CN107567503B - 用于ttk抑制剂化疗的预后生物标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于鉴定人类个体或动物中的易于受TTK抑制剂治疗影响的肿瘤的方法，所述方法包括：a)提供肿瘤样品；b)确定所述肿瘤样品中突变的CTNNB1基因的存在，其中所述突变位于CTNNB1的外显子3中，由此突变的CTNNB1基因的存在表明肿瘤易于受TTK抑制剂治疗影响。在另一方面，上述定义的方法的步骤b)被确定所述肿瘤样品中突变的CTNNB1蛋白的存在的步骤代替，其中所述突变位于CTNNB1的外显子3中，由此突变的CTNNB1蛋白质的存在表明肿瘤易于受TTK抑制剂治疗影响。在另一替代方案中，步骤b)包括确定CTNNB1调节的基因的改变的表达，由此CTNNB1调节的基因的改变的表达表明肿瘤易于受TTK抑制剂治疗影响。

Description

用于TTK抑制剂化疗的预后生物标记
本发明的领域
本发明涉及一种检测CTNNB1基因或CTNNB1蛋白的突变体状态或CTNNB1调节的基因的改变的表达、以确定易受TTK抑制剂抗癌治疗影响的肿瘤的方法。本发明还涉及一种通过检测CTNNB1基因或CTNNB1蛋白的突变体状态或CTNNB1调节的基因的改变的表达、来预测用TTK抑制剂治疗的癌症的结果、或疾病进展的方法。
本发明的背景
靶向治疗为癌症患者带来很大的好处，因为它们可以改善存活率，伴有比传统的、选择性较低的细胞毒性药物更少的副作用。蛋白激酶的小分子抑制剂是靶向治疗的成功的一个最好的例子:许多这些抑制剂利用肿瘤细胞独特的特征，从而允许癌症特异性，同时具有对健康细胞的有限效果。靶向治疗的一个典型的例子是在具有HER2基因扩增或过表达的乳腺癌患者中使用酪氨酸激酶抑制剂和抗体(Higgins,M.J.,and Baselga,J.,J.Clin.Invest.121:3797；2011)。
要确定患者是否有可能会响应某个靶向治疗，重要的是在治疗开始前确定与患者的肿瘤标本的药物敏感性相关的生物标志物的状态和存在。
蛋白激酶TTK(EC 2.7.12.1)，通常被称为Mps1，是纺锤体组装检查点(SAC)、确保染色体分离的保真度的监督机制的组分(Liu,X.,and Winey,M.,Annu.Rev.Biochem.81:561；2012)。SAC功能缺陷可以通过在未连接的动粒存在的情况下使有丝分裂退出(mitoticexit)而导致染色体分离错误。SAC功能完全丧失是在小鼠中致命的(Baker,D.J.,等人,Curr.Opin.Cell Biol.17,583；2005)和与人类细胞系不相容的(Michel,L.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101,4459；2004；Kops G.J.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA101,8699；2004)。TTK的mRNA水平在各种人类癌症(包括乳腺癌，甲状腺乳头状癌，肝细胞癌，胰腺导管腺癌，神经胶质瘤，胃癌，支气管原癌和肺癌)中是升高的(Daniel,J.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:5384；2011；Maire,V.,等人,PLoS ONE 8(5)e63712；2013；Kilpinen,S.,等人,PLoS ONE 5(12),e15068；2010；Landi,M.T.,等人,PLoS ONE 3(2)e1651；2008；Liang,X.D.,等人PLoS ONE 9(6),e97739；2014；Mills,G.B.,等人J.Biol.Chem.267:16000；1992；Mir,S.E.,等人,Cancer Cell 18:244；2010；Salvatore,G.,等人,Cancer Res.67:10148；2007:Slee,R.B.,等人,Mol.Cancer Ther.13:307；2014；Tannous,B.A.,等人,J.Natl.Cancer Inst.105:1322；2013；Yuan,B.,等人,Clin.CancerRes.12:405；2006)。因此，抑制TTK的活性的化合物适用于多种癌症的治疗。这些化合物可以作为单一试剂应用，或与其它抗癌剂组合应用。
已经公开了显示对TTK的抑制作用的不同化合物。阿斯利康英国有限公司(AstraZeneca UK Ltd.)在WO2009/024824A1中公开了2-苯胺基嘌呤-8-酮作为TTK的抑制剂。Oncotherapy Science Inc.在WO2011/013729A1中，公开稠合咪唑作为TTK抑制剂，并且在WO2011/016472A1中公开了吡啶和嘧啶衍生物作为TTK抑制剂。University HealthNetwork在WO2011/123937A1，WO2013/053051A1和WO2014/056083A1已经公开了抑制TTK的吲唑类。Dana Farber Cancer Institute在WO2010/080712A1中公开了嘧啶并二氮杂
Figure BDA0001454666190000021
酮作为TTK的抑制剂。Nerviano Medical Sciences S.R.L.在WO2009/156315A1中，公开吡唑并-喹唑啉作为TTK抑制剂，在WO2012/101029A1中公开三环衍生物作为TTK抑制剂，在WO2010/108921A1中，公开N-芳基-2-(2-芳基氨基嘧啶-4-基)吡咯-4-甲酰胺作为TTK抑制剂，在WO2012/013557A1中，公开异噁唑并喹唑啉类作为TTK抑制剂，在WO2012/101032A1中，公开三环吡咯衍生物作为TTK抑制剂，和在WO2012/139930A1中，公开吡唑基-嘧啶类作为TTK抑制剂。
Myriad Pharmaceuticals Inc.在WO2010/111406A2中公开了嘌呤类作为TTK的抑制剂。此外，Cancer Research Technology Ltd.公开了WO2012/123745A1中的吡咯并吡啶氨基衍生物和WO2014/037750A1和WO2014/037751A1中的双环类作为TTK抑制剂。
在WO2010/124826A1中的咪唑并喹喔啉类，在WO2011/026579A1中的氨基喹喔啉类、在WO2011/063907 A1,WO2011/063908 A1,WO2011/064328 A1,WO2011/157688 A1,WO2012/143329 A1,WO2014/009219 A1,WO2014/195274 A1,WO2014/195276 A1和WO2014/198647 A1中的三唑吡啶类，在WO2012/136531A1中的咪唑并吡啶类，在WO2012/130905 A1中的取代的苯并咪唑类，在WO2012/032031A1，WO2013/135612A1和WO2014/131739A1中的咪唑并哒嗪类，在WO2011/113862A1、WO2011/151259A1、WO2012/080228A1、WO2012/080229A1、WO2012/080230A1、WO2012/080232A1、WO2012/080234A1和WO 2012/080236A1中的咪唑并吡嗪类分别被Bayer Schering Pharma A.G.公开为TTK抑制剂。
已经在采用不同的人类癌细胞系的细胞增殖测定中研究了不同化学类别的代表性化合物。咪唑并吡嗪的代表性TTK抑制剂Mps-BAY2b显示出抑制来自不同肿瘤来源的二十七种人癌细胞系的增殖，IC50为160nM至4.3μM(Jemaà，M.，等人，Cell Death Different.20：1532；2013)；在基因组不稳定性的反应和模式，与肿瘤发生相关的几种蛋白质的活性或SAC的功能之间没有发现相关性。
作为吡唑并喹唑啉类的代表，NMS-P715在一组127个癌细胞系中抑制了广泛细胞系的增殖(Colombo，R.等人，Cancer Res.70：10255；2010)；IC50值接近1μM或更高，抗增殖作用与细胞倍增时间无相关性。
由Myriad公开的TTK抑制剂MPI-04079605被证明可以抑制来自不同肿瘤来源的十四种人类癌细胞系的生长，但是只有在延长的孵育时间后显示所述抑制(Tardif，KD等，Mol.Cancer Res.10：2267；2011)。
1H-吡咯并[2,3-c]吡啶类的代表CCT251455以160nM的GI50抑制HCT116细胞的增殖(Naud，S.等，J.Med.Chem.56：10045；2013)。
显示由Shionogi公开的基于咪唑并[1,2-b]哒嗪类的TTK抑制剂抑制来自不同肿瘤起源的14种人癌细胞系的增殖，IC50为3.3nM至320nM(Kusakabe，K.，等人，J.Med.Chem.58：1716；2015)；
吲唑的代表性CFI-401870在一组22个癌细胞系中抑制了广泛细胞系的增殖(Liu，Y.，等人，J.Med.Chem.58：ASAP；2015)，GI50为8nM至70nM。
而在上述引用的分析实验中，不同的癌细胞系对TTK抑制剂显示不同的相对敏感性，没有鉴定出与TTK抑制剂的敏感性相关的基因组或其他标记。
已经显示了上述化学类别的几种TTK抑制剂可以减少黑素瘤(Colombo，R.等人)、结肠直肠癌(Jemaà，M.等人；Tardif等人Laufer，R.等人，Bioorg.Med.Chem.22：4968；2014)、宫颈癌(Jemaà，M.等人)和胶质母细胞瘤细胞(Tannous，BA等人)的小鼠模型中异种移植物的生长，证明了TTK抑制剂在各种癌症治疗中的潜在的使用。
鉴于TTK抑制剂在许多不同细胞系和肿瘤类型中的广泛活性，显然需要可用于预测哪些癌症最有可能响应于用TTK抑制剂的化学治疗的生物标志物。这种预后药物敏感性生物标志物可用于鉴定对于应用使用TTK抑制剂的药物治疗为最佳的患者群体，或可用于预测用TTK抑制剂治疗的疾病的进展或结果。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了如所附权利要求1所定义的方法。
本发明人惊奇地观察到，在CTNNB1基因(HUGO名称：CTNNB1)中具有突变的癌细胞比正常细胞或不表达突变型CTNNB1(CTNNB1精通细胞(proficient cell))的癌细胞对TTK抑制剂更敏感。
CTNNB1基因编码双功能蛋白β-连环蛋白，其调节细胞粘附的协调并调节Wnt信号通路中的基因转录(Logan，C.Y.和Nusse，R.，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.896：1998；2004)。已经在许多癌症中发现了CTNNB1基因的突变，所述癌症包括结肠直肠(Morin，P.J.等人，Science 275：1787；1997；Iwao，K.，等人，Cancer Res.58：1021；1998；Sparks，AB，等人，Cancer Res.58：1130；1998)和肝细胞癌(Miyoshi，Y.等人，Cancer Res.58：2524；1998；Chen，Y.W.等人，Hepatology 36：927；2002)，黑素瘤(Rubinfeld，B.等人，Science 275：1790；1997)，髓母细胞瘤(成神经管细胞瘤)(medulloblastoma)(Zurrawel，R.H.，等人Cancer Res.58：896；1998)，肺癌(Shigemitsu，K.，等人，Oncogene 20：4249；2001)，子宫内膜癌(Fukuchi，T.等人，Cancer Res.58：3526；1998；Liu，Y.，等人，J.Natl.Canc.Inst.106(9)；2014)，卵巢癌(Palacios，J.，和Gamallo，C.，Cancer Res.58：1344；1998)和前列腺癌(Voeller，HJ和Gelmann，EP，Cancer Res.58,2520；1998)。
β-连环蛋白的活性受蛋白激酶糖原合酶激酶3β(GSK3β)和酪蛋白激酶I(CKI)的丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化(磷酰化)调节，随后是蛋白酶体导致的泛素化和降解(Liu，C.，等人Cell 108,837；2002)。导致这些丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个缺失或取代的CTNNB1基因的突变会损害磷酸化和降解，导致过度活化的β-连环蛋白和不受控制的细胞生长(Morin，P.J.等人，Science 275：1787；1997；Liu，C.，等人)。
本发明提供确定肿瘤衍生物质中CTNNB1的突变体状态、以确定所述肿瘤对采用TTK抑制剂的抗癌治疗的易感性(susceptibility)的方法。本发明还提供了确定CTNNB1的突变体状态以监测用TTK抑制剂的增殖性疾病的治疗的有效性或以预测用TTK抑制剂治疗的癌症的结果的方法。
CTNNB1的突变体状态的分析可以与其他基因和/或蛋白质的突变体状态或表达的分析结合进行，或者可以仅限于仅CTNNB1基因状态的分析。
本发明包括诊断方法。然而，该方法不直接在人体或动物体上进行。诊断方法可以在实验室中进行，但是提供结果，所述结果允许医师对癌症患者疾病进展做出准确预后，特别是关于患者是否可能响应于用TTK抑制剂的化学疗法，所述TTK抑制剂作为单一药剂应用，或与其它治疗剂或放射疗法组合应用。
更具体地，本发明提供了确定肿瘤衍生物质中致癌CTNNB1突变状态、以确定所述肿瘤在用本文详述的式I-VIII中定义的TTK抑制剂的抗癌治疗中的易感性的方法。
已经在癌症患者中观察到了β-连环蛋白中的许多不同突变，并且这些突变已被分类在诸如COSMIC的数据库中(http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/ cosmic/)。癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas)中报道了人类癌症中CTNNB1突变的表达，这可以在以下中查阅http://www.cancergenome.nih.gov。
CTNNB1核酸和蛋白质序列的链接可以在以下找到http://www.genenames.org/ cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝2514其公开内容通过引用并入本文。CTNNB1的蛋白质序列和氨基酸编号也在附图1中给出。
CTNNB1的外显子3含有影响激酶磷酸化β-连环蛋白的能力的突变热点(Morin，P.J.等，1997)。缺乏这种磷酸化导致细胞核中β-连环蛋白的积累(Liu，C.等人，2002)。更具体地说，在33、37或45位处的丝氨酸残基的突变或缺失，或在41位的苏氨酸残基的突变或缺失改变参与β-连环蛋白降解的GSK3β磷酸化基序(Rubinfeld，B.等Morin，P.J.等人)。因此，这些突变导致增加的致癌信号传导(Rubinfeld，B.，等人；Morin，P.J.，等人)。
根据本发明的另一方面，提供了如所附权利要求15至18所述的方法。具体地说，描述了一种确定化合物是否为TTK抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供第一和第二哺乳动物细胞系，其中第一细胞系为CTNNB1突变的，第二细胞系为CTNNB1精通细胞(proficient)；b)使所述第一和第二细胞系与第一候选化合物接触；和c)通过测定确定所述第一和第二细胞系的细胞增殖的抑制。在该方法的重要变体中，如上所述的步骤b)和c)采用第二候选化合物重复，并且基于在采用所述第一细胞系的测定中各个候选化合物的活性来进行候选化合物的选择。
在一个实施方案中，在该方法中使用的第一和第二细胞系可以是癌细胞系。在替代实施方案中，第一和第二细胞系可以是等基因细胞系。
本发明人惊奇地观察到，上述突变中的三个的表达与癌细胞对TTK的化学抑制剂的易感性增加相关。因此，可以使用在丝氨酸33、苏氨酸41或丝氨酸45处的CTNNB1基因的突变体状态的检测来确定肿瘤对TTK抑制剂治疗的易感性。
附图简要说明
将参考附图描述本发明，其中：
图1是CTNNB1(β-连环蛋白)的蛋白质序列和氨基酸编号(UniProt代码P35222)。在33、37、41和45位处的加下划线的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基的突变或缺失改变β-连环蛋白的磷酸化和降解(Rubinfeld，B.等人；Morin，P.J.等)。
图2表示实施例5、8、9、12、13、17和20的66个癌细胞系中的细胞谱分析(cellularprofiling)的火山图。
为了完整性，火山图是细胞系中存在的癌基因突变与这些细胞系在用化合物的增殖测定中的响应的方差分析(Anova)的关联的图形表示。火山图显示突变和非突变细胞系(x轴)之间的平均IC50偏移和来自Anova检验(y轴)的显著性。对多重测试的显著性进行了修正，并且高于阈值水平(虚线)的所有关联(associations)都以黑色填充。圆的区域与携带突变的细胞系的数量成比例。药物敏感性分析中使用的癌细胞系列于下表1。
本发明的详细说明
