimmt wurde.
Dies ist ein Anzeichen dafür,
daß 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) ohne weiteres in die Zellen eindringt. In Übereinstimmung
mit den biochemischen Daten (vide infra), die anzeigen, daß 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) eine vergleichbare Aktivität gegen Flk-1 und PDGFRβ hatte, ist
ebenso herausgefunden worden, daß es die PDGF-abhängige Rezeptor-Phosphorylierung
in Zellen mit einem IC50-Wert von ungefähr 0,03 μM inhibierte.
Die Fähigkeit
von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) c-kit, ein enger Verwandter der RTK, der den Stammzellenfaktor
(SCF) bindet, zu inhibieren, wurde unter Verwendung von MO7E-Zellen,
die diesen Rezeptor exprimieren, bestimmt. In diesen Zellen inhibierte
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) die SCF-abhängige c-kit-Phosphorylierung
mit einem IC50-Wert von 0,01–0,1 μM. Diese
Verbindung inhibierte auch die SCF-stimulierte c-kit-Phosphorylierung
bei akuter Myeloblastenleukämie
(AML), isoliert aus dem peripheren Blut von Patienten.
-
Neben
dem Test der Fähigkeit
von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35), die Liganden-abhängige Rezeptor-Phosphorylierung
in Zellen zu inhibieren, wurde auch ihre Wirkung auf die Liganden-abhängige proliferative Antwort
von Zellen in-vitro überprüft (siehe
Tabelle 4). In diesen Studien wurden Zellen, die durch Übernacht-Serumabreicherung
gehemmt wurden, bei der Zugabe des geeigneten mitogenen Liganden
der DNA-Synthese unterzogen. Wie in Tabelle 4 gezeigt, inhibierte
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) die PDGF-induzierte Proliferation der NIH-3T3-Zellen,
die PDGFRβ oder
PDGFRα mit
IC
50-Werten von 0,031 bzw. 0,069 μM überexprimieren,
und die SCF-induzierte Proliferation von MO7E-Zellen mit einem IC
50-Wert von 0,007 μM. TABELLE
4
-
Wie
in Tabelle 4 gezeigt, gibt es eine allgemeine Übereinstimmung zwischen den
biochemischen und zellulären
Aktivitäten
von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35), was die Schlußfolgerung
stützt,
daß diese
Verbindung zelluläre
Membranen kreuzt. Ferner kann geschlußfolgert werden, daß die zellulären Antworten
ein Ergebnis der Aktivität
der Verbindung 35 gegen das angezeigte Ziel sind. Wurde im Gegensatz
dazu in Abwesenheit eines kompletten Wachstummediums in-vitro getestet,
waren wesentlich höhere
Konzentrationen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung
35) (> 10 μM) zur Inhibierung
des Wachstums einer Vielzahl von humanen Tumorzellen erforderlich
(siehe Tabelle 5). Dies ist ein Anzeichen dafür, daß die Verbindung das Wachstum
dieser Zellen bei Konzentrationen, die zur Inhibierung der Liganden-abhängigen Rezeptor-Phosphorylierung
und Zellproliferation erforderlich sind, nicht direkt inhibierte. TABELLE
5
-
Kurz
gesagt wurden die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse durch die Inkubation
von Zellen für
48 h in komplettem Wachstumsmedium in Gegenwart serieller Verdünnungen
von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
erhalten. Am Ende der Wachstumsperiode wurde die relative Anzahl
von Zellen bestimmt. Die IC50-Werte wurden
als die Konzentration an Verbindung, die das Wachstum der Zellen
in Bezug auf unbehandelte Zellen um 50 % inhibierte, berechnet.
Die LD50-Werte wurden als die Konzentration
an Verbindung, die zu einer 50%igen Verringerung der Anzahl an Zellen,
bezogen auf die zu Beginn des Experiments, führte.
-
Ein
relevanterer Zell-basierender Assay, der das anti-angiogene Potential
von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) bewertet, ist der In-vitro-Mitogeneseassay unter
Verwendung humaner Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) als ein Modellsystem
für die
Endothelzellproliferation, die für
den angiogenen Prozeß kritisch
ist. In diesem Assay wird eine mitogene Antwort, gemessen als eine
Steigerung der DNA-Synthese, in serumabgereicherten HUVECs bei der
Zugabe von VEGF oder FGF induziert. In diesen Zellen inhibierte
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) die VEGF- und FGF-induzierte mitogene Antwort dosisabhängig mit
IC50-Werten von 0,004 μM bzw. 0,7 μM, wenn die Verbindung über den
48-h-Assay anwesend war.
