ES2522365T3 - Derivados de pirrolo [2,3-D] pirimidina como inhibidores de proteína quinasas B - Google Patents

Abstract

El compuesto: (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida: **Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de pirrolo [2,3-D] pirimidina como inhibidores de proteína quinasas B

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La presente invención se refiere a un heterociclo bicíclico que puede ser útil en el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección médica mediada por la proteína quinasa B (PKB, también conocida como AKT). Por lo tanto tal compuesto puede ser útil en el tratamiento o prevención de un número de cánceres diferentes. La invención 5 también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dicho compuesto, a procedimientos para la fabricación de dicho compuesto y a procedimientos de tratamiento de enfermedades mediadas por PKB usando dicho compuesto.

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PKB es un componente de la ruta de la fosfatidil 3-quinasa (PI3K) que juega una parte importante en la proliferación y supervivencia celular, que incluye respuestas celulares a los factores de crecimiento. Tras la unión de un factor de 10 crecimiento, por ejemplo factor de crecimiento epidérmico (EGF), a su tirosina quinasa del receptor de la superficie celular, por ejemplo receptor de EGF (EGFR), el receptor se dimeriza y experimenta autofosforilación. Este episodio de autofosforilación permite que la subunidad reguladora de 85 kDa de PI3K (p85) interactúe con el receptor o bien directamente o mediante una proteína adaptadora, por ejemplo proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento (GRB2), y por lo tanto activan la subunidad catalítica de 110 kDa de PI3K (p110). Tras la 15 activación, p110 cataliza la fosforilación de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfate (PIP2) para producir fosfatidilinositol-3,4,5- trifosfato (PIP3), una segunda molécula mensajera que recluta tanto la quinasa 1 dependiente de fosfatidilinositol (PDK1) como PKB a la membrana de plasma donde PDK1 fosforila y activa PKB.

Existen tres formas conocidas de PKB (PKBα/AKT1, PKBβ/AKT2 y PKBγ/AKT3), derivadas de tres genes distintos. La activación de PKBα está asociada a los episodios de señalización de células que median la proliferación y 20 supervivencia celular, mientras que la activación de PKBβ está asociada a la invasión, motilidad y procedimientos metabólicos mediados por insulina. La PKB activada protege las células de la apoptosis mediante la inactivación de factores proapoptópicos, por ejemplo la BAD, procaspasa-9 y factores de transcripción de tipo forkhead (FKHR), y que activan factores de transcripción que regulan hacia arriba genes antiapoptópicos, por ejemplo proteína de unión de elementos de respuesta de AMP cíclico (CREB). PKB también puede contribuir a la supervivencia celular 25 por la inactivación de p53 mediante la fosforilación de MDM2. De manera similar, la PKB activada induce la proliferación celular mediante la activación de proteínas implicada en el desarrollo celular y metabolismo, por ejemplo mediante una ruta que conduce a la activación de la diana de mamífero de rapamicina (mTOR) y mediante la glicógeno sintasa quinasa-3 (GSK3).

La estimulación mediada por PKB de la proliferación celular y protección de apoptosis por lo tanto favorece la 30 generación de tumor y alteraciones genéticas de los componentes dentro de la ruta de PI3K se encuentran comúnmente en cáncer. Por ejemplo, la mutación o amplificación de los genes que codifican las isoformas p110 de PI3K s encuentran en cánceres de mama, cáncer de intestino, cáncer de ovario, cánceres de cabeza y cuello y cervical escamoso, cánceres gástrico y de pulmón, oligodendrogliomas angioplásticos, astrocitomas amaplásticos, glioblastoma multiforme y meduloblastomas. De manera similar, la amplificación de mutación y / o sobre expresión 35 de los genes que codifican las isoformas PKB se encuentran en tumores de mama y de ovario. Además, el gen que codifica PTEN (una fosfatasa que tiene un papel inverso a PI3K, que cataliza la conversión de PIP3 a PIP2) está inactivado en muchos tipos de tumores, incluyendo de ovario, colorrectal, mama, glioma, melanoma, pulmón, leucemias y linfomas; esto da como resultado la activación de PKB/AKT.

En vista de la importancia de la ruta de señalización de PI3K en la proliferación y supervivencia de las células 40 tumorales, cualquier compuesto que interrumpa esta ruta, incluyendo los inhibidores de PKB, pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer. Las revisiones detalladas de la ruta de señalización de PI3K y su implicación en la generación de tumor se proporcionan por Hennessy et al., Nature Reviews / Drug Discovery (diciembre de 2005) Vol. 4, 988 - 1004. y Cully et al., Nature reviews / Cancer (marzo de 2006) Vol. 6, 184 - 192.

El canal de potasio dependiente de la tension codificado por el gen relacionado con ether-a-go-go humano (hERG) 45 se cree que juega un papel clave en la repolarización del potencial de acción cardiaca ventricular. Los cambios en su actividad, provocados o bien mediante mutaciones heredadas de la secuencia génica o modificación farmacológica, pueden conducir a la prolongación de la duración potencial de acción. Esto puede conducir a la prolongación del intervalo QT registrado en hombre o un electrocardiograma y a una arritmia cardiaca potencialmente fatal conocida como Torsades de Pointes (Vandenberg et al. (2001). Trends Pharmacol. Sci. 22, 240 - 246). Las directrices 50 reguladoras recientes (CPMP/ICH/539/00) recomiendan que un ensayo in vitro que investiga los efectos de los compuestos de ensayo en el canal hERG podría ser un elemento de una estrategia preclínica que pretende predecir la probabilidad de que nuevas entidades químicas prolonguen el intervalo QT registrado en hombre sobre un electrocardiograma. Como tal, la actividad que bloquea hERG permanece como una importante consideración en el desarrollo de cualquier fármaco nuevo. 55

Se ha descrito un número de compuestos que dirigen la ruta de PI3K. Por ejemplo los documentos WO2006/046023 y WO2006/046024 (Astex Therapeutics Limited) describen compuestos de purina, purinona y deazapurinona que

inhiben o modulan la actividad de la proteína quinasa B (PKB) y la proteína quinasa A (PKA). Sin embargo, todavía existe la necesidad de agenes mejorados adicionales que tienen superior potencia contra PKB y / o propiedades físicas ventajosas (por ejemplo, mayor solubilidad acuosa, mayor permeabilidad, y / o menor unión de proteína de plasma) y / o perfiles de toxicidad favorables (por ejemplo una disminución de la responsabilidad de bloqueo de hERG) y / o perfiles metabólicos favorables en comparación con otros inhibidores de PKB conocidos. 5

Se ha encontrado sorprendentemente que un derivado de heterociclo bicíclico determinado es particularmente eficaz en la inhibición de la actividad de PKB y por lo tanto puede ser útil en el tratamiento de estados patológicos en los que está implicada la actividad de PKB, por ejemplo cáncer.

De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que es: 10

(S)-4-amino-N-(1-(4clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida.

La síntesis de los compuestos ópticamente activos se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales de química orgánica bien conocidas en la técnica, por ejemplo mediante la síntesis a partir de materiales ópticamente activos o mediante la resolución de una forma racémica. Los compuestos racémicos e intermedios racémicos de los mismos se diseñan en el presente documento como estructuras planas mientras que los compuestos 15 estereoespecíficos e intermedios estereoespecíficos de los mismos se diseñan con la estereoquímica apropiada indicada.

La invención también se refiere a cualesquiera y todas las formas tautómeras del compuesto de la invención que son inhibidores de la actividad de Actividad de PKB.

Una sal farmacéuticamente aceptable adecuada de un compuesto de la invención es, por ejemplo, una sal de 20 adición de ácido de un compuesto de la invención que es suficientemente básica, por ejemplo, una sal de adición de ácido con, por ejemplo, un ácido inorgánico u orgánico, por ejemplo ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, trifluoroacético, cítrico o maleico.

Se entenderá que el compuesto de la presente invención puede existir en formas solvatadas, por ejemplo hidratadas, así como no solvatadas. Se ha de entender que la presente invención abarca todas las formas 25 solvatadas que son inhibidores de la actividad de PKB.

El compuesto de la invención se puede administrar en la forma de un profármaco que se descompone en el cuerpo humano o animal para proporcionar el compuesto de la invención. Los ejemplos de profármacos incluyen ésteres hidrolizables in vivo de un compuesto de la invención. Se conocen en la técnica diversas formas de profármacos. Para ejemplos de tales derivados de profármacos, véase: 30

a) Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) y Methods in Enzymology, Vol. 42, p. 309 - 396, editado por K. Widder, et al. (Academic Press, 1985);

b) A Textbook of Drug Design and Development, editado por Krogsgaard- Larsen y H. Bundgaard, Capítulo 5 “Design and Application of Prodrugs”, de H. Bundgaard p. 113 - 191 (1991);

c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1 - 38 (1992); 35

d) H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988);

y

N. Kakeya, et al., Chem Pharm Bull, 32, 692 (1984).

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se ha definido en el 40 presente documento anteriormente en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición de la invención puede estar en una forma adecuada para uso oral (por ejemplo en forma de comprimidos, pastillas, cápsulas duras o blandas, suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones, polvos o gránulos dispersables, jarabes o elixires), para uso tópico (por ejemplo en forma de cremas, pomadas, geles, o soluciones o suspensiones acuosas u oleosas), para administración mediante inhalación (por ejemplo en forma un polvo 45 finamente dividido o un aerosol líquido), para administración mediante insuflación (por ejemplo en forma de un polvo finamente dividido) o para administración parenteral (por ejemplo en forma de una solución acuosa u oleosa estéril para la dosificación intravenosa, subcutánea, intramuscular o en forma de un supositorio para dosificación rectal).

Las composiciones de la invención se pueden obtener mediante procedimientos convencionales que usan excipientes farmacéuticos convencionales, bien conocidos en la técnica. De este modo, las composiciones 50

propuestas para uso oral pueden contener, por ejemplo, uno o más agentes colorantes, edulcorantes, aromatizantes y / o conservantes.

El compuesto de la invención normalmente se administrará a un animal de sangre caliente a una dosificación unitaria dentro del intervalo de 5 - 5000 mg/m2 de área de cuerpo del animal, es decir, aproximadamente 0,1 - 100 mg/kg, y esto normalmente proporciona una dosis terapéuticamente eficaz. Una forma de dosificación unitaria tal 5 como un comprimido o cápsula contendrá usualmente, por ejemplo 1 - 250 mg de ingrediente activo. Preferiblemente se emplea una dosis diaria en el intervalo de 1 - 50 mg/kg, por ejemplo, 4 - 7 mg/kg dos veces al día. Sin embargo la dosis diaria necesariamente variará dependiendo del huésped tratado, la vía particular de administración, y la gravedad de la enfermedad que se está tratando. De acuerdo con lo anterior el facultativo que trata cualquier paciente particular puede determinar la dosificación óptima. 10

Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención adecuada para la administración oral puede comprender 1 - 200 mg/ml del compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, (tal como (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida) en hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) al 0,5%.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término "terapia" también incluye "profilaxis" salvo que existan 15 indicaciones específicas al contrario. Los términos "terapéutico" y "terapéuticamente" se deben considerer de acuerdo con lo anterior.

