CN114601836B - 一种akt抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，医药技术领域，解决了现有技术中乳腺癌治疗过程中，有大量患者存在化疗耐药的问题。本发明的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，所述AKT抑制剂为(S)‑4‑氨基‑N‑(1‑(4‑氯苯基)‑3‑羟基丙基)‑1‑(7H‑吡咯并[2,3‑d]嘧啶‑4‑基)哌啶‑4‑羧酰胺，即所述AKT抑制剂为Capivasertib。本发明通过所述AKT抑制剂可逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡，从而可提高化疗药物的治疗疗效，使患者获益。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型，根据基因表达差异将乳腺癌分为LuminalA，Luminal B，人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）富集和基底样型乳腺癌。临床上常根据雌激素受体（estrogen receptor，ER），孕激素受体（progesterone receptor，PR），HER2以及增殖指标Ki67的免疫组织化学结果分为Luminal A，Luminal B（HER2+），Luminal B（HER2-），HER2+，三阴型乳腺癌。不同分子分型的乳腺癌具有不同的临床表现和预后。目前除了常规手术治疗和术后辅助放化疗外，乳腺癌新辅助化疗已成为临床II、III期，HER2阳性或三阴性乳腺癌推荐的治疗方案。新辅助化疗是局部晚期或炎性乳腺癌的规范治疗方法，可将不可手术变为可手术；将不可保乳的乳腺癌降期为可保乳。新辅助化疗后的肿瘤缓解率可以较为直接地反映患者对化疗药物的敏感性，从而不仅可反映肿瘤对后续治疗的响应，也是目前研究肿瘤化疗耐药机制的重要途径。
乳腺癌的新辅助化疗于1970年引入临床，其中以蒽环类和紫杉醇类为基础的新辅助化疗是最常见的方案。2003年-2011年接受新辅化疗的Ⅰ-Ⅲ期乳腺癌患者从12.2%提高到24%；蒽环类与紫杉类序贯方案的病理完全缓解率为11%-31%，蒽环类与紫杉类联合方案的病理完全缓解率为8%-16%。对于不同分子分型的乳腺癌，雌孕激素受体阳性乳腺癌虽然预后较好，但对化疗的敏感性最差，肿瘤可能对新辅助化疗有反应，但病理完全缓解并不常见。另外，由于缺乏治疗靶点，化疗是三阴性乳腺癌的主要治疗方法，但仍有部分患者无法从中获益。三阴性乳腺癌新辅助化疗的病理完全缓解率约30%，高于ER阳性的Luminal A和Luminal B亚型。然而，约20%的乳腺癌患者对新辅助化疗不敏感；8%-10%的患者在接受新辅助化疗后出现疾病进展，甚至失去局部治疗的时机；在三阴性乳腺癌患者中，30%-50%会产生新辅化疗耐药。化疗药物耐药已成为有效治疗癌症的主要障碍。因此对乳腺癌化疗理论及耐药机制的研究，有望逆转耐药的过程。
阿霉素是蒽环类代表药物，有研究表明，阿霉素治疗可以从多个途径导致铁代谢的改变，而这也是阿霉素引起心肌受损副作用的重要原因。有研究表明，阿霉素诱导的HO-1上调通过亚铁血红素降解促进非血红素铁的积累，进而导致脂质过氧化和铁死亡。但是，目前尚未有研究报道阿霉素通过铁死亡途径导致癌细胞死亡的理论机制。
许多患者在治疗过程中对蒽环类药物表现出耐药，因此大量的研究对其耐药机制进行了报道。其耐药机制主要涉及以下几个方面：（1）药物摄取和外排的改变：编码Pgp的MDR1/ABCB1基因的上调和/或扩增可导致外排泵的高表达，介导了包括蒽环类药物在内的多种细胞内底物的跨膜转运进而导致多药耐药（MDR）。（2）DNA修复的改变：DNA损伤修复是耐药的重要因素之一，有研究者利用5种细胞系，这些细胞系分别缺乏了参与主要DNA修复途径(同源重组、错配修复、核苷酸切除修复、DNA链交联修复和非同源末端连接)的功能蛋白，结果表明NER和HR是蒽环-DNA加合物修复的重要机制。乳腺癌易感基因1 (BRCA1)突变导致DNA双链断裂修复和交联的同源重组修复减少，最终导致基因组不稳定。