EA018512B1

EA018512B1 - Производные пирроло[2,3-d]пиримидина в качестве ингибиторов протеинкиназы в

Info

Publication number: EA018512B1
Application number: EA201000552A
Authority: EA
Inventors: Пол Дейвид Джонсон; Эндрью Лич; Ричард Уилльям Артур Льюк; Збигнев Станли Матусьяк; Джеффри Джеймс Моррис
Original assignee: Астразенека Аб
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2013-08-30
Also published as: IL204721A; PE20090964A1; CN101861321B; CN101861321A; CA2701057C; CL2008003023A1; MX2010003927A; US20170057969A1; GT201000082A; CU23886B1; CO6270328A2; US20090163524A1; ZA201002318B; DK2201012T3; UY31384A1; EA201000552A1; DOP2010000103A; AR068846A1; HK1143154A1; US10654855B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединению (S)-4-амино-N-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида или его фармацевтически приемлемой соли, которое может быть полезным при лечении или предупреждении заболевания или состояния, опосредованного протеинкиназой В (PKB), такого как рак. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей вышеуказанное соединение, к применению вышеуказанного соединения для лечения заболеваний, опосредованных PKB, и к способам получения этого соединения.

Description

Настоящее изобретение относится к бициклическому гетероциклу, который может быть полезным при лечении или предупреждении заболевания или медицинского состояния, опосредованного протеинкиназой В (РКВ, также известна как АКТ). Следовательно, такое соединение может быть полезным при лечении или предупреждении ряда различных типов рака. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим вышеупомянутое соединение, к способам получения вышеупомянутого соединения и к способам лечения заболеваний, опосредованных РКВ с применением вышеупомянутого соединения.

РКВ является компонентом фосфатидил 3-киназного (Р13К) сигнального пути, который играет важную роль в пролиферации и выживании клеток, в том числе в клеточных ответах на факторы роста. После присоединения фактора роста, например эпидермального фактора роста (ЕСР), к его рецепторной тирозинкиназе на клеточной поверхности, например ЕСР рецептору (ЕСРК), рецептор димеризуется и подвергается автофосфорилированию. Это событие автофосфорилирования позволяет 85 кДа регуляторной субъединице Р13К (р85) взаимодействовать с рецептором либо непосредственно, либо через адаптерный белок, например связанный с рецептором фактора роста белок 2 (СКВ2), и таким образом активирует 110 кДа каталитическую субъединицу Р13К (р110). После активации, р110 катализирует фосфорилирование фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (Р1Р2) с получением фосфатидилинозитол-3,4,5трифосфата (Р1Р3), молекулы вторичного мессенджера, которая прикрепляет и фосфатадилинозитолзависимую киназу 1 (РЭК1), и РКВ к плазматической мембране, где РЭК1 фосфорилирует и активирует РКВ.

Известны три изоформы РКВ (РКВа/АКТ1, РКВ£/АКТ2 и РКВу/АКТ3), производные от трех разных генов. Активирование РКВа связывают с событиями в системе клеточных сигналов, которые опосредствуют пролиферацию и выживание клеток, тогда как активирование РКВв связывают с инвазией, подвижностью и инсулинопосредованными процессами метаболизма. Активированная РКВ защищает клетки от апоптоза путем инактивации проапоптических факторов, например ВАЭ, прокаспазы-9 и транскрипционного фактора Гогкйеай (РКНК.), и активации факторов транскрипции, что повышающе регулирует антиапоптозные гены, например циклический-АМР ответный элемент активирующего белка (СКЕВ). РКВ также может способствовать выживанию клеток путем инактивирования р53 через фосфорилирование ΜΌΜ2. Подобным образом, активированная РКВ индуцирует пролиферацию клеток с помощью активирующих белков, вовлеченных в рост и метаболизм клеток, например, посредством пути, ведущего к активированию мишени рапамицина в клетках млекопитающих (тТОК) и через гликогенсинтаза-киназу-3 (С8К3).

РКВ-опосредованная стимуляция пролиферации клеток и защита от апоптоза, таким образом, содействует образованию опухолей, и при раке обычно находят генетические нарушения компонентов в пределах Р13К пути. Например, мутацию или амплификацию генов, кодирующих р110 изоформы Р13К, находят при раке молочной железы, раке кишечника, раке яичников, раке головы и шеи, и плоскоклеточном раке шейки матки, раке желудка и легких, ангиопластических олигодендроглиомах, амапластических астроцитомах, мультиформной глиобластоме и медуллобластомах. Подобным образом, мутацию, амплификацию и/или сверхэкспрессию генов, кодирующих изоформы РКВ, находят при опухолях поджелудочной железы, молочной железы и яичника. Кроме того, ген, кодирующий РТЕЫ (фосфатазу, которая играет роль, обратную Р13К, катализирующую превращение Р1Р3 в Р1Р2) инактивируется во многих типах опухолей, в том числе опухолях яичников, колоректальных опухолях, опухолях молочной железы, глиоме, меланоме, опухолях легких, лейкемиях и лимфомах; это приводит к активированию РКВ/АКТ.

Принимая во внимание важность Р13К сигнального пути в пролиферации и выживании опухолевых клеток, какое-либо соединение, которое нарушает этот путь, в том числе РКВ ингибиторы, могут быть полезны при лечении рака. Подробные обзоры Р13К сигнального пути и его вовлечения в образование опухолей обеспечены исследователями Неиие88у и др., Ыа1иге ВсуЮхъ/Эгид Э^соусгу (декабрь 2005) т. 4, 988-1004 и Си11у и др., №Шге ге\зе\\ъ/Сапсег (март 2006) т. 6, 184-192.

Потенциалозависимый калиевый канал, кодированный посредством гена специфических калиевых каналов сердца человека (НЕКС), как полагают, играет ключевую роль в реполяризации потенциала действия желудочков сердца. Изменения в его активности, вызываемые либо унаследованными мутациями генной последовательности, либо фармакологической модификацией, могут приводить к увеличению продолжительности потенциала действия. Это может привести к увеличению интервала рТ, регистрируемого у человека на электрокардиограмме, и к потенциально фатальной аритмии сердца, известной как пируэтная желудочковая тахикардия (УапйепЬегд и др. (2001). ТгепЮ Р11агтасо1. 8с1. 22, 240-246). Согласно современным нормативным рекомендациям (СРМРЛСН/539/00), ίη νίΐτο исследование, изучающее действия тестируемых соединений в канале НЕКС, могло бы быть одним из элементов доклинической стратегии, нацеленной на прогнозирование вероятности того, что новые химические единицы будут увеличивать интервал РТ, регистрируемый у человека на электрокардиограмме. По существу, устранение НЕКС-блокирующей активности остается важным фактором в разработке любого нового лекарственного средства.

Был описан ряд соединений, которые нацелены на путь Р13К. Например в документах АО

- 1 018512

2006/046023 и \νϋ 2006/046024 (Аз1ех ТЬегареиОсз Ытбеб) описываются пуриновые, пуриноновые и деазапуриноновые соединения, которые ингибируют или модулируют активность протеинкиназы В (РКВ) и протеинкиназы А (РКА). Тем не менее, до сих пор существует потребность в дальнейших улучшенных средствах, имеющих лучшую активность по отношению к РКВ, и/или полезные физические свойства (например, более высокую растворимость в воде, более высокую проницаемость, и/или меньшее связывание с белком плазмы крови), и/или благоприятные профили токсичности (например, сниженную склонность к блокированию НЕЕС), и/или благоприятные метаболические профили в сравнении с другими известными ингибиторами РКВ.

Заявителями было неожиданно установлено, что определенное бициклическое гетероциклическое производное особенно эффективно при ингибировании активности РКВ и поэтому может быть полезным при лечении болезненных состояний, в которые вовлечена активность РКВ, например рака.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения обеспечивается соединение или его фармацевтически приемлемая соль, которое представляет собой (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид.

Синтез оптически активных соединений можно провести с помощью стандартных методов органической химии, хорошо известных в уровне техники, например с помощью синтеза из оптически активных исходных веществ или с помощью расщепления рацемической формы. Рацемические соединения и рацемические промежуточные соединения для их получения начерчены в данном документе в виде плоских структур, тогда как стереоспецифические соединения и стереоспецифические промежуточные соединения для их получения начерчены с соответствующим образом указанной стереохимией.

Изобретение также относится ко всем без исключения таутомерным формам заявленных соединений, которые являются ингибиторами активности РКВ.

Подходящей фармацевтически приемлемой солью заявленного соединения является, например, кислотно-аддитивная соль соединения согласно изобретению, которое является достаточно основным, например кислотно-аддитивная соль, например, с неорганической или органической кислотой, например соляной, бромисто-водородной, серной, фосфорной, трифторуксусной, лимонной или малеиновой кислотой.

Следует понимать, что соединение согласно настоящему изобретению может существовать в сольватированной, например гидратированной, а также в несольватированной формах. Ясно, что настоящее изобретение охватывает все такие сольватированные формы, которые являются ингибиторами активности РКВ.

Соединение может вводиться в виде пролекарства, которое разлагается в теле человека или животного с получением соединения. Примеры пролекарств включают гидролизуемые ίη νίνο сложные эфиры соединения. Различные формы пролекарств известны в уровне техники. Примеры таких пролекарственных производных см.:

a) Эемдп οί Ртобтидз, под ред. Н. Випбдаагб (Е1зеν^е^, 1985) и Мебюбз ίη Еп/утоФду, т. 42, с. 309396, под ред. К. '№1ббет и др. (АсабетФ Ргезз, 1985);

b) А ТехФоок οί Эгид Иез1дп апб ^еνе1οртеηΐ, под ред. Кгодздаатб-Ьагзеп и Н. Випбдаагб, гл. 5 Эез1дп апб Аррйсабоп οί Ртобтидз, под ред. Н. Випбдаагб с. 113-191 (1991);

c) Н. Випбдаагб, Абνаηсеб Эгид Ое1Е'егу К^1етез, 8, 1-38 (1992);

б) Н. Випбдаагб и др., Фигпа1 οί РЬаттасеибса1 8аепсез, 77, 285 (1988); и N. Какеуа и др., СЬет РЬагт Ви11, 32, 692 (1984).

В соответствии с дополнительным аспектом изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция, которая включает заявленное соединение или его фармацевтически приемлемую соль, как определено выше, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Композиции в соответствии с изобретением могут находиться в форме, пригодной для перорального применения (например, в виде таблеток, пастилок, твердых или мягких капсул, водных или масляных суспензий, эмульсий, диспергируемых порошков или гранул, сиропов или эликсиров), для местного применения (например, в виде кремов, мазей, гелей, или водных или масляных растворов или суспензий), для введения путем ингаляции (например, в виде тонкоизмельчённого порошка или жидкого аэрозоля), для введения путем инсуффляции (например, в виде тонкоизмельчённого порошка) или для парентерального введения (например, в виде стерильного водного или масляного раствора для внутривенного, подкожного или внутримышечного дозирования или в виде суппозитория для ректального дозирования).

Композиции в соответствии с изобретением могут быть получены с помощью обычных способов с использованием обычных фармацевтических наполнителей, хорошо известных в уровне техники. Так, композиции, предназначенные для перорального использования, могут содержать, например, один или несколько окрашивающих, подслащивающих, ароматизирующих и/или консервирующих агентов.

Заявленное соединение может вводиться теплокровному животному обычно в однократной дозе в диапазоне 5-5000 мг/м площади тела животного, то есть приблизительно 0,1-100 мг/кг, и это обычно обеспечивает терапевтически эффективную дозу. Форма однократной дозы, такая как таблетка или капсула, должна обычно содержать, например, 1-250 мг активного ингредиента. Предпочтительно применяют суточную дозу в диапазоне 1-50 мг/кг, например 4-7 мг/кг дважды в сутки. Тем не менее, суточная

- 2 018512 доза будет непременно варьироваться в зависимости от субъекта, получающего лечение, конкретного пути введения, и серьёзности болезни, подлежащей лечению. Таким образом, практикующий врач, осуществляющий лечение какого-либо отдельного пациента, может определить оптимальную дозу самостоятельно.