Como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” se pretende que tenga su significado normal acostumbrado de trato con una enfermedad con el fin de aliviarla completamente o parcialmente, alguno o todos sus síntomas, o corregir o compensar la patología subyacente. 20

Como se usa en el presente documento, el término “profilaxis” se pretende que tenga su significado normal acostumbrado e incluye profilaxis primaria para prevenir el desarrollo de la enfermedad y profilaxis secundaria mediante lo cual la enfermedad ya se ha desarrollado y el paciente está temporalmente o permanentemente protegido contra la exacerbación o empeoramiento de la la enfermedad o el desarrollo de nuevos síntomas asociados a la enfermedad. 25

Como un resultado de su actividad inhibidora de PKB, el compuesto de la presente invención se espera que sea útil en el tratamiento de enfermedades o afecciones médicas mediadas solas o en parte por la actividad de PKB, por ejemplo cáncer. Los tipos de cánceres que pueden ser susceptibles al tratamiento usando el compuesto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer pancreático, glioma, glioblastoma, melanoma, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, linfoma No- 30 Hodgkins, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST), glioma, cáncer de tiroides, cáncer de conducto biliar, cáncer de endometrio, cáncer renal, linfoma de células grandes anaplásicas, linfoma mieloide agudo (AML), mieloma múltiple, melanoma y mesotelioma. Cáncer de mama, y más específicamente cáncer de mama luminal, puede ser particularmente susceptible al tratamiento usando los compuestos de la presente invención. 35

Se contempla que para los procedimientos de tratamiento de cáncer mencionado en el presente documento, el compuesto de la invención se administrará a un mamífero, más particularmente a un ser humano. De manera similar, para los usos de un compuesto de la invención para el tratamiento de cáncer mencionado en el presente documento, se contempla que el compuesto de la invención se administrará a un mamífero, más particularmente a un ser humano. 40

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona por lo tanto un compuesto de la invención como se ha definido en el presente documento anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso como un medicamento.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un compuesto de la invención como se ha definido en el presente documento anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en el 45 tratamiento de una enfermedad mediada a través de PKB. En una realización de la invención, dicha mediada a través de PKB es cáncer. En una realización adicional de la invención, dicho cáncer se selecciona entre cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer pancreático, glioma, glioblastoma, melanoma, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, linfoma No-Hodgkins, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST), glioma, cáncer de tiroides, cáncer de 50 conducto biliarr, cáncer de endometrio, cáncer renal, linfoma de células grandes anaplásicas, leucemia mieloide aguda (AML), mieloma múltiple, melanoma y mesotelioma. En una realización de la invención, dicho cáncer se selecciona entre cáncer de mama, Linfoma No-Hodgkins, cáncer pancreático, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. En una realización particular, dicho cáncer es cáncer de mama, más particularmente cáncer de mama luminal. 55

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un compuesto de la invención como

se ha definido en el presente documento anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada a través de PKB. En una realización de la invención, dicha enfermedad mediada a través de PKB es cáncer. En una realización adicional de la invención, dicho cáncer se selecciona entre cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer pancreático, glioma, glioblastoma, melanoma, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, Linfoma No-5 Hodgkins, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST), glioma, cáncer de tiroides, cáncer de conducto biliar, cáncer de endometrio, cáncer renal, linfoma de células grandes anaplásicas, linfoma mieloide agudo (AML), mieloma múltiple, melanoma y mesotelioma. En una realización de la invención, dicho cáncer se selecciona entre cáncer de mama, linfoma no-Hodgkins, cáncer pancreático, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. En una realización 10 particular, dicho cáncer es cáncer de mama, más particularmente cáncer luminal de mama.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un compuesto de la invención como se ha definido en el presente documento anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En una realización de la invención, dicho cáncer se selecciona entre cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer pancreático, glioma, 15 glioblastoma, melanoma, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, linfoma No-Hodgkins, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago, tumor estromal gastrointestinal (GIST), glioma, cáncer de tiroides, cáncer de conducto biliar, cáncer de endometrio, cáncer renal, linfoma de células grandes anaplásico, linfoma mieloide agudo (AML), mieloma múltiple, melanoma y mesotelioma. En una realización de la invención, dicho cáncer se selecciona entre cáncer de mama, linfoma no-Hodgkins, cáncer pancreático, cáncer hepatocelular, 20 cáncer de estómago, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. En una realización particular, dicho cáncer es cáncer de mama, más particularmente cáncer luminal de mama.

El tratamiento de cáncer definido en el presente documento anteriormente se puede aplicar como una única terapia o puede implicar además del compuesto de la invención, cirugía convencional o radioterapia o quimioterapia. Tal quimioterapia puede incluir una o más de de las siguientes categorías de agentes antitumorales: 25

(i) otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y sus combinaciones, como se usa en oncología médica, tales como agentes alquilantes (por ejemplo cis- platino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalan, clorambucilo, busulfan, temozolamida y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo gemcitabina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5- fluorouracil y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinosida, e hidroxiurea); antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, 30 daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotere e inhibidores de la poloquinasa); e inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo epipodofilllotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecan y camptotecin);

(ii) agentes citostáticos tales como antioestrógenos (por ejemplo tamoxifeno, fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, 35 droloxifeno y yodoxifeno), antiandrógenos (por ejemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo goserelin, leuprorelin y buserelin), progestógenos (por ejemplo acetato de megestrol), inhibidores de la aromatasa (por ejemplo as anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de la 5α-reductasa tal como finasterida;

(iii) agentes anti-invasión (por ejemplo inhibidores de la familia c-Src quinasa como 4-(6-cloro-2,3-40 metilendioxianilino)-7-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]-5- tetrahidropiran-4-iloxiquinazolina (AZD0530; Solicitud de patente Internacional WO 01/94341) y N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-{6-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]-2- metilpirimidin-4-ilamino}tiazol-5-carboxamida (dasatinib, BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658 - 6661), e inhibidoers de la metaloproteinasa como marimastat, inhibidores de la función de receptor de activador de plasminógeno de uroquinasa o anticuerpos de Heparanasa); 45

(iv) inhibidores de la función del factor de crecimiento: por ejemplo tales inhibidores incluyen anticuerpos del factor de crecimiento y anticuerpos del factor de receptores de crecimiento (por ejemplo el anticuerpo anti-erbB2 trastuzumab [Herceptin®], el anticuerpo anti-EGFR panitumumab, el anticuerpo anti-erbB1 cetuximab [Erbitux, C225] y cualesquiera anticuerpos del factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento descritos por Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29); tales inhibidores también incluyen inhibidores de 50 la tirosina quinasa, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo inhibidores de la tirosina quinasa de la familia de EGFR tal como N-(3-cloro-4- fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolijnopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, ZD1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolijnopropoxi)- quinazolin-4-amina (CI 1033), inhibidores de erbB2 tirosina quinasa tal como lapatinib, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de 55 hepatocitos, inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas tal como imatinib, inhibidores de serine/treonina quinasas (por ejemplo inhibidores de la señalización Ras/Raf tales como inhibidores de la farnesil transferasa, por ejemplo sorafenib (BAY 43-9006)), inhibidores de la señalización celular mediante MEK y / o AKT quinasas, inhibidores de la familia dl factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de c-kit inhibidores, inhibidores

de la abl quinasa, inhibidores de quinasa del receptor IGF (factor de crecimiento de tipo insulina); inhibidores de la aurora quinasa (por ejemplo AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 25 y AX39459) e inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina tales como inhibidores CDK2 y / o CDK4;

(v) agentes antigiogénicos tales como los que inhiben los efectos del farctor de crecimiento endotelial vascular, [por ejemplo el anticuerpo del del factor de crecimiento celular endotelial anti-vascular endotelial bevacizumab 5 (Avastin®) e inhibidores de la tirosina quinasa del receptor VEGF tal como 4- (4-bromo-2- fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474; Ejemplo 2 en el documento WO 01/32651), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5- iloxi)-6- metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi)quinazolina (AZD2171; Ejemplo 240 en el documento WO 00/47212), vatalanib (PTK787; documento WO 98/35985) y SU11248 (sunitinib; documento WO 01/60814), compuestos tales como los descritos en las solicitudes de patente internacional WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 10 98/13354 y los compuestos que funcionan mediante otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de la integrina αvβ3 y angiostatina)];

(vi) agentes de daño vascular tales como Combretastatin A4 y los compuestos descritos en las solicitudes de patente internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213;

(vii) terapias de sentido contrario, por ejemplo los que se dirigen a las terapias enumeradas anteriormente, tal como 15 ISIS 2503, un anti-ras de sentido contrario;

(viii) planteamientos de terapia génica, que incluyen por ejemplo planteamientos para reemplazar genes aberrantes tales como p53 aberrante o BRCA1 aberrante o BRCA2, GDEPT (terapia de profármacos de enzima dirigida por genes) planteamientos tales como los que usan citosina deaminasa, timidina quinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y planteamientos para aumentar la tolerancia de pacientes a quimioterapia o radioterapia tal como 20 terapia génica de resistencia a fármacos múltiples; y

(ix) planteamientos de inmunoterapia, que incluyen por ejemplo planteamientos ex-vivo e in-vivo para incrementar la inmunogenicidad de células tumorales de pacientes, tal como transfección con citoquinas tal como interleuquina 2, interleuquina 4 o factor estimulante de de la colonia de granulocitos - macrófagos, planteamientos para disminuir la anergia de células T, planteamientos que usa células inmunes transfectadas tales como células dendríticas 25 transfectadas con citoquina, planteamientos que usan líneas de células tumorales transfectadas con citoquina, y planteamientos que usan anticuerpos anti-idiotípicos.

El compuesto de la invención, o una sal del mismo, se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido que se puede aplicar a la preparación de tales compuestos o compuestos relacionados estructuralmente. Los grupos funcionales se pueden proteger y desproteger usando procedimientos convencionales. Por ejemplo de grupos de 30 protección tales como grupos de protección amino y ácido carboxílico (así como medios de formación y desprotección eventual), véase T.W. Greene y P.G.M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, segunda edición, John Wiley & Sons, New York, 1991.

