JP2944721B2

JP2944721B2 - エンドトキシンの測定剤

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Publication number: JP2944721B2
Application number: JP21895490A
Authority: JP
Inventors: 重則田中; 弘志田村
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1990-08-22
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1999-09-06
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: EP0500947A4; EP0500947A1; US5286625A; EP0500947B1; JPH04102064A; WO1992003736A1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを
用いるエンドトキシンの測定剤に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単に
ライセートという）を使用して、エンドトキシンを測定
する方法が知られている。この方法は、ライセートが微
量のエンドトキシンにより凝固することに基づいている
が、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつ
かの凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らか
にされている（中村隆範ほか、日本細菌学雑誌、38、78
1−803（1983））。

すなわち、第１図に示すように、ライセートにエンド
トキシンが加わるとＣ因子（エンドトキシン感受性因
子、分子量123,000）を活性化して活性型Ｃ因子とな
り、これはＢ因子（分子量64,000）を限定水解し、活性
化して活性型Ｂ因子となり、これはプロクロッティング
エンザイム（分子量54,000）を活性化してクロッティン
グエンザイムに変換する。クロッティングエンザイムは
コアギュローゲン（凝固タンパク、分子量19,723）のAr
g¹⁸−Thr¹⁹とArg⁴⁶−Gly⁴⁷の特定箇所を限定水解するこ
とよりペプチドＣを遊離し、コアギュローゲンをコアギ
ュリンに変換して凝固（ゲル化）させる。岩永らの方法
（Haemostasis,７,183−188（1978））により、さらに
このコアギュローゲンの水解部位と共通のアミノ酸配列
を持った合成ペプチド、すなわち発色合成基質Boc−Leu
−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリド（pNA）あるいは発蛍
光合成基質Boc−Leu−Gly−Arg−４−メチルクマリル−
７−アミドとライセートを組み合わせた定量性のある測
定法が知られている。

該測定法は、エンドトキシンが引金（トリガー）とな
って複数の凝固因子（全てセリンプロテアーゼ前駆体）
を順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコ
アギュリンゲルを形成するという一連の反応を利用して
いる。

また、ライセートに（１→３）−β−Ｄ−グルカンが
加わると、第１図におけるＧ因子を活性化して活性型Ｇ
因子となり、これがプロクロッティングエンザイムをク
ロッティングエンザイムに変換し、エンドトキシンの場
合と同様にクロッティングエンザイムがコアギュローゲ
ンをコアギュリンに変換してゲルを形成し、また合成基
質を水解する（森田ら、FEBS Lett.,129,318−321（198
1））。

このＧ因子に反応する物質としては（１→３）−β−
Ｄ−グルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらには
セルロース系血液透析膜の洗浄液中及び該膜と接触した
血液中に含まれる物質などが知られており、これらはい
ずれもウサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認
められている。

ところで、エンドトキシンはグラム陰性菌細胞壁の構
成成分としても知られ、特に血液中のエンドトキシンを
測定することにより体内におけるグラム陰性菌の存在を
検知することができるので、エンドトキシンを（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの影響を全く受けずに、高い感
度で再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医学の分
野で望まれている。

ライセート中のＣ因子系を用いることによりエンドト
キシンを測定する方法が報告されている（大林ら、Cli
n.Chim.Acta,149,55−65（1985））が、この方法はライ
セートをゲル過法によりあるいはヘパリンまたはデキ
ストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用いる
クロマトグラフィーにより分画し、（１→３）−β−Ｄ
−グルカン感受性のＧ因子を除去することにより、Ｃ因
子、Ｂ因子とプロクロッティングエンザイムのみで再構
成するもので、きわめて煩雑な操作を必要とする方法で
ある。

［課題を解決するための手段］本発明は、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子
に対する抗体を使用し、（１→３）−β−Ｄ−グルカン
感受性のＧ因子の影響を受けずに、ライセート中のＣ、
Ｂ因子による反応を利用してエンドトキシンを測定する
試薬に関する。