Например, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, пригодная для перорального введения, может включать 1-200 мг/мл заявленного соединения или его фармацевтически приемлемой соли (такого как (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид) в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС).

Как здесь определено, термин терапия, если специально не указано обратное, также включает профилактику. Термины терапевтический и терапевтически следует толковать соответственно.

Как здесь определено, термин лечение имеет свое обычное значение борьбы с заболеванием с целью полного или частичного уменьшения одного, нескольких или всех его симптомов или с целью устранения или компенсирования патологии, лежащей в его основе.

Как здесь определено, термин профилактика имеет свое обычное значение и включает первичную профилактику для предотвращения развития заболевания, и вторичную профилактику, посредством которой пациент с уже развившимся заболеванием временно или постоянно защищается от обострения или ухудшения течения заболевания или от развития новых симптомов, связанных с заболеванием.

Благодаря своей РКВ ингибирующей активности ожидается, что соединение в соответствии с настоящим изобретением будет полезным для лечения заболеваний или медицинских состояний, опосредованных исключительно или частично активностью РКВ, например рака. Типы рака, которые могут быть чувствительными к лечению с использованием соединения в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничиваются перечисленными, рак яичников, рак шейки матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, глиому, глиобластому, меланому, рак предстательной железы, лейкемию, лимфому, неходжкинскую лимфому, рак желудка, рак легких, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (С18Т), глиому, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак эндометрия, рак почки, анапластическую крупноклеточную лимфому, острую миелоидную лейкемию (ЛМЬ), множественную миелому, меланому и мезотелиому. Рак молочной железы и более конкретно люминальный рак молочной железы может быть особенно чувствительным к лечению с использованием соединений в соответствии с настоящим изобретением.

Представляется, что для способов лечения рака, упоминаемых здесь, заявленное соединение должно быть введено млекопитающему, более предпочтительно человеку. Подобным образом, для применений заявленного соединения для лечения рака, упоминаемого здесь, представляется, что заявленное соединение должно быть введено млекопитающему, более предпочтительно человеку.

В соответствии с другим аспектом изобретения, таким образом, обеспечивается заявленное соединение, как определено выше, или его фармацевтически приемлемая соль для применения в качестве лекарственного средства.

В соответствии с дополнительным аспектом изобретения обеспечивается заявленное соединение, как определено выше, или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении заболевания, опосредованного РКВ. В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутое заболевание, опосредованное РКВ, представляет собой рак. В дальнейшем варианте осуществления изобретения вышеупомянутый рак выбирают из рака яичников, рака шейки матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, глиомы, глиобластомы, меланомы, рака предстательной железы, лейкемии, лимфомы, неходжкинской лимфомы, рака желудка, рака легких, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (С18Т). глиомы, рака щитовидной железы, рака желчных протоков, рака эндометрия, рака почки, анапластической крупноклеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии (ЛМЬ), множественной миеломы, меланомы и мезотелиомы. В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый рак выбирают из рака молочной железы, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной железы, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, рака предстательной железы и рака легких. В одном отдельном варианте осуществления вышеупомянутый рак представляет собой рак молочной железы, более предпочтительно люминальный рак молочной железы.

В соответствии с дополнительным аспектом изобретения обеспечивается применение заявленного соединения, как определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного РКВ. В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутое заболевание, опосредованное РКВ, представляет собой рак. В дальнейшем варианте осуществления изобретения вышеупомянутый рак выбирают из рака яичников, рака шейки матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, глиомы, глиобластомы, меланомы, рака предстательной железы, лейкемии, лимфомы, неходжкинской лимфомы, рака желудка, рака легких, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, стромальных опухолей желудочнокишечного тракта (С18Т), глиомы, рака щитовидной железы, рака желчных протоков, рака эндометрия, рака почки, анапластической крупноклеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии (ЛМЬ), множественной миеломы, меланомы и мезотелиомы. В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый рак выбирают из рака молочной железы, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной желе

- 3 018512 зы, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, рака предстательной железы и рака легких. В одном отдельном варианте осуществления вышеупомянутый рак представляет собой рак молочной железы, более предпочтительно люминальный рак молочной железы.

В соответствии с дополнительным аспектом изобретения обеспечивается применение заявленного соединения, как определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения рака. В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый рак выбирают из рака яичников, рака шейки матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, глиомы, глиобластомы, меланомы, рака предстательной железы, лейкемии, лимфомы, неходжкинской лимфомы, рака желудка, рака легких, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (С18Т), глиомы, рака щитовидной железы, рака желчных протоков, рака эндометрия, рака почки, анапластической крупноклеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии (ЛМЬ), множественной миеломы, меланомы и мезотелиомы. В одном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый рак выбирают из рака молочной железы, неходжкинской лимфомы, рака поджелудочной железы, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, рака предстательной железы и рака легких. В одном отдельном варианте осуществления вышеупомянутый рак представляет собой рак молочной железы, более предпочтительно люминальный рак молочной железы.

Противораковое лечение, описанное выше, может применяться в виде монотерапии или дополнительно к соединению согласно изобретению можно применять обычное хирургическое лечение, лучевую терапию или химиотерапию.

Такая химиотерапия может включать один или несколько следующих классов противоопухолевых средств:

(ί) другие антипролиферативные/противоопухолевые лекарственные средства и их комбинации, которые применяются в медицинской онкологии, такие как алкилирующие средства (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, циклофосфамид, азотный иприт, мельфалан, хлорамбуцил, бусульфан, темозоламид и нитрозомочевины); антиметаболиты (например, гемцитабин и антифолаты, такие как фторпиримидины, подобные 5-фторурацилу и тегафуру, ралтитрексед, метотрексат, арабинозид цитозина, и гидроксимочевины); противоопухолевые антибиотики (например, антрациклины, подобные адриамицину, блеомицину, доксорубицину, дауномицину, эпирубицину, идарубицину, митомицину-С, дактиномицину и митрамицину); антимитотические средства (например, алкалоиды барвинка, подобные винкристину, винбластину, виндезину и винорелбину и таксоиды, подобные таксолу и таксотеру и ингибиторы киназы); и ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины, подобные этопозиду и тенипозиду, амсакрину, топотекану и камфотецину);

(ίί) цитостатические средства, такие как антиэстрогены (например, тамоксифен, фульвестрант, торемифен, ралоксифен, дролоксифен и йодоксифен), антиандрогены (например, бикалутамид, флутамид, нилутамид и ципротерон ацетат), ЬНВН антагонисты или ЬНВН агонисты (например, гозерелин, лейпрорелин и бузерелин), прогестогены (например, мегестрол ацетат), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летрозол, воразол и эксеместан) и ингибиторы 5а-редуктазы, такие как финастерид;

(ш) антиинвазионные средства (например, ингибиторы семейства е-8те киназы, подобные 4-(6хлор-2,3-метилендиоксианилино)-7-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]-5-тетрагидропиран-4-илоксихиназолину (ΑΖΌ0530; международная патентная заявка ХУО 01/94341) и Ы-(2-хлор-6-метилфенил)-2-{6[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 -ил] -2-метилпиримидин-4-иламино }тиазол-5-карбоксамиду (дазатиниб, ВМ8-354825; 1. Мей. 011ст.. 2004, 47, 6658-6661), и ингибиторы металлопротеиназы, подобные маримастату, ингибиторы функции рецептора активатора плазминогена урокиназного типа или антител к гепараназе);

(ίν) ингибиторы действия факторов роста, например, такие ингибиторы включают антитела к фактору роста и антитела к рецепторам фактора роста (например, анти-етЬВ2 антитело трастузумаб [Негеерй™], анти-ЕСРВ антитело панитумумаб, анти-егЬВ1 антитело цетуксимаб [ЕтЬйих, С225] и любые антитела к фактору роста или рецепторам фактора роста, описанные 81ети и др. Стй1са1 ге\'1е\\'5 ίη опсо1оду/йаета1о1оду, 2005, т. 54, сс. 11-29); такие ингибиторы также включают ингибиторы тирозинкиназы, например ингибиторы семейства фактора роста эпидермиса (например, ингибиторы семейства ЕСРВ тирозинкиназ, такие как Ы-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4амин(гефитиниб, ΖΌ1839), №(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин (эрлотиниб, О81-774) и 6-акриламидо-Л-(3-хлор-4-фторфенил)-7-(3-морфолинопропокси)-хиназолин-4-амин (С11033), ингибиторы егЬВ2 тирозинкиназы, такие как лапатиниб, ингибиторы семейства фактора роста гепатоцитов, ингибиторы семейства фактора роста тромбоцитов такие как иматиниб, ингибиторы сериновых/реониновых киназ (например, ингибиторы Ваз/ВаР пути передачи сигналов, такие как ингибиторы фарнезилтрансферазы, например, сорафениб (ВАУ 43-9006)), ингибиторы передачи сигналов в клетках посредством МЕК и/или АКТ киназ, ингибиторы семейства фактора роста гепатоцитов, с-кй ингибиторы, ингибиторы аЬ1 киназы, ингибиторы киназы ЮР рецептора (инсулиноподобного фактора роста); ингибиторы аурора-киназы (например, ΑΖΌ1152, РН739358, УХ-680, ΜΕΝ8054, В763, МР235, МР529, УХ528 и АХ39459) и ингибиторы циклинзависимой киназы, такие как ΟΌΚ2 и/или ΟΌΚ4 ингибиторы;

(ν) антиангиогенные средства, такие как те, которые ингибируют действия фактора роста эндотелия

- 4 018512 сосудов [например, антитело к фактору роста эндотелиальных клеток сосудов бевацизумаб (ЛуакИи™) и ингибиторы тирозинкиназы рецептора УЕСЕ, такой как 4-(4-бром-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ΖΌ6474; пример 2 в заявке \О 01/32651), 4-(4-фтор-2метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (ΆΖΌ2171; пример 240 в заявке \'О 00/47212), ваталаниб (РТК787; \О 98/35985) и 8И11248 (сунитиниб; \'О 01/60814), соединения, такие как те, что раскрыты в международных патентных заявках \О 97/22596, \О 97/30035, \О 97/32856 и \О 98/13354, и соединения, которые действуют по другим механизмам (например, линомид, ингибиторы действия интегрина ανβ3 и ангиостатин)];

(νί) вещества, повреждающие сосуды, такие как комбрестатин А4, и соединения, раскрытые в международных патентных заявках \О 99/02166, \О 00/40529, \О 00/41669, \О 01/92224, \О 02/04434 и \\'О 02/08213;

(νίί) антисмысловая терапия, например, такая, которая направлена на мишени, перечисленные выше, такие как 1818 2503, антисмысловая терапия на основе гена гак;

(νίίί) подходы генной терапии, включая, например, подходы на основе замены аберрантных генов, такие как способы аберрации р53 или аберрации ВВСА1 или ВВСА2, СПЕРТ (пролекарственная терапия, направленная на ген фермента) подходы с использованием деаминазы цитозина, тимидинкиназы или бактериальной нитроредуктазы и подходы на основе повышения устойчивости пациента к химиотерапии или радиотерапии, такие как генная терапия резистентности ко многим лекарственным средствам; и (ίχ) иммунотерапевтические подходы, включая, например подходы повышения иммуногенности опухолевых клеток пациента в условиях ех νίνο и ίη νίνο, такие как трансфекция цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или фактор стимуляции колоний гранулоцитов-макрофагов, подходы снижения анэргии Т-клеток, подходы с использованием трансфектированных иммунных клеток, таких как цитокинтрансфектированные дендритные клетки, подходы с использованием цитокин-трансфектированных линий опухолевых клеток и подходы с использованием антиидиотипичных антител.

