JPS5927828A - アメボサイト・ライゼートの調製方法 - Google Patents
アメボサイト・ライゼートの調製方法Info
- Publication number
- JPS5927828A JPS5927828A JP57135680A JP13568082A JPS5927828A JP S5927828 A JPS5927828 A JP S5927828A JP 57135680 A JP57135680 A JP 57135680A JP 13568082 A JP13568082 A JP 13568082A JP S5927828 A JPS5927828 A JP S5927828A
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- JP
- Japan
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- endotoxin
- amebocyte lysate
- lysate
- same
- tris
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アメボッイト・ライゼートの棺ｊｊ！！法に
関し、更に詳しくは、カブトガニの血リンパ液よシ取得
されるアメボッイトの抽出１（’； （アメボッイト・
ライゼート）から不純物を除去１．で、エンドトキシン
特異性が高いアメボザイト・う・ｆゼートを調製する方
法に係る。
関し、更に詳しくは、カブトガニの血リンパ液よシ取得
されるアメボッイトの抽出１（’； （アメボッイト・
ライゼート）から不純物を除去１．で、エンドトキシン
特異性が高いアメボザイト・う・ｆゼートを調製する方
法に係る。
カブトガ＝ （Ｌｌｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｌｔｅｍｕ
ｓ 、ｉ’ａｃｌｓｙｐｌｅｕｓｔｒｉｄｅｎｔａｔｕ
ｓ 、 Ｔ、 ｇｌｇａｓ等）の血リンパ液に存在する
アメボッイトに対するダラム陰性菌表層物質゛エンドト
キシン”（リポ・ボリザツカライド）の作用によυ生起
するカブトガニ血リンパ液凝固現象は、生体防禦機構の
面から、興味深く研究されている。一方、アメボザイト
・ライゼートの、エンドトキシンによる凝固現象は、゛
リムルス・テスト”の一般名でエンドトキシン特異的検
出法として医学、薬学の領域において広く利用されてい
る。アメボザイト・ライゼートのゲル化を起す物質とし
て、エンドトキシンを除いて、哺乳動物等の凝固系酵素
（第ｘａ因子、トロンビン等）がカブトガニ凝固系類似
酵素として知られてし１．いるものの、これら酵素類以
外には見出せないことから、リムルス・デストはエンド
トキシンの特異的反応系とし°Ｃ評価さノしてきた。
ｓ 、ｉ’ａｃｌｓｙｐｌｅｕｓｔｒｉｄｅｎｔａｔｕ
ｓ 、 Ｔ、 ｇｌｇａｓ等）の血リンパ液に存在する
アメボッイトに対するダラム陰性菌表層物質゛エンドト
キシン”（リポ・ボリザツカライド）の作用によυ生起
するカブトガニ血リンパ液凝固現象は、生体防禦機構の
面から、興味深く研究されている。一方、アメボザイト
・ライゼートの、エンドトキシンによる凝固現象は、゛
リムルス・テスト”の一般名でエンドトキシン特異的検
出法として医学、薬学の領域において広く利用されてい
る。アメボザイト・ライゼートのゲル化を起す物質とし
て、エンドトキシンを除いて、哺乳動物等の凝固系酵素
（第ｘａ因子、トロンビン等）がカブトガニ凝固系類似
酵素として知られてし１．いるものの、これら酵素類以
外には見出せないことから、リムルス・デストはエンド
トキシンの特異的反応系とし°Ｃ評価さノしてきた。
本発明者らは、アメボザイト・ライゼートの凝固機＋ｒ
ｒｔの解明につき鋭意Ｉσ［究を打つできた過程で、カ
ブトガニの凝固系に係る酵素に特異的な合成基質を用い
る高感度且つカー′」几性の高いエンドトキシン検出測
定法（／ｌ°！［開閉５４−１５７９７参照）を１ＪＬ
供すると共にアメボザイト・ライゼートの凝固機転に於
てエンドトキシンが直接作用する物質は、従来よυも及
されている凝固酵素前駆体ではなく、他にエンドトキシ
ン感受性物質が存在し、エントド、キシンの作用によシ
それが活性化を受け、次いで凝固酵素前、躯体を、活性
を有する凝固酵素とし、かくして活性化された酵素の働