获得用于分析的肿瘤样品的方法是本领域公知的，并且在此不需要具体的说明。可以通过以下确定来自患有癌症的个体肿瘤的CTNNB1基因的突变体状态：分析肿瘤样品的DNA序列，将肿瘤DNA序列与健康组织中的DNA序列进行比较，或者与“野生型”CTNNB1序列进行比较，所述“野生型”CTNNB1序列在UniProt数据库中称为P35222，并显示在图1中。DNA样品可以直接从肿瘤活检中获取，或可以衍生自循环肿瘤DNA(Diaz，L.A.等人，Nature 486：537；2012)。也可以通过对肿瘤样品的mRNA进行测序来确定CTNNB1基因的突变体状态，或者可以通过分析β-连环蛋白的氨基酸序列或通过使用特异性抗体测定β-连环蛋白的磷酸化状态间接确定CTNNB1基因的突变体状态。
由于突变影响β-连环蛋白的降解，它们影响β-连环蛋白的总细胞水平和细胞核中β-连环蛋白的量。因此，CTNNB1基因的突变体状态也可以通过测定肿瘤细胞中的总的或核的β-连环蛋白水平来间接测定。
或者，CTNNB1的突变体状态可以通过分析由β-连环蛋白调节的基因的表达来确定。可以通过以下来确定β-连环蛋白调节的基因的检测：从肿瘤样品中提取RNA并使用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或使用微阵列分析来测量基因表达。已经描述了许多由β-连环蛋白调节的基因，包括Axin2(Yan，D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：14973；2001)，c-myc(He，T.C.等，Science 281：1509；1998)和LGR5(Barker，N.等人，Nature 499：1003；2007)。在Wnt主页(http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/target_genes)和科学文章(Willert，J.等人，BMC Dev.Biol.2：8；van de Wetering，M等人，Cell111：241；2002)中可以找到β-连环蛋白调节的基因的一个完整的列表。
β-连环蛋白调节的基因的表达也可以使用特异性抗体或基于质谱的方法在蛋白质水平来测定。由于几种β-连环蛋白调节的基因是癌基因，也可以通过测量致癌信号传导(oncogenic signaling)来确定CTNNB1的突变体状态。
TTK抑制剂的实例是属于根据式I的(5,6-二氢)嘧啶并[4,5-e]吲嗪类的化合物或其药学上可接受的盐。
Figure BDA0001454666190000101
其中，
R1选自由以下组成的组:
Figure BDA0001454666190000102
R11是H，卤素，(1-2C)烷基，(2-3C)烯基，(2-3C)炔基，(1-2C)烷氧基或OC2H3，所有烷基和烷氧基任选被一个或多个卤素取代；
R12是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R13是R131CH2、R132O、R133R134N、R135C(O)、R136S、R136S(O)、R136S(O)(NH)、R137SO2、(2-7C)杂环烷基或(1-5C)杂芳基，每个杂环烷基或杂芳基任选被(1-2C)烷基、氟、羟基、氧代、(1-2C)烷氧基、(1-6C)烷基羰基、(1-6C)烷基磺酰基、(1-5C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基、(3-6C)环烷基羰基、(2-7C)杂环烷基羰基或二[(1-2C)烷基]氨基取代，各烷基羰基、烷基磺酰基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、环烷基羰基或杂环烷基羰基任选被(1-2C)烷基、氟、羟基、氰基、氧代或(1-2C)烷氧基取代；
R131是(1-6C)烷基羰基氨基、(3-6C)环烷基羰基氨基或(2-7C)杂环烷基羰基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基，氟，羟基或(1-2C)烷氧基的基团取代；
R132是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基、(6-10C)芳基或(1-5C)杂芳基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、卤素、羟基、(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基或(2-7C)杂环烷基的基团取代；
R133是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基(1-6C)烷基羰基、(1-5C)烷氧基羰基、(3-6C)环烷基羰基或(2-7C)杂环烷基羰基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、卤素、羟基或(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基或(2-7C)杂环烷基的基团取代；
R134是氢或(1-2C)烷基；
R135是(2-7C)杂环烷基、(1-6C)烷基氨基、二[(1-6C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基氨基或(3-6C)环烷基氨基，其各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基、(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基、氧代、氰基或氨基的基团取代；
R136是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基，其各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基或(1-2C)烷氧基的基团取代；
R137是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基、(1-6C)烷基氨基、二[(1-6C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基氨基或(3-6C)环烷基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基或(1-2C)烷氧基的基团取代；
R14是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；和
R15是H，卤素。
在上述式I中，R2选自由以下组成的组：
Figure BDA0001454666190000111
R21是H，卤素，(1-3C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基(1-2C)烷基，(3-4C)环烷基，(2-3C)烯基或氰基；
R22是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R23是H，卤素，(1-2C)烷基，(1-2C)烷氧基，氰基或羟基；
R24是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R25是H，卤素，(1-3C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基(1-2C)烷基，(3-4C)环烷基，(2-3C)烯基或氰基；
R26是H，(1-6C)烷基，(3-6C)环烷基，(2-5C)杂环烷基，(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基，其中n表示1、2、3或4的整数，全部烷基、杂环烷基和(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基任选被一个或多个选自以下的基团取代：(1-2C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基，氧代，氨基，(3-6C)环烷基，二[(1-2C)烷基]氨基或(2-5C)杂环烷基。
在上式I中，R2中R21和R25中只有一个可以是H.
已知的TTK抑制剂的其它实例是属于根据式II的吡唑并-喹唑啉类的化合物或其药学上可接受的盐，如WO2009/156315A1中所述。
Figure BDA0001454666190000121
其中，
R1和R3独立地选自(6-10C)芳基和(1-5C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代；
R2选自(1-6C)烷基和(2-6C)烯基，其中两种基团任选地可以被取代；
R4选自氢和(1-6C)烷基，其中两种基团任选地可以被取代；
R5和R6独立地是氢或甲基。
其他已知的TTK抑制剂是属于根据式III的咪唑并吡嗪类的化合物或其药学上可接受的盐，如在WO2011/013729 A1,WO2011/113862 A1,WO2011/151259 A1,WO2012/080228A1,WO2012/080229 A1,WO2012/080230 A1,WO2012/080232 A1,WO2012/080234 A1和WO2012/080236 A1中所述。
Figure BDA0001454666190000131
其中，
R1选自由以下组成的组：(1-6C)烷基，卤代(1-6C)烷基，HO-(1-6C)烷基，H2N-(1-6C)烷基，氰基(1-6C)烷基，(1-6C)烷氧基(1-6C)烷基，(2-6C)烯基，(2-6C)炔基，(3-6C)环烷基，(3-7C)杂环烷基，(6-10C)芳基和(1-5C)杂芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2选自由以下组成的组：(6-10C)芳基和(1-9C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代；
R3选自由以下组成的组：(1-6C)烷基，-(CH2)n-(3-7C)杂环烷基)，-(CH2)n-(4-8C)杂环烯基)，(3-7C)杂环烷基，(6-10C)芳基，(1-9C)杂芳基，-(CH2)n-(6-10C)芳基，-O-(6-10C)芳基，-C(＝O)N和氰基，其中所述基团可以被取代并进一步地，其中n是0、1或2的整数。
已知的TTK抑制剂的另一个实例是属于根据式IV的嘌呤类化合物
或其药学上可接受的盐，如在WO2010/111406A1中所述的。
Figure BDA0001454666190000141
其中，
R1选自由以下组成的组：(3-6C)环烷基和(3-7C)杂环烷基，其中所述基团任选地可以被取代；和，
R2选自由以下组成的组：
a)(6-10C)芳基，和
b)(1-5C)杂芳基，
其中两种基团任选地可以被取代。
然而，其它已知的TTK抑制剂是属于根据式V的咪唑并哒嗪类的化合物或其药学上可接受的盐，如在WO2011/013729 A1,WO2012/032031 A1,WO2013/135612 A1和WO2014/131739 A1中所述。
Figure BDA0001454666190000142
其中，
R1选自由以下组成的组：氢，(1-6C)烷基，卤代(1-6C)烷基，HO(1-6C)烷基，(3-6C)环烷基，(3-7C)杂环烷基和(1-5C)杂芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2是(6-10C)芳基或(1-9C)杂芳基，它们各自可以被任选地取代；
R3选自由以下组成的组：X-(6-10C)芳基或X-(1-9C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代，其中X表示S(＝O)p，O，NR4，CR4aR4b，C＝CR4aR4b，并且进一步地，其中p是0、1、2的整数；
R4，R4a，R4b彼此独立地表示氢原子或(1-6C)烷基。
其他已知的TTK抑制剂是属于根据式VI的三唑并吡啶类的化合物或其药学上可接受的盐，如在WO2011/063907 A1,WO2011/063908 A1,WO2011/064328 A1,WO2011/157688A1,WO2012/143329 A1,WO2014/009219 A1,WO2014/195274 A1,WO2014/195276和WO2014/198647 A1中所述。
Figure BDA0001454666190000151
其中，
R1表示苯基，吡啶基或吲哚基，其中所述基团可任选被取代；
R2表示苯基，吡啶基或嘧啶基，其中所述基团可任选被取代；
R3表示选自以下的基团：氢或-C(＝O)-O-(CR7R8)-O-C(＝O)-R4，其中R4表示选自以下的基团：(1-6C)烷基，其一次或多次被相同或不同的选自以下的基团取代：-NH2，-N(H)R5，-N(R5)R6，(4-7C)杂环烷基，其任选地一次或多次被相同或不同的选自以下的基团取代：-NH2，-N(H)R5，-N(R5)R6。
R5和R6彼此独立地表示选自氢原子和(1-3C)烷基的基团。
R7表示选自氢原子和(1-3C)烷基的基团。
R8表示氢原子。
已知的TTK抑制剂的另一个实例是属于根据式VII的吡咯并吡啶类的化合物或其药学上可接受的盐，如在WO2009/032694 A1,WO2009/032703 A1和Nature ChemicalBiology 6(2010),359中所述。
Figure BDA0001454666190000161
其中，
R1选自(6-10C)芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2选自(6-10C)芳基，其中所述基团任选地可以被取代。
然而，已知的TTK抑制剂的另一个实例是属于根据式VIII的氨基吡啶类和氨基嘧啶类的化合物或其药学上可接受的盐，如在WO2011/016472 A1,ACS Med.Chem.Letters 3(2012),560和Bioorg.Med.Chem.Letters 23(2015),2247中所述。
Figure BDA0001454666190000162
其中，
R1选自氢原子或氨基；
R2选自由以下组成的组：(6-10C)芳基，(1-5C)杂芳基，(1-6C)烷基，(3-6C)环烷基和(3-7C)杂环烷基，其中所述基团任选地可以被取代；
R3选自(6-10C)芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
X是C或N。
本文所用的术语是指以下内容：
卤素是指氟，氯，溴或碘。
(1-2C)烷基是指具有1至2个碳原子的烷基，是甲基或乙基。甲基可以表示为Me或CH3。
(1-3C)烷基是指具有1-3个碳原子的支链或非支链烷基，是甲基、乙基、丙基或异丙基。
(1-4C)烷基是指具有1-4个碳原子的支链或非支链烷基，是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，(1-3C)烷基是优选的。
(1-5C)烷基是指具有1-5个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和异戊基，(1-4C)烷基是优选的。
(1-6C)烷基是指具有1-6个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，正戊基和正己基。(1-5C)烷基是优选的，(1-4C)烷基是更优选的。
(1-2C)烷氧基是指具有1-2个碳原子的烷氧基，该烷基部分具有与上述定义相同的含义。
(2-4C)烷氧基是指具有2-4个碳原子的烷氧基，例如乙氧基，丙氧基，丁氧基，异丙氧基，异丁氧基和叔丁氧基。乙氧基和丙氧基是优选的。更优选乙氧基。
(1-3C)烷氧基是指具有1-3个碳原子的烷氧基，该烷基部分具有与前述定义相同的含义。优选(1-2C)烷氧基。
(1-4C)烷氧基是指具有1-4个碳原子的烷氧基，该烷基部分具有与前述定义相同的含义。(1-3C)烷氧基是优选的，(1-2C)烷氧基是最优选的。
(1-5C)烷氧基是指具有1-5个碳原子的烷氧基，该烷基部分具有与上述定义相同的含义。优选(1-4C)烷氧基，更优选(1-3C)烷氧基。
(2-3C)烯基是指具有2-3个碳原子的支链或非支链烯基，如乙烯基或2-丙烯基。
(2-3C)炔基是指乙炔基或2-丙炔基。
(3-4C)环烷基是指具有3-4个碳原子的环烷基，为环丙基或环丁基。
(3-6C)环烷基是指具有3-6个原子的环烷基。“环烷基”的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基或环己基。
(2-5C)杂环烷基是指具有2-5个碳原子，优选3-5个碳原子；和一个或两个选自N，O和/或S的杂原子的杂环烷基，其可以通过杂原子(如果可行)，或者碳原子连接。优选的杂原子是N或O。优选的是氧杂环丁烷基，氮杂环丁烷基，哌啶基，吗啉基，吡咯烷基和哌嗪基。最优选的(2-5C)杂环烷基是氧杂环丁烷基和氮杂环丁烷基。
(2-7C)杂环烷基是指具有2-7个碳原子，优选2-5个碳原子和一个或两个选自N，O和/或S的杂原子的杂环烷基。优选的杂原子是N或O。优选的(2-7C)杂环烷基是氮杂环丁烷基，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，高哌啶基，吗啉基或硫代吗啉基。如果可行，杂环烷基可以通过杂原子连接。
(6-10C)芳基是指具有6-10个碳原子的芳族烃基。“(6-10C)芳基”的实例包括但不限于苯基，萘基，四氢萘基或茚基。