（3）拓扑异构酶II活性的改变：拓扑异构酶IIα亚基的突变和/或异常表达IIα亚基，抑制拓扑异构酶IIα调节的凋亡信号以及拓扑异构酶IIα的胞质定位胞质而非核定位均能造成临床蒽环耐药。然而，即使拓扑异构酶II的表达不变，转录后的修饰包括磷酸化，sumo化，以及泛素化，都会影响拓扑异构酶IIα和拓扑异构酶IIβ的正常活性，从而影响蒽环疗效。（4）抗氧化防御：谷胱甘肽直接参与活性氧和其他氧化分子的减少，并通过涉及谷胱甘肽-s-转移酶的机制参与细胞解毒。谷胱甘肽-s-转移酶是一类催化还原型谷胱甘肽与异种底物结合的酶。（5）细胞死亡反应：线粒体（固有途径）和细胞表面受体（非固有途径）介导的细胞凋亡是导致程序性细胞死亡的两种主要途径。在固有途径中，促凋亡Bcl-2蛋白家族与抗凋亡Bcl-2蛋白家族的相对浓度决定了细胞是否存活或凋亡，并可能在某些情况下形成抗肿瘤耐药的基础。
DNAJC12（DnaJ热休克蛋白家族成员C12）是一种热休克蛋白。热休克蛋白（Heatshock proteins，HSPs）是由热休克或其他应激源诱导表达的一类参与蛋白质折叠和成熟的蛋白质。根据分子量可以分为HSP27、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90和大HSPs几个亚组。HSPs在细胞增殖、分化和癌变过程中起着重要作用。DNAJC12属于HSP40亚组，在N端含有特征性的J区域。目前国内外有关DNAJC12的研究较少，主要集中在DNAJC12基因的突变与高苯丙氨酸血症，帕金森，单胺类神经递质代谢先天缺陷等相关，除此之外有文献报道DNAJC12表达的增加与胃癌的侵袭性表型有关，DNAJC12高表达可预测直肠癌患者对新辅助同步放化疗的不敏感。还有文献表明DNAJC12是雌激素受体的靶基因，其表达可作为雌激素受体反式激活活性的标志，对激素治疗的反应可能具有预测价值。免疫沉淀实验证实，内源性DNAJC12和Hsc70蛋白在LNCaP细胞中相互作用，阐明了DNAJC12在调节Hsp70功能中的作用。
在过去的几十年里，即使许多耐药途径已经被调控，仍有大量的患者存在化疗耐药。虽然化疗诱导的细胞凋亡是乳腺癌治疗的一个重要信号通路，但如果有新的死亡途径尚未被研究发现，耐药性就不能完全解决，仍然有大量乳腺癌患者多线治疗失败走到最后无药可用的地步。为此，透彻研究乳腺癌化疗耐药机制，寻找影响乳腺癌化疗疗效的关键基因，最终能逆转其耐药过程，对于乳腺癌的治疗具有重大的科学和临床价值。
发明内容
本发明的目的是提出一种AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，解决了现有技术中乳腺癌治疗过程中，有大量患者存在化疗耐药的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，所述AKT抑制剂为(S)-4-氨基-N-(1-(4-氯苯基)-3-羟基丙基)-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-羧酰胺，并且所述AKT抑制剂的结构式为：
所述AKT抑制剂用于逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡。
根据一个优选实施方式，所述AKT抑制剂通过抑制AKT的磷酸化来逆转DNAJC12高表达引起的对铁死亡的抑制作用，以逆转乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性并促进乳腺癌细胞铁死亡。
根据一个优选实施方式，所述AKT抑制剂通过下调铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11的蛋白表达来逆转DNAJC12高表达引起的对铁死亡的抑制作用。
根据一个优选实施方式，所述AKT抑制剂还用于逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的细胞凋亡抑制作用，以促进乳腺癌细胞凋亡。
根据一个优选实施方式，所述化疗药物包括蒽环类化疗药物和/或紫杉醇类化疗药物。
根据一个优选实施方式，所述化疗药物包括阿霉素。
根据一个优选实施方式，所述乳腺癌细胞系包括如下分子亚型：雌激素受体和孕激素受体中至少一个为阳性的细胞系，或者是人表皮生长因子受体2为阳性的细胞系。