すなわち、本発明のエンドトキシンの測定剤は、（１）ライセートと、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感
受性因子に対する抗体とからなるエンドトキシンの測定
剤、および（２）（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対す
る抗体を固定化した担体に、ライセートを接触させて得
た（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子不含ライセ
ートからなるエンドトキシンの測定剤、である。

本発明において測定剤とは、カブトガニ・アメボサイ
ト・ライセートと（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性
因子に対する抗体を予め混合した単一の測定剤だけでな
く、カブトガニ・アメボサイト・ライセートと（１→
３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対する抗体を別々
に用意し、エンドトキシン測定時に組み合わせて使用で
きるようにした試薬キットも包含する。

（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子は、前述し
たように（１→３）−β−Ｄ−グルカンによって活性化
されるＧ因子であり、ライセートを用いてエンドトキシ
ンを（１→３）−β−Ｄ−グルカンの影響を受けること
なく特異的に測定するには、ライセートに含まれるＧ因
子の影響を排除しなければならない。このため本発明で
はＧ因子に対する抗体をライセートと共に用いるか、ま
たは抗Ｇ因子抗体固定化によるＧ因子不含ライセートを
用いるものである。

本発明で使用するライセートは、リムルス・ポリフェ
ムス（L.polyphemus、アメリカ産）、タキプレウス、ギ
ガス（T.gigas、タイ国、マレーシア半島産）、タキプ
レウス・トリデンタツス（T.tridentatus、日本、中国
産）、カルシノスコルピウス・ロツンデイカウダ（C.ro
tundicauda、タイ国、マレーシア半島産）等のカブトガ
ニから血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、そ
の成分（ライセート）を分離する。ライセートは−40℃
以下に小分けして保存し、必要に応じ凍結融解して使用
するのが望ましい。

得られたライセートからＧ因子に対する抗体を製造す
るには、まず抗原となるＧ因子を精製しなければならな
いが、この方法としては、アガロース、セファロース
（ファルマシア社販売、商品名）、またはその架橋体等
の適当な担体にデキストラン硫酸、ヘパリン等を固定化
したものにライセートを接触させ、Ｇ因子を含む画分を
採取する方法を採用することができる。接触させる方法
としては、例えば、上記固定化物とライセートとを溶液
中で接触させる方法、カラムクロマトグラフィーにより
接触させる方法等を挙げることができる。

（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子を抗原とす
る抗体は、精製した（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受
性のＧ因子またはＣ、Ｂ因子を含まないＧ因子画分を抗
原として使用し、これら抗原に対するポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体を製造する。

本発明で使用するポリクローナル抗体の製造方法とし
ては、該抗原をウサギ、ヤギ等の被免疫動物に投与し、
得られた抗体を、さらに精製することが望ましい。被免
疫動物に投与する際に、補助剤（アジュバンド）を併用
することは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。

本発明で使用するモノクローナル抗体の製造方法とし
ては、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した
後に脾臓などを摘出し、該脾臓などから採取した細胞と
腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、
ハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを試
験管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイブリドー
マから上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細
胞株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウス
の腹腔などの生体内にて培養することによって、モノク
ローナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができ
る。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリン
パ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることが
できる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来の
ものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗
体産生ハイブリドーマを得ることができる。

得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウ
ム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポ
リエチレグリコールまたは等電点による選択的沈澱分別
法、ないしは電気泳動、DEAE−、CM−誘導体等のイオン
交換体やプロテインＡならびにハイドロキシアパタイト
吸着体による吸脱着法、ゲル過および超遠心法等を挙
げることができる。

エンドトキシンを測定する上記（１）の方法におい
て、該抗体をライセートとエンドトキシン溶液中に存在
させるには、例えばライセートの凍結乾燥品を蒸留水あ
るいは適当な緩衝液で溶解して調製した溶液に、該抗体
溶液を添加する方法、ライセート中に予め必要量の抗体
溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは
適当な緩衝液で溶解して用いる方法、ライセートと合成
基質の凍結乾燥品を適当な緩衝液等で溶解して調製した
溶液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセートと合成
基質の混合液中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結
乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解
して用いる方法、および必要量の該抗体溶液を試料に添
加する方法等が挙げられる。