きによシコアギュローゲンが繊維状コアギュリンとなる
こと、即ち、カブトガニの凝固系も、哺乳動物と同様、
多数の酵素群の段階的反応によシ凝固が進む系であるこ
とを報告した（ ＦＥＢ８． Ｌｅｔ ｔｅｒｓ、１２
０．２１７（１９８０）Ｓ、 Ｉｗａｎａｇａ ｅｔ
ａｔ ）。
ｒｔの解明につき鋭意Ｉσ［究を打つできた過程で、カ
ブトガニの凝固系に係る酵素に特異的な合成基質を用い
る高感度且つカー′」几性の高いエンドトキシン検出測
定法（／ｌ°！［開閉５４−１５７９７参照）を１ＪＬ
供すると共にアメボザイト・ライゼートの凝固機転に於
てエンドトキシンが直接作用する物質は、従来よυも及
されている凝固酵素前駆体ではなく、他にエンドトキシ
ン感受性物質が存在し、エントド、キシンの作用によシ
それが活性化を受け、次いで凝固酵素前、躯体を、活性
を有する凝固酵素とし、かくして活性化された酵素の働
きによシコアギュローゲンが繊維状コアギュリンとなる
こと、即ち、カブトガニの凝固系も、哺乳動物と同様、
多数の酵素群の段階的反応によシ凝固が進む系であるこ
とを報告した（ ＦＥＢ８． Ｌｅｔ ｔｅｒｓ、１２
０．２１７（１９８０）Ｓ、 Ｉｗａｎａｇａ ｅｔ
ａｔ ）。
本発明者らは、上記の事実に加えで、（匹に、次の新規
事実を見出し末完ψ１に到達しｆｃ Ｏ即ち、゛アメボ
ザイト争ライゼートに作用して綿う・イゼート各ゲル化
せしめる物質としてエンドトキシンの仙にβ−１，３−
結合を有するグルコース・ポリマー及びその誘導体が存
在することを初Ｍ）て確認し、アメボ・リーイト・ライ
ゼート中にｔ、１、こノ［らのＬｌｌ、ＪｉＩ４！によ
り作用を受けるβ−１，３−グルカン感・Ｖ：（１両づ
）が存在し、この両分はエンドトキシン１１＆受１シ１
：物′ノ′１両分とは異なることを見出した。
事実を見出し末完ψ１に到達しｆｃ Ｏ即ち、゛アメボ
ザイト争ライゼートに作用して綿う・イゼート各ゲル化
せしめる物質としてエンドトキシンの仙にβ−１，３−
結合を有するグルコース・ポリマー及びその誘導体が存
在することを初Ｍ）て確認し、アメボ・リーイト・ライ
ゼート中にｔ、１、こノ［らのＬｌｌ、ＪｉＩ４！によ
り作用を受けるβ−１，３−グルカン感・Ｖ：（１両づ
）が存在し、この両分はエンドトキシン１１＆受１シ１
：物′ノ′１両分とは異なることを見出した。
本発明は、これらアメボサイト・ライゼート中のβ−１
，３−グルカン及びその誘導体に感受性を有し、エンド
トキシンの非存在１・に於゛Ｃもアメボザイト・ライゼ
ートの凝固反応を起す物質（画分）を除去することによ
ジエントドキシンに対し１１”「異性の高いアメボザイ
ト・ライゼートを提供することに係る。
，３−グルカン及びその誘導体に感受性を有し、エンド
トキシンの非存在１・に於゛Ｃもアメボザイト・ライゼ
ートの凝固反応を起す物質（画分）を除去することによ
ジエントドキシンに対し１１”「異性の高いアメボザイ
ト・ライゼートを提供することに係る。
本発明のβ−１，３−グルカン感受性画分ヲ」、リムル
ス・ポリフエムス、及びタキゾロイスートリデンタタス
等のカブトガニのアメボザイト・ライゼートを、硫酸化
多糖類を吸着担体として吸着液体クロマトグラフィーを
行うときイオン強度０．１５〜０．３の塩溶液、好まし
くは塩化す）−ＩＪウム（ＮａＣ１）を含むトリス−塩
酸（１”ｒ ｌｓ −ＨＣｌ ）緩衝液を用いることに
よシ吸着担体から脱離溶出される。
ス・ポリフエムス、及びタキゾロイスートリデンタタス
等のカブトガニのアメボザイト・ライゼートを、硫酸化
多糖類を吸着担体として吸着液体クロマトグラフィーを
行うときイオン強度０．１５〜０．３の塩溶液、好まし
くは塩化す）−ＩＪウム（ＮａＣ１）を含むトリス−塩
酸（１”ｒ ｌｓ −ＨＣｌ ）緩衝液を用いることに
よシ吸着担体から脱離溶出される。
前記硫酸化多糖類としては、デキストラン硫酸・アガロ
ース、硫酸化アガロース等が拳げられ、これらは単独で
又は二種以上を組合わぜて用いてもよく、甘た、ヘハリ
ハセファロースＣＬ −６Ｂ■（Ｐｌｘａｒｍａｃｉａ
Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、スエーデン）のご
ときヘパリン結合架橋アガロース・ゲルと併用してもよ
い。
ース、硫酸化アガロース等が拳げられ、これらは単独で
又は二種以上を組合わぜて用いてもよく、甘た、ヘハリ
