PL211834B1 - Związki 2-indolinonowe, kompozycja farmaceutyczna je zawierająca oraz ich zastosowanie - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są związki pochodne 2-indolinonów, a także kompozycja farmaceutyczna zawierająca te związki oraz zastosowanie związków.

Kinazy białkowe są enzymami, które katalizują fosforylację grup hydroksylowych reszt tyrozyny, seryny i treoniny białek. Następstwa tej pozornie prostej aktywności są oszałamiające; wzrost, różnicowanie i proliferacja komórek, tj., właściwie wszystkie aspekty życia komórek zależą w taki czy inny sposób od aktywności kinaz białkowych.

Ponadto nieprawidłową aktywność kinaz białkowych powiązano z mnóstwem zaburzeń, sięgających od stosunkowo niegroźnych dla życia chorób, takich jak łuszczyca, do chorób niezmiernie zjadliwych, takich jak glejak (rak mózgu).

Kinazy białkowe można podzielić dogodnie na dwie klasy, tyrozynowe kinazy białkowe (PTK) i serynowe-treoninowe kinazy białkowe (STK).

Jednym z podstawowych przejawów aktywności PTK jest ich powiązanie z receptorami czynników wzrostowych. Receptory czynników wzrostowych są białkami powierzchniowymi komórek. Po związaniu z ligandem czynnika wzrostowego, receptory czynników wzrostowych ulegają przekształceniu do formy aktywnej, która oddziaływuje z białkami wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Prowadzi to do fosforylacji reszt tyrozyny receptora i innych białek oraz do tworzenia wewnątrz komórek kompleksów z różnorodnymi cytoplazmatycznymi cząsteczkami sygnałowymi, które z kolei wpływają na szereg odpowiedzi komórkowych, takich jak podział komórek (proliferacja), różnicowanie komórek, wzrost komórek, przekazywanie wpływów metabolicznych do otoczenia pozakomórkowego, itp. Szczegółowy opis i dyskusję opublikowano w pracy Schlessinger i Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992), którą włącza się jako odnośnik wraz z dowolnymi rysunkami tak, jakby umieszczono ją w tym dokumencie.

Receptory czynników wzrostowych o aktywności PTK znane są, jako receptorowe kinazy tyrozynowe („RTK”). Obejmują one dużą rodzinę receptorów przezbłonowych o różnorodnej aktywności biologicznej. Do chwili obecnej zidentyfikowano przynajmniej dziewiętnaście (19) różnych podrodzin RTK. Jednym z przykładów jest podrodzina oznaczona „HER” RTK, która obejmuje EGFR (receptor nabłonkowego czynnika wzrostowego), HER2, HER3 i HER4. Te RTK składają się z pozakomórkowej, glikozylowanej domeny wiążącej ligand, domeny przezbłonowej oraz wewnątrzkomórkowej, cytoplazmatycznej domeny katalitycznej, która może fosforylować reszty tyrozynowe białek.

Inna podrodzina RTK obejmuje receptor insuliny (IR), receptor insulino-podobnego czynnika wzrostowego 1 (IGF-IR) oraz receptor spokrewniony z receptorem insuliny (IRR). IR i IGF-IR oddziaływują z insuliną, IGF-I i IGF-II tworząc heterotetramer, składający się z dwóch całkowicie zewnątrzkomórkowych, glikozylowanych podjednostek oraz dwóch podjednostek p, które przechodzą przez błonę komórkową i zawierają domenę kinazy tyrozynowej.

Trzecią podrodzinę RTK określa się mianem grupy receptorów czynników wzrostowych pochodzących od płytek krwi („PDGFR”) i obejmuje ona PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, c-kit oraz c-fms. Receptory te zbudowane są z zewnątrzkomórkowych, glikozylowanych domen, składających się z różnorodnej liczby pętli podobnych do immunoglobin oraz domeny wewnątrzkomórkowej, przy czym domena kinazy tyrozynowej przerwana jest niezwiązanymi sekwencjami aminokwasowymi.

Inną grupą, którą czasami zalicza się do podrodziny PDGFR ze względu na ich podobieństwo, jest podrodzina receptorowych kinaz wątroby płodowej („flk”). Uważa się, że grupa ta obejmuje receptor kinazy zawierającej wstawkę domeny kinazy 1 wątroby płodowej (kinase insert domain-receptor fetal liver kinase-1, KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-lR, flk-4 i podobną do fms kinazę tyrozynową 1 (flt-1).

Dalszym członkiem rodziny receptorów czynników wzrostowych o aktywności kinazy tyrozynowej jest podgrupa receptorów czynników wzrostowych fibroblastów („FGF”). Grupa ta obejmuje cztery receptory, FGFR1-4 i siedem ligandów, FGF1-7. Chociaż jeszcze nie zdefiniowano tego dokładnie, wydaje się, że receptory te zbudowane są z zewnątrzkomórkowych, glikozylowanych domen, składających się z różnorodnej liczby pętli podobnych do immunoglobin oraz domeny wewnątrzkomórkowej, przy czym sekwencja domeny kinazy tyrozynowej przerwana jest niezwiązanymi sekwencjami aminokwasowymi.

Jeszcze innym członkiem rodziny receptorów czynników wzrostowych o aktywności kinazy tyrozynowej jest podgrupa receptorów czynników wzrostowych śródbłonka naczyniowego („VEGF”). VEGF jest dimerycznym glikoproteidem podobnym do PDGF, ale o innych funkcjach biologicznych

PL 211 834 B1 i innej specyficzności dla komórek docelowych in vivo. Obecnie uważa się, że VEGF odgrywa zasadniczą rolę w powstawaniu i rozwoju naczyń.

Bardziej kompletne wyliczenie znanych podrodzin RTK znajduje się w publikacji Plowman i in., DN&P, 7(6):334-339 (1994), którą włącza się jako odnośnik wraz z dowolnymi rysunkami tak, jakby umieszczono ją w tym dokumencie.

Oprócz RTK istnieje również rodzina wyłącznie wewnątrzkomórkowych PTK, nazywanych „niereceptorowymi kinazami tyrozynowymi” lub „komórkowymi kinazami tyrozynowymi”. W niniejszym opisie stosuje się to drugie określenie i jego formę skrótową „CTK”. CTK nie zawierają domen zewnątrzkomórkowych i przezbłonowych. Do chwili obecnej zidentyfikowano ponad 24 CTK w 11 podrodzinach (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZapVO, Fes, Fps, Fak, Jak i Ack).

Podrodzina Src jest jak do tej pory największą grupą CTK i obejmuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hck, Fgr oraz Yrk. Bardziej szczegółowy opis CTK znajduje się w publikacji Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), którą włącza się jako odnośnik wraz z dowolnymi rysunkami tak, jakby umieszczono ją w tym dokumencie.

Kinazy serynowe/treoninowe, STK, podobnie jak CTK, są przeważające wewnątrzkomórkowe, chociaż istnieje kilka kinaz receptorowych typu STK. STK są najbardziej powszechnymi kinazami cytozolowymi; tj. kinazami, które spełniają swoje funkcje w tej części cytoplazmy, która nie należy do organelli cytoplazmatycznych i szkieletu komórkowego. Cytozol jest regionem komórek, w którym zachodzi większość procesów metabolizmu pośredniego i biosyntezy komórek; np. synteza białek w rybosomach zachodzi w cytozolu.

Na udział RTK, CTK i STK wskazywano w szeregu stanów chorobotwórczych, włączających, co istotne, raka. Inne stany chorobotwórcze, które wiązano z PTK, obejmują, bez ograniczania, łuszczycę, marskość wątroby, cukrzycę, rozwój naczyń, nawrót zwężenia naczyń, choroby oczu, reumatyczne zapalenie stawów i inne zaburzenia zapalne, zaburzenia immunologiczne, takie jak choroby autoagresyjne, choroby sercowo-naczyniowe, takie jak miażdżyca tętnic i różnorakie zaburzenia nerkowe.

W odniesieniu do raka, dwie z zasadniczych hipotez wysuwają wyjaśnienie, że nadmierna proliferacja komórkowa, która jest odpowiedzialna za rozwój guzów, związana jest z funkcjami, o których wiadomo, że podlegają regulacji przez PK. Sugerowano, że wzrost komórek złośliwych jest wynikiem załamania mechanizmu kontrolującego podział i/lub różnicowanie komórek. Wykazano, że produkty białkowe szeregu proto-onkogenów są zaangażowane w szlakach przetwarzania sygnałów, które regulują wzrost i różnicowanie komórek. Te produkty białkowe proto-onkogenów włączają opisane powyżej zewnątrzkomórkowe czynniki wzrostowe, przezbłonowe receptory czynników wzrostowych PTK (RTK), cytoplazmatyczne PTK (CTK) i cytozolowe STK.

W świetle oczywistego połączenia aktywności komórkowych, związanymi z PK, z szeregiem różnorodnych zaburzeń u człowieka nie jest zaskakujące, że dokłada się wszelkich starań w celu identyfikacji sposobów modulacji aktywności PK. Niektóre z badań włączają podejście biomimetyczne z zastosowaniem dużych cząsteczek, modelowanych na wzór cząsteczek zaangażowanych w rzeczywistych procesach komórkowych (np. mutanty ligandów (Zgłoszenie Patentowe USA Nr 4,966,849); rozpuszczalne receptory i przeciwciała (Zgłoszenie Patentowe Nr WG 94/10202, Kendall i Thomas, Proc. Natl Acad. Sci., 90:10705-09 (1994), Kim i in., Nature, 362:841-844 (1993)); ligandy RNA (Jelinek i in., Biochemistry, 33:10450-56); Takano i in., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella i in., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright i in., J. Cellular Phys., 152:448-57) oraz inhibitory kinazy tyrozynowej (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Zgłoszenie Patentowe USA Nr 5,330,992; Mariani i in., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35:2268 (1994)).

Ponadto podjęto próby identyfikacji małych cząsteczek, które działają jako inhibitory PK. Jako inhibitory kinazy tyrozynowej opisano na przykład arylowe związki bis-monocykliczne, bicykliczne i heterocykliczne (PCT WO 92/20642), pochodne azaindoli winylenowych (PCT WO 94/14808) i 1-cyklopropylo-4-pyridylochinolony (Zgłoszenie Patentowe USA Nr 5,330,992). Jako inhibitory PTK użyteczne w leczeniu raka opisano również związki styrylowe (Zgłoszenie Patentowe USA Nr 5,217,999), związki pirydylowe podstawione grupą styrylową (Zgłoszenie Patentowe USA Nr 5,302,606), pochodne chinazolinowe (EP Zgłoszenie Patentowe Nr O 566 266 A1), indole selenowe i selenki (PCT WO 94/03427), tricykliczne związki polihydroksylowe (PCT WO 92/21660) oraz związki kwasu benzylofosfoniowego (PCT WO 91/15495).

Celem wynalazku jest, zatem dostarczenie pewnych 3-pirolo podstawionych 2-indolinonowych związków, które wykazują zdolność do modulowania PK i są tym samym przydatne w leczeniu zaburzeń związanych z nienormalną aktywnością PK.

PL 211 834 B1

Istotą wynalazku jest związek o wzorze (I):

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym:

R¹ jest wybrane z grupy obejmującej wodór, (C1-C4)alkil, i -C(O)NR⁸R⁹;

13 14

R² jest wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, fenyl, oraz -S(O)2NR¹³R¹⁴;

15

R³ jest wybrane z grupy obejmującej wodór, pirydynyl, -C(O)OR¹⁵ i fenyl, korzystnie podstawiony przez 1-2 podstawniki wybrane z grupy obejmującej fluorowiec i (C1-C4)alkil;

R⁴ oznacza wodór, ₅

R⁵ oznacza wodór lub (C1-C4)alkil;

R⁶ oznacza -C(O)R¹⁰;

R⁷oznacza (C1-C4) alkil lub fenyl;

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane spośród grupy obejmującej wodór i fenyl, korzystnie podstawiony przez 1-2 podstawniki wybrane z grupy obejmującej fluorowce;

R¹⁰ oznacza -N(R¹¹) (CH₂)_nR¹², gdzie n oznacza 1, 2, lub 3,

12

R¹¹ oznacza wodór, a R¹² jest wybrane spośród grupy obejmującej hydroksyl, heteroaryl zawie15 rający w pierścieniu 5-6 atomów z czego jeden stanowi atom N, a pozostałe są atomami C, -C(O)R¹⁵, oraz -NR¹³R¹⁴;

14

R¹³ i R¹⁴ są niezależnie wybrane spośród grupy obejmującej wodór, (C1-C4)alkil, pirydynyl, i fenyl, korzystnie podstawiony przez fluorowiec; albo

14

R¹³ i R¹⁴ mogą być połączone tworząc grupę heterocykliczną zawierającą 5-7 atomów w pierścieniu, z czego jeden lub dwa atomy stanowią atomy N, a pozostałe są atomami C, korzystnie podstawioną przez grupę okso;

R¹⁵ oznacza wodór, hydroksyl, i (C1-C4)alkoksyl, gdzie alkoksyl oznacza O-alkil.

14

Dla związku według wynalazku korzystne jest, gdy R¹³ i R¹⁴ są niezależnie wybrane spośród grupy obejmującej wodór, (C1-C4)alkil, i pirydynyl, lub połączone -(CH2)4-, -( CH2)5-, i - (CH2)2N (CH3) 12 13 14 13 14 (CH₂)₂- oraz gdy n oznacza 2 lub 3; a R¹² oznacza -NR¹³R¹⁴ „ którym R¹³ i R¹⁴ niezależnie oznaczają 12 13 14 13 14 (C₁-C₄) alkil, albo gdy n oznacza 2 lub 3; a R¹² oznacza -NR¹³R¹⁴ w którym R¹³ i R¹⁴ są połączone ₁ tworząc grupę wybraną spośród -(CH2)4-, -(CH2)5-, lub -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-, oraz gdy R¹ oznacza -C(O)NR⁸R⁹, gdzie R⁸ jest wodorem, a R⁹ jest fenylem, korzystnie podstawionym przez 1-2 podstawniki wybrane z grupy obejmującej fluorowce;.

Korzystnie jest, gdy związkiem według wynalazku jest związek o wzorze:

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, a równie korzystnie, gdy jest nim związek o wzorze:

PL 211 834 B1

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Celem wynalazku jest również dostarczenie odpowiedniej kompozycji farmaceutycznej. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca związek aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako związek aktywny zawiera związek według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól. Najkorzystniej, gdy jako związek aktywny kompozycja zawiera związek o wzorze przedstawionym powyżej, to jest związek

lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Przedmiotem wynalazku jest również nowe zastosowanie związków.

Zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że związki określone tak jak w wynalazku albo związek o wzorze przedstawionym bezpośrednio powyżej, lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, są stosowane do wytwarzania leku do leczenia chorób raka wybranych z grupy obejmującej raka płaskokomórkowego, gwiaździaka, mięsaka Kaposiego, glejaka niedojrzałego, raka płuc, raka pęcherza, raka głowy i szyi, czerniaka, raka jajnika, raka prostaty, raka piersi, drobnokomórkowego raka płuc, glejaka, raka okrężnicy, raka narządów moczowo-płciowych i raka żołądkowo-jelitowego.

Inne zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że związki określone tak jak w wynalazku albo związek o wzorze przedstawionym bezpośrednio powyżej, lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, są stosowane do wytwarzania leku do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej takie zaburzenia jak cukrzyca, zaburzenia autoimmunologiczne, zaburzenia hiperproliferacyjne, restenoza, zwłóknienie, łuszczyca, choroba von Heppel-Lindau, zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, rozwój naczyń, zaburzenia zapalne, zaburzenia immunologiczne i zaburzenia sercowo-naczyniowe.

Jeśli nie wskazano inaczej następujące terminy użyte w opisie i zastrzeżeniach patentowych mają znaczenia omówione poniżej:

„Alkil” odnosi się do nasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego obejmującego prostołańcuchowe i rozgałęzione grupy zawierające od 1 do 4 atomów węgla np. metyl, etyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, izo-butyl lub tert-butyl.

„Heteroaryl” odnosi się do monocyklicznego pierścienia grupy od 5 do 6 atomów w pierścieniu, zawierającym jeden, heteroatomy- N w pierścieniu, przy czym pozostałe atomy w pierścieniu stanowią C, a ponadto zawierającym całkowicie sprzężony system elektronów pi. Przykłady niepodstawionych grup heteroarylowych obejmują takie jak pirol, imidazol, pirazol, pirydyna, czy pirymidyna.

„Grupa heterocykliczna” oznacza nasycony cykliczny rodnik zawierający od 5 do 7 atomów w pierścieniu, z których jeden lub dwa atomy stanowią heteroatomy N, a pozostałe atomy stanowi węgiel, przy czym jeden lub dwa atomy węgla mogą ewentualnie być zastąpione grupą karbonylową.

„Hydroksyl” odnosi się do grupy -OH.

„Alkoksyl” odnosi się do -O-(niepodstawionego alkilu), i obejmuje metoksyl, etoksyl, propoksyl, czy butoksyl.

„Fluorowco” odnosi się do fluoru, chloru, bromu lub jodu, korzystnie fluoru lub chloru.

Określenie „ewentualny” lub „ewentualnie” oznacza, że później opisane zdarzenie lub okoliczność może, ale nie musi występować, zaś opis obejmuje przypadki, kiedy zdarzenie lub okoliczność występuje i przypadki, w których nie występuje. Np. „grupa heterocykliczna ewentualnie podstawiona

PL 211 834 B1 przez grupę alkilową” oznacza, że alkil może, ale nie musi występować i opis obejmuje sytuacje, w których grupa heterocykliczna jest podstawiona przez grupę alkilową i sytuacje, w których grupa heterocykliczna nie jest podstawiona przez grupę alkilową.

Terminy „2-indolinon”, „indolin-2-on” i „2-oksindol” są stosowane tutaj zamiennie do cząsteczki o budowie:

Termin „pirol” odnosi się do cząsteczki o budowie:

Termin „2-indolinon podstawiony na pierścieniu pirogowym” i „3-pirolidenylo-2-indolinon” stosuje się tutaj zamiennie w stosunku do związku o strukturze wyrażonej Wzorem (I).

Związki o takim samym wzorze chemicznym, ale różniące się właściwościami lub kolejnością wiązania atomów lub usytuowaniem atomów w cząsteczce są tutaj nazywane „izomery”. Izomery różniące się przestrzennym usytuowaniem atomów to „stereoizomery”. Stereoizomery niebędące lustrzanym odbiciem innych cząsteczek to „diastereomery” i te które stanowią nienakładające się obrazy innych cząsteczek są nazywane „enancjomery”. Gdy związek posiada centrum asymetrii, np. jest związany z czterema różnymi grupami, możliwe jest występowanie pary enancjomerów. Enancjomer można charakteryzować bezwzględną konfiguracją jego centrum asymetrii i opisywać regułami sekwencjonowania R- i S- Cahna i Preloga lub w sposób zależny od tego, w którym kierunku cząsteczka skręca płaszczyznę spolaryzowanego światła tzn. jako prawoskrętną lub lewoskrętną (tj., jako izomery odpowiednio (+) lub (-)). Związek chiralny może występować albo, jako poszczególne enancjomery albo jako ich mieszanina. Mieszanina zawierająca w równych proporcjach enancjomery jest określana jako „mieszanina racemiczna”.

Związki według wynalazku mogą posiadać jedno lub więcej centrów asymetrii; takie związki mogą więc być wytwarzane jako poszczególne stereoizomery (R)- lub (S) lub jako ich mieszaniny. Np. jeśli podstawnik R⁶ w związku o wzorze (I) stanowi 2-hydroksyetyl, przy czym węgiel, do którego przyłączona jest grupa hydroksylowa stanowi centrum asymetrii, wtedy związek o wzorze (I) może występować jako stereoizomer (R)- lub (S)-. Sposoby badania stereochemii i rozdzielania stereoizomerów są dobrze znane w dziedzinie (patrz omówienie w Rozdziale 4 „Advanced Organic Chemistry”, wydanie 4, J, March, John Wiley i Sons, Nowy Jork, 1992).

Związki o wzorze (I) mogą podlegać zjawisku tautomerii i izomerii strukturalnej. Np. związki według wynalazku mogą znajdować się w konfiguracji E lub Z w okolicy wiązania podwójnego łączącego grupę 2-indolinonową z grupą pirolową lub mogą stanowić mieszaninę E i Z.

„Kompozycja farmaceutyczna” odnosi się do mieszaniny zawierającej związek według wynalazku lub jego fizjologicznie/farmaceutycznie dopuszczalną sól, wraz z innymi chemicznymi składnikami, takimi jak fizjologicznie/farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i rozczynniki. Zadaniem kompozycji farmaceutycznej jest ułatwienie podawania związku do organizmu.

Związek o wzorze (I) może także być podawany w postaci proleku. Określenie „prolek” odnosi się do środka, który przekształca się w macierzysty lek in vivo. Proleki są często przydatne, ponieważ w pewnych sytuacjach są łatwiejsze do stosowania niż macierzyste leki. Mogą one, na przykład, być biodostępne przy podawaniu doustnym, podczas gdy lek macierzysty nie ma tej właściwości. Prolek może także mieć lepszą rozpuszczalność w kompozycjach farmaceutycznych niż macierzysty lek.

PL 211 834 B1

Przykładem proleku byłby związek według niniejszego wynalazku, który podaje się jako ester („prolek”), aby ułatwić transport w poprzek błony komórkowej w przypadku, gdy rozpuszczalność w wodzie jest szkodliwa dla mobilności, który następnie jest metabolicznie hydrolizowany do kwasu karboksylowego, jednostki aktywnej, kiedy wewnątrz komórki rozpuszczalność w wodzie jest korzystna.

Kolejnym przykładem proleku może być krótki polipeptyd, np., bez ograniczenia, zawierający 2-10 aminokwasów polipeptyd, związany poprzez końcową grupę aminową z grupą karboksylową związku według wynalazku, w którym polipeptyd hydrolizuje się lub metabolizuje in vivo w celu uwalniania aktywnej cząsteczki.

Ponadto, uważa się, że związek o wzorze (I) mógłby być metabolizowany przez enzymy w organizmie takim jak ludzki w celu wytworzenia metabolitu, który może modulować aktywność kinaz białkowych.

Stosowany tu termin „fizjologicznie/farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” odnosi się do grupy nośników lub rozcieńczalników, które nie powodują znaczącego podrażnienia organizmu i nie wpływają negatywnie na biologiczną aktywność i właściwości podawanego związku.

Termin „farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik” odnosi się do obojętnej substancji dodanej do kompozycji farmaceutycznej w celu ułatwienia podawania związku. Przykłady rozczynników obejmują węglan wapnia, fosforan wapnia, różne cukry i typy skrobi, pochodne celulozy, żelatyna, oleje roślinne i glikole polietylenowe.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalna sól” odnosi się do tych soli, który utrzymują biologiczną skuteczność i właściwości macierzystego związku. Takie sole są wybrane z grupy, w skład której wchodzą:

(i) sól addycyjna kwasu, którą otrzymuje się na drodze reakcji wolnej zasady macierzystego związku z kwasami nieorganicznymi takimi jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas azotowy, kwas fosforowy, kwas siarkowy i kwas nadchlorowy itp. lub z kwasami organicznymi takimi jak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas (D) lub (L) jabłkowy, kwas maleinowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas salicylowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas bursztynowy lub kwas malonowy itp., korzystnie kwas chlorowodorowy lub kwas (L)-jabłkowy taki jak sól L-jabłczanowa (2-dietyloaminoetylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego; lub (2) sole utworzone w przypadku, gdy kwasowy proton występujący w macierzystym związku albo jest zastąpiony przez jon metalu, np. jon metalu alkalicznego, ziem alkalicznych lub jon glinu; lub jest skoordynowany z organiczną zasadą taką jak etanoloamina, dietanoloamina, trietanoloamina, trometamina, N-metyloglukozoamina, itp.

Określenie „PK” odnosi się do receptorowych kinaz białkowych tyrozynowych (RTKs), niereceptorowych lub „komórkowych” kinaz tyrozynowych (CTKs) i kinaz seryno-treoninowych (STKs).

Określenie „metoda” odnosi się do sposobów, środków, technik i procedur dochodzenia do jakiegokolwiek celu, obejmujących, lecz nieograniczających się do, tych sposobów, środków, technik i procedur, które są albo znane, albo mogą być łatwo wyprowadzone, ze znanych sposobów, środków, technik i procedur, przez praktyków w dziedzinie chemii, farmacji, biologii, biochemii i medycyny.

Terminy „modulacja” lub „modulowanie” odnoszą się do zmiany katalitycznej aktywności RTKs, CTKs i STKs. W szczególności, modulowanie odnosi się do aktywacji katalitycznej aktywności RTKs, CTKs i STKs, korzystnie aktywacji lub hamowania katalitycznej aktywności RTKs, CTKs i STKs, zależnie od stężenia związku lub soli, na którego działanie wystawione są RTK, CTK lub STK lub, korzystniej, hamowania katalitycznej aktywności RTKs, CTKs i STKs.

„Katalityczna aktywność” odnosi się do stopnia fosforylacji tyrozyny pod wpływem, bezpośrednim lub pośrednim, RTKs i/lub CTKs lub fosforylacji seryny i treoniny pod wpływem, bezpośrednim lub pośrednim, STKs.

„Kontaktowanie” odnosi się do stykania związku według wynalazku i docelowego PK w taki sposób, że związek może wpływać na katalityczną aktywność PK, albo bezpośrednio, tj., przez oddziaływanie z kinazą jako taką lub pośrednio, tj., przez oddziaływanie z inną cząsteczką, od której jest zależna katalityczna aktywność kinazy. Takie „kontaktowanie” można przeprowadzić „in vitro,” tj., w probówce, na szalce Petriego i tym podobnych. W probówce, kontaktowanie może dotyczyć tylko interesującego związku i PK lub może dotyczyć całej komórki. Komórki mogą być także utrzymywane lub hodowane w naczyniach do hodowli komórkowych i kontaktowane ze związkami w tym środowisku. W tym kontekście, zdolność poszczególnych związków wpływania na zaburzenia związane z PK, tj., IC50 związku, określone poniżej, można wyznaczyć przed użyciem związków in vivo w odniesieniu

PL 211 834 B1 do bardziej skomplikowanych żywych organizmów. Dla komórek na zewnątrz organizmu, istnieje wiele metod dobrze znanych fachowcom w dziedzinie, przeprowadzania kontaktu PKs ze związkami chemicznymi, obejmujących, lecz nieograniczających się do, bezpośredniej mikroiniekcji komórki i licznych technik wykorzystujących nośniki błonowe.

„In vitro” odnosi się do metod przeprowadzanych w sztucznym środowisku takich jak np. bez ograniczenia, w probówce lub pożywce hodowlanej.