また、上記（２）の方法に用いる該抗体の固定化担体
にライセートを接触させてＧ因子を含まないライセート
を得る方法としては、該担体にライセートを接触させた
後に、遠心分離、過等の手法により該担体を除去する
方法、あるいは該担体を充填したカラムにライセートを
添加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。

該抗体の固定化担体としては、例えばセルロファイン
（生化学工業株式会社販売、商品名）またはセファロ
ース等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通
常の方法により共有結合させた固定化担体を用いること
ができる。担体としては、この他にもセルロース、アガ
ロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シ
リカビーズ等を用いることができる。

さらにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法とし
て、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方
法、例えば担体をエポキシ活性化後ホルミル化したの
ち、抗体を結合させる方法等を挙げることができる。

ライセートを固定化担体に接触させる場合のpHとして
は、ライセート中のＣ因子およびエンドトキシンとＣ因
子により開始される経路に関与する凝固因子が不活化さ
れない程度のpHであれば良いが、好ましくはpH6〜９の
範囲が好ましい。また、接触させる場合の温度として
は、該凝固因子が同様に不活化されない温度であれば良
いが、通常０〜45℃、より好ましくは０〜10℃である。

本発明により、エンドトキシンを測定する生体試料と
しては、血液、血漿または血清の他に、脳脊髄液、腹
水、関節液、胸水、乳汁および尿などの体内外の浸出ま
たは排泄液を挙げることができる。たとえば、血漿を試
料とするときは、ヘパリン、EDTA、クエン酸等の抗凝固
剤を加えて分離することが必要である。

本発明の測定剤を用いてエンドトキシンを測定するに
は、前述の発色合成基質あるいは発蛍光合成基質を反応
液中に共存させ、クロッティングエンザイムのアミダー
ゼ活性を測定する方法、凝固反応によるゲル形式の有無
を肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴って生ずる濁度を
適当な光学系を用いて測定する比濁法、一定の濁度に達
するまでの時間を適当な光学系を用いて測定する比濁時
間分析法、凝固に伴って生ずる粘性の変化を共振周波数
の変化としてとらえ、水晶振動子ゲル化測定装置を用い
て測定する方法等を採用することができる。

［作用］本発明のエンドトキシンの測定剤は、Ｇ因子に対する
抗体を使用しているので、少量でも優れたＧ因子に対す
る特異的結合能および中和効果を示すことが第一の特徴
である。また、該抗体はリムルス反応阻害物質として知
られているアンチトリプシン、アンチトロンビンIII等
のセリンプロテアーゼインヒビター類を含まず、Ｃ因子
活性を全く損なわないことが第二の特徴である。

（実施例）以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例１Ｇ因子に対するポリクローナル抗体の製造カブトガニ血リンパ液1.0を４℃下に、1,500rpmで1
0分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）約50gに
250mの0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）を加え、ホ
モゲナイザー（ポリトロンＲ PT10（商標）、Kinemati
ca社製）にて均一に破砕及び抽出し、冷却遠心分離機
（トミー精工RD−20III）にて、10,000rpmで30分間遠心
した。得られた沈澱物をさらに150mの同上緩衝液にて
２回抽出し、最終的に550mのライセートを得た。

同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファ
ロースCL−6Bカラム（５×23cm、0.05M NaCl含有0.02M
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化）に添加し、0.2
M NaCl含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）にて溶出
される画分、すなわち第１図に示すＧ因子を含むＧ因子
画分を、後記する大林らの方法（Clin,Chim,Acta、149,
55−65（1985））により、その活性を測定した。ついで
その50mを10mに減圧濃縮後、Ｇ因子の活性化を防ぐ
ために0.23gのEDTA−4Naを添加した。