-
Kurz
gesagt wurden die vorgenannten Ergebnisse unter Verwendung serum-abgereicherter
HUVECs, die mit mitogenen Konzentrationen von VEGF (100 ng/ml) oder
FGF (30 ng/ml) in Gegenwart serieller Verdünnungen von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) für
24 Stunden inkubiert wurden, erhalten. Die mitogene Antwort während der
folgenden 24 h in Gegenwart von Ligand und Inhibitor wurde durch
die Messung der DNA-Synthese, basierend auf der Einführung von
Bromdesoxyuridin in zelluläre
DNA, quantifiziert.
-
In
separaten Experimenten inhibierte Verbindung 35 die VEGF-abhängige Phosphorylierung
von ERK 1/2 (p42/44MAP-Kinase), ein frühes Downstream-Target von Flk-1/KDR,
dosisabhängig.
Es wurde auch gezeigt, daß die
Inhibierungsaktivität
der Verbindung 35 in diesem System langanhaltend war; Inihibierung
der VEGF-abhängigen
Phosphorylierung von ERK 1/2 noch 48 Stunden nach der Entfernung
von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung
35) aus dem Medium, gefolgt von einer kurzen (2 h) Exposition zu
mikromolaren Konzentrationen der Verbindung.
-
Es
ist erkannt worden, daß VEGF
ein wichtiger Überlebensfaktor
für Endothelzellen
ist. Da 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid (Verbindung
35) die VEGF-abhängige
mitogene Antwort von HUVECs inhibiert, wurde die Wirkung der Verbindung
auf das HUVEC-Überleben
untersucht. In diesen Experimenten wurde die Spaltung des Caspase-3-Substrats
polyADP-Ribosylpolymerase (PARP) als Ablesung für die Apoptose verwendet. HUVECs,
kultiviert in serumfreien Bedingungen für 24 Stunden, zeigten erhebliche
Niveaus an PARP-Spaltung, wie durch die Akkumulation des 23-kDa-PARP-Spaltfragments
detektiert. Diese wurde weitestgehend durch die Zugabe von VEGF
zu dem Zellmedium verhindert, was ein Anzeichen dafür ist, daß VEGF als
ein Überlebensfaktor
in diesem Assay agiert. Es ist gezeigt worden, daß 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) die KDR-Signalgebung inhibiert. Demgemäß inhibierte
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) das VEGF-vermittelte HUVEC-Überleben
dosisabhängig.
Diese Daten zeigen daher, daß Verbindung
35 die Apoptose in Endothelzellen in Kultur in Gegenwart von VEGF
induzierte.
-
C. In-vivo-Effizienzstudien
-
i. Effizienz gegenüber etablierten Tumor-Xenografts
-
Die
In-vivo-Effizienz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) wurde in subkutanen (SC) Xenograftmodellen unter
Verwendung humaner Tumorzellen, die in die Hinterflankenregion athymischer
Mäuse implantiert
wurden, untersucht. Nach der Implantation konnten sich die Tumore
vor Beginn der Behandlung mit der Verbindung bis zu einer Größe von 100–550 mm3 aufbauen.
-
Eine
tägliche
orale Verabreichung der Verbindung 35 führte zu einer dosisabhängigen Inhibierung
des A431-Tumorwachstums, wenn die Behandlung initiiert wurde, nachdem
die Tumore auf eine Größe von 400 mm
3 herangewachsen waren. Eine statistisch
signifikante (P < 0,05)
Inhibierung des Tumorwachstums war bei Dosen von 40 mg/kg/Tag (74%ige
Inhibierung) und 80 mg/kg/Tag (84%ige Inhibierung) zu sehen (siehe
Tabelle 6). In vorherigen Experimenten war eine höhere Dosis
der Verbindung (160 mg/kg/Tag) gegen die aufgebauten A43]-Tumore
nicht effizienter als die 80-mg/kg/Tag-Dosis. Überdies verloren Mäuse, die
mit der 160-mg/kg/Tag-Dosis der Verbindung behandelt wurden, an
Körpergewicht,
was ein Anzeichen dafür
ist, daß die
höhere
Dosis nicht so gut toleriert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in
einem Experiment erhalten, in dem A431-Tumore nur eine Größe von 100
mm
3 erreichen konnten (siehe Tabelle 5).