ハセファロースＣＬ −６Ｂ■（Ｐｌｘａｒｍａｃｉａ
Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、スエーデン）のご
ときヘパリン結合架橋アガロース・ゲルと併用してもよ
い。
この両分にβ−１，３−グルカンを加えてインキュベー
トし、次いで、凝固酵素前駆体画分を加えるとき凝固酵
素前駆体は活性化を受はコアギュロゲンやコアギュロゲ
ンの構造から調製された呈色性合成基質類に作用し、ゲ
ル化するか、又は発色する。とのβ−１，３−グルカン
感受性両方の存在は本発明者らが初めて明らかＫしたも
のである。
トし、次いで、凝固酵素前駆体画分を加えるとき凝固酵
素前駆体は活性化を受はコアギュロゲンやコアギュロゲ
ンの構造から調製された呈色性合成基質類に作用し、ゲ
ル化するか、又は発色する。とのβ−１，３−グルカン
感受性両方の存在は本発明者らが初めて明らかＫしたも
のである。
本発明の目的はカブトガニのアメボサイト・ライゼート
中のβ−１，３−グルカン感受４′Ｌｉ１ｆｉ分を除去
することによってエンドトキシンＫ ｌｒ、冒異的在ア
メボザイト・ライゼートを提供することであるから、β
−１，３−グルカン感受性画分の確認法に関しては本発
明の実施例に限定されるものでな」ない。
中のβ−１，３−グルカン感受４′Ｌｉ１ｆｉ分を除去
することによってエンドトキシンＫ ｌｒ、冒異的在ア
メボザイト・ライゼートを提供することであるから、β
−１，３−グルカン感受性画分の確認法に関しては本発
明の実施例に限定されるものでな」ない。
本発明のβ−１，３−グルカンを１、ブクリヨウ（Ｐｏ
ｒｌａ ｃｏｃｏｓの菌核）から得られるパキマン土墳
細閑Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｌｓ によ
り産生さｉするカードラン酵母細胞壁多糖ザイモザン、
シイタケ子実体由来のレンチナン等が適用され、パキマ
ン、カードラン等では水溶性を増すためにＡ、 ＩＶ、
ＣＩ ａｒｋｅ ：Ｐｌｔｙｔｏｃｌｌｅｍｌｓｔｒｙ
、１．１７５〜１８８ （１９６７）の手法に従いカル
ボキシメチル化誘導体として便用しても、いずれもβ−
１，３−グルカン感受性因子を活性化することが確認さ
れる。
ｒｌａ ｃｏｃｏｓの菌核）から得られるパキマン土墳
細閑Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｌｓ によ
り産生さｉするカードラン酵母細胞壁多糖ザイモザン、
シイタケ子実体由来のレンチナン等が適用され、パキマ
ン、カードラン等では水溶性を増すためにＡ、 ＩＶ、
ＣＩ ａｒｋｅ ：Ｐｌｔｙｔｏｃｌｌｅｍｌｓｔｒｙ
、１．１７５〜１８８ （１９６７）の手法に従いカル
ボキシメチル化誘導体として便用しても、いずれもβ−
１，３−グルカン感受性因子を活性化することが確認さ
れる。
以下、本発明を、調製例、実施例に」：り更に具体的に
説明する。
説明する。
調製例１ 硫酸化アガロースの調卿
（１） エポキシ活性化セファロースＣＩ：、 −６
，１，３のＨ＋ｒ、１製セファロースＣＬ−６Ｂ（商品
名；ファルマシア社製） ４００ ｍｅを蒸留水１１で
洗浄後、蒸留水６ （１０＋ｎｅに懸濁し、２Ｎ Ｎａ
ＯＨ水溶液２ Ｇ Ｏｍ／！とエピクロルヒドリン６０
ｍｌとを加え、４０℃で２時間攪拌し／ｃＯ反応後、
グラスフィルター上に移し、蒸留水７ （１０ｍｅでｐ
Ｈ７付近になる壕で洗浄した。更に、アセトンで洗浄後
、減圧乾燥して、エポキシ活性化セファロースＣＬ−６
１３２０ｔを得た。
，１，３のＨ＋ｒ、１製セファロースＣＬ−６Ｂ（商品
名；ファルマシア社製） ４００ ｍｅを蒸留水１１で
洗浄後、蒸留水６ （１０＋ｎｅに懸濁し、２Ｎ Ｎａ
ＯＨ水溶液２ Ｇ Ｏｍ／！とエピクロルヒドリン６０
ｍｌとを加え、４０℃で２時間攪拌し／ｃＯ反応後、
グラスフィルター上に移し、蒸留水７ （１０ｍｅでｐ
Ｈ７付近になる壕で洗浄した。更に、アセトンで洗浄後
、減圧乾燥して、エポキシ活性化セファロースＣＬ−６
１３２０ｔを得た。
（２） エポキシ活性化セファロースＣＬ −６Ｂの
硫酸化 エポキシ活性化セファロースＣＬ−６Ｌ１．２Ｏｒを、
Ｋｏｌ（で脱水したビリジ７３００ ｍｅに１ケｊ蜀し
、−２０℃Ｖｃ 冷却後、クロロホルム６０ ｍｅにク