Соединение согласно изобретению или его соль можно получить с помощью любого способа, известного в качестве подходящего для получения таких соединений или структурно родственных соединений. Функциональные группы могут быть защищены, и защита может быть снята с использованием обычных способов. Примеры защитных групп, таких как защитные группы для аминогруппы и карбоновой кислоты (а также средств образования защиты и последующего ее снятия), см. Т.\. Сгеепе и Р.С.М. \и1к, Рго1ес1|уе Сгоирк ίη Огдашс 8уп1йек1к, 8есопй Εάίίίοη, Ιοίιη \11еу & 8опк, Ыете Уогк, 1991.

Определенные способа синтеза заявленного соединения представляют собой дополнительную характерную особенность изобретения. Таким образом, в соответствии с дополнительным аспектом изобретения обеспечивается способ получения заявленного соединения или его фармацевтически приемлемой соли, который включает:

(а) реакцию кислоты формулы (II) с (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-олом

где Р¹ означает пригодную защитную группу; или (Ь) реакцию (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4-карбоксамида с бициклическим гетероциклом формулы (V)

где Ь₁ означает пригодную уходящую группу;

и затем, при необходимости:

(ί) удаление каких-либо защитных групп и/или (ίί) образование его фармацевтически приемлемой соли.

Характерные условия реакций для способов (а) и (Ь), упомянутых ранее, являются следующими:

Способ (а) - кислоты формулы (II) и амины, такие как (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ол, могут реагировать вместе в присутствии подходящего реагента сочетания, например гексафторфосфата О(7-азабензотриазол-1-ил)-Н,Х,Х',Х'-тетраметилурония (НАТИ), и подходящего основания, например

- 5 018512

Ν,Ν'-диизопропилэтиламина (ΌΙΡΕΆ), в подходящем растворителе, например диметилацетамиде (ΌΜΆ), и при подходящей температуре, например от 50 до 70°С, более подходяще при приблизительно 60°С;

Способ (Ь) - карбоксамиды, такие как (8)-4-амино-Н-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4-карбоксамид, и гетероциклы формулы (V), могут реагировать вместе в присутствии подходящего основания, например Ν,Ν'-диизопропилэтиламина (ΌΙΡΕΆ), в подходящем растворителе, например бутан-1-оле, и при подходящей температуре, например от 50 до 70°С, более подходяще при приблизительно 60°С.

Соединения формулы (II) могут быть получены в соответствии со схемой 1.

Схема 1

где Р¹ означает пригодную защитную группу, например трет-бутоксикарбонил, Ь¹ означает пригодную уходящую группу, например хлор.

Соединения, такие как (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4карбоксамид, могут быть получены в соответствии со схемой 2.

где Р¹ и Р² означают пригодные защитные группы, например трет-бутоксикарбонил.

Соединения, такие как (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ол, и соединения формул (V) и (VIII) доступны для приобретения, известны в литературе, получаются с помощью стандартных способов, известных в уровне техники, или могут получаться в соответствии со способами, описанными здесь.

Следующие примеры приведены в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема этой заявки. Каждое иллюстрируемое соединение представляет специфический и независимый аспект изобретения. Все исходные вещества являются доступными для приобретения соединениями, или они известны в литературе, или они получаются с помощью стандартных способов, известных в уровне техники.

Как правило, применительно к следующим примерам (ί) температуры приведены в градусах Цельсия (°С); операции проводили при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть при температуре в диапазоне от 18 до 25°С;

(ΐΐ) органические растворы сушили над безводным сульфатом магния или безводным сульфатом натрия; упаривание растворителя проводили с использованием роторного испарителя при пониженном давлении (600-4000 Па; 4,5-30 мм Нд) с температурой бани вплоть до 60°С;

(ίίί) хроматография подразумевает флэш-хроматографию на силикагеле; тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на силикагелевых пластинках;

(ίν) в общем, протекание реакций контролировали с помощью ТСХ и/или аналитической ЖХ-МС, а время реакций, если приведено, дано исключительно в иллюстративных целях;

(ν) конечные продукты имели удовлетворительный спектр протонного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и/или масс-спектральные данные;

- 6 018512 (νί) выходы приведены исключительно в иллюстративных целях и не являются непременно теми, которые можно получить с помощью старательного усовершенствования способа; процесс получения повторяли, если требовалось большее количество вещества;

(νίί) ЯМР данные, когда приведены, находятся в виде значения δ для главных отличительных протонов, приведенных в миллионных долях (м.д.) относительно тетраметилсилана (ТМС) в качестве внутреннего стандарта, определенного при 500 МГц с использованием пердейтеродиметилсульфоксида (ДМСО-б₆) в качестве растворителя, если не указано иное; использовались следующие сокращения: 5. синглет; б, дублет; 1, триплет; ср квартет; т, мультиплет; Ьк, широкий синглет;

(νίίί) химические символы имеют их обычные значения; использовали единицы и символы СИ;

(ίχ) масс-спектр (МС) и данные ЖХ-МС были генерированы на системе ЖХ-МС, где ВЭЖХ компонент включал обычно или оборудование Лдбеи! 1100, ка1егк АШаисе НТ (2790 & 2795) или насос НР 1100 и диодную матрицу с автосамплером СТС и работали на колонке Рйеиотеиех 6етш1 С18 5 мкм, 50x2 мм (или подобной) с элюированием либо кислотным элюентом (например, с использованием градиента между 0-95% воды/в ацетонитриле с 5% 1%-ной муравьиной кислоты в 50:50 смеси вода:ацетонитрил (об./об.)), или основный элюент (например, с использованием градиента между 0-95% воды/в ацетонитриле с 5% 0,1%-ного 880 аммиака в ацетонитрильной смеси); а МС компонент включал обычно масс-спектрометр \Уа1ег8 Ζρ, сканирующий при подходящем диапазоне масс. Были получены хроматограммы и сняты интенсивности основных пиков МС с положительным и отрицательным режимом электрораспыления (Ε8Ι), и полного УФ-поглощения при 220-300 нм, и приведены значения т/ζ; как правило, представлены только ионы, которые показывают массу, согласующуюся с исходным соединением, и, если не указано иное, приведенное значение (М+Н)⁺ соответствует режиму определения положительных ионов, а (М-Н)^- соответствует режиму определения отрицательных ионов;

(х) если не определено иное, соединения, содержащие асимметрично замещенный атом углерода и/или атом серы не разделяли;

(χί) какие-либо микроволновые реакции проводили либо в микроволновой печи Вю1аде Ορί^т^ζе^ ЕХР, либо в микроволновой печи СЕМ Ехр1огег;

(χίί) препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) выполняли на приборе от Обкои 1И51гитеи1 с использованием следующих условий:

Колонка: кремнеземная С18 с обращенной фазой, например каЮгк ХЬпбде, кремнезем 5 мкм, 19x100 мм или 30x100 мм, с использованием смеси растворителей с уменьшающейся полярностью в качестве элюента (убывающее отношение растворителя А - растворителя В), растворитель А: вода с 1% гидроксидом аммония, растворитель В: ацетонитрил, скорость потока: 28 мл/мин или 61 мл/мин, градиент: приспособленный специально для каждого соединения, обычно продолжительностью 710 мин, длина волны: 254 нм.

Сокращения

Вос - трет-бутоксикарбонил

СЛ8™ - химическая реферативная служба

ДХМ - дихлорметан

ΌΙΡΕΑ - Ν,Ν'-диизопропилэтиламин

ИЕА - диэтиламин

ИМА - диметилацетамид

ДМФА - диметилформамид

НАТИ - гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Н^№,№-тетраметилурония

ЖХМС - жидкостная хроматография - масс-спектроскопия

ЬИА - диизопропиламид лития

ЖХСД - жидкостная хроматография среднего давления

NМП - Ν-метилпирролидинон

ОВИ - Орбтит Веб Иеикбу (оптимальная плотность набивки)

ПТФЭ - политетрафторэтилен

8СХ - катионообменная (сильный катион)

СЖХ - сверхкритическая жидкостная хроматография

ТВМЕ - т-бутилметиловый эфир

ТЕА - триэтиламин

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТГФ - тетрагидрофуран.

Пример 9. (8)-4-амино-№(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4ил)пиперидин-4-карбоксамид (Е9).

- 7 018512

К (8)-трет-бутил 4-(1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропилкарбамоил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамату (промежуточное соединение 22) (1,27 г, 2,40 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли НС1 (4М в диоксане) (3,00 мл, 12,00 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 20°С в течение 16 ч. Реакционную смесь фильтровали через ПТФЭ чашечный фильтр и сырое твердое вещество очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (колонка ^а1ег8 ХТегга С18, кремнезем 5 мкм, диаметр 19 мм, длина 100 мм), используя смеси с уменьшающейся полярностью воды (содержащей 1% ТФУ) и МеСЯ в качестве элюентов. Фракции, содержащие целевое соединение, очищали с помощью ионообменной хроматографии, используя 8СХ колонку. Целевой продукт элюировали из колонки с использованием 7М ЯН₃/МеОН и чистые фракции упаривали досуха с получением (8)-4-амино-Я-(1-(4хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (0,200 г, 19,4%) в виде белого твердого вещества.

'|| ЯМР (399.9 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.45 (2Н, б), 1.86 (1Н, б), 1.90 -1.93 (1Н, т), 2.19 (2Н, 8), 3.38 (2Н, ф, 3.51-3.58 (2Н, т), 4.35- 4.38 (2Н, т), 4.53 (1Н, 1), 4.88 (1Н, б), 6.58 (1Н, 1), 7.16 (1Н, 1), 7.32-7.38 (4Н, т), 8.12 (1Н, 8), 8.43 (1Н, б), 11.63 (1Н, 8), т/ζ (Ε8Ι+) (М+Н)⁺ = 429; ВЭЖХЖ = 1,46 мин.

Пример 9, альтернативный путь 1. (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид.

К (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4-карбоксамиду (промежуточное соединение 49) (1 г, 3,21 ммоль) и 4-хлор-7Н-пирроло[2,3-б]пиримидину (0,493 г, 3,21 ммоль) в бутан-1оле (15 мл) добавляли Я-этилдиизопропиламин (1,676 мл, 9,62 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 60°С в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляли Е1ОАс (50 мл) и последовательно промывали водой (25 мл) и насыщенным раствором соли (25 мл). Органический слой сушили над Мд8О₄, фильтровали и упаривали с получением сырого продукта. Сырой продукт очищали с помощью флэшхроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 0-6% МеОН аммиака в ДХМ. Чистые фракции упаривали досуха с получением (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (842 мг) в виде белой пены. (8)-4-амино-Я-(1-(4хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид перемешивали в этилацетате (7 мл) в течение 18 ч. Твердое вещество собирали путем фильтрования, промывали небольшим количеством этилацетата и сушили в вакуумном шкафу при 55°С в течение 18 ч с получением (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (0,585 г, 42,5%) в виде белого твердого вещества, т/ζ (Е8+) (М+Н)⁺ = 429; ВЭЖХ Ж. = 1,60 мин.

'|| ЯМР (400.13 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.39-1.47 (2Н, т), 1.80-2.02 (4Н, т), 2.17 (2Н, 8), 3.35-3.40 (2Н, т), 3.50-3.59 (2Н, т), 4.34-4.41 (2Н, т), 4.53 (1Н, 1), 4.88 (1Н, б), 6.57 (1Н, т), 7.14-7.16 (1Н, т), 7.31-7.37 (4Н, т), 8.12 (1Н, 8), 8.42 (1Н, б), 11.62 (1Н, 8).

Пример 9, альтернативный путь 2. (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид.