その1.0mに等量のフロイントコンプリートアジュバ
ント（ヤトロン社販売、商品名）を加え、ウサギ（JW、
♂2.5kg）の背中、尻および横腹のそれぞれに0.3m、
0.3mおよび0.4mずつ皮下注射（感作）した。感作は
２週間に１度計５回行い、ゲル内二重拡散法により抗体
価の上昇を確認後、最終感作日より１週間後に頚動脈を
切開して全採血した。ひきつづき室温１時間、４℃一晩
放置後、2,000rpmで５分間遠心分離を行い、得られた血
清52mを56℃で30分間の熱処理を行い非働化した。そ
の血清の50mに対して34％（W/V）Na₂SO₄溶液を50m
加え、生じた沈澱を10,000rpmで30分間遠心分離し、得
た沈澱を17％（W/V）Na₂SO₄溶液で２回洗浄し、その沈
澱を0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）50mに溶解し
た。この溶液に、固形のNa₂SO₄7.5gを撹拌しながら溶か
し込み、生じた沈澱を上記と同様のトリス−塩酸緩衝液
に溶かし、さらにNa₂SO₄濃度7.5g/50mの条件で沈澱操
作を３回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。
ひきつづき0.05M NH₄HCO₃で平衡化したセルロファインG
H−20m（生化学工業株式会社販売、商品名）カラム（2.
8×90cm、0.05M NH₄HCO₃で溶出）を通過させ脱塩した
後、凍結乾燥し、ウサギ抗（Ｇ因子画分）血清のIgG溶
液を得た。

［Ｇ因子活性測定法］ 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.013M MgCl₂含
有）0.1mに、（１→３）−β−Ｄ−グルカン（カード
ラン・和光純薬工業販売、商品名;400ng/m）0.03m
、各画分0.05m、0.005M N−ターシャリ−ブトキシ
カルボニル（Boc）−Leu−Gly−Arg−pNA（ｐ−ニトロ
アニリド）0.02mと凝固酵素前駆体（プロクロッテイ
ングエンザイム）0.05mを加え、37℃で反応させる。
発色が認められることを確認し、0.6Mの酢酸0.8mを添
加することにより反応を停止し、次いで405nmの吸光度
を測定する。

実施例２精製Ｇ因子に対するポリクローナル抗体の製造カブトガニ血リンパ1.2を４℃下に1,500rpmで10分
間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）約53gに250
mの0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.001Mベンズ
アミジン、0.001M EDTA−4Na含有）を加え、実施例１と
同様に破砕、抽出後、10,000rpmで30分間遠心した。得
られた沈澱を200mの同上緩衝液にてさらに２回抽出
し、最終的に640mのライセートを得た。

同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファ
ロースCL−6Bカラム（５×23.5cm、0.02Mトリス−塩酸
緩衝液、pH8.0で平衡化）に添加し、0.2M NaCl含有0.02
Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）にて溶出されるＧ因子画
分をカラムライト（生化学工業販売、商品名）カラム
（3.0×29.6cm、0.02Mトリス−塩酸緩衝液、pH8.0で平
衡化）に添加し、0.02Mトリス−塩酸緩衝液、pH8.0およ
び0.5M炭素水素アンモニウム各800mで洗浄後、2M炭素
水素アンモニウムにて溶出し、精製Ｇ因子を得た。