ロルスルポン酸２０ ｍｅを溶解した溶液を２時間かけ
て攪拌しながら滴下した。滴下終了後、４５℃に加温し
、更に、２時間攪拌した。再び一２０℃に冷却後、蒸留
水１５＋＋＋／！を加えた後、７．５ ％ Ｎａｌ−Ｉ
ＣＯ３水溶液４００ ｍｌを加えて中和した。中和後、
グラスフィルター上に移し、５ ｑｌ、 Ｎａ１−ＩＣ
Ｏ，水溶液５００ ｍｌ、蒸留水５００ｍ１，５０％エ
タノール水溶液５０（）ｍｅで順次洗浄して、ピリジン
を完全に除去した。
硫酸化 エポキシ活性化セファロースＣＬ−６Ｌ１．２Ｏｒを、
Ｋｏｌ（で脱水したビリジ７３００ ｍｅに１ケｊ蜀し
、−２０℃Ｖｃ 冷却後、クロロホルム６０ ｍｅにク
ロルスルポン酸２０ ｍｅを溶解した溶液を２時間かけ
て攪拌しながら滴下した。滴下終了後、４５℃に加温し
、更に、２時間攪拌した。再び一２０℃に冷却後、蒸留
水１５＋＋＋／！を加えた後、７．５ ％ Ｎａｌ−Ｉ
ＣＯ３水溶液４００ ｍｌを加えて中和した。中和後、
グラスフィルター上に移し、５ ｑｌ、 Ｎａ１−ＩＣ
Ｏ，水溶液５００ ｍｌ、蒸留水５００ｍ１，５０％エ
タノール水溶液５０（）ｍｅで順次洗浄して、ピリジン
を完全に除去した。
次いで、蒸留水５００ ｍｌで洗浄後、（１，ｌｌ Ｍ
ｌ’ｒｌｓ−Ｊ、−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ９，０）
３００ ｍｅにｉｉ！Ｉｉ ７’＋’Ｊし、オー１−ク
レープ処理（１２１℃、２０分）して滅ｉ：＋￥ ｔ、
た。
ｌ’ｒｌｓ−Ｊ、−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ９，０）
３００ ｍｅにｉｉ！Ｉｉ ７’＋’Ｊし、オー１−ク
レープ処理（１２１℃、２０分）して滅ｉ：＋￥ ｔ、
た。
調製例２ デキスト２ン硫酸・アガロースの調製アンダ
ーソンらの方法（Ｌ、０．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ、。
ーソンらの方法（Ｌ、０．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ、。
Ｔ Ｉｔ ｒ ｏ ｔｎ ｂ、几ｅｓ、、７，４５１
（１９７５） ） Ｋ従って、１３ｒＣＮを用いてデキ
ストラン硫酸（ファルマシア社製；分子月 約５００，
０００）をセファロースＣＬ −６１３に固定化した。
（１９７５） ） Ｋ従って、１３ｒＣＮを用いてデキ
ストラン硫酸（ファルマシア社製；分子月 約５００，
０００）をセファロースＣＬ −６１３に固定化した。
即ち、デキストラン硫酸２５． ｆ ｆｆ氷冷水１１に
溶解し、セファロースＣＬ −６Ｂ’ ５ （＋ （ｌ
ｍｌ！と、１３ｒｃＮ１２５１のアセトニトリル１８
（ｌ ｍｅ 溶７７Ｉを加メ、４〜１０℃で５０分攪
。拌した。ガ」・・、反応中、１０ Ｎ ＮａＯＨ水溶
液を滴下することにより、ｐＨ１０，５に保った。反応
後、グラスフィルター上に移し、濾過した後、０．５
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ Ｋ５衝液（ｐＨ１８，５）Ｉｎ
に懸濁し、４℃で１．５時間ＴＩ’、（拌しプこ。
溶解し、セファロースＣＬ −６Ｂ’ ５ （＋ （ｌ
ｍｌ！と、１３ｒｃＮ１２５１のアセトニトリル１８
（ｌ ｍｅ 溶７７Ｉを加メ、４〜１０℃で５０分攪
。拌した。ガ」・・、反応中、１０ Ｎ ＮａＯＨ水溶
液を滴下することにより、ｐＨ１０，５に保った。反応
後、グラスフィルター上に移し、濾過した後、０．５
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ Ｋ５衝液（ｐＨ１８，５）Ｉｎ
に懸濁し、４℃で１．５時間ＴＩ’、（拌しプこ。
次いで、グラスフィルターで濾過し、蒸留水で充分に洗
浄後、蒸留水５００ ｍｌに懸濁し、オートクレーブ処
理（１２１℃、２０分）して滅菌した。
浄後、蒸留水５００ ｍｌに懸濁し、オートクレーブ処
理（１２１℃、２０分）して滅菌した。
調製例３ 活性測定法
クロマト後の各両分の酵素活性及び各因子の活性は、３
７℃の条件下で１記の方法に従って測定した。な」・・
、酵素活性は全て１分間に１μ＋１１０１ ｅのハラニ
） 口’７＝ ！Ｊ ７ （ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｌｌｉ
ｎｅ）を遊１ｊｌｌｔする酵素１’ｉ％を１単位とした
。
７℃の条件下で１記の方法に従って測定した。な」・・
、酵素活性は全て１分間に１μ＋１１０１ ｅのハラニ
） 口’７＝ ！Ｊ ７ （ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｌｌｉ
ｎｅ）を遊１ｊｌｌｔする酵素１’ｉ％を１単位とした
。
（１） エンドトキシン感受性因子の活性（ファクタ
ーＢ活件）：各両分５０μｌとエンドトキシン（リボボ
リザツカライド、ＬＰＳ）（ＧＯＯｎｆ／ｍ１）３０ｐ
Ｈ並びに（１，２Ｍ ’、ｔ’ｒｉｓ−ＨＣＩ −１３
ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液（ｐＨ８，０） １００μｌを
尻合し、１５分放１δ後、５ｍＭ １３ｏｃ−Ｌｅｕ−
０１ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ２０ ｔｔｌｌと両分Ａ（図
）５０μｌの混液を加え、一定時間後０．６Ｍ酢酸０．
８ｍｅを加えて反応を停止し、遊離したバラニトロアニ
リン計（ε＝１０，５００）を４０５ｎｔｎで測定した
。
ーＢ活件）：各両分５０μｌとエンドトキシン（リボボ
リザツカライド、ＬＰＳ）（ＧＯＯｎｆ／ｍ１）３０ｐ
Ｈ並びに（１，２Ｍ ’、ｔ’ｒｉｓ−ＨＣＩ −１３
ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液（ｐＨ８，０） １００μｌを
尻合し、１５分放１δ後、５ｍＭ １３ｏｃ−Ｌｅｕ−
０１ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ２０ ｔｔｌｌと両分Ａ（図
）５０μｌの混液を加え、一定時間後０．６Ｍ酢酸０．
８ｍｅを加えて反応を停止し、遊離したバラニトロアニ
リン計（ε＝１０，５００）を４０５ｎｔｎで測定した
。
（１１）凝固酵素前駆体（Ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅ
ｎｚｙｍｅ ） ：各両分５０μｌと活性型ファクター
Ｂ５０μ１１トリス緩衝液（（１）で使用したもの）１
００μｌを混合し、３０分放置後、２ｍＭ合成基質（（
１）で使用したもの）５０μｌを加え、出現したアミダ
ーゼ活性を測定した。なお、活性型ファクターＢは画分
１１ （１；ｙ、Ｉ ） ４０ ＋１ｔ、ｚｌ ト０．
４ Ｍ Ｔｒｉｓ −Ｉ−ＩＣＩ −２６ｍＭ ＭｇＣ
ｄ２緩（ｉＲｊ ／ｌｌ （ｐＨ８、（１）２００ｔｔ
ｌＪ１ ＬＰＳ（４００ｎｇ／ｍ／り２００ｔｔ（ｌの
ｉ昆液を１５分放ＩＮシて調製したものを用いた。
ｎｚｙｍｅ ） ：各両分５０μｌと活性型ファクター
Ｂ５０μ１１トリス緩衝液（（１）で使用したもの）１
００μｌを混合し、３０分放置後、２ｍＭ合成基質（（
１）で使用したもの）５０μｌを加え、出現したアミダ
ーゼ活性を測定した。なお、活性型ファクターＢは画分
１１ （１；ｙ、Ｉ ） ４０ ＋１ｔ、ｚｌ ト０．
４ Ｍ Ｔｒｉｓ −Ｉ−ＩＣＩ −２６ｍＭ ＭｇＣ
ｄ２緩（ｉＲｊ ／ｌｌ （ｐＨ８、（１）２００ｔｔ
ｌＪ１ ＬＰＳ（４００ｎｇ／ｍ／り２００ｔｔ（ｌの
ｉ昆液を１５分放ＩＮシて調製したものを用いた。
（Ｉｌ＋） 凝固酵素（Ｃｌｏｔｔｌｎｇ ｅｎｚｙ
ｍｅ） ：各画分５（）μｌｌとＴｒｉｓ緩衝液（（
１）で使用したもの）ｌｏＯｚ１ｃ２１１１Ｍ合成基質
（（１）で使用したもの） ５０１１１ｓ生理食塩水５
０μｌを混合し、一定時間（Ｊｊｌ 、０ 、６ Ｍ酢
酸０−８ｍ１を加えて反応を停止し、パラニトロアニリ
ンの遊離叶を測定した。
ｍｅ） ：各画分５（）μｌｌとＴｒｉｓ緩衝液（（
１）で使用したもの）ｌｏＯｚ１ｃ２１１１Ｍ合成基質
（（１）で使用したもの） ５０１１１ｓ生理食塩水５
０μｌを混合し、一定時間（Ｊｊｌ 、０ 、６ Ｍ酢
酸０−８ｍ１を加えて反応を停止し、パラニトロアニリ
ンの遊離叶を測定した。
カブトガニのアメボサイト１０２を（１、０５Ｍ Ｎａ
Ｃ１を含む帆０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８
，’（１） ”’Ｃ抽出して得たアメボザイト・ライゼ
ー１−９０ ｍｅを、上記緩衝液で平衡化した硫酸化上
ファＵ−スＣＪ、−６Ｂカラム（２，２Ｘ １８．ｏｃ