- 8 018512

К 4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-6]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоновой кислоте (промежуточное соединение 1) (4 г, 11,07 ммоль) и ΌΙΡΕΑ (5,80 мл, 33,20 ммоль) в ΌΜΆ (40 мл) одной порцией добавляли (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ол (промежуточное соединение 47) (2,055 г, 11,07 ммоль). Добавляли НАТИ (4,63 г, 12,18 ммоль) и получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 24 ч. Реакционную смесь упаривали досуха, затем разбавляли ЕЮАс (300 мл), и последовательно промывали водой (50 мл) и насыщенным раствором соли (50 мл). Органический слой сушили над Мд8О₄, фильтровали и упаривали с получением сырого продукта. Сырой продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 2-6% МеОН аммиака в ДХМ. Чистые фракции упаривали досуха и растирали с диоксаном (40 мл) с получением (8)-трет-бутил 4-(1-(4хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1-(7Н-пирроло[2,3-6]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамата (промежуточное соединение 22) (4,82 г, 82%) в виде белого твердого вещества. (8)-трет-бутил 4-(1(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1-(7Н-пирроло[2,3-6]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамат (промежуточное соединение 22) (4,82 г, 82%) суспендировали в диоксане (40,0 мл) и добавляли 4М хлороводород в диоксане (7,69 мл, 221,36 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Сырой продукт очищали с помощью ионообменной хроматографии, используя 8СХ колонку. Целевой продукт элюировали из колонки с использованием 3,5М ЫН₃/МеОН и чистые фракции упаривали досуха. Сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (колонка \Уа1егк ХВпбде Ргер С18 ΟΒΌ, кремнезем 5 мкм, диаметр 19 мм, длина 100 мм), используя смеси с уменьшающейся полярностью воды (содержащей 1% ΝΗ₃) и МеСЫ в качестве элюентов. Фракции, содержащие целевое соединение, упаривали досуха с получением (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-6]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (1,200 г, 25,3%) в виде белого твердого вещества, т/ζ (Е8+) (М+Н)⁺ = 429; ВЭЖХ 1Й = 1,67 мин.

'Н ЯМР совпадает с предыдущим.

Пример 13. 4-Амино-Ы-( 1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло [2,3-6]пиримидин-4ил)пиперидин-4-карбокеамид.

К суспензии трет-бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1-(7Н-пирроло[2,36]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамата (промежуточное соединение 36) (175 мг, 0,33 ммоль) в дихлорметане (7 мл) под аргоном добавляли ТФУ (0,7 мл). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 16 ч. Растворители удаляли в вакууме и реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, используя колонку с обращенной фазой \Уа1егк Х-Впбде (С-18, кремнезем 5 мкм, диаметр 19 мм, длина 100 мм) и смеси с уменьшающейся полярностью воды (содержащей 0,2% карбонат аммония) и ацетонитрила в качестве элюента. Чистые фракции упаривали досуха с получением 4-амино-Ы-(1-(4хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-6']пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (99 мг, 69,8%) в виде белого порошка.

'11 ЯМР (500 МГц, ДМСО-6₆) δ 1.38-1.46 (2Н, т), 1.81-1.91 (4Н, т), 2.25 (2Н, Ьг к), 3.48 (2Н, т), 3.35-3.54 (2Н, т), 4.35-4.41 (2Н, т), 4.57 (1Н, 1), 4.87 (1Н, т), 6.58 (1Н, 6), 7.16 (1Н, 6), 7.31-7.37 (4Н, т), 8.11 (1Н, к), 8.45 (1Н, 6), 11.65 (1Н, к). т/ζ (Ε8Σ+) (М+Н)⁺ = 429; ВЭЖХ 1Κ = 1,58 мин.

Пример 15. (К)-4-амино-Ы-( 1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло [2,3-6]пиримидин-4ил)пиперидин-4-карбоксамид.

- 9 018512

К (Я)-трет-бутил 4-(1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропилкарбамоил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамату (промежуточное соединение 42) (0,160 г, 0,30 ммоль) в ДХМ (3 мл) добавляли НС1 (4М в диоксане) (0,378 мл, 1,51 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 20°С в течение 3 ч. Реакционную смесь упаривали. Сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (колонка \Уа1ег8 ХТегга С18, кремнезем 5 мкм, диаметр 19 мм, длина 100 мм), используя смеси с уменьшающейся полярностью воды (содержащей 1% аммиака) и МеСЫ в качестве элюентов. Фракции, содержащие целевое соединение, упаривали досуха с получением (Я)-4-амино-Х-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (0,051 г, 39,3%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (399.9 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.46 (2Н, б), 1.86 (1Н, б), 1.90-1.93 (1Н, т), 2.10 (2Н, т), 3.37 (1Н, 1), 3.55 (2Н, б), 4.40 (2Н, б), 4.53 (2Н, т), 4.88 (1Н, б), 6.58 (1Н, 1), 7.16 (1Н, 1), 7.32-7.38 (4Н, т), 8.14 (1Н, б), 8.43 (1Н, б), 11.63 (1Н, 8) невидимый ЫН₂. МС т/е МН⁺ 429; ВЭЖХ 11/ = 1,46 мин.

Промежуточное соединение 1. 4-(трет-Бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4ил)пиперидин-4-карбоновая кислота.

К смеси 4-[(2-метилпропан-2-ил)оксикарбониламино]пиперидин-4-карбоновой кислоты (115,6 г) в СН₃СЫ-Н₂О (6 л) добавляли ЫаНСО₃(181 г) и далее 4-хлор-7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин (72,7 г). Смесь нагревали с обратным холодильником под азотом в течение 24 ч и затем экстрагировали Е1ОАс (1 лх4). Водный слой концентрировали и добавляли МеОН (1,5 л). Смесь встряхивали в течение 30 мин при 45°С и фильтровали. Фильтрат вновь концентрировали и растворяли в Н₂О (300 мл). До момента достижения значения рН, равным 4.5, добавляли 6н. НС1 (ок. 80 мл). Смесь фильтровали и кек сушили в вакууме с получением сырого продукта, который дополнительно очищали с помощью гель-хроматографии на кремнеземе (элюирование МеОН: ДХМ=1:3) с получением 4-[(2-метилпропан-2-ил)оксикарбониламино]1-(3,5,7-триазабицикло[4.3.0]нона-2,4,8,10-тетраен-2-ил)пиперидин-4-карбоновой кислоты в виде бледно-серого твердого вещества (105 г, 63%).

Ή ЯМР (400.13 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.40 (9Н, 8), 1.88-1.95 (2Н, т), 2.02-2.06 (2Н, т), 3.44-3.51 (2Н, т), 4.30 (2Н, б), 6.60-6.61 (1Н, т), 7.16-7.18 (1Н, т), 7.29 (1Н, 8), 8.14 (1Н, 8), 11.68 (1Н, 8). МС т/е МН⁺362.

Промежуточное соединение 19. (Б)-метил 3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропа ноат.

К (Б)-3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропановой кислоте (1 г, 3,34 ммоль) и карбонату калия (0,922 г, 6,67 ммоль) в ДМФА (15 мл) одной порцией добавляли йодметан (1,038 мл, 16,68 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 80°С в течение 24 ч. Реакционную смесь концентрировали и разбавляли Е1ОАс (50 мл) с водой (50 мл). Органический слой сушили над Мд§О₄, фильтро

- 10 018512 вали и упаривали с получением (8)-метил 3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропаноата (1,340 г, 128%) в виде оранжевого твердого вещества.

'11 ЯМР (399.9 МГц, ДМСО-й₆) δ 1.36 (9Н, 5), 2.71-2.74 (1Н, т), 2.74-2.80 (1Н, т), 3.57 (3Н, 5), 4.91 (1Н, й), 7.33 (2Н, й), 7.39 (2Н, й), 7.49 (1Н, й). т/ζ (Е8Г) (М-Н)^- = 312; ВЭЖХ ΐΚ = 2,57 мин.

Промежуточное соединение 20. (8)-метил 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропаноат (гидрохлорид).

К (8)-метил 3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропаноату (промежуточное соединение 19) (1,05 г, 3,35 ммоль) в ДХМ (20 мл) при 20°С одной порцией добавляли соляную кислоту (4,0М в 1,4-диоксане) (4,18 мл, 16,73 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 5 ч. Реакционную смесь упаривали с получением (8)-метил 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропаноата (гидрохлорида) (0,850 г, 102%) в виде белого твердого вещества.

'11 ЯМР (399.9 МГц, ДМСО-й₆) δ 2.98-3.04 (1Н, т), 3.16-3.21 (1Н, т), 3.58 (3Н, 5), 4.62-4.66 (1Н, т), 7.50-7.52 (2Н, т), 7.57-7.59 (2Н, т), 8.66 (3Н, 5). т/ζ (Ε8Γ) (М+Н)⁺ = 214; ВЭЖХ ΐΚ = 1,71 мин.

Промежуточное соединение 21. (8)-метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноат.

К 4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоновой кислоте (промежуточное соединение 1) (1 г, 2,77 ммоль) и Ν,Ν-диизопропилэтиламину (1,006 мл, 6,09 ммоль) в ΝΜΡ (10 мл) при 20°С одной порцией добавляли гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)Ν,Ν,Ν'Ν'-тетраметилурония (1,157 г, 3.04 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 5 мин. К раствору затем добавляли (8)-метил 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропаноат (гидрохлорид) (промежуточное соединение 20) (0,692 г, 2,77 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс (100 мл) и последовательно промывали водой (2x50 мл) и раствором соли (50 мл). Органический слой сушили над Мд8О₄, фильтровали и упаривали с получением сырого продукта. Сырой продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 0-5% МеОН в ДХМ. Чистые фракции упаривали досуха с получением (8)-метил 3-(4(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3 -(4хлорфенил)пропаноата (1,27 г, 82%) в виде белого твердого вещества.

'11 ЯМР (399.9 МГц, ДМСО-й₆) δ 1.40 (9Н, 5), 1.99 (2Н, 5), 2.04-2.07 (2Н, т), 2.79-2.84 (2Н, т), 3.56 (3Н, 5), 3.60-3.66 (1Н, т), 3.67-3.70 (1Н, т), 4.20 (2Н, ΐ), 5.20-5.26 (1Н, т), 6.73 (1Н, й), 7.13 (1Н, 5), 7.27 (1Н, ΐ), 7.35 (4Н, μ), 8.14 (1Н, й), 8.21 (1Н, 5), 11.98 (1Н, 5). т/ζ (ΕδΚ) (М+Н)⁺ = 557; ВЭЖХ ΐΚ = 2,12 мин.

Промежуточное соединение 22. (8)-трет-бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамат.

К (8)-метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноату (промежуточное соединение 21) (1,27 г, 2,28 ммоль) в ТГФ

- 11 018512 (70 мл), охлажденному до 0°С, под азотом по каплям добавляли Ь1Л1Н₄ (2,280 мл, 2,28 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили гидроксидом натрия (2М) (2 мл) и водой (1 мл). Раствор фильтровали и разбавляли ЕЮАс (200 мл) и последовательно промывали водой (100 мл), водой (100 мл) и насыщенным раствором соли (100 мл). Органический слой сушили над Мд§О₄, фильтровали и упаривали с получением (8)-трет-бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропилкарбамоил) -1 -(7Н-пирроло [2,3 -б] пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамата (1,04 г, 86%) в виде белого твердого вещества. М/ζ (Е81+) (М+Н)⁺ = 529; ВЭЖХ 1Κ = 2,00 мин.

Промежуточное соединение 29. 3-Амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ол.