上記により精製したＧ因子溶液50mを10mに濃縮
後、Ｇ因子の活性化を防ぐため0.23gのEDTA−4Naを添加
した。その1.0mに等量のフロイントコンプリートアジ
ュバントを加え、ウサギ（JW、♂、2.5kg）の背中、尻
および横腹のそれぞれに0.3m、0.3mおよび0.4mづ
つ皮下注射（感作）した。感作は２週間に１度計５回行
い、ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確認後、最
終感作日より１週間後の頚動脈切開により全採血した。
ひきつづき室温１時間、４℃一晩放置後、2,000rpmで５
分間遠心分離を行い、得られた血清65mを56℃で30分
間の熱処理を行い非働化した。その50mの血清に対し
て34％（W/V）Na₂SO₄溶液を50m加え、生じた沈澱を1
0,000rpmで30分間遠心分離し、沈澱を17％（W/V）Na₂SO
₄溶液で２回洗浄し、その沈澱を0.1Mトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0）50mに溶解した。この溶液に固形のNa₂SO₄
7.5gを撹拌しながら溶かし込み、生じた沈澱を上記と同
様のトリス−塩酸緩衝液に溶かし、さらにNa₂SO₄濃度7.
5g/50mの条件で沈澱操作を３回繰り返し、最終沈澱を
上記緩衝液に溶解した。ひきつづき0.05MのNH₄HCO₃で平
衡したセルロファインGH−20mカラム（2.8×90cm、0.05
M NH₄HCO₃にて溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥
し、抗Ｇ因子血清のIgG溶液を得た。

実施例３精製Ｇ因子に対するモノクローナル抗体の製造実施例２で得られたＧ因子0.5m（タンパク量、200
μg/m）を等料のフロイントコンプリートアジュバン
トと混合し、マウス（BALB/C、５週令、体重25g）の背
中に0.2mおよび尻に0.3mを皮下注射し、２度目の感
作を２週目に行い、３週後に300μg/mのＧ因子0.3m
を静脈内投与し最終免疫とした。これより４日後に9.2
×10⁷個の脾細胞を分離し、マウスミエローマSP/0細胞
の1.8×10⁷個と常法により融合させて、ハイブリドーマ
を作製した。得られたハイブリドーマにつき、Ｇ因子に
結合すること、またはＧ因子活性を中和させることがで
きることを確認した。つづいて、上記と同様のマウス腹
腔内にプリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン）を0.2m投与し、１週後にハイブリドーマ３×10
⁷個／匹を腹腔内に投与し、腹水の大量貯留がみられる
２週目に腹水を回収し、40％飽和硫酸アンモニウムでIg
G画分を沈澱させ、最終的な腹水型モノクローナル抗体
を得た。

実施例４抗Ｇ因子抗体固定化セルロファインによるＧ因子不含ラ
イセートの調製実施例１に記載の方法で得られたライセート100m
を、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.15M NaCl含
有）で平衡化したエンドトキシンおよびβ−グルカン不
含の抗Ｇ因子抗体固定化セルロファイン（調製方法は後
記）カラム（1.2×11cm）に添加し、0.1Mトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0、1M NaCl含有）にて洗浄後、素通りした
非吸着画分を集め、Ｇ因子を全く含まないＧ因子不含ラ
イセートを得た。

［抗Ｇ因子抗体固定化セルロファインの調製方法］ホルミルセルロファイン10gを0.1Mリン酸−Na緩衝液
（pH7.1）で充分洗浄し、実施例１〜４に記載のＧ因子
に対する抗体溶液（10mg/m0.1Mリン酸−Na緩衝液、pH
7.1）20mに懸濁し、NaCNBH₃50mgを加え溶解させる。
ひきつづき室温で８時間ゆるやかに撹拌し、0.2Mトリス
−塩酸緩衝液（pH7.0）で洗浄、過し、10mgのNaCNBH₃
を含む5mの上記緩衝液を加え、室温で３時間振とうす
る。その後、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.15M N
aCl含有）で充分洗浄する。

実施例５エンドトキシンの測定以下の方法で３種類の試薬を調製し、３種類の試料に
ついてその反応性を比較検討した。

Ａ剤は、ライセート440μ、塩化マグネシウム440μ
モル、およびBoc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモルを混
合し、凍結乾燥して調製した。Ｂ剤は、Ａ剤の成分に実
施例１で調製した抗Ｇ因子画分血清のIgG画分の10mg/m
0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）180μを添加、
混合し、凍結乾燥して調製した。Ｃ剤はＡ剤の成分に実
施例２で調製した抗Ｇ因子血清のIgG画分の10mg/m0.0
2Mトリス−塩酸緩衝液180μを添加、混合し、凍結乾
燥して調製した。