(1-5C)杂芳基是指具有1-5个碳原子和1-4个选自N，O和/或S的杂原子的取代或未取代的芳族基团。(1-5C)杂芳基可任选被取代。“(1-5C)杂芳基”的实例包括但不限于四唑基，咪唑基，吡啶基，嘧啶基，三嗪基，噻吩基呋喃基，吡咯基(pyrolyl)或吡唑基。
(3-6C)环烷基氨基是指被含有3-6个碳原子的环烷基单取代的氨基，所述环烷基具有与上述定义相同的含义。
(1-6C)烷基氨基是指被含有1-6个碳原子的烷基单取代的氨基，所述烷基具有与上述定义相同的含义。优选的(1-6C)烷基氨基是甲基氨基。
二[(1-2C)烷基]氨基是指被烷基二取代的氨基，所述烷基各自独立地含有1-2个碳原子并具有与前述定义相同的含义。优选的二[(1-2C)烷基]氨基是二甲基氨基。
二[(1-6C)烷基]氨基是指被烷基二取代的氨基，所述烷基各自独立地含有1-6个碳原子并具有与上述定义相同的含义。优选的二[(1-6C)烷基]氨基是N-甲基丙-1-氨基。
(2-7C)杂环烷基氨基是指被含有2-7个碳原子的(2-7)杂环烷基单取代的氨基，所述杂环烷基具有与前述定义相同的含义。
(1-6C)烷基氨基羰基是指被氨基取代的羰基。所述氨基被具有1-6个碳原子的烷基单取代，所述烷基具有与前述定义相同的含义。
(2-7C)杂环烷基羰基是指被具有2-7个碳原子的(2-7C)杂环烷基取代的羰基，所述杂环烷基具有与前述相同含义。
(1-5C)烷氧基羰基是指被烷氧基取代的羰基，其烷基部分具有1-6个碳原子，如前所定义。
(1-6C)烷基磺酰基是指被具有1-6个碳原子的(1-6C)烷基取代的磺酰基，所述烷基具有与上述相同含义。
(1-6C)烷基羰基是指被具有1-6个碳原子的(1-6C)烷基取代的羰基，所述烷基具有与前述相同含义。
(3-6C)环烷基羰基是指被具有3-6个碳原子的(3-6C)环烷基取代的羰基，所述环烷基具有与前述相同含义。
(1-6C)烷基氨基羰基是指被氨基取代的羰基。所述氨基被具有1-6个碳原子的烷基单取代，所述烷基具有与前述定义相同的含义。
(1-6C)烷基羰基氨基是指被羰基取代的氨基。所述羰基被具有1-6个碳原子的烷基单取代，所述烷基具有与前述定义相同的含义。
(3-6C)环烷基羰基氨基是指被羰基取代的氨基。所述羰基被具有3-6个碳原子的环烷基单取代，所述环烷基具有与前述定义相同的含义。
(2-7C)杂环烷基羰基氨基是指被羰基取代的氨基。所述羰基被具有2-7个碳原子的(2-7C)杂环烷基单取代，所述杂环烷基具有与前述定义相同的含义。
羟基(1-2C)烷基是指具有1-2个碳原子、具有与上述定义相同的含义的(1-2C)烷基，其被羟基取代。
(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基是指具有1-6个碳原子、具有与上述定义相同的含义的(1-6C)烷基，其被一个或多个(2-4C)烷氧基取代，其中n表示1、2、3或4的整数，烷氧基彼此线性地相连。最后的(2-4C)烷氧基被(1-2C)烷氧基取代。在(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基中，优选的(1-2C)烷氧基是甲氧基，优选的(2-4C)烷氧基是乙氧基，优选的(1-6C)烷基是乙基，优选n是1、2、3、4，n是1或2是最优选的。
(1-9C)杂芳基是指取代或未取代的具有1-9个碳原子和1-4个选自N，O和/或S的杂原子的芳族基团。(1-9C)杂芳基可任选被取代。“(1-9C)杂芳基”的实例包括但不限于喹诺酮，异喹啉，吲唑苯并异噁唑和吲哚。
(2-6C)烯基是指具有2-6个碳原子的支链或非支链烯基。“(2-6C)烯基”的实例包括但不限于乙烯基，2-丁烯基和正戊烯基。
(2-6C)炔基是指具有2-6个碳原子的支链或非支链炔基，“(2-6C)炔基”的实例包括但不限于乙炔基，丙炔基，正丁炔基，正戊炔基，异戊炔基，异己炔基或正己炔基。
(3-7C)杂环烷基是指具有3-7个碳原子，优选3-5个碳原子的杂环烷基和一个或两个选自N，O和/或S的杂原子。“杂环烷基”的实例包括但不限于氮杂环丁烷基，吡咯烷基，哌啶基，高哌啶基或吗啉基。
(4-8C)杂环烯基)是指具有4-8个碳原子，优选3-5个碳原子的，其中具有双键；和1个选自N，O和/或S的杂原子的杂环烯基。“杂烯基”的实例包括但不限于氧基环己烯基和氮杂环己烯基。
卤代(1-6C)烷基是指具有1-6个碳原子的支链或非支链烷基，其中一个至所有氢原子被如本文所定义的卤素代替。用于本发明的这种支链或直链卤代烷基的实例包括但不限于被一个或多个卤素原子独立地取代的甲基，乙基，丙基，异丙基，异丁基和正丁基，所述卤素例如氟，氯，溴和碘。“卤代烷基的具体实例包括但不限于氟甲基，二氟甲基，三氟甲基，1-氟乙基，2-氟乙基，2,2-二氟乙基，2,2,2-三氟乙基和全氟正丙基。
HO(1-6C)烷基是指具有1-6个碳原子的支链或非支链烷基，其中一个，两个或三个氢原子被羟基代替。“HO(1-6C)烷基”的实例包括但不限于羟甲基，1-羟乙基，2-羟乙基和1,2-二羟乙基。
H2N(1-6C)烷基是指具有1-6个碳原子的支链或非支链烷基，其中一个，两个或三个氢原子被氨基代替。“H2N(1-6C)烷基”的实例包括但不限于氨基甲基，1-氨基乙基，2-氨基乙基和1,2-二氨基乙基。
氰基(1-6C)烷基是指具有1-6个碳原子的支链或非支链烷基，其中一个，两个或三个氢原子被氰基代替。“氰基(1-6C)烷基”的实例包括但不限于氰甲基，1-氰基乙基，2-氰基乙基和1,2-二氰基乙基。
在具有多功能基团的上述定义中，连接点在最后的基团。
当在取代基的定义中，表示所述取代基的“全部烷基”任选被取代时，这也包括烷氧基的烷基部分。
术语“取代的”是指指定的一个原子/多个原子上的一个或多个氢被选自所指定的基团的基团所代替，条件是指定的原子在现有情况下的正常化合价未被超过，并且代替导致稳定化合物。取代基和/或变量的组合只有在这种组合导致稳定的化合物时才被允许。
“稳定化合物”或“稳定结构”被定义为足够稳定从而能经历从反应混合物中分离至有用的纯度的分离和成为有效的治疗剂的制剂的化合物或结构。
术语“任选取代的(任选地取代的)”是指用特定基团、残基或部分的任选的取代。
现在将在以下实施例中描述本发明。这些实施例旨在说明本发明，并不旨在限制本发明。
实施例
方法
癌细胞系
为了确定癌症衍生的细胞对TTK抑制剂的敏感性是否与特定基因组标志物的存在相关，各种TTK抑制剂平行分布在衍生自不同肿瘤起源的六十六种癌细胞系的一组，并已针对各种癌基因和肿瘤抑制基因的表达和突变体状态被表征(Uitdehaag，J.C.M.等，PLoSONE 9(3)，e92146；2014)。使用的癌细胞系列于表1中。所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(Manassas，VA，U.S.A.)。
表1.药物敏感性分析中使用的癌细胞系。
Figure BDA0001454666190000221
细胞系组中三十一种最频繁改变的癌症基因的遗传状况已被确定为公开测序数据中的“突变体”或“野生型”(Garnett，M.J.等，Nature 483：570；2012)。在表2中列出了具有CTNNB1基因突变的细胞系。A427，LS 174T，HCT116和SW48在丝氨酸或苏氨酸残基中具有突变，其通过在特定丝氨酸和苏氨酸残基处磷酸化来调节β-连环蛋白的稳定性(Polakis，P.，Curr.Opin.Gen.Dev.9：15；1999年)。表中列出的其他细胞系和来自未提及的六十六种癌细胞系组的细胞系都具有不涉及蛋白质稳定性调节的CTNNB1突变或不具有任何CTNNB1基因突变。
表2.包含在药物敏感性分析中的癌细胞系中的CTNNB1基因突变。
Figure BDA0001454666190000231
参考文献
1.Cosmic Cell Lines project,status February,2nd,2015
2.Garnett,M.J.,等人
3.Wang,Z.,等人,Cancer Res.63:5234；2003
4.Cancer Cell Line Encyclopedia,status February,2nd,2015
5.Morin,等人,1997；Ilyas,M.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10330；1997
细胞增殖测定
将所有细胞系按照ATCC的推荐在培养基中培养。培养培养基购自LifeTechnologies(荷兰Bleiswijk)。如(Uitdehaag J.C.M.，等人)所述，在384孔板中进行增殖测定，与化合物孵育120小时。TTK抑制剂的作用以9点稀释倍数、一式两份地测量。孵育期间的最终DMSO浓度在所有孔中为0.4％(v/v)。作为读数，将细胞内ATP含量用作细胞数量的间接测量，其使用ATPliteTM 1步骤溶液(ATPliteTM 1Step solution)(Perkin Elmer，Groningen，荷兰)。相对于仅含有0.4％(v/v)DMSO的对照孔，计算化合物对细胞生长的影响。使用XLfitTM5(ID Business Solutions，Ltd.，Surrey，U.K.)通过非线性回归拟合半最大抑制能力(IC50)。
细胞组响应数据分析
方差分析(Anova)用于确定细胞系组中特定遗传变化与药物敏感性之间是否存在统计学相关性。来自细胞增殖测定的突变和10logIC50被通过使用统计程序R的II型Anova分析(R Foundation for statistical computing，Vienna，Austria)进行分析，并被显示在如图2所示的火山图中。p值(火山图中的y轴)表示特定基因中的突变与IC50偏移的遗传关联的置信水平。在x轴上表示IC50偏移的平均因子(average factor)。圆的面积与细胞组中突变体的数目成比例(每个突变存在至少两次)。为了计算显著性，对p-值进行本杰明-霍赫伯格多重检验校正(Benjamini-Hochberg multiple testing correction)(Benjamini，Y.，和Hochberg，Y.，J.Royal.Statistic.Soc.B 57：289；1995)。具有<20％假发现率的遗传关联被认为是显著的。
敏感性差异的统计分析
为了量化CTNNB1突变体和CTNNB1精通细胞(proficient)之间的敏感性差异，TTK抑制剂的抑制效力表示为pIC50(-10logIC50)。进行双尾学生t检验以确定CTNNB1突变体和CTNNB1精通细胞(proficient)之间的敏感性差异(ΔpIC50)是否具有统计学意义(即，p<0.05)。
等基因细胞系的敏感性的比较
为了确定突变的CTNNB1是否足以赋予对TTK抑制剂增加的敏感性，用一对等基因细胞系进行增殖测定。亲本HCT116细胞在CTNNB1基因的一个拷贝中具有三个碱基对的缺失，导致β-连环蛋白的第45位(S45del)的调节丝氨酸残基的缺失(表2)。此外亲本HCT116细胞对于CTNNB1基因突变而言是杂合的，即关于CTNNB1的亲本HCT116的基因型为S45del/+。衍生自缺乏突变CTNNB1基因拷贝(+/-)的HCT116的等基因细胞系购自Horizon Discovery(Cambridge，UK)(Chan，T.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：8265；2002)。根据供应商的推荐，将HCT116亲本和等基因衍生物在相同的培养基中培养。如对癌细胞系所述进行增殖测定(Uitdehaag J.C.M.，等人)。绘制剂量响应曲线，使用XLfit TM 5计算IC50，pIC50和最大百分比效应(功效)。亲本和等基因衍生物的敏感性差异表示为pIC50中的差异(ΔpIC50)和功效中的差异(Δ效力)。
TTK抑制剂(实施例
Figure BDA0001454666190000252
)
以下实施例是本发明的说明性实施方案，而不是以任何方式限制本发明的范围。试剂可以是市售的或根据文献中的程序制备。
方法LCMS(A)
Figure BDA0001454666190000251
Figure BDA0001454666190000261
方法LCMS(B)
Figure BDA0001454666190000262
Figure BDA0001454666190000271
方法LCMS(C)
Figure BDA0001454666190000272
Figure BDA0001454666190000273
方法制备型HPLC
Figure BDA0001454666190000274
Figure BDA0001454666190000281
关于化学术语，在整个申请文件中使用以下缩写：
TFA 三氟乙酸
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
DMF N,N-二甲基甲酰胺
THF 四氢呋喃
MeOH 甲醇
EtOAc 乙酸乙酯
DCM 二氯甲烷
Na2SO4 硫酸钠
TMS-Cl 三甲基氯硅烷
DiPEA N,N-二异丙基乙胺
EtOH 乙醇
10％Pd/C 10％钯炭
HPLC 高效液相色谱
LCMS 液相色谱，其具有质谱检测
NaOH 氢氧化钠
KOH 氢氧化钾
HCl 氯化氢
NaHCO3 碳酸氢钠
4-DMAP 4-二甲基氨基吡啶
Boc 叔丁氧基羰基
Cbz 苄氧基羰基
HNO3 硝酸
LiHMDS 双(三甲基甲硅烷基)氨基锂
DDQ 2,3-二氯-5,6-二氰基-对苯醌
DEAD 偶氮二羧酸二乙酯
o/n 过夜
实施例中最终产品的名称使用Accelrys Draw(4.1版)生成。
实施例1(WITJ0018D)
Figure BDA0001454666190000291
N6-环己基-N2-(2-甲基-4-吗啉代-苯基)-9H-嘌呤-2,6-二胺
该化合物如WO2010/111406A2和Bioorg.Med.Chem.Letters 22(2012)4377所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(338mg)。数据：LCMS(C)Rt:10.995min；m/z408.3(M+H)+。
实施例2(JGS0282C)
Figure BDA0001454666190000301
N-环丙基-4-[8-(异丁基氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基]苯甲酰胺
如WO2012/080229A1和Cell Death and Differentiation 20(2013)，1532中所述制备该化合物。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(47mg)。数据：LCMS(B)Rt:8.088min；m/z 350.2(M+H)+。
实施例3(BTHO238B)
Figure BDA0001454666190000302
N-(2,6-二乙基苯基)-1-甲基-8-[4-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基甲酰基]-2-(三氟甲氧基)苯胺基]-4,5-二氢吡唑并[4,3-h]喹唑啉-3-甲酰胺
该化合物如WO2009/156315A1和Cancer Res.70(2010)，10255所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(191mg)。数据：LCMS(A)Rt:5.810min；m/z 677.6(M+H)+。
实施例4(WITJ113B)
Figure BDA0001454666190000303
N-(2,6-二乙基苯基)-8-(2-甲氧基-4-哌嗪-1-基-苯胺基)-1-甲基-4,5-二氢吡唑并[4,3-h]喹唑啉-3-甲酰胺
该化合物如WO2009/156315A1中所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(7.3mg)。数据：LCMS(C)Rt:12.954min；m/z 567.3(M+H)+。
实施例5(JGS0716D)
Figure BDA0001454666190000311
N-环丙基-4-[6-(2,3-二氟-4-甲氧基-苯氧基)-8-(四氢吡喃-4-基甲基氨基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基]-2-甲基-苯甲酰胺
该化合物如WO 2014/131739A1中所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(90mg)。数据：LCMS(B)Rt:13.496min；m/z 564.5(M+H)+。
实施例6(JGS0728A)
Figure BDA0001454666190000312
N-环丙基-4-[6-(3-氟-4-甲氧基-苯氧基)-8-(氧杂环丁烷-3-基甲基氨基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基]-2-甲基-苯甲酰胺
该化合物如WO 2014/131739A1中所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(45mg)。数据：LCMS(B)Rt:11.640min；m/z 518.4(M+H)+。
中间体1
Figure BDA0001454666190000321