Se proporcionan ciertos procedimientos para la síntesis del compuesto de la invención así como una característica adicional de la invención. De este modo, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un 35 procedimiento para la preparación de un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable de este, que comprende:

(a) reacción de un ácido de Fórmula (II) con (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol:

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en la que P1 representa un grupo protector adecuado, por ejemplo terc- butoxicarbonil;

o

(b) reacción de (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida con un heterociclo bicíclico de Fórmula (V):

en la que L1 representa un grupo saliente adecuado, por ejemplo cloro; 5

y de aquí en adelante, si es necesario:

(i) eliminar el grupo protector; y / o

(ii) formar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Las condiciones de reacción específicas para los procedimientos (a) y (b) anteriores son como sigue:

Procedimiento (a) - ácidos de Fórmula (II) y aminas tales como (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol se pueden 10 hacer reaccionar conjuntamente en la presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado, por ejemplo hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU), y una base adecuada, por ejemplo N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA), en un disolvente adecuado, por ejemplo dimetilacetamida (DMA), y a una temperatura adecuada, por ejemplo 50 a 70ºC, más adecuadamente aproximadamente 60ºC;

Procedimiento (b) - carboxamidas tales como (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-15 carboxamida y heterociclos de Fórmula (V) se pueden reaccionar conjuntamente en la presencia de una base adecuada, por ejemplo butan-1-ol, y a una temperatura adecuada, por ejemplo 50 a 70ºC, de manera más adecuada a aproximadamente 60ºC;

Los compuestos de Fórmula (II) se pueden preparar de acuerdo con el Esquema 1:

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Esquema 1

en el que P1 un grupo protector adecuado, por ejemplo terc- butoxicarbonilo, L1 es un grupo saliente adecuado, por ejemplo cloro.

Los compuestos tales como (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida se pueden preparar de acuerdo con el esquema 2: 25

Esquema 2

en el que P1 y P2 son grupos protectores adecuados, por ejemplo terc- butoxicarbonilo.

Los compuestos tales como (S)-3-amino-(4-clorofenil)propan-1-ol y compuestos de Fórmulas (V) y (VIII) están comercialmente disponibles, se conocen en la bibliografía, se preparan mediante procedimientos convencionales 5 conocidos en la técnica, o se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.

Los siguientes ejemplos son para propósitos de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de esta solicitud. Cada compuesto ejemplificado representa un aspecto particular e independiente de la invención. Todos los materiales de partida son compuestos comercialmente disponibles, o se pueden preparar mediante procedimientos 10 convencionales conocidos en la técnica.

En general, con respecto a los siguientes ejemplos:

(i) las temperaturas se proporcionan en grados Celsius (°C); las operaciones se llevaron a cabo a temperatura de laboratorio o ambiente, esto es, a una temperatura en el intervalo de 18 a 25°C;

(ii) las soluciones orgánicas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro o sulfato de sodio anhidro; la evaporación 15 del disolvente se llevó a cabo usando un rotavapor a presión reducida (600 a 4000 Pascales; 4,5 a 30 mm Hg) con una temperatura de baño de hasta 60°C;

(iii) cromatografía significa cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice; la cromatografía en capa fina (TLC) se llevó a cabo sobre placas de gel de sílice;

(iv) en general, el curso de las reacciones se siguió mediante TLC y / o CL-EM analítica, y los tiempos de reacción 20 cuando se proporcionan son para ilustración solamente.

(v) los productos finales tienen datos de espectros de resonancia magnética nuclear de protón (NMR) satisfactorios y / o de espectros de masas;

(vi) los rendimientos se proporcionan para ilustración solamente y no son necesariamente los que se pueden obtener mediante desarrollo del procedimiento diligente; las preparaciones se repitieron si se requería más material; 25

(vii) cuando se proporciona, los datos de RMN están en la forma de valores delta para los protones de diagnóstico principales, se proporcionan en partes por millón (ppm) con relación a tetrametilsilano (TMS) como un patrón

interno, determinado a 500 MHz que usan dimetilsulfóxido de perdeuterio (DMSO-d6) como disolvente salvo que se indique de otra manera; se han usado las siguientes abreviaturas: s, singlete; d, doblete; t, triplete; c, cuartete; m, multiplete; s a, singlete ancho;

(viii) los símbolos químicos tienen sus significados usuales; se usan unidades SI y símbolos;

(ix) Los datos de espectro de masas (EM) y CL-EM se generaron sobre un sistema CL-EM donde el componente de 5 HPLC que comprende en general o bien un equipo Agilent 1100, Waters Alliance HT (2790 20 & 2795) o una bomba HP1100 y Disposición de Diodos con un automuestreador CTC y se desarrolló sobre una columna Phenomenex Gemini C18 5 μm, 50 x 2 mm (o similar) eluyendo o bien con o bien eluyente ácido (por ejemplo, usando un gradiente entre 0 - 95% agua / acetonitrilo con 5% de una mezcla de ácido fórmico al 1% en 50:50 agua:acetonitrilo (v/v)), o eluyente básico (por ejemplo, 10

usando un gradiente entre 0 - 95% agua / acetonitrilo con 5% de una mezcla de 0,1% de 880 amoníaco en acetonitrilo); y el componente EM comprendía en general un barrido de espectrómetro de masas Waters ZQ sobre un intervalo de masas apropiado. Los cromatogramas para la Intensidad de Máximo de Base positiva y negativa de electropulverización (ESI), y cromatograma de Absorción Total de UV desde 220 - 300 nm, se generan y se proporcionan los valores para m/z; en general, solamente los iones que indican la masa precursora se reseñan y 15 salvo que se indique otra cosa el valor citado es el (M+H)+ para la forma de ion positivo y (M-H)- para la forma de ion negativo;

(x) salvo que se establezca de otra manera los compuestos que contienen un carbono sustituido de manera simétrica y / o átomo de azufre no se han resuelto;

(xi) cualesquiera de las reacciones de microondas se llevaron a cabo o bien en Biotage Optimizer EXP, o un un 20 microondas CEM Explorer;

(xii) la cromatografís líquida de alta resolución (HPLC) preparativa se realizó sobre un instrumento Gilson usando la siguientes condiciones:

Columna: sílice de fase inversa C18, por ejemplo, Waters ‘Xbridge’, 5 μm de sílice, 19 x 100 mm, o 30 x 100 mm, usando mezclas de de disolventes polares decrecientes como eluyente (relación decreciente de Disolvente A a 25 Disolvente B)

Disolvente A: agua con 1de hidróxido de amonio

Disolvente B: Acetonitrilo

Caudal: 28 ml / min o 61 ml / min

Gradiente: confeccionada adaptar cada componente – en general 7 - 10 min de longitud 30

Longitud de onda: 254 nm

Abreviaturas

BOC

Tert-butoxicarbonil

DCM

Diclorometano

DIPEA

N,N'-diisopropiletilamina

DMA

Dimetilacetamida

DMF

Dimetilformamida

HATU

hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio

NMP

N-metilpirrolidinona

OBD

densidad de lecho óptima

PTFE

Politetrafluoroetileno

SCX

intercambio catiónico fuerte

SFC

cromatografía de fluidos supercríticos

THF

Tetrahidrofurano

Ejemplo 9: (S)-4-Amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (E9)

Se añadió HCl (4 M en dioxano) (3,00 ml, 12,00 mmol) a 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (S)-terc-butilo (Intermedio 22) (1,27 g, 2,40 mmol) en 5 diclorometano (20 ml). La suspensión resultante se agitó a 20ºC durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtercup PTFE y el sólido en bruto se purificó por HPLC preparativa (columna Waters XTerra C18, 5 m de sílice, 19 mm de diámetro, 100 mm de longitud), usando mezclas de polaridad decreciente de agua (que contenía TFA al 1%) y MeCN como eluyentes. Las fracciones que contenían el compuesto deseado se purificaron por cromatografía de intercambio iónico, usando una columna SCX. El producto deseado se eluyó de la columna usando 10 NH3 7 M/MeOH y las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (0,200 g, 19,4%) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,45 (2H, d), 1,86 (1H, d), 1,90 - 1,93 (1H, m), 2,19 (2H, s), 3,38 (2H, c), 3,51 - 3,58 (2H, m), 4,35 - 4,38 (2H, m), 4,53 (1H, t), 4,88 (1H, d), 6,58 (1H, t), 7,16 (1H, t), 7,32 - 7,38 (4H, m), 8,12 (1H, s), 8,43 (1H, d), 11,63 (1H, s), m/z (IEN+) (M+H)+ = 429; tR de HPLC = 1,46 min. 15

Ejemplo 9 ruta alternativa 1: (S)-4-Amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida

Se añadió N-etildiisopropilamina (1,676 ml, 9,62 mmol) a (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida (Intermedio 49) (1 g, 3,21 mmol) y 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (0,493 g, 3,21 mmol) en butan-1-20 ol (15 ml). La solución resultante se agitó a 60ºC durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml) y se lavó secuencialmente con agua (25 ml) y salmuera saturada (25 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo el producto en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución de MeOH del 0 al 6% con amoniaco en DCM. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-25 il)piperidina-4-carboxamida (842 mg) en forma de una espuma de color blanco. La (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida se agitó en acetato de etilo (7 ml) durante 18 horas. El sólido se recogió por filtración, se lavó con una pequeña cantidad de acetato de etilo y se secó en una estufa de vacío a 55 ºC durante 18 horas, produciendo (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-

pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (0,585 g, 42,5%) en forma de un sólido de color blanco. m/z (ES+) (M+H)+ = 429; tR de HPLC = 1,60 min.

RMN 1H (400,13 MHz, DMSO-d6)  1,39 - 1,47 (2H, m), 1,80 - 2,02 (4H, m), 2,17 (2H, s), 3,35 - 3,40 (2H, m), 3,50 - 3,59 (2H, m), 4,34 - 4,41 (2H, m), 4,53 (1H, t), 4,88 (1H, d), 6,57 (1H, m), 7,14 - 7,16 (1H, m), 7,31 - 7,37 (4H, m), 8,12 (1H, s), 8,42 (1H, d), 11,62 (1H, s). 5

Ejemplo 9 ruta alternativa 2: (S)-4-Amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida

Se añadió en una porción (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol (Intermedio 47) (2,055 g, 11,07 mmol) a ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxílico (Intermedio 1) (4 g, 11,07 mmol) 10 y DIPEA (5,80 ml, 33,20 mmol) en DMA (40 ml). Se añadió HATU (4,63 g, 12,18 mmol) y la solución resultante se agitó a 20ºC durante 24 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, después se diluyó con EtOAc (300 ml) y se lavó secuencialmente con agua (50 ml) y salmuera saturada (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo el producto en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución de MeOH del 2 al 6% con amoniaco en DCM. Las fracciones puras se 15 evaporaron a sequedad y se trituraron con dioxano (40 ml), produciendo 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (S)-terc-butilo (Intermedio 22) (4,82 g, 82%) en forma de un sólido de color blanco. Se suspendió 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (S)-terc-butilo (Intermedio 22) (4,82 g, 82%) en dioxano (40,0 ml) y se añadió cloruro de hidrógeno 4 M en dioxano (7,69 ml, 221,36 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El 20 producto en bruto se purificó por cromatografía de intercambio iónico, usando una columna SCX. El producto deseado se eluyó de la columna usando NH3 3,5 M/MeOH y las fracciones puras se evaporaron a sequedad. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa (columna Waters XBridge Prep C18 OBD, 5 m de sílice, 19 mm de diámetro, 100 mm de longitud), usando mezclas de polaridad decreciente de agua (que contenía NH3 al 1%) y MeCN como eluyentes. Las fracciones que contenían el compuesto deseado se evaporaron a sequedad, 25 produciendo (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (1,200 g, 25,3%) en forma de un sólido de color blanco.

m/z (ES+) (M+H)+ = 429; tR de HPLC = 1,67 min.