К перемешиваемой суспензии 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропионовой кислоты (2,50 г, 12,52 ммоль) в ТГФ (75 мл) при 0°С на протяжении 20 мин под азотом по каплям добавляли борантетрагидрофурановый комплекс (94,0 мл, 93,92 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 0°С в течение 30 мин, затем при 22°С в течение 5 ч. Реакционную смесь порциями добавляли к метанолу (500 мл). Смесь концентрировали, повторно растворяли в метаноле (250 мл) и повторно концентрировали (этот приём повторяли трижды). Остаток растворяли в ДХМ (200 мл) и промывали 1н. ЫаОН (150 мл). Водный слой экстрагировали ДХМ (5x100 мл) и экстракты объединяли с органическим слоем. Объединенную органику промывали насыщенным раствором соли (2x150 мл), сушили над Мд§О₄ и концентрировали с получением белого полутвердого вещества. Сырой продукт очищали с помощью флэшхроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 5-7% (10:1 МеОН/конц. ΝΗ₃ (водн.)) в ДХМ. Чистые фракции упаривали досуха с получением 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ола (1,320 г, 56,8%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (399.902 МГц, СЭС1₃) δ 1.87 (2Н, т), 2.34 (2Н, Ьг.8), 3.79 (2Н, т), 4.13 (1Н, 1), 7.24 (2Н, б), 7.32 (2Н, б). МС т/е МН⁺ = 169.

Промежуточное соединение 30. трет-Бутил 1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамат.

К 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-олу (промежуточное соединение 29) (0,500 г, 2,69 ммоль) в ДХМ (30 мл) при 22°С добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (0,705 г, 3,23 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 22°С в течение 2 ч. Смесь концентрировали и остаток очищали с помощью флэшхроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 0-4% (10:1 МеОН/конц. ЫН₃ (водн.)) в ДХМ. Чистые фракции упаривали досуха с получением трет-бутил 1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамата (0,759 г, 99%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (399.902 МГц, СЭС1₃) δ 1.43 (9Н, 8), 1.81 (1Н, т), 2.04 (1Н, т), 2.74 (1Н, Ьг.8), 3.69 (2Н, т), 4.88 (1Н, Ьг.8), 5.04 (1Н, б), 7.23 (2Н, б), 7.32 (2Н, б). МС т/е МН^- = 284, 286.

Промежуточное соединение 35. Метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноат.

К 4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоновой кислоте (промежуточное соединение 1) (72,3 мг, 0,20 ммоль), гидрохлориду сложного метилового эфира 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропионовой кислоты (50 мг, 0,20 ммоль) и Ν,Ν-диизопропилэтиламину (0,104 мл, 0,60 ммоль) в Ы-метил-2-пирролидиноне (1,5 мл) при 20°С под аргоном одной порцией добавляли гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Ы.Ы.ЫЫ'-тетраметилурония (84 мг, 0,22 ммоль). Получающийся раствор перемешивали в течение 5 ч. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с использованием колонки с обращенной фазой ЭДа1ет8 Х-Впбде (С-18, кремнезем 5 мкм, диаметр

- 12 018512 мм, длина 100 мм, скорость потока 40 мл/мин) и смеси с уменьшающейся полярностью воды (содержащей 0,2% карбоната аммония) и ацетонитрила в качестве элюента. Фракции, содержащие целевое соединение, упаривали досуха с получением метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноата (71,0 мг, 63,8%) в виде кристаллического твердого вещества.

'|| ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.36 (9Н, 8), 1.94-2.00 (4Н, т), 2.79-2.86 (2Н, άφ, 3.54 (3Н, 8), 3.523.61 (2Н, т), 4.19 (2Н, 1), 5.22 (1Н, ф, 6.56 (1Н, ά), 6.9 (1Н Ьг 8), 7.13 (1Н, ά), 7.33 (4Н, ф, 7.98 (1Н, ά), 8.12 (1Н, 8), 11.53 (1Н, 8). т/ζ (Ε8Ι+) (М+Н)⁺ = 557; ВЭЖХ 1Κ = 3,18 мин.

Промежуточное соединение 36. трет-Бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамат.

он

К перемешиваемой суспензии метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноата (промежуточное соединение 35) (1,0 г, 1,80 ммоль), растворенного в ЕЮН (400 мл) под аргоном одной порцией добавляли борогидрид натрия (1,019 г, 26,93 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 20°С в течение 70 ч. Несколько капель воды добавляли с целью погасить избыток гидрида и смесь перемешивали в течение 1 ч. Смесь упаривали досуха и остаток распределяли между СН₂С1₂ и водой, насыщенной №1С1. Органическую фазу сушили и концентрировали с обеспечением сырого продукта в виде белых кристаллов. Сырой продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле, элюирование 0-10% метанолом в дихлорметане. Чистые фракции упаривали досуха с получением трет-бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропилкарбамоил)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамата (286 мг, 30,1%) в виде белого твердого вещества.

'|| ЯМР (500 МГц, ДМСО-Л) δ 1.41 (9Н, 8), 1.79-1.99 (6Н, т), 3.31-3.37 (2Н, т), 3.51 (2Н, т), 4.214.28 (2Н, т), 4.55 (1Н, 8), 4.90 (1Н, ф, 6.59 (1Н, ά), 7.06 (1Н, 8), 7.16 (1Н, ά), 7.31 (4Н, 8), 8.01 (1Н, ά), 8.12 (1Н, 8), 11.67 (1Н, 8). т/ζ (Ε8Ι+) (М-Н)^- = 529; ВЭЖХ ΐΚ = 2,93 мин.

Промежуточное соединение 39. (К)-метил 3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропаноат.

К Ьос-(К)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропионовой кислоте (950 мг, 3,17 ммоль) и карбонату калия (876 мг, 6,34 ммоль) в ДМФА (15 мл) одной порцией добавляли йодметан (0,987 мл, 15,85 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 80°С в течение 24 ч. Реакционную смесь концентрировали и разбавляли ЕЮАс (25 мл) с водой (25 мл). Органический слой сушили над Мд8О₄, фильтровали и упаривали с получением (К)-метил 3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропаноата (990 мг, 100%) в виде оранжевого твердого вещества.

'|| ЯМР (399.9 МГц, ДМСО-ά^ δ 1.36 (9Н, 8), 2.67-2.70 (1Н, т), 2.71-2.80 (1Н, т), 3.57 (3Н, 8), 4.91 (1Н, ά), 7.32-7.34 (2Н, т), 7.38-7.40 (2Н, т), 7.49 (1Н, ά). МС т/е МН⁺ = 312; ВЭЖХ 1Κ = 2,57 мин.

Промежуточное соединение 40. (К)-метил 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропаноат (гидрохлорид).

К (К)-метил 3-(трет-бутоксикарбониламино)-3-(4-хлорфенил)пропаноату (промежуточное соединение 39) (990 мг, 3,16 ммоль) в ДХМ (20 мл) при 20°С одной порцией добавляли соляную кислоту (4,0М в диоксане) (7,89 мл, 31,55 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 3 ч. Реакционную смесь упаривали с получением (К)-метил 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропаноата (гидрохлорид) (777

- 13 018512 мг, 98%) в виде желтого твердого вещества.

Ή ЯМР (399,9 МГц, ДМСО-б₆) δ 2.99-3.05 (1Н, т), 3.18-3.23 (1Н, т), 3.58 (3Н, б), 4.62-4.65 (1Н, т), 7.49-7.53 (2Н, т), 7.57-7.61 (2Н, т), 8.72 (3Н, 8). МС т/е МН⁴ = 214; ВЭЖХ ΐΒ = 1,71 мин.

Промежуточное соединение 41. (В)-метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноат.

О

К 4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоновой кислоте (промежуточное соединение 1) (0,5 г, 1,38 ммоль) и ΌΙΡΕΑ (0,503 мл, 3,04 ммоль) в ΝΜΡ (5 мл) при 20°С одной порцией добавляли гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Н^№,№тетраметилурония (0,579 г, 1,52 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 5 мин. К раствору затем добавляли (В)-метил 3-амино-3-(4-хлорфенил)пропаноат (гидрохлорид) (промежуточное соединение 40) (0,346 г, 1,38 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс (100 мл) и последовательно промывали водой (50 мл), водой (50 мл) и водой (50 мл). Органический слой сушили над Мд§О₄, фильтровали и упаривали с получением сырого продукта. Сырой продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 0-5% МеОН в ДХМ. Чистые фракции упаривали досуха с получением (В)-метил 3-(4-(третбутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноата (0,800 г, 100%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (399,9 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.40 (9Н, 8), 1.94-1.98 (2Н, т), 2.00-2.01 (2Н, т), 2.83 (1Н, б), 2.852.87 (2Н, т), 3.55 (3Н, 8), 3.60 (2Н, 8), 4.21 (2Н, 8), 5.23 (1Н, б), 6.60-6.61 (1Н, т), 7.16-7.18 (1Н, т), 7.35 (4Н, ф, 8.09-8.14 (2Н, т), 11.65 (1Н, 8). МС т/е МН⁺ = 557; ВЭЖХ ΐΒ = 2,29 мин.

Промежуточное соединение 42. (В)-трет-бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамат.

К (В)-метил 3-(4-(трет-бутоксикарбониламино)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4карбоксамидо)-3-(4-хлорфенил)пропаноату (промежуточное соединение 41) (779 мг, 1,40 ммоль) в ТГФ (40 мл), охлажденному до 0°С, под азотом по каплям добавляли ЫА1Н₄ (1,398 мл, 1,40 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 3 ч. Реакционную смесь гасили водой (1 мл) и нейтрализовали 2М НС1. Реакционную смесь упаривали досуха и повторно растворяли в ДХМ (100 мл) и промывали водой (100 мл). Органический слой сушили над Мд§О₄, фильтровали и упаривали с получением сырого продукта. Сырой продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 0-10% МеОН в ДХМ. Чистые фракции объединяли и упаривали с получением (В)трет-бутил 4-(1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропилкарбамоил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-илкарбамата (160 мг, 21,63%) виде твердого вещества.

Ή ЯМР (399,9 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.37-1.41 (9Н, 8), 1.86-1.92 (2Н, т), 1.94 (2Н, б), 2.00 (2Н, б), 3.38 (2Н, 8), 3.53-3.55 (2Н, т), 4.25 (2Н, ΐ), 4.52 (1Н, 8), 4.91 (1Н, б), 6.60-6.62 (1Н, т), 7.01 (1Н, 8), 7.16-7.18 (1Н, т), 7.33 (4Н, т), 7.98-8.00 (1Н, т), 8.14 (1Н, 8), 11.67 (1Н,8). МС т/е МН⁺ = 529; ВЭЖХ ΐΒ = 2,01 мин.

Промежуточное соединение 47. (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ол.

- 14 018512

К перемешиваемой суспензии (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропановой кислоты (10 г, 50,09 ммоль) в ТГФ (500 мл) при 0°С на протяжении 45 мин под азотом по каплям добавляли борантетрагидрофурановый комплекс (376 мл, 375,69 ммоль). Получающуюся суспензию перемешивали при 0°С в течение 30 мин, затем при 22°С в течение 5 ч. Реакционную смесь порциями добавляли к метанолу (500 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение трех дней. Смесь концентрировали, повторно растворяли в метаноле (250 мл) и повторно концентрировали (этот приём повторяли трижды). Остаток растворяли в ДХМ (75 мл) и промывали 1н. ΝαΟΗ (50 мл). Водный слой экстрагировали ДХМ (3x100 мл) и экстракты объединяли с органическим слоем. Объединенную органику промывали насыщенным раствором соли (50 мл), сушили над Мд8О₄ и концентрировали с получением сырого продукта. Сырой продукт очищали с помощью флэш-хроматографии на кремнеземе, элюирование градиентом 2-6% МеОН/аммиака в ДХМ.

Чистые фракции упаривали досуха с получением (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ола (5,76 г, 61,9%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (400,13 МГц, СБС1₃) δ 1.84-1.93 (2Н, т), 3.76-3.81 (2Н, т), 4.13 (1Н, ΐ), 7.23-7.25 (2Н, т), 7.30-7.34 (2Н, т).

МС т/е МН⁺ = 186.

Промежуточное соединение 48. (8)-трет-бутил 4-(трет-бутоксикарбониламино)-4-(1-(4-хлорфенил)3 -гидроксипропилкарбамоил)пиперидин-1 -карбоксилат.