３種類の試薬それぞれを2.2mの0.2Mトリス−塩酸緩
衝液（pH8.0）に溶解させ、その溶液0.1mを試験管に
分注し、そこへ試料0.1mを添加してよく混合し、37℃
にて30分間反応させた。３種類の試薬に対する試料の反
応性は、30分後に生じたpNAを、0.5mの0.04％亜硝酸
ナトリウム（0.48M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸ア
ンモニウム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジア
ミン二塩酸塩を順次添加して発色させ、545nmの吸光度
値で示した。その結果を第１表に示した。この結果か
ら、Ｇ因子画分に対するポリクローナル抗体及びＧ因子
に対するポリクローナル抗体を添加して調製した試薬を
用いれば、（１→３）−β−Ｄ−グルカンの影響を全く
受けずに、エンドトキシンを特異的に定量することがで
きることは明らかである。

実施例６エンドトキシンの測定以下の方法で２種類の試薬を調製し、エンドトキシン
及び（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を比
較検討した。Ａ剤は、ライセート440μ、塩化マグネ
シウム440μモル、Boc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモル
を混合し、凍結乾燥して調製した。Ｄ剤はＡ剤の成分
に、実施例３で調製した精製Ｇ因子に対して中和能のあ
るモノクローナル抗体を含む溶液80μを添加し、凍結
乾燥して調製した。

２種類の試薬それぞれを2.2mの0.2Mトリス−塩酸緩
衝液（pH8.0）に溶解させ、その溶液0.1mを試験管に
分注し、そこへ試料0.1mを添加してよく混合し、37℃
にて30分間反応させた。２種類の試薬に対する試料の反
応性は、30分後に生じたpNAを0.5mの0.04％亜硝酸ナ
トリウム（0.48M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アン
モニウム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミ
ン二塩酸塩を順次添加して発色させ、545nmの吸光度値
で示した。

第２図は（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応
性を比較した実験結果である。Ａ剤は（１→３）−β−
Ｄ−グルカンに対して濃度依存的に反応するが、Ｄ剤は
1,000ng/mの（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対して
も全く反応しない。この結果は、精製Ｇ因子に対するモ
ノクローナル抗体が、ライセート中のＧ因子を完全に中
和し、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を
消失させていることを示している。

第３図は、Ａ、Ｄ両試薬のエンドトキシンに対する反
応性を用量反応曲線で比較した結果である。２つの試薬
の用量反応曲線はほとんど一致しており、このことはＤ
剤に含まれる精製Ｇ因子に対するモノクローナル抗体
が、ライセートのエンドトキシンに対する反応性に全く
影響を与えないことを示している。

第４図はエンドトキシンの蒸留水による希釈系列と、
100ng/mの（１→３）−β−Ｄ−グルカン溶液による
希釈系列に対するＤ剤の用量反応曲線である。２つの用
量反応曲線はほとんど一致しており、このことは、Ｄ剤
を用いれば、試料中に混在する（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンには全く影響されずにエンドトキシンを特異的に
定量できることを示している。

以上の結果から、精製Ｇ因子に対するモノクローナル
抗体を添加して調製した試薬を用いれば、（１→３）−
β−Ｄ−グルカンの影響を全く受けずに、エンドトキシ
ンを特異的に定量することができることは明らかであ
る。

実施例７エンドトキシンの測定以下の方法で２種類の試薬を調製し、３種類の試料に
ついてその反応性を比較検討した。

Ａ剤は、ライセート440μ、塩化マグネシウム440μ
モルおよびBoc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモルを混合
し、凍結乾燥して調製した。Ｅ剤は、実施例４で調製し
たＧ因子不含ライセート440μ、塩化マグネシウム440
μモル、Boc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモルを混合
し、凍結乾燥して調製した。