La RMN 1H concuerda con lo anterior.

Ejemplo 13: 4-Amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-30 carboxamida

Se añadió TFA (0,7 ml) a una suspensión de 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de terc-butilo (Intermedio 36) (175 mg, 0,33 mmol) en diclorometano (7 ml) en atmósfera de argón. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 16 horas. Los disolventes se retiraron al vacío y la mezcla de reacción se purificó por HPLC preparativa usando una columna de fase inversa Waters X-Bridge (C-18, sílice de 5 5 micrómetros, 19 mm de diámetro, 100 mm de longitud) con mezclas de polaridad decreciente de agua (que contenía carbonato de amonio al 0,2%) y acetonitrilo como eluyente. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (99 mg, 69,8%) en forma de un polvo de color blanco.

RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6)  1,38 -1,46 (2H, m), 1,81 - 1,91 (4H, m), 2,25 (2H, s a), 3,48 (2H, m), 3,35 - 3,54 (2H, 10 m), 4,35 - 4,41 (2H, m), 4,57 (1H, t), 4,87 (1H, m), 6,58 (1H, d), 7,16 (1H, d), 7,31 - 7,37 (4H, m), 8,11 (1H, s), 8,45 (1H, d), 11,65 (1H, s). m/z (IEN+) (M+H)+ = 429; tR de HPLC = 1,58 min.

Ejemplo 15: (R)-4-Amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida

15

Se añadió HCl (4 M en dioxano) (0,378 ml, 1,51 mmol) a 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (R)-terc-butilo (Intermedio 42) (0,160 g, 0,30 mmol) en DCM (3 ml). La suspensión resultante se agitó a 20ºC durante 3 horas. La mezcla de reacción se evaporó. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa (columna Waters XTerra C18, 5 m de sílice, 19 mm de diámetro, 100 mm de longitud), usando mezclas de polaridad decreciente de agua (que contenía amoniaco al 1%) y MeCN como 20 eluyentes. Las fracciones que contenían el compuesto deseado se evaporaron a sequedad, produciendo (R)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (0,051 g, 39,3%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,46 (2H, d), 1,86 (1H, d), 1,90 - 1,93 (1H, m), 2,10 (2H, m), 3,37 (1H, t), 3,55 (2H, d), 4,40 (2H, d), 4,53 (2H, m), 4,88 (1H, d), 6,58 (1H, t), 7,16 (1H, t), 7,32 - 7,38 (4H, m), 8,14 (1H, d), 8,43 (1H, d), 25 11,63 (1H, s) no visible NH2, EM m/e MH+ 429; tR de HPLC = 1,46 min.

Intermedio 1: Ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxílico

A una mezcla de ácido 4-[(2-metilpropan-2-il)oxicarbonilamino]piperidina-4-carboxílico (115,6 g) en CH3CN-H2O (6 l) se le añadió NaHCO3 (181 g) seguido de 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (72,7 g). La mezcla se calentó a reflujo durante una noche en atmósfera de nitrógeno durante 24 h y después se extrajo con EtOAc (1 l x 4). La fase acuosa se concentró y se añadió MeOH (1,5 l). La mezcla se agitó durante 30 min a 45ºC y se filtró. El filtrado se concentró 5 de nuevo y se disolvió en H2O (300 ml). Se añadió HCl 6 N hasta que el pH alcanzó 4,5 (aprox. 80 ml). La mezcla se filtró y la torta se secó al vacío, produciendo el producto del título, que se purificó adicionalmente por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con MeOH:DCM = 1:3) para producir ácido 4-[(2-metilpropan-2-il)oxicarbonilamino]-1-(3,5,7-triazabiciclo[4.3.0]nona-2,4,8,10-tetraen-2-il)piperidina-4-carboxílico en forma de un sólido de color gris pálido (105 g, 63%). 10

RMN 1H (400,13 MHz, DMSO-d6)  1,40 (9H, s), 1,88 - 1,95 (2H, m), 2,02 - 2,06 (2H, m), 3,44 - 3,51 (2H, m), 4,30 (2H, d), 6,60 - 6,61 (1H, m), 7,16 - 7,18 (1H, m), 7,29 (1H, s), 8,14 (1H, s), 11,68 (1H, s).

EM m/e MH+ 362.

Intermedio 19: 3-(terc-Butoxicarbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo

15

Se añadió en una porción yodometano (1,038 ml, 16,68 mmol) a ácido (S)-3-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoico (1 g, 3,34 mmol) y carbonato potásico (0,922 g, 6,67 mmol) en DMF (15 ml). La suspensión resultante se agitó a 80ºC durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró y se diluyó con EtOAc (50 ml) y con agua (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo 3-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo (1,340 g, 128%) en forma de un sólido de color 20 naranja.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,36 (9H, s), 2,71 - 2,74 (1H, m), 2,74 - 2,80 (1H, m), 3,57 (3H, s), 4,91 (1H, d), 7,33 (2H, d), 7,39 (2H, d), 7,49 (1H, d). m/z (IEN-) (M-H)- = 312; tR de HPLC = 2,57 min.

Intermedio 20: (Clorhidrato de) 3-amino-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo

25

Se añadió en una porción ácido clorhídrico (4,0 M en 1,4-dioxano) (4,18 ml, 16,73 mmol) a 3-(terc-

butoxicarbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo (Intermedio 19) (1,05 g, 3,35 mmol) en DCM (20 ml) a 20ºC. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción se evaporó, dando (clorhidrato de) 3-amino-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo (0,850 g, 102%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  2,98 - 3,04 (1H, m), 3,16 - 3,21 (1H, m), 3,58 (3H, s), 4,62 -4,66 (1H, m), 7,50 - 7,52 (2H, m), 7,57 - 7,59 (2H, m), 8,66 (3H, s). m/z (IEN+) (M+H)+ = 214; tR de HPLC = 1,71 min. 5

Intermedio 21: 3-(4-(terc-Butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo

Se añadió en una porción hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (1,157 g, 3,04 mmol) a ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxílico (Intermedio 1) (1 10 g, 2,77 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,006 ml, 6,09 mmol) en NMP (10 ml) a 20ºC. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 5 minutos. Después, a la solución se le añadió (clorhidrato de) 3-amino-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo (Intermedio 20) (0,692 g, 2,77 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó secuencialmente con agua (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo el producto en bruto. El 15 producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución de MeOH del 0 al 5% en DCM. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 3-(4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo (1,27 g, 82%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,40 (9H, s), 1,99 (2H, s), 2,04 - 2,07 (2H, m), 2,79 - 2,84 (2H, m), 3,56 (3H, s), 20 3,60 - 3,66 (1H, m), 3,67 - 3,70 (1H, m), 4,20 (2H, t), 5,20 - 5,26 (1H, m), 6,73 (1H, d), 7,13 (1H, s), 7,27 (1H, t), 7,35 (4H, c), 8,14 (1H, d), 8,21 (1H, s), 11,98 (1H, s). m/z (IEN+) (M+H)+ = 557; tR de HPLC = 2,12 min.

Intermedio 22: 4-(1-(4-Clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (S)-terc-butilo

25

Se añadió gota a gota LiAlH4 (2,280 ml, 2,28 mmol) a 3-(4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de (S)-metilo (Intermedio 21) (1,27 g, 2,28 mmol) en THF (70 ml) enfriado a 0ºC en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se inactivó con hidróxido sódico (2 M) (2 ml) y agua (1 ml). La solución se filtró y se diluyó con EtOAc (200 ml) y se lavó secuencialmente con agua (100 ml), agua (100 ml) y salmuera saturada (100 ml). La fase orgánica se 30

secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (S)-terc-butilo (1,04 g, 86%) en forma de un sólido de color blanco. M/z (IEN+) (M+H)+ = 529; tR de HPLC = 2,00 min.

Intermedio 29: 3-Amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol

5

Se añadió gota a gota complejo de borano-tetrahidrofurano (94,0 ml, 93,92 mmol) a una suspensión agitada de ácido 3-amino-3-(4-clorofenil)propiónico (2,50 g, 12,52 mmol) en THF (75 ml) a 0ºC durante un periodo de 20 minutos en atmósfera de nitrógeno. La suspensión resultante se agitó a 0ºC durante 30 minutos y después a 22ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción se añadió en porciones a metanol (500 ml). La mezcla se concentró, se disolvió de nuevo en metanol (250 ml) y se concentró de nuevo (este procedimiento se repitió tres veces). El residuo 10 se disolvió en DCM (200 ml) y se lavó con NaOH 1 N (150 ml). La fase acuosa se extrajo con DCM (5 x 100 ml) y los extractos se combinaron con la fase orgánica. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera saturada (2 x 150 ml), se secaron sobre MgSO4 y se concentraron, produciendo un semisólido de color blanco. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución del 5 al 7% de (10:1 de MeOH/NH3 (ac.) conc.) en DCM. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 3-amino-3-(4-15 clorofenil)propan-1-ol (1,320 g, 56,8%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (399,902 MHz, CDCl3)  1,87 (2H, m), 2,34 (2H, s a), 3,79 (2H, m), 4,13 (1H, t), 7,24 (2H, d), 7,32 (2H, d).

EM m/e MH+ 169.

Intermedio 30: 1-(4-Clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamato de terc-butilo

20

Se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (0,705 g, 3,23 mmol) a 3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol (Intermedio 29) (0,500 g, 2,69 mmol) en DCM (30 ml) a 22ºC. La solución resultante se agitó a 22ºC durante 2 horas. La mezcla se concentró y el residuo se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución del 0 al 4% de (10:1 de MeOH/NH3 (ac.) conc.) en DCM. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamato de terc-butilo (0,759 g, 99%) en forma de un sólido de color blanco. 25

RMN 1H (399,902 MHz, CDCl3)  1,43 (9H, s), 1,81 (1H, m), 2,04 (1H, m), 2,74 (1H, s a), 3,69 (2H, m), 4,88 (1H, s a), 5,04 (1H, d), 7,23 (2H, d), 7,32 (2H, d).

EM m/e MH- 284, 286.