根据一个优选实施方式，所述乳腺癌细胞系包括如下分子亚型：BT-474、MCF-7、SK-BR-3。不限于此，本发明的AKT抑制剂也可用于其余分子亚型的乳腺癌治疗中。
根据一个优选实施方式，所述AKT抑制剂的浓度为4~8μM。
根据一个优选实施方式，所述AKT抑制剂的浓度为4μM或8μM。
本发明的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用至少具有如下有益技术效果：
本发明的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，所述AKT抑制剂为(S)-4-氨基-N-(1-(4-氯苯基)-3-羟基丙基)-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-羧酰胺，即所述AKT抑制剂为Capivasertib，所述AKT抑制剂用于逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡，从而可提高化疗药物的治疗疗效，使患者获益。
即本发明的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，解决了现有技术中乳腺癌治疗过程中，有大量患者存在化疗耐药的技术问题。
此外，本发明优选技术方案还具有如下有益技术效果：
本发明优选技术方案的AKT抑制剂还用于逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的细胞凋亡抑制作用，以促进乳腺癌细胞凋亡，从而可进一步提高化疗药物的治疗疗效，使患者获益。
可见，本发明的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，为解决乳腺癌化疗过程中产生的耐药问题提供了一种新的解决思路，即同时靶向细胞凋亡和铁死亡，从而克服乳腺癌细胞的耐药性，使更多患者获益。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是新辅助化疗疗效Boruta特征选取图；
图2是四个数据集里pCR和non-pCR患者DNAJC12的mRNA水平结果图；
图3是115例pCR和non-pCR患者 DNAJC12的mRNA水平RT-qPCR结果图，散点图中的两条竖线分别为pCR和non-pCR患者mRNA水平的中位值，***，p＜0.01；
图4是四个数据集中不同分子分型乳腺癌DNAJC12 mRNA水平与新辅助化疗疗效的关系图；
图5是四个数据集中不同分子分型乳腺癌DNAJC12 mRNA水平的比较结果图；
图6是四个数据集中HR+和HR-病例DNAJC12 mRNA水平的比较结果图；
图7是四个数据集中DNAJC12与ESR1的相关性分析结果图；
图8是不同分子分型乳腺癌细胞系DNAJC12表达水平结果图，图中，A是不同分子分型乳腺癌细胞系DNAJC12 mRNA表达水平结果图，B是不同分子分型乳腺癌细胞系DNAJC12蛋白表达水平结果图及灰度分析结果图；
图9是DNAJC12的高表达和敲降验证结果图；图中，A是RT-qPCR验证稳定高表达和敲降细胞株DNAJC12的mRNA水平结果图，B是Western blot验证稳定高表达和敲降细胞株的DNAJC12蛋白水平结果图及灰度分析图，***，P<0.01；
图10是DNAJC12对阿霉素药物敏感性的影响结果图；
图11是siDNAJC12的干扰效率验证结果图，图中，A是siDNAJC12作用下BT-474、SK-BR-3、MCF-7中DNAJC12的mRNA水平结果图，B是siDNAJC12作用下BT-474、SK-BR-3、MCF-7中DNAJC12的蛋白水平结果图及灰度分析图，***，P<0.01；
图12是DNAJC12对阿霉素药物敏感性的影响结果图，图中，A是BT-474，B是MCF-7，C是SK-BR-3；
图13是DNAJC12上调AKT磷酸化水平结果图，图中，A是Western blot 检测MDA-MB-231、MCF-7实验组和对照组细胞AKT、p-AKT蛋白表达结果图，B是Western blot 检测MDA-MB-231 OE组细胞和MCF-7 NC组细胞在不同浓度AKT抑制剂Capivasertib的作用下AKT、p-AKT蛋白表达结果图；