２種類の試薬それぞれを2.2mの0.2Mトリス−塩酸緩
衝液（pH8.0）に溶解し、その溶液0.1mを試験管に分
注し、そこへ試料0.1mを添加してよく混合し、37℃に
て30分間反応させた。２種類の試薬に対する試料の反応
性は、30分後に生じたpNAを、0.5mの0.04％亜硝酸ナ
トリウム（0.48M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アン
モニウム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミ
ン二塩酸塩を順次添加して発色させ、545nmの吸光度値
で示した。その結果を第２表に示した。この結果から、
Ｇ因子不含ライセートを用いて調製した試薬によれば、
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの影響を全く受けずに、
エンドトキシンを特異的に定量することができることは
明らかである。

実施例８血漿検体の測定対象は、グラム陰性菌による敗血症を疑った自治医大
血液科に入院中の白血病等の重症血液疾患および感染を
合併した肝、胆道疾患を有する患者の25例で、それぞれ
無菌的に採血したヘパリン加血液を試料として、４℃で
150×Ｇ、10分間遠心して多血小板血漿（PRP）を得た。
その0.1mに0.32Mの過塩素酸0.2mを加え、37℃で20
分間加温し、析出物を遠心（3,000rpm、10分間）除去
し、その上清0.05mに0.18M NaOHを0.05m加えて中和
し被検液とした。

ひきつづき実施例６に記載の方法で調製した、本発明
によるエンドキシン測定剤0.1mを加え、37℃で30分間
加温した。この溶液に0.04％亜硝酸ナトリウム（0.48M
塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アンモニウム、0.07
％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩の各
0.5mを順次加えてジアゾカップリングし、545nmでそ
の吸光度を測定し、別に作成した検量線（第５図）のａ
よりE.coli 0111:B4エンドキシン換算量として表わし
た。第６図に示すように25例全例において高濃度のエン
ドトキシンが検出され（健常人25例:0.8±0.6pg/m
）、そのうちの３例（＊印）は血培にて、イシェリキ
ア・コリ（Escherichia coli）、シュードモナス・エル
ギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシェラ・
ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）をそれぞれ検
出し、残りの22例は血培では陰性であったが、発熱、白
血球数、その他臨床症状及び抗生物質感受性よりグラム
陰性菌敗血症と診断された。従って、本発明方法は通常
の検査法では診断がきわめて困難なグラム陰性菌敗血症
の迅速診断法としてきわめて有力な手法として評価され
うるものであることが理解できよう。

実施例９尿検体の測定自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿
培養でイシェリキア・コリ（Escherichia coli）、セラ
チア・マルセッセンス（Serratiamarcescens）を検出し
た３症例につき、本発明方法による尿中エンドトキシン
の定量を行った。

尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コップに採取し、その
0.005mに実施例７に記載の本発明方法によるエンドト
キシン測定剤0.2mを加え、37℃で30分間加温した。実
施例８と同様にジアゾカップリング後、545nmでその溶
液の吸光度を測定し、別に作成した検量線（第５図）の
ｂよりE.coli 0111:B4エンドキシン換算値として表わし
た。第３表に示すように３例中全例において高濃度のエ
ンドトキシンが検出され（健常人:60pg/m以下）、本
発明方法はグラム陰性菌尿路感染症の迅速確定診断法と
して、きわめて有力な手法であることが理解できよう。

実施例10 脳脊髄液検体の測定自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にシュー
ドモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）お
よびヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus infl
uenzae）を検出した細菌性髄膜炎の３症例につき、本発
明方法によるエンドトキシンの定量を行った。