In diesem zweiten Experiment trat komplette Regression der Tumore
bei sechs von acht Tieren, die mit 80 mg/kg/Tag für 21 Tage
behandelt wurden, ein. Bei diesen sechs Tieren wuchsen die Tumore über einen
110 tägigen
Beobachtungszeitraum nach dem Ende der Behandlung nicht nach. Bei
zwei Tieren, bei denen die Tumore auf eine große Größe (2000–3000 mm
3)
nachwuchsen, bildeten sich die Tumore in Reaktion auf eine zweite
Behandlungsrunde mit Verbindung 35 zurück. Wichtig ist, daß in allen
Effizienzexperimenten 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) bei 80 mg/kg/Tag gut toleriert worden ist, selbst
wenn sie kontinuierlich für
mehr als 100 Tage dosiert wurde. TABELLE
6
-
Kurz
gesagt wurden die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse unter Verwendung
von A431-Zellen
(0,5 × 106 Zellen/Maus), die SC in die Hinterflankenregion
athymischer Mäuse
implantiert wurden, erhalten. Eine tägliche Verabreichung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidemnethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) in einem Cremophor-basierenden Vehikel oder einer
Vehikelkontrolle begann, wenn die Tumore das angezeigte durchschnittliche
Volumen erreicht hatten. Die Tumore wurden unter Verwendung von
Meßschiebern
gemessen und das Tumorvolumen wurde als das Produkt von Länge × Breite × Höhe berechnet.
Die P-Werte wurden durch den Vergleich der Größe der Tumore bei Tieren, die
mit Verbindung 35 (n = 8) behandelt wurden, mit denen von Tieren,
die mit einem Vehikel behandelt wurden (n = 16), am letzten Tag
des Experiments unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests berechnet.
-
Die
Effizienz der Verbindung 35 gegen aufgebaute humane Tumore unterschiedlichen
Ursprungs wurde unter Verwendung von Colo205-(Dickdarmkarzinom),
SF763T-(Gliom) und NCI-H460-(nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom)
Xenografts bestimmt (siehe Tabelle 7). Diese Experimente wurden
unter Verwendung von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) durchgeführt,
die oral mit 80 mg/kg/Tag verabreicht wurde; eine Dosis, die effektiv
war und gut toleriert wurde. TABELLE
7
-
In
den oben genannten Experimenten wurde Verbindung 35 einmal täglich mit
80 mg/kg in einem Cremophor-basierenden Vehikel verabreicht, wenn
die Tumore die angezeigte Größe erreicht
hatten. Die prozentuale Inhibierung im Vergleich zu der Vehikel-behandelten
Kontrollgruppe wurde am Ende der Experimente berechnet. Die P-Werte
wurden durch den Vergleich der Größe der Tumorgrößen bei
Tieren, die mit der Verbindung behandelt wurden, mit den Tumorgrößen von
Tieren, die mit dem Vehikel behandelt wurden, unter Verwendung des
Zweipunkt-Student-Tests berechnet.
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Obgleich
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
(Verbindung 35) das Wachstum aller Tumorarten, die in "Tabelle 7 gezeigt
sind, inhibierte, gab es einen Unterschied hinsichtlich der Antwort
auf die verschiedenen Xenograftmodelle. Genauer gesagt, wurde das
Wachstum von NCI-H460-
und SF763T-Tumoren zum Stehen gebracht oder weitestgehend verlangsamt,
wohingegen sich die Colo205-Tumore, wie A431-Tumore, bei der Behandlung
mit 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-(2-diethylamino-ethyl)amid zurückbildeten.