图14是Capivasertib缓解DNAJC12引起的DOX耐药结果图，图中，A是利用CCK-8检测 50 nM DOX或对应体积的DMSO处理的 MDA-MB-231在0.1 μM CAPI作用下的细胞活性结果图，B是利用CCK-8检测 1 μM DOX或对应体积的DMSO处理的MCF-7在0.1 μM CAPI作用下的细胞活性结果图，***，P<0.01；
图15是Capivasertib下调铁死亡抑制蛋白表达结果图，图中，A和B分别是不同浓度Capivasertib作用后MDA-MB-231 OE组细胞和MCF-7 NC组细胞铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11的Western blot结果图；
图16是Capivasertib逆转乳腺癌细胞DOX治疗下的凋亡障碍结果图，图中，A是MDA-MB-231和MCF-7细胞实验组、对照组在DOX和AKT抑制剂作用下的凋亡流式结果图，B是图A中早期凋亡和晚期凋亡的统计结果图，C是Western blot测定凋亡相关蛋白的蛋白水平结果图，***，P<0.01；
图17是AKT抑制剂抑制DNAJC12荷瘤小鼠的化疗耐药结果图，图中，A是荷瘤小鼠药物注射示意图，B是给药15天后OE/CAPI组、OE/DOX、NC/DOX、OE/CAPI+DOX组的肿瘤图片，C是不同处理组每只小鼠的15天肿瘤体积变化，D是不同处理组肿瘤体积变化及差异分析结果图，***，P<0.01。
具体实施方式：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1：
（1）在GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中筛选出以蒽环和紫杉醇类化疗药物为基础治疗方案的人类全基因组表达芯片数据集。
在GEO数据库中筛选出四个符合要求的GEO数据集GSE41998，GSE25065，GSE20194，GSE20271，共933例乳腺癌患者，具体信息见表1。所有患者均接受以蒽环和紫杉醇类化疗药物为基础方案的新辅助化疗，HER2阳性患者未接受靶向治疗。患者中位年龄分别为48，48，51，49岁。新辅助化疗的pCR率分别为25%，21%，20%，14.6%。ER阳性率分别为38.7%，62.1%，59.0%，55.1%。PR阳性率分别为35.5%，51.0%，43.5%，46.6%。HER2阳性率分别为10.0%，1%，21.2%，14.6%。
表1 GEO数据集临床病理特征
注：A：doxorubicin多柔比星；C：cyclophosphamide环磷酰胺； P：paclitaxel紫杉醇；T：docetaxel多西他赛；F：5-fluorouracil氟尿嘧啶
（2）收集四川大学华西医院接受以蒽环和紫杉醇类化疗药物为基础新辅助化疗方案的乳腺癌女性患者的临床病理信息以及手术前穿刺石蜡样本，以进行后续研究。本实施例共纳入115例II-III期乳腺癌患者，在接受以蒽环和/或紫杉醇类化疗药物为方案的新辅助化疗后，115例中有25例（27.8%）达到病理完全缓解（pCR）。临床病理特征具体见表2。病理完全缓解组和非病理完全缓解（non-pCR）组的中位年龄分别为49，47岁；雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性率分别为44.0%，75.6%；孕激素受体（progesteronereceptor，PR）阳性率分别为56.0%，68.9%；人表皮生长因子受体2（Human epidermalgrowth factor receptor 2，HER2）阳性率分别为56.0%，30.0%；ki67高表达率分别为96.0%，91.1%；淋巴结转移分别发生在92.0%，90.0%患者中。进一步分析了各种临床病理特征与新辅助化疗疗效的相关性，只有ER状态和NAC治疗方案相关，有统计学意义（P<0.05）。ER阳性患者和接受了4-6个周期PE治疗的患者具有更高的病理完全缓解率（P<0.05）。