Intermedio 35: 3-(4-(terc-Butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de metilo 30

Se añadió en una porción hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (84 mg, 0,22 mmol) a ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxílico (Intermedio 1) (72,3 mg, 0,20 mmol), clorhidrato de éster metílico del ácido 3-amino-3-(4-cloro-fenil)-propiónico (50 mg, 0,20 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,104 ml, 0,60 mmol) en N-metil-2-pirrolidinona (1,5 ml) a 20ºC en atmósfera de argón. La 5 solución resultante se agitó durante 5 h. La mezcla de reacción se purificó por HPLC preparativa usando una columna de fase inversa Waters X-Bridge (C-18, sílice de 5 micrómetros, 19 mm de diámetro, 100 mm de longitud, caudal de 40 ml/minuto) con mezclas de polaridad decreciente de agua (que contenía carbonato de amonio al 0,2%) y acetonitrilo como eluyente. Las fracciones que contenían el compuesto deseado se evaporaron a sequedad, produciendo 3-(4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-10 clorofenil)propanoato de metilo (71,0 mg, 63,8%) en forma de un sólido cristalino de color blanco.

RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6)  1,36 (9H, s), 1,94 - 2,00 (4H, m), 2,79 - 2,86 (2H, dc), 3,54 (3H, s), 3,52 - 3,61 (2H, m), 4,19 (2H, t), 5,22 (1H, c), 6,56 (1H, d), 6,9 (1H sa), 7,13 (1H, d), 7,33 (4H, c), 7,98 (1H, d), 8,12 (1H, s), 11,53 (1H, s). m/z (IEN+) (M+H)+ = 557; tR de HPLC = 3,18 min.

Intermedio 36: 4-(1-(4-Clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-15 ilcarbamato de terc-butilo

Se añadió en una porción borohidruro sódico (1,019 g, 26,93 mmol) a una suspensión agitada de 3-(4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de metilo (Intermedio 35) (1,0 g, 1,80 mmol) disuelto en EtOH (400 ml) en atmósfera de argón. La suspensión resultante se 20 agitó a 20ºC durante 70 horas. Se añadieron unas gotas de agua para inactivar el exceso de hidruro y la mezcla se agitó durante 1 hora. La mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se repartió entre CH2Cl2 y agua saturada con NaCl. La fase orgánica se secó y se concentró, proporcionando el producto en bruto en forma de cristales de color blanco. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con metanol del 0 al 10% en diclorometano. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 4-(1-(4-clorofenil)-3-25 hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de terc-butilo (286 mg, 30,1%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6)  1,41 (9H, s), 1,79 - 1,99 (6H, m), 3,31 - 3,37 (2H, m), 3,51 (2H, m), 4,21 - 4,28 (2H, m), 4,55 (1H, s), 4,90 (1H, c), 6,59 (1H, d), 7,06 (1H, s), 7,16 (1H, d), 7,31 (4H, s), 8,01 (1H, d), 8,12 (1H, s), 11,67 (1H, s). m/z (IEN+) (M-H)- = 529; tR de HPLC = 2,93 min. 30

Intermedio 39: 3-(terc-Butoxicarbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo

Se añadió en una porción yodometano (0,987 ml, 15,85 mmol) a ácido boc-(R)-3-amino-3-(4-cloro-fenil)-propiónico (950 mg, 3,17 mmol) y carbonato potásico (876 mg, 6,34 mmol) en DMF (15 ml). La suspensión resultante se agitó a 80ºC durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró y se diluyó con EtOAc (25 ml) con agua (25 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo 3-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(4-5 clorofenil)propanoato de (R)-metilo (990 mg, 100%) en forma de un sólido de color naranja.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,36 (9H, s), 2,67 - 2,70 (1H, m), 2,71 - 2,80 (1H, m), 3,57 (3H, s), 4,91 (1H, d), 7,32 - 7,34 (2H, m), 7,38 - 7,40 (2H, m), 7,49 (1H, d).

EM m/e MH+ 312; tR de HPLC = 2,57 min.

Intermedio 40: (Clorhidrato de) 3-amino-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo 10

Se añadió en una porción ácido clorhídrico (4,0 M en dioxano) (7,89 ml, 31,55 mmol) a 3-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo (Intermedio 39) (990 mg, 3,16 mmol) en DCM (20 ml) a 20ºC. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 3 horas. La mezcla de reacción se evaporó, produciendo (clorhidrato de) 3-amino-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo (777 mg, 98%) en forma de un sólido de color amarillo. 15

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  2,99 - 3,05 (1H, m), 3,18 - 3,23 (1H, m), 3,58 (3H, d), 4,62 - 4,65 (1H, m), 7,49 - 7,53 (2H, m), 7,57 - 7,61 (2H, m), 8,72 (3H, s).

EM m/e MH+ 214; tR de HPLC = 1,71 min.

Intermedio 41: 3-(4-(terc-Butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo 20

Se añadió en una porción hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (0,579 g, 1,52 mmol) a ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxílico (Intermedio 1) (0,5 g, 1,38 mmol) y DIPEA (0,503 ml, 3,04 mmol) en NMP (5 ml) a 20ºC. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 5 minutos. Después, a la solución se le añadió (clorhidrato de) 3-amino-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-25 metilo (Intermedio 40) (0,346 g, 1,38 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó secuencialmente con agua (50 ml), agua (50 ml) y agua (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo el producto en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución de MeOH del 0 al 5% en DCM. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 3-(4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-30

d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo (0,800 g, 100%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,40 (9H, s), 1,94 - 1,98 (2H, m), 2,00 - 2,01 (2H, m), 2,83 (1H, d), 2,85 - 2,87 (2H, m), 3,55 (3H, s), 3,60 (2H, s), 4,21 (2H, s), 5,23 (1H, d), 6,60 - 6,61 (1H, m), 7,16 - 7,18 (1H, m), 7,35 (4H, c), 8,09 - 8,14 (2H, m), 11,65 (1H, s). 5

EM m/e MH+ 557; tR de HPLC = 2,29 min.

Intermedio 42: 4-(1-(4-Clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (R)-terc-butilo

Se añadió gota a gota LiAlH4 (1,398 ml, 1,40 mmol) a 3-(4-(terc-butoxicarbonilamino)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-10 il)piperidina-4-carboxamido)-3-(4-clorofenil)propanoato de (R)-metilo (Intermedio 41) (779 mg, 1,40 mmol) en THF (40 ml) enfriado a 0ºC en atmósfera de nitrógeno. La solución resultante se agitó a 20ºC durante 3 horas. La mezcla de reacción se inactivó con agua (1 ml) y se neutralizó con HCl 2 M. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, se disolvió de nuevo en DCM (100 ml) y se lavó con agua (100 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó, produciendo el producto en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice 15 ultrarrápida, gradiente de elución de MeOH del 0 al 10% en DCM. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron, dando 4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de (R)-terc-butilo (160 mg, 21,63%) en forma de un sólido.

RMN 1H (399,9 MHz, DMSO-d6)  1,37 - 1,41 (9H, s), 1,86 - 1,92 (2H, m), 1,94 (2H, d), 2,00 (2H, d), 3,38 (2H, s), 3,53 - 3,55 (2H, m), 4,25 (2H, t), 4,52 (1H, s), 4,91 (1H, d), 6,60 - 6,62 (1H, m), 7,01 (1H, s), 7,16 - 7,18 (1H, m), 7,33 20 (4H, m), 7,98 - 8,00 (1H, m), 8,14 (1H, s), 11,67 (1H, s).

EM m/e MH+ 529; tR de HPLC = 2,01 min.

Intermedio 47: (S)-3-Amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol

Se añadió gota a gota complejo de borano-tetrahidrofurano (376 ml, 375,69 mmol) a una suspensión agitada de 25 ácido (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propanoico (10 g, 50,09 mmol) en THF (500 ml) a 0ºC durante un periodo de 45 minutos en atmósfera de nitrógeno. La suspensión resultante se agitó a 0ºC durante 30 minutos y después a 22ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción se añadió en porciones a metanol (500 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante tres días. La mezcla se concentró, se disolvió de nuevo en metanol (250 ml) y se concentró de nuevo (este procedimiento se repitió tres veces). El residuo se disolvió en DCM (75 ml) y se lavó con 30 NaOH 1 N (50 ml). La fase acuosa se extrajo con DCM (3 x 100 ml) y los extractos se combinaron con la fase orgánica. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera saturada (50 ml), se secaron sobre MgSO4 y se concentraron, produciendo el producto en bruto. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre sílice ultrarrápida, gradiente de elución de MeOH del 2 al 6%/amoniaco en DCM. Las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol (5,76 g, 61,9%) en forma de un sólido de color 35

blanco.

RMN 1H (400,13 MHz, CDCl3)  1,84 - 1,93 (2H, m), 3,76 - 3,81 (2H, m), 4,13 (1H, t), 7,23 - 7,25 (2H, m), 7,30 - 7,34 (2H, m).

EM m/e MH+ 186.

Intermedio 48: 4-(terc-Butoxicarbonilamino)-4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)piperidina-1-5 carboxilato de (S)-terc-butilo

Se añadió en una porción (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol (Intermedio 47) (1,09 g, 5,87 mmol) a ácido 1-(terc-butoxicarbonil)-4-(terc-butoxicarbonilamino)piperidina-4-carboxílico (Intermedio 70) (2,022 g, 5,87 mmol) y DIPEA (3,08 ml, 17,61 mmol) en DMA (20 ml). Se añadió hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-10 tetrametiluronio (2,456 g, 6,46 mmol) y la solución resultante se agitó a 20ºC durante 24 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, después se diluyó con EtOAc (300 ml) y se lavó secuencialmente con agua (50 ml) y salmuera saturada (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró, se evaporó y después se trituró con éter dietílico, produciendo el 4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)piperidina-1-carboxilato de (S)-terc-butilo en bruto (4,66 g, 155%) en forma de un sólido de color blanco. 15

RMN 1H (400,13 MHz, DMSO-d6)  1,39 (18H, s), 1,71 - 1,92 (6H, m), 3,06 (2H, s), 3,36 (2H, t), 3,54 - 3,65 (2H, m), 4,52 (1H, t), 4,89 (1H, c), 6,89 (1H, s), 7,29 - 7,34 (4H, m).

EM m/e M+Na+ 534.

Intermedio 49: (S)-4-Amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida

20

Se añadió cloruro de hidrógeno 4 M en dioxano (11,72 ml, 46,87 mmol) a 4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)piperidina-1-carboxilato de (S)-terc-butilo (Intermedio 48) (3 g, 5,86 mmol) en dioxano (30 ml). La solución resultante se agitó a 20ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se disolvió en metanol y se purificó por cromatografía de intercambio iónico, usando una columna SCX. El producto deseado se eluyó de la columna usando amoniaco 3,5 N/MeOH y las fracciones puras se evaporaron a sequedad, produciendo 25 (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida (1,970 g, 108%) en forma de una goma incolora.