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Zur
Bestimmung der molekularen Basis für den Unterschied hinsichtlich
der Antwort zwischen Xenograftmodellen, wurden die SF763T-Tumore
untersucht. Hierfür
sind SF763T-Tumore,
die auf eine Behandlung mit 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-diethylamino-ethyl)amid
weniger reagierten, auf einem molekularen Niveau unter Verwendung
immunohistologischer Techniken zur Bestimmung der Wirkung der Behandlung
mit der Verbindung bewertet worden. Diese Studien wurden zu Beginn
bei dieser Tumorart durchgeführt,
da SF763T-Tumore stark mit Mikrogefäßen, die den Endothelzellenmarker
CD31 stark exprimieren, vaskularisiert und daher für die Studien
der Tumormikrogefäßdichte
(MVD) gut geeignet sind. Die immunohistologische Bewertung der SF763T-Tumore
zeigte an, daß Tumore
aus behandelten Tieren, bezogen auf Vehikel-behandelte Kontrollen,
eine verringerte MVD aufwiesen, was mit einem antiangiogenen Wirkmechanismus
für Verbindung
35 übereinstimmt;
die MVD betrug 24,2 ± 4,1 bei
Tieren, die mit Verbindung 35 behandelt wurden, im Vergleich zu
39,3 ± 5,7
für die,
die nur mit dem Vehikel behandelt wurden. Wie aus dem assoziierten
Tumorwachstumsstillstand zu erwarten war, war eine ausgeprägte Inhibierung
der Tumorzellproliferation in Tumoren, die mit Verbindung 35 behandelt
wurden, ersichtlich. Diese Tumore zeigten nur die Hälfte des
Mitoseindex vom dem in Vehikel-behandelten Tumoren (Daten sind nicht gezeigt).
Die Wirkung der Verbindung 35 auf MVD und die Tumorzellproliferation
ist ein Anzeichen dafür,
daß die
Verbindung starke anti-angiogene und Anti-Tumor-Wirkungen hat, selbst
unter Bedingungen, in denen sich Tumore nicht zurückbilden.
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Die
Fähigkeit
der Verbindung 35, die PDGFR-Phosphorylierung und die anschließende In-vivo-Signalgebung
zu inhibieren, wurde in den SF763T-Tumoren, die hohe Konzentrationen
an PDGFRβ exprimieren, ebenso
bewertet. Die Behandlung der SF763T-Tumore mit Verbindung 35 inhibiert
stark die PDGFRβ-Tyrosin-Phosphorylierung
in aufgebauten SF763T-Tumoren.
Verbindung 35 verringerte ebenso die Konzentrationen an phosphorylierter
(aktivierter) Phospholipase-C-gamma (PLC-γ), einem unmittelbar nachgelagerten
Indikator der PDGFR-Aktivierung. Diese Daten demonstrieren, daß die orale
Verabreichung von Verbindung 35 zu einer direkten Wirkung auf die
angestrebte (PDGFR-) Aktivität
in Tumoren in vivo führt.
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Basierend
auf der Demonstration, daß die
Fähigkeit
von Verbindung 35, die VEGF-abhängige Signalgebung
in HUVECs in-vitro zu inhibieren, lang andauernd war (siehe oben),
wurde die Wirksamkeit der Verbindung bewertet, wenn die Verbindung
selten in das Colo205-Tumormodell verabreicht wurde. Wie in Tabelle 8
gezeigt, waren 80 mg/kg (91 %ige Inhibierung) und 40 mg/kg (84%ige
Inhibierung) bei einer täglichen
Verabreichung, jedoch nicht bei einer Verabreichung zweimal pro
Woche wirksam. Im Gegensatz dazu inhibierte eine höhere Dosis
der Verbindung 35 (160 mg/kg) das Wachstum aufgebauter Colo205-Tumore (52%ige Inhibierung)
bei einer Verabreichung zweimal pro Woche, was darauf schließen läßt, daß diese
Verbindung bei einer seltenen Verabreichung in höherer Dosis wirk sam sein kann.
Es ist anzumerken, daß die
Dosierregime von einem Fachmann ohne unnötige Experimente bestimmt werden
können. TABELLE
8
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Kurz
gesagt, die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse wurden unter Verwendung
von Colo205-Zellen
(0,5 × 106 Zellen/Maus), die SC in die Hinterflankenregion
athymischer Mäuse
implantiert wurden, erhalten. Die orale Verabreichung von Verbindung
35 gemäß dem angezeigten
Plan begann, als die Tumore eine Größe von 400 mm3 erreicht
hatten. Die Tumore wurden unter Verwendung von Meßschiebern
gemessen und das Tumorvolumen wurde als das Produkt von Länge × Breite × Höhe berechnet.
Die P-Werte wurden durch den Vergleich der Größe der Tumore von Tieren, die
mit Verbindung 35 behandelt wurden, mit denen von Tieren, die mit
einem Vehikel behandelt wurden, am letzten Tag des Experimentes
unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests berechnet.