表2 患者临床病理特征
注：P：palitaxel紫杉醇；E：epirubicin；T：docetaxel多西他赛；
C：cyclophosphamide环磷酰胺。
实施例2：
（1）本实施例合并四个数据集GSE41998，GSE25065，GSE20194，GSE20271后采用特征选取算法Boruta对新辅助化疗疗效相关特征进行选取，发现DNAJC12的重要性在转录组中排在首位，如图1所示。另外ESR1、RARRES1、NFIB、ELF5、CA12的最要性依次排在前五，如图1所示。
（2）本实施例还分别比较了四个数据集GSE41998，GSE25065，GSE20194，GSE20271里pCR和non-pCR患者DNAJC12的mRNA水平，结果显示在四个数据集中non-pCR患者的DNAJC12 mRNA水平均高于pCR患者，差异有统计学意义（P<0.05），结果如图2所示。
（3）为了进一步验证DNAJC12在新辅助化疗中的作用，本实施例分析了收集的115例四川大学华西医院接受以蒽环和/或紫杉醇类化疗药物为基础方案且未接受HER2靶向治疗患者的石蜡穿刺样本，提取总RNA，利用逆转录定量聚合酶链反应（ReverseTranscriptional Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）对其进行DNAJC12 mRNA水平的检测，结果进一步证实non-pCR患者的DNAJC12 mRNA水平高于pCR患者，如图3所示。
为了探究不同DNAJC12表达水平患者的pCR率，本实施例以pCR和non-pCR患者DNAJC12的mRNA水平中位值作为阈值将DNAJC12的表达划分为高中低三类表达，通过分析发现DNAJC12高表达组的患者占总数的43%，其pCR率仅为8%；低表达组的患者占总数的32%，其pCR率为38%。中表达组的患者占总数的25%，pCR率为28%，与整体pCR率24%接近。该结果表明DNAJC12高低表达组的pCR率有较大差别。
本发明所说的DNAJC12高表达也即是DNAJC12的mRNA水平超过中位值的表达。
实施例3：
本实施例研究DNAJC12表达与新辅助化疗耐药关系。
（1）在四个数据集和本院病例的RT-qPCR结果中单独对每个分子分型里pCR和non-pCR患者的DNAJC12表达进行了分析。首先在数据集GSE41998中（图4A），HR+（ER和PR至少有一者为阳性）、HER2+、三阴性三种分子分型的乳腺癌中non-pCR和pCR患者的DNAJC12 mRNA水平均没有明显差异（P>0.05）；在GSE20194中（图4B），HR+和三阴性乳腺癌患者中non-pCR患者的DNAJC12表达均高于pCR，差异有统计学意义（P<0.05），在HER2+乳腺癌患者中无明显差异（P>0.05）；在GSE20271中（图4C），三种分子分型均无统计学差异（P>0.05）；在GSE25065中（图4D），HR+的non-pCR患者DNAJC12表达高于pCR（P<0.05），三阴性乳腺癌没有明显差异（P>0.05）。
（2）在分析了DNAJC12与化疗疗效的关系后，本实施例进一步在四个数据集以及临床样本RT-qPCR结果中分析了DNAJC12在不同分子亚型中的表达，在GSE41998，GSE20194，GSE20271中均为HR+高于HER2+高于三阴性乳腺癌，GSE25065中HR+高于三阴性乳腺癌，如图5所示。DNAJC12在HR+患者中表达最高，而前面的研究结果表明DNAJC12高表达与化疗耐药相关，这符合临床上ER阳性患者对化疗的反应率低于ER阴性患者，更难达到pCR。有文献报道DNAJC12是雌激素受体的靶基因，四个数据集的结果也显示HR+乳腺癌患者的DNAJC12水平均高于HR-患者，如图6所示。
以上结果显示DNAJC12与乳腺癌雌激素受体的表达表现出明显相关性，于是本实施例对四个数据集中DNAJC12与ESR1的mRNA表达水平进行了相关性分析，结果如图7所示，GSE41998（r=0.7903，P<0.05）、GSE25065（r=0.7062，P<0.05）、GSE20194（r=0.7405，P<0.05）、GSE20271（r=0.6714，P<0.05），DNAJC12与ESR1的mRNA水平均呈正相关，差异有统计学意义。