„In vivo” odnosi się do metod przeprowadzanych wewnątrz żywych organizmów takich jak, bez ograniczenia, mysz, szczur lub królik.

Terminy „zaburzenia związane z PK”, „zaburzenia powodowane przez PK”, i „nienormalna aktywność PK” wszystkie odnoszą się do grupy stanów charakteryzujących się niewłaściwą, tj., zbyt małą lub, bardziej powszechnie, nadmierną, katalityczną aktywnością PK, przy czym poszczególne PK mogą stanowić RTK, CTK lub STK. Niewłaściwa katalityczna aktywność może pojawiać się, jako wynik: (1) ekspresji PK w komórce, która normalnie nie wytwarza PK, (2) zwiększonej ekspresji PK prowadzącej do niepożądanego namnażania, różnicowania i/lub wzrostu komórki, lub, (3) obniżonej ekspresji PK prowadzącej do niepożądanej redukcji namnażania, różnicowania i/lub wzrostu komórki. Nadmierna aktywność PK odnosi się do albo wzmocnienia genu kodującego poszczególną PK lub powstaniem poziomu aktywności PK, który koreluje z zaburzeniem proliferacji, różnicowania i/lub wzrostu komórki (tj., w momencie zwiększenia poziomu PK stan zaawansowania jednego lub więcej symptomów zaburzeń komórkowych zwiększa się). Zbyt mała aktywność jest, oczywiście, przeciwieństwem, w którym stan zaawansowania jednego lub więcej symptomów zaburzeń komórkowych zwiększa się kiedy poziom aktywności PK zmniejsza się.

Określenia „leczyć” i „leczenie” odnoszą się do metody łagodzenia lub usuwania zaburzeń komórkowych związanych z PK i/lub związanych z nimi symptomów. W odniesieniu do raka, te terminy znaczą po prostu, że przewidywana długość życia osoby dotkniętej tym schorzeniem zwiększy się i jeden lub więcej z symptomów choroby będzie zredukowanych.

Określenie organizm odnosi się do dowolnej żywej jednostki składającej się, z co najmniej jednej komórki. Organizm może być organizmem prostym jak np. pojedyncza komórka eukariotyczna lub skomplikowanym jak np. ssak, włączając istoty ludzkie.

Określenie „terapeutycznie skuteczna ilość” odnosi się do takiej ilości związku, która podczas podawania będzie łagodziła pewien zakres jednego lub więcej symptomów leczonego zaburzenia. W odniesieniu do leczenia raka, terapeutycznie skuteczną ilość stanowi tutaj ilość, która ma następujący wpływ:

1) zmniejsza wymiar guza;

2) hamuje (tj., spowalnia w pewnym stopniu, korzystnie zatrzymuje) przerzuty guza;

3) hamuje w pewnym zakresie (tj., spowalnia w pewnym stopniu, korzystnie zatrzymuje) wzrost guza, i/lub,

4) łagodzi w pewnym zakresie (lub, korzystnie, eliminuje) jeden lub więcej symptomów związanych z rakiem.

„Monitoring” oznacza obserwację lub wykrywanie wpływu kontaktowania związku z komórką eksprymującą poszczególne PK. Obserwowanym lub wykrywanym efektem może być zmiana fenotypu komórki, zmiana aktywności katalitycznej PK lub zmiana wzajemnego oddziaływania PK i naturalnym partnerem wiązania. Techniki obserwowania lub wykrywania takich efektów są dobrze znane w dziedzinie.

Wyżej wymieniony efekt jest wybrany spośród zmiany lub braku zmiany fenotypu komórki, zmiany lub braku zmiany katalitycznej aktywności wymienionej kinazy białkowej lub zmiany lub braku zmiany wzajemnego oddziaływania wymienionej kinazy białkowej i naturalnego partnera wiązania w końcowym aspekcie wynalazku.

Określenie „fenotyp komórki” odnosi się do zewnętrznego wyglądu komórki lub tkanki lub funkcji biologicznej komórki lub tkanki. Przykłady, bez ograniczenia, fenotypu komórki to wymiar komórki, wzrost komórki, proliferacja komórki, różnicowanie komórki, przeżycie komórki, apoptoza i pobieranie środków odżywczych i ich zastosowanie. Takie właściwości fenotypowe są mierzalne technikami dobrze znanymi w dziedzinie techniki.

Określenie „naturalny partner wiązania” odnosi się do grupy polipeptydów, które łączą się z poszczególnymi PK w komórce. Naturalni partnerzy wiązania mogą mieć znaczenie przy propagacji sygnału przy transdukcji sygnału za pośrednictwem PK. Zmiana we wzajemnym oddziaływaniu naturalnego partnera wiązania i PK może objawiać się jako zwiększone lub zmniejszone stężenie kompleksu

PL 211 834 B1

PK/naturalny partner wiązania i, w rezultacie, zauważalną zmianą zdolności PK do wpływania na sygnał transdukcyjny.

Reprezentatywne związki według niniejszego wynalazku pokazano w tablicy I poniżej.

Tablica 1

Przy kład	Budowa	Nazwa
37		Q 0 J! # W I yw	lp-N~	(3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromc-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenometylo >- 2-i zoprapylo-4-fenylo-lH- piroio-3-karboksylowego
38	I	O o \_/“N H YW 1		(3-pirolidyn-l-ylopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2-izopropylo-4-fenylo-lH- piroio-3-karboksylowego
39		Q Q Gr(	o Ν» '«	(2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2-
	Br., 1,	Λ J N Yrw		(dihydroindol-3-ylidenometylo)-
				izopropylo-4-fenylo-lH-pirolo-
				3-karboksylowego
40		0>,-	y—	[3-(4-metylopiperazyn-l-ylo)-
	Gf^-	Ul ii jf N iT YW 1 <-N H		propylo)amid kwasu 5-(5-bromc- 2-okso-l,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-2-izopropylo-4- fenylo-lH-pirolo-3- karboksylowego

PL 211 834 B1

41	ΘΊ	9 5-„	kwas 5-(5-bromo-2-okso-l, 2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2- izopropylo-4-fenyl ΙΗ-pirolo- 3- karboksylowy
42		Ο ι	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid
		Ηζη	kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l, 2-
	Βγυ		dihydroindol-3-ylidenennetylo)-
		Αν Η	2-metylo-4-fenylo-łH-pirolo-3-
			karboksylowego
44		Ο Q —Ν”	(2-dimetyloaminoetylo)amid
		~Κ«	kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2-
	τ	γθ	dihydroindol-3-ylidenomety_o)-
			2-metylo-4-ferLylo-lH-pirolo-3-
			karboksylowego
47		%rc	(3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-
	βτ	tp	dihydroindol-3-ylidenometylo) -
		Η	2-metylo-4-fenylo-lH-pirolo-3-
			karboksylowego
48		0 w >Ζί.	(2-dimetyloaminoetylc)amid
	Βν	Αρ ·'	kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l, 2-
		Η1	dihydroindol-3-ylidenometylo)-
			2,4-dimetylo-lH-pirolo-3-
			karboksylowego

PL 211 834 B1

49		(2-dimetyloaminoetylο)amid kwasu 2,4-dirneoylo-5-(2-okso-6- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego
50		(2-diir.etyloamir.oetylo) amid kwasu 5-{5-chloro-2-okso-1,2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2, 4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
51	0 Η π, Λ λ	(2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5- ; 5-bromo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2,4-dimetylo-lH-piro o-3- karboksylowego
52	Ο Η W Η	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2,4-ćimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
53		(3-lmidazol-l-ylopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidcnometylo)- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego

PL 211 834 B1

56	νΛη	(2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-{2-okso-5- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego
H	JL Ά F A
57		? 0	(2-pirolidyn-l-ylc-etylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karbcksylowego
58	°O^ H	Ac	(3-imidazol-l-ylopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego
59	σ°ί	yj-n fa	{2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenemetylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego
60	cr°i	yJ-H -fC '—ł F 0	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo) amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6- fenylo-1,2-dihydroir.dol-3- ylidenometylc)-lH-pirolo-3- karboksylowego

PL 211 834 B1

61		O H	(3-imidazol-l-ylopropylo) air.id kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-lH-pirclo-3- karbo ksylowego
62			0 „ <	(2-dieryloaminoetylo)amid kwasu
	ν C1	y$	>0		5-[6-(3,5-dichlorofeny1 o)-2- okso-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylol-2,4-dimetylo-lH- pirolo-3-karboksylowego
63	f/			,c	(2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6- pirydyn-3-ylo-l, 2-dihydroindol- 3-ylidenomerylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego
64			o	P	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid
		g-	\An <v		kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-
	(/	Ά	J1		pirydyn-3-ylo-l,2-dihydroindol- 3-ylidenometylo}-1H-pirolo-3- karboksylowego
65	_ X N	H	0 \ Λν“ H cT	X Z*N	(3-dimetyloaminopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6- pirydyn-3-ylo-l,2-dihydroindol- 3-ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego

PL 211 834 B1

67	%iAc· κ	(3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5- fenylo-1,2-óihydroindol-3- ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karboksylowego
68	0 Η	(3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 2f4-dimetylo-5-(2-okso-6- fenylo-1,2-dihydroindol-3- ylidenomerylo)-lE-pirolo-3- karboksylowego
69	“Φ jTj2Y=O <-	(3-chloro-4-metoksyfenylo)amid kwasu 3—[4—[3— dietyloaminopropylkarbamoilo)- 3, 5-dimetylo-lH-pirolo-2- y[metylen]-2-okso-2,3-dihydro- lH-indolo-4-karboksylowego
70		(3-dieLyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l, 2- dihydroindol-3-yiidenometylo!- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
71		[2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenonetylo)- 2, 4-diizopropylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
72	u =< ffi	i 3-dietyloa.minopropylo) amid kwasu 5-(5-bromc-2-okso-l·,2- dihydroindol-3-y1 i denonetylc)- 2,4-diizopropylo- lI-I-pirolo-3- karboksylowego

PL 211 834 B1

72	ΥΎ>·<^ ^- Η	(3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-brcmo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2,4-diizopropylo-lH-pirolo-3- karboksy1owego
73	-Ch Η	(3-pirolidyn-1-ylopropy'o)ani d kwasu 5-(5-brcmo-2-okso-l,2 - dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2,4-diizopropylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
74		(pirydyn-4-ylometylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-l,2- dihydroindol-3-ylidenometylo i - 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
75		(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid kwasu 5-[6-{4-butylofenylo)-2- okso-l,2-dlhydroindol-3- ylidenometylc]-2,4-dimetylo-1H- pirolo-3-karboksylowego
77	ο ο ___Ν-7	(2-pirolidyn-l-ylc-etylo)amid kwasu 5-[6-(4-Etylcfenylo}-2- okso-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H- pirolo-3-karboksylowego

PL 211 834 B1

79	0 2^	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid kwasu 5-(6-(3- izopropylofenylo)-2-okso-l,2- dihydraindol-3-ylidenometylo]- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
80	o N—/ H	(2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2- dihydroindol-3-ylidenometylo)- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
81	0 N-7 OH H	kwas 3-(4-(2- dietyloaminoetylokarbamoilo)- 3,5-dimetylo-lH-pirolo-2- ylometylen]2-okso-2,3-dihydro- 1H-indolo-6-karboksylowy
82	o o N~> ° l\xX-N °	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid kwasu 5-(5-dimetylosulfamoil-2- okso-1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-2, 4-dimetylo-lH- pirolo-3-karboksylowego

PL 211 834 B1

83		(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid kwasu 5- [5-(3- chlorofenylosulfamoilo)-2-okso- 1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo]-2,4-dimetylo-lH- pirolo-3-karboksylowego
84	o o _N-7 V	(2-pirolidyn-l-ylo-etylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-[2-okso-5- (pirydyn-3-sulfamoilo)-1,2- dihydroindol-3-ylidenometylo]- lH-pirolo-3-karboksylowego
87	o o rK-	(2-dietyloaminoetylc)amid kwasu 5-(5-dimetylosulfamcil-2-okso- 1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo)-2,4-dimetylo-lH- pirolo-3-karboksylowego
88	% ° ,-G •·%Υ	(2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-[5-(3- chlorofenylosulfamoilo)-2-okso- 1,2-dihydroindol-3- ylidenometylo]-2,4-dimetylo-lH- pi roi o-3-karboksylowego

PL 211 834 B1

116	ο ο-/ Ο I η! ό ]ί TT >ο	ester etylowy kwasu ([4-metylo- 5-(4-metylo-5-metylosulfamoil- 2-okso-l,2-dihydro-indol-3- ylidenometylo)-lH-pirolo-3- karbonylo]-amino}-octowego
117	Ο \ η «Ό>» \	ester etylowy kwasu { [4-metylo- 5-{5-metylosulfamoil-2-okso- 1,2-dihydro-indol-3- ylidenomeuylo)-lH-pirolc-3- karbonylo]-amino}-octowego
118	• ο >fv N Ś_X~xJ/N θ ό Ττ>ο	kwas {[4-metylo-5-{5- metylosulfamoil-2-okso-l,2- dihydro-indol-3-ylidenometylo)- lH-piroio-3-karbonylo]-amino}- octowy

126	/—CH, 0, N n '—CH, Λ Fn^CH, ί I >0 H	(2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 2,4-dimetylo-5-[2- okso-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-1H- piroio-3-karboksylowego	381 [M+l]
127	rCH, N η>%_Λ-ν ’ CM> M-jj 0	(2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 5- (5-chloro-2-okso- 1,2-dihydro-indol-(3Z)- ylidenometylo)-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	415 [M+l]

PL 211 834 B1

128	___νΟ* Ε c Η j Η	(2-pirolidyn-l-yletylo)- amid kwasu 2,4-dimetylo-5- [2-okso-l,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	379 [M+l]
129	CHj LA >°	(2-pirolidyn-l-yletylo)- amid kwasu 5-[5-fluoro-2- okso-1,2-dihydro-indol- (3 Z)-ylidenometylo]-2,4- dlmetylo-1H-p:roi o-3- karboksylowego	397 [M+l]
130	wlp/) αγγΟΓ0' Η	(2-pirolidyn-l-yletylo)- amid kwasu 5-[ 5-chloro-2- okso-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-1H- piroio-3-karboksylowego	413 [M+l]
131	?Η’ η c Q r__,n-CH, p/y*ch· LAw >0	(2-dimetyloamir.oetylo) - amid kwasu 2,4-dimetylo-5- [2-okso-l,2-dihydro-indol- (3 Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	353 [M+l]

PL 211 834 B1

136	ΗΑ Λ*— Ο Κ CH> Τ Τ >ο Η	[3-(2-okso-tetrahydro- pirymidyn-l-ylo)-propylo]- amid kwasu 5-[5-bromo-2- okso-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	500 [M+l] 502 [M+l]
137	k-Λκ ε'ν^τΛ tCCMj τ τ ν° Χ^-Ν Η	[3-(2-okso-Letrahydro- pirymidyn-l-ylo)-propylo]- amid kwasu 5-[5-chloro-2- okso-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	454 [M-l]
138	i ^°Ί μλΑν <> JY Η wH chI Τ >=ο Η	[3-(2-okso-tetrahydro- pirymidyn-l-ylo)-propylo]- amid kwasu 5- [5-fluoro-2- okso-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	438 [M-l]

PL 211 834 B1

139	ί/ΐ H Α ν0*· i JZ >0 AF-fj	[3-(2-okso-tetrahydro- pirymidyn-l-ylo)-propylo]- amid kwasu 2,4-dimetylo-5- [2-okso-l,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-1H- pirolo-3-karboksylowego	422 [M+l]
141	0 d 0 N.~z M.C 'i. 1 V Z N /i h V>° M F	Trifluoro-octan-4-[2-({5- [5-bromo-2-okso-l,2- dihydro-indol-(3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karbonylo}-amino)-etylo]- 2-okso-piperazyn-l-iowy;	486 [M+l] 488 [M+l]

143	Anh o Λ-Λη 0	[2-(2-okso-imidazolidyn-1-	470 [M-l
	r'CK> 1 I ?=°	ylo)-etylo]-amid kwasu 5- [5-bromo-2-okso-l, 2- dihydroindol-(3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	472 [M-l

PL 211 834 B1

144	q ΗΥΛίί ° □yU! CH’ 11 B	[2-(2-okso-imidazolidyn-l- ylo)-etylo]-amid kwasu 5- (5-chloro-2-okso-l,2- dihydro-indol-(3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	428 [M+l]
145	Γ*~ NH o yJh 0 CH· ιχ^0	[2-(2-okso-imidazolidyn-l- ylo!-etylo]-amid kwasu 5- [5-fluoro-2-okso-l, 2- dihydro-indol-(3Z) - ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	412 [M+l]
146	<νη 0 N-Y HJ-p ° r^r-Λ H CHl fj>°	[2-(2-okso-imidazolidyn-l- ylo)-etylo]-amid kwasu 2,4-dimetylo-5-[2-okso- 1,2-dihydro-indol-(3 Z)- ylidenometylo]-lH-pirol 3- karboksylowego	392 [M-l]
148	ΒΛ £ H *+\X ΤΧΧ .H	ester etylowy kwasu {4-[2- ({5-[5-bromo-2-okso-i,2- dihydro-indol-(3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karbonylo}amino)-etylo]- piperazyn-1-ylo}-octowego	558 [M+l] 560 [M+T

PL 211 834 B1

149	Λ Γ'' Ν'Ίτ-Ο HC <1 Γ η α ν CH, Ο> Η	ester etylowy kwasu {4-12- (]5-[5-chloro-2-okso-l,2- dihydro-indol-<3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- ka rbonylo}amino)-etylo]- piperazyn-l-ylo}-octowego	514 [M+l]
150	H,C KC 1 —'Ν·> ° ΑΛν Η H	ester etylowy kwasu 4-[2- ({5-[ 5-f1uoro-2-okso-l,2- dihydro-indol-(3Z) - ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karbonylo]-amino)-etylol- piperazyn-l-ylo}-octowego	498 [M+l]
154	W CH’ I Γ >0	[3-(2-okso-azepan-l-ylo)- propylo]-amid kwasu 5-[5- bromo-2-okso-l,2-ćihydro- indol-(3 Z)-ylidenometylo]- 2,4-dimetylo-lH-pirclo-3- karboksylowego	511 [M-l] 513 [M-l]
155	D \V. (i X>0	[3-(2-okso-azepan-l-ylo)- propylo]-amid kwasu 5—[5— chloro-2-okso-l,2-dihydro- indol-(3Z)-ylidenometylo]- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	469 [M+l]

PL 211 834 B1

156	/X c lT N' CH, I r bo H	[3-(2-okso-azepan-l-ylo)- propylo]-amid kwasu 5-[5- fluoro-2-okso-l,2-dihydro- indol- (3Z)-ylidenometylo]- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	453 [M+l]
157		[3-(2-okso-azepan-l-ylo)- propylo]-amid kwasu 2,4- dimetylo-5-[2-okso-l, 2- dihydro-indol-(3Z) - ylidenometylo]-lH-pirolo- 3-karboksylowego	435 LM+1J
160	0 Ć5 0 N^/ Η5-Λκ~ 0 w°	Trifluoro-octan-4-[2-({5- [5-fluoro-2-okso-l,2- dihydro-indol-(3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karbonylo}-amino)-etyle]- 2-okso-piperazyn-l-iowy;	426 [M+l]
161	0 d □ H'VXr 0 CX,fo >Λ”	Trifluoro-octan-4-[2- ({2,4-dimetylo-5-[2-okso- 1,2-dihydro-indol-{3 Z) — ylidenometylo]-IH-pirolo- 3-karbonylo}-amino)- etyl.o] -2-okso-piperazyn-l- iowy;	408 [M+l]

PL 211 834 B1

13 4	CK, O ζ'-Ν-'γ0 // H iA^h^Ch, M (f Zl^“°	(l-pirolidyn-l-ylo-2-on;- amid kwasu 5-[5-chloro-2- okso-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego	480	[M+l]
185	o A H,= ,,.,-+- „ N Jj Λ H	Trifluorooctan 4-[2-({5-	440	[M-l]
	fi N C M. C < H XJ1/=o CF,CO;H ~ H	[5-chlorc-2-okso-l,2- dihydro-indol- (3Z)- ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karbonylo}amino)-etylo]-2- okso-piperazyn-l-iowy

193	H (23=° H	(2-etyloaminoetylo)-amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-l,2-dihydro- indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4- dimetylo-lH-pirolo-3- karboksylowego
195	H,C 0 FY^PoK CHl	(2-dietylo-N-oksoaminoeLylo)- amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso- 1,2-dihydro-indol-(3Z)- ylidenometylo]-2,4-dimetylo- 2,4-dimetylo-lH-pirolo-3- karbc ksylowego

PL 211 834 B1

Numery związków odpowiadają numerom przykładów w części ich dotyczącej. Oznacza to, że np. synteza związku 37 w tablicy 1 jest opisana w przykładzie 37. Związki przedstawione w tablicy 1 są związkami przykładowymi.

Najszersza definicja związków według wynalazku została podana w części opisu dotyczącej istoty wynalazku, zaś poniżej przedstawiono związki o wzorze (I) które są korzystne.

3 4

1. Korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R¹, R³ i R⁴ oznaczają atom wodoru.

2 4

2. Inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R¹, R² i R⁴ oznaczają atom wodoru.

2 3

3. Inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R¹, R² i R³ oznaczają atom wodoru.

3 4

4. Inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R², R³ i R⁴ oznaczają atom wodoru.

5. Inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R¹, R², R³ i R⁴ oznaczają atom wodoru.

6. Jeszcze inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R⁶ stanowi

-COR¹⁰, w którym R¹⁰ stanowi -NR¹¹ (CH₂)_nR¹² w którym:

R¹¹ oznacza atom wodoru;

n jest korzystnie 2 lub 3; i

R¹² stanowi -NR¹³R¹⁴, w którym R¹³ i R¹⁴ stanowią niezależnie (C₁-C₄) alkil, lub R¹³ i R¹⁴ łączą się tworząc grupę wybraną spośród takich jak -(CH2)4-, -(CH2)5-, lub -(CH2)2N (CH3) (CH2)2-, korzystnie 13 14

R¹³ i R¹⁴ niezależnie oznaczają atom wodoru, metyl, etyl lub łączą się z wytworzeniem pirolidyn-1-ylu, piperazyn-1-ylu lub 4-metylopiperazyn-1-ylu.

Korzystniej, R⁶ w p.6. powyżej stanowi N-(2-dimetyloaminoetylo-)aminokarbonyl, N-(2-etyloaminoetylo)-N-metyloaminokarbonyl, N-(3-dimetyloaminopropylo)-aminokarbonyl, N-(2-dietyloaminoetylo)aminokarbonyl, N-(3-etyloaminopropylo)aminokarbonyl, N-(3-dietyloaminopropylo)aminokarbonyl, 3-pirolidyn-1-ylo-propylo-aminokarbonyl, 2-pirolidyn-1-yletyloaminokarbonyl, 2-(4-metylopiperazyn-1-ylo)etyloaminokarbonyl, 2-(4-metylopiperazyn-1-ylo)propyloaminokarbonyl, 2-(3,5-dimetylopiperazyn-1-y)etyloaminokarbonyl lub 2-(3,5-dimetylopiperazyn-1-y)propyloaminokarbonyl, bardziej korzystnie N-(2-dietyloaminoetylo)aminokarbonyl lub N-(2-etyloaminoetylo)aminokarbonyl.

(7) Jeszcze inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R⁶ stanowi

10 13 14 13 14

-COR¹⁰, w którym R¹⁰ stanowi -NR¹³R¹⁴, w którym R¹³ oznacza atom wodoru i R¹⁴ oznacza (C₁-C₄)alkil, korzystnie metyl, etyl, propyl lub butyl. Jeszcze korzystniej w obrębie tej grupy (7), R⁶ stanowi 2-etoksykarbonylometyloaminokarbonyl, karboksymetyloaminokarbonyl, 3-hydroksypropyloaminokarbonyl, 2-hydroksyetyloaminokarbonyl, 4-hydroksyfenyloetyloaminokarbonyl, 3-imidazol-1-ylopropyloaminokarbonyl, pirydyn-4-ylometyloaminokarbonyl, 2-pirydyn-2-yloetyloaminokarbonyl, lub 2-imidazol-1-yloetyloaminokarbonyl.

(8) Jeszcze inną korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowią związki, w których R⁶ stanowi -COR¹⁰, w którym R¹⁰ stanowi -NR¹¹ (CH₂)_nR¹² w którym:

R¹¹ oznacza atom wodoru;

n jest korzystnie 2 lub 3; i 12 13 14 13 14

R¹² stanowi -NR¹³R¹⁴, w którym R¹³ i R¹⁴ razem łączą się z wytworzeniem heterocyklu, korzystnie 5, 6 lub 7 członowego heterocyklu zawierającego grupę karbonylową i 1 lub 2 atomy azotu.

Korzystnie, R⁶ stanowi 2-(3-etoksykarbonylometylopiperazyn-1-ylo)etyloaminokarbonyl, 2-(3-oksopiperazyn-1-ylo)etyloaminokarbonyl, 2-(imidazolidyn-1-ylo-2-on)etyloaminokarbonyl, 2-(tetrahydropirymidyn-1-ylo-2-on)etyloaminokarbonyl, 2-(2-oksopirolidyn-1-ylo)-etyloaminokarbonyl, 3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)-propyloaminokarbonyl, 3-(3-etoksykarbonylometylopiperazyn-1-ylo)-propyloaminokarbonyl, 3-(3-oksopiperazyn-1-ylo)propyloaminokarbonyl, 3-(imidazolidyn-1-ylo-2-on)propyloaminokarbonyl, 3-(tetrahydropirymidyn-1-ylo-2-on)-propyloaminokarbonyl, 3-(2-oksopirolidyn-1-ylo)propyloaminokarbonyl, 2-(2-oksohomopiperydyn-1-ylo)etyloaminokarbonyl lub 3-(2-oksohomopiperydyn-1-ylo) propyloaminokarbonyl.

(9) W powyższych korzystnych grupach (6)-(8), gdy R⁶ stanowi -C(O)R¹⁰, bardziej korzystną grupę związków stanowi grupa, w której:

₅

R⁵ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru i (C1-C4)alkil, korzystnie wodór, metyl, etyl, izopropyl, tert-butyl, izobutyl lub n-butyl, korzystniej wodór lub metyl; i

R⁷ jest wybrane z grupy obejmującej (C1-C4)alkil i fenyl, korzystnie metyl, etyl, izopropyl, n-, izo-, lub tert-butyl, oraz fenyl, bardziej korzystnie metyl i fenyl.