2-氯-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯
(a)5-溴-2-氯-嘧啶-4-胺(WITJ0221)
向5-溴-2,4-二氯-嘧啶(150g；658mmol)在THF(445mL)中的溶液中加入氢氧化铵(25％，在水中，250mL)，并将所得反应混合物在室温搅拌90分钟。随后将混合物真空浓缩至小体积，并在乙酸乙酯和水之间分配。分离有机相，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到137.3g(定量产率)5-溴-2-氯-嘧啶-4-胺。
(b)5-溴-2-甲氧基-嘧啶-4-胺(WITJ0223)
向5-溴-2-氯-嘧啶-4-胺(137.3g，658mmol)在甲醇(1L)中的悬浮液中分批加入甲醇钠(83.5g；1.54mol)。将反应混合物在回流情况下搅拌2小时。将反应混合物浓缩至小体积
Figure BDA0001454666190000322
并倒入饱和氯化铵水溶液(1.2L)中。将该混合物搅拌15分钟，然后用乙酸乙酯萃取水层。合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到5-溴-2-甲氧基嘧啶-4-胺(133.7g，99.4％)。
(c)(E)-3-(4-氨基-2-甲氧基-嘧啶-5-基)丙-2-烯酸乙酯(WITJ0256)
将乙酸钯(II)(1.21g，5.5mmol)和三苯基膦(3.40g，13.0mmol)溶于无水和无氧DMF(53mL)中，并在30℃下搅拌5分钟，得到橙色悬浮液。向该悬浮液中加入5-溴-2-甲氧基嘧啶-4-胺(44.1g，216mmol)在DMF(270mL)中的溶液，三乙胺(60.2mL，432mmol)和丙烯酸乙酯(23.5mL，216mmol)的DMF(50mL)溶液。将反应混合物在氮气氛下在100℃下搅拌过夜。将反应混合物蒸发至小体积。将水(300mL)和盐水(300mL)加入到混合物中，然后用乙酸乙酯(300mL，两次)萃取。将合并的有机层用水，盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空浓缩。粗产物通过二氧化硅的柱色谱法(乙酸乙酯：庚烷＝2:1v/v％)纯化，得到标题化合物(38.2g，77％)。
(d)2-甲氧基-6,8-二氢-5H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(WITJ0262)
向搅拌的(E)-3-(4-氨基-2-甲氧基-嘧啶-5-基)丙-2-烯酸乙酯(12.52g，56.1mmol)的甲醇(250mL)溶液中加入10％Pd/炭(钯碳)(1.19g)的甲醇/乙醇＝3/1v/v％(30mL)悬浮液。将反应混合物在氮气氛下在室温下搅拌15分钟。然后，加入甲酸铵(35.3g，561mmol)，所得反应混合物回流过夜。冷却反应混合物后，加入新鲜部分的甲酸铵(20g，317mmol)，并在回流下再搅拌一夜。将反应混合物经
Figure BDA0001454666190000331
和Pd-C/
Figure BDA0001454666190000332
过滤，残余物用二氯甲烷/甲醇＝8/2v/v％洗涤，真空浓缩滤液。将残余物溶解在二氯甲烷中，用水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到9.4g(94％)2-甲氧基-6,8-二氢-5H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。
(e)2-甲氧基-5,6,8,9-四氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(JGS0241)
将2-甲氧基-6,8-二氢-5H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(4.79g，26.8mmol)悬浮在三颈烧瓶(500mL)中的THF(200mL)中，所述三颈烧瓶配有机械搅拌器，温度计和回流冷凝器。将混合物冷却至0℃，分两批加入氢化钠(60％在油中的分散液，1.18g，29.4mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。(1-乙氧基羰基环丙基)三苯基鏻四氟硼酸盐(13.6g，29.4mmol)，将所得悬浮液加热至回流并保持回流温度3天。将反应混合物冷却至室温，倒入盐水/水/EtOAc(450mL)的1/1/1混合物中。水层用乙酸乙酯(2x)萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到18.05g橙色油状物。粗产物直接用于下一步骤而不进行纯化。
(f)2-甲氧基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(JGS244)
向搅拌的2-甲氧基-5,6,8,9-四氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(18.05g，26.2mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入乙酸(3.15g，3mL)和乙酸铅(IV)(13.9g，31.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后通过PE过滤器过滤以除去Pb盐，并将Pb残留物用2×30mL DCM洗涤。将滤液真空浓缩，将所得残余物溶于乙酸乙酯(300mL)中。加入碳酸氢钠溶液(5％)至
Figure BDA0001454666190000341
通过
Figure BDA0001454666190000342
过滤有机层和水层以除去任何剩余的盐。随后用EtOAc(2×50mL)萃取水层。合并的有机层用5％碳酸氢钠溶液(100mL)，水(100mL)，盐水(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化(庚烷：乙酸乙酯＝1/0至1/1v/v％)，得到标题化合物(4.74g，两步为66％)。
(g)2-羟基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(JGS0245)
将碘化钠(7.83g，52.2mmol)加入到搅拌的2-甲氧基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(4.74g，17.3mmol)的乙腈(150mL)溶液。溶解在乙腈(30mL)中的三甲基氯硅烷(5.64g，6.59mL)逐滴加到反应混合物中，混合物在室温下搅拌过夜。加入NaI(1当量)，滴加另外的TMS-Cl(0.94g，1.1mmol)在乙腈(6mL)中的溶液，将反应物在室温下搅拌3天。将混合物浓缩，将残余物悬浮于200mL DCM/MeOH(4/1)中，并用硫代硫酸钠(200mL)和水(200mL)的饱和溶液的混合物萃取。水层用3×150mL DCM/MeOH(4/1)萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并在减压下除去溶剂，得到黄色固体。残余物在40℃下真空干燥18小时，得到3.89g 2-羟基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(86％)。
(h)2-氯-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(中间体1)(JGS0248)
将N,N-二甲基苯胺(182mg，191uL，1.50mmol)加入到2-羟基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(3.89g，15.0mmol)在乙腈(100mL)中的溶液中。向反应混合物中逐滴加入磷酰氯(phosphorus(V)oxychloride)(11.5g，7.00mL，75.0mmol)在乙腈(15mL)中的溶液。将黄色悬浮液加热4小时至65℃，在此期间悬浮液变成澄清溶液。冷却后，将混合物缓慢倒入搅拌的25％氨水(200mL，86.7当量)和冰水(250mL)中，在15-20分钟内保持温度低于10℃。再搅拌15分钟后，过滤固体。将固体溶于200mL EtOAc中，并用盐水(20mL)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，真空浓缩，得到灰白色固体。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化(庚烷/乙酸乙酯＝1/0至1/1v/v％)，得到标题化合物(3.05g，73％)。
中间体A
Figure BDA0001454666190000351
4-(4-氨基-3-甲基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯
(a)4-(3-甲基-4-硝基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯(WITJ404)
将哌嗪-1-羧酸苄酯(1.05mL，5.25mmol)和碳酸钾(1.38g，10mmol)加入至4-氟-2-甲基-1-硝基-苯(776mg，5mmol)的DMF(10mL)溶液，所得混合物在100℃下搅拌18小时。向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空浓缩。粗产物通过二氧化硅的柱色谱法
Figure BDA0001454666190000362
纯化，得到标题化合物(1.75g，98％)。
(b)4-(4-氨基-3-甲基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯(中间体A)(WITJ406)
将4-(3-甲基-4-硝基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯(355mg，1mmol)溶于THF(5mL)中，加入乙酸(1.1mL)。将混合物冷却至0℃，分几个小部分加入锌(1.31g，20mmol)以保持温度低于20℃。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC分析表明完全转化起始原料后，将混合物通过
Figure BDA0001454666190000363
和Zn-
Figure BDA0001454666190000364
过滤，并将残余物用EtOAc(20mL)洗涤。合并的滤液用1NNaOH-溶液(25mL)，然后用水(25mL)和盐水(25mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩，得到4-(4-氨基-3-甲基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯(327mg，定量)。
中间体2
Figure BDA0001454666190000361
4-[4-[(7-氯羰基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-2-基)氨基]-3-甲基-苯基]哌嗪-1-羧酸苄酯
(a)2-[4-(4-苄氧基羰基哌嗪-1-基)-2-甲基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(WITJ407)
向2-氯-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(中间体1,292mg，1.05mmol)在正丁醇(8mL)中的悬浮液中加入4-(4-氨基-3-甲基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄基酯(中间体A，327mg，1.0mmol)和三氟乙酸(153μL，2.0mmol)。将反应混合物在120℃，微波辐射下加热12小时。将反应混合物真空浓缩，将残余物溶于乙酸乙酯。有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。粗产物通过二氧化硅的柱色谱法
Figure BDA0001454666190000371
纯化。收集含有产物的级分并蒸发，得到2-[4-(4-苄氧基羰基哌嗪-1-基)-2-甲基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(423mg，75％产率)。
(b)4-[4-[(7-氯羰基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-2-基)氨基]-3-甲基-苯基]哌嗪-1-羧酸苄酯(中间体2)(WITJ408/WITJ414)
向2-[4-(4-苄氧基羰基哌嗪-1-基)-2-甲基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(423mg，0.75mmol)在15mL无水乙醇中的溶液中加入2M NaOH溶液(935μL(2.5当量)，1.87mmol)。将反应混合物在65℃加热过夜。将反应混合物蒸发至干，并在高真空下干燥。将所得残余物溶于水中，室温搅拌过夜，并冷冻干燥，得到粗制的2-[4-(4-苄氧基羰基哌嗪-1-基)-2-甲基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸钠。
将亚硫酰氯(561μL，7.mmol)加入到冷的(0℃)粗制的2-[4-(4-苄氧羰基哌嗪-1-基)-2-甲基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸钠(217mg，0.39mmol理论剂(theor.))在二氯甲烷(8mL)中的悬浮液。将所得浆液在室温下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，残余物与甲苯(2×10mL)共蒸发，得到4-[4-[(7-氯羰基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-2-基)氨基]-3-甲基-苯基]哌嗪-1-羧酸苄基酯，为黄色/棕色粉末(261mg，定量粗产率)。
实施例7(WITJ0416/WITJ429A)
Figure BDA0001454666190000381
N-(2,6-二甲基苯基)-2-(2-甲基-4-哌嗪-1-基-苯胺基)-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
向4-[4-[(7-氯羰基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-2-基)氨基]-3-甲基-苯基]哌嗪-1-羧酸苄酯(中间体2,45mg，0.081mmol，理论剂(theor.))在乙腈(3mL)中的悬浮液中加入2,6-二甲基苯胺(15μL，0.12mmol)和催化量的4-DMAP。将反应混合物在50℃下搅拌1小时。蒸发溶剂后，使用TFA/硫代苯甲醚将Cbz基团脱保护，粗产物通过制备型HPLC纯化。收集含有产物的级分并真空浓缩。将残余物在二氯甲烷和5％NaHCO3溶液之间分配。有机相通过PE-过滤器分离并蒸发，得到标题化合物(20mg，64％)。数据：LCMS(B)Rt:9.706min；m/z508.3(M+H)+。
实施例8(JGS439C)
Figure BDA0001454666190000382
N-(2,6-二甲基苯基)-2-[2-甲氧基-4-(四氢吡喃-4-基氨基甲酰基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
(a)2-(4-溴-2-甲氧基-苯胺基)-N-(2,6-二甲基苯基)-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺(JGS453)
使用市售的4-溴-2-甲氧基苯胺作为原料，使用与针对中间体2所述相同的反应顺序由其相应的酰氯制备该化合物。随后根据实施例7中所述的方法使酰氯与2,6-二甲基苯胺反应，得到标题化合物(1.35g，84％)。
(b)2-(4-氰基-2-甲氧基-苯胺基)-N-(2,6-二甲基苯基)-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺(JGS455)
向2-(4-溴-2-甲氧基-苯胺基)-N-(2,6-二甲基苯基)-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺(1.35g，2.6mmol)和氰化锌(321mg，2.73mmol)的DMF(4mL)溶液中加入四(三苯基膦)钯(0)(300mg，0.26mmol)。将反应混合物在微波辐射下在170℃下加热30分钟。冷却至环境温度后，浓缩混合物，残余物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到粗标题化合物(1.05g，87％)。
(c)4-[[7-[(2,6-二甲基苯基)氨基甲酰基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-2-基]氨基]-3-甲氧基-苯甲酸(JGS0457)