Ｉｎ）にかけ、上記緩衝液５００−（Ｂｌ）で洗浄する
ことによシ、素通り画分として凝固酵素前駆体（画分Ａ
）を得た。次いで、０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０
、０２ Ｍ ｉ、’ｒ ｌ ５−ＨＣＩ緩ｆ！］＋７
ｉｔｙ（ｊｕｌｌ ｓ、ｏ ） ｓ ｏ Ｏｍｇ（１３
２，）で溶出して、β−１，３−グルカン類により活性
化される非エンドトキシン性凝固酵翠前駆体活性化因子
であるファクター０（画分０）を得た。更に、０．４５
Ｍ ＮａＣ］を含む（１，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ｐＨ８，０） ５００ｍｅ （１３３）で溶出し
て、エンドトキシン感受性因子であるファクターＢ（画
分Ｂ）を得た。イのクロマトグラムを図に示す。図にお
いて、ｒｉｌｌ線Ａ、１１３．Ｇは、それぞれ画分Ａ、
１３．Ｇを表わす。
Ｃ１を含む帆０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８
，’（１） ”’Ｃ抽出して得たアメボザイト・ライゼ
ー１−９０ ｍｅを、上記緩衝液で平衡化した硫酸化上
ファＵ−スＣＪ、−６Ｂカラム（２，２Ｘ １８．ｏｃ
Ｉｎ）にかけ、上記緩衝液５００−（Ｂｌ）で洗浄する
ことによシ、素通り画分として凝固酵素前駆体（画分Ａ
）を得た。次いで、０．１５ Ｍ ＮａＣ１を含む０
、０２ Ｍ ｉ、’ｒ ｌ ５−ＨＣＩ緩ｆ！］＋７
ｉｔｙ（ｊｕｌｌ ｓ、ｏ ） ｓ ｏ Ｏｍｇ（１３
２，）で溶出して、β−１，３−グルカン類により活性
化される非エンドトキシン性凝固酵翠前駆体活性化因子
であるファクター０（画分０）を得た。更に、０．４５
Ｍ ＮａＣ］を含む（１，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ｐＨ８，０） ５００ｍｅ （１３３）で溶出し
て、エンドトキシン感受性因子であるファクターＢ（画
分Ｂ）を得た。イのクロマトグラムを図に示す。図にお
いて、ｒｉｌｌ線Ａ、１１３．Ｇは、それぞれ画分Ａ、
１３．Ｇを表わす。
以上のようにして、得られた両分Ａ及び画分１３を合わ
せることにより、目的とするエンドトキシンにｌＩ＋ｉ
ｒ異的なアメボーリ゛イト・ライゼートを得ることがで
きた。
せることにより、目的とするエンドトキシンにｌＩ＋ｉ
ｒ異的なアメボーリ゛イト・ライゼートを得ることがで
きた。
カブトガニのアメボザイト４２２を０．０５ＭＮａ１ｌ
を含む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｉ−１ｃＩ緩衝液（ｐＨ
８，０）で抽出して得たアメボサイト・ライゼー）６３
０ｍＡを、上記緩衝液で平衡化したデキストラン硫酸・
セファロースＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ ２３．５ｃ１ｒ
ｌ）にかけ、上記緩衝液２ノで洗浄すＺ）ことニ、１：
す、累通シ両分として凝固酵素前１駆休（画分Ａ ）
’、ｉ・得プこ。
を含む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｉ−１ｃＩ緩衝液（ｐＨ
８，０）で抽出して得たアメボサイト・ライゼー）６３
０ｍＡを、上記緩衝液で平衡化したデキストラン硫酸・
セファロースＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ ２３．５ｃ１ｒ
ｌ）にかけ、上記緩衝液２ノで洗浄すＺ）ことニ、１：
す、累通シ両分として凝固酵素前１駆休（画分Ａ ）
’、ｉ・得プこ。
次いで、Ｑ、３ＭＮａＣ１を含む帆＋１２ Ｍ ”Ｊ’
ｒ ｉ ５−ＩＨシＩ緩衝液（１）１１８．０ ） ２
１で溶出し−（、β−１，；３−グルカン類によシ活性
化される非エンドトキシンイク：凝固酵素前駆体活性化
因子であるファクター（）（画分Ｇ）を得た。更に、０
．５ＭＮａＣ１を含む０．０２ＭＴｒｌｓ−Ｉ（ＣＩ緩
衝液（ｐｉ（８，０）２１で冶出して、エンドトキシン
感受性因子であるファクターＪ、ｌ （１１１ｉｉ分Ｂ
）を得た。
ｒ ｉ ５−ＩＨシＩ緩衝液（１）１１８．０ ） ２
１で溶出し−（、β−１，；３−グルカン類によシ活性
化される非エンドトキシンイク：凝固酵素前駆体活性化