PL 211 834 B1 (10) W obrębie powyższych korzystnych i bardziej korzystnych grup (6)-(8), jeszcze bardziej korzystną grupę związków stanowi grupa, w której:

R¹ oznacza atom wodoru, (C1-C4)alkil, i -C(O)NR⁸R⁹, korzystnie wodór, 3,4-dimetoksyfenyloaminokarbonyl, 4-metoksy-3-chlorofenyloaminokarbonyl, bardziej korzystnie wodór lub metyl, najkorzystniej wodór;

13 14

R² stanowi grupa obejmująca wodór, atom fluorowca, fenyl lub -S(O)2NR¹³R¹⁴, w którym R 14 2 oznacza atom wodoru i R¹⁴ oznacza atom wodoru, fenyl lub (C1-C4)alkil, korzystnie R² oznacza atom wodoru, chloro, bromo, fluoro, fenyl, dimetyloaminosulfonyl, 3-chlorofenyloaminosulfonyl, aminosulfonyl, metyloaminosulfonyl, fenyloaminosulfonyl, pirydyn-3-ylo-aminosulfonyl, dimetyloaminosulfonyl, izopropyloaminosulfonyl, korzystniej wodór, fluoro, lub bromo;

15

R³ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, -C(O)R¹⁵, pirydynyl, fenyl, korzystnie fenyl ewentualnie podstawiony przez jeden lub dwa podstawniki wybrane z grupy obejmującej (C1-C4)alkil i atom fluorowca, korzystnie wodór, metoksyl, karboksyl, fenyl, pirydyn-3-yl, 3,4-dichlorofenyl, 2-metoksy-5-izopropylfenyl, 4-n-butylofenyl, 3-izopropylofenyl, najkorzystniej wodór lub fenyl; i

R⁴ oznacza atom wodoru.

(11) Inną bardziej korzystną grupę związków o wzorze (I) stanowi grupa, w której:

R¹ oznacza atom wodoru, (C1-C4)alkil, lub -C(O)NR⁸R⁹, korzystnie wodór, 3,4-dimetoksyfenyloaminokarbonyl, 4-metoksy-3-chlorofenyloaminokarbonyl, bardziej korzystnie wodór lub metyl, najkorzystniej wodór;

13 14 13

R² oznacza, wodór, atom fluorowca, fenyl lub -S(O)2NR¹³R¹⁴, w którym R¹³ oznacza atom wodo14 2 ru i R¹⁴ oznacza atom wodoru, fenyl lub (C1-C4)alkil, korzystnie R² oznacza atom wodoru, chloro, bromo, fluoro, fenyl, dimetyloaminosulfonyl, 3-chlorofenyloaminosulfonyl, aminosulfonyl, metyloaminosulfonyl, fenyloaminosulfonyl, pirydyn-3-ylo-aminosulfonyl, dimetyloaminosulfonyl, izopropyloaminosulfonyl, korzystniej wodór, fluoro, lub bromo;

15

R³ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, -C(O)R¹⁵, i fenyl, korzystnie fenyl ewentualnie podstawiony przez jeden lub dwa podstawniki wybrane z grupy obejmującej (C1-C4)alkil i atom fluorowca, korzystniej wodór, fenyl, pirydyn-3-yl, 3,4-dichlorofenyl, 4-n-butylfenyl, 3-izopropylfenyl, najkorzystniej wodór i fenyl; i 14

R¹⁴ oznacza atom wodoru.

W obrębie powyższej korzystnej grupy (11) bardziej korzystną grupą związków jest grupa, w której:

R⁶ stanowi -C(O)R¹⁰, przy czym R¹⁰ ma znaczenie zdefiniowane w części dotyczącej istoty wyna11 12 13 14 lazku, korzystnie -NR¹¹(CH2)nR¹² lub -NR¹³R¹⁴ jak zdefiniowano w części dotyczącej istoty wynalazku.

₅

R⁵ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru i (C1-C4)alkil, korzystnie wodór, metyl, etyl, izopropyl, tert-butyl, izobutyl, lub n-butyl, korzystniej wodór lub metyl; i

R⁷ jest wybrane z grupy obejmującej alkil i fenyl, korzystniej metyl, etyl, izopropyl, n-, izo lub tert-butyl, fenyl, bardziej korzystnie metyl, lub fenyl.

(13) Podobnie, innym korzystnym przykładem wykonania wynalazku jest związek, w którym:

R¹ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, (C1-C4)alkil, i -C(O)NR⁸R⁹;

13 14

R² jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, atom fluorowca, fenyl i -S(O)2NR¹³R¹⁴;

15

R³ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, (C1-C4)alkil, fenyl, pirydynyl, i -C(O)R¹⁵;

R⁴ oznacza atom wodoru;

₅

R⁵ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru i (C1-C4)alkil;

R⁶ stanowi -C(O)R¹⁰;

R⁷ jest wybrane z grupy obejmującej (C1-C4)alkil i fenyl;

11 12 11

R stanowi -NR (CH₂)_nR , w którym n jest równe 1, 2 lub 3, R oznacza atom wodoru, 12 15 i R¹² jest wybrane z grupy obejmującej hydroksyl, -C(O)R¹⁵, heteroaryl zawierający w pierścieniu 5-6

14 atomów, w tym jeden atom N, a pozostałe są atomami C, i -NR¹³R¹⁴.

Innym kolejnym korzystnym przykładem wykonania wynalazku jest związek o budowie opisanej

14 w paragrafie bezpośrednio powyżej, w którym R¹³ i R¹⁴ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, (C1-C4)alkil, pirydynyl, i połączone -(CH2)4-, -(CH2)5-, lub -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

Innym kolejnym korzystnym przykładem wykonania wynalazku jest związek, w którym:

ft Q ft Q

R¹ stanowi -C(O)NR⁸R⁹, w którym R⁸ oznacza atom wodoru, a R⁹ oznacza fenyl, ewentualnie podstawiony przez jeden lub dwa atomy fluorowca;

13 14 R² jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, atom fluorowca, fenyl i -S(O)2NR¹³R¹⁴;

15 R³ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, fenyl, pirydynyl, i -C(O)R¹⁵;

PL 211 834 B1

R⁴ oznacza atom wodoru;

₅

R⁵ jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru i (C1-C4)alkil;

R⁶ stanowi -C(O)R¹⁰;

R⁷ jest wybrane z grupy obejmującej (C1-C4)alkil i fenyl;

Innym kolejnym korzystnym przykładem wykonania wynalazku jest związek o budowie opisanej 13 14 w paragrafie bezpośrednio powyżej, w którym R¹³ i R¹⁴ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, (C1-C4)alkil, i połączone, -(CH2)4-, -(CH2)5-, lub -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

Kinazy białkowe, których aktywność katalityczna podlega modulacji przez związki według wynalazku, obejmują białkowe kinazy tyrozynowe, wśród których wyróżnia się dwa typy: receptorowe kinazy tyrozynowe (RTK) i komórkowe kinazy tyrozynowe (CTK), oraz kinazy serynowe-treoninowe (STK). Inicjacja transdukcji sygnału, w którym pośredniczy RTK, zachodzi przez jej zewnątrzkomórkowe oddziaływanie ze specyficznym czynnikiem wzrostowym (ligand), po którym następuje dimeryzacja receptora, przejściowa stymulacja wewnętrznej aktywności białkowej kinazy tyrozynowej i fosforylacja. Dzięki temu powstają miejsca wiązania dla wewnątrzkomórkowych cząsteczek transdukcji sygnałów i dochodzi do tworzenia kompleksów z szeregiem cytoplazmatycznych cząsteczek sygnałowych, które ułatwiają właściwe odpowiedzi komórkowe (np. podział komórek, działania metaboliczne na zewnątrzkomórkowe otoczenie, itp.). Patrz Schlessinger i Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.

Wykazano, że miejsca fosforylacji tyrozyny na receptorach czynników wzrostowych działają, jako miejsca wiązania o wysokim powinowactwie dla domen SH2 (homologia src) cząsteczek sygnałowych. Fantl i in., 1992, Cell 69:413-423, Songyang i in., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785, Songyang i in., 1993, Cell 72:767-778 oraz Koch i in., 1991, Science 252:668-678. Zidentyfikowano szereg wewnątrzkomórkowych substratów białkowych, które przyłączają się do RTKs. Można je podzielić na dwie zasadnicze grupy: (1) substraty posiadające domenę katalityczną i (2) substraty nieposiadające takiej domeny, ale które służą jako elementy pośredniczące i przyłączają się do cząsteczek aktywnych katalitycznie. Songyang i in., 1993, Celi 72:767-778. Specyficzność oddziaływań między receptorami a domenami SH2 ich substratów determinują reszty aminokwasowe, bezpośrednio otaczające ufosforylowane reszty tyrozynowe. Różnice w powinowactwie wiązania między domenami SH2 a resztami aminokwasowymi, otaczającymi reszty fosfotyrozynowe poszczególnych receptorów, są zgodne z oberwowanymi różnicami ich profilów fosforylacji substratu. Songyang i in., 1993, Celi 72:767-778. Obserwacje te sugerują, że działanie każdej RTK jest zdeterminowane nie tylko przez sposób ich ekspresji i dostępność ligandu, ale również przez układ schodzących szlaków transdukcji sygnałów, które ulegają aktywacji przez poszczególne receptory. Stąd też fosforylacja stanowi ważny etap regulacyjny, który determinuje selektywność szlaków sygnałowych, uruchamianych zarówno przez specyficzne receptory czynników wzrostowych, jak i przez receptory czynników różnicowania.

STK, będące zasadniczo białkami cytozolowymi, wpływają na wewnątrzkomórkowe procesy biochemiczne komórek, często w odpowiedzi na bodziec PTK. Wskazywano na udział STK w procesach sygnałowych, które zapoczątkowują syntezę DNA i następnie mitozę, prowadząc do proliferacji komórek.

Stąd też transdukcja sygnału PK daje w wyniku, pośród innych odpowiedzi, proliferację komórek, ich różnicowanie, wzrost i metabolizm. Nieprawidłowa proliferacja komórek może prowadzić do wielu zaburzeń i chorób, obejmujących rozwój nowotworów, takich jak rak, mięsak, glejak i naczyniak krwionośny, zaburzenia takie jak białaczka, łuszczyca, stwardnienie tętnic, zapalenie stawów i retynopatia cukrzycowa oraz inne zaburzenia, związane z niekontrolowanym rozwojem naczyń i/lub ich powstawaniem.

Dokładne zrozumienie mechanizmu hamowania PK przez związki według wynalazku nie jest wymagane do praktycznego wykorzystania niniejszego wynalazku. Nie wiążąc się z żadnym szczególnym mechanizmem czy teorią, uważa się, że związki oddziaływują z aminokwasami w katalitycznym regionie kinaz białkowych. PK posiadają zazwyczaj dwupłatową strukturę, w której ATP wydaje się wiązać w szczelinie między dwoma płatami w regionie, w którym sekwencja aminokwasów kinaz białkowych jest konserwatywna. Uważa się, że wiązanie inhibitorów PK zachodzi sposobem niekowalencyjnym, takim jak wiązanie wodorowe, siły van der Waalsa czy oddziaływania jonowe, i że wiążą się one w tym samym regionie ogólnym, w którym zachodzi wiązanie wyżej wymienionego ATP z PK. Dokładniej, uważa się, że składnik 2-indolinonowy związków według wynalazku wiąże się ogólnie z miejscem zajmowanym zazwyczaj przez pierścień adeninowy ATP. Specyficzność poszczególnych cząsteczek dla poszczególnych PK może wtedy być wynikiem dodatkowych oddziaływań między różnymi

PL 211 834 B1 podstawnikami rdzenia 2-indolinonowego a domenami aminokwasowymi, specyficznymi dla poszczególnych PK. Stąd też różne podstawniki indolinonu mogą przyczyniać się do preferencyjnego wiązania do poszczególnych PK. Możliwość wybrania związków aktywnych dla różnych miejsc wiązania ATP (lub innego nukleotydu) czyni związki według wynalazku użytecznymi dla celowego hamowania dowolnego białka, posiadającego takie miejsce wiązania. Ujawnione tutaj związki mają, więc zastosowanie zarówno w testach in vitro na takie białka, jak również w wykazywaniu działań leczniczych in vivo dzięki oddziaływaniu z takimi białkami.

Ponadto związki według niniejszego wynalazku umożliwiają podejście terapeutyczne do leczenia wielu rodzajów guzów litych, obejmujących, ale nieograniczonych do: raka, mięsaków, włączając mięsaka Kaposia, erytroblastomy, glejaka, oponiaka, gwiaździaka, czerniaka i mięśniaka zarodkowego. Rozważa się także leczenie lub zapobieganie rakowym guzom nie litym, takim jak białaczka, przy pomocy wynalazku. Wskazania mogą obejmować do: raka mózgu, raka pęcherza moczowego, raka jajników, raka żołądka, raka trzustki, raka okrężnicy, raka krwi, raka płuc i raka kości.

Dalszymi nieograniczającymi przykładami rodzajów zaburzeń, związanych z nieprawidłową aktywnością PK, w których zapobieganiu, leczeniu lub badaniu związki tutaj opisane mogą być użyteczne, są komórkowe zaburzenia proliferacyjne, zaburzenia zwłóknieniowe i zaburzenia metaboliczne.

Komórkowe zaburzenia proliferacyjne, którym można zapobiegać, je leczyć lub dalej badać dzięki niniejszemu wynalazkowi, włączają raka, zaburzenia proliferacyjne naczyń krwionośnych oraz zaburzenia proliferacyjne komórek mezangialnych.

Zaburzenia proliferacyjne naczyń krwionośnych dotyczą zaburzeń związanych z nieprawidłowym powstawaniem (tworzenie naczyń krwionośnych) i rozwojem naczyń (rozprzestrzenianie naczyń krwionośnych). O ile powstawanie i rozwój naczyń odgrywa ważną rolę w różnych normalnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, tworzenie ciałka żółtego, gojenie ran i regeneracja narządów, również w rozwoju raka ich rola jest zasadnicza, ponieważ dają one w wyniku tworzenie nowych kapilar niezbędnych do utrzymania guza przy życiu. Innymi przykładami proliferacyjnych zaburzeń naczyń krwionośnych są zapalenie stawów, w których nowe kapilarne naczynia krwionośne dokonują inwazji stawu i niszczą chrząstkę oraz choroby oczu, takie jak retynopatia cukrzycowa, w których nowe kapilary w siatkówce dokonują inwazji ciałka szklistego, krwawią i powodują ślepotę.

Zidentyfikowano dwie strukturalnie spokrewnione TRK, które wiążą VEGF z wysokim powinowactwem: podobny do fms receptor tyrozynowy 1 (fit-1) (Shibuya i in., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries i in., 1992, Science, 255:989-991) oraz receptor KDR/FLK-1, znany również jako VEGF-R2. Doniesiono, że czynnik wzrostowy śródbłonka naczyniowego (Vascular endothelial growth factor, VEGF) jest specyficznym mitogenem komórek śródbłonkowych, który wykazuje aktywność pobudzania wzrostu komórek śródbłonka in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman i in., 1990, J. Biol. Chem., 2 65:194 61-19566. Informacje w Zgłoszeniach Patentowych USA o numerach seryjnych 08/193,829, 08/038,596 i 07/975,750, silnie sugerują, że VEGF jest odpowiedzialny nie tylko za proliferację komórek śródbłonka, ale stanowi również zasadniczy regulator normalnego i patologicznego rozwoju naczyń. Patrz ogólnie: Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck i in., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.

Normalne powstawanie i rozwój naczyń odgrywają ważną rolę w różnorodnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, gojenie ran, regeneracja narządów oraz żeńskie procesy reprodukcyjne, takie jak rozwój pęcherzyka w ciałku żółtym podczas owulacji i wzrost łożyska po ciąży. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16) :10931-34. Niekontrolowane powstawanie i/lub rozwój naczyń wiążą się z chorobami takimi jak cukrzyca, jak również złośliwymi guzami litymi, których wzrost uwarunkowany jest unaczynieniem. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10):699-702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner i in., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.

Przypuszczalna rola VEGF w proliferacji i migracji komórek śródbłonka podczas rozwoju naczyń i ich powstawania wskazuje na istotną rolę receptora KDR/FLK-1 w tych procesach. Zarówno choroby takie jak cukrzyca (Folkman, 198, w XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (wydawcy Verstraeta i in.), str. 583-596, Leuven University Press, Leuven) i zapalenie stawów, jak również wzrost guzów złośliwych mogą być wynikiem niekontrolowanego rozwoju naczyń. Patrz np. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Receptory wiążące specyficznie VEGF są istotnym i potężnym celem leczniczym dla regulacji i modulacji powstawania i/lub rozwoju naczyń oraz różnorodnych ciężkich chorób, w których zaangażowany jest nieprawidłowy wzrost komórkowy spowodowany takimi procesami. Plowman i in., 1994, DN&P, 7(6):334-339. W szczególności wysoce specyficzna rola receptora

PL 211 834 B1

KDR/FLK-1 w nowounaczynieniu czyni go wybranym celem dla podejścia terapeutycznego w leczeniu raka i innych chorób, związanych z niekontrolowanym tworzeniem naczyń krwionośnych.

Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza związki zdolne do regulowania i/lub modulowania transdukcji sygnałów kinazy tyrozynowej, włączając transdukcję sygnałów receptora KDR/FLK-1, w celu hamowania lub pobudzania rozwoju naczyń i/lub ich powstawania, to jest, związki, które hamują, zapobiegają lub przeszkadzają w transdukcji sygnału przez KDR/FLK-1 po jego aktywacji przez ligandy takie jak VEGF. Chociaż uważa się, że związki według niniejszego wynalazku działają na receptor lub inny składnik szlaku transdukcji sygnału kinazy tyrozynowej, mogą one także działać bezpośrednio na komórki guza, który powstał dzięki niekontrolowanemu rozwojowi naczyń.

Mimo że nazewnictwo rodzajowego receptora „flk-1” człowieka i myszy różnią się, są one pod wieloma względami wymienne. Receptor mysi, Flk-1 i jego ludzki odpowiednik.

KDR, wykazują homologię sekwencji domeny wewnątrzkomórkowej w 93,4%. Podobnie, FLK-1 myszy wiąże VEGF człowieka z tym samym powinowactwem, jakie wykazuje VEGF myszy i zgodnie z tym ulega aktywacji przez ligandy pochodzące z innych gatunków. Millauer i in., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn i in., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. Po ekspresji FLK-1 w komórkach 293 (fibroblasty embrionalnej nerki człowieka), łączy się ona również z substratami RTK człowieka i fosforyluje tyrozynę (np., PLC-y lub p85).

Dlatego też modele opierające się na receptorze FLK-1 można bezpośrednio odnosić do zrozumienia receptora KDR. Na przykład wyniki zastosowania receptora FLK-1 myszy do identyfikacji związków regulujących szlak transdukcji sygnału u myszy można bezpośrednio odnosić do identyfikacji związków, które można zastosować do regulacji szlaku transdukcji sygnału u człowieka, czyli związków, które regulują aktywność związaną z receptorem KDR. Stąd też związki chemiczne, zidentyfikowane, jako inhibitory KDR/FLK-1 in vitro, można potwierdzać w odpowiednich modelach in vivo. Wykazano, że zarówno myszy jak i szczury stanowią modele zwierzęce in vivo o wyśmienitej wartości dla badania potencjału klinicznego środków działających na szlak transdukcji sygnałów indukowanych przez KDR/FLK-1.

Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza związki które regulują, modulują i/lub hamują powstawanie i/lub rozwój naczyń przez wpływ na aktywność enzymatyczną receptora KDR/FLK-1 i przez przeszkadzanie w transdukcji sygnałów za pośrednictwem KDR/FLK-1. Stąd też niniejszy wynalazek dostarcza podejście terapeutyczne w leczeniu wielu rodzajów guzów litych, obejmujących, ale nieograniczonych do guzów takich jak: glejak, czerniak i mięsak Kaposia oraz rak jajników, płuc, sutka, prostaty, trzustki, okrężnicy i naskórka. Ponadto dane sugerują, że podawanie związków hamujących szlak transdukcji sygnału za pośrednictwem KDR/Flk-1 można również stosować do leczenia naczyniaka krwionośnego, nawrotu zwężenia i retynopatii cukrzycowej.

Ponadto wynalazek związany jest z hamowaniem powstawania i rozwoju naczyń w innych szlakach, w których pośredniczą receptory, włączając szlak obejmujący receptor flt-1.

Transdukcja sygnału za pośrednictwem receptorowej kinazy tyrozynowej zapoczątkowane jest przez zewnątrzkomórkowe oddziaływanie ze specyficznym czynnikiem wzrostowym (ligand), po którym następuje dimeryzacja receptora, przejściowa stymulacja aktywności wewnętrznej białkowej kinazy tyrozynowej i autofosforylacja. Przy tym powstają miejsca wiązania dla wewnątrzkomórkowych cząsteczek transdukcji sygnału, co prowadzi do tworzenia kompleksów z szeregiem cytoplazmatycznych cząsteczek sygnałowych i ułatwia właściwą odpowiedź komórkową, np. podział komórek i działania metaboliczne na zewnątrzkomórkowe otoczenie. Patrz Schlessinger i Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.

Ścisła homologia wewnątrzkomórkowych regionów KDR/FLK-1 i receptora PDGF-β (50,3% homologii) i/lub spokrewnionego receptora flt-1 wskazuje na indukcję nakładających się szlaków transdukcji sygnału. Wykazano na przykład dla receptora PDGF-β, że do regionów związanych z różnymi miejscami autofosforylacji wiążą się: członkowie rodziny src (Twamley i in., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), kinaza fosfatydyloinozytolu-3' (Hu i in., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipaza cy (Kashishian & Cooper, 1993 Mol. Cell. Biol., 4:49-51), białko aktywujące GTPazę ras, (Kashishian i in., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas i in., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson i in., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726) oraz cząsteczki pośredniczące She i Nek (Nishimura i in., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896). Patrz Claesson-Welsh, 1994 Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Dlatego też wydaje się prawdopodobne, że aktywowane przez

KDR/FLK-1 szlaki transdukcji sygnałów obejmują szlak ras (Rozakis i in., 1992, Nature, 360:689-692), kinazę PI-3' oraz szlaki, w których pośredniczą src i plcy. Każdy z tych szlaków może odgrywać krytyczną rolę w działaniu KDR/FLK-1 w komórkach śródbłonka, które prowadzi do powstawania i/lub

PL 211 834 B1 rozwoju naczyń. W konsekwencji, jeszcze inny aspekt wynalazku związany jest z zastosowaniem opisanych tutaj związków organicznych do modulacji rozwoju naczyń i ich powstawania, jako że takie procesy podlegają kontroli tych szlaków.

Wskazuje się również, że zaburzenia związane z kurczeniem się, zwężaniem lub zamykaniem naczyń krwionośnych, takie jak nawrót zwężenia, mogą być leczone lub można im zapobiegać sposobami według wynalazku.

Zaburzenia zwłóknieniowe odnoszą się do nieprawidłowego tworzenia substancji międzykomórkowej. Przykładami zaburzeń zwłóknieniowych są marskość wątroby i zaburzenia proliferacyjne komórek mezangialnych. Marskość wątroby charakteryzuje się wzrostem składników substancji międzykomórkowej, co powoduje tworzenie blizny wątrobowej. Powodem wzrostu składników substancji międzykomórkowej, prowadzącego do tworzenia blizny wątrobowej, mogą być także infekcje wirusowe, takie jak zapalenie wątroby. Wydaje się, że główną rolę w marskości wątroby odgrywają lipocyty. Inne wskazane zaburzenia zwłóknieniowe obejmują miażdżycę tętnic.

Zaburzenia proliferacyjne komórek mezangialnych dotyczą zaburzeń spowodowanych przez nieprawidłową proliferację komórek mezangialnych. Mezangialne zaburzenia proliferacyjne obejmują różne choroby nerek człowieka, zarówno takie jak zapalenie kłębuszków nerkowych, nefropatię cukrzycową i złośliwą marskość nerki, jak i zaburzenia takie jak zespół zakrzepowej choroby włośniczek, odrzucenie przeszczepu i stany patologiczne kłębuszków nerkowych. Wskazano na udział RTK PDGFR w utrzymaniu proliferacji komórek mezangialnych. Floege i in., 1993, Kidney International 43:473-543.

Wiele rodzajów raka to zaburzenia proliferacyjne komórek i jak wspomniano wcześniej, kinazy białkowe kojarzy się z zaburzeniami proliferacyjnymi komórek. Stąd też nie jest to niespodzianką, że kinazy białkowe, takie jak na przykład członkowie rodziny RTK, wiąże się z rozwojem raka. Niektóre z tych receptorów, jak EGFR (Tuzi i in., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp i in., 1992, APMIS 100:713-719), HER2/neu (Slamon i in., 1989, Science 244:707-712) i PDGF-R (Kumabe i in., 1992, Oncogene, 7:627-633) ulegają nadmiernej ekspresji w wielu guzach i/lub podlegają trwałej aktywacji przez pętle autowydzielnicze. Istotnie, dla najpowszechniejszych i poważnych raków wykazano nadmierną ekspresję receptorów (Akbasak i Suner-Akbasak i in., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson i in., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Korc i in., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) i pętle autowydzielnicze (Lee i Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc i in., supra, Akbasak i Suner-Akbasak i in., supra). EGFR kojarzono na przykład z rakiem płaskokomórkowym, gwiaździakiem, glejakiem, rakiem głowy i szyi, rakiem płuc i pęcherza moczowego. HER2 powiązano z rakiem sutka, jajników, żołądka, płuc, trzustki i pęcherza moczowego. PDGFR powiązano z glejakiem i czerniakiem, jak również z rakiem płuc, jajników i prostaty. Również RTK c-met powiązano z tworzeniem guzów złośliwych. Na przykład c-met powiązano między innymi z rakiem jelita grubego, tarczycy, trzustki, żołądka oraz rakiem wątrobokomórkowym i chłoniakami. Ponadto c-met powiązano z białaczką. Nadmierną ekspresję genu c-met wykryto również u pacjentów cierpiących na chorobę Hodgkina i chorobę Burkitta.

IGF-IR, poza implikacją we wsparciu żywieniowym i w cukrzycy typu II, powiązano także z szeregiem rodzajów raka. Wskazano na przykład, że IGF-I jest czynnikiem autowydzielniczym, stymulującym wzrost dla szeregu rodzajów guzów, np. raka komórek sutka człowieka (Arteaga i in., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) i komórek guza płuc (Macauley i in., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Ponadto IGF-I, który jest nierozdzielnie związany z normalnym wzrostem i różnicowaniem układu nerwowego, wydaje się również być autowydzielniczym stymulatorem glejaków u człowieka. SandbergNordqvist i in., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Znaczenie IGF-IR i jego ligandów w proliferacji komórek potwierdza ponadto fakt, że IGF-I stymuluje wzrost wielu rodzajów komórek w hodowlach (fibroblasty, komórki nabłonkowe, komórki mięśni gładkich, limfocyty T, komórki podobne do szpikowych, chondrocyty i osteoblasty (komórki macierzyste szpiku kości)). Goldring i Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. Baserga i Coppola sugerują, że IGF-IR odgrywa centralną rolę w mechanizmie transformacji i jako taki mógłby być preferowanym celem dla interwencji terapeutycznych w szeregu złośliwych schorzeń człowieka. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola i in., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595.