向2-(4-氰基-2-甲氧基-苯胺基)-N-(2,6-二甲基苯基)-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺(750mg，1.61mmol)在MeOH(25mL)中的溶液中加入氢氧化钾(453mg，8.07mmol)在水(12.5mL)中的溶液。将反应混合物在120℃，微波辐射下加热2小时。在蒸发甲醇级份后，通过加入2N HCl溶液将得到的水层酸化至
Figure BDA0001454666190000391
用二氯甲烷萃取后，将合并的有机层通过PE-过滤器过滤，得到330mg标题化合物(产率：42％)。
(d)N-(2,6-二甲基苯基)-2-[2-甲氧基-4-(四氢吡喃-4-基氨基甲酰基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺(JGS439C)
4-[[7-[(2,6-二甲基苯基)氨基甲酰基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-2-基]氨基]-3-甲氧基-苯甲酸(30mg，0.062mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3ml)中。随后加入HATU(25.9mg，0.068mmol)和N,N-二异丙基乙胺(43.1μL，0.25mmol)，将混合物在室温下搅拌10分钟。加入4-氨基四氢吡喃盐酸盐(12.8mg，0.093mmol)，混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入乙酸乙酯/水/盐水(1/1/1)的混合物中并搅拌15分钟。分离有机层，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(5mg，18％)。数据：LCMS(B)Rt:14.407min；m/z 567.3(M+H)+。
中间体B(NV0068/NV0076)
Figure BDA0001454666190000401
2-甲氧基-4-(1,3,5-三甲基吡唑-4-基)苯胺
(a)N-[2-甲氧基-4-(1,3,5-三甲基吡唑-4-基)苯基]氨基甲酸叔丁酯(NV0068)
将N-(4-溴-2-甲氧基-苯基)氨基甲酸叔丁酯(150mg，0.5mmol)，1,3,5-三甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)吡唑(118毫克，0.5毫摩尔)，四(三苯基膦)钯(0)(58毫克，0.05毫摩尔)和碳酸钾(207毫克，1.5毫摩尔)在二氧六环(4mL)中的混合物在密封管中在微波照射下在100℃加热20分钟。冷却至环境温度后，将混合物浓缩，残余物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝100/0至25/75v/v％)纯化，得到N-[2-甲氧基-4-(1,3,5-三甲基吡唑-4-基)苯基]氨基甲酸叔丁酯(126.8mg，77％)。
(b)2-甲氧基-4-(1,3,5-三甲基吡唑-4-基)苯胺(中间体B)(NV0076)
将N-[2-甲氧基-4-(1,3,5-三甲基吡唑-4-基)苯基]氨基甲酸叔丁酯(127mg，0.38mmol)溶于DCM(2mL)中。加入TFA(3mL)，将反应混合物在室温下搅拌1小时。将混合物真空浓缩，得到棕色油状物(313mg)，其不经进一步纯化即使用。
中间体C(JDM0438/JDM0435)
Figure BDA0001454666190000411
1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-胺
(a)1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑
向3,5-二甲基-4-硝基-1H-吡唑(250mg，1.77mmol)，三乙二醇单甲醚(482μL，3.01mmol)和三苯基膦(789mg，3.01mmol)在THF(10mL)中的冷(0℃)的溶液中滴加40％DEAD在甲苯(1.31mL，3.01mmol)中的溶液。将反应混合物升温至室温并搅拌3小时。加入乙酸乙酯，用10％NaCl溶液洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。残余物通过柱色谱法
Figure BDA0001454666190000414
纯化，得到1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑(1.7g，粗品)，其不经纯化用于下一步骤。
(b)1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-胺(中间体C)
将1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑(1.5g，1.77mmol理论剂(theor.))溶于THF(15mL)和乙酸(1.6mL)。将混合物冷却至0℃，分多个小部分加入锌(2.3g，35.4mmol)，保持温度低于20℃。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC分析表明原料完全转化后，将混合物通过
Figure BDA0001454666190000412
和
Figure BDA0001454666190000413
过滤，并将残余物用乙酸乙酯洗涤。合并的滤液用1N NaOH溶液洗涤，然后用水和盐水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将残余物溶于甲醇中，然后通过SCX-2柱过滤。用甲醇冲洗柱后，用0.7N氨/甲醇溶液洗脱所需产物，得到标题化合物(340.1mg，74.7％)。
实施例9(JDM0641A)
Figure BDA0001454666190000421
N-[1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-(1,3,5-三甲基吡唑-4-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体B作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体C反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(19.5mg，42.6％)。数据：LCMS(B)Rt：10.946min；m/z684.7(M+H)+。
中间体D(JGS88/92)
Figure BDA0001454666190000422
2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺
以与针对中间体A所述类似的方式，由N-甲基哌嗪和2-甲氧基-4-氟硝基苯开始，制备该化合物，得到标题化合物(1.38g，94％)。
实施例10(JDM0443A)
Figure BDA0001454666190000431
N-[1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对间体2所述相同的反应顺序，使用中间体D作为起始原料，由其相应的酰氯制备该化合物。随后根据实施例8d中所述的程序将酰氯与中间体C反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(11.6mg，28.6％)。数据：LCMS(B)Rt:6.985min；m/z 674.3(M+H)+。
实施例11(JGS79C)
Figure BDA0001454666190000432
N-(2,6-二乙基苯基)-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对间体2a所述的相同的反应顺序，使用中间体D作为起始原料，由其相应的酯制备该化合物。
将LiHDMS(1M，在THF/乙苯中，412μL，0.412mmol)加入到冷却(0℃)的2,6-二乙基苯胺(50.8μL，0.31mmol)的THF(1mL)溶液中。在0℃下搅拌15分钟后，将2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(48mg，0.103mmol)在THF(2mL)中的溶液逐滴加入到反应混合物中，在0℃继续搅拌90分钟。在室温下滴加另外的LiHMDS(100μL)，在室温下继续搅拌2小时。将反应混合物用20mL饱和氯化铵溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水，盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(13.5mg，23.2％)。数据：LCMS(C)Rt:12.686min；m/z 566.4(M+H)+。
中间体E(/WITJ437WITJ438/WITJ440)
Figure BDA0001454666190000441
2-(二氟甲氧基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺
向5-氟-2-硝基-苯酚(500mg，3.18mmol)的DMF(6ml)溶液中加入2-氯-2,2-二氟乙酸钠(970mg，6.36mmol)和碳酸二钠(405mg，3.82mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌3.5小时，然后在室温下搅拌3天。加入4M HCl溶液直至得到澄清溶液，并将混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物用水稀释并用EtOAc萃取。合并的有机层用1M NaOH溶液，盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝10/0至8/2v/v％)纯化，得到2-(二氟甲氧基)-4-氟-1-硝基-苯(493mg，75％)。
以与针对中间体A所述类似的方式，由N-甲基哌嗪和2-(二氟甲氧基)-4-氟-1-硝基-苯开始，制备标题化合物，得到180mg(80％)。
中间体F(JDM300/WITJ410/WITJ411/WITJ413)
Figure BDA0001454666190000442
3,5-二乙基-1H-吡唑-4-胺
(a)3,5-二乙基-1H-吡唑
向3,5-庚二酮(2g，15.6mmol)和水合肼(0.77g，15.8mmol)在水(10mL)中的溶液中加入乙酸(1滴)，将反应混合物加热回流1h。然后将反应混合物冷却，减压浓缩，得到1.8g标题化合物。该化合物不经纯化直接用于下一步骤。
(b)3,5-二乙基-4-硝基-1H-吡唑
向3,5-二乙基-1H-吡唑(1.8g，14.5mmol)和浓硫酸(1.5ml)的冷(0℃)混合物，在剧烈搅拌下，缓慢加入发烟的HNO3(4.35ml)。将反应混合物在60℃下搅拌过夜。随后将混合物冷却至室温，然后小心地加入到冰冷的饱和碳酸氢钠溶液中并搅拌15分钟。然后将混合物用EtOAc萃取三次，合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发，得到2.52g 3,5-二乙基-4-硝基-1H-吡唑。
(c)3,5-二乙基-1H-吡唑-4-胺(中间体F)
以与对于中间体C所述类似的方式，由3,5-二乙基-4-硝基-1H-吡唑开始，制备标题化合物，得到3,5-二乙基-1H-吡唑-4-胺(174mg，71％)。
实施例12(WITJ453B)
Figure BDA0001454666190000451
N-(3,5-二乙基-1H-吡唑-4-基)-2-[2-(二氟甲氧基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用中间体E作为起始原料，使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，由其相应的羧酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体F反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(9.6mg，23％)。数据：LCMS(B)Rt:8.864min；m/z592.3(M+H)+。
中间体G(JDM617/JDM622/JDM630)
Figure BDA0001454666190000461
3,5-二乙基-1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]吡唑-4-胺
以与针对中间体C所述相同的方式，由3,5-二乙基-4-硝基-1H-吡唑(中间体Fb)和三甘醇单甲醚开始，制备标题化合物，得到660mg 3,5-二乙基-1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]吡唑-4-胺(41.7％)。
中间体M(WITJ461/WITJ458)
Figure BDA0001454666190000462
4-(4-氨基-3-甲氧基-苯基)哌嗪-1-羧酸苄酯
以与针对中间体A所述类似的方式，由哌嗪-1-羧酸苄酯和2-甲氧基-4-氟硝基苯制备该化合物，得到标题化合物(1.2g，95％)。
实施例13(JDM0684A)
Figure BDA0001454666190000463
N-[3,5-二乙基-1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-[4-(2-甲氧基乙酰基)哌嗪-1-基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法，由其相应的胺(如针对实施例7所述从中间体1和中间体M开始，制备)和甲氧基乙酸制备该化合物。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(17.8mg，57.1％)。数据：LCMS(B)Rt:9.908min；m/z 760.8(M+H)+。
中间体H(JDM221/JDM0222/JDM393)
Figure BDA0001454666190000471
1-(2-甲氧基乙基)-3,5-二甲基吡唑-4-胺
(a)1-(2-甲氧基乙基)-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑
向3,5-二甲基-4-硝基-1H-吡唑(2.5g，17.7mmol)和碳酸铯(6.06g，18.6mmol)在DMF(50mL)中的溶液中加入2-溴乙基甲基醚(2.59g，1.75mL，18.6mmol)。将混合物在100℃加热3.5小时。冷却至室温后，将混合物倒入水中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过柱色谱法(EtOAc/庚烷＝1/4v/v％)纯化，得到1-(2-甲氧基乙基)-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑(2.66g，75.4％)，为白色结晶固体。
(b)1-(2-甲氧基乙基)-3,5-二甲基-吡唑-4-胺
将1-(2-甲氧基乙基)-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑(245mg，1.22mmol)溶于甲醇(25mL)中。所得溶液使用H-Cube连续流动氢化反应器，10％Pd/C，在30℃，8-10巴，1mL/min，全H2模式下氢化。将所得溶液真空浓缩，得到208mg(定量产率)标题化合物，为浅棕色油状物。
中间体I(JDM464/JDM450)
Figure BDA0001454666190000472
3,5-二乙基-1-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]吡唑-4-胺
以与针对中间体H所述相似的方式，由3,5-二乙基-4-硝基-1H-吡唑(中间体Fb)和1-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-乙烷开始，制备标题化合物，得到290mg 3,5-二乙基-1-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]吡唑-4-胺(72.2％)。
实施例14(JDM0466A)
Figure BDA0001454666190000481
N-[3,5-二乙基-1-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对间体2所述相同的反应顺序，使用中间体D作为起始原料，由其相应的酰氯制备该化合物。随后根据实施例7中所述的方法将酰氯与中间体I反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(22mg，54.4％)。数据：LCMS(B)Rt:7.845min；m/z 658.3(M+H)+。
中间体J(WITJ277/WITJ84)
Figure BDA0001454666190000482
4-(4-氨基-3-甲氧基-苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯
该化合物按照与针对中间体A所述的类似方式，由哌嗪-1-羧酸叔丁酯和2-甲氧基-4-氟硝基苯制备，得到标题化合物(245mg，91％)。
