JP3630348B2 - 機能性糖鎖高分子及びその使用方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、機能化した糖鎖高分子に関する。特に、光反応性官能基を有し、光照射によって簡便に架橋させることにより基材等に確実に固定化させることのできる糖鎖高分子に関する。
【0002】
【従来の技術】
特異な立体構造を有し、その立体構造の中で豊富な極性部位と疎水性部位とが均衡している糖分子は、生体の認識機構に深く関わっているほか、植物の細胞壁やカニの甲羅などの生体骨格を構成する材料などに用いられている。
本発明者等は、このような糖分子の機能に着目し、ポリビニル系高分子に糖分子を導入した糖鎖高分子を合成し、精力的に研究を行ってきた(例えば、由良洋文、赤池敏宏、「細胞培養」、第19巻、317−322頁、1993年)。
【0003】
本発明者等は、これらの糖鎖高分子で表面修飾することにより、糖の持つ臓器、組織または細胞特異的な性質を利用することを提唱している。しかし、これまでの糖鎖高分子の固定化方法では、主にビニル系高分子からなる主鎖の物理吸着を利用して基材に固定化していた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
物理吸着による固定化では、主鎖をなすビニル系高分子と基材表面との親和性により固定化できる材料が限定される場合があり、固定化された糖鎖高分子が温度や湿度などの環境の変化によって脱離しやすくなる場合もあった。
【0005】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するため、本発明は、ビニル系高分子主鎖に糖分子と光反応性官能基とをグラフトさせた機能性糖鎖高分子を提供する。この光反応性官能基は、アジドベンゼンなどのアジド基であるのが好ましい。
【0006】
この機能性糖鎖高分子は、糖分子を含有するビニル系モノマーと、光反応性官能基を含有するビニル系モノマーとを共重合させることによって好適に合成することができる。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明の機能化糖鎖高分子の一例として、下記式(1)で表されるポリ(3−アジドスチレン−co−{N−p−ビニルベンジル−[O−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−D−グルコンアミド]})(以後、Azo−PVLAと略記)を挙げることができる。
【0008】
【化1】
【0009】
このAzo−PVLAは、β−ガラクトース残基を有するポリ(N−p−ビニルベンジル−[O−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−D−グルコンアミド])(PVLAと略記)と、3−アジドスチレンとが共重合した構造を有している。
【0010】
また、本発明の機能性糖鎖高分子の他の例として、下記式(2)で表されるポリ(3−アジドスチレン−co−{N−p−ビニルベンジル−[O−α−D−グルコピラノシル−(1→4)−D−グルコンアミド]})(以後、Azo−PVMAと略記)を挙げることもできる。このPVMAはグルコース残基を有する。
【0011】
【化2】
【0012】
さらに、本発明の機能性糖鎖高分子は、例えば、
マンノース残基を有するポリ(N−p−ビニルベンジル−[O−β−D−マンノピラノシル−(1→4)−D−マンナアミド])(PVManと略記);
ガラクトース残基を有するポリ(N−p−ビニルベンジル−[O−α−D−ガラクトピラノシル−(1→6)−D−グルコンアミド])(PVMeAと略記);
カルボキシメチル化ガラクトース残基を有するポリ(N−p−ビニルベンジル−[O−6−カルボキシメチル−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−O−D−6−カルボキシメチル−グルコンアミド])(PVLACOOHと略記);
グルコース残基を有するポリ(3−O−4’−ビニルベンジル−D−グルコース)(PVGと略記);
N−アセチルグルコサミン残基を有するポリ(N−p−ビニルベンジル−[O−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−(1→4)−O−D−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−(1→4)−O−D−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコンアミド])、及びポリ(N−p−ビニルベンジル−[O−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−(1→4)−O−D−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコンアミド])、またはそれらの混合物(いずれもPVGlcNAcと略記);