实施例4：
本实施例研究DNAJC12在乳腺癌细胞的本底数据及高表达/敲降表达模型。
利用RT-qPCR和Western blot检测DNAJC12在不同分子分型乳腺癌细胞系中的本底表达。通过慢病毒转染分别构建DNAJC12稳定高表达的MD-MB-231细胞株以及稳定敲降的MCF-7细胞株，并通过Western blot和RT-qPCR技术验证稳转细胞株DNAJC12的表达调控效果。经过验证的稳转细胞株进行常规的细胞功能实验包括增殖、凋亡、细胞周期、划痕、transwell迁移侵袭等研究，从而研究DNAJC12对细胞功能的影响。
为了进一步研究DNAJC12在乳腺癌进展和治疗中的作用，本实施例首先评估了其在乳腺癌不同分子亚型细胞系中的表达水平，不同分子亚型乳腺癌细胞系的受体表达见表3。结合表3和图8所示，DNAJC12在HR+（ER和PR中至少一者为阳性）中表达量最高，在三阴性细胞系MDA-MB-231和HCC1937中表达量最低。该结果与临床规律一致：即HR+对化疗最不敏感，而TNBC最为敏感，HER2+居中。
本实施例使用含有高表达或DNAJC12 RNAi序列的慢病毒载体，在MDA-MB-231中高表达DNAJC12，在MCF-7细胞系中敲降DNAJC12，然后分别在RNA（图9 A）和蛋白（图9 B）水平上验证高表达和敲降DNAJC12的效率。如图9所示，在RNA水平上MDA-MB-231细胞OE组和NC组相比高表达30倍（P<0.05），在蛋白水平上高表达3.5倍（P<0.05）。在RNA水平上SH1的敲降效率为49%，SH2为38.3%（P<0.05）；在蛋白水平上SH1的敲降效率为70.7%，SH2为64.8%（P<0.05）。
表3 不同分子亚型乳腺癌细胞系受体表达
| 细胞名称 | ER | PR | HER2 |
| MCF-7 | + | - | - |
| SK-BR-3 | - | - | + |
| BT-474 | + | + | + |
| HCC1937 | - | - | - |
| MDA-MB-231 | - | - | - |
实施例5：
（1）在前面的研究中发现DNAJC12与新辅助化疗疗效密切相关，但所研究对象多是采用阿霉素和紫杉醇联合用药方案的患者。因此，为了进一步探讨DNAJC12具体是对阿霉素还是紫杉醇的疗效有影响，本实施例首先利用构建的高表达DNAJC12的MDA-MB-231细胞和对照组细胞分别进行了阿霉素的药物敏感实验。阿霉素的药敏实验结果如图10所示，高表达DNAJC12后，IC50从16.18nM变为82.95nM。由此可知，DNAJC12的高表达降低了阿霉素的敏感性。
（2）本实施例利用干扰了DNAJC12表达的HR+，HER2-型MCF-7；HR+，HER2+型BT474；HR-，HER2+型SK-BR-3的乳腺癌细胞，以及MDA-MB-231的高表达稳定株进行了阿霉素和紫杉醇的药物敏感性实验。siDNAJC12对不同分子亚型的乳腺癌细胞的干扰效率如图11所示，在RNA水平，siDNAJC12对BT-474的干扰效率为60.3%，对SK-BR-3为48.2%，对MCF-7为63.5%。在蛋白水平，siDNAJC12对BT-474的干扰效率为33.0%，对SK-BR-3为48.6%，对MCF-7为80.8%。不管是RNA水平还是蛋白水平都显示出了明显的敲降效果（P<0.05）。
确认了干扰效率后，本实施例还进行了阿霉素的药物敏感实验，探究其IC50的改变。阿霉素的药敏实验结果如图12所示，BT-474、MCF-7、SK-BR-3被干扰DNAJC12的表达后，阿霉素的IC50分别从160.8nM到31nM，2672nM到893.1nM，66.45nM到15.57nM。DNAJC12敲降后的阿霉素IC50小于对照组，抑制DNAJC12可以提高阿霉素敏感性。
实施例6：
（1）本实施例检测了稳定敲降DNAJC12的MCF-7和稳定高表达DNAJC12的MDA-MB-231细胞株与对照细胞株中AKT的磷酸化水平。Western blot结果显示，MDA-MB-231细胞DNAJC12高表达组磷酸化AKT水平较高，MCF-7细胞DNAJC12高表达组磷酸化AKT水平较高，如图13 A所示。另外为了找到最合适的AKT抑制剂Capivasertib（CAPI）浓度，使用不同浓度的CAPI对MDA-MB-231和MCF-7细胞系进行处理，AKT磷酸化的抑制效果见图13 B。优选的，AKT抑制剂Capivasertib的浓度为4μM或8μM。