实施例15(WITJ349B)
Figure BDA0001454666190000491
N-[1-(2-甲氧基乙基)-3,5-二甲基吡唑-4-基]-2-(2-甲氧基-4-哌嗪-1-基-苯胺基)-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
2-氯-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(中间体1,296mg，1.07mmol)，4-(4-氨基-3-甲氧基-苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体J，328mg，1.07mmol)和碳酸铯(1.39g，4.27mmol)悬浮于二氧六环(25mL)中。在30℃下将氮气鼓泡通过混合物，持续5分钟，然后加入9,9-双-二甲基-4,5-双(二苯基膦基)呫吨(62mg，0.11mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(49mg，53μmol)。将反应混合物在氮气流下在80℃下搅拌20小时。
将乙酸乙酯/水/盐水(1/1/1v/v％，50mL)加入到反应混合物中并继续搅拌15分钟。经
Figure BDA0001454666190000492
过滤后，分离出水层，用乙酸乙酯(2×20mL)萃取。随后用水(40mL)，盐水(20mL)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过二氧化硅的柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝1/0至0/1v/v％)纯化，得到2-[4-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(115mg，20％)。
随后使用对中间体2b所述的条件水解所得到的乙酯。然后将相应的羧酸的钠盐以与针对实施例8d所述类似的方式与中间体H反应。在将Boc-基团脱保护之后，使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(5.2mg，28％)。数据：LCMS(B)Rt:8.140min；m/z 572.3(M+H)+。
中间体K(JDM251/JDM302)
Figure BDA0001454666190000501
2-甲氧基-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯胺
(a)4-(3-甲氧基-4-硝基-苯氧基)-1-甲基-哌啶
向4-氟-2-甲氧基-1-硝基-苯(750mg，4.38mmol)在甲苯(10mL)中的溶液中加入10mL 25％KOH-溶液，4-羟基-N-甲基哌啶(1009mg，8.76mmol)和四正丁基溴化铵(282mg，0.876mmol)。将混合物加热至60℃过夜。然后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并蒸发。残余物通过硅胶快速色谱法纯化
Figure BDA0001454666190000504
得到标题化合物。(650mg，55.7％)
(b)2-甲氧基-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯胺(中间体K)
将10％Pd/C(20mg)作为在乙醇中的悬浮液加入到4-(3-甲氧基-4-硝基-苯氧基)-1-甲基-哌啶(200mg，0.75mmol)在乙醇(5毫升)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌15分钟。加入甲酸铵(473mg，7.5mmol)，将反应混合物在氮气氛下回流搅拌1小时。将反应混合物冷却至室温并通过
Figure BDA0001454666190000502
过滤。将滤液真空浓缩，然后加入二氯甲烷，有机相用5％NaHCO3溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到2-甲氧基-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯胺(169.5mg，95.6％)。
中间体L(JDM221/JDM0222)
Figure BDA0001454666190000503
3,5-二甲基-1H-吡唑-4-胺
以与针对中间体Hb所述相似的方式，由3,5-二甲基-4-硝基-1H-吡唑开始，制备标题化合物，得到110mg 3,5-二甲基-1H-吡唑-4-胺(定量)。
实施例16(JDM323A)
Figure BDA0001454666190000511
N-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)-2-[2-甲氧基-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2所述相同的反应顺序，使用中间体K作为起始原料，由其相应的酰氯制备该化合物。然后根据实施例7中所述的程序将酰氯与中间体L反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(14.1mg，37％)。数据：LCMS(B)Rt:7.902min；m/z 543.2(M+H)+。
实施例17(WITJ0529B)
Figure BDA0001454666190000512
N-(2,6-二甲基苯基)-2-[2-甲氧基-4-[4-(2-甲氧基乙酰基)哌嗪-1-基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法，由其相应的胺(如实施例7所述从中间体1和中间体M开始，制备)和甲氧基乙酸制备该化合物。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(10mg，49％)。数据：LCMS(B)Rt:12.973min；m/z 596.3(M+H)+。
中间体3
Figure BDA0001454666190000521
2-氯嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯
(a)2-甲氧基嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(JGS362)
将DDQ(1.53g，6.76mmol)加入到搅拌的2-甲氧基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(1.54g，5.63mmol)的DCM(50mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3天。加入额外量的200mg DDQ，将反应混合物在室温下再搅拌7天。将混合物过滤并真空浓缩至小体积。将粗产物通过二氧化硅的柱色谱纯化(庚烷/乙酸乙酯＝1/0至1/1v/v％)，得到标题化合物(750mg，50％)。
(b)2-羟基嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(JGS377)
将碘化钠(1.24g，8.29mmol)加入到搅拌的2-甲氧基-嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(750mg，2.76mmol)的乙腈(19mL)溶液中。将三甲基氯硅烷(trimethylsilylchloride)(896mg，1.05mL)的乙腈(3mL)溶液逐滴加到反应混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜。滴加另外的碘化钠(3.33g)TMS-Cl(2.4g，2.8mL)的乙腈(6mL)溶液，将反应物在室温下搅拌3天。将混合物减压浓缩。将残余物悬浮于200mL DCM/MeOH(4/1)中，用饱和硫代硫酸钠(50mL)和水(100mL)的混合物萃取。水层用DCM/MeOH(4/1，2×150mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，得到固体。将固体在沸腾的乙酸乙酯(50mL)中研磨。冷却后，将固体在室温下搅拌1小时并过滤。残余物在40℃下真空干燥，得到1.0g粗制2-羟基-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(定量收率)。
(c)2-氯嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(中间体3)(JGS380)
将N,N-二甲基苯胺(47mg，50μL，1.50mmol)加入到2-羟基嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-羧酸乙酯(1.0g，3.89mmol)的乙腈(30mL)溶液中。将磷酰氯(phosphorus(V)oxychloride)(2.99g，1.81mL，19.5mmol)在乙腈(4mL)中的溶液逐滴加入到反应混合物中。将棕色/红色悬浮液加热至65℃持续4小时。冷却后，将混合物缓慢倒入搅拌的25％氨水(50mL)和冰水(100mL)，保持温度低于10℃。再搅拌15分钟后，混合物用乙酸乙酯萃取。随后用水(50mL)，0.2N HCl(50mL)，盐水(25mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。粗产物通过二氧化硅的柱色谱法纯化(庚烷/乙酸乙酯＝1/0至1/1v/v％)，得到200mg标题化合物。
实施例18(WITJ490B)
Figure BDA0001454666190000531
N-(2,6-二甲基苯基)-2-[2-甲氧基-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯胺基]嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2所述相同的反应顺序，由中间体3和中间体K作为起始原料，由其相应的酰氯制备该化合物。随后根据实施例7中所述的程序将酰氯与2,6-二甲基苯胺反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(30mg，45％)。数据：LCMS(B)Rt:12.491min；m/z 551.3(M+H)+。
中间体N(JDM618/JDM626/JDM634)
Figure BDA0001454666190000532
1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二乙基-吡唑-4-胺
(a)4-甲基苯磺酸2-(2-乙氧基乙氧基)乙酯
在冷却至0℃的二(乙二醇)乙醚(4.92ml，36.2mmol)在15mL THF中的溶液中，在剧烈搅拌下加入溶解在15mL水中的NaOH(2.46g，61.5mmol)。在0℃下经10分钟向该混合物中滴加甲苯磺酰氯(8.28g，43.4mmol)在15mL THF中的溶液。然后将反应混合物升至室温并在氮气下搅拌1小时。然后将混合物用50mL二乙醚萃取两次，有机层用1M NaOH水溶液洗涤，用硫酸钠干燥。在减压下除去溶剂，得到4-甲基苯磺酸2-(2-乙氧基乙氧基)乙酯，为无色液体(10g，95.8％)。
(b)1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑
向3,5-二甲基-4-硝基-1H-吡唑(1g，7.08mmol)和碳酸铯(2.31g，7.08mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入2-(2-乙氧基乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯(2.04g，7.08mmol)。将混合物在100℃下加热1小时。冷却至室温后，将混合物倒入水/盐水中，用乙酸乙酯(100mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到1.69g标题化合物(92.8％)。
(c)1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-胺(中间体N)
向搅拌的1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二甲基-4-硝基-吡唑(1.69g，6.57mmol)的甲醇(25mL)溶液中加入10％Pd/炭(钯碳)(200mg)在乙醇(1mL)中的悬浮液。将反应混合物在氮气氛下在室温下搅拌15分钟。然后，加入甲酸铵(4.14g，65.7mmol)，将反应混合物加热至回流温度15分钟。将反应混合物冷却，经
Figure BDA0001454666190000541
过滤并真空浓缩。将残余物溶于甲醇中，然后经SCX-2柱过滤。用甲醇冲洗柱后，用0.7N氨/甲醇溶液洗脱所需产物。将所得洗脱液真空浓缩，得到标题化合物(520mg，34.8％)。
实施例19(JDM640A)
Figure BDA0001454666190000551
N-[1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体D作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体N反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(32.3mg，53.9％)。数据：LCMS(B)Rt:7.432min；m/z644.6(M+H)+。
实施例20(JDM677A)
Figure BDA0001454666190000552
N-[1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]-3,5-二甲基-吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-[4-(2-甲氧基乙酰基)哌嗪-1-基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体C反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入甲氧基乙酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(19.0mg，63.4％)。数据：LCMS(B)Rt:8.815min；m/z 732.7(M+H)+。
实施例21(JDM711A)
Figure BDA0001454666190000561
N-[3,5-二乙基-1-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-[4-(3-甲基氮杂环丁烷-3-羰基)哌嗪-1-基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体I反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入1-(叔丁氧基羰基)-3-甲基氮杂环丁烷-3-羧酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。对Boc-基团脱保护后，使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(16.3mg，55％)。数据：LCMS(B)Rt:8.107min；m/z 741.8(M+H)+。
中间体O(JDM618/JDM625/JDM633)
Figure BDA0001454666190000562
1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二乙基-吡唑-4-胺
以与针对中间体N所述类似的方式，由3,5-二乙基-4-硝基-1H-吡唑(中间体Fb)和二(乙二醇)乙醚开始，制备标题化合物，得到550mg1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二乙基-吡唑-4-胺(79.8％)。
实施例22(JDM713A)
Figure BDA0001454666190000571
N-[3,5-二乙基-1-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-[4-(3-甲基氮杂环丁烷-3-羰基)哌嗪-1-基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体O反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入Boc-N-乙基-甘氨酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。对Boc-基团脱保护后使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(15mg，53.1％)。数据：LCMS(B)Rt:8.619min；m/z 743.8(M+H)+。
实施例23(JDM697A)
Figure BDA0001454666190000572