N−p−ビニルベンジル−[O−β−D−グルコピラノシル−(1→3)−D−グルコンアミド](PVLamと略記);または、
D−グルコースを開環させた構造を有するポリ(N−p−ビニルベンジル−D−グルコンアミド)(PVGAと略記)等の糖鎖を含有するビニル系高分子と、前記ポリアジドスチレンとが共重合した構造をなしていてもよい。
【0013】
ここで、上記式(1)で表されるAzo−PVLAの合成法について述べる。まず、下記式(3)に示すように、3−ニトロスチレンをアジド化して3−アジドスチレンとする。
【0014】
【化3】
【0015】
これとは別に、p−アミノメチルスチレンとラクトースとから、下記式(4)で表されるN−p−ビニルベンジル−[O−β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−D−グルコンアミド])(VLAと略記)を合成し、このVLAと前記3−アジドスチレンとを共重合させることによってAzo−PVLAを得ることができる。
【0016】
【化4】
【0017】
このAzo−PVLA以外の、PVMA、PVMan、PVMeA、PVLACOOH、PVG、PNGlcNAc、またはPVGA構造を有する機能性糖鎖高分子も、各々のモノマーと3−アジドスチレンとを共重合させることによって得ることができる。
【0018】
本発明の機能性高分子は、光反応性の官能基を有して光架橋が可能とされているのが好ましい。この光反応性官能基としては、架橋反応後に、細胞などと非特異的相互作用をする可能性のあるアミノ基を残さないもの、触媒を用いなくても容易に架橋反応が起こる程度の反応性を持つもの、常温から高くとも120℃程度の温度で架橋反応が完了するもの、糖鎖高分子への導入が容易であるもの、及び反応が限定的でなく汎用性が高いものが好ましい。このような条件に合致する官能基としては、アジド基等の光アゾ・カップリングを起こす官能基等が好ましい。また、光反応性官能基に代えて、60から120℃程度の加熱によって架橋する官能基を用いてもよい。
【0019】
このアジド基などの光反応性官能基は、ビニル基系モノマーに共有結合を介して結合させるのが好ましい。このビニル系モノマーは特に限られないが、上述したようなアミノメチルスチレンに糖分子を結合させた糖鎖を含むモノマーと共重合させる場合には、スチレンモノマーを用いるのが好ましい。また、当該光反応性官能基は、天然の多糖類、オリゴ糖類、好ましくはアミノ基を有するものあるいはアミノ基を誘導したものにも簡単に誘導できる。
【0020】
このようにして合成された機能性糖鎖高分子は、ポリビニル系高分子を主鎖とし、その主鎖に糖分子及び光反応系官能基がグラフトされている。従って、この機能性糖鎖高分子を適当な溶媒に溶解または分散させて、その溶液または分散液を基材に塗布し、必要に応じて乾燥させ、次いで光照射することによって架橋させることができる。
【0021】
このように架橋させた機能性糖鎖高分子は、従来の物理吸着による固定化に比較して、より強固に確実に基材に固定化される。よって、本発明の機能性糖鎖高分子は、基材表面に糖分子を強固かつ確実に固定化し、基材の表面改質をするために好適に使用することができる。
【0022】
ここで、本発明の機能性糖鎖高分子によって表面改質される基材としては、種々の医用材料、臨床診断用基材、アフィニティ・クロマトグラフィーの担体等の固体材料等が挙げられる。また、水に難溶性の物質の表面に本発明の機能性糖鎖高分子を固定化することにより、物質表面に糖分子が導入されて可溶化することができる。さらに、非特異的に作用する薬剤を本発明の機能性糖鎖高分子で包接することにより、糖分子が持つ特異性に基づいた薬剤の局所的投与、いわゆるドラッグ・デリバリー・システム(DDS)を構築することも可能である。
【0023】
【発明の効果】
本発明の機能性糖鎖高分子は、生体器官、組織、または細胞などとの間に特異的親和性を有する糖分子を含んでいるので、その特異性を利用することによってこの機能性糖鎖高分子で被覆した種々の基材の表面機能化が図れる。
【0024】
本発明の糖鎖高分子は、分子内に光反応性官能基が導入されているので、その官能基を介して光架橋させることにより、より強固にそして確実に基材に固定化することができる。