Na udział STK wskazywano w wielu rodzajach raka, włączając raka sutka (Cance, i in., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Powiązanie nieprawidłowej aktywności PK z chorobą nie ogranicza się do raka. RTK wiąże się na przykład z chorobami takimi jak: łuszczyca, cukrzyca, endometrioza, rozwój naczyń, rozwój płytki miażdżycowej, choroba Alzheimera, nawrót zwężenia, choroba von Hippel-Lindau, nadmierny rozrost

PL 211 834 B1 naskórka, choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego, starcze zwyrodnienie plamki żółtej i naczyniak krwionośny. Wskazywano na przykład na udział EGFR w gojeniu ran rogówkowych i skórnych. Wskazywano na defekty receptora insuliny i IGF-IR przy cukrzycy typu II. Pełniejszą korelację specyficznych RTK z wskazaniami terapeutycznymi znajduje się w Plowman i in., 1994, DN&P 7:334-339.

Jak wspomniano uprzednio, nie tylko RTK są związane ze szlakiem transdukcji sygnałów proliferacyjnych i metabolicznych, ale również CTK obejmujące, ale nie ograniczone się do: src, abl, fps, yes, fyn, lyn, Ick, blk, hck, fgr i yrk (praca przeglądowa Bolen i in., 1992, FASEB J., 6:3403-3409). Stąd też można oczekiwać i już wykazano, że są one związane z licznymi zaburzeniami, w których pośredniczą PTK i do których odnosi się wynalazek. Wykazano na przykład, że zmutowany src (v-src) jest białkiem nowotworowym (pp60^v-src) u kurczaka. Co więcej, jego homolog komórkowy, protoonkogen pp60^v-src przekazuje sygnały onkogenne wielu receptorów. Nadmierna ekspresja EGFR lub HER2/neu w guzach prowadzi do konstytucyjnej aktywacji pp60^v-src który jest charakterystyczny dla komórek złośliwych, ale nie występuje w komórkach normalnych. Z drugiej strony, myszy z niewystarczającą ekspresją c-src wykazują fenotyp marmurowatości kości, co wskazuje na kluczowy udział c-src w działaniu osteoklastów i możliwe powiązania z pokrewnymi zaburzeniami.

Podobnie wskazano, że Zap70 bierze udział w sygnalizacji komórek T, co może wiązać się z zaburzeniami autoagresyjnymi.

STK powiązano z zapaleniem, chorobami autoagresyjnymi, odpowiedziami immunologicznymi i zaburzeniami hiperproliferacyjnymi, takimi jak nawrót zwężenia, zwłóknienie, łuszczyca, zapalenie kości i stawów oraz reumatyczne zapalenie kości i stawów.

Wskazywano też na udział PK w zagnieżdżeniu embrionu. Stąd też związki według wynalazku mogą dostarczyć skuteczny sposób zapobiegania takiemu zagnieżdżeniu embrionu i dzięki temu mogą być użyteczne, jako środki zapobiegające ciąży. Dodatkowymi zaburzeniami, które można leczyć lub którym można zapobiegać stosując związki według wynalazku są: zaburzenia immunologiczne, takie jak choroby autoagresyjne, AIDS i zaburzenia sercowo-naczyniowe, takie jak miażdżyca tętnic.

Wreszcie podejrzewa się, że zarówno RTK jak i CTK są związane z zaburzeniami nadczynności układu odpornościowego.

Przykłady działania kilku przykładowych związków według wynalazku na szereg PTK przedstawiono poniżej w Tablicy 2. Przedstawionych związków i danych nie należy interpretować jako ograniczające zakres wynalazku w jakikolwiek sposób.

Sposób podawania i kompozycje farmaceutyczne

Związek według niniejszego wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól można podawać pacjentowi ludzkiemu w postaci czystej lub w postaci kompozycji farmaceutycznych, w których powyższe substancje zmieszane są z odpowiednimi nośnikami lub zarobkami. Sposoby przygotowania i podawania leków można znaleźć w ostatnim wydaniu „Remington's Pharmacological Science”, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Stosowane tutaj określenie „podawać” lub „podawanie” oznacza dostarczenie organizmowi związku o wzorze (I) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli albo kompozycji farmaceutycznej, zawierającej związek o wzorze (I) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól według wynalazku w celu zapobiegania zaburzeniom związanym z PK lub w celu leczenia zaburzeń związanym z PK.

Odpowiednie drogi podawania mogą obejmować, bez ograniczania, podawanie doustne, doodbytnicze, przezśluzówkowe lub dojelitowe, albo iniekcje domięśniowe, podskórne, dordzeniowe, dooponowe, bezpośrednio dokomorowe, dożylne, do ciałka szklistego, dootrzewnowe, donosowe lub śródoczne. Korzystnymi drogami podawania są drogi doustna i pozajelitowa.

Ewentualnie związek można podawać w sposób raczej lokalny niż ogólnoustrojowy, na przykład przez iniekcję związku bezpośrednio w guz lity, często w formie użytkowej depotowej lub o opóźnionym uwalnianiu.

Ponadto lek można podawać w postaci docelowego układu dostarczania leku, na przykład w liposomach, zawierających specyficzne przeciwciała przeciwko guzowi. Celem liposomów jest guz i ulegają one selektywnemu wchłanianiu przez guz.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można wytwarzać sposobami dobrze znanymi w dziedzinie, np. przez tradycyjne mieszanie, rozpuszczanie, granulowanie, drażetkowanie, mielenie mokre i frakcjonowanie sedymentacyjne, emulgowanie, obudowanie, uwięzienie lub liofilizowanie.

Kompozycje farmaceutyczne do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem można przygotować w tradycyjny sposób, stosując jeden lub więcej fizjologicznie dopuszczalnych nośników, zawierających

PL 211 834 B1 zaróbki i środki pomocnicze, które ułatwiają przetwarzanie związków aktywnych w formy użytkowe i które można stosować farmaceutycznie. Właściwe przygotowanie zależy od wybranej drogi podawania.

Związki według wynalazku można przygotować do iniekcji w postaci roztworów wodnych, korzystnie w buforach kompatybilnych fizjologicznie, takich jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera lub izotoniczny roztwór soli. W formach użytkowych do podawania na drodze przezśluzówkowej stosuje się środki przenikające, odpowiednie dla bariery, którą muszą one przekroczyć. Takie środki przenikające są ogólnie znane w dziedzinie.

Do podawania doustnego związki można przygotować przez łączenie związków aktywnych z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, dobrze znanymi w dziedzinie. Takie nośniki umożliwiają przygotowanie związków według wynalazku w postaci tabletek, pigułek, pastylek, drażetek, kapsułek, płynów, żeli, syropów, rzadkich zawiesin, zawiesin itp. do przyjmowania doustnego przez pacjenta. Farmaceutyczne formy użytkowe do podawania doustnego można wytworzyć z zastosowaniem zaróbki litej, ewentualnie mieląc otrzymaną mieszaninę i przetwarzając mieszaninę granulek po dodaniu innych, odpowiednich środków pomocniczych, o ile to pożądane, do otrzymania tabletek lub rdzeni drażetek. Użytecznymi zarobkami są w szczególności wypełniacze, takie jak cukry, obejmujące laktozę, sacharozę, mannitol lub sorbitol, preparaty celulozy, takie jak na przykład skrobia kukurydziana, skrobia pszenna, skrobia ryżowa i skrobia ziemniaczana oraz inne materiały, takie jak żelatyna, guma tragakantowa, metyloceluloza, metyloceluloza hydroksypropylowa, karboksymetyloceluloza sodowa i/lub pirolidon poliwinylowy (PVP). O ile pożądane, można dodać czynniki spulchniające, takie jak usieciowany pirolidon poliwinylowy, agar lub kwas algininowy. Można również zastosować sól, taką jak alginian sodu.

Rdzenie drażetek powleka się odpowiednimi powleczeniami. Do tego celu można użyć stężonych roztworów cukru, które mogą ewentualnie zawierać gumę arabską, talk, pirolidon poliwinylowy, żel karbopolowy, glikol polietylenowy i/lub dwutlenek tytanu, roztwory lakieru i odpowiednie rozpuszczalniki organiczne lub mieszaniny rozpuszczalników. Do powleczeń tabletek i drażetek można dodać barwniki lub pigmenty, co pozwala na identyfikację lub charakteryzuje różne połączenia dawek związku aktywnego.

Kompozycje farmaceutyczne do użytku doustnego obejmują zarówno pasowane przylgowo kapsułki żelatynowe, jak i miękkie kapsułki, wytworzone z żelatyny i zmiękczacza, takiego jak glicerol lub sorbitol. Pasowane przylgowo kapsułki mogą zawierać składniki aktywne zmieszane z wypełniaczem, takim jak laktoza, spoiwem, takim jak skrobia i/lub środkiem poślizgowym, takim jak talk lub stearynian magnezu oraz ewentualnie środkami stabilizującymi. W kapsułkach miękkich związki aktywne mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich płynach, takich jak oleje, ciekła parafina lub ciekłe glikole polietylenowe. Do tych form użytkowych można również dodać środki stabilizujące.

Kompozycje farmaceutyczne, które także można zastosować, obejmują twarde kapsułki żelatynowe. Jako nieograniczający przykład można podać, że doustna forma użytkowa leku może zawierać związek aktywny w dawce wynoszącej 50 i 200 mg (odpowiednie kody form użytkowych J-011248-AA-00 i J-011248-AA-01). Te dwie dawki o różnej sile przygotowuje się z tych samych granulek przez napełnianie nimi twardych kapsułek żelatynowych o różnych rozmiarach, rozmiarze 3 dla kapsułek 50 mg i rozmiarze 0 dla kapsułek 200 mg. Kompozycja formy użytkowej może odpowiadać przykładowo kompozycji przedstawionej w tablicy 2.

T a b l i c a 2

Nazwa/klasa składnika	Stężenie w granulacji (% wagowo)	Ilość w 50 mg kapsułce (mg)	Ilość w 200 mg kapsułce (mg)
Kod preparatu	J-011248-AA	J-011248-AA-00	J-011248-AA-01
Aktywny związek NF	65,0	50,0	200,0
Mannitol NF	23,5	18,1	72,4
Kroskarmeloza sodu NF	6,0	4,6	18,4
Povidon K 30 NF	5,0	3,8	15,2
Stearynian magnezu NF	0,5	0,38	1,52
Kapsułka, szwedzki żółty NF		Wymiar 3	Wymiar 0

PL 211 834 B1

Kapsułki można zapakować w szklane lub plastikowe butelki o barwie brązowej dla ochrony związku aktywnego przed światłem. Pojemniki zawierające kapsułkową formę użytkową związku aktywnego należy przechowywać w kontrolowanej temperaturze pokojowej (15-30°C).

Związki do zastosowania według wynalazku do inhalacji podaje się dogodnie w postaci aerozolu, stosując opakowanie ciśnieniowe lub rozpylacz i odpowiedni propelent, np., bez ograniczania, dichlorodifluorometan, trichlorofluorometan, dichlorotetra-fluoroetan lub dwutlenek węgla. W przypadku aerozolu ciśnieniowego jednostkę dawkowania można kontrolować za pomocą zaworu, dostarczającego odmierzoną ilość. Kapsułki i naboje, na przykład z żelatyny, do użycia w inhalatorze lub insuflatorze można przygotować w postaci mieszaniny proszkowej związku z odpowiednim podłożem proszkowym, takim jak laktoza lub skrobia.

Związki można również przygotować do podawania pozajelitowego, np. jako pojedynczą iniekcję dużej dawki leku (bolus) lub ciągły wlew. Formy użytkowe do iniekcji można przedstawiać w formie jednostek dawkowania, np. w ampułkach, lub pojemnikach wielodawkowych z dodatkiem środka konserwującego. Kompozycje mogą przyjmować postać zawiesin, roztworów lub emulsji w nośnikach olejowych lub wodnych i mogą zawierać materiały wchodzące w skład formy użytkowej, takie jak środki zawieszające, stabilizujące i/lub dyspergujące.

Kompozycje farmaceutyczne do podawania pozajelitowego obejmują roztwory wodne formy rozpuszczalnej w wodzie, takiej jak, bez ograniczania, soli związku aktywnego. Ponadto można przygotować zawiesiny związków aktywnych w nośniku lipofilowym. Odpowiednimi nośnikami lipofilowymi są oleje tłuszczowe, takie jak olej sezamowy, estry syntetycznych kwasów tłuszczowych, takich jak oleinian etylowy i triglicerydy, lub materiały takie jak liposomy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które podnoszą lepkość zawiesiny, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol lub dekstran. Ewentualnie zawiesina może również zawierać odpowiednie środki stabilizujące i/lub środki zwiększające rozpuszczalność związków w celu umożliwienia przygotowania roztworów o bardzo wysokich stężeniach.

Alternatywnie, składnik aktywny może być w postaci proszku do odtworzenia przed użyciem z odpowiednim nośnikiem, np. sterylną wodą wolną od pirogenów.

Związki można także przygotować w postaci kompozycji doodbytniczych, takich jak czopki lub enemy retencyjne, stosując np. tradycyjne podłoża czopkowe, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.

Oprócz wyżej opisanych form użytkowych, związki można również przygotować, jako preparaty depotowe. Takie formy użytkowe o przedłużonym działaniu można podawać przez implantację (na przykład podskórnie lub domięśniowo) lub przez iniekcję domięśniową. Związek według wynalazku można przygotować dla tej drogi podawania z odpowiednimi materiałami polimerycznymi lub hydrofobowymi (na przykład emulsja z farmaceutycznie dopuszczalnym olejem), z żywicami jonowymiennymi lub w postaci słabo rozpuszczalnych pochodnych, takich jak, bez ograniczania, słabo rozpuszczalna sól.

Nieograniczającym przykładem nośnika farmaceutycznego dla hydrofobowych związków według wynalazku jest układ współrozpuszczalników, składający się z alkoholu benzylowego, niepolarnego środka powierzchniowo czynnego, mieszalnego z wodą polimeru organicznego i fazy wodnej, taki jak układ współrozpuszczalników VPD. VPD jest roztworem zawierającym: 3% w/v alkoholu benzylowego, 8% w/v niepolarnego środka powierzchniowo czynnego Polisorbat 80 oraz 65% w/v glikolu polietylenowego 300, dopełnione do objętości etanolem absolutnym. Układ współrozpuszczalników VPD (VPD:D5W) składa się z VPD rozcieńczonego 1:1 wodnym 5% roztworem dekstrozy. Taki układ współrozpuszczalników dobrze rozpuszcza związki hydrofobowe i wykazuje niską toksyczność przy podawaniu ogólnoustrojowym. Proporcje składników w takim układzie współrozpuszczalników można znacząco zmieniać bez niszczenia jego charakterystyki rozpuszczania i toksyczności. Ponadto można zmieniać tożsamość składników współrozpuszczalnika: na przykład zamiast Polisorbatu 80 można zastosować inne niepolarne środki powierzchniowo czynne o niskiej toksyczności, można zmienić rozmiar frakcji glikolu polietylenowego, można zastąpić glikol polietylenowy innymi polimerami kompatybilnymi biologicznie, np. pirolidonem poliwinylu oraz można zastąpić dekstrozę innymi cukrami lub polisacharydami.

Ewentualnie można zastosować inne układy dostarczania hydrofobowych związków farmaceutycznych. Liposomy i emulsje są dobrze znanymi przykładami cieczy nośnych lub nośników dla leków hydrofobowych. Ponadto można zastosować pewne rozpuszczalniki organiczne, takie jak sulfotlenek metylu, chociaż często kosztem zwiększonej toksyczności.

Dodatkowo, związki można dostarczać z zastosowaniem układu o przedłużonym uwalnianiu, takiego jak półprzepuszczalne matryce stałych polimerów hydrofobowych, zawierające środek leczniczy.

PL 211 834 B1

Różne materiały o przedłużonym uwalnianiu są uznane i dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Kapsułki o przedłużonym uwalnianiu mogą w zależności od ich charakteru chemicznego uwalniać związki przez okresy czasu sięgające od kilku tygodni do ponad 100 dni. W zależności od charakteru chemicznego i stabilności biologicznej odczynnika leczniczego można stosować dodatkowe strategie dla stabilizacji białka.

Kompozycje farmaceutyczne mogą również obejmować odpowiednie nośniki lub zaróbki fazy stałej lub żelowej. Przykłady takich nośników lub zarobek włączają, ale nie ograniczają się do: węglanu wapnia, fosforanu wapnia, różnych cukrów, skrobi, pochodnych celulozy, żelatyny i polimerów, takich jak glikole polietylenowe.

Wiele związków według wynalazku modulujących PK można dostarczać, jako fizjologicznie dopuszczalne sole, w których zastrzeżony związek może tworzyć cząsteczki naładowane negatywnie lub pozytywnie. Przykłady soli, w których związek tworzy cząsteczki naładowane pozytywnie, włączają, bez ograniczania, aminy czwartorzędowe (zdefiniowane tutaj w innym miejscu), sole, takie jak chlorowodorek, siarczan, węglan, mleczan, winian, jabłczan, maleinian, bursztynian, w których atom azotu czwartorzędowej grupy aminowej jest azotem wybranego związku według wynalazku, który uległ reakcji z odpowiednim kwasem. Sole, w których związek według wynalazku tworzy cząsteczki naładowane negatywnie, włączają, bez ograniczania, sole sodu, potasu, wapnia i magnezu utworzone przez reakcję grupy karboksylowej związku z odpowiednią zasadą (np. wodorotlenek sodu (NaOH), wodorotlenek potasu (KOH), wodorotlenek wapnia (Ca(OH)2), itp.).

Kompozycje farmaceutyczne, odpowiednie do zastosowania w niniejszym wynalazku, obejmują kompozycje, które zawierają składniki aktywne w ilości wystarczającej do osiągnięcia zamierzonego celu, takiego jak np. modulacja aktywności PK lub leczenie albo zapobieganie zaburzeniu związanemu z PK.

Dokładniej, ilość skuteczna leczniczo oznacza ilość związku, która jest skuteczna w zapobieganiu, łagodzeniu lub poprawianiu objawów choroby lub przedłużaniu życie osobnika leczonego.

Oznaczenie ilości skutecznej leczniczo mieści się w zakresie umiejętności specjalistów w dziedzinie, szczególnie w świetle dostarczonego tutaj szczegółowego ujawnienia.

Skuteczną leczniczo ilość lub dawkę dla dowolnego związku użytego w sposobach według wynalazku można ustalić najpierw na podstawie testów w kulturach komórkowych. Następnie dawkowanie można przystosować do zastosowania w modelach zwierzęcych tak, aby osiągnąć zakres stężenia w krążeniu, który włącza wartość IC50 oznaczoną w hodowli komórkowej (tj. stężenie związku badanego, przy którym dochodzi do połowy najsilniejszego hamowania aktywności PK). Taką informację można następnie wykorzystać do dokładniejszego określenia użytecznych dawek dla człowieka.

Opisaną tutaj toksyczność i skuteczność leczniczą związków można ustalić z zastosowaniem standartowego postępowania farmaceutycznego w hodowlach komórkowych lub na zwierzętach doświadczalnych, np, określając wartości IC50 i LD50 (które opisano tutaj w innym miejscu) dla danego związku. Dane otrzymane z tych testów w hodowlach komórkowych i badaniach na zwierzętach można wykorzystać do metodycznego przygotowania zakresu dawkowania dla człowieka. Dawkowanie może ulegać zmianom w zależności od zastosowanej formy dawkowania i wykorzystanej drogi podawania. Dokładna forma użytkowa, droga podawania i dawkowanie mogą być wybrane przez lekarza w zależności od stanu pacjenta. (Patrz np. Fingl i in., 1975, w “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Rozdz. 1 str. 1).

Ilość dawkowania i przedział czasu można dostosować indywidualnie tak, że poziom substancji aktywnej w osoczu krwi jest wystarczający do utrzymania modulującego wpływu na kinazę. Taki poziom w osoczu krwi określa się mianem minimalnego stężenia skutecznego (MEC). Wartość MEC będzie ulegać zmianom dla każdego związku, ale może być ustalona na podstawie danych otrzymanych in vitro, np. stężenie niezbędne do osiągnięcia 50-90% inhibicji aktywności kinazy można ustalić z zastosowaniem opisanych tutaj testów.

Dawkowania niezbędne do uzyskania MEC będą zależały od indywidualnych charakterystyk i drogi podawania. W celu określenia poziomu w osoczu krwi można zastosować testy HPLC lub testy biologiczne.

Interwały dawkowania można także ustalić przy użyciu wartości MEC. Związki należy podawać stosując tryb postępowania, który utrzymuje poziom w osoczu powyżej wartości MEC przez 10-90% czasu, korzystnie przez 30-90% czasu, a najkorzystniej przez 50-90% czasu.

PL 211 834 B1

Skuteczne leczniczo ilości związków o wzorze (I) mogą mieścić się obecnie w zakresie od około 2 2 2 2 mg/m² do 1500 mg/m² dziennie; korzystnie około 3 mg/m²/dzień. Nawet korzystniej od 50mg/m²/dzień ₂ do 400 mg/m²/dzień.

W przypadkach podawania miejscowego lub selektywnego pobierania, skuteczne stężenia lokalne leku mogą nie być związane ze stężeniem w osoczu i dla określenia prawidłowej ilości dawkowania i interwału można wykorzystać inne sposoby postępowania znane w dziedzinie.

Podawana ilość kompozycji będzie oczywiście zależeć od osobnika leczonego, ciężkości przypadku, sposobu podawania, oceny lekarza przepisującego lek, itp.

O ile pożądane, kompozycje można przedkładać w opakowaniu lub dozowniku, takim jak zestaw zaakceptowany przez FDA, który może zawierać jedną lub więcej form jednostki dawkowania, zawierających składnik aktywny. Opakowanie może składać się na przykład z folii metalowej lub plastykowej, takiej jak opakowanie listkowe. Do opakowania lub dozownika można dołączyć instrukcje podawania.

Do opakowania lub dozownika można także dołączyć wzmiankę połączoną z pojemnikiem w formie zaleconej przez przedstawicielstwo rządowe, regulujące wytwarzanie, zastosowanie lub sprzedaż środków farmaceutycznych, która to wzmianka odzwierciedla zatwierdzenie przez przedstawicielstwo formy kompozycji lub jej stosowanie w medycynie lub weterynarii. Taka wzmianka może na przykład mieć oznakowanie zatwierdzone przez amerykańskie Food and Drug Administration jako lek na receptę lub zatwierdzony wyrób. Kompozycje zawierające związek według wynalazku, przygotowane w kompatybilnym nośniku farmaceutycznym, można również wytworzyć, umieścić w odpowiednim pojemniku i oznakować, jako środek do leczenia wskazanego stanu. Odpowiednie stany wskazane na etykiecie mogą obejmować leczenie guza, hamowanie rozwoju naczyń, leczenie zwłóknienia, cukrzycy, itp.

Aspektem wynalazku jest również, że opisany tutaj związek, jego sól lub przedlek, można łączyć z innymi środkami chemoterapeutycznymi do leczenia opisanych powyżej chorób i zaburzeń. Związek, jego sól lub przedlek według wynalazku można na przykład połączyć ze środkami alkilującymi, takimi jak fluorouracyl (5-FU) sam lub w następnym połączeniu z leukoworyną; lub innymi środkami alkilującymi, takimi jak, bez ograniczania, inne analogi pirymidyny, takie jak UFT, kapecytabina, gemcytabina i cytarabina, sulfoniany alkilowe, np. busulfan (stosowany w leczeniu chronicznej białaczki granulocytowej), improsulfan i piposulfan; azyrydyny, np. benzodepa, karbokwon, meturedepa i uredepa; etylenoiminy i metylomelaminy, np. altretamina, trietylenomelamina, trietylenofosforamid, trietylenotiofosforamid i trimetylolomelamina; oraz musztardy azotowe, np. chlorambucyl (stosowany w leczeniu chronicznej białaczki limfocytowej, pierwotnej makroglobulinemii i chłoniaka nieziarniczego), cyklofosfamid (stosowany w leczeniu choroby Hodgkina, szpiczaka mnogiego, nerwiaka niedojrzałego, raka sutka, raka jajników, raka płuc, guza Wilma i mięśniakomięsaka prążkowanego), estramustyna, ifosfamid, nowembrychina, prednimustyna i musztarda uracylowa (stosowana w leczeniu trombocytozy pierwotnej, chłoniaka nieziarniczego, choroby Hodgkina i raka jajników); oraz triazyny, np. dakarbazyna (stosowana w leczeniu mięsaka tkanek miękkich).

Związek, sól lub przedlek według wynalazku można również stosować w połączeniu z innymi antymetabolicznymi środkami chemoterapeutycznymi, takimi jak, bez ograniczania, analogi kwasu foliowego, np. metotreksat (stosowany w leczeniu ostrej białaczki limfocytowej, złośliwego nabłoniaka kosmówkowego, raka sutka wywołanego przez ziarniniaka grzybiastego, raka głowy i szyi oraz mięsaka kościotwórczego) i pteropteryna; oraz analogi puryn, takie jak merkaptopuryna i tioguanina, które znajdują zastosowanie w leczeniu ostrej białaczki granulocytowej, ostrej białaczki limfocytowej i chronicznej białaczki granulocytowej.

Rozważa się, że związek, sól lub przedlek według wynalazku można także stosować w połączeniu ze środkami chemoterapeutycznymi, opartymi na środkach naturalnych, takich jak, bez ograniczania, alkaloidy winka, np. winblastyna (stosowana w leczeniu raka sutka i jąder), winkrystyna i windezyna; epipodofilotoksyny, np. etopozyd i tenipozyd, które są użyteczne w leczeniu raka jąder i mięsaka Kaposia; antybiotyczne środki chemoterapeutyczne, np. daunorubicyna, doksorubicyna, epirubicyna, mitomycyna (stosowane w leczeniu raka żołądka, szyjki, okrężnicy, sutka, pęcherza moczowego i trzustki), daktynomycyna, temozolomid, plikamycyna, bleomycyna (stosowane w leczeniu raka skóry, przełyku i przewodu moczowo-płciowego); oraz enzymatyczne środki chemoterapeutyczne, takie jak L-asparaginaza.