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ii. Wirksamkeit von Verbindung 35 in einem
Modell einer disseminierten Krankheit
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Neben
der Förderung
des länger
anhaltenden Wachstums solider Primärtumore, ist auch die Angiogenese
eine wichtige Komponente, die die Entwicklung einer disseminierten
Krankheit aufgrund einer Metastasenbildung aus dem Primärtumor fördert. Die
Wirkung von Verbindung 35 auf die Entwicklung einer disseminierten
Krankheit wurde in dem B16 F1-Maus-Melanom-Lungen-Kolonisationsmodell untersucht.
In diesem Modell bevölkern
B16-F1-Zellen, die
intravenös über die
Schwanzvene athymischer Mäuse
inokuliert wurden, die Lungen und bilden Tumore. Wie in Tabelle
8 gezeigt, verringert die orale Verabreichung von Verbindung 35 mit
80 mg/kg/Tag wirksam die Belastung der Lunge mit B16-F1-Zellen,
was durch Messungen des Gesamtlungengewichts bewertet wurde. Diese
Daten lassen darauf schließen,
daß Verbindung
35 eine disseminierte Krankheit in vivo inhibieren kann. TABELLE
9
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Kurz
gesagt, wurden die in Tabelle 9 gezeigten Ergebnisse unter Verwendung
athymischer Mäuse,
die mit B16-F1-Tumorzellen (5 x 105 Zellen/Maus) über die
Schwanzvene inokuliert worden sind, erhalten. Die Mäuse wurden
täglich
mit der oral verabreichten Verbindung 35 mit 80 mg/kg/Tag (n = 10)
oder Vehikel (n = 18) für
24 Tage nach der Tumorzellinokulation behandelt. Am Ende des Behandlungszeitraumes
wurden die Mäuse
getötet
und ihre Lungen wurden entfernt und gewogen. Die prozentuale Inhibierung
wurde durch den Vergleich des Lungengewichtes von Tieren, die mit
Verbindung 35 behandelt worden sind, mit dem Lungengewicht von Tieren,
die nur mit Vehikel behandelt worden sind, berechnet. Die P-Werte
wurden unter Verwendung des Zweipunkt-Student-Tests bestimmt.
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D. Beispiele für die biologische Aktivität.
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Beispiele
des In-vitro-Potenzials der Verbindungen dieser Erfindung werden
in Tabelle 2 gezeigt.
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SCHLUßFOLGERUNG
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In
Studien zur Untersuchung der pharmakokinetischen Merkmale der Verbindungen
aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist demonstriert worden, daß die orale
Verabreichung einer Einzeldosis der Verbindungen bei Mäusen zu
einer hohen oralen Bioverfügbarkeit
führte.
Die gute orale Bioverfügbarkeit
und die linearen Pharmakokinetiken sind ein Anzeichen dafür, daß die Verbindungen
aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung günstige
pharmakokinetische Merkmale haben.
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Überdies
sind die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung potente Inhibitoren der Tyrosinkinaseaktivität der Split-Kinasedomäne-RTKs
Flk-1/KDR und PDGFR, die in die Angiogenese involviert sind, und
der RTK c-kit, ein Rezeptor für
den Stammzellenfaktor (SCF), der in bestimmte hämatologische Krebsarten involviert
ist. Bei höheren
Konzentrationen inhibieren die Verbindungen aus den bevorzugten
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung auch die Tyrosinkinaseaktivität von FGFR-1.
einer dritten RTK, die in die Angiogenese involviert ist. In Übereinstimmung
mit ihrer biochemischen Aktivität
inhibieren die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung die Liganden-abhängige Tyrosinphosphorylierung
der angestrebten RTKs und die mitogene In-vitro-Antwort humaner Nabelvenenendothelzellen
(HUVECs), die mit VEGF oder FGF stimuliert werden, PDGFR-exprimierender NIH-3T3-Zellen, die mit
PDGF stimuliert werden, und von MO7E-Zellen akuter Myeloidleukämie, die
mit SCF stimuliert werden. Im Gegensatz dazu inhibierten die Verbindungen
aus den bevorzugten Ausführungsformen der
vorliegen Erfindung nicht direkt die Proliferation von Tumorzellen
in komplettem Wachstumsmedium, außer bei Konzentrationen, die
um das 2-bis 3fache
höher waren
als die zur Inhibierung der Liganden-abhängigen mitogenen Antworten
erforderlichen. In Maus-Xenograft-Studien inhibierten die Verbindungen
aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung das Wachstum aufgebauter humaner Tumore
unterschiedlichen Ursprungs dosisabhängig und bei Konzentrationen,
die selbst bei einer länger
dauernden Dosierung (> 100
Tage) gut toleriert wurden. Bei 80 mg/kg/Tag induzierten die Verbindungen
aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegen Erfindung die Zurückbildung
großer
aufgebauter A431- und Colo205-Tumore, und führten zu einer beträchtlichen
Wachstumsinhibierung oder -stase von SF763T- und NCl-H460-Tumoren.