К 1-(трет-бутоксикарбонил)-4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин-4-карбоновой кислоте (промежуточное соединение 70) (2,022 г, 5,87 ммоль) и ΌΙΡΕΆ (3,08 мл, 17,61 ммоль) в БМЛ (20 мл) одной порцией добавляли (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-ол (промежуточное соединение 47) (1,09 г, 5,87 ммоль). Добавляли гексафторфосфат О-(7-азабензотриазолил)-^^№,№-тетраметилурония (2,456 г, 6,46 ммоль), и получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 24 ч. Реакционную смесь упаривали досуха, затем разбавляли ЕЮЛе (300 мл) и последовательно промывали водой (50 мл) и насыщенным раствором соли (50 мл). Органический слой сушили над Мд8О₄, фильтровали и упаривали, затем растирали с диэтиловым эфиром с получением сырого (8)-трет-бутил 4-(трет-бутоксикарбониламино)-4-( 1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропилкарбамоил)пиперидин-1 -карбоксилата (4,66 г, 155%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (400,13 МГц, ДМСО-б₆) δ 1.39 (18Н, 8), 1.71-1.92 (6Н, т), 3.06 (2Н, в), 3.36 (2Н, ΐ), 3.54-3.65 (2Н, т), 4.52 (1Н, ΐ), 4.89 (1Н, ф, 6.89 (1Н, в), 7.29-7.34 (4Н, т). МС т/е \1·Νι' = 534.

Промежуточное соединение 49. (8)-4-амино-№(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4карбоксамид.

К (8)-трет-бутил 4-(трет-бутоксикарбониламино)-4-( 1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропилкарбамоил) пиперидин-1-карбоксилату (промежуточное соединение 48) (3 г, 5,86 ммоль) в диоксане (30 мл) добавляли хлороводород 4М в диоксане (11,72 мл, 46,87 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 2 ч. Реакционную смесь растворяли в метаноле и очищали с помощью ионообменной хроматографии, используя 8СХ колонку. Целевой продукт элюировали из колонки с использованием 3,5н. аммиака/МеОН и чистые фракции упаривали досуха с получением (8)-4-амино-№(1-(4-хлорфенил)3-гидроксипропил)пиперидин-4-карбоксамида (1,970 г, 108%) в виде бесцветной смолы.

- 15 018512

Ή ЯМР (400,13 МГц, ДМСО-а₆) δ 1.20-1.28 (2Н, т), 1.75-1.91 (4Н, т), 2.67-2.83 (2Н, т), 3.30 (2Н, т), 4.87 (1Н, к), 7.30-7.37 (4Н, т). МС т/е МН⁺ = 312.

Промежуточное соединение 69. 1-трет-Бутил 4-метил-4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин1,4-дикарбоксилат.

Метил 4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин-4-карбоксилат (\О 2008075109) (10 г, 38,71 ммоль) растворяли в ДХМ (194 мл). К раствору порциями добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (10,67 мл, 46,46 ммоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 1 ч. Сырой продукт промывали насыщенным бикарбонатом натрия (3x50 мл) и органические слои сушили над Мд8О₄ и упаривали досуха с получением 1-трет-бутил 4-метил-4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин-1,4дикарбоксилата (13,6 г, 98%) в виде белого твердого вещества.

Ή ЯМР (400,13 МГц, ДМСО) δ 1.39 (9Н, к), 1.40 (9Н, к), 1.70-1.77 (2Н, ΐά), 1.88-1.92 (2Н, ά), 3.05 (2Н, широкий), 3.61 (3Н, к), 3.62-3.65 (2Н, т), 7.33 (широкий, обмен).

Промежуточное соединение 70. 1-(трет-Бутоксикарбонил)-4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин-4-карбоновая кислота.

К 1-трет-бутил 4-метил-4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин-1,4-дикарбоксилату (промежуточное соединение 69) (13,88 г, 38,72 ммоль) в воде (21,51 мл), ТГФ (86 мл) и метаноле (86 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (8,13 г, 193,62 ммоль). Получающийся раствор перемешивали при 20°С в течение 1 дня. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс (75 мл) и промывали водой (75 мл). Значение рН водной фазы устанавливали на 5 с помощью 1М раствора лимонной кислоты, затем экстрагировали ЕЮАс (3x200 мл). Органические экстракты промывали насыщенным раствором соли (50 мл), затем сушили над Мд8О₄, фильтровали и упаривали с получением целевого продукта 1-(трет-бутоксикарбонил)4-(трет-бутоксикарбониламино)пиперидин-4-карбоновой кислоты (10,36 г, 78%) в виде мелкозернистого твердого вещества.

Ή ЯМР (400,13 МГц, ДМСО) δ 1.39 (9Н, к), 1.40 (9Н, к), 1.68-1.76 (2Н, ΐά), 1.89-1.92 (2Н, ά), 3.03 (2Н, широкий), 3.62-3.65 (2Н, ά), 7.16 (обмен), 12.36 (обмен).

Биологическое действие заявленного соединения может быть исследовано, как изложено ниже.

Исследование фосфорилирования С8К-3 аденокарциномы молочной железы человека МИА-МВ-468 в условиях ΐη νΐΐΓθ

В этом исследовании определяли способность тестируемых соединений ингибировать фосфорилирование остатка серина-9 в киназе-3 β гликоген-синтазы (С8К-3в) в качестве суррогатного маркера активности РКВ (Ак1) в клетках, что оценивали с помощью технологии Аситеп Ехр1огег Ииогексей Р1а1еРе;-^ег. Клеточную линию аденокарциномы молочной железы человека МИА-МВ-468 (ЬСС Рготосйет, Теάά^ηдιοη, М^άά1екеχ, ИК, № каталога НТВ-132) поддерживали общепринятым способом в ростовой среде Игла, модифицированной Дульбекко (ИМЕМ; [пуЦгодеп ^^т^ΐеά, РаЕ1еу, ИК № каталога 11966025), содержащей 10% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку (ФТС; 81дта, Роо1е, ЭогкеЕ ИК, № каталога Е0392) и 1% Ь-глутамин (С1Ьсо, № каталога 25030-024) при температуре 37°С с 5% СО₂ вплоть до слияния 70-90%.

Для исследования фосфорилирования клетки отсоединяли от культивируемой колбы, используя Трипсин-ЕИТА (ЧпуЦгодеп Επιπλά, № каталога 25300-062), и высевали в лунки черного планшета с прозрачным дном Согшпд Сок1аг Ро1ук1угепе на 96 лунок (Икйег ЗаепцПс ИК, ЬоидйЬогоидй, ЬеюейегкЫге, ИК; № каталога 3904 и ИР8-130-020К) при плотности 5000 клеток на лунку в 100 мкл полной ростовой среды. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С с 5% СО₂, что давало возможность им прилипнуть.

В день 2 клетки обрабатывали тестируемыми соединениями и инкубировали в течение 2 ч при 37°С с 5% СО₂. Тестируемые соединения приготавливали в виде 10 мМ маточных растворов в ДМСО и дозировали непосредственно до необходимых концентраций в тестируемые лунки, используя неконтактную (акустическое распределение множества капелек 2,5 нл непосредственно в исследуемые лунки) ЕСНО технологию дозирования (ЬаЬсу1е Ечс. 8иппууа1е, СаШогша, И8А). Каждый планшет содержал контрольные лунки без тестируемого соединения.

- 16 018512

Затем в каждую лунку добавляли 20 мкл фиксирующего буфера (фосфатно-солевой буфер (ФСБ), содержащий 10% формальдегид; 8щта; № каталога Е1635) для получения конечных концентраций в лунке 1,6%. После этого планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре перед удалением фиксажа. Каждую лунку один раз промывали 250 мкл ФСБ и затем в каждую лунку добавляли 50 мкл ФСБ. Затем ФСБ отсасывали и клетки пермеализировали и блокировали путем инкубирования каждой лунки с 50 мкл пермеализирующего/блокирующего буфера (ФСБ, содержащий 0,5% Твин 20 (81§та; № каталога Р5927) и 5% Магче1 Мбк Рочбег (Лпбге\\'8 Ркагтасу Ыб., Масс1е8Йе1б, Сбе8Й1ге, ИК; № каталога АРС100199) в течение 1 ч при комнатной температуре до окрашивания.

После удаления пермеализирующего/блокирующего буфера в каждую лунку добавляли 50 мкл первичного антифосфо-68К-33 антитела (Се11 8щпа11пщ Тес1то1оду (Ыеч Епд1апб В1о1аЙ8 (Ик) Ыб.), НбсЫп, НегЙогб8Й1ге, ИК; № каталога 9336, разведенного 1:400 в блокирующем буфере (ФСБ, содержащий 5% Магче1 и 0,05% Твин/Полисорбат 20) и инкубировали в течение ночи при 4°С.

Каждую лунку промывали три раза в 250 мкл промывочного буфера (ФСБ, содержащий 0,05% полисорбат 20) и клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 50 мкл вторичного флюоресцентно-меченого антикроличьего А1еха Ииог 488 антитела (Мо1еси1аг РтоЬе8, 1пч1бодеп Ытбеб, № каталога А11008), разведенного 1:750 в блокирующем буфере. Планшеты промывали три раза в 250 мкл промывочного буфера и хранили содержащими 50 мкл ФСБ при 4°С до дальнейших исследований.

Планшеты анализировали, используя планшет-ридер Аситеп Ехр1огег для количественного определения флуоресцентного сигнала, который характеризует количество фосфорилированного-С8К-33. Активные соединения вызывают снижение фосфо-С8К-3в фосфорилирования относительно максимума (недозированного) контроля для каждого исследования, который измеряли по количеству фосфорилированных объектов на лунку, и это предоставляет возможность оценить потенциал ингибиторов РКВ (Ак1).

1С₅₀ расчет - 1С₅₀ представляет собой концентрацию соединения, необходимую для получения 50% действия по сравнению с уровнем активности, оказываемой соединением, между максимумом (без соединения) и минимумом (избыточный уровень соединения) ответной реакции относительно контрольных данных. Значения 1С₅₀ определяли путем подгонки скорректированного фона, данных исследования ответной реакции для модели 4-параметрической логистической подгонки кривой соответствия уравнению с минимальным ответом, установленным равным нулю. Это осуществляли с помощью собственного разработанного алгоритма с Опдт графическим программным обеспечением (ОпщпЫ1Ь Сотротабоп, Ыог111атр1оп, МА, И8А).

Соединения-примеры изобретения тестировали в вышеупомянутом исследовании и вычисляли их средние значения 1С₅₀. Эти значения представлены в табл. С.

Исследование АКТ1 киназы в условиях ΐη νίίτο

В этом исследовании детектировали ингибиторы активности АКТ1 (РКВа) киназы с использованием прибора Сабрет ЬаЬСЫр 60’3000. Исследование по сдвигу пятна с инкубированием вне чипа на Сабрег включает использование микрожидкостного чипа для измерения превращения флуоресцентномеченого пептида в фосфорилированный продукт посредством соответствующей киназы. Необратимую ферментативную реакцию проводят в микротитрационных планшетах и затем гасят. Получающиеся остановленные растворы серийно протягивают через капилляр в чип, где пептидный субстрат и фосфорилированный продукт разделяется с помощью электрофореза. Затем их детектируют с помощью лазерно-индуцированной флуоресценции. Субстрат и продукт разделяют на два пика путем наложения высокого электрического поля и непосредственно детектируют с использованием флуоресценции. Сигнатура флуоресцентного сигнала показывает степень реакции.

Растворитель для ЕСНО-дозирования представлял собой 100% ДМСО. Мастер-планшет приготовляли исходя из 40 мкл 10 мМ маточного раствора из своего первичного запаса жидкостей в 1 квадранте 384-луночного планшета ЬаЬсу1е. 1:100 разбавление приготовляли из 1 квадранта во 2 квадранте путем извлечения 0,4 мкл и добавления их к 39,6 мкл ДМСО. Последующие 1:100 разбавления приготовляли в 3 квадранте из разбавлений 2 квадранта и в квадранте 4 из разбавлений 3 квадранта.