Ponadto związek, sól lub przedlek według wynalazku można by było również użyć w połączeniu z: koordynacyjnymi kompleksami platyny (cisplatyna, itp.); podstawionymi mocznikami, takimi jak

PL 211 834 B1 hydroksymocznik; pochodnymi metylohydrazyny, np. prokarbazyną; korowonadnerczowymi środkami tłumiącymi (suppressant), np. mitotanem, aminoglutetimidem; oraz hormonami i antagonistami hormonów, takimi jak sterydy adrenokortykowe (np. prednison), progestyny (np. kapronian hydroksyprogesteronu); estrogeny (np. dietylostilbesterol); antyestrogeny, takie jak tamoksyfen; androgeny, np. propionian testosteronu; jak również inhibitorami aromatazy, takimi jak anastrozol.

W końcu rozważa się również, że połączenie związku według wynalazku powinno być skuteczne w zestawieniu z mitoksantronem lub paklitakselem w leczeniu guzów rakowych lub białaczek, takich jak, bez ograniczania, ostra białaczka szpikowa (nie-limfocytowa).

Ogólna procedura syntezy.

Następująca ogólna metodologia może być stosowana w celu przygotowywania związków według wynalazku:

Odpowiednio podstawiony 2-oksindol (1 równoważnik), odpowiednio podstawiony aldehyd (1,2 równoważnik) i zasadę (0,1 równoważnik) miesza się w rozpuszczalniku (1-2 ml/mmol 2-oksindol) i mieszaninę następnie ogrzewa się przez od około 2 do około 12 godzin. Po oziębieniu, utworzony osad przesącza się, przemywa zimnym etanolem lub eterem i osusza się pod silnie zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem ciała stałego. Jeśli nie utworzy się osad, mieszaninę reakcyjną zatęża się i resztę rozciera się mieszaniną dichlorometan/eter, uzyskane ciało stałe zbiera się przez filtrację i następnie osusza. Produkt można ewentualnie następnie oczyszczać metodą chromatografii.

Zasadą może być zasada organiczna lub nieorganiczna. W przypadku zastosowania zasady organicznej, korzystnie jest to zasada azotowa. Przykłady organicznych zasad azotowych obejmują między innymi takie jak diizopropyloamina, trimetyloamina, trietyloamina, anilina, pirydyna, 1,8-diazabicyklo[5,4,1]undek-7-en, pirolidyna i piperydyna.

Przykłady nieorganicznych zasad to, bez ograniczenia, amoniak, wodorotlenki metali alkalicznych lub ziem alkalicznych, fosforany, węglany, wodorowęglany, bisiarczany i amidy. Metale alkaliczne obejmują lit, sod i potas, natomiast metale ziem alkalicznych obejmują wapń, magnez i bar.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, gdy stosuje się protonowy rozpuszczalnik, taki jak woda lub alkohol, zasadą jest nieorganiczna zasada metalu alkalicznego lub ziem alkalicznych, korzystnie, wodorotlenek metalu alkalicznego lub ziem alkalicznych.

Będzie jasne dla fachowców w dziedzinie, w oparciu zarówno o znane ogólne zasady syntezy organicznej, jak i ujawnienie niniejszego wynalazku, które zasady będą najbardziej odpowiednie dla każdej z reakcji.

Rozpuszczalnik, w którym prowadzi się reakcję może stanowić protonowy lub aprotonowy rozpuszczalnik, korzystnie protonowy rozpuszczalnik. Określenie „protonowy rozpuszczalnik” obejmuje rozpuszczalnik, który ma atom wodoru kowalencyjnie związany z tlenem lub azotem, co czyni atomy wodoru odpowiednio kwasowymi i tym samym zdolnymi do bycia „współdzielonymi” z solutem przez wiązania wodorowe. Przykłady protonowych rozpuszczalników obejmują, bez ograniczenia, wodę i alkohole.

„Aprotonowe rozpuszczalniki” mogą być polarne lub niepolarne, ale, w każdym przypadku, nie zawierają kwasowego atomu wodoru i nie są tym samym zdolne do tworzenia wiązań wodorowych z rozpuszczonymi substancjami. Przykłady, bez ograniczenia, niepolarnych aprotonowych rozpuszczalników, obejmują pentan, heksan, benzen, toluen, chlorek metylenu i tetrachlorek węgla. Przykłady polarnych aprotonowych rozpuszczalników obejmujące chloroform, tetrahydrofuran, dimetylosulfotlenek i dimetyloformamid.

Korzystnie rozpuszczalnikiem jest protonowy rozpuszczalnik, korzystnie woda lub alkohol taki jak etanol.

Reakcję prowadzi się w temperaturach powyżej temperatury pokojowej. Temperaturę wynosi na ogół od około 30°C do około 150°C, korzystnie około 80°C do około 100°C, najbardziej korzystnie około 75°C do około 85°C, co stanowi w przybliżeniu temperaturę wrzenia etanolu. Przez określenie „około” rozumie się, że zakres temperatury obejmuje korzystnie 10 stopni Celsjusza wokół wskazanej temperatury, korzystniej 5 stopni Celsjusza i, najkorzystniej, 2 stopnie Celsjusza. Tak więc, np. przez „około 75°C” rozumie się 75°C ± 10°C, korzystnie 75°C ± 5°C i najkorzystniej, 75°C ± 2°C.

2-0xindole i aldehydy, można łatwo zsyntetyzować stosując techniki dobrze znany w dziedzinie chemii. Należy rozumieć, że związki według wynalazku mogą być wytworzone przez chemika również innymi technikami znanymi w dziedzinie, a poniższe przykłady nie ograniczają zakresu wynalazku.

PL 211 834 B1

P r z y k ł a d y

Następujący preparaty i przykłady podano, aby umożliwić specjalistom w dziedzinie lepsze zrozumienie i wykonywanie niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d y syntetyczne

Metoda A: Formylacja piroli

POCl3 (1,1 równoważnika) wkroplono do dimetyloformamidu (3 równoważnik) w -10°C, a następnie dodano odpowiedni pirol rozpuszczony w dimetyloformamidzie. Po wymieszaniu w ciągu dwóch godzin, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono H2O i zalkalizowano do pH 11 przy pomocy 10 N KOH. Wytworzony osad zebrano przez filtrację, przemyto H2O i osuszono w piecu próżniowym z wytworzeniem pożądanego aldehydu.

Metoda B: Zmydlanie estrów kwasu pirolokarboksylowego Mieszaninę estru kwasu pirolokarboksylowego i KOH (2-4 równoważników) w EtOH ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną do momentu wskazania zakończenia reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną zakwaszono do pH 3 przy pomocy 1 N HCl. Wytworzony osad zebrano przez filtrację, przemyto H2O i osuszono w piecu próżniowym z wytworzeniem pożądanego kwasu pirolokarboksylowego.

Metoda C: Amidowanie

Do mieszanego roztworu kwasu pirolokarboksylowego rozpuszczonego w dimetyloformamidzie (0,3M) dodano 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid (1,2 równoważnika), 1-hydroksybenzotriazol (1,2 równoważnika) i trietyloaminę (2 równoważniki). Dodano odpowiednią aminę (1 równoważnik) i mieszaninę reakcyjną mieszano aż do wskazania zakończenia reakcji przez TLC. Następnie dodano do mieszaniny reakcyjnej octan etylu i roztwór przemyto nasyconym NaHCO3 i solanką (z nadmiarem soli), osuszono nad bezwodnym mgSO4 i zatężono uzyskując pożądany amid.

Metoda D: Kondensacja aldehydów i oksindoli zawierających podstawniki kwasu karboksylowego

Mieszaninę oksindolu (1 równoważnik), 1 równoważnika aldehydu i 1-3 równoważników piperydyny (lub pirolidyny) w etanolu (0,4 M) mieszano w 90-100°C do momentu wskazania zakończenia reakcji przez TLC. Mieszaninę następnie zatężono i resztę zakwaszono 2N HCl. Wytworzony osad przemyto H2O i EtOH i następnie osuszono w. piecu próżniowym z wytworzeniem produktu.

Metoda E: Kondensacja aldehydów i oksindoli nie zawierających podstawników kwasu karboksylowego

Mieszaninę oksindolu (1 równoważnik), 1 równoważnika aldehydu i 1-3 równoważników piperydyny (lub pirolidyny) w etanolu (0,4 M) mieszano w 90-100°C do momentu wskazania zakończenia reakcji przez TLC. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i wytworzone ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową, przemyto etanolem i osuszono z wytworzeniem produktu. W przypadku braku osadu, po oziębieniu mieszaniny reakcyjnej, mieszaninę zatężono i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej.

C. P r z y k ł a d y syntezy oksindolu

Następujące przykłady syntezy reprezentatywnych oksindoli nie ograniczają w żaden sposób wynalazku. Dla specjalisty w dziedzinie będą oczywiste alternatywne oksindole oraz metody otrzymywania oksindoli stosowanych do wytworzenia związków według wynalazku. Takie syntezy i oksindole wchodzą w zakres i myśl przewodnią wynalazku.

5-amino-2-oksindol

5-nitro-2-oksindol (6,3 g) uwodorniano w metanolu nad 10% palladem na węglu z wytworzeniem 3,0 g (60% wydajności) tytułowego związku w postaci białego ciała stałego.

5-bromo-2-oksindol

2-Oksindol (1,3 g) w 20 ml acetonitryl ochłodzono do -10°C i powoli dodano 2,0 g N-bromosukcynoimidu z mieszaniem. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w -10°C i 2 godziny w 0°C. Osad zebrano, przemyto wodą i osuszono z wytworzeniem 1,9 g (90% wydajności) tytułowego związku

4-metylo-2-oksindol

Szczawian dietylu (30 ml) w 20 ml suchego eteru dodano mieszając do 19 g etanolanu potasu zawieszonego w 50 ml suchego eteru. Mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej i powoli dodano 20 ml

3-nitro-o-ksylenu w 20 ml suchego eteru. Gęstą ciemnoczerwoną mieszaninę ogrzewano do temperatury wrzenia przez 0,5 godziny, zatężono do ciemnoczerwonego ciała stałego i potraktowano 10% wodorotlenkiem sodu do prawie całkowitego rozpuszczenia ciała stałego. Ciemnoczerwoną mieszaninę potraktowano 30% nadtlenkiem wodoru aż czerwono zabarwienie zmieniło się na żółte. Mieszaninę

PL 211 834 B1 potraktowano naprzemian 10% wodorotlenkiem sodu i 30% nadtlenkiem wodoru do zaniku ciemnoczerwonego zabarwienia. Ciało stałe odsączono i przesącz zakwaszono 6N kwasem chlorowodorowym. Uzyskany osad zebrano przez filtrację próżniową, przemyto wodą i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 9,8 g (45% wydajności) kwasu 2-metylo-6-nitrofenylooctowego w postaci białawego ciała stałego. Ciało stałe uwodorniano w metanolu nad 10% palladem na węglu z wytworzeniem 9,04 g tytułowego związku w postaci białego ciała stałego.

7-bromo-5-chloro-2-oksindol

5-chloro-2-oksindol (16,8 g) i 19,6 g N-bromosukcynoimidu zawieszono w 140 ml acetonitrylu i ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3 godziny. Chromatografia cienkowarstwowa (krzemionka, octan etylu) przy 2 godzinach ogrzewania w temperaturze wrzenia wykazała 5-chloro-2-oksindol lub N-bromosukcynoimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) i drugi produkt (Rf 0,9), których proporcje nie zmieniły się po kolejnej godzinie ogrzewania w temperaturze wrzenia. Mieszaninę ochłodzono do 10°C, osad zebrano przez filtrację próżniową, przemyto 25 ml etanolu i odsysano na sucho przez 20 minut w lejku z wytworzeniem 14,1 g wilgotnego produktu (56 % wydajności). Ciało stałe zawieszono w 200 ml technicznego etanolu i odmyto z zawiesiny mieszając i ogrzewając w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 10 minut. Mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej do 10°C. Stały produkt zebrano przez filtrację próżniową, przemyto 25 ml etanolu i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 40 °C z wytworzeniem 12,7 g (51% wydajności) 7-bromo-5-chloro-2-oksindolu.

5-fluoro-2-oksindol

5-fluoroizatynę (8,2 g) rozpuszczono w 50 ml hydratu hydrazyny i ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1,0 godzinę. Mieszanie reakcyjną następnie wylano do lodowatej wody. Następnie przesączono osad, przemyto wodą i osuszono w piecu próżniowym z wytworzeniem tytułowego związku

5-nitro-2-oksindol

2-oksindol (6,5 g) rozpuszczono w 25 ml stężonego kwasu siarkowego i mieszaninę utrzymywano w -10 do -15 °C podczas dodawania kroplami 2,1 ml dymiącego kwasu azotowego. Po dodaniu kwasu azotowego, mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 0,5 godziny i wylano na wodą z lodem. Osad zebrano przez filtrację, przemyto wodą i krystalizowano z 50% kwasu octowego. Krystaliczny produkt następnie przesączono, przemyto wodą i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 6,3 g (70%) 5-nitro-2-oksindolu.

5-aminosulfonylo-2-oksindol

Do 100 ml kolby napełnionej 27 ml kwasu chlorosulfonowego dodano powoli 13,3 g 2-oksindolu. Temperaturę reakcji utrzymywano poniżej 30°C podczas dodawania. Po dodaniu, mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny, ogrzewano do 68°C przez 1 godzinę, ochłodzono i wylano do wody. Osad przemyto wodą i osuszono w piecu próżniowym z wytworzeniem 11,0 g 5chlorosulfonylo-2-oksindolu (50% wydajności), który użyto bez dalszego oczyszczania.

5-chlorosulfonylo-2-oksindol (2,1 g) dodano do 10 ml wodorotlenku amonu w 10 ml etanolu i mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę zatężono i ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową z wytworzeniem 0,4 g (20% wydajności) tytułowego związku w postaci białawego ciała stałego.

5-izopropyloaminosulfonylo-2-oksindol

Do 100 ml kolby napełnionej 27 ml kwasu chlorosulfonowego powoli dodano 13,3 g 2-oksindolu. Temperaturę reakcji utrzymywano poniżej 30°C podczas dodawania. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny, ogrzewano do 68°C przez 1 godzinę, ochłodzono i wylano do wody. Wytworzony osad przesączono, przemyto wodą i osuszono w piecu próżniowym z wytworzeniem 11,0 g (50%) 5-chlorosulfonylo-2-oksindolu, który użyto bez dalszego oczyszczania.

Zawiesinę 3 g 5-chlorosulfonylo-2-oksindolu, 1,15 g izopropyloaminy i 1,2 ml pirydyny w 50 ml dichlorometanu mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, podczas którego to czasu powstało białe ciało stałe. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową, przemyto z zawiesiny gorącym etanolem, ochłodzono, zebrano przez filtrację próżniową i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 40°C przez noc z wytworzeniem 1,5 g (45%) 5-izopropyloaminosulfonylo-2-oksindolu.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,69 (s, br, 1H, NH), 7,63 (dd, J=2 i 8 Hz, 1IH), 7,59 (d, J=2 Hz, 1H), 7,32 (d, J= 1 Hz, 1H, NH-SO2-), 6,93 (d, J= 8 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH3)2), 0,94 (d, J= 1 Hz, 6H, 2xCH3).

PL 211 834 B1

5-fenyloaminosulf onylo-2-ok;sindol

Zawiesinę 5-chlorosulf onylo-2-oksindolu (1,62 g, 7 mmol), aniliny (0, 782 ml, 8,4 mmol) i pirydyny (1 ml) w dichlorometanie (20 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (300 ml) i zakwaszono 1N kwasem chlorowodorowym (16 ml). Warstwę organiczną przemyto wodorowęglanem sodu i solanką, osuszono i zatężono. Resztę przemyto etanolem (3 ml) i następnie poddano chromatografii na żelu krzemionkowym eluując mieszaniną metanol/dichlorometan 1:9 z wytworzeniem 5-fenyloaminosulfonylo-2-oksindolu.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J=8,4 Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).

Pirydyn-3-ylamid kwasu 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowego

Roztwór 5-chlorosufonylo-2-oksindolu (3 g) i 3-aminopirydyny (1,46g) w pirydynie (15 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, po którym to czasie pojawiło się brunatne ciało stałe. Ciało stałe przesączono, przemyto etanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 1,4 g (38%) pirydyn-3-ylamidu kwasu 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,74 (s, 1H, NH), 10,39 (s, 1H, SO2NH), 8,27-8, 28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).

MS m/z (APCI+) 290,2.

5-fenylooksindol

5- bromo-2-oksindol (5 g, 23,5 mmol) rozpuszczono w 110 ml toluenu i 110 ml etanolu mieszając i delikatnie ogrzewając. Dodano tetrakis(trifenylofosfino)pallad(O) (1,9 g, 1,6 mmol), a następnie 40 ml (80 mmol) 2M wodnego roztworu węglanu sodu. Do tej mieszaniny dodano kwas benzenoboronowy (3,7 g, 30,6 mmol) i mieszaninę ogrzewano w 100°C w łaźni olejowej przez 12 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono, rozcieńczono octanem etylu (500 ml), przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (200 ml), wodą (200 ml), 1N HCl (200 ml) i solanką (200 ml). Warstwę organiczną osuszono nadsiarczanem magnezu i zatężono uzyskując brunatne ciało stałe. Rozcieranie dichlorometanem dało 3,8 g (77%) 5-fenylo-2-oksindolu w postaci brązowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J=1,8 i 7,2 Hz, 1H), 7,5 do 7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J=8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).

MS m/z 209 [M⁺].

W podobny sposób, można wytworzyć następujące oksindole:

6- (3,5-dichlorofenylo)-1,3-dihydroindol-2-on ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J=1,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J-1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).

MS-EI m/z 277/279 [M]⁺.

6-(4-butylfenylo)-1,3-dihydroindol-2-on ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J=8 Hz, 3H), 7,17 (dd, J=1,5 i 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J=1,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,60 (t, J=7,5 Hz, 2Hz, CH2CH3), 1,57 (m, 2H, CH2), 1,32 (m, 2H, CH2), 0,9 (t, J= 7,5 Hz, 3H, CH3).

6-(5-izopropylo-2-metoksyfenylo) -1,3-dihydroindol-2-on ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,29 (br s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J=2,4 Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J=0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19-(d, J=6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 281 [M]⁺.

6-(4-Etylofenylo)-1,3-dihydroindol-2-on ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J= 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J=1,6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO) , 2,63 (q, J=7,6 Hz, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, J=7,6 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 237 [M]⁺.

6-(3-izopropylfenylo)-1,3-dihydroindol-2-on ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J=1,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,24 (d, J=6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 251 [M]⁺.

6-(2, 4-dimetok;syfenylo)-1,3-dihydroindol-2-on

PL 211 834 B1 ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J=1,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J= 1,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J=2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J=2,4 & 8,5 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,45 (s, 2H, CH2CO).

MS-EI m/z 269 [M]⁺.

6-pirydyn-3-ylo-1,3-dihydroindol-2-on ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J=1,8 i 5,7 Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J=5,7 i 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).

MS m/z 210 [M]⁺.

(3-chloro-4-etoksyfenylo)-amid kwasu 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-4-karboksylowego

Do roztworu 4-karboksy-2-oksindolu (200 mg, 1,13 mmol) i 3-chloro-4-metoksyfenyloaminy (178 mg, 1,13 mmol) w dimetyloformamidzie (15 ml) w temperaturze pokojowej dodano heksafluorofosforan benzotriazol-1-yloksytris(dimetyloamino)fosfoniowy (reagent BOP, 997 mg, 2,26 mmol), a następnie

4-dimetyloaminopirydynę (206 mg, 1,69 mmol). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 72 godzin. Mieszaninę reakcyjną następnie rozcieńczono octanem etylu (300 ml), przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (100 ml), wodą, 2N kwasem chlorowodorowym (100 ml), wodą (3x200 ml) i solanką. Następnie osuszono ją nadsiarczanem magnezu i zatężono. Resztę roztarto octanem etylu z wytworzeniem (3-chloro-4-metoksyfenylo)-amidu kwasu 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-4-karboksylowego w postaci różowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,50 (s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H NH), 7,9 (s/ J=2,5 Hz, 1H), 7,62 (dd, J=2,5 & 9 Hz, 1H), 7,38 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,13 (d, J= 9 Hz, 1H), 6,98 (d, J=7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (s, 2H, CH2).

MS-EI m/z 316 [M]⁺.

4-karboksy-2-oksindol

Roztwór trimetylosilildiazometanu w heksanie (2 M) dodano kroplami do roztworu 2,01 g 2-chloro-3-karboksynitrobenzenu w 20 ml metanolu w temperaturze pokojowej aż do ustąpienia wydzielania się gazu. Następnie dodano kwas octowy, aby stłumić nadmiar trimetylosilildiazometanu.

Mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i resztę osuszono w piecu przez noc. Otrzymany 2-chloro-3-metoksykarbonylonitrobenzen był wystarczająco czysty do dalszej obróbki.

Dodano malonian dimetylu (6,0 ml) do oziębionej lodem zawiesiny 2,1 g wodorku sodu w 15 ml DMSO. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 100°C przez 1 godzinę i następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Dodano 2-chloro-3-metoksykarbonylonitrobenzen (2,15 g) w jednej porcji i mieszaninę ogrzewano do temperatury 100°C przez 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną następnie ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do wody z lodem, zakwaszono do pH 5 i ekstrahowano octanem etylu.

Warstwę organiczną przemyto solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono uzyskując 3,0 g 2-metoksykarbonylo-6-nitrofenylomalonianu dimetylu.

2-metoksykarbonylo-6-nitrofenylomalonian dimetylu (3,0 g) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w 50 ml 6 N kwasu chlorowodorowego przez noc. Mieszaninę zatężono do suchej masy, dodano 20 ml etanolu i 1,1 g chlorku cyny(II) chlorek i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Mieszaninę przesączono przez celit, zatężono i poddano chromatografii na żelu krzemionkowym stosując mieszaninę octan etylu:heksan:kwas octowy jako eluent z wytworzeniem 0,65 g (37%) 4-karboksy-2-oksindolu w postaci białego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J=8Hz, 1H), 7,39 (t, J = BHz, 1H), 7,12 (d, J = BHz, 1H), 3,67 (s, 2H).

D. Synteza 2-indolinonów podstawionych na pierścieniu pirolowym.

P r z y k ł a d 37 (3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Mieszaninę chlorowodorku 2-aminoacetofenonu (1 równoważnik), izobutyryloctanu etylu (1,2 równoważnik) i octanu sodu (2,4 równoważnik) w H2O mieszano w 100°C przez 18 godzin i następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Warstwę wodną zdekantowano i olej rozpuszczono w octanie etylu. Mieszaninę przemyto następnie wodą i solanką i następnie osuszono z wytworzeniem (93%) estru metylowego) kwasu 2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego w postaci czerwonobrunatnego oleju.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J=2,7 Hz, 1H), 4,02 (q, J=7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,22 (d, J=7,5 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1-04 (t, J=7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).

PL 211 834 B1

MS-EI m/z 257 [M⁺].

Powyższy pirol formylowano stosując metodę A z wytworzeniem (41%) estru metylowego kwasu 5-formylo-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego w postaci czerwonawego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J=7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,29 (d, J=6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 (t, J=7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 285 [M⁺].

Ester kwasu pirolokarboksylowego zhydrolizowano stosując metodę B z wytworzeniem (57%) kwasu 5-formylo-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego w postaci beżowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1-28 (d, J=6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 257 [M⁺].

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (120 mg, 0,31 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (wytworzono metodą C) z wytworzeniem 120 mg (71%) tytułowego związku ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH2), 7,30 (s, 1H, H-winylo), 7,26 (dd, J=1,8 & 7,8 Hz, 1H), 6,85 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2), 2,34 (q, J=7,1 Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J=6,9 Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J= 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)²), 0,86 (t, J=7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 565,1 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 38 (3-pirolidyn-l-ylpropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Kwas 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowy (127 mg, 0,28 mmol) skondensowano z 3-pirolidyn-1-ylo-propyloaminą (43 mg, 0, 336 mmol) z wytworzeniem 140 mg (66%) tytułowego związku ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J=8,1 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2), 2,30 (m, 4H, 2xCH2), 2,20 (t, J= 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,62 (m, 4H, 2xCH2), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,31 (d, J= 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 560 i 562 [M⁺ -1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 39 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (57,g. 0,27 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (120 mg) z wytworzeniem mg (53%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3)2 & CH2, 1,31 (d, J=6,9 Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J=7,0 Hz, 6H, N (CH2CH3)2.

MS-EI m/z 548 i 550 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 40

[3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)propylo]amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) skondensowano z [3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)propylo]amidem kwasu 5-formylo-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (300 mg) z wytworzeniem 65 mg tytułowego związku ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J= 8',1 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2), 2,24 (m, 8H, 4xCH2), 2,11 (m, 5H, CH2 & CH3),1,42 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J=7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2)

MS-EI m/z 589 i 591 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 41 kwas 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowy

PL 211 834 B1

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) skondensowano z kwasem 5-formylo-2-izopropylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowym (205 mg) stosując metodę D z wytworzeniem 210 mg (58%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,31 (s, br, 1H, NH), 11,16 (s, br, 1H, NH), 7, 26-7, 44 (m, 7H), 7,11 (s, 1H, H-winylo), 6,85 (d, J=7,8 Hz, 1H), 3,78 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,34 (d, J=6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2)

MS-EI m/z 452 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 42 (2-pirolidyn-l-yletylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-metylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)-amidem kwasu 5-formylo-2-metylo-4-fenylo-lH-pirolo-3-karboksylowego (70 mg, wytworzono w taki sam sposób jak izopropylowy analog powyżej) z wytworzeniem 0,03 g (27%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J=1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-winylo), 7,09 (m, 1H, CONHCH2), 6,83 (d, J=8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3xNCH2), 1,59 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/z 518 i 520 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 44 (2-dimetyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-metylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) skondensowano z (2-dimetyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2-metylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (65 mg) z wytworzeniem 60 mg (55%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, J= 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-winylo), 7,04 (m, 1H, CONHCH2), 6,77 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,16 (t, J=6,8 Hz, 2H, 3xNCH2), 2,02 (s, 6H, 2xNCH3).

MS m/z 493 i 494,8 [M⁺ i M⁺+2].

P r z y k ł a d 47 (3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2-metylo4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2-metylo-4-fenylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,75 g) z wytworzeniem 0,11 g (42%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,38 (q, J= 7,1 Hz, 4H, 2xNCH2CH3), 2,26 (t, J=6,9 Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J=7,1 Hz, 6H,

2xNCH2CH3).

MS-EI m/z 535,0 i 537 [M⁺ i M⁺+2].

P r z y k ł a d 48 (2-dimetyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Mieszaninę 3-oksomaślanu tert-butylu i azotynu sodu (1 równoważnik) w kwasie octowym mieszano w temperaturze pokojowej z wytworzeniem 2-hydroksimino-3-oksomaślanu tert-butylu.