（2）有文献报道激活AKT可通过不同的下游途径抑制细胞凋亡和铁死亡。为了研究DNAJC12引起的耐药是否是通过调节AKT信号通路引起，本实施例将MDA-MB-231细胞分为OE、OE+CAPI和NC组分别用DOX和对应体积的DMSO处理细胞。将MCF-7细胞分为NC、NC+CAPI、siDNAJC12组分别用DOX和对应体积的DMSO处理细胞。48h处理后CCK-8的结果显示在MDA-MB-231（图14 A）和MCF-7（图14 B）中CAPI均可显著增强DOX诱导的细胞死亡，逆转DNAJC12引起的DOX耐药。
（3）本实施例还分别使用1、2、4、8μM的AKT抑制剂CAPI处理MDA-MB-231 OE组和MCF-7 NC组细胞，Western blot结果显示CAPI能以剂量依赖性的方式下调铁死亡抑制基因GPX4和SLC7A11的蛋白水平，如图15所示，进而抑制乳腺癌细胞铁死亡。
（4）本实施例进一步探讨了DNAJC12是否通过AKT调控DOX诱导的乳腺癌细胞的凋亡。本实施例将MDA-MB-231细胞分为NC+DMSO、OE+CAPI、OE+DMSO组，各组分别用DOX处理细胞。将MCF-7细胞分为NC+DMSO、NC+CAPI、SH1+DMSO、SH2+DMSO组，各组分别用DOX处理细胞。细胞凋亡流式结果（图16 A、16 B）显示在DOX作用48小时后，MDA-MB-231 NC+DMSO组的平均早期凋亡率为11.51%，晚期凋亡率为13.99%，总凋亡率为25.5%；OE+CAPI组的平均早期凋亡率为10.58%，晚期凋亡率为16.27%，总凋亡率为26.85%；OE+DMSO组的平均早期凋亡率为4.41%，晚期凋亡率为9.37%，总凋亡率为13.78%。MCF-7 NC+DMSO组的平均早期凋亡率为6.43%，晚期凋亡率为4.86%，总凋亡率为11.29%；NC+CAPI组的平均早期凋亡率为16.23%，晚期凋亡率为5.81%，总凋亡率为22.04%；SH1组的平均早期凋亡率为14.18%，晚期凋亡率为5.80%，总凋亡率为19.98%，SH2组的平均早期凋亡率为15.84%，晚期凋亡率为4.99%，总凋亡率为20.83%。MDA-MB-231 OE+DMSO组的凋亡率低于 NC+DMSO组、OE+CAPI组的凋亡率（P<0.05）。MCF-7 NC+DMSO组的凋亡率低于NC+CAPI组、SH1+DMSO组、SH2+DMSO组的凋亡率（P<0.05）。在同样分组的细胞中可以观察到cleaved caspase 3的表达水平与凋亡率一致（图16 C），MDA-MB-231 OE+DMSO组的cleaved caspase 3蛋白水平低于 NC+DMSO组、OE+CAPI组；MCF-7 NC+DMSO组的cleaved caspase 3蛋白水平低于NC+CAPI组、SH1+DMSO组、SH2+DMSO组（P<0.05）。综上所述，DNAJC12高表达组中使用CAPI促进其凋亡率，提高DOX诱导的cleaved caspase 3的蛋白表达水平。
综上，CCK-8药敏实验结果显示Capivasertib可以逆转由DNAJC12高表达引起的阿霉素耐药。铁死亡诱导剂RSL3药敏试验结果显示Capivasertib能够逆转DNAJC12引起铁死亡抑制（P<0.05）；并且BODIPY™ 581/591 C11荧光强度流式检测和MDA含量测定实验结果证实Capivasertib可以逆转DNAJC12对铁死亡的抑制作用；Western blot结果显示Capivasertib能够下调由DNAJC12引起的铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11蛋白水平高表达。凋亡流式结果以及凋亡相关蛋白cleaved caspase 3的Western blot结果显示Capivasertib能够逆转DNAJC12高表达引起的阿霉素对细胞的凋亡抑制（P<0.05）。