Для получения диапазона доз, который был необходим для данного исследования из каждого квадранта мастер-планшета многократно дозировали 2,5 нл капель с использованием технологии ЕСНОдозирования (ЬаЬсу1е 1пс. 8иппууа1е, СабТотша, И8А). Обычно используемый диапазон доз был следующим: 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003, 0,001, 0,0001 мкМ. Каждую лунку заполняли диметилсульфоксидом (ДМСО) до общего объема 120 нл так, что когда добавляли смесь фермента и субстрата, конечная концентрация ДМСО составляла 1%. ДМСО добавляли к лункам с максимальным контролем в количестве 120 нл, лунки с минимальным контролем были обработаны 120 нл соединения при концентрации, которая ингибирует активность фермента на 100%.

После добавления соединения или контроля к аналитическому планшету, добавляли 6 мкл пептидной смеси, содержащей 3 мкМ субстрат (5-ЕАМ-6ВРВТ88ЕАЕ6-СОИН2; СКВ) и 40 мкМ АТФ в киназном основном буфере (100 мкМ Нере8 рН 7.5, 0,015% Вгц-35) и 6 мкл ферментной смеси, содержащей 8 нМ АКТ1/РКВа активный фермент (Ир81а1е Вю1есбпо1оду, кат. № 14-276), 8 мМ ЭТТ и 20 мМ МдС1₂ в киназном основном буфере. Все буферы приготовляли из воды с сопротивлением 18 МОм. Планшеты

- 17 018512 запечатывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 50 мин. Реакцию останавливали путем добавления 10 мкл останавливающего буфера (100 мМ Нерек рН 7.5, 0,015% раствор Вгу-35, 0,1% покрывающий реактив #3, 40 мМ ЕИТА, 5% ДМСО) к каждой лунке (прим. планшеты могут быть заморожены после остановки реакции и прочитаны позднее). Планшеты затем анализировали, используя систему поиска новых лекарств Сайрег ЬаЬСЫр ЬС3000 (Сайрег Ь1£е 8с1еисе5, 1 ке11Пе1б, РгеЧоп Вгоок, Киисоги, кА7 3ΛΖ), с использованием следующих условий разделения: - 1,8 фунта на кв.дюйм, - 500 входное напряжение, - 1700 выходное напряжение, время введения образца 0,2 с, время начала введения образца 30 с и конечная задержка 120 с. Интегрирование субстрата и пиков продукта проводили с использованием программного обеспечения Сабрег ЬаЬСЫр, а кривые 1С₅₀ рассчитывали с использованием программного обеспечения Обдт™ (ОпдтЬаЬ Согрогабои, ШпИатрЮи, МА, И8А). Соединенияпримеры в соответствии с изобретением тестировали в исследовании фермента АКТ1 в условиях ш У11го, и полученные средние значения 1С₅₀ сводили в табл. О.

Таблица О

Номер соединенияпримера	Клеточная РКВ среднее 1Сзо (мкМ)	Ιη νΐίτο ΡΚΒα среднее 1С;о (мкМ)
9	0.09	0.0032
13	0.09	0.0042
15	>3.10	0.093

НЕКС анализ

Культура клеток.

Описанные НЕКО-экспрессирующие клетки яичника китайского хомячка К1 (СНО) (Регккои, Саг1ккои, Иикег, & ЗасоЬкои, 2005) выращивали до полуконфлюэнтного состояния при 37°С во влажной атмосфере (5% СО₂) в Р-12 Нат среде, содержащей Ь-глутамин, 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) и 0,6 мг/мл гигромицина (все от 81дта-А1ббсб). Перед использованием монослой промывали с использованием предварительно нагретой (37°С) 3 мл аликвоты версена 1:5,000 (1№1бодеи). После аспирации этого раствора колбу инкубировали при 37°С в инкубаторе с дополнительными 2 мл версена 1:5,000 в течение 6 мин. Клетки затем отделяли от дна колбы путем легкого постукивания и затем к колбе добавляли 10 мл физиологического раствора, забуференного фосфатом Дульбекко, содержащего кальций (0,9 мМ) и магний (0,5 мМ) (ФСБ; 1№1бодеи), и аспирировали в 15 мл центрифужную пробирку перед центрифугированием (50 д, в течение 4 мин). Получающийся супернатант отбрасывали и осадок осторожно ресуспендировали в 3 мл ФСБ. Аликвоту 0,5 мл суспензии клеток удаляли и ряд жизнеспособных клеток определяли (на основе эксклюзии трипанового синего) в автоматическом планшет-ридере (Себех; Iηηоνаΐίδ) с целью отрегулировать с помощью ФСБ объем ресуспендированных клеток с получением требуемой конечной концентрации клеток. Последняя является концентрация клеток в данной точке исследования, которая приведена при ссылке на этот параметр. Клетки СНО-Ку1.5, которые использовали для корректирования смещения напряжения на 1ои когкк™ НТ, хранили и приготовляли для использования таким же образом.

Электрофизиология.

Принципы и функционирование этого устройства описано ранее (8сЫоебег, №ад1е, Т^еζ^8е. & ког1еу, 2003). Вкратце, технология основывается на 384-луночном планшете (Ра1сйР1а1е™), в котором регистрацию предпринимают в каждой лунке путем использования всасывания для расположения и фиксации клетки в небольшом отверстии, разделенном двумя отдельными камерами с жидкостями. После запечатывания раствор в нижней части РаЫЬР1а1е™ загружают в камеру, которая содержит амфотерицин В. Это делает участок клеточной мембраны, которая покрывает отверстие у каждой лунки, проницаемым и, в сущности, позволяет записывать перфорированный, фиксированный потенциал (петч-кламп) в целой клетке.

Для Р-теста использовали прибор 1ои когкк™ НТ от Еккеи ^битеШ. Прибор не обладал свойством подогревать растворы, поэтому работу проводили при комнатной температуре (~21°С), как изложено ниже. Резервуар в положении Буфер загружали 4 мл ФСБ, а в положении Клетки вносили суспензию клеток СНО-НЕКО, описанную выше. 96-Луночный планшет (с У-подобным дном, Огетег Вю-оие), содержащий подлежащие тестированию соединения (при 3-кратной вышеуказанной их конечной тестируемой концентрации), помещали в положение Планшет 1 и Ра1сбР1а1е™ зажимали в терминале РаЫбР1а1е™. Планшет с каждым соединением выставляли в 12 колонках таким образом, чтобы обеспечить построение десяти 8-точковых кривых зависимости действия от концентрации; оставшиеся на планшете две колонки заполняли наполнителем (конечная концентрация 0,33% ДМСО), для определения исходного уровня исследования и надмаксимальной блокирующей концентрацией цизаприда (конечная концентрация 10 мкМ) для определения 100% уровня ингибирования. Потом через жидкостную головку (Рголовка) 1ои когкк™ НТ прибавляли 3,5 мкл РВ8 в каждую лунку Ра1сНР1а1е™, и его нижнюю часть обрызгивали внутренним раствором следующего состава (в мМ): К-глюконат 100, КС140, МдС1₂ 3,2,

- 18 018512

ЕСТА 3 и НЕРЕ8 5 (все производства 81дта-А1бпсЬ) (рН 7,25-7,30 с помощью 10М КОН). После примирования и дебарботирования электронную головку (Е-головку) перемещали вокруг Ра1сНР1а1е™, выполняя тест на проницаемость (то есть прикладывали напряжение для определения того, является ли отверстие в каждой клетке открытым). После этого через Е-головку вводили 3,5 мкл суспензии клеток, описанной выше, в каждую лунку Ра1сНР1а1е™, и клеткам давали 200 с для реагирования и закрытия отверстия в каждой лунке. После этого Е-головку перемещали вокруг Ра1сНР1а1е™ для определения сопротивления закрытию, полученного в каждой лунке. Далее раствор на нижней части Ра1сНР1а1е™ загружали в раствор доступа, который имел следующий состав (в мМ): КС1 140, ЕСТА 1, МдС1₂ 1 и НЕРЕ8 20 (рН 7.25-7.30 с использованием 10М КОН) плюс 100 мг/мл амфотерицина В (81дта-А1бпсЬ). После выдерживания в течение 9 мин для осуществления перфорации участка Е-головку перемещали вокруг 48 лунок Ра1сНР1а1е™ за раз для получения измерений тока НЕЕС перед действием соединения. Через Е-головку затем добавляли 3,5 мкл раствора из каждой лунки планшета с соединением к 4 лункам на РаФНР1а1е™ (конечная концентрация ДМСО составляла 0,33% в каждой ячейке). Это достигали путем перемещения из наиболее разбавленной к наиболее концентрированной ячейки планшета с соединением для минимизирования влияния какого-либо переноса соединения. Через приблизительно 3,5 мин инкубирования Еголовку затем передвигали вокруг всех 384-лунок Ра1сНР1а1е™ для получения измерений тока НЕЕС после действия соединения. Таким способом получали некумулятивные дозазависимые кривые при условии, что критерий исходного контроля достигали в достаточном проценте лунок (см. ниже), действие каждой концентрации исследуемого соединения рассчитывали на основании записей от 1 до 4 лунок с клетками.

Токи НЕЕС до и после введения соединения вызывали при помощи одиночного импульса напряжения, состоящего из 20 с периода, поддерживаемом на уровне -70 мВ, 160 мс шага до -60 мВ (с получением оценки утечки), 100 мс шага обратно к -70 мВ, 1 с шага до +40 мВ, 2 с шага до -30 мВ и в заключение 500 мс шага до -70 мВ. В интервале между импульсами напряжения, снятыми до и после введения соединения, потенциал мембраны не фиксировали. Токи корректировали, вычитая токи утечки, полученные на основе оценки тока, вызываемого во время шага +10 мВ в начале протокола импульса напряжения. Любые сдвиги напряжения в 1оп Vο^кз™ НТ корректировали одним из двух путей. При определении активности соединения к клеткам СНО-Ку1.5 прилаживали деполяризующее линейно изменяющееся напряжение и отмечали напряжение, при котором наблюдалась точка перегиба в следе тока (то есть точку, в которой активирование каналов было видно из линейно изменяющегося протокола). Напряжение, при котором это происходило, предварительно определяли с использованием таких же команд управления напряжением в обычном электрофизиологическом тесте и, как установлено, было равным -15 мВ (данные не показаны); таким образом, потенциал сдвига мог быть введен в программное обеспечение 1оп Vο^кз™ НТ с использованием этого значения в виде контрольной точки. При определении основных электрофизиологических свойств НЕЕС любой сдвиг корректировали путем определения потенциала реверсии НЕЕС следового тока в 1оп Vο^кз™ НТ, сравнивая его с таковым, установленным в обычном электрофизиологическом тесте (-82 мВ) и затем осуществляя необходимый ввод значения сдвига в программное обеспечение 1оп Vο^кз™ НТ. Сигнал тока был дискретный с частотой 2,5 кГц.

Магнитуду НЕЕС тока до и после сканирования измеряли автоматически из вычтенных следов утечки с помощью программного обеспечения 1оп Vο^кз™ НТ, беря 40 мс среднего тока во время начального периода, поддерживаемого на уровне -70 мВ (исходный ток), и вычитая результат из ответного пика следового тока. Критериями приемлемости для вызываемых токов в каждой лунке являлись сопротивление закрытию перед сканированием >60 МОм, амплитуда следового НЕЕС тока перед сканированием >150 пА; сопротивление закрытия после сканирования >60 МОм. Степень ингибирования НЕЕС тока определяли путем деления НЕЕС тока после сканирования на соответствующий НЕЕС ток перед сканированием для каждой лунки.