3-Oksomaślan etylu (1 równoważnik), sproszkowany cynk (3,8 równoważnik) i surowy 2-hydroksimino-3-oksomaślan tert-butylu w kwasie octowym mieszano w 60°C przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną wylano na H2O i przesącz zebrano z wytworzeniem (65%) 2-tert-butyloksykarbonylo-3,5-dimetylo-4-etoksykarbonylopirolu.

Mieszaninę 2-tert-butyloksykarbonylo-3,5-dimetylo-4-etoksykarbonylopirolu i ortomrówczanu trietylu (1,5 równoważnik) w kwasie trifluorooctowym mieszano w 15°C przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną zatężono i resztę oczyszczono z wytworzeniem (64%) 2,4-dimetylo-3-etoksykarbonylo-5-formylpirolu w postaci żółtych igieł.

2,4-dimetylo-3-etoksykarbonylo-5-formylpirol poddano hydrolizie stosując metodę B z wytworzeniem (90%) kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego.

PL 211 834 B1 ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br s, 2H, NH i CO₂H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).

MS m/z 267 [M⁺].

5- bromo-1,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) skondensowano z (2-dimetyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,2 g, wytworzono metodą C) stosując metodę B z wytworzeniem 0,3 g (83%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J= 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-winylo), 7,44 (t, J=5,2 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J= 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,4 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 t, J=6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 430 i 432 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 49 (2-dimetyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6- fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) skondensowano z (2-dimetyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,2 g) z wytworzeniem 0,13 g (36%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (br, 1H, NH), 7,85 (d, J= 7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7, 65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H,), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 1,6 & 7,9 Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J= 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J= 6,8 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 428 [M⁺].

P r z y k ł a d 50 (2-dimetyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-chloro-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-chloro-1,3-dihydroindol-2-on (0,1 g, 0,6 mmol) skondensowano z (2-dimetyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,15 g) z wytworzeniem 0,22 g (90%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 7,96 (d, J=2,0 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-winylo), 7,50 (t, J= 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,12 (dd, J= 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J=8,3 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36 (t, J=6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 386 [M⁺].

P r z y k ł a d 51 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,2 g) z wytworzeniem 0,09 g (26%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 8,09 (d, J= 1,7 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-winylo), 7,42 (t, J= 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J=1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J=7,2 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EI m/z 458 i 460 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 52 (2-pirolidyn-1-ylo-etylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,1 g) z wytworzeniem 0,14 g (81%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,9 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-winylo), 7,53 (t, J= 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J= 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6),

6,81 (d, J= 8,5 Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH2), 2,54 (t, J=6,9 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, under DMSO), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1, 66-1, 69 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/z 456 i 458 [M⁺-1 i M⁺+1].

PL 211 834 B1

P r z y k ł a d 53 (3-imidazol-1-ylo-propylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) skondensowano z (3-imidazol-1-ylpropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,1 g) z wytworzeniem 0,1 g (59%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 8,09 (d, J=2,2 Hz, 1H, H-4), 7,77 (s, 1H, H-winylo), 7,71 (t, J= 5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J=2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J=8,4 Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, J=6,7 Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q, J=6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 467 i 469 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 56 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,1 g) stosując metodę B z wytworzeniem 7 9 mg (46%) tytułowego związku ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (br, 1H, NH), 8,15 (d, J=1,2 Hz, 1H),

7,81 (s, 1H, H-winylo), 7,71 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J=8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 0,96 (t, J=7,4 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EI m/z 456 [M⁺].

P r z y k ł a d 57 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (0,04 g, 0,2 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,04 g) z wytworzeniem tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (br, 1H, NH), 8,15 (d, J=1,0 Hz, 1H),

7.80 (s, 1H, H-winylo), 7,71 (d, J=7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, J=6,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J=7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2x NCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2), 2,55 (t, J=7,1 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, under DMSO), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 1,66 (m, 4H, 2xCH2).

MS-El m/z 454 [M+].

P r z y k ł a d 58 (3-imidazol-1-ylpropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

5- fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) skondensowano z (3-imidazol-1-ylpropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (10 mg) z wytworzeniem 10 mg (59%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (br, 1H, NH), 8,16 (d, J=1,2 Hz, 1H),

7.81 (s, 1H, H-winylo), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, J=6,5 Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q, J= 6,5 Hz, 2H, CONHCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 1,93 (m, 2H, CH2CH2CH2).

MS-EI m/z 465 [M⁺].

P r z y k ł a d 59 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6- fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (0,08 g, 0,4 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,1 g) z wytworzeniem 65 mg (38%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86. (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7, 47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J=1,2 Hz,' 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,2 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EI m/z 456 [M⁺].

PL 211 834 B1

P r z y k ł a d 60 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6-fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (40 mg) z wytworzeniem 5,9 mg (8,5%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J=1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3xNCH2), 2,55 (t, J=6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H,

2xCH2).

MS-EI m/z 454 [M⁺].

P r z y k ł a d 61 (3-imidazol-1-ylpropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6-fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) skondensowano z (3-imidazol-1-ylpropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (10 mg) z wytworzeniem 7,3 mg (43%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J=1,4 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J=1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J=6,9 Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NCH2 CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (t, J= 6,9 Hz, 2H, NCH2).

MS-EI m/z 465 [M⁺].

P r z y k ł a d 62 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-[6-(3,5-dichlorofenylo)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego 6-(3,5-dichlorofenylo)-1,3-dihydroindol-2-on (64 mg, 0,23 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu

5- formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (60 mg) z wytworzeniem 53 mg (44%) tytułowego związku w postaci jasnobrunatnego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J=7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH2), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, J=1,4 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58 (m, 6H, 3xNCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0/97 (t, J=6,8 Hz, 6H, 3xNCH2CH3).

MS m/z 526,9 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 63 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-pirydyn-3-ylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6- pirydyn-3-ylo-1,3-dihydroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (50 mg) uzyskując 29 mg (33%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H),

8.53 (d, J=5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-winylo), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2, 48-2, 55 (m, 3xNCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J= 6,9 Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EI m/z 457 [M⁺].

P r z y k ł a d 64 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-pirydyn-3-ylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6-pirydyn-3-ylo-1,3-dihydroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (75 mg) z wytworzeniem 90 mg (71%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego, ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J=1,5 Hz, 1H),

8.54 (dd, J=1,5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-winylo), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J=1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J=1,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/z 455 [M⁺].

PL 211 834 B1

P r z y k ł a d 65 (3-dimetyloaminopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-pirydyn-3-ylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6-pirydyn-3-ylo-1,3-dihydroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) skondensowano z (3-dimetyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (50 mg) z wytworzeniem mg (75%) tytułowego związku w postaci żółto-brunatnego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H),

8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-winylo), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J=1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J=1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2), 2,14 (s, 6H, 2xNCH3), 1,64 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 443 [M⁺].

P r z y k ł a d 66 (3-dimetyloaminopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) skondensowano z (3-dimetyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (81 mg) z wytworzeniem 40 mg (28%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2xNCH3), 1,63 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 442 [M+].

P r z y k ł a d 67 (3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-5-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

5- fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (2 g) z wytworzeniem 1,3 g (40%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH) , 8,14 (d, J=1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J=1,2 i'8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J=5,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J=7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J=8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 i 2xCH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J=6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/z 470 [M⁺].

P r z y k ł a d 68 (3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-6-fenylo-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

6- fenylo-1,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (2 g) z wytworzeniem 1,9 g (57%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J=7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J=7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J=1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 i 2xCH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J=6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/z 470 [M⁺].

P r z y k ł a d 69 (3-chloro-4-metoksyfenylo)amid kwasu 3-[4-(3-dietyloaminopropylkarbamoilo)-3,5-dimetylo-1H-pirolo-2-ylometylen]-2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-4-karboksylowego (3-chloro-4-methbxyfenylo)amid kwasu 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-4-karboksylowego (1 g, 3,16 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (1 g, 3,58 mmol) z wytworzeniem 1,7 g (85%) tytułowego związku w postaci żółtopomarańczowego ciała stałego.

MS-EI m/z 578,2, [M⁺].

P r z y k ł a d 70 (3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

PL 211 834 B1

5-bromo-1,3-ditiydroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (0,51 g) z wytworzeniem 0,84 g tytułowego związku w postaci czerwono-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,8 Hz, 1H, ArH), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, J=1,8 i 8,3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J=7,8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2xNCH2), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2 i 2xCH3), 2,4 (s, 6H, 2xCH3), 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J= 7,1 Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/z 472 i 474 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 71 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-diizopropylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-diizopropylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (150 mg) z wytworzeniem 0,15 g (62%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J=1,3 i 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8,1 Hz, 1H, ArH) 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH i NHCH2), 2,5 (br m, 6H, 3xNCH2), 1,28 (d, J=6,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,23 (d, J=6,6 Hz, 6H, 2xCH3), 0,96 (m, 6H, 2xCH2CH3).

MS-EI m/z 514 i 516 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 72 (3-dietyloaminopropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-diizopropylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) skondensowano z (3-dietyloaminopropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-diizopropylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (140 mg) z wytworzeniem 54 mg (25%) tytułowego związku w postaci czerwono-brunatnego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-winylo), 7,23 (dd, J=1,7 i 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J=8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2), 1,7 (brm, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J=6,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J=5,9 Hz, 6H, 2xCH3), 1,06 (m, 6H, 2xCH2CH3).

MS-EI m/z 528 i 530 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 73 (3-pirolidyn-1-ylpropylo)amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-diizopropylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) skondensowano z (3-pirolidyn-1-ylpropylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-diizopropylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (150 mg, 0,45 mmol) z wytworzeniem 36 mg (15%) tytułowego związku w postaci brązowo-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J=1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-winylo), 7,23 (dd, J=1,6 i 1,6 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J=7,6 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2), 1,7 (br m, 6H, 3xNCH2CH2), 1,28 (d, J = 5,6 Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J=5,7 Hz, 6H, 2xCH3).

MS-EI m/z 526 i 528 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 74 (pirydyn-4-ylometylo)-amid kwasu 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-bromo-1,3-dihydroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) skondensowano z (pirydyn-4-ylometylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (200 mg) z wytworzeniem 14 mg (4%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J=1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, J=6,0 Hz, 1H, CONHCH2), 8,11 (d, J=1,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-winylo), 7,31 (d, J=6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, J=1,9 & 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J=8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, J= 6,0 Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2xCH3).

MS-EI m/z 450 i 452 [M⁺-1 i M⁺+1].

P r z y k ł a d 75 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 5-[6-(4-butylfenylo)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

PL 211 834 B1

5- [6-(4-butylfenylo)]-1,3-dihydroindol-2-on (50 mg, 0,19 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (50 mg) z wytworzeniem 74 mg (76%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J=7,9 Hz, 1H),

7.63 (s, 1H, H-winylo), 7,54 (d, J=7,9 Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH2), 2, 52-2, 63 (m, 4H, 2xCH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2), 1,58 (m, 2H, CH2) / 1-34 (m, 2H, CH2), 0,91 (t, J= 7,2 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 510 [M⁺].

P r z y k ł a d 77 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 5-[6-(4-Etylofenylo)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

6- (4-Etylofenylo)-1,3-dihydroindol-2-on (45 mg, 0,19 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (50 mg) z wytworzeniem 60 mg (65%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 7,83 (d, J=8,4 Hz, 1H),

7.64 (s, 1H, H-winylo), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J=1 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, CH2), 2,63 (m, 2H, CH2CH3), 2,55 (m, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3),

1.67 (m, 4H, 2xCH2), 1,20 (t, J=7,5 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 482 [M⁺].

P r z y k ł a d 79 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 5-[6-(3-izopropylfenylo)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

6-(3-izopropylfenylo)-1,3-dihydroindol-2-on (48 mg, 0,19 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (50 mg) z wytworzeniem 59 mg (63%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J=7,8 Hz, 1H),

7.68 (s, 1H, H-winylo), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H, CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2), 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 4H, 2xCH2), 1,27 (d, J=6.9 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 496 [M⁺].

P r z y k ł a d 80 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-fluoro-1,3-dihydroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego z wytworzeniem 0,83 g (55%) tytułowego związku jako żółty zielony solid.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J=2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-winylo), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3xCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J=6,9 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 398 [M⁺].

P r z y k ł a d 80 (Alternatywna synteza) (2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-12-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Hydrat hydrazyny (55 %, 3000 ml) i 5-fluoroizatynę (300 g) ogrzewano do temperatury 100°C. Dodano porcjami dodatkową porcję 5-fluoro-izatyny (500 g) (100 g) w ciągu 120 minut z mieszaniem. Mieszaninę ogrzewano do temperatury 110°C i mieszano przez 4 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową z wytworzeniem surowego hydrazydu kwasu (2-amino-5-fluorofenylo)-octowego (748 g). Hydrazyd zawieszono w wodzie (700 ml) i pH mieszaniny nastawiono na < pH 3 12 N kwasem chlorowodorowym. Mieszaninę mieszano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową i przemyto dwukrotnie wodą. Produkt osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 5-fluoro-1,3-dihydro-indol-2-onu (600 g, 73% wydajności) w postaci brunatnego proszku.

¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3H, aromatyczny), 10,35 (s, 1H, NH).

MS m/z 152 [M+1].

PL 211 834 B1

Ester 4-etylowy estru 2-tert-butylowego kwasu 3,5-dimetylo-1H-pirolo-2,4-dikarboksylowego (2600 g) i etanol (7800 ml) mieszano energicznie równocześnie dodając powoli 10 N kwas chlorowodorowy (3650 ml). Temperaturę zwiększono z 25°C do 35°C i rozpoczęło się wydzielanie się gazu. Mieszaninę ogrzewano do 54°C i mieszano a następnie ogrzewano przez jedną godzinę, po którym to czasie temperatura wynosiła 67°C. Mieszaninę ochłodzono do 5°C i dodano powoli 32 l lodu i wody mieszając. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową i przemyto trzy razy wodą. Ciało stałe osuszono powietrzem do stałej wagi z wytworzeniem estru metylowego kwasu 2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (1418 g, 87% wydajności) w postaci różowawego ciała stałego.

¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 2,10, 2,35 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,13 (q, 2H, CH2), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85. (s, 1H, NH).

MS m/z 167 [M+1].

Dimetyloformamid (322 g) i dichlorometan (3700 ml) ochłodzono w łaźni lodowej do 4°C i dodano mieszając tlenochlorek fosforu (684 g). Powoli dodano stały ester metylowy kwasu 2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (670 g) do próbki w ciągu 15 minut. Maksymalna temperatura osiągnęła 18°C. Mieszaninę ogrzewano do temperatury wrzenia przez jedną godzinę, ochłodzono do 10°C w łaźni lodowej i szybko dodano 1,6 1 lodowatej wody intensywnie mieszając. Temperaturę zwiększono do 15°C. Dodano 10 N kwas chlorowodorowy (1,6 l) intensywnie mieszając. Temperaturę zwiększono do 22°C. Mieszaninę pozostawiono do odstania na 30 minut i pozwalając oddzielić się warstwom. Temperatura osiągnęła maksymalną wartość 40°C. pH warstwy wodnej nastawiono na 12-13 10 N wodorotlenkiem potasu (3,8 L) dodając go z taką prędkością aby osiągnąć i utrzymać temperaturę 55°C podczas dodawania. Po zakończeniu dodawania mieszanina ochłodzono do 10°C i mieszano przez 1 godzinę. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową i przemyto cztery razy wodą z wytworzeniem estru metylowego kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (778 g, 100% wydajności) w postaci żółtego ciała stałego.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ 1,25 (t, 3H, CH3), 2,44, 2,48 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH).

MS m/z 195 [M+1].

Ester metylowy kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (806 g), wodorotlenek potasu (548 g), wodę (2400 ml) i metanol (300 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu dwóch godzin mieszając i następnie ochłodzono do 8°C. Mieszaninę ekstrahowano dwukrotnie dichlorometanem. pH warstwy wodnej nastawiono na 4 1000 ml 10 N kwasem chlorowodorowym utrzymując temperaturę poniżej 15°C. Dodano wody w celu ułatwienia mieszania. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową, przemyto trzy razy wodą i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 50°C z wytworzeniem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (645 g, 93,5% wydajności) w postaci żółtego ciała stałego.

NMR (DMS0-d6) δ 2,40, 2,43 (2xs, 2x3H, 2xCH3), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH+COOH).

MS m/z 168 [M+1].

Kwas formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowy (1204 g) i 6020 ml dimetyloformamidu mieszano w temperaturze pokojowej równocześnie dodając chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo-3-etylokarbodiimidu (2071 g), hydroksybenzotriazol (1460 g), trietyloaminę (2016 ml) i dietyloetylenodiaminę (1215 ml). Mieszaninę mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono 3000 ml wody, 2000 ml z solanki i 3000 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i pH nastawiono na powyżej 10 10 N wodorotlenkiem sodu. Mieszaninę ekstrahowano dwukrotnie każdorazowo 5000 ml 10% metanolu w dichlorometanie i ekstrakty połączono, osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu i odparowano na wyparce obrotowej do suchej masy. Mieszaninę rozcieńczono 1950 ml toluenu i odparowano na wyparce obrotowej ponownie do suchej masy. Resztę roztarto z mieszaniną 3:1 heksan:eter dietylowy (4000 ml). Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową, przemyto dwukrotnie 400 ml octanu etylu i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 34°C w ciągu 21 godzin z wytworzeniem (2-dietyloaminoetylo)-amidu kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (819 g, 43% wydajności) w postaci jasnobrunatnego ciała stałego.

¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 0,96 (t, 6H, 2xCH3), 2,31, 2,38 (2xs, 2 x CH3), 2,51 (m, 6H 3xCH2), 3,28 (m, 2H, CH2), 7,34 (m, 1H, amid NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pirol NH).

MS m/z 266 [M+1].

(2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (809 g), 5-fluoro-1,3-dihydro-indol-2-on (438 g), etanol (8000 ml) i pirolidynę (13 ml) ogrzewano w temperatuPL 211 834 B1 rze 78°C przez 3 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową i przemyto etanolem. Ciało stałe mieszano z etanolem (5900 ml) w 72°C przez 30 minut. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową, przemyto etanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w 54°C przez 130 godzin z wytworzeniem (2-dietyloaminoetylo)-amidu kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (1013 g, 88% wydajności) w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 0,98 (t, 6H, 2xCH3), 2,43, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (q, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5H, aromatyczn, winyl, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pirol NH).

MS m/z 397 [M-1].

P r z y k ł a d 81 kwas 3-[4-(2-dietyloaminoetylokarbamoilo)-3,5-dimetylo-1H-pirolo-2-ylometylen]-2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-6-karboksylowy

Kwas 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-6-karboksylowy (80 mg, 0,45 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego z wytworzeniem 210 mg (92%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-winylo), 7,57 (dd, J=1,5 & 8,0 Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,88 (m, H-piperydyna), 2,54 (m, 6H, 3xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-piperydyna), 0,97 (t, J=6,98 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 424 [M⁺].

P r z y k ł a d 82 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 5-(5-dimetylosulfamoil-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Dimetyloamid kwasu 2-Okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowego (90 mg, 0,38 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo) amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (100 mg) z wytworzeniem 100 mg (54%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-winylo), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J=8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H, N(CH3)2), 2,56 (t, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/z 485 [M⁺].

P r z y k ł a d 83 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 5-[5-(3-chlorofenylosulfamoilo)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (3-chlorofenylo)amid kwasu 2-okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowy (120 mg, 0,38 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo) amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (100 mg) z wytworzeniem 150 mg (69%) tytułowego związku w postaci żółto-pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 10,30 (br s, 1H, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-winylo), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J=8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44. (m, 2H, CH2), 2,57 (t, J=7,0 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2).

MS m/z 568 [M⁺].

P r z y k ł a d 84 (2-pirolidyn-1-yletylo)amid kwasu 2,4-dimetylo-5-[2-okso-5-(pirydyn-3-ylsulfamoilo)-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-1H-pirolo-3-karboksylowego

Pirydyn-3-ylamid kwasu 2-Okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowy (110 mg, 0,38 mmol) skondensowano z (2-pirolidyn-1-yletylo) amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (100 mg) z wytworzeniem 150 mg (74%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J=2,0 Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-winylo), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2) / 2,56 (t, J= 7,06 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2).

MS m/z 535 [M⁺].

P r z y k ł a d 87

PL 211 834 B1 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-dimetylosulfamoil-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Dimetyloamid kwasu 2-Okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowego (90 mg, 0,38 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (100 mg) z wytworzeniem 80 mg (43%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, J=1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-winylo), 7,49 (dd, J=1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,07 (d, J=8,0 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,60 (s, 6H, N(CH3)2), 2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2xCH3 & N(CH2CH3)2, 0,96 (t, J=7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 487 [M⁺].

P r z y k ł a d 88 (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-[5-(3-chlorofenylosulfamoilo)-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (3-chlorofenylo)amid kwasu 2-Okso-2,3-dihydro-1H-indolo-5-sulfonowego (120 mg, 3,8 mmol) skondensowano z (2-dietyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (100 mg) z wytworzeniem 80 mg (37%) tytułowego związku w postaci żółtego ciała stałego.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J=1,87 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-winylo), 7,52 (dd, J=1,87 & 8,3 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,22 (t, J=8,02 Hz, 1H), 7,15 (t, J=2 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,48-2,57 (m, 6H, 3xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 570,1 [M⁺].

P r z y k ł a d 116 ester etylowy kwasu {[4-metylo-5-(4-metylo-5-metylosulfamoil-2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karbonylo]-amino}-octowego

Ester metylowy kwasu 4-metylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (lit. ref. D.O. Cheng, T. L. Bowman i E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) formylowano stosując metodę A, zhydrolizowano stosując metodę B, a następnie amidowanie (metoda C) z wytworzeniem estru etylowego kwasu [(5-formylo-4-metylo-1H-pirolo-3-karbonylo)-amino]-octowego.

4-metylo-5-metyloaminosulfonylo-2-oksindol (50 mg, 0,21 mmol) skondensowano z estrem etylowym kwasu [(5-formylo-4-metylo-1H-pirolo-3-karbonylo)-amino]-octowego (100 mg, 0,42 mmol) i piperydyna (0,1 ml) w etanolu (2 ml) z wytworzeniem 50 mg (52%) tytułowego związku ¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v.br. s, 1H, NH-CO), 8,33 (t, J=5,8 Hz, 1H, CONHCH2), 7,83 (d, J = 3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-winylo), 7,71 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3), 6,89 (d, J=8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J=7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J=5,8 Hz, 2H, GlyCH2), 2,86 (s, 3H, CH3), 2,48 (s, 3H, CH3), 2,42 (d, J=4,71 Hz, 3H, HNCH3), 1,20 (t, J=7,1 Hz/3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 460 [M⁺].

P r z y k ł a d 117 ester etylowy kwasu {[4-metylo-5-(5-metylosulfamoil-2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karbonylo]-amino}-octowego

Mieszaninę 5-metyloaminosulfonylo-2-oksindolu (0,06 g, 0,22 mmol), estru etylowego kwasu [(5-formylo-4-metylo-1H-pirolo-3-karbonylo)-amino]-octowego (0,075 g, 0,27 mmol) i piperydyny (2 krople) w etanolu (5 ml) ogrzewano w uszczelnionej probówce w 90°C przez 12 godzin. Po oziębieniu, osad zebrano przez filtrację próżniową, przemyto etanolem, roztarto z mieszaniną dichlorometan/eter i osuszono z wytworzeniem 0,035 g (36%) tytułowego związku w postaci żółtawo-brunatnego ciała stałego.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 11 (v.br. s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, J=5,7 Hz, 1H, CON3CH2), 8,25 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-winylo), 7,84 (d, J=3,3 Hz, 1H), 7,57 (dd, J1,9&8,5HZ, 1H), 7,14 (brm, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J=8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J=6,7 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J=5,7 Hz, 2H, GlyCH2), 2,55 (s, 3H, CH3), 2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J=6,7 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS m/z 446 [M⁺].

P r z y k ł a d 118 kwas ([4-metylo-5-(5-metylosulfamoil-2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karbonylo]-amino}-octowy

Mieszaninę estru etylowego kwasu [(5-formylo-4-metylo-1H-pirolo-3-karbonylo)-amino]-octowego (0,142 g, 0,59 mmol) i 1N NaOH (1,2 ml) w metanolu (10 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 1

PL 211 834 B1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną zatężono i resztę skondensowano z 5-metyloaminosulfonylo-2-oksindolem (0,13 g, 0,48 mmol) i piperydyna (0,12 ml) w etanolu (12 ml) z wytworzeniem 0,11 g (52%) tytułowego związku.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (br s, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J=3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, J=2 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (m on br.s, 2H), 6,97 (d, J=8,1 Hz, 1H), 3,41 (d, J=4,2 Hz, 2H, CH2NH), 2,54 (s, 3H, pirolo-CH3), 2,39 (s, 3H, ArCH3).

MS m/z 417 [M-1]⁺.

P r z y k ł a d 126 (2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-1Hpirolo-3-karboksylowego

Mieszaninę 1,3-dihydro-indol-2-onu (266 mg, 2 mmol), (2-dietyloaminoetylo)-amidu kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (530 mg, 2 mmol) i piperydyny (1 kropla) w etanolu ogrzewano w temperaturze 90°C przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, uzyskany osad zebrano przez filtrację próżniową, przemyto etanolem i osuszono z wytworzeniem 422 mg (55%) tytułowego związku w postaci jasnożółtego ciała stałego.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,7 (s, 1H, NR), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-winylo), 7,41 (t, J=5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J=1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,99 (dt, J=1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J=7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 381 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 127 (2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 5-(5-chloro-2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Mieszaninę 5-chloro-1,3-dihydro-indol-2-onu (335 mg, 2 mmol), (2-dietyloaminoetylo)-amidu kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (530 mg, 2 mmol) i piperydyny (1 kropla) w etanolu ogrzewano w temperaturze 90°C przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, uzyskany osad zebrano przez filtrację próżniową, przemyto etanolem i osuszono z wytworzeniem 565 mg (68%) tytułowego związku w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J=2,1 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H H-winylo), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J=2,1 & 8,4 Hz, 1H) 6,87 (d, J=8,4 Hz, 1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 415 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 128 (2-pirolidyn-1-etylo)-amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

1,3-dihydro-indol-2-on skondensowano z (2-pirolidyn-1-ylo-etylo) -amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego z wytworzeniem tytułowego związku

MS + ve APCI 379 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 129 (2-pirolidyn-1-ylo-etylo)-amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-fluoro-1,3-dihydro-indol-2-on skondensowano z (2-pirolidyn-1-ylo-etylo)-amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego z wytworzeniem tytułowego związku

MS + ve APCI 397 [M⁺+1].