因子であるファクター（）（画分Ｇ）を得た。更に、０
．５ＭＮａＣ１を含む０．０２ＭＴｒｌｓ−Ｉ（ＣＩ緩
衝液（ｐｉ（８，０）２１で冶出して、エンドトキシン
感受性因子であるファクターＪ、ｌ （１１１ｉｉ分Ｂ
）を得た。
以上のようにして、得られ六画分Ａ及び画分１３を合わ
せることによシ、目的とするエンドｔ・キシンＶｃ％異
的なアメボザイト・ライゼートを４！）ることができた
。
せることによシ、目的とするエンドｔ・キシンＶｃ％異
的なアメボザイト・ライゼートを４！）ることができた
。
図は、硫酸化アガロースカラノ・をＪ（１いたアメボザ
イトやライゼートのクロマトグラムである。
イトやライゼートのクロマトグラムである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ カブトガニのアメボザイトφライゼート又はそれを
含む液体を硫酸化多糖類を吸着担体とする液体クロマト
グラフィーに付し、非エンドトキシン性凝固酵素前駆体
活性化因子を含む両分を除去スることを特徴とするエン
ドトキシンＫ ／ｌ’Ｊｉ異的なアメボサイトーライゼ
ート又はそれを含む液体の調製方法。 ２ 非エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子がβ
−１，３−グルカン類によル活性化されるものであるｌ
Ｎｊ ｉ’ｌ−請求の範囲ｌｔ１項記載の調製方法。 ３ 液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液としてイ
オン強度０．１５〜０．３の塩溶液を用いて非エンドト
キシン性凝固酵素前駆体活性化因子を含む両分を除去す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記
載のｗ！４製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57135680A JPS5927828A (ja) | 1982-08-05 | 1982-08-05 | アメボサイト・ライゼートの調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57135680A JPS5927828A (ja) | 1982-08-05 | 1982-08-05 | アメボサイト・ライゼートの調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5927828A true JPS5927828A (ja) | 1984-02-14 |
| JPH0218080B2 JPH0218080B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15157410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57135680A Granted JPS5927828A (ja) | 1982-08-05 | 1982-08-05 | アメボサイト・ライゼートの調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5927828A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61102995A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-21 | 三井サイアナミッド株式会社 | 石油回収用重合体組成物 |
| JPS61102994A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-21 | 三井サイアナミッド株式会社 | 石油回収用重合体組成物 |
| US5047353A (en) * | 1988-03-16 | 1991-09-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for preparing reagent for measuring endotoxin |
| WO1992003736A1 (en) * | 1990-08-22 | 1992-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Assaying agent for endotoxin |