Ссылки

Регззоп, Е., Саг1ззоп, Ь., Эикег, С., & 1асоЬзоп, I. (2005). В1осктд сНагас1епзНсз οί НЕЕС, НNаν1.5, апб НКуБОТ1/Нт1пК айег абтИизЧаНоп οί Ле ηονе1 апй-аггкуЛтк сотроипб ΛΖΌ7009. 1. Сагбюуазс. Е1ес1горНу8ю1, 16, 329-341.

8сНгоебег, К., №ад1е, В., Тге/1зе, Ό.Ε, & Vο^1еу, 1. (2003). 1опетогкз НТ: а пе\у ЫдЫНгоидкри! е1ес1горНузю1оду теазигетеп! р1айогт. 1. Вюто1. 8сгееп., 8, 50-64.

Результаты НЕЕС анализа.

Соединение-пример 9, (8)-4-амино-№( 1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1 -(7Н-пирроло [2,3 б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид, испытывали вплоть до 100 мкМ в соответствии с методикой, описанной выше, и среднее НЕЕС значение 1С₅₀ для 177 мкМ получали путем экстраполяции кривой.

Эксперименты в условиях ш νί\Ό.

Фармакодинамический анализ РКВ субстратных белков Ο8Ε3β и РЕА840 в ответ на (8)-4-амино-№ (1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид.

2,5х10⁶ И87-МС клеток (АТСС номер НТВ-14™) + 50% матригеля инъецировали п/к (подкожно) в

- 19 018512 бок голой мыши. Когда опухоли достигали объема около 0,5 см³, давали п/о (перорально, принудительно) острую дозу 150 или 300 мг/кг (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Нпирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (Е9). Животных умерщвляли в заданный момент времени и опухоли вырезали и быстро замораживали в жидком азоте.

Εχ-νίνο опухолевые лизаты приготовляли в 10% тритон-Х-100 Трис-лизирующем буфере, содержавшем используемые ингибиторы протеазы и фосфатазы, используя методику Ба81Ргер 24 (МР Βίοтеб1са18, матрикс #6910-500). Концентрации белка оценивали по БСА калибровочной кривой с использованием набора Р1егсе ВСА (#23225). ρ68Κ3β измеряли с помощью вестерн-блоттинга, а рРКА.840 с помощью сэндвич-метода иммуноферментного твердофазного анализа - ЕБ18А (Вю8оигсе КНО0421).

Для вестерн-блоттинга эквивалентные количества белка разделяли с помощью 4-12% градиента заранее приготовленного В18-Тп8 полиакриламида (ЗпуЦгодеп ЯР0323), переносили на НуЬопб С Ех1га нитроцеллюлозные мембраны (ЗпуЦгодеп БС2001) и инкубировали с первичной антисывороткой (ρ68Κ3β 8ег9, Се11 81дпа1тд ТесЬпо1оду #9336; весь 68Κ3β, ВИ Тгапзбисйоп ЬаЬ8 #610202) и впоследствии либо с конъюгированными с пероксидазой хрена антикроличьими 1д6 (Се11 81диа1шд ТесЬпо1оду #7074), либо с антимышиными 1дС (Се11 81дпаШпд ТесЬпо1оду #7076). Иммунореактивные белки детектировали с помощью усиленной хемилюминесценции (#34076 Р1егсе 8ирег81дпа1 Иига) и полосы количественно определяли с помощью СйетЮеши8 II (8упдепе). Нанесённые на график значения показывают ингибирование ρΟ8Κ3β, выраженное в процентах, по сравнению с контролями, содержащими наполнитель, следуя нормировки общего ρ68Κ3β.

Для ЕБ18А (энзим связанный иммуносорбентный анализ), эквивалентные количества белков добавляли к 96-луночному планшету, предварительно покрытому захватывающим рРВА.840 специфическим моноклональным антителом. Затем добавляли обнаруживающее антитело, специфическое для рРВА.840 (ТЬг 246) и далее Н.Р меченное антикроличье 1дС антитело. Исследование затем проводили в количественной форме с использованием стабилизированного ТМВ (тетраметилбензидин) при 450 нм на планшет-ридере. Интенсивность окраски является пропорциональной концентрации рРВА.840 (ТЬг 246). Результаты показаны на фиг. 1.

Изучение МСБ-7 противоопухолевого действия с использованием (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)3 -гидроксипропил)-1 -(7Н-пирроло [2,3-б]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (Е9).

Мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО) получали от СЬаг1е8 Вгуег ЬаЬога1опе8. Мышей обеспечивали местом обитания и содержали в специфических, непатогенных условиях. Для 1п угуо имплантации клетки получали из колбы с культурой Т225 ткани путем 2-5-минутной обработки последней 3 х трипсином (1пу11годеп) в ЕИТА растворе с последующим суспендированием в основной среде и троекратным промыванием в забуференном фосфатом физиологическом растворе (1пу11годеп). Для инъекции использовали исключительно суспензии из отдельных клеток с более чем 90% жизнеспособностью, как установлено с помощью эксклюзии трипановым синим. МСБ-7 клетки опухоли молочной железы (АТСС номер НТВ-22™) (5х10⁶ клеток + 50% Ма1пде1™) инъецировали подкожно в левый бок животного в объеме 0,1 мл. Перед имплантацией МСБ-7 клеток 8С1И мышей анестезировали и осуществляли имплантацию пеллет с 0,5 мг эстрогена в течение 21 дня. Когда средний размер опухоли достигал ~0.3 см³, мышей рандомизировали в контрольную и лечебную группы. Лечебная группа получала 300 мг/кг соединения Е9, солюбилизированного в наполнителе, состоящем из 10% (об./об.) ДМСО, 25% (мас./об.) Иер1о8е™ в воде, путем перорального введения, принудительно. Контрольная группа получала один наполнитель, один раз в день путем перорального введения, принудительно. Объем опухоли (измеренный штангенциркулем) регистрировали через определенные интервалы времени проведения исследования. Мышей умерщвляли с помощью СО₂. Объем опухоли рассчитывали, беря длину, являющуюся наибольшим диаметром от края до края опухоли, и ширину, являющуюся соответствующим перпендикулярным диаметром, с использованием формулы (длинах ширина) х^(длинах ширина) х(п/6). Ингибирование роста с самого начала лечения оценивали с помощью сравнения различий объема опухоли между контрольной и лечебной группами. Поскольку вариация данных среднего объема опухоли возрастает пропорционально объему (и является, вследствие этого, непропорциональной между группами), данные 1од-преобразовывали для устранения какой-либо зависимости от размера перед статистической оценкой. Статистическую достоверность оценивали с использованием двухвыборочного 1 теста с использованием одностороннего критерия. Результаты показаны на фиг. 2.

Прогнозирование дозы для человека.

Прогнозирование дозы для человека для клинических исследований требует оценки параметров фармакокинетики у человека (ФК), важных для определения Т_1/2 элиминации и формы и амплитуды концентрации в плазме в зависимости от времени при конкретной дозе. Эти параметры элиминации включают клиренс, объем распределения в стационарном состоянии (У88), константу скорости всасывания (1<а), бионакопление (Б) и периодичность дозирования. Прогнозирование дозы для человека также требует некоторых фармакологических данных о том, каким образом доза сопоставляется с эффективностью (Мсбшпйу, СоШпдЮп, Аи81т & В11еу, Сиггеп1 Эгид Ме1аЬо118т 2007 8 463-479).

Для (8)-4-амино-Я-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)пи

- 20 018512 перидин-4-карбоксамида (Е9), клиренс для человека прогнозировали исходя из данных собственного клиренса (С1т1), определенного у гепатоцитов человека с поправкой на ίη νίνο клиренс путем включения хорошоперемешиваемой модели (К11еу, МсСтпЦу & ΛιΐδΙίη. Эгид Ме1аЬо118т & Όίδροδίΐίοη 2005 33(9) 1304-1311). Незначительные различия наблюдали в связывании белка плазмы крови с соединением у крысы, собаки и человека; следовательно, наблюдаемые у крысы и собаки значения У§8 корректировали с помощью фактора Ри, человек/Ри (крыса или собака) (где Ри = фракция, не связанная в плазме). С использованием этого подхода У§8 человека прогнозировали на уровне 3,3 л/кг. Фракцию, абсорбировавшуюся (РаЬ§) у людей, принимали в качестве средней между крысой и человеком. Этот РаЬ§ параметр затем был подогнан под бионакопление (Р) с помощью поправки на печеночную экстракцию.

Скорость абсорбции (Ка) полагали обеспечивающей значение Т_тах для Е9 равным 1 ч, причем дано относительно установившееся значение, которое наблюдалось доклинически, и должно в равной степени приводить к установившемуся значению С_тах для использования в подсчете границ, что касается исследований безопасности. Предпочтительная частота дозирования препарата, как предполагалось, составляет дважды в сутки (ВШ).

Определив форму и величину концентрации в плазме человека в зависимости от кривой времени, на заключительной стадии доза должна была быть установлена так, чтобы в плазме были достигнуты такие концентрации, которые, вероятно, обеспечат эффективность. В ФД исследованиях на мышах ингибирование рС8К (суррогатная концевая точка противоопухолевой активности) наблюдалась в то время, когда концентрации в свободной плазме 1-кратно превышали концентрацию 1С₅₀ для каждого соединения, определяемую в клеточном исследовании АКТ ингибирующей активности, скорректированную с учетом связывания вследствие присутствия фетальной телячьей сыворотки при исследовании. Следовательно, ФК модель человека допускает, что свободная экспозиция Е9 для обеспечения клинической эффективности должна превышать свободную РКВ 1С₅₀.

Суммируя все эти данные вместе, можно предположить, что эффективная для человека доза (8)-4амино-Н-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4карбоксамида (Е9) будет составлять около 7 мг/кг два раза в день, а период полувыведения будет равным приблизительно 6 ч.

Перечень фигур

Фиг. 1 - уровни Ο8Ι<3β и РКА840 фосфорилирования у образцов, взятых из И87-МС опухолей, выращенных в голых мышах, после острой дозы 150 или 300 мг/кг (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (Е9), п=5 в определенный момент времени.

Фиг. 2 - результаты МСР-7 противоопухолевого исследования на 8СГО мышах с использованием дозы 300 мг/кг (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4ил)пиперидин-4-карбоксамида (Е9), вводимой один раз в день (00).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение (8)-4-амино-Ы-( 1 -(4-хлорфенил)-3 -гидроксипропил)-1 -(7Н-пирроло [2,3 -

ά] пиримидин-4 -ил) пиперидин-4 -карбоксамид или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
3. Применение соединения (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3ά] пиримидин-4 -ил) пиперидин-4 -карбоксамида

- 21 018512 он ς

или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления медикамента, предназначенного для ле чения рака.
4. Применение соединения, определенного в п.3, или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления медикамента, предназначенного для лечения рака молочной железы.
5. Соединение по п.1, которое представляет собой (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамид.
6. Способ получения соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли, включающий реакцию кислоты формулы (II) с (8)-3-амино-3-(4-хлорфенил)пропан-1-олом где Р¹ означает пригодную защитную группу;

и затем, при необходимости, (ί) удаление каких-либо защитных групп и/или (ίί) образование его фармацевтически приемлемой соли.
7. Способ по п.6, в котором Р¹ означает трет-бутоксикарбонильную защитную группу.
8. Соединение (8)-трет-бутил 4-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропилкарбамоил)-1-(7Н-пирроло[2,3й] пиримидин-4 -ил) пиперидин-4 -илкарбамат
9. Способ получения соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли, включающий реакцию (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4-карбоксамида с бициклическим гетероциклом формулы (V) где Ь₁ означает пригодную уходящую группу;

и затем, при необходимости, образование его фармацевтически приемлемой соли.
10. Способ по п.9, в котором Ь₁ означает хлор.
11. Соединение (8)-4-амино-Ы-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)пиперидин-4-карбоксамид