Procedura powiększania skali:

Kwas 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowy (61 g), 5-fluoro-1,3-dihydro-indol-2-on (79 g), etanol (300 ml) i pirolidynę (32 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4,5 godziny. Dodano do mieszanina kwas octowy (24 ml) i ogrzewanie w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną kontynuowano przez 30 minut. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową i przemyto dwukrotnie etanolem. Ciało stałe mieszano przez 130 minut w 40% acetonie w wodzie (400 ml) zawierającym 12 N kwas chlorowodorowy (6,5 ml). Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową i przemyto dwukrotnie 40% acetonem w wodzie. Ciało stałe osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (86 g, 79% wydajności) w postaci pomarańczowego ciała stałego.

PL 211 834 B1 ¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 2,48, 2,50 (2xs, 6H, 2xCH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xm, 4H, aromatyczny i winylowy), 10,88 (s, 1H, CONR), 12,12 (s, 1H, COOR), 13,82 (s, 1H, pirol NH).

MS m/z 299 [M-1].

Kwas 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowy (100 g) i dimetyloformamid (500 ml) mieszano i dodano heksafluorofosforan benzotriazol-1-yloksytris(dimetyloamino)fosfoniowy (221 g), 1-(2-aminoetylo)pirolidynę (45,6 g) i trietyloaminę (93 ml). Mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze otoczenia. Stały produkt zebrano przez filtrację próżniową i przemyto etanolem. Ciało stałe przemyto z zawiesiny przez mieszanie w etanolu (500 ml) przez jedną godzinę w 64 °C i ochłodzono do temperatury pokojowej. Ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową, przemyto etanolem i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem (2-pirolidyn-1-ylo-etylo)-amidu kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1Hpirolo-3-karboksylowego (101,5 g, 77% wydajności).

¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 1,60 (m, 4H, 2xCH2), 2,40, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,57, 3,35 (2xm, 4H, 2XCH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4H, aromatyczny i winylowy), 10,88 (s, 1H, CONR), 13,67 (s, 1H, pirol NH).

MS m/z 396 [M+1].

P r z y k ł a d 130 (2-pirolidyn-1-ylo-etylo)-amid kwasu 5-(5-chloro-2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

5-chloro-1,3-dihydro-indol-2-on skondensowano z (2-pirolidyn-1-ylo-etylo)-amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego z wytworzeniem tytułowego związku

MS + ve APCI 413 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 131 (2-dimetyloaminoetylo)-amid kwasu 2,4-dimetylo-5-(2-okso-1,2-dihydro-indol-3-ylidenometylo)-1H-pirolo-3-karboksylowego

1,3-dihydro-indol-2-on skondensowano z (2-dimetyloaminoetylo)amidem kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego z wytworzeniem tytułowego związku ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NR), 10,90 (s, 1H, NR), 7,78 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H R-winylo), 7,48 (t, 1H, NR), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J=7,7 Hz, 1H), 3,31 (q, J=6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 353 [M⁺+1].

P r z y k ł a d 190

[2-(pirydyn-1-ylo)etylo]-amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego.

Kwas 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowy (120 mg, 0,4 mmol) wytrząsano z EDC, HCl (96 mg, 0,5 mmol), bezwodnym 1-hydroksybenztriazolem (68 mg, 0,5 mmol) i 2-(2-aminoetylopirydyną, zakupioną w firmie Aldrich, w bezwodnym DMF (3 ml) przez 2-3 dni w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 1M NaHCO3 (1,5 ml), następnie 8 ml wody. Wytrącony surowy produkt zebrano przez filtrację, przemyto wodą, osuszono i oczyszczono przez krystalizację lub chromatografię z wytworzeniem [2-(pirydyn-1-ylo)-etylo]amidu kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego.

P r z y k ł a d 193 (2-etyloaminoetylo)-amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (2-etyloaminoetylo)-amid kwasu 5-Formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (99 g), etanol (400 ml), 5-fluoro-2-oksindol (32 g) i pirolidynę (1,5 g) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3 godziny mieszając. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i ciało stałe zebrano przez filtrację próżniową. Ciało stałe mieszano w etanolu w 60°C, ochłodzono do temperatury pokojowej i zebrano przez filtrację próżniową. Produkt osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem (2-etyloaminoetylo)-amidu kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (75 g, 95% wydajności).

¹H-NMR (dimetylosulfotlenek-d6) δ 1,03 (t, 3R, CH3), 2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70, 3,30 (2xt, 4H, 2xCH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5xm, 5H, aromatyczny, winyl i CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, pirol NH).

MS m/z 369 [M-1].

PL 211 834 B1

P r z y k ł a d 195 (2-dietylo-N-oksoaminoetylo)-amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego

Metoda A:

(2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (598 mg) i dichlorometan (60 ml) w łaźni lodowej potraktowano kwasem 3-chloronadbenzoesowym (336 mg) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik odparowano na wyparce obrotowej i resztę zawieszono w metanolu (20 ml). Dodano wodę (20 ml) zawierającą wodorotlenek sodu (240 mg) i mieszaninę mieszano przez jedną godzinę. Osad zebrano przez filtrację próżniową, przemyto 5 ml wody i osuszono pod próżnią z wytworzeniem (2dietylo-N-oksoaminoetylo)-amidu kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (510 mg, 82 % wydajności) w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ 13,72 (br s, 1H, NR), 11,02 (br s, 1H, CONH), 9,81 (br s, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromatyczn), 7,70 (s, 1H, aromatyczn), 6,93 (td, 1H, aromatyczn), 6,84 (m, 1H, aromatyczn), 3,63 (m, 2R, CH2), 3,29 (m, 2R, CH2), 3,14 (m, 4R, 2xCH2), 2,47 (s, 1H, CH3), 2,45 (s, 3H, CH3), 1,64 (t, 6H, 2xCH3).

MS m/z 415 [M+1].

Metoda B:

(2-dietyloaminoetylo)-amid kwasu 5-Formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (10 g) zawieszono w dichlorometanie (100 ml) i ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano kwas 3-chloro-peroksybenzoesowy (13,1 g) mieszając i mieszaninę pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i następnie mieszano przez noc. Mieszaninę odparowano na wyparce obrotowej do suchej masy i poddano chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym eluując mieszaniną 20% metanol w dichlorometanie. Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano na wyparce obrotowej do suchej masy z wytworzeniem (2-dietylo-N-oksoaminoetylo)-amidu kwasu 5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (9 g, 83% wydajności).

(2-dietylo-N-oksoaminoetylo)-amid kwasu 5-Formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (9 g), 5-fluoro-1,3-dihydro-indol-2-on ((9 g, 83% wydajności)) i pirolidynę ((9 g, 83% wydajności (0,1 g) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w etanolu (30 ml) przez 4 godziny. Mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej i osad zebrano przez filtrację próżniową i przemyto etanolem. Ciało stałe mieszano w octanie etylu (30 ml), zebrano przez filtrację próżniową, przemyto octanem etylu i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem (2-dietylo-N-oksoaminoetylo)-amidu kwasu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenometylo]-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (10.3 g 80% wydajności) w postaci pomarańczowego ciała stałego.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ 13,72 (br s, 1H, NH), 11,02 (br s, 1H, CONH), 9,81 (br s, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromatyczn), 7,70 (s, 1H, aromatyczn), 6,93 (td, 1H, aromatyczn), 6,84 (m, 1H, aromatyczny), 3,63 (m, 2R, CH2), 3,29 (m, 2H, CH2), 3,14 (m, 4H, 2xCH2), 2,47 (s, 1H, CH3), 2,45 (s, 3H, CH3), 1,64 (t, 6R, 2xCH3).

MS m/z 415 [M+1].

P r z y k ł a d y 143-146

Postępując tak jak opisano w przykładzie 190 powyżej, ale zastępując 2-(2-aminoetylo)pirydynę przez 1-(2-aminoetylo)imidazolin-2-on (wytworzono przez ogrzewanie węglanu dimetylu z bis(2-aminoetylo)aminą (2 równoważniki) w uszczelnionej kolbie do 150°C przez 30 min., postępując zgodnie z procedurą opisaną w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr. Patent 2613212 (1950), firmy Rohm & Raas Co. Surowy produkt oczyszczono na krzemionce stosując jako eluent mieszaninę chloroformmetanol-wodny roztwór amoniaku 80:25:2) uzyskano pożądane związki.

P r z y k ł a d y 148-150 i 184

Postępując tak jak opisano w przykładzie 190 powyżej, ale zastępując 2-(2-aminoetylo)pirydynę przez ester etylowy kwasu 4-(2-aminoetylo)piperazyn-1-octowego (wytworzonego następująco: ester etylowy kwasu piperazyn-1-octowego (11,22 g) potraktowano jodoacetonitrylem (5,0 ml) w obecności węglanu potasu (6,9 g) w octanie etylu (260 ml) w 0°C. Po zakończeniu dodawania jodoacetonitrylu (45 min), mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 11 godzin. Mieszaninę reakcyjną przesączono i przesącze odparowano. Resztę uwodorniano w obecności borku kobaltowe56

PL 211 834 B1 go (wytworzono z COCI2 i borowodorku sodu) w temperaturze pokojowej przy 50 psi przez 2 dni w etanolu. Filtracja, odparowanie i chromatograficzne oczyszczanie z zastosowaniem jako eluenta mieszaniny chloroform-metanol-wodny roztwór amoniaku 80:25:2 uzyskano pożądaną aminę (3,306 g) w postaci jasnożółtego oleju) uzyskano pożądane związki.

P r z y k ł a d y 154-157

Postępując tak jak opisano w przykładzie 190 powyżej, ale zastępując 2-(2-aminoetylo)pirydynę przez 1-(3-aminopropylo)-azepin-2-on (wytworzony według procedury opisanej w Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14, z tym wyjątkiem, że hydrolizę DBU przeprowadzono w 145°C w czystej postaci w obecności wodorotlenku litu (1 godzina, 5 ml DBU, 2 ml wody, 420 mg hydratu wodorotlenku litowego). Oczyszczanie surowego produktu na krzemionce stosując jako eluent mieszaninę chloroform-metanol-wodny roztwór amoniaku 80:40:4 uzyskano 1-(3-aminopropylo)-azepin-2-on (4,973g, 87% wydajności) otrzymano pożądane związki.

P r z y k ł a d y 143-146

Postępując tak jak opisano w przykładzie 190 powyżej, ale zastępując 2-(2-aminoetylo)pirydynę przez 1-(3-aminopropylo)-tetrahydro-pirymidyn-2-on (wytworzono w taki sam sposób jak 1-(3-aminopropylo)-azepin-2-on według procedury opisanej w Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14: W skrócie, 1,3,4,6,7,8-heksahydro-2H-pyrimido[1,2-a]pirymidynę (4,939 g), hydrat wodorotlenku litowego (918 mg) i 2 ml wody ogrzewano bez rozpuszczalnika w uszczelnionym naczyniu do 145°C przez 1 godzinę. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z krzemionką z mieszaniną chloroformmetanol-wodny roztwór amoniaku 80:40:4 z wytworzeniem czystej aminy (5,265g, 94% wydajności).

P r z y k ł a d y 141, 160-161 i 185

Postępując tak jak opisano w Przykładach 190 powyżej, ale zastępując 2-(2-aminoetylo)pirydynę przez 1-(2-aminoetylo)-piperazyn-2-on (wytworzono następująco: Czysty chlorek tertbutylodifenylosililu (25 ml, 97,7 mmol) dodano kroplami do roztworu DBU (19,5 ml, 130 mmol) i bis(2-aminoetylo)aminy (4,32 ml, 40 mmol) w bezwodnym dimetyloacetamidzie (80 ml) w temperaturze pokojowej po oziębieniu w łaźni wodnej w ciągu 5 minut. Mieszaninę mieszano przez 5 godzin. Dodano czysty ester etylowy kwasu bromooctowego (6,70 ml, 60 mmol) po oziębieniu do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 25 minut, następnie odparowano pod wysoką próżnią. Resztę rozpuszczono w metanolu (200 ml), KHCO3 (10 g) i dodano KF (12 g, 200 mmol) i mieszaninę mieszano w 60°C przez 5 godzin. Dodano 10 g Na2CO3, mieszano przez 10 minut, ochłodzono i przesączono. Przesącze odparowano. Resztę ekstrahowano heksanami (2 razy 250 ml). Materiał nierozpuszczalny w heksanach rozpuszczono w etanolu (60 ml), przesączono i odparowano. Resztę oczyszczono na kolumnie z krzemionką z mieszaniną chloroform-metanol-wodny roztwór amoniaku 80:40:4 z wytworzeniem czystej aminy (4,245g, 74% wydajności)) uzyskano pożądane związki.

W celu wyszukania związków i wykazania optymalnego stopnia ich pożądanej aktywności stosowano następujące testy biologiczne.

A. Postępowanie testowe.

Poniżej opisane testy można stosować w celu określenia poziomu aktywności i wpływu różnych związków według niniejszego wynalazku na jedną lub wiele kinaz białkowych. Podobne testy można zaprojektować dla dowolnej kinazy

T a b l i c a 3

Przy- kład	bio flkGST IC50 (pM)	bio FGFR1 IC50 (pM)	bio PDGF IC50 (pM)	bio EGF IC50 (pM)	Komórka EGF IC50 (pM)	Kinaza Her2 IC50 (pM)	ck2spa IC50 (pM)	bio pyk2 IC50 (pM)
1	2	3	4	5	6	7	8	9
37	0,22		3,06	10,78	9,84	1,4
38	4,17		3,06	6,04	8,97	2,16
39	3,38		4,69	3, 67	14,54	3,53
40	4,5		7,9	6,52		6,27
42	0,1		0,12	11,95	74,55	20,43
44	<0,05		0,02	20,73	67,46	6,99
46	30,62		6,18	>100	>100	>100
47	0,08	1,56	0,06	11,42	41,54	8,4	>20	1,05

PL 211 834 B1

48	0, 006	0,3	<0,78	17,88	21,58	7,93		0,09
cd. tablicy 3
1	2	3	4	5	6	7	8	9
49			<0,78	>100	43,86	>100
50			<0,78	>100	20,34	>100
51	0,006	1,66	0,01	18,1	21,61	23,24	16,69	0,35
52	0,08	1,26	<0,78	12,53	>100	>100	10,66	0,45
53			<0,78	>100	>100	>100
56	2,32		3,19	>100	10,03	7,11
57	0,06		7,98	>100	9,97	6,94
58			21,14	>100	>100	MOO
59			<0,78	>100	>100	>100
60			<0,78	>100	>100	>100
61			<0,78	>100	>100	>100
62	8,00		8,32	>100	>100	>100
63	0,21		<0,78	8,59	>100	>100
64	0,55		<0,78	30,49	>100	>100
65	0,37		<0,05	>100	74,36	15,97
66	<0,05			>100	11,84	2,76
67	0,39		24,77	31,38	19,79	2,56
68	1,16		0,03	>100	23,52	34,13
70	0,09	1,50	0,0030	10,57	6,42	7,99	12,62	0,63
71	15,21		22,5	>100		9,91
72	6,06		10,54	>100	39,94	9,65
73	5,95		14,12	>100-	39,5	8,59
74	1,2		0,09	46,75		>100
75	2,7		61,55	>100		>100
77	0,49		25,01	>100		>100
79	1,49		>100	27,39		>100
80	0,13	4,29	0,001	>100		50,19	17,19	0,28
81	0,21		0,18	>100		>100
82	2,03	7,69	6,88	>100		>100		0,31
83	0,34	0,41	9,46	2,18		86, 9		0,008
84	1,38		12,51	67,2		5,86		0,006
87	3,27	7,56	6,46	>100		9,1		0,17
88	0,35	1,18	8,06	2,36		>100		0,09
116	>20		>100	>100		>100	<0,0005
117	0, 91		12,9	>100		MOO	0,006
118	1,93		1,2	>100		>100	0,002

PL 211 834 B1

Modele zwierzęce in vivo

Modele zwierzęce heteroprzeszczepów

Zdolność guzów człowieka do wzrostu, jako heteroprzeszczep w myszach pozbawionych grasicy (np. Balb/c, nu/nu) stanowi użyteczny model in vivo do badań odpowiedzi biologicznych guzów ludzkich na leczenie. Od czasu pierwszego, uwieńczonego sukcesem heteroprzeszczepu guzów człowieka myszom pozbawionym grasicy (Rygaard i Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), przeszczepiono szereg różnych linii komórkowych guzów człowieka (np. guzy sutka, płuc, moczowo-płciowe, żołądkowe-jelitowe, głowy i szyi, kości, oraz glejak i czerniaki złośliwe) myszom bezwłosym i utrzymano z powodzeniem ich wzrost. Poniżej wymienione testy można stosować w celu określenia poziomu aktywności, specyficzności i działania różnych związków według niniejszego wynalazku. Do oceny związków użyteczne są trzy ogólne rodzaje testów: komórkowy/katalityczny, komórkowy/biologiczny oraz in vivo. Przedmiotem testu komórkowego/katalitycznego jest ustalenie wpływu związku na zdolność TK do fosforylowania reszt tyrozynowych znanych substratów w komórce. Przedmiotem testu komórkowego/biologicznego jest ustalenie wpływu związku na odpowiedź komórkową, stymulowaną przez TK w komórce. Przedmiotem testów in vivo jest ustalenie wpływu związku na szczególne zaburzenie, takie jak rak, w modelu zwierzęcym.

Linie komórkowe, odpowiednie do doświadczeń z podskórnym heteroprzeszczepem, obejmują komórki C6 (glejak, ATCC Nr katalogowy CCL 107), komórki A375 (czerniak, ATCC Nr katalogowy CRL 1619), komórki A431 (rak naskórkowy, ATCC Nr katalogowy CRL 1555), komórki Calu 6 (płuca, ATCC Nr katalogowy HTB 56), komórki PC3 (prostata, ATCC Nr katalogowy CRL 1435), komórki SKOV3TP5 i zmodyfikowane genetycznie fibroblasty NIH 3T3 o nadmiernej ekspresji EGFR, PDGFR, IGF-IR lub dowolnej innej kinazy badanej. W celu przeprowadzenia doświadczeń z heteroprzeszczepem można zastosować następujący protokół:

Samice myszy pozbawionych grasicy (BALB/c, nu/nu) otrzymano w firmie Simonsen Laboratories (Gilroy). Wszystkie zwierzęta trzymano w warunkach pomieszczenia czystego w klatkach Micro-isolator z wyściółką Alpha-dri. Otrzymują one sterylną paszę dla gryzoni i wodę ad libitum.

Linie komórkowe hodowano w odpowiedniej pożywce (na przykład MEM, DMEM, F10 Hama lub F12 Hama plus 5% - 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM glutaminy (GLN)). O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie pożywki do hodowli komórek, glutaminę i płodową surowicę bydlęcą otrzymano w firmie Gibco Life Technologies (Grand Island). Wszystkie komórki hodowano w wilgotnej atmosferze 90-95% powietrza i 5-10% CO2 w temperaturze 37°C. Ze wszystkich linii komórkowych przygotowywano rutynowo hodowle następcze dwa razy na tydzień i testowano na zawartość mykoplazm przy użyciu sposobu Mycotect (Gibco) z wynikiem negatywnym.

Komórki zbierano przy osiągnięciu konfluencji przez trypsynizację z użyciem 0,05% trypsynyEDTA i osadzano przez wirowanie przy 450 x g przez 10 min. Osady zawieszano w sterylnym PBS lub pożywce (pozbawionej FBS) do uzyskania określonego stężenia i wszczepiano je myszom (8-10 myszy w grupie, 2-10x10⁶ komórek/zwierzę) w tylną część boku. Wzrost guza mierzono przez 3 do 6 tygodni, stosując skalowany cyrkiel (venier calipers). Objętość guza obliczano, o ile nie zaznaczono odmiennie, mnożąc jego długość przez szerokość i przez wysokość. Wartości P obliczano z zastosowaniem testu t Studenta. Związki badane w 50-100 μΐ zaróbki (DMSO lub VPD:D5W) można podawać przez iniekcję IP w różnych stężeniach, rozpoczynając ogólnie w pierwszym dniu po wszczepie.

Model inwazji guza

Opisany tutaj model inwazji guza opracowano dla oceny wartości leczniczej i skuteczności związków zidentyfikowanych, jako selektywne inhibitory receptora KDR/FLK-1 i w tym celu można ten model stosować.

Postępowanie

Jako zwierzęta doświadczalne stosowano samice myszy bezwłosych w wieku 8 tygodni (Simonsen Inc.). Wszczepienia komórek guza można dokonać pod wyciągiem o przepływie laminarnym. Jako środek znieczulający podawano dootrzewnowe koktajl ksylazyna/ketamina (100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny). Dokonywano cięcia (długość w przybliżeniu 1,5 cm) wzdłuż linii środkowej ciała w celu odsłonięcia jamy brzusznej i dokonania iniekcji komórek guza w ilości 10⁷ komórek w 100 μl pożywki. Komórki wstrzykiwano albo do dwunastniczego płata trzustki albo pod błonę surowiczą okrężnicy. Otrzewną i mięśnie zamykano szwem ciągłym przy użyciu nici jedwabnych 6-0, a skórę

PL 211 834 B1 zszywano przy pomocy klamerek do łączenia brzegów rany. Obserwację zwierząt przeprowadzano codziennie.

Analiza

Po upływie 2-6 tygodni, w zależności od ogólnych obserwacji zwierząt, myszy poświęcano, wycinano miejscowe przerzuty guza z różnych narządów (płuca, wątroba, mózg, żołądek, śledziona, serce, mięśnie) i analizowano (pomiar rozmiarów guza, stopień inwazyjności, immunochemia, określenie hybrydyzacji in situ, itp.).

Test na c-kit

Test ten stosuje się w celu wykrycia poziomu fosforylacji reszt tyrozynowych kinazy c-kit.

Komórki MOTE (ostra białaczka szpikowa człowieka) głodzono przez noc w pożywce zawierającej 0,1% surowicy. Przed stymulacją przez ligand, komórki poddawano działaniu związku (jednocześnie z głodzeniem surowiczym). Komórki stymulowano przy użyciu 250 ng/ml RH - SCF przez 15 minut. Po stymulacji komórki poddawano lizie i immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciw c-kit. Poziom fosfotyrozyny i białka określano z zastosowaniem blottingu Western.

Test proliferacji MTT

Komórki MOTE głodzono w pożywce zawierającej 0,1% surowicy krwi i poddawano działaniu związku jak opisano dla doświadczeń nad fosforylacja. Komórki wysiewano na płytki o 96 studzien₅ kach w ilości 4x10⁵ komórek/studzienkę w 100 pi RPMI + 10% surowicy. Dodawano rh-SCF (100 ng/ml) i inkubowano płytkę przez 48 godzin. Po upływie 48 godzin dodawano 10 μl roztworu MTT [bromek 3-(4,5-dimetytiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolu) o stężeniu 5 mg/ml i inkubowano przez 4 godziny. Dodawano kwaśny izopropanol (100 pl 0,04 N HCl w izopropanolu) i mierzono gęstość optyczną przy długości fali 550 nm.

Test na apoptozę

Komórki MOVE inkubowano +/- SCF i +/- związek w 10% FBS z rh-GM-CSF (10 ng/ml) i rh-IL-3 (10 ng/ml). Próbki testowano po upływie 24 i 48 godzin. Aby zmierzyć aktywowaną kaspazę-3, próbki przemywano przy użyciu PBS i zwiększano ich przepuszczalność stosując lodowaty 70% etanol. Następnie komórki barwiono przy pomocy poliklonalnych przeciwciał królika przeciw aktywnej kaspazie-3, sprzężonych z PE i analizowano z zastosowaniem FACS. Do pomiaru rozszczepionego PARP próbki poddawano lizie i analizowano przy pomocy western blotting, stosując przeciwciała przeciw PARP.

Testy dodatkowe

Testy dodatkowe, które można zastosować do oceny związków według wynalazku, włączają, bez ograniczania, test biologiczny na flk-1, test na receptor chimeryczny EGF - HER2 w całych komórkach, test biologiczny na src, test biologiczny na lek oraz test pomiaru funkcji fosforylacji raf. Protokoły dla każdego z tych testów można znaleźć w Zgłoszeniach Patentowych USA o numerze seryjnym 09/099,842, które włącza się tutaj jako odnośniki wraz z dowolnymi rysunkami.

Pomiar toksyczności komórek

Związki lecznicze powinny wykazywać silniejsze działanie hamujące aktywność receptorowych kinaz tyrozynowych niż działanie cytotoksyczne. Rozmiar skuteczności i toksyczności komórkowej związku można uzyskać przez określenie wskaźnika terapeutycznego, tj., IC50/ID50. Wartość IC50, dawki wymaganej do uzyskania 50% hamowania, można zmierzyć, stosując sposoby standartowe, takie jak tutaj opisane. Wartość ID50, czyli dawkowania, które daje w wyniku 50% toksyczności, można także zmierzyć stosując sposoby standartowe (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), przez pomiar ilości uwolnionego LDH (Korzeniewski i Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker i Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61) lub przez pomiar dawki letalnej w modelach zwierzęcych. Korzystne są związki o dużym wskaźniku terapeutycznym. Wskaźnik terapeutyczny powinien być wyższy niż 2, korzystnie przynajmniej 10, korzystniej przynajmniej 50.

B. Przykład wyników testu komórkowego z zastosowaniem (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego.

W celu potwierdzenia potencji (2-dietyloaminoetylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80), wykrywanego w testach biochemicznych (vide infra), oceniano zdolność wymienionego związku do hamowania zależnej od ligandu fosforylacji RTK w teście opartym na komórkach z zastosowaniem komórek myszy NIH-3T3, zmienionych w celu uzyskania nadmiernej ekspresji Flk-1 lub PDGFRp człowieka. (2-dietyloaminoetylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamował zależną od VEGF fosforylację reszt tyrozyny Flk-1 z wartością IC50 wyno60

PL 211 834 B1 szącą w przybliżeniu 0,03 μΜ. Wartość ta jest podobna do wartości K_i, wynoszącej 0,009 μΜ, określonej dla hamowania aktywności Flk-1 przez (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) w testach biochemicznych. Wskazuje to, że (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) łatwo wchodzi do komórek. Zgodnie z danymi biochemicznymi (vide infra) wskazującymi, że (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) wykazuje porównywalną aktywność hamującą dla Flk-1 i PDGFRp, stwierdzono również, że hamuje on zależną od PDGF fosforylację receptora w komórkach z wartością IC50 wynoszącą w przybliżeniu 0,03 μΜ. Zdolność (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) do hamowania c-kit, ściśle spokrewnionej RTK, która wiąże czynnik komórek macierzystych (SCF), określono przy użyciu komórek M07E, w których receptor ten ulega ekspresji. W komórkach tych (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamował zależną od SCF fosforylację c-kit z wartością IC50 wynoszącą 0,01-0,1 μΜ. Związek ten hamował także stymulowaną przez SCF fosforylację c-kit w komórkach blastycznych ostrej białaczki szpikowej (AML), izolowanych z krwi obwodowej pacjentów.