RMN 1H (400,13 MHz, DMSO-d6)  1,20 - 1,28 (2H, m), 1,75 - 1,91 (4H, m), 2,67 - 2,83 (2H, m), 3,30 (2H, m), 4,87 (1H, s), 7,30 - 7,37 (4H, m).

EM m/e MH+ 312. 30

Intermedio 69: 4-(terc-Butoxicarbonilamino)piperidina-1,4-dicarboxilato de 1-terc-butil-4-metilo

Se disolvió 4-(terc-butoxicarbonilamino)piperidina-4-carboxilato de metilo (documento WO 2008075109) (10 g, 38,71 mmol) en DCM (194 ml). A esto se le añadió en porciones dicarbonato de di-terc-butilo (10,67 ml, 46,46 mmol). Después de la adición, la reacción se agitó a 25ºC durante 1 hora. El producto en bruto se lavó con bicarbonato 5 sódico saturado (3 x 50 ml) y las fases orgánicas se secaron sobre MgSO4 antes de evaporarse a sequedad, produciendo 4-(terc-butoxicarbonilamino)piperidina-1,4-dicarboxilato de 1-terc-butil-4-metilo (13,6 g, 98%) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (400,13 MHz, DMSO)  1,39 (9H, s), 1,40 (9H, s), 1,70-1,77 (2H, td), 1,88-1,92 (2H, d), 3,05 (2H, ancho), 3,61 (3H, s), 3,62-3,65 (2H, m), 7,33 (ancho, intercambio). 10

Intermedio 70: Ácido 1-(terc-butoxicarbonil)-4-(terc-butoxicarbonilamino)piperidina-4-carboxílico

Se añadió hidróxido de litio monohidrato (8,13 g, 193,62 mmol) a 4-(terc-butoxicarbonilamino)piperidina-1,4-dicarboxilato de 1-terc-butil-4-metilo (Intermedio 69) (13,88 g, 38,72 mmol) en agua (21,51 ml), THF (86 ml) y metanol (86 ml). La solución resultante se agitó a 20ºC durante 1 día. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc 15 (75 ml) y se lavó con agua (75 ml). La fase acuosa se ajustó a pH 5 con una solución 1 M de ácido cítrico, después se extrajo con EtOAc (3 x 200 ml). Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera saturada (50 ml), después se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron, produciendo el producto deseado, ácido 1-(terc-butoxicarbonil)-4-(terc-butoxicarbonilamino)piperidina-4-carboxílico (10,36 g, 78%), en forma de un sólido fino de color blanco.

RMN 1H (400,13 MHz, DMSO)  1,39 (9H, s), 1,40 (9H, s), 1,68-1,76 (2H, td), 1,89-1,92 (2H, d), 3,03 (2H, ancho), 20 3,62-3,65 (2H, d), 7,16 (intercambio), 12,36 (intercambio).

Los efectos biológicos del compuesto de la invenci ón se pueden ensayar como se establece más adelante.

Ensayo de fosforilación de GSK-3 In Vitro de adenocarcinoma de mama humano MDA-MB-468

Este ensayo determina la capacidad de los compuestos de ensayo para inhibir la fosforilación del resto de Serina-9 en Glicógeno Sintasa Quinasa- 3beta (GSK-3β) como un marcador sustituto de la actividad celular de PKB (Akt), 25 según se determina usando la tecnología de lector de Placas Acumen Explorer Fluorescent. Una línea de células de adenocarcinoma de mama humano MDA- MB-468 (LGC Promochem, Teddington, Middlesex, Reino Unido, Nº de catálogo HTB-132) se mantuvo de manera rutinaria en medio de crecimiento de Tagle modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen Limited, Paisley, Reino Unido Nº de catálogo 11966-025) que contiene 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor al (FCS; Sigma, 103060-1 Poole, Dorset, Reino Unido Nº de catálogo F0392) y 1% de L-30 glutamina (Gibco, Nº de catálogo 25030-024) a 37°C con 5% CO2 hasta una confluencia de 70 - 90 %.

Para el ensayo de fosforilación, se separaron las células del matraz usando Tripsina-EDTA (Invitrogen Limited, Nº de catálogo 25300-062) y se sembraron en los pocillos de una placa de poliestireno de 96 pocillos de fondo negro transparente Corning Costar (Fisher Scientific Reino Unido, Loughborough, Leicestershire, Reino Unido Nº de catálogo 3904 y DPS-130-020K) a una densidad de 5000 células por pocillo en 100μl de medio de crecimiento 35 completo. Las células se incubaron durante toda una noche a 37°C con 5% de CO2 para dejar que se

adhirieran.

El día 2, las células se trataron con los compuestos de ensayo y se incubaron durante 2 horas a 37°C con 5% de CO2. Los compuestos de ensayo se prepararon en forma de soluciones madre 10 mM en DMSO y se dosificaron directamente hasta la concentración requerida en los pocillos de ensayo usando la tecnología de dosificación de ECHO de no contacto (dispensión acústica de 2,5 nl de gotitas múltiples directamente en los pocillos de ensayo) 5

(Labcyte Inc. Sunnyvale, California, Estados Unidos). Cada placa contenía pocillos de control sin compuesto de ensayo.

20 μl de tampón de fijación (Solución salina Tamponada con Fosfato (PBS) que contenía 10% de formaldehído; Sigma; Nº de catálogo F1635) se añadió después a cada pocillo para proporcionar una concentración en pocillo final de 1.6%. Después las plaacs se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de que se retiraran las 10 que se habían fijado. Cada pocillo se lavó una vez con 250 μl de PBS y después se añadieron 50 μl de PBS a cada pocillo. Después se aspiró el PBS y las células se permeabilizaron y se bloquearon mediante incubación de cada pocillo con 50 μl de tampón de permeabilización/bloqueo (PBS 20 que contenía 0,5% de Tween 20 (Sigma; Nº de catálogo P5927) y 5% de Polvo de Marvel Milk (Andrews Pharmacy Ltd, Macclesfield, Cheshire, Reino Unido; Nº de catálogo APC100199)) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de teñir. 15

Después de la retirada del tampón Perm/Bloqueo, se añadieron 50 μl de anticuerpo primario anti-fosfo-GSK-3β (Tecnología de señalización de Células (New England Biolabs (Reino Unido) Ltd.), Hitchin, Hertfordshire, REINO UNIDO; Nº de catálogo 9336 diluido 1:400 en tampón de bloqueo (PBS que contenía 5% de Marvel y 0,05% de Tween/Polisorbato 20) a cada pocillo y se incubaron durante toda uan noche a 4ºC.

Cada pocillo se lavó tres veces en 250 μl de tampón de lavado (PBS que contenía 0,05% de polisorbato 20), y se 20 incubaron las células durante 1 hora a temperatura ambiente con 50 μl de anticuerpo secundario anti-rabbit Alexa Fluor 488 marcado fluorescentemente (Molecular Probes, Invitrogen 103060-1

Limited, Nº de catálogo A11008) diluido 1:750 en tampón de bloqueo. Las plaacs se lavaron tres veces en 250 μl de tampón de lavado y se almacenaron para que contuviera 50 μl de PBS a 4ºC hasta que se necesitara.

Las placas se analizaron usando un lector de placas Acumen Explorer para cuantificar el nivel de la señal 25 fluorescente que representa la cantidad de GSK- 3β fosforilado. Los compuestos activos provocaron una disminución en la fosforilación de fosfo-GSK-3β con relación al control máximo (sin dosificar) para cada ensayo., que se mide por el número de objetos fosforilados por pocillo, y la potencia permitida de inhibidores de PKB (Akt) a determinar.

Cálculo de CI50 - CI50 es la concentración de compuesto requerida para proporcionar el 50% de efecto sobre el 30 intervalo de actividad afectada por el compuesto, entre los datos de control de respuesta máxima (sin compuesto) y mínima (nivel en exceso de compuesto). Los valores de CI50 se determinaron mediante ajuste de los datos antecedentes corregidos, ensayo de respuesta de dosis a un modelo de ecuación de ajuste de curva de logística de 4 parámetros con la respuesta mínima fijada en cero. Esto se realizó usando un algoritmo desarrollado en casa dentro del paquete de software de formación de gráficos Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, 35 Estados Unidos).

Los ejemplos de la invención se ensayaron en en ensayo anterior y se calcularon sus valores medios de CI50. Estos valores se muestran en la Tabla G.

Ensayo In vitro de AKT1 quinasa

Este ensayo detecta los inhibidoers de la actividad de la AKT1 (PKBα) quinasa usando Caliper LabChip LC3000. El 40 ensayo de desplazamiento de movilidad de incubación fuera de Caliper usa un procesador de microfluidificación para medir la conversión de un péptido marcado fluorescente para un producto fosforilado mediante una quinasa respectiva. La reacción de enzima completa se lleva a cabo en placas de microtitulación y después se inactiva. Las soluciones paradas resultantes se transportaron en “serie” a través de un capilar sobre el procesador, donde el sustrato de péptido y el producto fosforilado se separan mediante electroforesis. Después se detectan mediante 45 fluorescencia inducida por láser. El sustrato y producto se eparan en dos máximos mediante la aplicación de un campo eléctrico alto y directamente se detectan usando fluorescencia. La firma de la señal fluorescente revela el grado de la reacción.

Para la dosificación de Echo el disolvente era 100% de DMSO. Se prepare una placa maestra con 40 ul de solución madre de nuestra Primary Liquid Store en el cuadrante 1 de una placa de 384 pocillos Labcyte. Se realizó una 50 dilución 1 en 100 del cuadrante 1 en el cuadrante 2 retirando 0,4 ul y añadiéndolo a 39,6 ul de DMSO. Posteriormente diluciones 1 en 100 se realizaron en un cuadrante 3 del cuadrante 2 y cuadrante 4 del cuadrante 3.

Se dispensaron gotitas múltiples de 2,5 nl de cada cuadrante de la placa maestra usando la tecnología de

dosificación de ECHO (Labcyte Inc. Sunnyvale, California, Estados Unidos) para generar el intervalo de dosis que se requería en el ensayo. El intervalo de dosis más comúnmente usado era< como sigue: 100 uM, 30 uM, 10 uM, 3 uM, 1 uM, 0,3 uM, 0,1 uM, 0,03 uM, 0,01 uM, 0,003 uM, 0,001 uM, 0,0001 uM. Cada pocillo se volvió a llenar con dimetilsulfóxido (DMSO) hasta un volumen total de 120 nl, de manera que cuando la mezcla de enzima y sustrato se añade la concentración final de DMSO era 1%. Se añadió DMSO a los pocillos de de control máximos tanto como 5 120 nl, los pocillos de control mínimos se trataron con 120 nl de compuesto a una concentración que inhibe la actividad de la enzima en un 100%.