实施例7：
本实施例通过在裸鼠体内接种稳定高表达DNAJC12和对照组的MDA-MB-231细胞株，观察两组的肿瘤生长情况研究DNAJC12对细胞增殖的影响。在裸鼠体内接种稳定高表达DNAJC12和对照组的MDA-MB-231细胞株分为NC+DOX、OE+DOX、OE+Capivasertib、OE+DOX+Capivasertib组给药，观察并记录肿瘤的生长情况研究DNAJC12是否通过AKT通路调控阿霉素耐药并可通过小分子抑制剂的使用逆转或改善阿霉素作用效果。
前期体外实验表明，DNAJC12与HSP70相互作用，促进AKT磷酸化，诱导DOX耐药。本实施例使用DOX单独或联合CAPI治疗小鼠模型。图17 A显示采用腹腔注射模式。治疗2周后，4组NC/DOX、DNAJC12v/DOX、DNAJC12v/CAPI、DNAJC12v/DOX+CAPI的平均体积分别为264.5、471.1、809.3、120.9（图17 D）。单用DOX处理时，DNAJC12 OE组体积大于NC组。DOX和CAPI联合使用可引起肿瘤最大程度的减少。因此，体内实验结果提示，DNAJC12高表达引起DOX耐药，AKT抑制剂与DOX联合使用可协同克服耐药性。即裸鼠体内实验结果显示接种高表达DNAJC12的MDA-MB-231细胞株的裸鼠肿瘤增长速率高于对照组（P<0.05），对阿霉素的敏感性低于对照组（P<0.05）。AKT抑制剂Capivasertib可以逆转DNAJC12高表达引起的阿霉素耐药（P<0.05）。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述AKT抑制剂为(S)-4-氨基-N-(1-(4-氯苯基)-3-羟基丙基)-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-羧酰胺，并且所述AKT抑制剂的结构式为：
所述化疗药物为阿霉素。
2.根据权利要求1所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述AKT抑制剂通过抑制AKT的磷酸化来逆转DNAJC12高表达引起的对铁死亡的抑制作用，以逆转乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性并促进乳腺癌细胞铁死亡。
3.根据权利要求2所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述AKT抑制剂通过下调铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11的蛋白表达来逆转DNAJC12高表达引起的对铁死亡的抑制作用。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述AKT抑制剂还用于逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的细胞凋亡抑制作用，以促进乳腺癌细胞凋亡。
5.根据权利要求1所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述乳腺癌细胞的细胞系为如下分子亚型：雌激素受体和孕激素受体中至少一个为阳性的细胞系，或者是人表皮生长因子受体2为阳性的细胞系。
6.根据权利要求5所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述乳腺癌细胞的细胞系为如下分子亚型：BT-474、MCF-7、SK-BR-3。
7.根据权利要求6所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述AKT抑制剂的浓度为4~8μM。
8.根据权利要求7所述的AKT抑制剂在制备用于乳腺癌治疗中逆转DNAJC12高表达引起的乳腺癌细胞在使用化疗药物治疗中的耐药性，并促进乳腺癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述AKT抑制剂的浓度为4μM或8μM。
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