【0025】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【0026】
実施例1:Azo−PVLAの合成
(1)3−アジドスチレンの合成
3−ニトロスチレン(5g)を、10mLのエタノールに分散させ、20mLの濃塩酸を加えた後、塩化スズ(6水和物)の22.5g/25mLエタノールを添加して12時間撹拌した。これに水酸化ナトリウム溶液を添加して中和した後、エーテルを加えて抽出した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、塩素ガスを加えて粗化合物を得た。
【0027】
次いで、この粗化合物2.4gを20mLの水溶液とし、2mLの濃硫酸を加えて、氷冷下26mLの1N亜硝酸ナトリウムの溶液を加えた。3時間後、1.6gのアジ化ナトリウムの水溶液200mLをゆっくりと添加して5時間反応させた。反応終了後、エーテル抽出を行い、0.1N炭酸水素ナトリウム溶液で4回洗浄した後に、エーテル層を乾燥、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラム(クロロホルム:ヘキサン=20:80)で精製し(Rf=0.85)、0.8gの3−アジドスチレンを得た。
【0028】
(2)Azo−PVLAの合成
上記の3−アジドスチレン(10、5mol%)と、VLA(90、95mol%)とを共重合させ、本発明の機能性糖鎖高分子の一例であるAzo−PVLAを合成した。
このAzo−PVLAのIRスペクトルを図1に示す。2010cm−1付近にアジド基に特有の吸収ピークが見られる。
【0029】
実施例2:Azo−PVMAの合成
VLAの代わりにN−p−ビニルベンジル−[O−α−D−グルコピラノシル−(1→4)−D−グルコンアミド](VMAと略記)を用いた以外は実施例1と同様にして、本発明の機能性糖鎖高分子の他の例であるAzo−PVMAを合成した。
このAzo−PVMAのIRスペクトルを図1に示す。2010cm−1付近にアジド基に特有の吸収ピークが見られる。
【0030】
実施例3
Azo−PVLAを少量の水に溶解した後、各々0.05、0.025、及び0.005重量%の濃度となるようにイソプロパノール:水(7:3)の混合溶媒で希釈した。
塩化ビニル(塩ビ)シートを直径20mmの円形に成型し、エタノールで洗浄した後に12well細胞培養用シャーレの底面にシリコーン樹脂を用いて固定した。このシャーレに各濃度のAzo−PVLA溶液を各々250μLずつ添加して、60℃で1時間キャストした。
その後、これらのキャスト膜に、殺菌用UVランプ下15cmにおいて、3時間UV照射を照射した。キャスト膜を蒸留水で数回洗浄した後、各シャーレ毎にビーカー中で蒸留水に浸漬し、器具洗浄用のソニケーターで20分間超音波処理した。
【0031】
これらのシャーレに、100μg/mLのBSA溶液を加えて15分間放置した後、PBSで十分に洗浄した。
その後、Azo−PVLAに含まれるβ−ガラクトースと特異的に結合するレクチンであるAllo−Aのペルオキシダーゼ修飾したものを1μg含むPBSを各シャーレに添加し、37℃で30分間インキュベートした。3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液中を加えて20分間インキュベートした。この上澄液の波長450nmでの吸収を測定することにより、Allo−Aの固定量、即ち塩ビシート表面への糖導入量を算出した。
結果を表1に示す。
【0032】
【表1】
【0033】
実施例4
エポキシ樹脂シート表面へのAzo−PVLAの固定化について、実施例3の方法に準じて評価した。
その結果、超音波処理前の固定化量は161±59ngであり、超音波処理後の固定化量は176±50ngであった。測定誤差を含めても、超音波処理という過酷な処理を行っても本発明の機能性糖鎖高分子の被覆は脱離しないことがわかった。
【0034】
実施例5
架橋ポリスチレン(ジビニルベンゼン)ビーズ(DVBビーズと略記)表面へのAzo−PVLAの固定化についても同様に評価した。このビーズの粒径は0.3mmであり、ビーズ0.1g当たりの表面積は1000mm2であった。
その結果、何も被覆していないDVBビーズ表面には、2.1ng/cm2しか固定化されないのに対し、Azo−PVLAで被覆したDVBビーズでは5.2ng/cm2が固定化されていた。一般に非特異的吸着の影響が大きなマイクロビーズにおいて、Azo−PVLAの被覆効果に基づく3倍以上のAlloAの吸着が見られた。
【0035】