N-[1-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙基]-3,5-二乙基-吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-[4-(2-甲氧基乙酰基)哌嗪-1-基]苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体O反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入甲氧基乙酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(17.0mg，61.4％)。数据：LCMS(B)Rt:10.554min；m/z 730.7(M+H)+。
实施例24(JDM636A)
Figure BDA0001454666190000581
N-[3,5-二乙基-1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]吡唑-4-基]-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体D作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后，羧酸以与针对实施例8d所述类似的方式与中间体G反应。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(22.5mg，34.5％)。数据：LCMS(B)Rt:7.879min；m/z702.7(M+H)+。
实施例25(JDM703A)
Figure BDA0001454666190000582
N-[3,5-二乙基-1-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]吡唑-4-基]-2-[4-[4-[2-(乙基氨基)乙酰基]哌嗪-1-基]-2-甲氧基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后，羧酸以与针对实施例8d所述类似的方式与中间体G反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入Boc-N-乙基-甘氨酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。对Boc-基团脱保护后使用制备型HPLC，进行纯化，得到标题化合物(18.4mg，59.4％)。数据：LCMS(B)Rt:8.194min；m/z 773.8(M+H)+。
实施例26(JDM709A)
Figure BDA0001454666190000591
2-[4-[4-[(2R)-氮杂环丁烷-2-羰基]哌嗪-1-基]-2-甲氧基-苯胺基]-N-[3,5-二乙基-1-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]吡唑-4-基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
使用与针对中间体2b所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料，由其相应的酸制备该化合物。随后以与针对实施例8d所述类似的方式使羧酸与中间体I反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入(R)-N-Boc-氮杂环丁烷-2-羧酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。对Boc-基团脱保护后使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(16.8mg，57.7％)。数据：LCMS(B)Rt:8.017min；m/z727.9(M+H)+。
实施例27(JDM666A)
Figure BDA0001454666190000601
N-(2,6-二甲基苯基)-2-[4-[4-[2-(乙基氨基)乙酰基]哌嗪-1-基]-2-甲氧基-苯胺基]-5,6-二氢嘧啶并[4,5-e]吲嗪-7-甲酰胺
该化合物由相应的酰氯制备，使用与针对中间体2所述相同的反应顺序，使用中间体M作为起始原料。随后将酰氯与2,6-二甲基苯胺以与实施例7所述相似的方式进行反应。对Cbz-基团脱保护后得到相应的胺，引入Boc-N-乙基-甘氨酸，使用实施例8d中所述的标准HATU偶联方法。对Boc-基团脱保护后使用制备型HPLC，进行纯化，得到标题化合物(1mg，13.2％)。数据：LCMS(B)Rt:9.388min；m/z 609.6(M+H)+。
实施例28(JGS0715B)
Figure BDA0001454666190000602
N-环丙基-4-[6-(2,3-二氟-4-甲氧基-苯氧基)-8-(3,3,3-三氟丙基氨基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基]-2-甲基苯甲酰胺
该化合物如WO 2014/131739A1中所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(30mg)。数据：LCMS(B)Rt:14.958min；m/z 562.5(M+H)+。
实施例29(JDM943D)
Figure BDA0001454666190000611
(2R)-2-(4-氟苯基)-N-[4-[2-(2-甲氧基-4-甲基磺酰基-苯胺基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基]苯基]丙酰胺
该化合物如WO 2014/009219 A1中所述制备。使用制备型HPLC进行纯化，得到标题化合物(107.1mg)。数据：LCMS(B)Rt:13.703min；m/z 558.0(M-H)-。
实施例30(JDM969A)
Figure BDA0001454666190000612
1-[4-[[4-(2-异丙基磺酰基苯胺基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-6-基]氨基]-3-甲氧基-苯基]哌啶-4-醇(Mps1-IN-1)
该化合物购自Tocris。
实施例31(JDM969B)
Figure BDA0001454666190000613
4-[[4-氨基-6-(叔丁基氨基)-5-氰基-2-吡啶基]氨基]苯甲酰胺(TC Mps1 12)
该化合物购自Tocris。
TTK酶分析
在
Figure BDA0001454666190000621
测定(分子装置(Molecular Devices)，Sunnyvale，CA，U.S.A.)中测定化合物对生物化学纯化的全长TTK(Life Technologies，Madison，WI，U.S.A.)的抑制活性。将化合物溶于100％二甲基亚砜(DMSO)中。在实验当天，将化合物原液在100％DMSO中以3.16倍步骤稀释，得到10点(point)稀释系列，随后在IMAP反应缓冲液中进一步稀释，所述缓冲液由以下组成：10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.01％Tween-20，0.1％NaN3和1mM新制备的二硫苏糖醇。将化合物溶液与等体积的全长TTK酶在IMAP反应缓冲液中混合。在室温下在黑暗中预孵育1小时后，加入荧光素标记的MBP衍生的底物肽(分子装置(MolecularDevices))，和ATP开始反应。最终酶浓度为3.9nM，最终底物浓度为50nM，最终ATP浓度为5μM。使反应在黑暗中在室温下进行2小时。通过根据制造商(分子装置(Molecular Devices))的方案采用IMAP逐步结合溶液淬灭来终止反应。荧光素极化在Envision多模读取器(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)上测量。剂量响应曲线拟合为XLfitTM 5(ID BusinessSolutions，Ltd.，Guildford，U.K.)中的四参数对数方程。
表3显示了TTK酶分析中不同化学类别的多种TTK抑制剂的半最大抑制效力。
表3.TTK酶分析中小分子TTK抑制剂的活性。
Figure BDA0001454666190000622
Figure BDA0001454666190000631
为了鉴定与癌细胞对TTK抑制剂的敏感性相关的基因组生物标志物，在具有六十六种不同的遗传良好表征的癌细胞系的增殖测定中测试了化合物。
抑制剂的抗增殖活性与细胞系中特异性癌基因突变的存在的统计学分析显示，TTK抑制剂优先杀死已知涉及CTNNB1编码蛋白β-连环蛋白稳定性调节的CTNNB1基因突变的细胞。
图2显示了实施例5、8、9、12、13和17的Anova分析的火山图。为了验证TTK抑制剂在表达突变型CTNNB1的细胞系中是否比在CTNNB1中没有突变的细胞系显著更有效，进行单边学生t检验。表4显示了来自不同化学类别的多种代表性TTK抑制剂的敏感性差异(ΔpIC50)。负ΔpIC50值表示，CTNNB1突变体细胞系比不含CTNNB1基因调控结构域突变的细胞系对抑制剂更敏感(表2)。p值<0.05表示差异显著。
表4.CTNNB1突变体和非突变细胞系对TTK抑制剂的敏感性差异
Figure BDA0001454666190000641
Figure BDA0001454666190000651
1定义为-10log IC50(以M计)
2单边(单侧)学生T检验，异方差
3意指CTNNB1基因
为了验证突变的CTNNB1基因拷贝的存在足以赋予TTK抑制剂增加的敏感性，用亲本HCT116细胞(S45del/+)和缺乏突变CTNNB1(-/+)的等基因衍生物进行增殖测定。表5总结了与亲本HCT116细胞相比，来自不同化学类别的许多代表性TTK抑制剂在等基因细胞系中敏感性差异。负ΔpIC50或负Δ效力表明表达突变型CTNNB1(S45del/+)的HCT116亲代细胞比已经除去突变型CTNNB1基因(-/+)的等位基因衍生物对抑制剂更敏感。因此，具有负ΔpIC50或负Δ效力的抑制剂更好地抑制存在突变型CTNNB1信号传导的细胞系。
表5.TTK抑制剂在表达CTNNB1基因的突变拷贝或不表达CTNNB1基因的突变拷贝的HCT116细胞中的敏感性差异。
ΔpIC<sub>50</sub> Δ效力
实施例5 -0.17 -26
实施例8 -0.29 -11
实施例12 -0.14 -18
实施例13 -0.01 -27
实施例17 -0.12 -16
实施例20 -0.20 -34

Claims (41)

1.一种确定突变的CTNNB1基因的存在的试剂在制备诊断产品中的用途，所述诊断产品用于鉴定人个体或动物中的易于受TTK抑制剂治疗影响的肿瘤，所述鉴定包括：
a)提供肿瘤样品；
b)确定所述肿瘤样品中突变的CTNNB1基因的存在，其中所述突变位于CTNNB1的外显子3中；
其中所述突变导致在相应的CTNNB1-编码蛋白中在选自位置S33、S37、S45和T41的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个取代，或者其中所述突变是在相应的CTNNB1-编码蛋白中在选自位置S33、S37、S45和T41的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个缺失；
由此突变的CTNNB1基因的存在表明肿瘤易于受TTK抑制剂治疗影响。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变导致与CTNNB1的密码子33相对应的丝氨酸残基的取代，或者是与CTNNB1的密码子33相对应的丝氨酸残基的缺失。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变导致与CTNNB1的密码子41相对应的苏氨酸残基的取代，或者是与CTNNB1的密码子41相对应的苏氨酸残基的缺失。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变导致与CTNNB1的密码子45相对应的丝氨酸残基的取代，或者是与CTNNB1的密码子45相对应的丝氨酸残基的缺失。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变是在CTNNB1的密码子33并且编码S33Y。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变是在CTNNB1的密码子41并且编码T41A。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变是在CTNNB1的密码子45并且编码S45F。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变是对应于CTNNB1的密码子45的丝氨酸残基的缺失。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变的CTNNB1基因的存在是通过测定肿瘤样品中的肿瘤DNA确定的。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述突变的CTNNB1基因的存在是通过测定肿瘤样品中的肿瘤mRNA确定的。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于对DNA序列或mRNA序列进行测序。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品从肿瘤活检中获取。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品是DNA样品并且衍生自循环肿瘤DNA。
14.一种确定突变的CTNNB1-编码蛋白的存在的试剂在制备诊断产品中的用途，所述诊断产品用于鉴定人个体或动物中的易于受TTK抑制剂治疗影响的肿瘤，所述鉴定包括：
a)提供肿瘤样品；
b)确定所述肿瘤样品中突变的CTNNB1-编码蛋白的存在，其中所述突变位于CTNNB1的外显子3中；其中所述突变是在相应的CTNNB1-编码蛋白中在选自位置S33、S37、S45和T41的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个取代，或者其中所述突变是在相应的CTNNB1-编码蛋白中在选自位置S33、S37、S45和T41的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个缺失；
由此突变的CTNNB1-编码蛋白的存在表明肿瘤易于受TTK抑制剂治疗影响。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变导致与CTNNB1的密码子33相对应的丝氨酸残基的取代，或者是与CTNNB1的密码子33相对应的丝氨酸残基的缺失。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变导致与CTNNB1的密码子41相对应的苏氨酸残基的取代，或者是与CTNNB1的密码子41相对应的苏氨酸残基的缺失。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变导致与CTNNB1的密码子45相对应的丝氨酸残基的取代，或者是与CTNNB1的密码子45相对应的丝氨酸残基的缺失。
18.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变是在CTNNB1的密码子33并且编码S33Y。
19.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变是在CTNNB1的密码子41并且编码T41A。
20.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变是在CTNNB1的密码子45并且编码S45F。
21.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变是与CTNNB1的密码子45相对应的丝氨酸残基的缺失。
22.根据权利要求14所述的用途，其中所述突变的CTNNB1-编码蛋白的存在是通过分析肿瘤样品中β-连环蛋白的氨基酸序列或磷酸化而确定的。
23.根据权利要求14所述的用途，其中所述试剂是抗体。
24.根据权利要求14所述的用途，其中所述试剂是在确定突变的CTNNB1-编码蛋白的存在的基于质谱的方法中采用的试剂。
25.根据权利要求14所述的用途，其中所述样品从肿瘤活检中获取。
26.根据权利要求14所述的用途，其中所述样品是DNA样品并且衍生自循环肿瘤DNA。
27.一种通过确定CTNNB1调节的基因的改变的表达来确定突变的CTNNB1基因的存在的试剂在制备诊断产品中的用途，所述诊断产品用于鉴定人个体或动物中的易于受TTK抑制剂治疗影响的肿瘤，其中所述CTNNB1基因中的突变导致在相应的CTNNB1-编码蛋白中在选自位置S33、S37、S45和T41的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个取代，或者其中所述突变是在相应的CTNNB1-编码蛋白中在选自位置S33、S37、S45和T41的丝氨酸或苏氨酸残基中的一个或多个缺失；所述鉴定包括：