Después de la adición del compuesto o control a la placa de ensayo, se añadieron 6 μl de mezcla de péptidos que contenía sustrato 3 μM (5-FAM- GRPRTSSFAEG-CONH2; CRB) y 40 μM de ATP en tampón de base de Quinasa (100 mM Hepes pH 7,5, 0,015% Brij-35) y 6 μl de mezcla de enzimas que contenía 8 nM AKT1/PKBα de enzima 10 activa (Upstate Biotechnology, Nº de catálogo 14-276), 8 mM DTT y 20 mM MgCl2 en tampón base de quinasa. Todos los tampons se completaron con agua 18 MΩ water. Las placas se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 50 minutos. Se detuvo la reacción mediante la adición de 10 μl de tampón de parada (100 mM Hepes pH 7,5, solución 0,015% Brij-35, 0,1% de reactivo de recubrimiento nº 3, 40 mM EDTA, 5% DMSO) a cada pocillo (las placas N.B. se pueden congelar después de la parada y se leyeron más tarde). Después las placas se 15 analizaron usando el Sistema Caliper LabChip LC3000 Drug Discovery (Caliper Life Sciences, 1 Wellfield, Preston Brook, Runcorn, WA7 3AZ) usando las siguientes condiciones de separación; -1.8 PSI (12,411 kPa), -500 de tensión hacia arriba, -1700 de tensión hacia abajo, tiempo de toma de muestra de 0,2 seg, tiempo de toma de muestra de posterior de 30 seg y un retraso final de 120 seg. La integración de máximos del sustrato y del producto se llevaron a cabo usando el software Caliper LabChip y se calcularon als curvas de CI50 usando el software Origin® (OriginLab 20 Corporation, Northampton, MA, Estados Unidos). Se ensayaron los ejemplos de la invención en el ensayo de enzima in vitro de AKT1 y los valores medios obtenidos de CI50 se presentan en la Tabla G.

Tabla G

Número de ejemplo

Media de PKB celular CI50 (μM) Media de PKBα In vitro CI50 (μM)

9

0,09 0,0032

13

0,09 0,0042

15

> 3,10 0,093

Análisis de hERG 25

Cultivo de células

Las células de ovario de hámster chino (CHO) K1 que expresan hERG descritas por (Persson, Carlsson, Duker, & Jacobson, 2005) se desarrollaron hasta semi confluencia a 37 C en un ambiente humidificado (5% de CO2) en medio F-12 Ham que contiene L-glutamina, 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 0,6 mg/ml de higromicina (todo se Sigma-Aldrich). Antes de uso, la monocapa se lavó usando una alícuota de 3 ml calentada previamente (37°C) de 30 Versene 1:5.000 (Invitrogen). Después de la aspiración de esta solución se incubó el matraz a 37 °C en un incubador con 2 ml adicionales de Versene 1:5.000 durante un período de 6 minutos. Después las células se desprendieron del fondo del matraz mediante un golpeado ligero y suave y se añadieron después 10 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía calcio (0,9 mM) y magnesio (0,5 mM) (PBS; Invitrogen) al matraz y se aspiró en un tubo de centrífuga de 15 ml antes la centrifugación (50 g, durante 4 mins). Se desechó el 35 sobrenadante resultante y se volvió a suspender el sedimento resultante en 3 ml de PBS. Se retiró una alícuota de 0,5 ml de suspensión de células y se determine el número de células viables (basándose en la exclusión de azul de triptano) en un lector automático (Cedex; Innovatis) de manera que el volumen de resuspensión celular se puede ajustar con PBS proporcionando la concentración de células final deseada. Si está la concentración en este momento en el ensayo que se cita cuando se refiere a este parámetro. Las células CHO-Kv1.5, que se usaron para 40 ajustar la compensación de tensión sobre IonWorks® HT, se mantuvieron y se prepararon de la misma manera.

Electrofisiología

Los principios y operación de este dispositivo se han descrito por (Schroeder, Neagle, Trezise, & Worley, 2003). En resumen, la tecnología se basa en una placa de 384 pocillos (PatchPlate®) en la que se intenta un registro en cada pocillo mediante el uso de succión a la posición y se mantiene una célula en un pequeño agujero separando dos 45 cámaras de fluido aisladas. Una vez que el sellado ha tenido lugar, la solución en la parte inferior de la PatchPlate® se cambia a una que contiene amfotericina B. esto permeabiliza el parche de la membrana celular que cubre el agujero en cada pocillo, y, en efecto, permite que se pueda realizar un registro de patch clamp de célula entera.

Se usó un ensayo β IonWorks® HT de Essen Instrument. No existe ninguna capacidad para calendar las soluciones en este dispositivo ya que funciona a temperatura ambiente (~ 21°C), como sigue. El depósito en la posición "Tampón" se cargo con 4 ml de PBS y la de la posición "Células" con la suspensión de células CHO-hERG descrita anteriormente. Una placa de 96 pocillos (de fondo en V, Greiner Bio-one) que contenía los compuestos a ensayar (a 3 veces por encima de la concentración de ensayo final) se colocó en la posición de “Placa 1” y una 5 PatchPlate® y se pinzó en la situación PatchPlate®. Cada placa< de compuesto se situó en 12 columnas para permitir diez, las curves concentración - efecto de 8 puntos a construir; las dos columnas restantes sobre la placa se ocuparon con vehículo (concentración final 0,33% de DMSO), para definir los resultados iniciales del ensayo, y una concentración de bloqueo supra-máxima de cisaprida (concentración final 10 μM) para definir el nivel de inhibición de 100%. El cabezal hidraúlico (cabezal F) de IonWorks® HT añadió después 3,5 µl de PBS a cada pocillo de 10 PatchPlate® y su lado inferior se perfundió con solución “interna” que tenía la siguiente composición (en mM): K-Gluconato 100, KCl 40, MgCl2 3,2, EGTA 3 y HEPES 5 (todos de Sigma-Aldrich; pH 7,25 – 7,30 usando 10 M KOH). Después del cebado y quitar las burbujas, el cabezal electrónico (cabezal E) se movió después alrededor de la PatchPlate® realizando un ensayo de perforación (es decir aplicando un pulso de tensión para determinar si la perforación en cada pocillo estaba abierta). El cabezal F después dispensó 3,5 µl de la suspensión de células 15 descrita anteriormente en cada pocillo de la PatchPlate® y se proporcionó a las células 200 segundos para alcanzar y sellar la perforación en cada pocillo. Después de esto, el cabezal E se movió alrededor de la PatchPlate® para determinar la resistencia del sello obtenida en cada pocillo. A continuación, la solución en la parte inferior de la PatchPlate® se cambió a solución de “acceso” que tenía la siguiente composición (en mM): KCl 140, EGTA 1, MgCl2 1 y HEPES 20 (pH 7,25 - 7.30 usando 10 M KOH) más 100 μg/ml de amfotericina B (Sigma-Aldrich). Después 20 de dejar 9 minutos para que tuviera lugar la perforación del parche, el cabezal E se movió alrededor de la PatchPlate® de 48 pocillos en un momento para obtener las mediciones de coriente del compuesto previo de hERG. El cabezal F añadió después 3,5 μl de solución de cada pocillo de la placa del compuesto a 4 pocillos sobre la PatchPlate® (la concentración final de DMSO era 0,33% en cada pocillo). Esto se logró trasladando el compuesto del pocillo más diluido al más concentrado de la placa para minimizar el impacto de cualquier compuesto arrastrado. 25 Después de aproximadamente 3,5 minutos de incubación, el cabezal E se movió alrededor de la PatchPlate® de 384 pocillos para obtener las mediciones de corriente del compuesto posterior de hERG. De esta forma, se pueden producir las curvas de concentración - efecto no acumulativas donde, con tal que los criterios de aceptación se lograran en un porcentaje suficiente de pocillos (véase más adelante), el efecto de cada concentración del compuesto de ensayo se basó en el registro de las células 1 y 4 células. 30

La corriente del compuesto previo y posterior de hERG se evocó mediante un pulso de tensión individual de un período de 20 s que se mantenía a -70 mV, una etapa de 160 ms a -60 mV (obteniendo una estimación de escape), de nuevo una etapa de 100 ms -70 mV, una etapa de 1 s a + 40 mV, una etapa de 2 s a -30 mV y finalmente una etapa de 500 ms a – 70 mV. Entre los pulsos de la tensión del compuesto previo y posterior no había ningún pinzamiento del potencial del potencial de la membrana. Las corrientes se restaron de la pérdida basándose en la 35 estimación de la corriente evocada durante la etapa de +10 mV al comienzo del protocolo de pulso de tensión. Cualesquiera compensaciones de tensión en IonWorks® HT se ajustaron en una de dos formas. Cuando se determina la potencia del compuesto, se aplicó una rampa de tensión de despolarización a las células CHO-Kv1.5 y se anotó la tensión a la que existía un punto de inflexión en el indicio de corriente (es decir el punto en el que la activación del canal se observa con un protocolo de rampa). La tensión a la que se produce esto se había 40 determinado previamente usando el mismo comando de tensión en la electrofisiología convencional y se encontró que era –15 mV (datos no mostrados); de este modo un potencial de compensación se puede meter en el software IonWorks® HT usando este valor como un punto de referencia. Cuando se determinan las propiedades electrofisiológicas básicas de hERG, se ajustó cualquier compensación mediante la determinación del potencial inverso de la corriente de cola de hERG en IonWorks® HT, comparándolo con el encontrado en la electrofisiología 45 convencional (-82 mV) y después haciendo el ajuste de compensación necesario en el software IonWorks® HT. Se muestreó la señal de corriente a 2,5 kHz.

La magnitud de la corriente antes y después del barrido de hERG se midió automáticamente a partir de los indicios restados de la pérdida mediante el software IonWorks® HT tomando una media de 40 ms de la corriente durante el período de mantenimiento inicial a–70 mV (corriente inicial) y restando esto del máximo de de la respuesta de 50 corriente de cola. El criterio de aceptación para als corrientes evocadas en cada posillo eran: resistencia de sellado antes del barrido > 60 M, amplitud de la corriente de cola de hERG antes del barrido > 150 pA; resistencia del sello después de barrido > 60 M. el grado de inhibición de la corriente de hERG se ensayó dividiendo la corriente de hERG después del barrido por la corriente respectiva de hERG antes de barrido para cada pocillo.

Resultados de los análisis de hERG 55

Ejemplo 9, (S)-4-amino-N-(1-(4-chlorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida, se ensayó en concentraciones de hasta 100μM de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente y por extrapolación de la curva se obtuvo un valor medio de CI50 de hERG de 177 μM.