実施例3から5の結果から、本発明の機能性糖鎖高分子を用いることにより、塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリスチレン等といった基材材料によらず、さらには、平面状、球面状等の基材の形状にもよらずに糖分子を強固に固定化できることがわかった。
【0036】
実施例6
機能性糖鎖高分子としてAzo−PVLA及びAzo−PVMAを選択した。実施例1と同様にして各々の糖鎖高分子溶液を調製した。それらの溶液に1000IU/mLのヘパリンを添加した。各溶液をポリスチレン製シャーレに添加して乾燥させ、UV照射後に超純水で20分間超音波処理を行い、さらに3回洗浄してから乾燥させた。
【0037】
正常ヒト血液を室温で遠心(100rpm、10分間)し、その上清をPRP(Plate Rich Plasma)として用いた。PRPを0.1%BSAを含むPBSで希釈し、1cm3当たり1〜5×106細胞数になるように調製して、これを上記各シャーレに添加した。添加後、1500rpm、10分間遠心し、37℃で1時間静置して血小板を接着させた。接着後の上清をピペッティングにより回収し血球計測装置(sysmex社製)で上清に残った血小板を計数することによって接着量を算出した。結果を図3に示す。但し、記載したデータは、3回の測定結果の平均値である。
【0038】
図3には、対照用として、何も被覆していないシャーレについての結果も記載した。図から明らかなように、ヘパリン濃度固定化していない場合でも、Azo−PVLAまたはAzo−PVMAで被覆することによって、血小板の接着を低下させることが可能であり、高濃度のヘパリン(1000IU/mL)とともに固定化することによって、この効果はさらに顕著になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1で合成したAzo−PVLAのIRスペクトルを示す図である。
【図2】実施例2で合成したAzo−PVMAのIRスペクトルを示す図である。
【図3】実施例のヘパリン吸着実験の結果を示すグラフである。
Claims (5)
- 糖鎖を含有するビニル系モノマーと、光反応性官能基を含有するビニル系モノマーとを共重合させて得られる共重合体からなることを特徴とする機能性糖鎖高分子。
- 前記光反応性官能基がアジド基であることを特徴とする請求項1記載の機能性糖鎖高分子。
- 前記糖鎖を含有するビニル系モノマーが、N-p-ビニルベンジル-[O-β-D-ガラクトピラノシル-(1→4)-D-グルコンアミド];N-p-ビニルベンジル-[O-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコンアミド];N-p-ビニルベンジル-[O-β-D-マンノピラノシル-(1→4)-D-マンナアミド];N-p-ビニルベンジル-[O-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-D-グルコンアミド];N-p-ビニルベンジル-[O-6-カルボキシメチル-β-D-ガラクトピラノシル-(1→4)-O-D-6-カルボキシメチル-グルコンアミド];3-O-4’-ビニルベンジル-D-グルコース;N-p-ビニルベンジル-[O-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-O-D-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-O-D-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコンアミド]、及びN-p-ビニルベンジル-[O-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-O-D-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコンアミド]、またはそれらの混合物;N-p-ビニルベンジル-[O-β-D-グルコピラノシル-(1→3)-D-グルコンアミド];及び、N-p-ビニルベンジル-D-グルコンアミドからなる群から選択される少なくとも1つのモノマーであることを特徴とする請求項1記載の機能性糖鎖高分子。
- 前記光反応性官能基を含有するモノマーが、3−アジドスチレンであることを特徴とする請求項2記載の機能性糖鎖高分子。
- 請求項1から4のいずれかの機能性糖鎖高分子の溶液を基材に塗布し、光照射または加熱することからなる機能性糖鎖高分子の使用方法。
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