Poza badaniem zdolności (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) do hamowania zależnej od ligandu fosforylacji receptora w komórkach, zbadano również in vitro wpływ tego związku na zależną od ligandu odpowiedź proliferacyjną komórek (patrz tablica 4). W badaniach tych w komórkach spoczynkowych po całonocnym głodzeniu surowiczym indukowano syntezę DNA przez dodanie odpowiedniego ligandu pobudzającego mitozę. Jak przedstawiono w tablicy 4, (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamował indukowaną przez PDGF proliferację komórek NIH-3T3, w których PDGFRp lub PDGFRa ulegały nadmiernej ekspresji, z wartościami IC₅₀ wynoszącymi odpowiednio 0,031 i 0,069 μM, a indukowana przez SCF proliferacja komórek M07E ulegała hamowaniu z wartością i IC₅₀ wynoszącą 0,007 μΜ.

T a b l i c a 4

	Biochemiczne	Komórkowe IC50
Receptor	Ki1 (pM)	Fosforylacja receptora (μΜ)	Proliferacja zależna od ligandu (μΜ)
Flk-1/KDR	0,009	0,032	0,0043
PDGFRa	0,008	0,034	0,0314
PDGFRa	ND	ND	0,0695
FGFR	0,83	ND	0,73
c-kit	ND	0,01-0,16	0,0076
ND = Nie określono 1 Określono stosując rekombinacyjny enzym 2 Określono stosując pozbawione osocza komórki NIH-3T3 ekspresji Flk-1 3 Określono stosując pozbawione osocza HUVEC 4 Określono stosując pozbawione osocza komórki NIH-3T3 ekspresji PDGFRa 5 Określono stosując pozbawione osocza komórki NIH-3T3 ekspresji PDGFRp 6 Określono stosując pozbawione osocza komórki M07E

Jak przedstawiono w tablicy 4, aktywności biochemiczne i komórkowe (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) są ogólnie zgodne, co potwierdza wniosek, że związek ten przechodzi przez błony komórkowe. Ponadto można stwierdzić, że odpowiedzi komórkowe są wynikiem hamującej aktywności związku 80 w stosunku do wskazanego celu. Jeżeli natomiast badano in vitro wpływ (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) w obecności kompletnej pożywki hodowlanej, zdecydowanie wyższe stężenia (>10 μΜ) były niezbędne do zahamowania wzrostu różnorodnych komórek guzów człowieka (patrz tablica 5). Wskazuje to, że związek w stężeniach koniecznych do hamowania zależPL 211 834 B1 nych od ligandu fosforylacji receptora i proliferacji komórek nie hamuje bezpośrednio wzrostu tych komórek.

PL 211 834 B1

T a b l i c a 5

Linia komórkowa	Pochodzenie	IC50 (μΜ)	ID50 (μΜ)
HT29	Rak okrężnicy	10	22
A549	Rak płuca	9,5	22
NCI-H460	Rak płuca NSC	8,9	20
SF767T	Glejak	7,9	14
A431	Rak skóry	6,0	18

W skrócie, wyniki przedstawione w tablicy 5 otrzymano przez inkubację komórek przez 48 godz. w kompletnej pożywce hodowlanej w obecności seryjnych rozcieńczeń (2-dietyloaminoetylo) amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego. Pod koniec okresu wzrostu określano względną liczbę komórek. Wartości IC50 obliczono jako stężenie związku, które hamowało wzrost komórek o 50% w stosunku do komórek nie poddanych działaniu związku. Wartości ID50 obliczono jako stężenie związku, które powodowało zmniejszenie liczby komórek o 50% w stosunku do liczby komórek na początku doświadczenia.

Bardziej stosownym, opartym na komórkach testem do oceny potencjału (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) do hamowania rozwoju naczyń jest test wywoływania mitozy in vitro z zastosowaniem komórek śródbłonka żyły pępkowej człowieka (HUVECs) jako układu modelowego proliferacji komórek śródbłonka, krytycznej w procesie rozwoju naczyń. W teście tym indukuje się odpowiedź mitotyczną, mierzoną, jako wzrost syntezy DNA, w głodzonych surowicze komórkach HUVEC przez dodanie VEGF lub FGF. W tych komórkach (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamował indukowaną przez VEGF i FGF odpowiedź mitotyczną w sposób zależny od dawki z wartościami IC50 wynoszącymi odpowiednio 0, 004 μΜ i 0,7 μΜ, jeżeli związek był obecny podczas 48-godzinnego testu.

W skrócie, wymienione wcześniej wyniki otrzymano stosując komórki HUVEC głodzone surowicze, które inkubowano przez 24 godz. z VEGF (100 ng/ml) lub FGF (30 ng/ml) w stężeniach pobudzających mitozę i w obecności seryjnych rozcieńczeń (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80). Odpowiedź mitotyczną podczas następujących 24 godz. w obecności ligandu i inhibitora mierzono ilościowo, dokonując pomiaru syntezy DNA w oparciu o inkorporację bromodezoksyurydyny w DNA komórki.

W oddzielnych doświadczeniach związek 80 hamował zależną od VEGF fosforylację ERK 1/2 (kinaza p42/4 4MAP), wczesny cel Flk-1/KDR, w sposób zależny od dawki. Wykazano również, że aktywność hamująca związku 80 jest długotrwała w tym układzie; hamowanie zależnej od VEGF fosforylacji ERK 1/2 w następstwie krótkiego (2 godz.) wystawienia na działanie mikromolarnych stężeń (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) trwało przez 48 godzin po usunięciu związku z pożywki.

VEGF uznano za istotny czynnik przeżycia dla komórek śródbłonkowych. Ponieważ (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamuje zależną od VEGF odpowiedź mitotyczną komórek HUVEC, zbadano wpływ związku na przeżycie komórek HUVEC. W doświadczeniach tych stosowano rozszczepienie substratu kaspazy 3, polimerazy poli-ADP-rybozylowej (PARP), jako odczyt dla apoptozy. Komórki HUVEC, hodowane w warunkach pożywki nie zawierającej surowicy przez 24 godziny, wykazywały znaczny poziom rozszczepienia PARP, wykrywanego w postaci nagromadzania fragmentu PARP o masie 23 kDa. Zjawisku temu zapobiega dodanie VEGF do pożywki komórkowej, co wskazuje, że VEGF działa, jako czynnik przeżycia w tym teście. Wykazano, że (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamuje sygnalizację za pośrednictwem KDR. Odpowiednio, (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamował w sposób zależny od dawki przeżycie komórek HUVEC, w którym pośredniczy VEGF. Tak więc dane te wskazują, że związek 80 indukuje apoptozę hodowlanych komórek śródbłonka w obecności VEGF.

PL 211 834 B1

C. Badania skuteczności in vivo

i. Skuteczność przeciw ustalonym heteroprzeszczepem guza

Skuteczność (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) in vivo badano w modelu podskórnego (SC) heteroprzeszczepu przy użyciu komórek guza człowieka, wszczepionych myszom pozbawionym grasicy w obszarze tylnej części boku. Po wszczepieniu pozawalano na ustalenie guzów do rozmiarów ₃

100-550 mm³ przed rozpoczęciem doustnego leczenia za pomocą związku.

Dzienne podawanie doustne związku 80 powodowało zależne od dawki hamowanie wzrostu ₃ guza A431, jeżeli leczenie rozpoczynano po osiągnięciu przez guz rozmiarów 400 mm³. Statystycznie znaczące (P <0,05) hamowanie wzrostu guza obserwowano przy dawkach wynoszących 40 mg/kg/dzień (74% hamowania) i 80 mg/kg/dzień (84% hamowania) (patrz tablica 6). We wstępnych doświadczeniach wyższa dawka (160 mg/kg/dzień) związku nie była skuteczniejsza w odniesieniu do ustalonych guzów A431 niż dawka wynosząca 80 mg/kg/dzień. Ponadto myszy leczone dawką 160 mg/kg/dzień związku traciły na wadze, co wskazuje, że wyższa dawka nie była dobrze tolerowana. Podobne wyniki ₃ otrzymano w doświadczeniu, w którym guzom A431 pozwalano osiągnąć tylko rozmiary 100 mm³ (patrz tablica 5). W tym drugim doświadczeniu u sześciu spośród ośmiu zwierząt nastąpiła całkowita regresja guzów w wyniku leczenia prowadzonego przez 21 dni przy dawce wynoszącej 80 mg/kg/dzień. U tych sześciu zwierząt nie doszło do powtórnego rozrostu guza podczas okresu obserwacji po zakończeniu leczenia, wynoszącego 110 dni. U dwóch zwierząt, u których guzy powtórnie rozrosły się do dużych ₃ rozmiarów (2000-3000 mm³), uległy one regresji w odpowiedzi na powtórzenie leczenia przy użyciu związku 80. Co jest istotne, we wszystkich skutecznych doświadczeniach, dawki (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) wynoszące 80 mg/kg/dzień były dobrze tolerowane nawet w przypadku ciągłego podawania przez okres czasu dłuższy niż 100 dni.

T a b l i c a 6

Początkowa objętość guza (mm3)	Związek1 (mg/kg/dzień)	% Hamowania (dzień)	Wartość P
400	80	84 (36)	0,001
40	74 (36)	0,003
20	51 (36)	0,130
100	80	93 (40)	0,002
40	75 (40)	0,015
10	61 (40)	0,059
1Związek 80

W skrócie, wyniki przedstawione w tablicy 6 otrzymano z zastosowaniem komórek A431 (0,5x10⁶ komórek/mysz), które wszczepiano podskórnie myszom pozbawionym grasicy w obszarze tylnej części boku. Kiedy guzy osiągnęły wskazaną objętość średnią, rozpoczęto dzienne podawanie doustne (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) w nośniku opartym na Kremoforze lub kontroli, zawierającej jedynie nośnik. Guzy mierzono przy użyciu skalowanego cyrkla i obliczano ich objętość przez mnożenie długość x szerokość x wysokość. Wartości P obliczano stosując test t-Studenta dla powiązanych par wyników na podstawie porównania rozmiarów guzów u zwierząt leczonych związkiem 80 (n=8) i t rozmiarów guzów u zwierząt, którym podawano jedynie nośnik (n=16), w ostatnim dniu doświadczenia.

Skuteczność związku 80 w odniesieniu do ustalonych guzów człowieka o różnym pochodzeniu określano z zastosowaniem heteroprzeszczepów Colo205 (rak okrężnicy), SF763T (glejak), i NCI-H460 (niedrobnokomórkowy rak płuc) (patrz tablica 7). Doświadczenia te przeprowadzono stosując (2-dietyloaminoetylo) amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) podawany doustnie w dawce wynoszącej 80 mg/kg/dzień, która była skuteczna i dobrze tolerowana.

PL 211 834 B1

T a b l i c a 7

	Typ guza	Początkowa objętość guza (mm3)	% Hamowania (dzień)	Wartość P
A4311	Skóra	100	93 (40)	0,002
A4311	Skóra	400	84 (36)	0,001
Colo205	Okrężnica	370	77 (54)	0,028
NCI-H460	Płuco	300	61 (54)	0,003
SF763T	Glejak	550	53 (30)	0,001
1 Dane z doświadczenia przedstawionego w tablicy 5

W wyżej wymienionych doświadczeniach związek 80 podawano raz dziennie w ilości 80 mg/kg w nośniku opartym na Kremoforze, kiedy guzy osiągnęły wskazaną objętość. Po zakończeniu doświadczeń obliczano procent hamowania w porównaniu do kontrolnej grupy zwierząt, którym podawano jedynie nośnik. Wartości P obliczano stosując test t-Studenta dla powiązanych par wyników na podstawie porównania rozmiarów guzów u zwierząt leczonych związkiem 80 (n=8) i rozmiarów guzów u zwierząt, którym podawano jedynie nośnik (n=16).

Chociaż (2-dietyloamino-etylo)amid kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego (związek 80) hamował wzrost wszystkich rodzajów guzów, przedstawionych w tablicy 7, odpowiedzi różnych modeli heteroprzeszczepów były różne. W szczególności, wzrost guzów NCI-H460 i SF763T ulegał zatrzymaniu lub ogromnemu spowolnieniu, podczas gdy guzy Colo205, podobnie jak guzy A431, ulegały regresji podczas leczenia za pomocą (2-dietyloamino-etylo)amidu kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego.

Aby określić podstawy molekularne różnic w odpowiedzi modeli heteroprzeszczepów, badano guzy SF763T. W tym celu guzy SF763T, które były mniej wrażliwe na leczenie (2-dietyloamino-etylo)amidem kwasu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihydroindolo-3-ylidenometylo)-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksylowego, oceniono na poziomie molekularnym, stosując techniki immunohistologiczne do zbadania wpływu podawania związku. Badania te prowadzono początkowo na tym rodzaju guza, ponieważ guzy SF763T są silnie unaczynione naczyniami kapilarnymi, w których marker komórek śródbłonka CD31 ulega silnej ekspresji i skutkiem tego są one odpowiednie do badań nad gęstością naczyń kapilarnych guzów (MVD). Immunohistologiczna ocena guzów SF763T wskazuje, że zgodnie z mechanizmem działania związku 80, prowadzącym do hamowania rozwoju naczyń, guzy u zwierząt poddanych leczeniu wykazują zmniejszoną wartość MVD w stosunku do zwierząt kontrolnych, którym podawano nośnik; wartość MVD wynosiła 24,2 ± 4,1 u zwierząt leczonych związkiem 80, w porównaniu z wartością 39,3 ± 5,7 u zwierząt kontrolnych, którym podawano tylko nośnik. Zgodnie z przewidywaniami, związanymi z zatrzymaniem wzrostu guzów, obserwowano bardzo dostrzegalne hamowanie proliferacji komórek guza w guzach poddanych działaniu związku 80. Wskaźnik mitotyczny tych guzów miał wartość o połowę niższą niż wskaźnik guzów, poddanych działaniu nośnika (dane nie przedstawione). Wpływ związku 80 na MVD i proliferację komórek guza wskazuje, że związek wykazuje ogromne działania hamujące rozwój naczyń i rozwój guzów, nawet w warunkach, w których guzy nie ulegają regresji.

Zdolność związku 80 do hamowania fosforylacji PDGFR i wynikłej sygnalizacji in vivo badano także w guzach SF763T, w których PDGFR3 ulega silnej ekspresji. Poddawanie guzów SF763T działaniu związku 80 silnie hamuje fosforylację tyrozynową PDGFR3 w ustalonych guzach SF763T. Związek 80 obniżał również poziom ufosforylowanej (aktywowanej) fosfolipazy C gamma (PLC-γ), bezpośredniego wskaźnika aktywacji PDGFR. Dane te wykazują, że podawanie doustne związku 80 powoduje bezpośredni wpływ na aktywność celu (PDGFR) w guzach in vivo.

W oparciu o wykazanie, że zdolność związku 80 do hamowania zależnej od VEGF sygnalizacji w komórkach HUVEC in vitro jest długotrwała (patrz powyżej), oceniono skuteczność związku przy użyciu modelu guza Colo205 przy rzadkim podawaniu związku. Jak przedstawiono w tablicy 8, dawki 80 mg/kg (hamowanie 91%) i 40 mg/kg (hamowanie 84%) były skuteczne przy podawaniu dziennym, ale nieskuteczne przy podawaniu dwa razy tygodniowo. Natomiast wyższa dawka związku 80 (160 mg/kg) podawana dwa razy tygodniowo doprowadziła do hamowania (hamowanie 52%) wzrostu ustalonych guzów Colo205, co sugeruje, że związek ten może wykazać skuteczność przy rzadkim podawaniu wyższych

PL 211 834 B1 dawek. Należy zaznaczyć, że reżim dawkowania może określić przeciętny specjalista w dziedzinie bez potrzeby nadmiernego przeprowadzania doświadczeń.

T a b l i c a 8

Dawka (mg/kg)	Częstotliwość	% Hamowania	Wartość P
160	Dwukrotnie w ciągu tygodnia	52	0,085
	Jednokrotnie w ciągu tygodnia	17	NS
80	Dziennie	91	0,039
	Dwukrotnie w ciągu tygodnia	19	NS
	Jednokrotnie w ciągu tygodnia	0	NS
40	Dziennie	84	0,028
	Dwukrotnie w ciągu tygodnia	36	NS
NS: nie znaczące (P >0,05)

W skrócie, wyniki przedstawione w tablicy 8 otrzymano z zastosowaniem komórek Colo205 (0,5x10⁶ komórek/mysz), które wszczepiano podskórnie myszom pozbawionym grasicy w obszarze tylnej części boku. Doustne podawanie związku 80 zgodnie ze wskazanym harmonogramem rozpoczęto, kiedy guzy osiągnęły rozmiar 400 mm^A Guzy mierzono przy użyciu skalowanego cyrkla i obliczano ich objętość przez mnożenie długość x szerokość x wysokość. Wartości P obliczano w ostatnim dniu doświadczenia stosując test t-Studenta dla powiązanych par wyników na podstawie porównania rozmiarów guzów u zwierząt leczonych związkiem 80 i rozmiarów guzów u zwierząt, którym podawano jedynie nośnik.

ii. Skuteczność związku 80 w modelu choroby rozsianej

Rozwój naczyń nie tylko wspomaga podtrzymywany wzrost litych guzów pierwotnych, ale jest także zasadniczym składnikiem wspomagającym rozwój choroby rozsianej, spowodowanej przez przerzuty guza pierwotnego. Wpływ związku 80 na rozwój choroby rozsianej badano z zastosowaniem modelu kolonizacji płuc myszy przez czerniaka B16-F1. W modelu tym komórki B16-F1, wszczepione dożylnie w żyłę ogonową myszy pozbawionych grasicy, kolonizują płuca i tworzą guzy. Jak przedstawiono w Tablicy 8, doustne podawanie związku 80 w dawce 80 mg/kg/dzień skutecznie zmniejsza obciążenie płuc komórkami B16-F1, co oceniono na podstawie pomiarów całkowitej wagi płuc. Dane te sugerują, że związek 80 może hamować chorobę rozsianą in vivo.

T a b l i c a 9

	Waga płuca (g)	% Hamowania	Wartość P
Rozczynnik	0,83 ± 0,07	-	-
Związek1	0,41 ± 0,04	50	< 0,001
1 Związek 80

W skrócie, wyniki przedstawione w tablicy 9 otrzymano przy użyciu myszy pozbawionych grasi₅ cy (athymic mice), którym wszczepiono komórki guza B16-F1 (5x10⁵ komórek/mysz) przez żyłę ogonową. Przez 24 dni po wszczepieniu komórek guza myszom podawano codziennie doustnie związek 80 w ilości 80 mg/kg/dzień (n=10) lub zaróbkę (n=18). Pod koniec okresu podawania myszy poświęcano i ważono ich płuca. Procent hamowania obliczano na podstawie porównania wagi płuc zwierząt, którym podawano związek 80, z wagą płuc zwierząt, którym podawano jedynie zaróbkę. Wartości P określono z zastosowaniem testu t-Studenta dla powiązanych par wyników. D. Przykłady aktywności biologicznej.

Przykłady potencji związków według niniejszego wynalazku in vitro przedstawiono w tablicy 2.

Wniosek

Badania nad charakterystyką farmakokinetyczną związków w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku wykazały, że podawanie doustne pojedynczej dawki wymienionych związków daje w wyniku wysoką doustną dostępność biologiczną u myszy. Dobra doustna dostępność

PL 211 834 B1 biologiczna i liniowa farmakokinetyka wskazują, że związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku posiadają korzystną charakterystykę farmakokinetyczną.

Ponadto związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku są silnymi inhibitorami aktywności kinazy tyrozynowej receptorowych kinaz tyrozynowych z domeną rozszczepionej kinazy (split-kinase domain), Flk-1/KDR i PDGFR, które są zaangażowane w rozwój naczyń oraz RTK c-kit, receptora czynnika komórek macierzystych (SCF), który jest związany z pewnymi rodzajami raka hematologicznego. Przy wyższych stężeniach związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku hamują również aktywność kinazy tyrozynowej FGFR-1, trzeciej RTK zaangażowanej w rozwój naczyń. Zgodnie z ich aktywnością biochemiczną, związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku hamują in vitro zależną od ligandu fosforylację tyrozyn docelowych RTK i odpowiedź mitotyczną komórek takich jak: komórki śródbłonka żyły pępkowej człowieka (HUVEC) po stymulacji przez VEGF lub FGF, komórki NIH-3T3, w których PDGFR ulega ekspresji, po stymulacji przez PDGF oraz komórki ostrej białaczki szpikowej M07E po stymulacji przez SCF. Związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku nie hamują natomiast bezpośrednio proliferacji komórek guza w pełnej pożywce hodowlanej, z wyjątkiem stężeń 2 do 3 rzędów wielkości wyższych niż wymagane do hamowania zależnych od ligandu odpowiedzi mitotycznych. W badaniach nad heteroprzeszczepami u myszy związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku hamowały wzrost ustalonych guzów człowieka o różnym pochodzeniu w sposób zależny od dawki i przy stężeniach, które były dobrze tolerowane nawet podczas przedłużonego (> 100 dni) dawkowania. Przy dawce 80 mg/kg/dzień, związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku indukowały regresję dużych ustalonych guzów A431 i Colo205 oraz powodowały znaczące zahamowanie wzrostu lub zastój guzów SF763T i NCIH460. U myszy z guzami SF763T związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku powodowały zmniejszenie: gęstości naczyń kapilarnych, fosforylacji PDGFR w guzach i wskaźnika mitotycznego komórek guza. Przy takiej dawce związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku hamowały również kolonizację płuc przez komórki guza B16-F1 w modelu przerzutów guza. Badania reżimu wykazały, że związki w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku są najbardziej skuteczne przy podawaniu dziennym. Bezpośredni dowód na zdolność związków w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku do hamowania rozwoju naczyń stanowią guzy SF763T, w których gęstość naczyń kapilarnych ulegała zmniejszeniu. Bezpośredni dowód na zdolność związków w korzystnych sposobach wykonania według niniejszego wynalazku do hamowania fosforylacji PDGFR i sygnalizacji in vivo otrzymano z zastosowaniem guzów SF763T.

Podsumowując, przedstawione powyżej dane popierają pogląd, że związki według korzystnych sposobów wykonania wynalazku, podawane doustnie, są środkami antyangiogennymi w procesie leczenia raka, włączając w to guzy lite i nowotwory hematologiczne, w których rozwój naczyń i/lub sygnalizacja za pośrednictwem c-kit są ważnymi czynnikami patologii choroby.

Szacuje się, że jeżeli związki, sposoby i kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku są skuteczne w modulacji aktywności kinaz białkowych, to można oczekiwać, że będą one skuteczne również jako środki lecznicze przeciwko zaburzeniom związanym z RTK, CTK oraz STK.

Claims (11)

1. Związek 2-indolinowy o wzorze (I):

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym:

R¹ jest wybrane z grupy obejmującej wodór, (C1-C4)alkil, i -C(O)NR⁸R⁹;

2 13 14

R² jest wybrane z grupy obejmującej wodór, fluorowiec, fenyl, oraz -S(O)2NR¹³R¹⁴;

3 15

R³ jest wybrane z grupy obejmującej wodór, pirydynyl, -C(O)OR¹⁵ i fenyl, korzystnie podstawiony przez 1-2 podstawniki wybrane z grupy obejmującej fluorowiec i (C1-C4)alkil;

R⁴ oznacza wodór, ₅

R⁵ oznacza wodór lub (C1-C4)alkil;

R⁶ oznacza -C(O)R¹⁰;

R⁷oznacza (C1-C4) alkil lub fenyl;

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane spośród grupy obejmującej wodór i fenyl, korzystnie podstawiony przez 1-2 podstawniki wybrane z grupy obejmującej fluorowce;

R¹⁰ oznacza -N(R¹¹) (CH₂)_nR¹², gdzie n oznacza 1, 2, lub 3,

11 12

R¹¹ oznacza wodór, a R¹² jest wybrane spośród grupy obejmującej hydroksyl, heteroaryl zawie15 rający w pierścieniu 5-6 atomów z czego jeden stanowi atom N, a pozostałe są atomami C, -C(O)R¹⁵, oraz-NR¹³R¹⁴;

13 14

R¹³ i R¹⁴ są niezależnie wybrane spośród grupy obejmującej wodór, (C1-C4)alkil, pirydynyl, i fenyl, korzystnie podstawiony przez fluorowiec; albo

13 14

R¹³ i R¹⁴ mogą być połączone tworząc grupę heterocykliczną zawierającą 5-7 atomów w pierścieniu, z czego jeden lub dwa atomy stanowią atomy N, a pozostałe są atomami C, korzystnie podstawioną przez grupę okso;

R¹⁵ oznacza wodór, hydroksyl, i (C1-C4)alkoksyl, gdzie alkoksyl oznacza O-alkil.

13 14

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że R¹³ i R¹⁴ są niezależnie wybrane spośród grupy obejmującej wodór, (C1-C4)alkil, i pirydynyl, lub połączone -(CH2)4-, -(CH2)5-, i -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

12 13 14

3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że n oznacza 2 lub 3; a R¹² oznacza -NR¹³R¹⁴,

13 14 którym R¹³ i R¹⁴ niezależnie oznaczają (C1-C4)alkil.

12 13 14

4. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że n oznacza 2 lub 3; a R¹² oznacza -NR¹³R¹⁴,

13 14 w którym R¹³ i R¹⁴ są połączone tworząc grupę wybraną spośród -(CH2)4-, -(CH2)5-, lub -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

5. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że R¹ oznacza -C(O)NR⁸R⁹, gdzie R⁸ jest wodorem, a R⁹ jest fenylem, ewentualnie podstawionym przez 1-2 podstawniki wybrane z grupy obejmującej fluorowce.

6. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze:

PL 211 834 B1

F

Η lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą.

7. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem o wzorze:

O

F.

H lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą.

8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, znamienna tym, że jako związek aktywny zawiera związek określony w zastrz. 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jako związek aktywny zawiera związek określony w zastrz. 6 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

10. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 albo 6, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, do wytwarzania leku do leczenia chorób raka wybranych z grupy obejmującej raka płaskokomórkowego, gwiaździaka, mięsaka Kaposiego, glejaka niedojrzałego, raka płuc, raka pęcherza, raka głowy i szyi, czerniaka, raka jajnika, raka prostaty, raka piersi, drobnokomórkowego raka płuc, glejaka, raka okrężnicy, raka narządów moczowo-płciowych i raka żołądkowe-jelitowego.

11. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 albo 6, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, do wytwarzania leku do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej takie zaburzenia jak cukrzyca, zaburzenia autoimmunologiczne, zaburzenia hiperproliferacyjne, restenoza, zwłóknienie, łuszczyca, choroba von Heppel-Lindau, zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, rozwój naczyń, zaburzenia zapalne, zaburzenia immunologiczne i zaburzenia sercowo-naczyniowe.