腰推穿刺にて無菌的に採取した髄液0.05mに注射用
蒸留水0.05mを加え、さらに実施例５に記載の本発明
方法によるエンドトキシン測定剤0.1mを加え、37℃で
30分間加温した。実施例８と同様にジアゾカップリング
後、545nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した
検量線（第５図）のｂよりE.coli 0111:B4エンドキシン
換算値として表わした。第４表に示すように、３例中全
例において高濃度のエンドキシンが検出され（健常人:3
pg/m以下）、本発明方法はグラム陰性菌髄膜炎の早期
迅速診断法としてきわめて有力な手法として評価され得
るものであることが理解できよう。

［発明の効果］以上述べたように、本発明はライセートを用いたエン
ドトキシンに特異的な測定剤を提供するものであり、血
液や尿、髄液等の生体試料中に存在するグラム陰性菌由
来のエンドトキシンを迅速簡便かつ高い精度で測定する
ことが可能であり、グラム陰性菌血症ならびにエンドト
キシン血症の迅速な診断ならびに治療効果の判定に役立
つもので、特に臨床検査医学に貢献するところ大であ
る。

さらに本発明は、注射用蒸留水、医療用具および注射
薬を汚染したエンドトキシンを迅速かつ正確に測定する
ことを可能とし、これらはいずれも本発明の副次的効果
として、とくに医薬品製造分野に貢献するところ大であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はカブトガニ血液凝固系のカスケード機構を示
す。第２図はＡ剤、Ｄ剤の（１→３）−β−Ｄ−グルカンに
対する反応性を示す。第３図はＡ、Ｄ剤のE.coli 0111:
B4エンドキシンに対する反応性を示す。第４図はSalmon
ellaenteritidisエンドキシンの水及び（１→３）−β
−Ｄ−グルカン添加希釈液に対するＤ剤の反応性を示
す。第５図は実施例８〜10のE.coli 0111:B4エンドトキシン
の検量線を示す。第６図は実施例８の血漿検体中のエンドトキシン測定結
果を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】リムルス・アメボサイト・ライセートと、
（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対し特異的
結合能及び中和効果を有する（１→３）−β−Ｄ−グル
カン感受性因子に対する抗体とを共存させ、該ライセー
ト中の（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対す
る（１→３）−β−Ｄ−グルカンの反応性を消失させて
なるエンドトキシンに特異的に反応する該ライセートを
含むエンドトキシンの測定剤。
【請求項２】リムルス・アメボサイト・ライセートと、
（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対し特異的
結合能及び中和効果を有する（１→３）−β−Ｄ−グル
カン感受性因子に対する抗体及びペプチド合成基質とか
らなる、該ライセート中の（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン感受性因子に対する（１→３）−β−Ｄ−グルカンの
反応性が消失し、エンドトキシンに特異的に反応する該
ライセートを含むエンドトキシンの測定剤。
【請求項３】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
を、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対し特
異的結合能及び中和効果を有する（１→３）−β−Ｄ−
グルカン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に接
触させ、該ライセートを該担体と分離することにより得
られる、（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子不含
ライセートからなるエンドトキシンに特異的に反応する
該ライセートを含むエンドトキシンの測定剤。
【請求項４】（ａ）請求項３記載の測定剤と試料とを混
合して、エンドトキシンによって活性化されるカスケー
ド機構によりプロクロッティングエンザイムを活性化さ
せ、（ｂ）活性化されたクロッティングエンザイムと、コア
ギュローゲン又はペプチド合成基質とを接触させ、（ｃ）コアギュローゲン又はペプチド合成基質の変化を
測定することからなるエンドトキシンの測定法。
【請求項５】（ａ）カブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートに、該ライセート中の（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン感受性因子に対し特異的結合能及び中和効果を有する
（１→３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子に対する抗体
を添加し、（ｂ）前記ライセートと、試料とを混合して、エンドト
キシンによって活性化されるカスケード機構によりプロ
クロッティングエンザイムを活性化させ、（ｃ）活性化されたクロッティングエンザイムと、コア
ギュローゲン又はペプチド合成基質とを接触させ、（ｄ）コアギュローゲン又はペプチド合成基質の変化を
測定することからなるエンドトキシンの測定法。