a)提供肿瘤样品；
b)确定CTNNB1调节的基因的改变的表达，由此CTNNB1调节的基因的改变的表达表明肿瘤易于受TTK抑制剂治疗影响。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述CTNNB1调节的基因选自Axin2、c-myc和LGR5。
29.根据权利要求27所述的用途，其中所述CTNNB1调节的基因是Axin2。
30.根据权利要求27所述的用途，其中所述样品从肿瘤活检中获取。
31.根据权利要求27所述的用途，其中所述样品是DNA样品并且衍生自循环肿瘤DNA。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式I的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000051
其中：
R1选自由以下组成的组：
Figure FDA0003365831100000052
R11是H，卤素，(1-2C)烷基，(2-3C)烯基，(2-3C)炔基，或(1-2C)烷氧基，所有烷基和烷氧基任选被一个或多个卤素取代；
R12是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R13是R131CH2、R132O、R133R134N、R135C(O)、R136S、R136S(O)、R136S(O)(NH)、R137SO2、(2-7C)杂环烷基或(1-5C)杂芳基，各个杂环烷基或杂芳基任选被(1-2C)烷基、氟、羟基、氧代、(1-2C)烷氧基、(1-6C)烷基羰基、(1-6C)烷基磺酰基、(1-5C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基、(3-6C)环烷基羰基、(2-7C)杂环烷基羰基或二[(1-2C)烷基]氨基取代，各个烷基羰基、烷基磺酰基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、环烷基羰基或杂环烷基羰基任选被(1-2C)烷基、氟、羟基、氰基、氧代或(1-2C)烷氧基取代；
R131是(1-6C)烷基羰基氨基、(3-6C)环烷基羰基氨基或(2-7C)杂环烷基羰基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基或(1-2C)烷氧基的基团取代；
R132是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基、(6-10C)芳基或(1-5C)杂芳基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、卤素、羟基、(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基或(2-7C)杂环烷基的基团取代；
R133是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基、(1-6C)烷基羰基、(1-5C)烷氧基羰基、(3-6C)环烷基羰基或(2-7C)杂环烷基羰基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、卤素、羟基或(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基或(2-7C)杂环烷基的基团取代；
R134是氢或(1-2C)烷基；
R135是(2-7C)杂环烷基、(1-6C)烷基氨基、二[(1-6C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基氨基或(3-6C)环烷基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基、(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基、氧代、氰基或氨基的基团取代；
R136是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基或(1-2C)烷氧基的基团取代；
R137是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基、(1-6C)烷基氨基、二[(1-6C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基氨基或(3-6C)环烷基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基或(1-2C)烷氧基的基团取代；
R14是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；和
R15是H，卤素；
在上述式I中，R2选自由以下组成的组：
Figure FDA0003365831100000071
R21是H，卤素，(1-3C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基(1-2C)烷基，(3-4C)环烷基，(2-3C)烯基或氰基；
R22是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R23是H，卤素，(1-2C)烷基，(1-2C)烷氧基，氰基或羟基；
R24是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R25是H，卤素，(1-3C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基(1-2C)烷基，(3-4C)环烷基，(2-3C)烯基或氰基；
R26是H、(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-5C)杂环烷基或(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基，其中n表示1、2、3或4的整数，全部烷基、杂环烷基和(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基任选被一个或多个选自以下的基团取代：(1-2C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基，氧代，氨基，(3-6C)环烷基，二[(1-2C)烷基]氨基或(2-5C)杂环烷基；并且其中
在上述式I中，R2中的R21和R25中只有一个可以是H。
33.根据权利要求32所述的用途，其中在式I中，
R1是
Figure FDA0003365831100000081
R11是H，卤素，(1-2C)烷基，(2-3C)烯基，(2-3C)炔基，或(1-2C)烷氧基，所有烷基和烷氧基任选被一个或多个卤素取代；
R12是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R13是R132O、R135C(O)、(2-7C)杂环烷基或(1-5C)杂芳基，各个杂环烷基或杂芳基任选被(1-2C)烷基、氟、羟基、氧代、(1-2C)烷氧基、(1-6C)烷基羰基、(1-6C)烷基磺酰基、(1-5C)烷氧基羰基、(1-6C)烷基氨基羰基、(3-6C)环烷基羰基、(2-7C)杂环烷基羰基或二[(1-2C)烷基]氨基取代，各个烷基羰基、烷基磺酰基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、环烷基羰基或杂环烷基羰基任选被(1-2C)烷基、氟、羟基、氰基、氧代或(1-2C)烷氧基取代；
R132是(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-7C)杂环烷基、(6-10C)芳基或(1-5C)杂芳基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、卤素、羟基、(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基或(2-7C)杂环烷基的基团取代；
R135是(2-7C)杂环烷基、(1-6C)烷基氨基、二[(1-6C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基氨基或(3-6C)环烷基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基、氟、羟基、(1-2C)烷氧基、二[(1-2C)烷基]氨基、(2-7C)杂环烷基、氧代、氰基或氨基的基团取代；
R14是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；和
R15是H，卤素；
R2选自由以下组成的组：
Figure FDA0003365831100000091
R21是H，卤素，(1-3C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基(1-2C)烷基，(3-4C)环烷基，(2-3C)烯基或氰基；
R22是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R23是H，卤素，(1-2C)烷基，(1-2C)烷氧基，氰基或羟基；
R24是H，卤素，(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基；
R25是H，卤素，(1-3C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基(1-2C)烷基，(3-4C)环烷基，(2-3C)烯基或氰基；
R26是H、(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(2-5C)杂环烷基、(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基，其中n表示1、2、3或4的整数，全部烷基、杂环烷基和(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基任选被一个或多个选自以下的基团取代：(1-2C)烷基，(1-2C)烷氧基，羟基，氧代，氨基，(3-6C)环烷基，二[(1-2C)烷基]氨基或(2-5C)杂环烷基；并且其中
在上述式I中，R2中的R21和R25中只有一个可以是H。
34.根据权利要求32所述的用途，其中在式I中，
R1是
Figure FDA0003365831100000092
R11是(1-2C)烷氧基，所述烷氧基任选被一个或多个卤素取代；
R12是H；
R13是R132O、R135C(O)、(2-7C)杂环烷基或(1-5C)杂芳基，各个杂环烷基或杂芳基任选被(1-2C)烷基、(1-6C)烷基羰基或(2-7C)杂环烷基羰基取代，各个烷基羰基或杂环烷基羰基任选被(1-2C)烷基或(1-2C)烷氧基取代；
R132是(2-7C)杂环烷基，任选被一个或多个选自(1-2C)烷基的基团取代；
R135是(2-7C)杂环烷基、或(2-7C)杂环烷基氨基，各自任选被一个或多个选自(1-2C)烷基的基团取代；
R14是H；
R15是H；
R2选自由以下组成的组：
Figure FDA0003365831100000101
R21是(1-3C)烷基；
R22是H；
R23是H；
R24是H；
R25是(1-3C)烷基；
R26是H、(1-6C)烷基、或(1-2C)烷氧基[(2-4C)烷氧基]n(1-6C)烷基，其中n表示1、2、3或4的整数。
35.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式II的化合物类别的化合物，
Figure FDA0003365831100000111
其中：
R1和R3独立地选自(6-10C)芳基和(1-5C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代；
R2选自(1-6C)烷基和(2-6C)烯基，其中两种基团任选地可以被取代；
R4选自氢和(1-6C)烷基，其中所述烷基任选地可以被取代；和，
R5和R6独立地是氢或甲基。
36.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式III的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000112
其中，
R1选自(1-6C)烷基、卤代(1-6C)烷基、HO-(1-6C)烷基、H2N-(1-6C)烷基、氰基(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基(1-6C)烷基、(2-6C)烯基、(2-6C)炔基、(3-6C)环烷基、(3-7C)杂环烷基、(6-10C)芳基和(1-5C)杂芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2选自(6-10C)芳基和(1-9C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代；
R3选自(1-6C)烷基，-(CH2)n-(3-7C)杂环烷基，-(CH2)n-(4-8C)杂环烯基，(3-7C)杂环烷基，(6-10C)芳基，(1-9C)杂芳基，-(CH2)n-(6-10C)芳基，-O-(6-10C)芳基，-C(＝O)N和氰基，其中所述基团可以被取代，并且其中n是0、1或2的整数。
37.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式IV的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000121
其中，
R1选自(3-6C)环烷基，(3-7C)杂环烷基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2选自(6-10C)芳基和(1-5C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代。
38.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式V的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000122
其中，
R1选自氢、(1-6C)烷基、卤代(1-6C)烷基、HO(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(3-7C)杂环烷基或(1-5C)杂芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2是(6-10C)芳基或(1-9C)杂芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R3选自X-(6-10C)芳基和X-(1-9C)杂芳基，其中两种基团任选地可以被取代，其中X表示S(＝O)p，O，NR4，CR4aR4b，C＝CR4aR4b，其中p是0、1、2的整数，并且其中R4，R4a，R4b彼此独立地表示氢原子或(1-6C)烷基。
39.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式VI的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000131
其中，
R1表示苯基，吡啶基或吲哚基，其中所述基团可任选被取代；
R2表示苯基，吡啶基或嘧啶基，其中所述基团可任选被取代；
R3表示选自以下的基团：氢原子或-C(＝O)-O-(CR7R8)-O-C(＝O)-R4，其中R4表示选自以下的基团：(1-6C)烷基，其一次或多次被相同或不同的选自以下的基团取代：-NH2，-N(H)R5，-N(R5)R6，(4-7C)杂环烷基，其任选地一次或多次被相同或不同的选自以下的基团取代：-NH2，-N(H)R5，-N(R5)R6；
R5和R6彼此独立地表示选自氢原子和(1-3C)烷基的基团；
R7表示选自氢原子和(1-3C)烷基的基团；
R8表示氢原子。
40.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式VII的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000141
其中，
R1选自(6-10C)芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
R2选自(6-10C)芳基，其中所述基团任选地可以被取代。
41.根据权利要求1至31中任一项所述的用途，其中所述TTK抑制剂是属于根据式VIII的化合物类别的化合物：
Figure FDA0003365831100000142
其中，
R1选自氢原子或氨基；
R2选自(6-10C)芳基，(1-5C)杂芳基，(1-6C)烷基，(3-6C)环烷基和(3-7C)杂环烷基，其中所述基团任选地可以被取代；
R3选自(6-10C)芳基，其中所述基团任选地可以被取代；
X是C或N。
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