| US5179006A (en) * | 1988-02-27 | 1993-01-12 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for measuring endotoxin |
| US5605806A (en) * | 1990-08-22 | 1997-02-25 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Reagent for assaying endotoxin |
| US5614369A (en) * | 1988-06-23 | 1997-03-25 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
-
1982
- 1982-08-05 JP JP57135680A patent/JPS5927828A/ja active Granted
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61102995A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-21 | 三井サイアナミッド株式会社 | 石油回収用重合体組成物 |
| JPS61102994A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-21 | 三井サイアナミッド株式会社 | 石油回収用重合体組成物 |
| JPH0410557B2 (ja) * | 1984-10-26 | 1992-02-25 | ||
| JPH0410556B2 (ja) * | 1984-10-26 | 1992-02-25 | ||
| US5179006A (en) * | 1988-02-27 | 1993-01-12 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for measuring endotoxin |
| US5318893A (en) * | 1988-02-27 | 1994-06-07 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for measuring endotoxin |
| US5047353A (en) * | 1988-03-16 | 1991-09-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for preparing reagent for measuring endotoxin |
| US5614369A (en) * | 1988-06-23 | 1997-03-25 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
| US5627266A (en) * | 1988-06-23 | 1997-05-06 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
| US6384200B1 (en) | 1988-06-23 | 2002-05-07 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
| WO1992003736A1 (en) * | 1990-08-22 | 1992-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Assaying agent for endotoxin |
| US5605806A (en) * | 1990-08-22 | 1997-02-25 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Reagent for assaying endotoxin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0218080B2 (ja) | 1990-04-24 |
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