Bei SF763T-Tumore-tragenden Mäusen
führten
die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung zu Verringerungen der Mikrogefäßdichte, Phosphorylierung von
PDGFR in den Tumoren und des Mitoseindex in den Tumorzellen. Bei
dieser Dosis inhibierten die Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung auch die Lungenkolonisation durch B16-F1-Tumorzellen
in einem Tumormetastase-Modell. Regimestudien demonstrierten, daß die Verbindungen
aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bei täglicher
Verabreichung am wirksamsten sind. Ein direkter Nachweis der anti-angiogenen
Aktivität
der Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung wurde in SF763T-Tumoren detektiert, in denen die Mikrogefäßdicht geringer
war. Ein direkter Nachweis dafür,
daß die
Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegen
Erfindung die PDGFR-Phosphorylierung
und -signalgebung in-vivo inhibieren, wurde auch in SF763T-Tumoren
erhalten.
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Alles
in allem stützen
diese Daten die Ansicht, daß die
oral verabreichten Verbindungen aus den bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung anti-angiogene Mittel zur Behandlung
von Krebsarten, einschließlich
solider Tumore und hämatologischer
Malignitäten,
in denen Angiogenese und/oder Signalgebung durch c-kit für die Krankheitspathologie
wichtig sind, sind.
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Es
wird zu erkennen sein, daß die
Verbindungen, Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen der
vorliegende Erfindung die PK-Aktivität effektiv modulieren und daher
erwartungsgemäß als therapeutische
Mittel gegen RTK-, CTK- und STK-bedingte Erkrankungen wirksam sein
werden.
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Alle
in der Beschreibung genannten Patente und Veröffentlichungen beziehen sich
auf das Niveau eines Fachmannes für die Technik, die diese Erfindung
betrifft. Alle Patente und Veröffentlichungen
sind hierin durch Verweis in demselben Ausmaß, als wenn jede einzelne Veröffentlichung
speziell und einzeln durch Verweis aufgenommen worden wäre, aufgenommen.
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Die
hierin veranschaulichend beschriebene Erfindung kann geeigneterweise
ohne irgendein Element oder Elemente, eine Einschränkung oder
Einschränkungen,
die hierin nicht speziell offenbart sind, praktiziert werden. Daher
können
beispielsweise in jedem Beispiel hierin die Ausdrücke „umfassend", „im wesentlichen bestehend
aus" und „bestehend
aus" durch eines
der beiden anderen ersetzt werden. Die Ausdrücke und Äußerungen, die eingesetzt wurden,
werden als Ausdrücke
zur Beschreibung und nicht zur Einschränkung verwendet, und bei der
Verwendung dieser Ausdrücke
und Äußerungen
sollen jegliche Äquivalente
der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon nicht
ausgeschlossen werden, jedoch ist zu erkennen, daß verschiedene
Modifikationen innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung
möglich
sind. Es sollte daher selbstverständlich sein, daß, obgleich
die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen und optionale
Merkmale beschrieben worden ist, ein Fachmann auf Modifikationen
und Variationen der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen
kann, und daß solche
Modifikationen und Variationen im Umfang dieser Erfindung, wie er
in den anhängenden
Ansprüchen
definiert ist, liegen.
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Wenn überdies
Merkmale oder Aspekte der Erfindung hinsichtlich der Markush-Gruppen
beschrieben werden, wird ein Fachmann erkennen, daß die Erfindung
dabei auch im Hinblick auf jedes einzelne Mitglied oder eine Untergruppe
der Mitglieder der Markush-Gruppe be schrieben wird. Wenn beispielsweise
X als ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Brom, Chlor und Iod beschrieben wird,
sind Ansprüche
für X als
Brom und Ansprüche
für X als
Brom und Chlor vollständig
beschrieben.
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Andere
Ausführungsformen
liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.