Experimentos In vivo

Análisis farmacodinámico de GSK3β y PRAS40, proteínas sustrato de PKB como respuesta a (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida

2,5 x 106 de células U87-MG (ATCC número HTB-14®) + 50% de matrigel se inyectaron s.c. (por vía subcutánea) en el costado del ratón desnudo. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 0,5 cm3 se proporcionó una dosis aguda de 150 ó 300 mg/kg de (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-5 pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (E9) p.o. (sonda nasogástrica oral). Se sacrificaron mediante eutanasia a los animales en el momento especificado y se diseccionaron los tumores y se congelaron de manera repentina en nitrógeno líquido.

Se prepararon lisados de tumores ex-vivo en tampón 10% triton-X-100 Tris Lysis que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa usando la metodología ‘FastPrep 24’ (MP Biomedicals matrix nº 6910-500). Se estimaron las 10 concentraciones de proteína contra una curva estándar de BSA usando el kit Pierce BCA (nº 23225). Se midió pGSK3β mediante transferencia de western y pPRAS40 mediante ELISA de sandwich de fase sólida (Biosource KHO0421).

Para la transferencia de western, se resolvieron cantidades equivalentes de proteína mediante gradiente 4 - 12% de geles Bis-Tris poliacrilamida antes de moldeado (Invitrogen NP0323), se transfirieron a membranes de 15 nitrocelulosa Hybond C Extra (Invitrogen LC2001) y se incubaron con antisuero primario (pGSK3β ser9, Cell Signaling Technology nº 9336; GSK3β total, BD Transduction Labs nº 610202) y posteriormente con cualquier anti- conejo IgG conjugado a peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling Technology nº 7074) o anti-ratón IgG ( Cell Signalling Technology nº 7076). Se detectaron las proteínas inmunorreactivas mediante quimioluminiscencia potenciada (nº 34076 Pierce Supersignal Dura) y las bandas se cuantificaron con un ChemiGenius II (Syngene). Los 20 valores representados gráficamente muestran el porcentaje de inhibición de pGSK3β comparados con los controles de vehículo, después de la normalización para pGSK3β total.

Para ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas), se añadieron cantidades equivalentes de proteína a una placa de 96 pocillos recubierta previamente con un anticuerpo monoclonal específico de pPRAS40 de ‘captura’. Se añadió después un anticuerpo de ‘detección’ específico de pPRAS40 (Thr 246) seguido de un anticuerpo anti-25 conejo IgG marcado con HRP. Después se cuantificó el ensayo usando TMB (tetrametilbenzidina) a 450 nm sobre un lector de placas. La intensidad de color es proporcional a la concentración de pPRAS40 (Thr 246). Los resultados se muestran en la Figura 1.

Estudio de antitumor de MCF-7 usando (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3- hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (E9) 30

Se obtuvieron ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) de los laboratorios Charles River. Los ratones se alojaron y se mantuvieron en condiciones específicas, sin patógenos. Para el implante in vivo, se recogieron las células de un matraz de cultivo de tejido T225 mediante un tratamiento de 2- a 5-minutos con 3 x tripsina (Invitrogen) en solución de EDTA seguido de la suspensión en emdio básico y tres lavados en solución salina tamponada con fosfato (Invitrogen). Solamente las suspensiones de células individuales de más de un 90% 35 de viabilidad, como se determina por exclusión de azul de tripano, se usaron para inyección. Se inyectaron células de tumor de mama MCF-7 (ATCC número HTB-22) (5 x 106 células + 50% de Matrigel) se inyectaron por vía subcutánea en el costado izquierdo del animal en un volumen de 0,1 ml. Antes del implante de las células MCF-7, se anestesiaron ratones SCID y se implantaron con un gránulo de estrógeno de 0,5 mg/21 días de duración. Cuando el tamaño medio del tumor alcanzó ~ 0.3 cm3, los ratones se distribuyeron al azar en grupos de control y de 40 tratamiento. El grupo de tratamiento recibió 300 mg/kg de E9 solubilizado en un vehículo que consistía en 10% (v/v) de DMSO, 25% (p/v) de Kleptose en agua, mediante sonda nasogástrica oral. El grupo control recibió el vehículo solo, una vez al día mediante sonda nasogástrica oral. Los volúmenes tumorales (medidos mediante calibre) se registraron a intervalos durante la duración del estudio. Se sacrificaron los ratones mediante eutanasia con CO2. Se calculó el volumen tumoral (tomando que es la longitud el diámetro más largo a través del tumor y la anchura que es 45 el diámetro perpendicular correspondiente usando la fórmula: (longitud x anchura) x (longitud x anchura) x (/6). Se determine la inhibición de crecimiento desde el comienzo del tratamiento mediante comparación de las diferencias en el volumen de tumor entre los grupos control y tratados. Debido a que la varianza en los datos del volumen de tumor medio se incrementan proporcionalmente con el volumen (y por lo tanto no existe proporcionalidad entre los grupos), los datos se transformaron logarítmicamente para eliminar cualquier dependencia 50 del tamaño antes de la evolución estadística. La significación estadística se evaluó usando un ensayo t de una cola, dos muestras. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Predicción de Dosis Humana

55

La predicción de dosis humana para estudios clínicos requiere un cálculo aproximado de parámetros farmacocinéticos humanos (PK) importante para definir el T1/2 de eliminación y la forma y magnitud de la concentración plasmática frente a perfil temporal a una dosis particular. Estos parámetros estimados incluyen Eliminación, Volumen de Distribución en el Estado Estacionario (Vss), constante de velocidad de de absorción (Ka),

biodisponibilidad (F) y frecuencia de dosificación. Las predicciones de dosis humanas requieren también alguna evidencia farmacológica acerca de cómo la exposición está relacionada con la eficacia (McGinnity, Collington, Austin & Riley, Current Drug Metabolism 2007 8 463-479).

Para (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (E9), la eliminación humana se estimó a partir de los datos de la eliminación intrínseca (Clint) determinados en 5 hepatocitos humanos corregidos a eliminación in vivo mediante incorporación del modelo de compartimentos bien agitados (Riley, McGinnity & Austin, Drug Metabolism & Disposition 2005 33(9) 1304-1311). Se observaron diferencias de poca importancia en la unión de proteínas de plasma del compuesto entre rata, perro y ser humano; consecuentemente, los valores de Vss de rata y perro observados se corrrigieron mediante el factor Fu, ser humano/Fu (de rata o de perro) (donde Fu = fracción no unida en plasma). El Vss de ser humano se estimó que es 10 3,3 l/kg usando esta aproximación. La fracción absorbida (Fabs) en seres humanos se tomó como el promedio entre rata y perro. Este parámetro Fabs se ajustó después a biodisponibilidad (F) mediante corrección para extracción hepática. La velocidad de absorción (Ka) se ajustó para asegurar que el Tmáx. fue 1 hora para E9, un valor relativamente conservador dado que se observó preclínicamente, y resultaría igualmente en un valor de Cmáx. relativamente conservador para usar en cálculo de márgenes con respecto a estudios de seguridad. La frecuencia 15 de dosificación clínica deseada se asume que es dos veces diariamente (BID).

Habiendo definido la forma y magnitud de la curva de concentración plasmática humana frente a tiempo, la etapa final fue ajustar la dosis de tal manera que se lograron las concentraciones plasmáticas que son probables para conseguir eficacia. En estudios de PD de ratón, la inhibición de pGSK (un punto final sustituto para actividad antitumoral) se ha observado cuando las concentraciones plasmáticas libres exceden de una vez CI50 para cada 20 compuesto como se mide en el ensayo celular de actividad inhibidora de AKT, corregida para unión debido al Suero de Ternero Fetal presente en el ensayo. Consecuentemente, el modelo de PK humano supone que la exposición libre a E9 debe exceder la CI50 de PKB libre para asegurar eficacia clínica.

Poniendo todos estos datos juntos, se predice (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (E9) para requerir una dosis humana de aproximadamente 7mg/kg BID para 25 conseguir eficacia, con una semivida estimada que está alrededor de 6 horas.

Lista de Figuras

Figura 1: niveles de fosforilación de GSK3β y PRAS40 en muestras tomadas de U87-MG tumores desarrollados en 30 ratones desnudos después de una dosis aguda de 150 ó 300 mg/kg de (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1- (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida (E9), n = 5 por instante.

Figura 2: Resultados de estudio de antitumor MCF-7 en ratones SCID usando una dosis una vez al día (QD) de 300 mg/kg de (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)- 3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida 35 (E9).

Referencias

Persson, F., Carlsson, L., Duker, G., & Jacobson, I. (2005). Blocking characteristics of hERG, hNav1.5, and hKvLQT1/hminK after administration of the novel anti-arrhythmic compound AZD7009. J Cardiovasc.Electrophysiol., 16, 329 - 341. 40

Schroeder, K., Neagle, B., Trezise, D. J., & Worley, J. (2003). Ionworks HT: a new high-throughput electrophysiology measurement platform. J Biomol Screen., 8, 50 - 64.

Claims (19)

1. imagen1

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   imagen3

   imagen4

   imagen5

   REIVINDICACIONES

   1. El compuesto: (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida:

   5

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
2. 2. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, conjuntamente con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso como un medicamento. 10
4. 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de cáncer.
5. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de cáncer, donde el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, linfoma No-Hodgkins, cáncer pancreático, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. 15
6. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de cáncer de mama.
7. 7. El uso del compuesto que se reivindica en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.
8. 8. El uso del compuesto que se reivindica en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, 20 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, donde el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, linfoma No-Hodgkins, cáncer pancreático, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de próstata y cáncer de pulmón.
9. 9. El uso del compuesto que se reivindica en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de mama. 25
10. 10. El compuesto: (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidina-4-carboxamida, de acuerdo con la reivindicación 1.
11. 11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento de cáncer.
12. 12. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento de cáncer, donde el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, linfoma No-Hodgkins, cáncer pancreático, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, 30 cáncer de próstata y cáncer de pulmón.
13. 13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento de cáncer de mama.
14. 14. Un proceso para la preparación del compuesto que se reivindica en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde el proceso comprende la reacción de un ácido de Fórmula (II) con (S)-3-amino-3-(4-clorofenil)propan-1-ol: 35

    en la que P1 representa un grupo protector adecuado; y de aquí en adelante, si es necesario:

    eliminar el grupo protector; y/o 5

    formar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. 15. El proceso que se reivindica en la reivindicación 14, donde P1 representa un grupo protector terc-butoxicarbonilo.
16. 16. El compuesto: (S)-4-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropilcarbamoil)-1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperidin-4-ilcarbamato de terc-butilo:

    10
17. 17. Un proceso para la preparación del compuesto que se reivindica en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde el proceso comprende la reacción de (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida con un heterociclo bicíclico de Fórmula (V):

    15

    en la que L1 representa un grupo saliente adecuado; y de aquí en adelante, si es necesario, formar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
18. 18. El proceso que se reivindica en la reivindicación 17, en el que L1 es cloro.
19. 19. El compuesto: (S)-4-amino-N-(1-(4-clorofenil)-3-hidroxipropil)piperidina-4-carboxamida: